WO2022092248A1 - 血液凝固反応の検出方法 - Google Patents

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WO2022092248A1
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auc
time
reaction
measurement
peak
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PCT/JP2021/039947
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俊樹 川辺
健悟 大西
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積水メディカル株式会社
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/49—Blood
    • G01N33/4905—Determining clotting time of blood

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a blood coagulation reaction.
  • the blood coagulation test is a test for diagnosing the blood coagulation ability of a patient by adding a predetermined reagent to the blood sample of the patient and measuring the blood coagulation time or the like.
  • Typical examples of blood coagulation time include prothrombin time (PT), activated partial thromboplastin time (APTT), and thrombin time.
  • Abnormal blood coagulation ability causes an increase in coagulation time.
  • Causes of prolonged coagulation time include the effects of coagulation inhibitors, a decrease in coagulation-related components, a congenital deficiency of blood coagulation factors, and the acquired appearance of autoantibodies that inhibit the coagulation reaction.
  • an automatic analyzer that automatically measures the blood coagulation reaction has become widespread, and it is possible to easily carry out a blood coagulation test.
  • a mixed solution obtained by adding a reagent to a blood sample is irradiated with light, and the coagulation reaction of the blood sample is measured based on the change in the amount of scattered light obtained.
  • the amount of scattered light rapidly increases due to the progress of the coagulation reaction, and then as the coagulation reaction approaches the end, the amount of scattered light saturates and reaches a plateau.
  • the time when the amount of scattered light becomes maximum is the time when the coagulation reaction ends.
  • the blood coagulation time can be calculated based on such a temporal change in the amount of scattered light.
  • the photometric data in the analyzer includes various noises due to the state of the device, the reagent, the sample, and the like. For example, after adding a reagent to a blood sample, a slight increase in the amount of scattered light may be measured at the initial stage of the reaction before the amount of scattered light increases due to the original coagulation reaction. It is called (Patent Documents 1 and 2). Noise in the photometric data, such as the initial reaction, can lead to miscalculation of the coagulation time.
  • a method to exclude the influence of initial reaction or pre-peak has been proposed.
  • a threshold value is set in advance for the measured time or the measured value, and the reaction after the measured time or data reaches the threshold value is regarded as a true coagulation reaction and the coagulation time calculation process is performed.
  • the initial reaction is performed by monitoring the amount and rate of optical changes due to the coagulation reaction at at least one checkpoint or check region from the start of measurement of the coagulation reaction to the end of the reaction.
  • Patent Document 2 describes the steps of measuring the amount of scattered light and calculating the time when the measured amount of scattered light reaches 1 / N of the coagulation reaction end point as the coagulation time until the calculated coagulation time is determined to be normal.
  • a blood coagulation analysis method is disclosed, which comprises repeating.
  • percentage detection method After measuring the amount of scattered light until the end of the coagulation reaction, the point where X% (for example, 50%) of the amount of light (maximum scattered light amount) at the end of the coagulation reaction is detected is detected as the coagulation time.
  • the percent detection method enables accurate calculation of coagulation time even for abnormal specimens such as low fibrinogen specimens, chyle specimens, and hemolytic specimens.
  • the percentage detection method since the true coagulation reaction that is not noise can be detected by measuring the amount of scattered light until the end of the coagulation reaction, it is possible to prevent the erroneous calculation of the coagulation time due to the above-mentioned initial reaction.
  • the percentage detection method in order to make it possible to detect the end of the coagulation reaction in various blood samples including an abnormal sample having an extended coagulation time, one sample is measured for several minutes and then the coagulation time is calculated. However, normal samples, which account for most of the blood samples, do not require such a long measurement time.
  • Patent Document 3 the scattered light amount data obtained in real time from the analyzer is smoothed and the origin is adjusted to obtain the reference data X, and the reference integration data Y obtained by further integrating the reference data and the reference data are described.
  • a reference data value Xd is selected at a subsequent time point and at a time point when the reference integration data Y becomes a predetermined threshold value Ys or more, and 1 / N of the Xd (N is a constant integer of 1 or more) corresponds to the corresponding time point.
  • a method for measuring blood coagulation time is described in which the coagulation time is the time from the time of mixing up to.
  • the present invention provides a method for detecting a blood coagulation reaction, which can detect a true coagulation reaction in real time during blood coagulation reaction measurement.
  • cVmax (k) reaches a predetermined length.
  • Vmax of V (i) Including, how.
  • AUC pre (k) is the pre-peak AUC at k and represents the AUC of V (i) from k 1 to cVmaxT (k).
  • AUC post (k) is the post-peak AUC at k and represents the AUC of V (i) from cVmaxT (k) to k 2 .
  • k 1 is the latest measurement point or time among the measurement points or times in which V (i) ⁇ cVmax (k) ⁇ Hr% before cVmaxT (k).
  • k 2 is the earliest measurement point or time among the measurement points or times satisfying V (i) ⁇ cVmax (k) ⁇ Hr% after cVmaxT (k).
  • both the pre-peak AUC and the post-peak AUC at k are equal to or higher than the second threshold value AUC th2 .
  • the measurement point or time at which the pre-peak AUC is maximum and the time is cVmax (k)
  • the measurement point or time at which the post-peak AUC is maximum is cVmax (k).
  • the method of the present invention it is possible to prevent erroneous detection of noise such as an initial reaction in blood coagulation reaction measurement, and to correctly detect a true coagulation reaction in real time during measurement.
  • the coagulation time based on the true coagulation reaction can be calculated correctly.
  • the real-time true coagulation reaction detection by the method of the present invention when the data necessary for calculating the coagulation time of one blood sample can be obtained, the measurement of the sample is stopped and the measurement of the next blood sample is started. to enable. Therefore, according to the method of the present invention, it is possible to shorten the measurement time required for one blood sample and improve the efficiency of the blood coagulation test.
  • FIG. 1 An example of coagulation reaction measurement data.
  • A Pre-peak AUC and post-peak AUC of V (i) of the initial reaction and the true reaction
  • B Enlarged view of the initial reaction.
  • the conceptual diagram which shows the structure of the automatic analyzer for performing the detection method of the blood coagulation reaction by this invention. Relationship between parameters calculated from the coagulation reaction.
  • a predetermined reagent is added to a blood sample, the subsequent blood coagulation reaction is measured, and the blood coagulation time is calculated from the coagulation reaction.
  • a blood sample may be simply referred to as a sample.
  • a general means for example, an optical means for measuring the amount of scattered light, a transmittance, an absorbance, or the like, a mechanical means for measuring the viscosity of plasma, or the like is used.
  • the blood coagulation reaction is generally represented by a coagulation reaction curve showing a change in the amount of the coagulation reaction over time.
  • the coagulation reaction curve of a normal sample having no coagulation abnormality factor depends on the measuring means, but basically shows a sigmoid shape.
  • the coagulation reaction curve based on the amount of scattered light of a normal sample usually rises sharply due to the progress of coagulation when a certain amount of time has passed from the addition of the reagent, and then the coagulation reaction ends. It reaches the plateau as it approaches.
  • the coagulation reaction curve of an abnormal sample having a coagulation abnormality factor shows various shapes depending on the cause of the abnormality, such as a delay in the rise time of the curve and a gradual increase.
  • the reaction amount from the start of the reaction to the end of the reaction can be set as 100%, and the time until the reaction amount reaches a predetermined value (for example, 50%) can be calculated as the coagulation time.
  • a predetermined value for example, 50%
  • the coagulation time is determined based on the rate of change of the coagulation reaction curve, for example, the peak of the coagulation reaction rate (so-called differential method), or the time course of the integrated value of the coagulation reaction in a minute time zone (see Patent Document 3). Can be calculated.
  • the measurement time per sample is set sufficiently long in order to enable the measurement of the amount of scattered light until the end of the coagulation reaction in various blood samples including an abnormal sample having an extended coagulation time. It is necessary, so the analysis efficiency is not high.
  • the coagulation time can be calculated before the end of the coagulation reaction, so that the coagulation time can be calculated in a shorter time, but the inaccurate coagulation time may be calculated due to the influence of noise. be.
  • the coagulation reaction may be detected too early due to the equipment noise at the initial stage of measurement and the initial noise such as the initial reaction. Such false detection of the coagulation reaction leads to inaccurate calculation of the coagulation time.
  • a threshold value is set in advance for the measurement time and the measured value, and the reaction after the measured time and data reach the threshold value is regarded as a true coagulation reaction and coagulation. There is a method to perform the time calculation process. However, if the threshold value is set too high, the true coagulation reaction may not be detected, especially in an abnormal sample having a small coagulation reaction, while if the threshold value is lowered, the possibility of false detection of noise increases.
  • the conventional blood coagulation reaction analysis method for calculating the coagulation time after detecting the end of the coagulation reaction can accurately calculate the coagulation time, but the analysis efficiency is low because the measurement time per sample is long. It is more preferable if the measurement time per sample can be shortened and the analysis efficiency of the blood sample can be improved while preventing false detection of noise.
  • the present invention provides a method for detecting a blood coagulation reaction.
  • the true coagulation reaction (hereinafter, also referred to as “test sample”) is realized in real time from the time-series data of the coagulation reaction obtained by the measurement. A true reaction) is detected.
  • the method of the present invention prevents false detection of noise such as an initial reaction during blood coagulation reaction measurement, and makes it possible to correctly detect a true reaction.
  • the blood coagulation time of the test sample can be calculated based on the obtained true reaction. According to the method of the present invention, the coagulation time can be accurately calculated without being affected by noise such as an initial reaction. Further, according to the present invention, the measurement time is optimized so that the minimum coagulation reaction measurement time required for calculating each coagulation time is applied to various blood samples including normal samples and abnormal samples. Can be done.
  • Examples of blood coagulation time that can be calculated according to the present invention include prothrombin time (PT), activated partial thromboplastin time (APTT), and coagulation time in fibrinogen (Fbg) concentration measurement.
  • PT prothrombin time
  • APTT activated partial thromboplastin time
  • Fbg fibrinogen concentration measurement.
  • the method of the present invention will be described mainly by taking the activated partial thromboplastin time (APTT) as an example as a coagulation time. Modifications of the method of the invention to other coagulation times (eg, prothrombin time (PT)) can be performed by those of skill in the art.
  • the plasma of the subject is preferably used as the subject.
  • An anticoagulant commonly used for coagulation tests may be added to the sample.
  • plasma can be obtained by collecting blood using a blood collection tube containing sodium citrate and then centrifuging.
  • a reagent for measuring coagulation time is added to the test sample, and the blood coagulation reaction is started.
  • the coagulation reaction of the mixed solution containing the reagent and the test sample can be measured.
  • the coagulation time measuring reagent used can be arbitrarily selected according to the measurement purpose. Reagents for measuring various coagulation times are commercially available (for example, APTT reagent Coagupia APTT-N; manufactured by Sekisui Medical Co., Ltd.).
  • a general means for example, an optical means for measuring the amount of scattered light, a transmittance, an absorbance, or the like, or a mechanical means for measuring the viscosity of plasma may be used.
  • the method of the present invention will be described by taking the measurement of coagulation reaction based on the amount of scattered light as an example.
  • the reaction start time of the coagulation reaction can be typically defined as the time when the reagent is mixed with the sample to start the coagulation reaction, but other timings may be defined as the reaction start time.
  • the time for continuing the measurement of the coagulation reaction may be, for example, several tens of seconds to 8 minutes from the time of mixing the sample and the reagent. This measurement time may be up to the time when the true coagulation reaction of each sample is detected, may be up to the time when other arbitrary conditions are satisfied, or may be a fixed value arbitrarily determined.
  • the measurement of the progress of the coagulation reaction (photometry when optically detected) may be repeated at predetermined intervals. For example, the measurement may be performed at intervals of 0.1 seconds.
  • the temperature of the mixed solution during the measurement is under normal conditions, for example, 30 ° C. or higher and 40 ° C. or lower, preferably 35 ° C. or higher and 39 ° C. or lower. Further, various measurement conditions can be appropriately set according to the test sample, the reagent, the measurement means, and the like.
  • the series of operations in the above-mentioned coagulation reaction measurement can be performed using an automatic analyzer.
  • the automatic analyzer there is a blood coagulation automatic analyzer CP3000 (manufactured by Sekisui Medical Co., Ltd.).
  • some operations may be performed manually.
  • a human can prepare a test sample, and subsequent operations can be performed by an automatic analyzer.
  • step 1) of the method of the present invention the blood coagulation reaction of the test sample is measured to obtain the first derivative V (i) of the coagulation reaction up to the latest measurement point.
  • the measurement data D (i) photometric value of the scattered light amount
  • i represents a measurement point, that is, the number measured from the start of measurement.
  • the reaction P (i) is acquired from the measurement data D (i). Since the measurement data D (i) contains noise during metering and fluctuations unrelated to the reaction that appears immediately after the start of metering, the measured values are smoothed by a known method. Is preferable. When the solidification reaction is measured by the amount of scattered light, it is preferable to perform a zero point adjustment process in which the amount of scattered light derived from the sample mixture before the reaction is subtracted.
  • any of various known methods for noise reduction can be used.
  • examples of the smoothing process include a filtering process, a process of obtaining a differential value by a difference value or an operation of an average slope in an interval, which will be described later, and then integrating the differential value.
  • the smoothed measurement data may be adjusted so that the value at the start of measurement becomes 0.
  • the measurement data D (i) is smoothed or zeroed to obtain the reaction P (i). More preferably, the measurement data D (i) is smoothed and zero-point adjusted to obtain the reaction P (i).
  • the reaction P (i) constitutes a solidification reaction curve.
  • the first derivative V (i) is obtained from the obtained reaction P (i).
  • the differential process for obtaining V (i) from P (i) can be performed by any method, and can be performed, for example, by calculating the average slope value in the section.
  • a certain number of measurement points before and after each measurement point i for example, 2K + 1 measurement points from i-K to i + K can be used.
  • K is an arbitrary integer.
  • the average slope value means the slope value when these multiple measurement points are linearly approximated.
  • the average slope value of these measurement points can be regarded as the first derivative at the measurement point i.
  • the first derivative V (i) constitutes a curve representing the rate of the solidification reaction.
  • the "latest V (i)" means the most recently calculated V (i) using the solidification reaction P at the latest measurement point or time.
  • the slowest measurement point or time for V (i) is the "latest measurement point or time for V (i)".
  • V (i) is solidification reaction rate data from 1 second to 100 seconds after measurement
  • 100 seconds is the "latest measurement time” for V (i).
  • k 0 represents any measurement point or time point prior to k (ie, k 0 ⁇ k).
  • k 0 represents a measurement point or time point at which the detection process of the true reaction shown in step 2) is started, and is also referred to as a detection start point (or detection start time) in the present specification.
  • the measurement point k 0 is the measurement point after the point where P (i) can be acquired by the smoothing process of D (i) or V (i) can be acquired by the differentiation of P (i), or the time corresponding to the measurement point. Therefore, basically, the measurement point k 0 is 2 or more. For example, when the in-section average slope method using the above-mentioned five measurement points is performed, the measurement points k 0 are 3 or more. Further, for example, when 20 measurement points are used for smoothing processing or differentiation processing, the measurement points k 0 are 21 or more.
  • k 0 is a measurement point or time after the detection exclusion range set at the initial stage of measurement.
  • the detection exclusion area corresponds to a measurement area or a time area in which a true reaction cannot occur at the initial stage of measurement.
  • the detection exclusion range is set as a time domain of about 10 seconds from the start of measurement or a measurement range corresponding thereto under standard APTT measurement conditions, in which time k 0 is larger than 10 seconds. The same applies to PT measurement. Under the measurement conditions for Fbg concentration measurement, the detection exclusion range is set as a time range of about 3 to 4 seconds from the start of measurement or a measurement range corresponding thereto, and at this time, the time k 0 is larger than 3 seconds.
  • k 0 is the measurement point or time when V (i) first reaches the threshold V th .
  • V th minute noise mixed in the coagulation reaction can be excluded from the true reaction detection process.
  • step 2) of the method of the present invention the area under the curve (AUC) before and after the peak of V (i) acquired in step 1) is calculated.
  • the peak of V (i) having the maximum value of V (i) up to the measurement point or time k acquired in step 1) as the peak top is used.
  • the maximum value of V (i) at k is referred to as cVmax (k) in the following specification.
  • cVmax (k) can vary depending on k. Therefore, the pre-peak AUC and the post-peak AUC can also vary depending on k, and are therefore represented herein as the variables AUC pre (k) and AUC post (k) of k, respectively.
  • cVmax (k), cVmaxT (k), AUC pre (k), and AUC post (k) are calculated.
  • the AUC pre (k) and AUC post (k) are the pre-peak AUC and the post-peak AUC at k described above, respectively.
  • AUC pre (k) represents the AUC of V (i) from k 1 to cVmaxT (k)
  • AUC post (k) represents the AUC of V (i) from cVmaxT (k) to k 2 .
  • k 1 is the latest measurement point or time among the measurement points or times in which V (i) ⁇ cVmax (k) ⁇ Hr% before cVmaxT (k)
  • k 2 is cVmaxT (k). After that, it is the earliest measurement point or time among the measurement points or times that satisfy V (i) ⁇ cVmax (k) ⁇ Hr%.
  • k 1 ⁇ k 2 and AUC post (k) 0 from the rising edge of the peak of V (i) to the peak top.
  • k 1 and k 2 are the start point of the calculation of the AUC pre (k) and the end point of the calculation of the AUC post (k), respectively.
  • Hr is a height ratio and determines the height of the start or end point of V (i) used in the calculation of AUC pre (k) and AUC post (k).
  • Hr is set to an arbitrary value greater than 0 and less than 100 (0 ⁇ Hr ⁇ 100), preferably in the range of 10 ⁇ Hr ⁇ 70.
  • V (i) the first derivative V (i) of the solidification reaction curve is plotted against time.
  • the peak top of V (i) is the maximum value cVmax (k)
  • the time at that time is cVmaxT (k).
  • a line (baseline) indicating cVmax (k) ⁇ Hr% is drawn under the curve of V (i).
  • V (i) was divided into the following four sections T1 to T4 along the horizontal axis direction (reaction progress).
  • a line representing Hr% of the peak top Vmax of V (i) was set.
  • T1 From the rising point of the reaction
  • T2 From the rising point to the maximum point
  • T3 From the maximum point to the end point of the baseline
  • T4 After the end point of the baseline Table 1, cVmax (k), AUC pre (k) and AUC post at T1 to T4
  • T3 is the time when V (i) reaches the true maximum value Vmax and then decreases, and cVmax (k) remains constant at Vmax, so that AUC pre (k) is also constant, while after the peak.
  • the region AUC post (k) increases with k.
  • T4 is the period after V (i) has passed the baseline end point (k 2 ), and both AUC pre (k) and AUC post (k) are constant.
  • FIG. 3B illustrates the temporal changes in AUC pre (k) and AUC post (k) together with V (i).
  • FIG. 4 illustrates pre-peak AUC and post-peak AUC of V (i) of the initial reaction and the true reaction in the coagulation reaction having the initial reaction.
  • FIG. 4A shows V (i) of the entire coagulation reaction including the initial reaction and the true reaction
  • FIG. 4B is an enlarged view of V (i) of the initial reaction.
  • V (i) increases rapidly immediately after the reaction to form a small peak in the initial reaction, and then gradually decreases to approach zero.
  • the pre-peak AUC (AUC pre ) and post-peak AUC (AUC post ) of the initial reaction are smaller than those of the subsequent true reaction.
  • the AUC pre (k) and AUC post (k) change according to the progress of the coagulation reaction. Therefore, the progress of the coagulation reaction can be grasped based on the AUC pre (k) and the AUC post (k).
  • FIG. 5 shows an example of a coagulation reaction with and without an initial reaction.
  • Each figure in each row shows the change with time of the baseline Bh, AUC pre and AUC post showing the reaction P, cVmax (k) ⁇ Hr% from the left.
  • the first derivative V is shown together in each figure.
  • Bh and AUC pre increase with an increase in V, and are constant after V reaches the peak top (Vmax).
  • the AUC post increases after V reaches Vmax, and is constant after V becomes Bh or less.
  • Bh increases in two stages, that is, the initial reaction and the true reaction.
  • the AUC pre and AUC post rise once during the initial reaction, rise again in response to the shift of Bh due to the appearance of the true reaction, and then become constant.
  • the AUC pre (k) may become constant when V (i) reaches the peak top, and the AUC post (k) may also become constant, regardless of whether it is an initial noise such as an initial reaction or a true reaction. ..
  • the peak of V (i) that appears in the initial noise has a relatively small height and width, both the AUC pre (k) and the AUC post (k) are relatively small values.
  • the AUC pre (k) and AUC post (k) for the peak of the initial noise are reset by the appearance of the true reaction, the time for them to keep constant values is not long.
  • the true reaction can be detected from V (i) based on the values of the pre-peak AUC and the post-peak AUC.
  • the pre-peak AUC and the post-peak AUC exceed a predetermined threshold value and the state continues for a certain period or longer, the pre-peak AUC and the post-peak AUC are calculated.
  • the peak as the peak of the true reaction.
  • step 3) of the method of the present invention the pre-peak AUC and the post-peak AUC of V (i) calculated in step 2) are both set to the first threshold value AUC th1 or higher.
  • cVmax (k) is detected as the true maximum value Vmax of V (i).
  • Vmax is the maximum value of the true reaction at V (i).
  • the first threshold value AUC th1 may be set to different values for the pre-peak AUC and the post-peak AUC, but a common threshold value may be set for both.
  • AUC th1 can be appropriately set in consideration of the magnitude of the coagulation reaction of the test sample and the magnitude of noise. Therefore, AUC th1 can be appropriately set according to the types of reagents and devices used for coagulation reaction measurement. Under standard APTT measurement conditions, AUC th1 is preferably in the range of about 1.5 to 2.5 times the maximum pre-peak AUC of the initial reaction, eg 250-420. If AUC th1 is set smaller, Vmax can be detected even from a sample having a small coagulation reaction, but the risk of false detection of the initial reaction increases.
  • L th a predetermined value L th
  • cVmax (k) is detected as the true maximum value Vmax of V (i).
  • the latest measurement point or time for V (i) is k
  • the previous measurement point or time is k-x
  • x can be appropriately set according to the time frame for comparing with the previously calculated value.
  • L th can be set as appropriate, but under standard APTT measurement conditions, L th is preferably in the range of 0.5 to 2 seconds.
  • Vmax detected in the premature measurement range or time domain (for example, the above-mentioned detection exclusion range) where a true reaction cannot occur can be excluded as an error. ..
  • the time for the detected Vmax that is, cVmaxT (k)
  • AUC th1 can be set relatively small, so that the true maximum value Vmax can be detected even from a sample having a small coagulation reaction.
  • Vmax means that the reaction measured at the measurement point or the time k is not an initial noise such as an initial reaction but a true solidification reaction. Therefore, the peak of V (i) having the detected Vmax as the peak top is considered to be V (i) of the true reaction.
  • the time when Vmax is detected is at the point where the AUC post (k) becomes a constant value, that is, after V (i) drops below the baseline, and thus the coagulation reaction has reached the end stage at this point. Therefore, in the method of the present invention, after the time when Vmax is detected, the coagulation reaction measurement of the test sample can be completed after acquiring the measurement data necessary for calculating the coagulation time.
  • the coagulation reaction measurement of the test sample can be completed. Further, for example, after Vmax is detected, the coagulation reaction measurement of the test sample can be terminated when V (i) is sufficiently lowered.
  • the coagulation time of the test sample can be accurately calculated.
  • steps 1) to 3) are repeated again.
  • This procedure is repeated as long as Vmax is not detected or k does not exceed the measurement end point or time (the maximum measurement point or time at which the coagulation reaction measurement of the test specimen is performed as defined in advance).
  • Vmax is detected or k exceeds the measurement end point or time
  • the iterative process of steps 1) to 3) ends.
  • the measurement end point or time can be set as appropriate, and is preferably in the range of 4 to 8 minutes under standard APTT measurement conditions.
  • FIG. 6 shows a flowchart illustrating a procedure for detecting a true coagulation reaction according to the method of the present invention.
  • S01 Setting value (setting value: Hr, AUC th1 , L th , etc.)
  • S02: Set the measurement counter to "i 1" (initial value)
  • D (i) S04: Proceed to S05 when the calculation of reaction P (i) is possible (predetermined number for smoothing process) Because D (i) is required)
  • S06 Proceed to S07 when the operation of the first derivative V (i) is possible (because a predetermined number of P (i) are required for the differentiation process).
  • the reaction may not be completed and P (i) may continue to rise even at the measurement end point or time.
  • the peak top of V (i) of the true reaction does not appear, or V (i) does not drop sufficiently after the peak top, so that the pre-peak AUC does not reach a certain value.
  • the post-peak AUC is 0, or the post-peak AUC does not reach a constant value even if the pre-peak AUC reaches a constant value, and as a result, Vmax is detected by the measurement end point or time by the method of the present invention. It may not be done.
  • the AUC pre (k) at the measurement end point is AUC th1 or higher. If so, cVmax (k) is detected as the true maximum value Vmax of V (i).
  • Vmax may not be detected by the measurement end point or time because the pre-peak AUC or the post-peak AUC does not reach AUC th1 . Therefore, in one embodiment of the method of the present invention, when k exceeds the measurement end point or time without detecting the true maximum value Vmax, the maximum values of the pre-peak AUC and the post-peak AUC are the second threshold values AUC.
  • the measurement point or time with the maximum pre-peak AUC is the same as cVmaxT (k), and the measurement point or time with the maximum post-peak AUC is later than cVmaxT (k).
  • cVmax (k) is detected as the true maximum value Vmax of V (i) (for example, the procedure shown in FIG. 11 described later is used).
  • AUC th2 is preferably smaller than AUC th1 and preferably in the range of 10% to 30% of AUC th1 .
  • the true reaction of the test subject may be unclear if there is no or very small coagulation reaction of the test sample, or for other reasons. In such cases, it is difficult to distinguish between true reaction and noise. Specimens with an unclear true reaction can typically be identified by the pre-peak AUC not reaching AUC th1 (and even AUC th2 ). Alternatively, it can be distinguished by the fact that V (i) does not exceed the above-mentioned threshold value V th . For example, by starting step 2) only when V (i) reaches V th , false detection of noise can be prevented. In a sample in which the true reaction is unclear, the true reaction is excluded along with noise, and Vmax may not be detected.
  • FIGS. 7A to 7C show the reaction P and the first derivative V of three test specimens having different coagulation abilities.
  • FIG. 7A shows a sample in which the true reaction is unclear
  • FIG. 7B shows a sample in which the true reaction was not completed within the measurement end point or time
  • FIG. 7C shows a sample in which the true reaction was detected. Is shown. These specimens can be classified based on AUC pre (k) and AUC post (k) as follows.
  • the coagulation time of the test sample can be calculated by using the further detected true reaction.
  • the true coagulation reaction obtained in the method of the present invention such as P (i) or V (i)
  • the true maximum value Vmax is detected using V (i) acquired from the data of coagulation reaction measurement, and the coagulation time is calculated using V (i). can.
  • P (i) and V (i) are obtained from the data of coagulation reaction measurement, V (i) is used to detect the true maximum value Vmax, and then P ( The coagulation time can be calculated using i) and / or V (i).
  • the coagulation reaction measurement of the test sample is terminated when Vmax is detected, and the true reaction P (i) and / or V (i) obtained so far is obtained. It can be used to calculate the coagulation time.
  • P (i) and / or V (i) after the rise of the peak containing the detected Vmax eg, P (i) and / or V (i) at i ⁇ k 1 is used.
  • the solidification time can be calculated.
  • the coagulation reaction measurement of the test sample is continued even after Vmax is detected, and the data on the coagulation reaction necessary for the calculation of the coagulation time or other analysis is acquired. Can be done.
  • the method for calculating the coagulation time from the coagulation reaction obtained by the method of the present invention is not particularly limited.
  • a method of calculating the time when P (i) reaches N% of the maximum value Pmax as the coagulation time (so-called percentage detection method); V (i) is the maximum value Vmax or its own.
  • a method of calculating the time when N% is reached as the coagulation time (so-called differential method); a method of calculating the coagulation time based on the time course of the integrated value of P (i) in a minute time zone (Patent Documents 3 and). (See Japanese Patent Application No.
  • a method of calculating the coagulation time based on the weighted average time of V (i) (see Japanese Patent Application No. 2020-309344); As a calculation starting point Te, a method of calculating the time when P (i) reaches N% of P (Te) as a coagulation time (see Japanese Patent Application No. 2020-068877) can be mentioned.
  • the method for detecting the blood coagulation reaction of the present invention has been described above by taking the case of coagulation reaction measurement based on the amount of scattered light as an example.
  • those skilled in the art can apply the method of the present invention to a method for detecting a blood coagulation reaction using another coagulation reaction measuring method (for example, a blood coagulation reaction measuring method based on permeability, absorbance, viscosity, etc.).
  • a blood coagulation reaction measuring method based on permeability, absorbance, viscosity, etc.
  • the reaction P (i) obtained from an inverse sigmoid-like solidification reaction curve based on the amount of transmitted light has a positive and negative opposite to that based on the amount of scattered light described above.
  • the method for detecting the blood coagulation reaction of the present invention described above can be automatically performed using a computer program. Therefore, one aspect of the present invention is a program for performing the above-mentioned method for detecting the blood coagulation reaction of the present invention. Further, the series of steps of the method of the present invention described above can be automatically performed by an automatic analyzer. Therefore, one aspect of the present invention is an apparatus for performing the above-mentioned method for detecting the blood coagulation reaction of the present invention.
  • the automatic analyzer 1 includes a control unit 10, an operation unit 20, a measurement unit 30, and an output unit 40.
  • the control unit 10 controls the overall operation of the automatic analyzer 1.
  • the control unit 10 may be configured by, for example, a personal computer (PC).
  • the control unit 10 includes a CPU, memory, storage, communication interface (I / F), etc., processes commands from the operation unit 20, controls the operation of the measurement unit 30, and stores measurement data received from the measurement unit 30. Data analysis, storage of analysis results, control of output of measurement data and analysis results by the output unit 40, etc. are performed. Further, the control unit 10 may be connected to other devices such as an external medium and a host computer. In the control unit 10, the PC that controls the operation of the measurement unit 30 and the PC that analyzes the measurement data may be the same or different.
  • the operation unit 20 acquires the input from the operator and transmits the obtained input information to the control unit 10.
  • the operation unit 20 includes a user interface (UI) such as a keyboard and a touch panel.
  • UI user interface
  • the output unit 40 includes measurement data of the measurement unit 30, analysis results thereof, for example, detection results of P (i), V (i), true coagulation reaction (Vmax, etc.), and a blood sample. Outputs the solidification time of.
  • the output unit 40 includes a display device such as a display.
  • the measurement unit 30 executes a series of operations for a blood coagulation test and acquires measurement data of the coagulation reaction of a sample including a blood sample.
  • the measurement unit 30 includes various equipment and analysis modules necessary for a blood coagulation test, for example, a sample container for storing a blood sample, a reagent container for storing a test reagent, a reaction container for a reaction between a sample and a reagent, a blood sample, and a blood sample.
  • Probe for dispensing reagents to reaction vessel, light source, detector for detecting scattered or transmitted light from sample in reaction vessel, data processing circuit for sending data from detector to control unit 10, control It is provided with a control circuit that controls the operation of the measuring unit 30 in response to a command from the unit 10.
  • the control unit 10 analyzes the coagulation reaction of the sample based on the data measured by the measurement unit 30. This analysis includes acquisition of P (i) and V (i) described above, detection of a true coagulation reaction (Vmax, etc.), and calculation of a coagulation time using the detected true coagulation reaction. obtain.
  • the coagulation reaction curve P (i) or the first derivative V may be created by the control unit 10 based on the measurement data from the measurement unit 30, or may be created and controlled by another device, for example, the measurement unit 30. It may be sent to the unit 10.
  • the control unit 10 may store parameters used for detecting the true coagulation reaction, for example, setting values such as AUC th1 and L Th , or the control unit 10 is stored on an external device or a network.
  • the set value may be incorporated at the time of analysis.
  • control unit 10 may include a program for performing the method for detecting the blood coagulation reaction of the present invention.
  • the analysis result in the control unit 10 is sent to the output unit 40 and output.
  • the output can take any form, such as display on a screen, transmission to a host computer, or printing.
  • the output information from the output unit can include P (i), V (i), the detection result of the true coagulation reaction, the coagulation time, and the like.
  • the type of output information from the output unit can be controlled by the program of the present invention.
  • the measurement unit 30 continues to measure the test sample until the coagulation reaction is completed, and the data is sequentially sent to the control unit 10.
  • the control unit 10 sequentially performs calculations for acquiring P (i) and V (i), and calculates cVmax (k), cVmaxT (k), AUC pre (k), AUC post (k), and the like. Further, it is determined whether or not L ⁇ L Th , and Vmax is detected. When Vmax is detected, the control unit 10 further calculates the coagulation time of the test sample. The obtained analysis result is sent to the output unit and output.
  • V (i) and V (i) are sequentially output in parallel with the measurement, and cVmax (k), cVmaxT (k), AUC pre (k), and AUC post (k) are also sequentially output as needed. Will be done. After Vmax is detected, Vmax, its time, and coagulation time are output in a timely manner.
  • Example 1 Parameters reflecting the coagulation reaction 1 Test specimens The following 187 cases were used as test specimens: normal plasma (10 cases), heparin-administered plasma (47 cases), LA-positive plasma (11 cases), and so on. Coagulation factor-deficient plasma (14 cases), inhibitor plasma (41 cases), low-concentration fibrinogen plasma (5 cases), other coagulation time-prolonged plasma (59 cases). Initial reactions were observed in 6 of these cases.
  • Coagulation reaction measurement Coagpia APTT-N (manufactured by Sekisui Medical Co., Ltd.), which is a reagent for APTT measurement, is used as a reagent for measurement, and Coagupia APTT-N calcium chloride solution (manufactured by Sekisui Medical Co., Ltd.) is used as a calcium chloride solution. board.
  • the coagulation reaction of the sample including the sample was measured using a blood coagulation automatic analyzer CP3000 (manufactured by Sekisui Medical Co., Ltd.). After heating 50 ⁇ L of the sample in the cuvette at 37 ° C.
  • the cuvette was irradiated with light having a wavelength of 660 nm using an LED as a light source, and the amount of scattered 90-degree laterally scattered light was measured at 0.1 second intervals.
  • reaction P (i) was created by zero point adjustment processing.
  • the first derivative V (i) was calculated from P (i).
  • APTT coagulation time
  • Vmax Maximum value of V (i)
  • VmaxT Time of Vmax
  • Pmax Maximum value of P (i)
  • AUC pre AUC before peak of V (i)
  • AUC post AUC after the peak of V (i)
  • Table 2 shows an example of the calculated parameters. The nine samples shown in Table 2 were as follows. Specimen 1: Specimen with the smallest Pmax Specimen 2: Specimen with the smallest VmaxT Specimen 3: Specimen with bimodal V (i) Specimens 4-9: Specimen with initial reaction
  • FIGS. 9A to 9F The relationships between the parameters are shown in FIGS. 9A to 9F.
  • the APTT of 187 test specimens was distributed between the minimum value of 24.9 seconds and the maximum value of 283.7 seconds, and VmaxT had a nearly linear relationship with APTT (FIG. 9A).
  • the two specimens deviated from the linear relationship were coagulation factor VIII (FVIII) deficient specimens having a bimodal V (i) in which the first peak was larger.
  • Vmax and VmaxT of P (i) FIG. 9B
  • the relationship between Vmax and VmaxT tended to be inversely proportional (Fig. 9C).
  • Example 2 Real-time detection of true coagulation reaction-1 Using the coagulation reaction data of 187 samples measured in Example 1, real-time detection of Vmax was performed by the procedure shown in the flowchart of FIG. 1) Determination of threshold value AUC th1 As a result of Example 1, the minimum values of AUC pre and AUC post in the test sample were 207 and 285 in the sample 1 having the smallest Pmax. On the other hand, the maximum value of AUC pre in the initial reaction section of the samples 4 to 9 having the initial reaction was 168 in the sample 5. If AUC th1 is too low, sample 5 and other initial reaction parts will be erroneously detected, while if AUC th1 is too large, small reactions in sample 1 and sample 3 cannot be detected. From the above results, AUC th1 was determined to be 255, that is, about 1.5 times the maximum value of the initial reaction part (168 in sample 5).
  • Example 3 Real-time detection of true coagulation reaction-2 (low threshold, with detection exclusion range) From the results of Example 1, it was confirmed that the peak of the initial reaction appeared in the early stage of measurement. Therefore, although a reaction smaller than that of the sample 1 of Example 1 can be detected, Vmax real-time detection is performed under the condition that the reaction is not detected in the section where the initial reaction is expected to appear (low threshold value, step S13 is present). bottom. Specifically, real-time detection of Vmax was carried out under the same conditions as in Example 2 except that the following was changed. AUC th1 : 100 Detection exclusion area (step S13): Yes. Vmax is detected only when cVmaxT (i) is 50 (5 seconds) or later.
  • FIG. 10 is a plot of the time (Fix) at which Vmax was detected in this example with respect to VmaxT measured in Example 1. Since all Fixes were slower than VmaxT, it was confirmed that the true reaction could be detected correctly by the procedure of this example. Further, from the results of this example, it was shown that by setting the detection exclusion region (step S13), the true reaction can be correctly detected even in a sample having a small reaction.
  • Example 4 Real-time detection of true coagulation reaction-3 (high threshold, with offline detection) Assuming that an initial reaction larger than that of Samples 4 to 9 of Example 1 appears, AUC th1 higher than that of Examples 2 and 1) was set. It was predicted that by increasing AUC th1 , some specimens (eg, specimen 1) would not be able to detect a true reaction by the procedure of FIG. Therefore, the procedure of FIG. 11 was incorporated from S24 of FIG. 6 to the end. Specifically, real-time detection of Vmax was carried out under the same conditions as in Example 2 except that the following was changed.
  • AUC th1 510 AUC th2 : 100 Perform the following procedure in S24: S31: Determining whether the maximum values AUC pre Max and AUC post Max of AUC pre (i) and AUC post (i) both exceed the threshold value AUC th2 S32: Time to become AUC pre Max when S31 is satisfied (AUC) Determining whether preMaxT ) is the same time as cVmaxT (i) and the time (AUC post MaxT ) becomes cVmaxT (i) or later S33: When S32 is satisfied, cVmax (i) is detected as Vmax.
  • Vmax was detected in 12 samples including the sample 1 having the smallest Pmax via S24, and Vmax was detected in all the other samples without passing through S24.
  • FIG. 12 shows the temporal change of the parameters calculated when the procedure of this example was performed on the sample 1. As shown in FIGS. 12B to 12D, cVmaxT (i) was maximized at the true maximum time VmaxT, AUC pre (i) was maximized at VmaxT, and AUC post (i) was maximized after VmaxT. .. It was confirmed that Vmax correctly detected the maximum value of the true reaction in 12 samples including the sample 1 detected via S24.

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Abstract

血液凝固反応の検出方法であって、該方法は、１）被検血液検体の血液凝固反応を計測して、最新の計測点までの凝固反応の一次微分Ｖ（ｉ）を求めること；２）Ｖ（ｉ）の最大値ｃＶｍａｘ（ｋ）をＶ（ｉ）のピークトップとして、Ｖ（ｉ）のピーク前及びピーク後の曲線下面積（ＡＵＣ）を求めること；３）該ピーク前ＡＵＣ及びピーク後ＡＵＣがいずれも第１の閾値ＡＵＣth1又はそれ以上であってかつそれぞれ一定値であり続けた期間Ｌが、所定の長さに達したときに、ｃＶｍａｘ（ｋ）をＶ（ｉ）の真の最大値Ｖｍａｘとして検出すること、を含む方法。

Description

血液凝固反応の検出方法
　本発明は、血液凝固反応の検出方法に関する。
　血液凝固検査は、患者の血液検体に所定の試薬を添加して血液凝固時間等を測定することにより、患者の血液凝固能を診断するための検査である。血液凝固時間の典型的な例としては、プロトロンビン時間（ＰＴ）、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）、トロンビン時間などがある。血液凝固能の異常は、凝固時間の延長を引き起こす。凝固時間の延長が生じる原因としては、凝固阻害薬剤の影響、凝固関与成分の減少、先天的な血液凝固因子の欠乏、凝固反応を阻害する自己抗体の後天的な出現などが挙げられる。
　近年では、血液凝固反応の自動計測を行う自動分析装置が汎用されており、血液凝固検査を簡便に実施することが可能である。例えば、ある種の自動分析装置では、血液検体に試薬を添加して得られる混合液に光を当て、得られた散乱光量の変化に基づいて該血液検体の凝固反応を計測する。通常の血液凝固反応では、試薬添加からある程度の時間が経過した時点で、凝固反応の進行により散乱光量が急激に上昇し、その後、凝固反応が終了に近づくとともに散乱光量は飽和してプラトーに達し、散乱光量が最大となる時点が凝固反応の終了時点である。このような散乱光量の時間的変化に基づいて血液凝固時間を算出することができる。一方、分析装置での測光データには、装置、試薬、検体の状態などに起因する様々なノイズが含まれる。例えば、血液検体に試薬を添加した後、本来の凝固反応により散乱光量が上昇する前の反応初期に、散乱光量の微妙な増大が計測されることがあり、この現象は初期反応、プレピークなどと呼ばれる（特許文献１、２）。初期反応などの測光データのノイズは、凝固時間の誤算出をもたらし得る。
　血液凝固反応の自動計測において、初期反応又はプレピークの影響を除外する手法が提案されている。例えば、予め計測時間や計測値に閾値を設定して、計測した時間やデータが閾値に達した後の反応を真の凝固反応とみなして凝固時間の算出プロセスを行う手法がある。また前述の特許文献１には、凝固反応の計測開始から反応終了までの間の少なくとも１つのチェックポイントまたはチェック領域における、凝固反応による光学的変化の量や速度などを監視することによって、初期反応を検出することを特徴とする血液凝固反応解析方法が開示されている。特許文献２には、散乱光量の計測と、計測した散乱光量が凝固反応終了点の１／Ｎに達した時点を凝固時間として算出する工程とを、算出した凝固時間が正常と判断されるまで繰り返すことを特徴とする、血液凝固分析方法が開示されている。
　自動分析装置による凝固時間の算出法としては、パーセント検出法、微分法などいくつかの手法が用いられている。例えば、パーセント検出法では、凝固反応終了まで散乱光量を計測した後、該凝固反応終了時の光量（最大散乱光量）のＸ％（例えば５０％）到達点を凝固時間として検出する。パーセント検出法は、低フィブリノーゲン検体、乳び検体、溶血検体などの異常検体でも凝固時間の正確な算出を可能にする。またパーセント検出法は、凝固反応終了まで散乱光量を計測することで、ノイズではない真の凝固反応を検出することができるので、前述した初期反応による凝固時間の誤算出を防止することができる。一方で、パーセント検出法では、凝固時間が延長した異常検体を含む様々な血液検体で凝固反応終了を検出可能にするために、１検体を数分間計測した後、凝固時間を算出する。しかし、血液検体の多くを占める正常検体では、そのような長い計測時間は必要ない。
　特許文献３には、分析装置からリアルタイムに得られる散乱光量データを平滑化及び原点調整して基準データＸとし、該基準データから、更にこれを積分した基準積分データＹと、前記基準データの各隣り合う微小時間での積算値の比である基準比データＺとを演算し、該基準比データＺが予め定めた一定の基準比データ値Ｚｓになる時点のうち、該基準比データＺのピーク以降の時点で且つ該基準積分データＹが予め定めた閾値Ｙｓ以上となる時点における基準データ値Ｘｄを選出し、該Ｘｄの１／Ｎ（Ｎは１以上の一定整数）の値が対応する時点までの混合時点からの時間を凝固時間とする血液凝固時間測定方法が記載されている。
特開２００３－１６９７００号公報 特開２０１０－２１７０５９号公報 特開平６－２４９８５５号公報
　本発明は、血液凝固反応計測中にリアルタイムに真の凝固反応を検出することができる、血液凝固反応の検出方法を提供する。
　すなわち、本発明は、以下を提供する。
〔１〕血液凝固反応の検出方法であって、
１）被検血液検体の血液凝固反応を計測して、最新の計測点までの凝固反応の一次微分Ｖ（ｉ）を取得すること、ここでｉは計測点又は時間を表し、ｉ＝ｋ0～ｋであり、ｋは最新のＶ（ｉ）についての最も遅い計測点又は時間を表し、ｋ0はｋ0≦ｋである任意の計測点又は時間を表す、
２）ｋまでのＶ（ｉ）の最大値ｃＶｍａｘ（ｋ）をＶ（ｉ）のピークトップとして、Ｖ（ｉ）のピーク前及びピーク後の曲線下面積（ＡＵＣ）を算出すること、
３）該ピーク前ＡＵＣ及びピーク後ＡＵＣがいずれも第１の閾値ＡＵＣth1又はそれ以上であってかつそれぞれ一定値であり続けた期間Ｌが、所定の長さに達したときに、ｃＶｍａｘ（ｋ）をＶ（ｉ）の真の最大値Ｖｍａｘとして検出すること、
を含む、方法。
〔２〕〔１〕記載の方法であって、
　前記２）が、ｃＶｍａｘ（ｋ）、ｃＶｍａｘＴ（ｋ）、ＡＵＣpre（ｋ）、及びＡＵＣpost（ｋ）を算出することを含み、ここで
　　ｃＶｍａｘ（ｋ）はＶ（ｉ）（ｉ＝ｋ0～ｋ）の最大値を表し、
　　ｃＶｍａｘＴ（ｋ）はＶ（ｉ）＝ｃＶｍａｘ（ｋ）となる計測点又は時間を表し、
　　ＡＵＣpre（ｋ）は、ｋでのピーク前ＡＵＣであって、ｋ1からｃＶｍａｘＴ（ｋ）までのＶ（ｉ）のＡＵＣを表し、
　　ＡＵＣpost（ｋ）は、ｋでのピーク後ＡＵＣであって、ｃＶｍａｘＴ（ｋ）からｋ2までのＶ（ｉ）のＡＵＣを表し、
　　ｋ1は、ｃＶｍａｘＴ（ｋ）以前にＶ（ｉ）≦ｃＶｍａｘ（ｋ）×Ｈｒ％となる計測点又は時間のうち最も遅い計測点又は時間であり、
　　ｋ2は、ｃＶｍａｘＴ（ｋ）以後にＶ（ｉ）≦ｃＶｍａｘ（ｋ）×Ｈｒ％を満たす計測点又は時間のうち最も早い計測点又は時間であり、
　　０＜Ｈｒ＜１００であり；
かつ、該方法が、
　前記３）で真の最大値Ｖｍａｘを検出しなかった場合に、ｋ＝ｋ＋ｘ（ｘ＞０）として、前記１）～３）を繰り返すこと、
を含む、方法。
〔３〕前記３）が、
　ＡＵＣpre（ｋ）及びＡＵＣpost（ｋ）がいずれもＡＵＣth1またはそれ以上であって、
かつＡＵＣpre（ｋ）＝ＡＵＣpre（ｋ－ｘ）、及びＡＵＣpost（ｋ）＝ＡＵＣpost（ｋ－ｘ）であった場合はＬ＝Ｌ＋１とし、そうでない場合はＬ＝０とすること；
　Ｌが所定値に達した場合に、ｃＶｍａｘ（ｋ）をＶ（ｉ）の真の最大値Ｖｍａｘとして検出すること、
を含む、〔２〕記載の方法。
〔４〕１０≦Ｈｒ≦７０である、〔２〕又は〔３〕記載の方法。
〔５〕前記３）において、ｃＶｍａｘ（ｋ）となる計測点又は時間が検出除外域に含まれている場合にＶｍａｘを検出しない、〔１〕～〔４〕のいずれか１項記載の方法。
〔６〕真の最大値Ｖｍａｘを検出することなくｋが計測終了点又は時間を超えた場合に、ｋでのピーク前ＡＵＣが第１の閾値ＡＵＣth1又はそれ以上であれば、ｃＶｍａｘ（ｋ）をＶ（ｉ）の真の最大値Ｖｍａｘとして検出することをさらに含む、〔１〕～〔５〕のいずれか１項記載の方法。
〔７〕真の最大値Ｖｍａｘを検出することなくｋが計測終了点又は時間を超えた場合に、ｋでのピーク前ＡＵＣ及びピーク後ＡＵＣがいずれも第２の閾値ＡＵＣth2又はそれ以上であり、ピーク前ＡＵＣが最大である計測点又は時間がｃＶｍａｘ（ｋ）となる計測点又は時間と同じであり、かつピーク後ＡＵＣが最大である計測点又は時間がｃＶｍａｘ（ｋ）となる計測点又は時間よりも遅い場合、ｃＶｍａｘ（ｋ）をＶ（ｉ）の真の最大値Ｖｍａｘとして検出することをさらに含む、〔１〕～〔６〕のいずれか１項記載の方法。
〔８〕前記最新の計測点までの凝固反応を反応Ｐ（ｉ）として求めることをさらに含む、〔１〕～〔７〕のいずれか１項記載の方法。
〔９〕前記Ｐ（ｉ）又はＶ（ｉ）に基づいて前記被検血液検体の血液凝固時間を算出することをさらに含む、〔８〕記載の方法。
〔１０〕ｉ≧ｋ1である、〔９〕記載の方法。
　本発明の方法によれば、血液凝固反応計測における初期反応などのノイズの誤検出を防ぎ、計測中にリアルタイムに真の凝固反応を正しく検出することができる。本発明の方法によれば、真の凝固反応に基づく凝固時間を正しく算出することができる。また本発明の方法によるリアルタイムな真の凝固反応検出は、１つの血液検体の凝固時間算出に必要なデータを取得できたところで該検体の計測を止め、次の血液検体の計測に移行することを可能にする。したがって本発明の方法によれば、１つの血液検体にかかる計測時間を短縮して、血液凝固検査の効率を向上させることができる。
凝固反応計測データの一例。 ｃＶｍａｘ（ｋ）、ｃＶｍａｘＴ（ｋ）、ＡＵＣpre（ｋ）及びＡＵＣpost（ｋ）を説明する概念図。 凝固反応進行に伴うＡＵＣpre（ｋ）及びＡＵＣpost（ｋ）の変化。Ａ：凝固反応進行度。Ｂ：ＡＵＣpre（ｋ）及びＡＵＣpost（ｋ）の時間的変化。 初期反応を有する凝固反応。Ａ：初期反応と真の反応のＶ（ｉ）のピーク前ＡＵＣ及びピーク後ＡＵＣ、Ｂ：初期反応の拡大図。 初期反応を有する及び有さない凝固反応。 本発明の方法の手順の一実施形態を説明するフローチャート。 凝固能の異なる３つの被検検体の凝固反応。 本発明による血液凝固反応の検出方法を行うための自動分析装置の構成を示す概念図。 凝固反応から算出したパラメータ間の関係性。 実施例１で測定したＶｍａｘＴに対する、実施例３でＶｍａｘを検出した時間（Ｆｉｘ）のプロット。 実施例４で用いたＶｍａｘ検出手順のフローチャート。 実施例４において検体１から算出されたパラメータの時間的変化。
　血液凝固検査では、血液検体に所定の試薬を添加してその後の血液凝固反応を計測し、該凝固反応から血液凝固時間を算出する。本明細書において、血液検体を単に検体と称する場合がある。血液凝固反応の計測には、一般的な手段、例えば、散乱光量、透過度、吸光度等を計測する光学的な手段、又は血漿の粘度を計測する力学的な手段などが用いられる。血液凝固反応は、一般的に、凝固反応量の経時的変化を示す凝固反応曲線で表される。凝固異常要因のない正常検体の凝固反応曲線は、計測手段に依存するが、基本的にはシグモイド形状を示す。例えば、図１に示すように、正常検体の散乱光量に基づく凝固反応曲線は、通常、試薬添加からある程度の時間が経過した時点で凝固の進行により急激に上昇し、その後、凝固反応が終了に近づくとともにプラトーに達する。一方で、凝固異常要因を有する異常検体の凝固反応曲線は、曲線の立ち上がり時間の遅れ、緩やかな上昇など、異常原因に依存して様々な形状を示す。
　検体の血液凝固時間の測定においては、凝固反応終了まで、すなわち凝固反応曲線がプラトーに達するまでデータを集め、そのデータを基にして凝固時間を算出することができる。例えば、パーセント検出法では、反応開始から反応終了までの反応量を１００％として、反応量が所定値（例えば５０％）に到達するまでの時間を凝固時間として算出することができる。あるいは、凝固反応曲線の変化率、例えば、凝固反応速度のピーク（いわゆる微分法）、又は微小時間帯での凝固反応の積算値の経時的変化（特許文献３参照）などに基づいて凝固時間を算出することができる。しかしながら、パーセント検出法は、凝固時間が延長した異常検体を含む様々な血液検体で凝固反応終了までの散乱光量を計測することを可能にするために、１検体あたりの計測時間を充分長く設定する必要があり、そのため分析効率は高くない。一方、後者の方法では、凝固反応終了前に凝固時間を算出することができるためより短時間での凝固時間算出が可能であるが、ノイズの影響により不正確な凝固時間が算出されることがある。
　凝固反応計測では、計測初期での機器ノイズや初期反応等の初期ノイズに起因して、早過ぎる時点で凝固反応が検出されることがある。このような凝固反応の誤検出は、不正確な凝固時間の算出につながる。早過ぎる時点での凝固反応の誤検出を防止するため、予め計測時間や計測値に閾値を設定して、計測した時間やデータが閾値に達した後の反応を真の凝固反応とみなして凝固時間の算出プロセスを行う手法がある。しかし、閾値を高く設定しすぎると、特に凝固反応が小さい異常検体で、真の凝固反応を検出できないことがあり、一方、閾値を下げるとノイズの誤検出の可能性が高まる。
　血液凝固反応計測において、初期反応などのノイズを誤検出することなく、真の凝固反応を正しく検出して、正確に凝固時間を算出することが望まれる。また、凝固反応終了を検出してから凝固時間を算出する従来の血液凝固反応分析方法は、凝固時間の正確な算出が可能であるが、１検体あたりの計測時間が長いため分析効率は低い。ノイズの誤検出を防ぎつつも、１検体あたりの計測時間を短縮化して血液検体の分析効率を向上させることができればより好ましい。
〔１．血液凝固反応の検出方法〕
　本発明は、血液凝固反応の検出方法を提供する。本発明による血液凝固反応の検出方法（以下、本発明の方法ともいう）は、代表的には、以下を含む：
１）被検血液検体の血液凝固反応を計測して、最新の計測点までの凝固反応の一次微分Ｖ（ｉ）を取得すること、ここでｉは計測点又は時間を表し、ｉ＝ｋ0～ｋであり、ｋは最新のＶ（ｉ）についての最も遅い計測点又は時間を表し、ｋ0はｋ0≦ｋである任意の計測点又は時間を表す；
２）ｋまでのＶ（ｉ）の最大値ｃＶｍａｘ（ｋ）をＶ（ｉ）のピークトップとして、Ｖ（ｉ）のピーク前及びピーク後の曲線下面積（ＡＵＣ）を算出すること、
３）該ピーク前ＡＵＣ及びピーク後ＡＵＣがいずれも第１の閾値ＡＵＣth1又はそれ以上であってかつそれぞれ一定値であり続けた期間Ｌが、所定の長さに達したときに、ｃＶｍａｘ（ｋ）をＶ（ｉ）の真の最大値Ｖｍａｘとして検出すること。
　本発明の方法では、被検血液検体（以下、被検検体ともいう）の血液凝固反応を計測しながら、該計測で得られた凝固反応の時系列データからリアルタイムに真の凝固反応（以下、真の反応ともいう）が検出される。本発明の方法は、血液凝固反応計測中に、初期反応などのノイズの誤検出を防ぎ、真の反応を正しく検出することを可能にする。得られた真の反応に基づいて、該被検検体の血液凝固時間を算出することができる。本発明の方法によれば、初期反応などのノイズに影響されることなく、凝固時間を正確に算出することができる。また本発明によれば、正常検体や異常検体を含む様々な血液検体に対して、それぞれの凝固時間算出に必要最低限な凝固反応計測時間が適用されるように、計測時間を最適化することができる。
　本発明に従って算出することができる血液凝固時間の例としては、プロトロンビン時間（ＰＴ）、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）、フィブリノーゲン（Ｆｂｇ）濃度測定での凝固時間などが挙げられる。以下の本明細書においては、主に、凝固時間として活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）を例に挙げて本発明の方法を説明する。その他の凝固時間（例えばプロトロンビン時間（ＰＴ））への本発明の方法の変更は、当業者であれば実施可能である。
　以下に、本発明の方法の手順について詳細に説明する。
　本発明の方法において、被検検体としては、被検者の血漿が好ましく用いられる。該検体には、凝固検査に通常用いられる抗凝固剤が添加され得る。例えば、クエン酸ナトリウム入り採血管を用いて採血した後、遠心分離することで血漿が得られる。
　血液凝固反応の計測においては、被検検体に凝固時間測定試薬が添加され、血液凝固反応が開始される。該試薬と被検検体を含む混合液の凝固反応が計測され得る。使用される凝固時間測定試薬は、測定目的に合わせて任意に選択することができる。各種凝固時間測定のための試薬は市販されている（例えば、ＡＰＴＴ試薬コアグピア　ＡＰＴＴ－Ｎ；積水メディカル株式会社製）。凝固反応の計測には、一般的な手段、例えば、散乱光量、透過度、吸光度等を計測する光学的な手段、又は血漿の粘度を計測する力学的な手段などを用いればよい。以下の本明細書では、散乱光量に基づく凝固反応計測を例として本発明の方法を説明する。
　凝固反応の反応開始時点は、典型的には、検体に試薬を混合して凝固反応を開始させた時点として定義され得るが、他のタイミングが反応開始時点として定義されてもよい。凝固反応の計測を継続する時間は、例えば、検体と試薬との混合の時点から数十秒～８分程度であり得る。この計測時間は、各検体の真の凝固反応を検出した時点までとしてもよいが、その他の任意の条件を満たす時点まででもよく、又は任意に定めた固定の値でもよい。該計測時間の間、所定の間隔で凝固反応の進行状況の計測（光学的に検出する場合は測光）が繰り返し行われ得る。例えば、０．１秒間隔で計測が行われればよい。該計測中の混合液の温度は、通常の条件、例えば３０℃以上４０℃以下、好ましくは３５℃以上３９℃以下である。また、計測の各種条件は、被検検体や試薬、計測手段等に応じて適宜設定され得る。
　上述の凝固反応計測における一連の操作は、自動分析装置を用いて行うことができる。自動分析装置の一例として、血液凝固自動分析装置ＣＰ３０００（積水メディカル株式会社製）が挙げられる。あるいは、一部の操作が手作業で行われてもよい。例えば、被検検体の調製を人間が行い、それ以降の操作は自動分析装置で行うことができる。
　本発明の方法の工程１）では、被検検体の血液凝固反応を計測して、最新の計測点までの凝固反応の一次微分Ｖ（ｉ）を取得する。
　まず、上述した凝固反応計測により、計測データＤ（ｉ）（散乱光量の測光値）が逐次取得される。ここで「ｉ」は、計測点、すなわち計測開始から何番目に計測された点であるかを表す。あるいは「ｉ」は、凝固反応開始からの時間（単に時間ともいう）を表す。例えば、計測（測光）間隔が０．１秒であれば、時間＝０．１×ｉで表される。
　次いで、計測データＤ（ｉ）から反応Ｐ（ｉ）が取得される。計測データＤ（ｉ）には、測光時のノイズや、測光開始直後に出現する反応とは無関係の変動が含まれているため、該計測値に対して、公知の方法で平滑化処理を行うことが好ましい。また凝固反応を散乱光量で測光する場合は、反応前の検体混合液由来の散乱光量を差し引くゼロ点調整処理を行うことが好ましい。計測データの平滑化処理には、ノイズ除去に関する種々の公知の方法の何れかが用いられ得る。例えば、平滑化処理としては、フィルタリング処理、又は差分値や後述する区間内平均傾きの演算等により微分値を求めた後それを積分する処理、などが挙げられる。ゼロ点調整では、例えば、平滑化した計測データを計測開始時点での値が０となるように調整すればよい。好ましくは、計測データＤ（ｉ）は平滑化又はゼロ点調整されて、反応Ｐ（ｉ）が取得される。より好ましくは、計測データＤ（ｉ）は平滑化及びゼロ点調整されて、反応Ｐ（ｉ）が取得される。反応Ｐ（ｉ）は、凝固反応曲線を構成する。
　求めた反応Ｐ（ｉ）から、その一次微分Ｖ（ｉ）を取得する。Ｐ（ｉ）からＶ（ｉ）を求める微分処理は任意の手法にて実施することができ、例えば、区間内平均傾き値の算出により行われ得る。区間内平均傾き値の算出では、各計測点ｉの前後の一定数の計測点、例えば、ｉ－Ｋからｉ＋Ｋまでの２Ｋ＋１個の計測点が利用され得る。ここで、Ｋは任意の整数である。例えば、Ｋが２のとき、ｉ－２，ｉ－１，ｉ，ｉ＋１，ｉ＋２番目の５点の計測点が利用され得る。平均傾き値は、これら複数の計測点を直線近似したときの傾き値を意味する。直線近似の演算方法には、最小二乗法などの定法が利用され得る。これらの計測点の平均傾き値が、計測点ｉでの一次微分とみなされ得る。一次微分Ｖ（ｉ）は、凝固反応の速度を表す曲線を構成する。
　本発明の方法で用いるＶ（ｉ）は、任意の計測点又は時間から最新の計測点又は時間までの凝固反応Ｐから算出された一次微分値であればよい。したがって、本発明の方法で用いるＶ（ｉ）は、凝固反応計測の進行とともに伸長する曲線を構成し得る。具体的には、本発明の方法では、ｉ＝ｋ0～ｋでのＶ（ｉ）が取得され得る。ｋは最新のＶ（ｉ）についての最も遅い計測点又は計測時間を表す。よってｋは、凝固反応計測の進行とともに増加する。なお「最新のＶ（ｉ）」とは、最新の計測点又は時間での凝固反応Ｐを用いてもっとも最近に算出されたＶ（ｉ）をいう。このＶ（ｉ）に対する計測点又は時間の中で最も遅いものが、「Ｖ（ｉ）についての最も遅い計測点又は時間」である。例えば、Ｖ（ｉ）が計測後１秒～１００秒までの凝固反応速度データであれば、１００秒は該Ｖ（ｉ）についての「最も遅い計測時間」である。ｋ0は、ｋ以前の任意の計測点又は時点を表す（すなわちｋ0≦ｋ）。ｋ0は、工程２）に示す真の反応の検出プロセスが開始される計測点又は時点を表し、本明細書において検出開始点（又は検出開始時間）とも呼ばれる。ｋ0は、Ｄ（ｉ）の平滑化処理によるＰ（ｉ）の取得、又はＰ（ｉ）の微分によるＶ（ｉ）の取得が可能な点以降の計測点又はそれに対応する時間であり、よって基本的には計測点ｋ0は２以上である。例えば、上述した５点の計測点を用いた区間内平均傾き法を行う場合、計測点ｋ0は３以上である。また例えば、平滑化処理又は微分処理に２０点の計測点を用いる場合、計測点ｋ0は２１以上である。
　一実施形態において、ｋ0は、計測初期に設定される検出除外域より後の計測点又は時間である。検出除外域は、計測初期における真の反応が発生し得ない計測域又は時間域に相当する。好ましくは、検出除外域は、標準的なＡＰＴＴ計測の条件下では、計測開始から１０秒程度の時間域又はそれに対応する計測域として設定され、このとき時間ｋ0は１０秒より大きい。ＰＴ計測の場合も同様である。Ｆｂｇ濃度測定のための計測条件下では、検出除外域は計測開始から３～４秒程度の時間域又はそれに対応する計測域として設定され、このとき時間ｋ0は３秒より大きい。検出除外域を設定することによって、計測初期に発生するノイズを真の反応の検出プロセスから除外することができる。
　別の一実施形態において、ｋ0は、Ｖ（ｉ）が最初に閾値Ｖthに達した計測点又は時間である。閾値Ｖthを設定することによって、凝固反応に混じる微小なノイズを真の反応の検出プロセスから除外することができる。
　本発明の方法の工程２）では、工程１）で取得したＶ（ｉ）のピーク前及びピーク後の曲線下面積（ＡＵＣ）を算出する。
　該ピーク前ＡＵＣ及びピーク後ＡＵＣの算出には、工程１）で取得した計測点又は時間ｋまでのＶ（ｉ）の最大値をピークトップとするＶ（ｉ）のピークが用いられる。ｋでのＶ（ｉ）の最大値を、以下の本明細書においてｃＶｍａｘ（ｋ）という。ｃＶｍａｘ（ｋ）はｋに依存して変動し得る。したがって、ピーク前ＡＵＣ及びピーク後ＡＵＣもｋに依存して変動し得、よってそれぞれ本明細書において、ｋの変数ＡＵＣpre（ｋ）、及びＡＵＣpost（ｋ）として表される。
　好ましくは、工程２）では、ｃＶｍａｘ（ｋ）、ｃＶｍａｘＴ（ｋ）、ＡＵＣpre（ｋ）、及びＡＵＣpost（ｋ）を算出する。
　ｃＶｍａｘ（ｋ）は、工程１）で取得した計測点又は時間ｋまでのＶ（ｉ）の最大値、すなわちＶ（ｉ）（ｉ＝ｋ0～ｋ）の最大値である。
　ｃＶｍａｘＴ（ｋ）はＶ（ｉ）＝ｃＶｍａｘ（ｋ）となる計測点又は時間を表す。
　ＡＵＣpre（ｋ）及びＡＵＣpost（ｋ）は、それぞれ、上述したｋでのピーク前ＡＵＣ及びピーク後ＡＵＣである。ＡＵＣpre（ｋ）は、ｋ1からｃＶｍａｘＴ（ｋ）までのＶ（ｉ）のＡＵＣを表し、ＡＵＣpost（ｋ）は、ｃＶｍａｘＴ（ｋ）からｋ2までのＶ（ｉ）のＡＵＣを表し、ここで、ｋ1は、ｃＶｍａｘＴ（ｋ）以前にＶ（ｉ）≦ｃＶｍａｘ（ｋ）×Ｈｒ％となる計測点又は時間のうち最も遅い計測点又は時間であり、ｋ2は、ｃＶｍａｘＴ（ｋ）以後にＶ（ｉ）≦ｃＶｍａｘ（ｋ）×Ｈｒ％を満たす計測点又は時間のうち最も早い計測点又は時間である。したがって、基本的にはｋ1≦ｋ2であり、またＶ（ｉ）のピークの立ち上がりからピークトップまではＡＵＣpost（ｋ）＝０である。ｋ1及びｋ2は、それぞれ、ＡＵＣpre（ｋ）の算出の始点、及びＡＵＣpost（ｋ）の算出の終点である。Ｈｒは、高さ比であり、ＡＵＣpre（ｋ）及びＡＵＣpost（ｋ）の算出に用いられるＶ（ｉ）の始点又は終点の高さを決定する。Ｈｒは、０より大きく１００未満（０＜Ｈｒ＜１００）、好ましく１０≦Ｈｒ≦７０の範囲の任意の値に設定される。
　図２を参照して、ｃＶｍａｘ（ｋ）、ｃＶｍａｘＴ（ｋ）、ＡＵＣpre（ｋ）、及びＡＵＣpost（ｋ）について説明する。図２には、凝固反応曲線の一次微分Ｖ（ｉ）が、時間に対してプロットされている。図２の場合、計測点ｋでは、Ｖ（ｉ）のピークトップが最大値ｃＶｍａｘ（ｋ）であり、そのときの時間がｃＶｍａｘＴ（ｋ）である。Ｖ（ｉ）の曲線下にｃＶｍａｘ（ｋ）×Ｈｒ％を示すライン（基線）が引かれている。Ｖ（ｉ）ｃＶｍａｘ（ｋ）×Ｈｒ％となる時点（Ｖ（ｉ）と基線との交点）は２つ存在し、その一方はｃＶｍａｘＴ（ｋ）よりも前に存在するｋ1であり、もう一方はｃＶｍａｘＴ（ｋ）よりも後に存在するｋ2である。ｋ1及びｋ2は、それぞれ基線の始点及び終点に相当する。Ｖ（ｉ）のピーク前、すなわちｋ1からｃＶｍａｘＴ（ｋ）までのＡＵＣがＡＵＣpre（ｋ）であり、Ｖ（ｉ）のピーク後、すなわちｃＶｍａｘＴ（ｋ）からｋ2までのＡＵＣがＡＵＣpost（ｋ）である。
　凝固反応進行に伴うＡＵＣpre（ｋ）及びＡＵＣpost（ｋ）の変化を、図３を参照して説明する。図３Ａに示すように、Ｖ（ｉ）を横軸方向（反応進行）に沿って下記Ｔ１～Ｔ４の４つの区間に分けた。基線として、Ｖ（ｉ）のピークトップＶｍａｘのＨｒ％を表すラインを設定した。最大点は、Ｖ（ｉ）＝Ｖｍａｘの時間である。ｉ、ｋは時間を表す。
　Ｔ１：反応の立上り点まで
　Ｔ２：立上り点から最大点まで
　Ｔ３：最大点から基線終点まで
　Ｔ４：基線終点以降
　表１に、Ｔ１～Ｔ４でのｃＶｍａｘ（ｋ）、ＡＵＣpre（ｋ）及びＡＵＣpost（ｋ）の挙動を示す。Ｔ１で示される凝固反応開始前では、ＡＵＣpre（ｋ）及びＡＵＣpost（ｋ）はともに０である。Ｔ２で示されるＶ（ｉ）の上昇部では、ｃＶｍａｘ（ｋ）はｋとともに増加し、すなわちｃＶｍａｘ（ｋ）＝Ｖ（ｋ）であり、そのためＡＵＣpre（ｋ）もｋとともに増加し、一方、ピーク後領域は存在しないためＡＵＣpost（ｋ）は０である。Ｔ３は、Ｖ（ｉ）が真の最大値Ｖｍａｘに達した後減少する時期であり、ｃＶｍａｘ（ｋ）はＶｍａｘのまま一定であり、そのためＡＵＣpre（ｋ）も一定であり、一方、ピーク後領域ＡＵＣpost（ｋ）はｋとともに増加する。Ｔ４は、Ｖ（ｉ）が基線終点（ｋ2）を過ぎた後の時期であり、ＡＵＣpre（ｋ）、ＡＵＣpost（ｋ）はともに一定である。図３ＢにＡＵＣpre（ｋ）及びＡＵＣpost（ｋ）の時間的変化をＶ（ｉ）とともに図示する。
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　図４には、初期反応を有する凝固反応における、初期反応と真の反応のＶ（ｉ）のピーク前ＡＵＣ及びピーク後ＡＵＣを例示する。図４Ａは、初期反応と真の反応を含む凝固反応全体のＶ（ｉ）を示し、図４Ｂは初期反応のＶ（ｉ）の拡大図である。Ｖ（ｉ）は反応直後に急激に増加して初期反応の小さなピークを形成した後、緩やかに減少して０に近づく。初期反応のピーク前ＡＵＣ（ＡＵＣpre）及びピーク後ＡＵＣ（ＡＵＣpost）は、その後に続く真の反応のそれに比べて小さい。
　このように、凝固反応の進行に応じてＡＵＣpre（ｋ）及びＡＵＣpost（ｋ）は変化する。したがって、ＡＵＣpre（ｋ）及びＡＵＣpost（ｋ）に基づいて凝固反応の進行状況を把握することができる。
　さらに、ＡＵＣpre（ｋ）及びＡＵＣpost（ｋ）に基づいて、凝固反応における初期反応等の初期ノイズと真の反応を区別することができる。図５には、初期反応を有する及び有さない凝固反応の例を示す。各行の各図は、左から反応Ｐ、ｃＶｍａｘ（ｋ）×Ｈｒ％を示す基線Ｂｈ、ＡＵＣpre及びＡＵＣpostの時間による変化を示す。各図にはそれぞれ一次微分Ｖが一緒に示されている。凝固反応が初期反応を有さない場合（上段）、Ｂｈ及びＡＵＣpreはＶの上昇とともに上昇し、Ｖがピークトップ（Ｖｍａｘ）に達した以降は一定である。一方、ＡＵＣpostはＶがＶｍａｘに達した以降に上昇し、ＶがＢｈ以下になるとき以降は一定である。凝固反応が初期反応を有する場合（中段及び下段）、Ｂｈは初期反応のときと真の反応のときの２段階で上昇する。ＡＵＣpre及びＡＵＣpostは、初期反応のときに一旦上昇し、真の反応の出現によるＢｈのシフトに応じて再び上昇し、その後一定になる。
　このように、初期反応等の初期ノイズでも真の反応でも、Ｖ（ｉ）がピークトップに達するとＡＵＣpre（ｋ）は一定になり、続いてＡＵＣpost（ｋ）も一定になることがある。しかし、初期ノイズで出現するＶ（ｉ）のピークは高さも幅も比較的小さいため、ＡＵＣpre（ｋ）もＡＵＣpost（ｋ）も比較的小さい値にとどまる。また初期ノイズのピークに対するＡＵＣpre（ｋ）及びＡＵＣpost（ｋ）は、真の反応の出現によりリセットされるので、それらが一定値を保つ時間は長くない。
　したがって、該ピーク前ＡＵＣ及びピーク後ＡＵＣの値に基づいて、Ｖ（ｉ）から真の反応を検出することができる。本発明の方法では、該ピーク前ＡＵＣ及びピーク後ＡＵＣが所定の閾値を超えており、かつその状態が一定期間以上継続している場合に、該ピーク前ＡＵＣ及びピーク後ＡＵＣの算出に用いたピークを真の反応のピークとみなす。
　より詳細には、本発明の方法の工程３）では、工程２）で算出したＶ（ｉ）のピーク前ＡＵＣ及びピーク後ＡＵＣが、いずれも第１の閾値ＡＵＣth1又はそれ以上であってかつそれぞれ一定値であり続けた期間Ｌが、所定の長さに達したときに、ｃＶｍａｘ（ｋ）をＶ（ｉ）の真の最大値Ｖｍａｘとして検出する。Ｖｍａｘは、Ｖ（ｉ）における真の反応の最大値である。
　第１の閾値ＡＵＣth1は、ピーク前ＡＵＣ及びピーク後ＡＵＣに対して別々の値が設定されてもよいが、両者に共通の閾値が設定されればよい。ＡＵＣth1は、被検検体の凝固反応の大きさやノイズの大きさを考慮して適宜設定することができる。したがって、ＡＵＣth1は、凝固反応計測に使用する試薬や機器の種類に応じて適宜設定され得る。標準的なＡＰＴＴ計測の条件下では、ＡＵＣth1は、初期反応のピーク前ＡＵＣの最大値の約１．５～２．５倍、例えば２５０～４２０の範囲であることが好ましい。ＡＵＣth1をより小さく設定すれば、凝固反応の小さい検体からでもＶｍａｘを検出することが可能になるが、初期反応の誤検出のリスクが増大する。その場合、前述した検出除外域を設けておけば、初期反応の誤検出を防止することができる。一方、ＡＵＣth1をより大きく設定すれば、初期反応の誤検出を防止できるが、凝固反応の小さい検体でＶｍａｘの検出が難しくなる。その場合、後述の図１１に示すような手順を行うことで、凝固反応の小さい検体のＶｍａｘを検出することができる。
　Ｌは、ピーク前ＡＵＣ及びピーク後ＡＵＣがそれぞれ一定値であり続けた期間を表す。例えば、Ｌの初期値は０であり、計測点又は時間ｋでのピーク前ＡＵＣ及びピーク後ＡＵＣがいずれも前の算出値と同じであれば、Ｌ＝Ｌ＋１に増加し、一方、ピーク前ＡＵＣ及びピーク後ＡＵＣの一方又は両方が前の算出値と異なる（増加又は減少した）のであれば、Ｌ＝０にリセットされる。
　好ましくは、工程３）では、ＡＵＣpre（ｋ）及びＡＵＣpost（ｋ）がいずれもＡＵＣth1またはそれ以上であって、かつＡＵＣpre（ｋ）＝ＡＵＣpre（ｋ－ｘ）、及びＡＵＣpost（ｋ）＝ＡＵＣpost（ｋ－ｘ）であった場合はＬ＝Ｌ＋１とし、そうでない場合はＬ＝０とする。Ｌが所定値Ｌthに達した場合、ｃＶｍａｘ（ｋ）をＶ（ｉ）の真の最大値Ｖｍａｘとして検出する。ここで、Ｖ（ｉ）についての最新の計測点又は時間がｋ、前の計測点又は時間がｋ－ｘであり、ｘ＞０である。ｘは、前の算出値との比較を行うための時間枠に応じて適宜設定され得る。例えば、ｋが計測点数の場合、ｘ＝１として、最新のＡＵＣpre（ｋ）と１つ前の計測点で算出したＡＵＣpre（ｋ－１）を比較してもよく、又は、計算プロセスの迅速化のためにｘを２、３又はそれ以上に設定してもよい。ｋが時間の場合も同様である。Ｌthの値は適宜設定され得るが、標準的なＡＰＴＴ計測の条件下では、Ｌthは０．５～２秒の範囲であることが好ましい。
　初期反応等の初期ノイズの誤検出を除くため、真の反応が発生し得ない早すぎる計測域又は時間域（例えば、前述の検出除外域）に検出されたＶｍａｘをエラーとして除外することができる。この場合、検出されたＶｍａｘに対する時間（すなわちｃＶｍａｘＴ（ｋ））が検出除外域に含まれていれば、Ｖｍａｘは検出されなかったこととなる。検出除外域を設定する場合、ＡＵＣth1を比較的小さく設定することができるので、凝固反応の小さい検体からでも真の最大値Ｖｍａｘを検出することが可能になる。
　真の最大値Ｖｍａｘの検出は、計測点又は時間ｋで計測している反応が、初期反応等の初期ノイズではなく真の凝固反応であることを意味する。したがって、検出したＶｍａｘをピークトップとするＶ（ｉ）のピークは、真の反応のＶ（ｉ）であるとみなされる。Ｖｍａｘが検出される時点は、ＡＵＣpost（ｋ）が一定値になる点、つまりＶ（ｉ）が基線以下に低下した後であり、よってこの時点では凝固反応は終了段階に到達している。したがって、本発明の方法では、Ｖｍａｘが検出された時点以降で、凝固時間の算出に必要となる計測データを取得した後に被検検体の凝固反応計測を終了することができる。例えば、Ｖｍａｘが検出された時点で、被検検体の凝固反応計測を終了することができる。また例えば、Ｖｍａｘが検出された後、Ｖ（ｉ）が充分に下がった時点で、被検検体の凝固反応計測を終了することができる。計測終了までに計測した凝固反応、例えばＰ（ｉ）又はＶ（ｉ）を用いれば、被検検体の凝固時間を正確に算出することができる。
　一方、本発明の方法では、工程３）にて計測点又は時間ｋにおいて真の最大値Ｖｍａｘが検出されなかった場合、すなわち、ｋにおいて該ピーク前ＡＵＣ又はピーク後ＡＵＣがＡＵＣth1に達していないか、又はＬが所定の長さに達していない場合、凝固反応計測が継続され、再び工程１）～３）が繰り返される。好ましくは、ｋ＝ｋ＋ｘ（ｘは上述のとおり）として、工程１）～３）を繰り返す。Ｖｍａｘが検出されるか、又はｋが計測終了点又は時間（予め規定された被検検体の凝固反応計測が行われる最大の計測点又は時間）を超えない限り、この手順は繰り返される。Ｖｍａｘが検出されるか、又はｋが計測終了点又は時間を超えると、工程１）～３）の繰り返しプロセスは終了する。計測終了点又は時間は適宜設定することができ、標準的なＡＰＴＴ計測の条件下では、４分～８分の範囲であることが好ましい。
　本発明の一実施形態として、本発明の方法に従う真の凝固反応の検出のための手順を説明するフローチャートを図６に示す。
　Ｓ０１：設定値の設定（設定値：Ｈｒ，ＡＵＣth1，Ｌthなど）
　Ｓ０２：計測カウンタを「ｉ＝１」（初期値）に設定
　Ｓ０３：計測データＤ（ｉ）の取得
　Ｓ０４：反応Ｐ（ｉ）の演算が可能なときにＳ０５に進む（平滑化処理に所定個数のＤ（ｉ）が必要なため）
　Ｓ０５：Ｐ（ｉ）の演算
　Ｓ０６：一次微分Ｖ（ｉ）の演算が可能なときにＳ０７に進む（微分処理に所定個数のＰ（ｉ）が必要なため）
　Ｓ０７：Ｖ（ｉ）の演算
　Ｓ０８：ｃＶｍａｘ（ｉ）を設定（ｃＶｍａｘ（ｉ）となるｉをｃＶｍａｘＴ（ｉ）と設定）
　Ｓ０９：ｃＶｍａｘ（ｉ）に対する基線Ｂｈ（ｉ）(=ｃＶｍａｘ（ｉ）×Ｈｒ％)を算出
　Ｓ１０：ＡＵＣpre（ｉ）とＡＵＣpost（ｉ）を算出
　Ｓ１１：ＡＵＣpre（ｉ）とＡＵＣpost（ｉ）の両方が閾値ＡＵＣth1に適合するかを判定
　Ｓ１２：ＡＵＣpre（ｉ）とＡＵＣpost（ｉ）の両方が閾値ＡＵＣth1に適合し、かつ一定値を維持しているか（Ｌ≧Ｌthを満たすか）を判定
　Ｓ１３：本ステップは必須でない：ｃＶｍａｘＴ（ｉ）が検出除外域にあるか否かを判定
　Ｓ１４：ｃＶｍａｘＴ（ｉ）が検出除外域に含まれなかった場合は、ｃＶｍａｘ（ｉ）をＶ（ｉ）の真の最大値Ｖｍａｘ（真の反応の最大値）と決定する
　Ｓ２１：計測カウンタをカウントアップする
　Ｓ２２：計測カウンタが設定した計測時間を超えるかを判定し、超えていない場合はＳ０３に戻る
　Ｓ２３：計測カウンタが計測時間を超えた場合は、計測を終了してＶｍａｘの検出の有無を判定する
　Ｓ２４：得られた演算値を基にして、オフラインで計測データを評価する
　被検検体の凝固能が低い場合、計測終了点又は時間でも反応が終了せずＰ（ｉ）が上昇し続けることがある。このような場合には、真の反応のＶ（ｉ）のピークトップが出現しないか、又はピークトップの後、Ｖ（ｉ）が充分下がらないので、ピーク前ＡＵＣが一定値に達しておらずかつピーク後ＡＵＣが０であるか、又はピーク前ＡＵＣが一定値に達していてもピーク後ＡＵＣが一定に達しておらず、結果、本発明の方法で計測終了点又は時間までにＶｍａｘが検出されないことがある。そこで本発明の方法の一実施形態においては、真の最大値Ｖｍａｘを検出することなくｋが計測終了点又は時間を超えた場合、計測終了点でのＡＵＣpre（ｋ）がＡＵＣth1又はそれ以上であれば、ｃＶｍａｘ（ｋ）をＶ（ｉ）の真の最大値Ｖｍａｘとして検出する。本手順によって、計測終了点又は時間内に反応が終了しない被検検体の真の反応を検出することができる。必要に応じて、Ｖｍａｘとともに、このＶｍａｘが本手順で検出されたことを示す情報を出力することで、被検検体の凝固能に関する付加情報を提供することができる。
　被検検体の凝固反応が比較的小さい場合、ピーク前ＡＵＣ又はピーク後ＡＵＣがＡＵＣth1に達しないために、計測終了点又は時間までにＶｍａｘが検出されないことがある。そこで本発明の方法の一実施形態においては、真の最大値Ｖｍａｘを検出することなくｋが計測終了点又は時間を超えた場合、ピーク前ＡＵＣ及びピーク後ＡＵＣの最大値が第２の閾値ＡＵＣth2又はそれ以上であり、ピーク前ＡＵＣが最大である計測点又は時間がｃＶｍａｘＴ（ｋ）と同じであり、かつピーク後ＡＵＣが最大である計測点又は時間がｃＶｍａｘＴ（ｋ）よりも遅い場合、ｃＶｍａｘ（ｋ）をＶ（ｉ）の真の最大値Ｖｍａｘとして検出する（例えば、後述の図１１に示す手順を用いる）。ＡＵＣth2は、好ましくはＡＵＣth1よりも小さく、かつ好ましくはＡＵＣth1の１０％～３０％の範囲である。本手順によって、血液凝固能が比較的低い被検検体の真の反応を検出することができる。必要に応じて、Ｖｍａｘとともに、このＶｍａｘが本手順で検出されたことを示す情報を出力することで、被検検体の凝固能に関する付加情報を提供することができる。
　被検検体の凝固反応がないもしくは非常に小さい場合、又はその他の原因により、被検検体の真の反応が不明瞭なことがある。このような場合では、真の反応とノイズとの区別が困難である。真の反応が不明瞭な検体は、典型的には、ピーク前ＡＵＣがＡＵＣth1にも（さらにＡＵＣth2にも）達しないことによって見分けることができる。あるいは、Ｖ（ｉ）が前述した閾値Ｖthを超えないことによって見分けることができる。例えば、Ｖ（ｉ）がＶthに達している場合にのみ工程２）を開始することによって、ノイズの誤検出を防止することができる。真の反応が不明瞭な検体では、ノイズとともに真の反応も除外され、Ｖｍａｘが検出されないことがあり得る。その場合、Ｖｍａｘが未検出であるという結果と、それが閾値ＡＵＣth1を超えるピーク前ＡＵＣが検出できないか、又はＶth以上のＶ（ｉ）が検出できないためであることを示す情報を出力することで、被検検体の凝固能に関する付加情報を提供することができる。
　例として、図７Ａ～Ｃに、凝固能の異なる３つの被検検体の反応Ｐと一次微分Ｖを示す。図７Ａは、真の反応が不明瞭な検体を示し、図７Ｂは、計測終了点又は時間内に真の反応が終了しなかった検体を示し、図７Ｃは、真の反応が検出された検体を示す。これらの検体は、以下のとおり、ＡＵＣpre（ｋ）及びＡＵＣpost（ｋ）に基づいて分類できる。
　図７Ａ：ＡＵＣpre（ｋ）（及びＡＵＣpost（ｋ））がＡＵＣth1にもＡＵＣth2にも達しない→反応なし
　図７Ｂ：ＡＵＣpre（ｋ）（又はＡＵＣpost（ｋ））がＡＵＣth1に達するが一定値に達しない→反応途中
　図７Ｃ：ＡＵＣpre（ｋ）及びＡＵＣpost（ｋ）がＡＵＣth1に達し、かつ継続的に一定値である→反応検出
〔２．血液凝固時間の算出及びその他の分析〕
　一実施形態において、本発明の方法では、被検検体の真の反応を検出した後、さらに検出した真の反応を用いて、被検検体の凝固時間の算出を行うことができる。本発明の方法において取得された真の凝固反応、例えばＰ（ｉ）又はＶ（ｉ）は、血液凝固時間の算出又はその他の各種血液分析に使用することができる。
　一例において、本発明の方法では、凝固反応計測のデータから取得したＶ（ｉ）を用いて真の最大値Ｖｍａｘの検出を行い、さらにＶ（ｉ）を用いて凝固時間の算出を行うことができる。別の一例において、本発明の方法では、凝固反応計測のデータからＰ（ｉ）及びＶ（ｉ）を取得し、Ｖ（ｉ）を用いて真の最大値Ｖｍａｘの検出を行い、次いでＰ（ｉ）及び／又はＶ（ｉ）を用いて凝固時間の算出を行うことができる。
　一実施形態において、本発明の方法では、Ｖｍａｘが検出された時点で被検検体の凝固反応計測を終了し、それまでに取得した真の反応のＰ（ｉ）及び／又はＶ（ｉ）を用いて凝固時間の算出を行うことができる。一実施形態においては、検出されたＶｍａｘを含むピークの立ち上がり以降のＰ（ｉ）及び／又はＶ（ｉ）、例えばｉ≧ｋ1でのＰ（ｉ）及び／又はＶ（ｉ）を用いて凝固時間の算出を行うことができる。
　別の一実施形態において、本発明の方法では、Ｖｍａｘが検出された後も被検検体の凝固反応計測を継続し、凝固時間の算出又はその他の分析に必要な凝固反応に関するデータを取得することができる。
　本発明の方法で取得した凝固反応から凝固時間を算出する手法は、特に限定されない。凝固時間の算出方法の例としては、Ｐ（ｉ）が最大値ＰｍａｘのＮ％に達した時点を、凝固時間として算出する方法（いわゆるパーセント検出法）；Ｖ（ｉ）が最大値Ｖｍａｘ又はそのＮ％に達した時点を凝固時間として算出する方法（いわゆる微分法）；微小時間帯でのＰ（ｉ）の積算値の経時的変化に基づいて凝固時間を算出する方法（特許文献３、及び特願２０１９－２３７４２７参照）；Ｖ（ｉ）の加重平均時間に基づいて凝固時間を算出する方法（特願２０２０－０３９３４４参照）；Ｖ（ｉ）が最大値Ｖｍａｘに達した後所定値に達したときを算出起点Ｔｅとして、Ｐ（ｉ）がＰ（Ｔｅ）のＮ％に達した時点を凝固時間として算出する方法（特願２０２０－０６８８７７参照）、などが挙げられる。
〔３．他の凝固反応計測法への応用〕
　以上、散乱光量に基づく凝固反応計測の場合を例として、本発明の血液凝固反応の検出方法を説明した。しかしながら、当業者であれば、本発明の方法を他の凝固反応計測法（例えば透過度、吸光度、粘度などに基づく血液凝固反応計測法）を用いた血液凝固反応の検出方法に応用することが可能であり、よって当該応用は本発明の範囲に包含される。例えば、透過光量に基づくような逆シグモイド状の凝固反応曲線から得られる反応Ｐ（ｉ）は、上述した散乱光量に基づくものに対して正負が逆になる。このような場合に、上述した工程１）～３）において、Ｐ（ｉ）及びＶ（ｉ）の符号が逆転することや、ｃＶｍａｘ（ｋ）の代わりに、ｋまでのＶ（ｉ）の最小値ｃＶｍｉｎ（ｋ）が算出され、曲線下面積（ＡＵＣ）の代わりに、曲線上面積（ＡＯＣ）が算出されること等は、当業者に明らかである。
〔４．プログラム及び装置〕
　上述の本発明の血液凝固反応の検出方法は、コンピュータプログラムを用いて自動的に行われ得る。したがって、本発明の一態様は、上述の本発明の血液凝固反応の検出方法を行うためのプログラムである。また、上述した本発明の方法の一連の工程は、自動分析装置によって自動的に行われ得る。したがって、本発明の一態様は、上述の本発明の血液凝固反応の検出方法を行うための装置である。
　本発明の装置の一実施形態について、以下に説明する。本発明の装置の一実施形態は、図８に示すような自動分析装置１である。自動分析装置１は、制御ユニット１０と、操作ユニット２０と、測定ユニット３０と、出力ユニット４０とを備える。
　制御ユニット１０は、自動分析装置１の全体の動作を制御する。制御ユニット１０は、例えばパーソナルコンピュータ（ＰＣ）によって構成され得る。制御ユニット１０は、ＣＰＵ、メモリ、ストレージ、通信インターフェース（Ｉ／Ｆ）などを備え、操作ユニット２０からのコマンドの処理、測定ユニット３０の動作の制御、測定ユニット３０から受けた測定データの保存やデータ分析、分析結果の保存、出力ユニット４０による測定データや分析結果の出力の制御、などを行う。さらに制御ユニット１０は、外部メディア、ホストコンピュータなどの他の機器と接続されてもよい。なお、制御ユニット１０において、測定ユニット３０の動作を制御するＰＣと、計測データの分析を行うＰＣとは、同一であっても、異なっていてもよい。
　操作ユニット２０は、操作者からの入力を取得し、得られた入力情報を制御ユニット１０へと伝達する。例えば、操作ユニット２０は、キーボード、タッチパネル等のユーザーインターフェース（ＵＩ）を備える。出力ユニット４０は、制御ユニット１０の制御下で、測定ユニット３０の計測データや、その分析結果、例えばＰ（ｉ）、Ｖ（ｉ）、真の凝固反応（Ｖｍａｘ等）の検出結果、血液検体の凝固時間などを出力する。例えば、出力ユニット４０は、ディスプレイ等の表示装置を備える。
　測定ユニット３０は、血液凝固検査のための一連の操作を実行し、血液検体を含む試料の凝固反応の計測データを取得する。測定ユニット３０は、血液凝固検査に必要な各種の器材や分析モジュール、例えば、血液検体を収める検体容器、検査用試薬を収める試薬容器、検体と試薬との反応のための反応容器、血液検体及び試薬を反応容器に分注するためのプローブ、光源、反応容器内の試料からの散乱光又は透過光を検出するための検出器、検出器からのデータを制御ユニット１０に送るデータ処理回路、制御ユニット１０の指令を受けて測定ユニット３０の操作を制御する制御回路、などを備える。
　制御ユニット１０は、測定ユニット３０が計測したデータに基づいて、検体の凝固反応の分析を行う。本分析には、上述したＰ（ｉ）、Ｖ（ｉ）の取得、真の凝固反応（Ｖｍａｘ等）の検出、ならびに、検出した真の凝固反応を用いた凝固時間の算出、などが含まれ得る。あるいは、凝固反応曲線Ｐ（ｉ）又は一次微分Ｖは、測定ユニット３０からの計測データに基づいて制御ユニット１０で作成されてもよく、又は、別の機器、例えば測定ユニット３０で作成し、制御ユニット１０に送られてもよい。制御ユニット１０には、真の凝固反応の検出に用いるパラメータ、例えばＡＵＣth1、ＬThなどの設定値が保存されていてもよく、又は制御ユニット１０は、外部機器又はネットワーク上に保存された該設定値を分析の際に取り込んでもよい。
　以上の本分析は、本発明の方法を行うためのプログラムによって実施され得る。したがって、制御ユニット１０は、本発明の血液凝固反応の検出方法を行うためのプログラムを備え得る。
　制御ユニット１０での分析結果は、出力ユニット４０に送られ、出力される。出力は、画面への表示、ホストコンピュータへの送信、印刷など、任意の形態をとり得る。出力ユニットからの出力情報は、Ｐ（ｉ）、Ｖ（ｉ）、真の凝固反応の検出結果、凝固時間などを含むことができる。出力ユニットからの出力情報の種類は、本発明のプログラムによって制御され得る。
　本発明の装置の一実施形態において、測定ユニット３０は凝固反応終了まで被検検体の計測を続け、データは逐次、制御ユニット１０に送られる。制御ユニット１０は逐次、Ｐ（ｉ）及びＶ（ｉ）を取得するための計算、ならびにｃＶｍａｘ（ｋ）、ｃＶｍａｘＴ（ｋ）、ＡＵＣpre（ｋ）、ＡＵＣpost（ｋ）などの算出を行い、さらにＬ≧ＬThであるか否かを判定してＶｍａｘの検出を行う。Ｖｍａｘが検出されると、制御ユニット１０はさらに被検検体の凝固時間を算出する。得られた分析結果は、出力ユニットに送られ、出力される。例えば、Ｐ（ｉ）及びＶ（ｉ）は計測と並行して逐次出力され、また必要に応じてｃＶｍａｘ（ｋ）、ｃＶｍａｘＴ（ｋ）、ＡＵＣpre（ｋ）、ＡＵＣpost（ｋ）も逐次出力される。Ｖｍａｘが検出された後は、Ｖｍａｘやその時間、凝固時間が適時出力される。
　以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１　凝固反応を反映するパラメータ
１）被検検体
　被検検体は、次の１８７例を用いた：正常血漿（１０例）、ヘパリン投与血漿（４７例）、ＬＡ陽性血漿（１１例）、凝固因子欠乏血漿（１４例）、インヒビター血漿（４１例）、低濃度フィブリノーゲン血漿（５例）、他の凝固時間延長血漿（５９例）。このうち６例で初期反応が観察された。
２）凝固反応計測
　測定用試薬として、ＡＰＴＴ測定用試薬であるコアグピアＡＰＴＴ－Ｎ（積水メディカル株式会社製）を、塩化カルシウム液として、コアグピアＡＰＴＴ－Ｎ　塩化カルシウム液（積水メディカル株式会社製）を用いた。検体を含む試料の凝固反応計測は、血液凝固自動分析装置ＣＰ３０００（積水メディカル株式会社製）を用いて行った。検体５０μＬをキュベット内にて３７℃で４５秒間加温した後、約３７℃の測定用試薬５０μＬを添加し、さらに１７１秒経過後に２５ｍＭ塩化カルシウム液５０μＬを添加して凝固反応を開始させた。反応は３７℃で行った。凝固反応の測定では、キュベットにＬＥＤを光源とする波長６６０ｎｍの光を照射し、０．１秒間隔で９０度側方散乱光の散乱光量を計測した。最大計測時間は４００秒間とした（計測点ｉ＝１～４０００）。
３）反応Ｐ（ｉ）、及び反応速度Ｖ（ｉ）の取得
　各検体からの測光データに対してノイズ除去を含む平滑化処理を行った後、測光開始時点の散乱光量が０となるようにゼロ点調整処理して反応Ｐ（ｉ）を作成した。Ｐ（ｉ）から、一次微分Ｖ（ｉ）を算出した。
４）ＡＰＴＴ算出
　被検検体の凝固時間（ＡＰＴＴ）をパーセント法により算出した。Ｐ（ｉ）が、その最大値（Ｐｍａｘ）の５０％となる時間を凝固時間とした。
実施例１　凝固反応を反映するパラメータ
１）パラメータの算出
　得られたＰ（ｉ）とＶ（ｉ）（ｉ＝２１～３９８０）を用いて、高さ比（Ｈｒ）を２０％にして以下のパラメータを算出した。
　Ｖｍａｘ：Ｖ（ｉ）の最大値
　ＶｍａｘＴ：Ｖｍａｘの時間
　Ｐｍａｘ：Ｐ（ｉ）の最大値
　ＡＵＣpre：Ｖ（ｉ）のピーク前ＡＵＣ
　ＡＵＣpost：Ｖ（ｉ）のピーク後ＡＵＣ
　算出されたパラメータの例を表２に示す。表２に示す９検体は以下のとおりであった。
　検体１：最もＰｍａｘが小さい検体
　検体２：最もＶｍａｘＴが小さい検体
　検体３：Ｖ（ｉ）が２峰性になった検体
　検体４～９：初期反応が出現した検体
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　パラメータ間の関係性を図９Ａ～Ｆに示す。１８７例の被検検体のＡＰＴＴは、最小値２４．９秒から最大値２８３．７秒の間に分布しており、ＶｍａｘＴはＡＰＴＴとほぼ直線関係になった（図９Ａ）。図９Ａ中、直線関係から外れた２つの検体は、第１峰の方が大きい２峰性のＶ（ｉ）を有する凝固第VIII因子（FVIII）欠乏検体であった。Ｐ（ｉ）の最大値ＰｍａｘとＶｍａｘＴとの間に明確な傾向はなかった（図９Ｂ）。ＶｍａｘとＶｍａｘＴとの関係は反比例の傾向となった（図９Ｃ）。この傾向は、Ｖ（ｉ）のピークが凝固反応の進行が速いと大きくなり、遅いと小さくなることを表す。ピーク前ＡＵＣ及びピーク後ＡＵＣとＶｍａｘＴとの間には明確な関係はなかった（図９Ｄ、Ｅ）。ピーク後ＡＵＣは、ピーク前ＡＵＣと比べて大きい傾向があった（図９Ｆ）。
２）初期反応を有する被検検体のパラメータ
　初期反応を有する被検検体（表２の検体４～９）について、取得した凝固反応曲線から初期反応部と真の反応部を判定した後、各々の部分におけるパラメータＶｍａｘ、ＶｍａｘＴ、Ｐｍａｘ、ピーク前ＡＵＣ（ＡＵＣpre）、及びピーク後ＡＵＣ（ＡＵＣpost）を算出した。結果を表３に示す。真の反応部のＶｍａｘＴは、約７０秒から２７５秒の範囲であったが、初期反応部のＶｍａｘＴは、いずれも約４秒であり計測の初期に出現していることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
実施例２　真の凝固反応のリアルタイム検出－１
　実施例１で計測した１８７検体の凝固反応データを用いて、図６のフローチャートで示される手順により、Ｖｍａｘのリアルタイム検出を実施した。
１）閾値ＡＵＣth1の決定
　実施例１の結果、被検検体中でのＡＵＣpreとＡＵＣpostの最小値は、Ｐｍａｘが最も小さい検体１における２０７と２８５であった。一方、初期反応を有する検体４～９の初期反応部のＡＵＣpreの最大値は、検体５における１６８であった。ＡＵＣth1が低すぎる場合、検体５やその他の初期反応部を誤検出することになり、一方、ＡＵＣth1が大きすぎる場合、検体１や検体３などでの小さい反応を検出できない。以上の結果から、ＡＵＣth1を２５５、すなわち初期反応部の最大値（検体５における１６８）の１．５倍程度に決定した。
２）検出条件
　以下の条件でＶｍａｘのリアルタイム検出を実施した。
　ｉ＝２１～Ｖｍａｘ検出まで（最大３９８０）
　Ｈｒ（％）：２０％
　ＡＵＣth1：２５５
　Ｌth：１０（１秒）
　検出除外域（ステップＳ１３）：なし
３）結果
　検体１を除く１８６検体で真の反応からＶｍａｘを検出することができた。
実施例３　真の凝固反応のリアルタイム検出－２（低閾値、検出除外域あり）
　実施例１の結果より、初期反応のピークは計測初期に出現することが確認された。そこで、実施例１の検体１よりも小さい反応を検出できるが、初期反応が出現すると想定される区間での反応の検出を実施しない（低閾値、ステップＳ１３あり）条件でＶｍａｘのリアルタイム検出を実施した。具体的には、下記を変更した以外は実施例２と同様の条件でＶｍａｘのリアルタイム検出を実施した。
　ＡＵＣth1：１００
　検出除外域（ステップＳ１３）：あり。ｃＶｍａｘＴ（ｉ）が５０（５秒）以降のときのみＶｍａｘを検出
　１８７検体全てで真の反応からＶｍａｘを検出することができた。図１０は、実施例１で測定したＶｍａｘＴに対して、本実施例でＶｍａｘを検出した時間（Ｆｉｘ）のプロットである。全てのＦｉｘがＶｍａｘＴより遅い時間であったことから、本実施例の手順で真の反応を正しく検出できたことが確認された。また本実施例の結果から、検出除外域（ステップＳ１３）を設定することで、反応の小さい検体においても真の反応を正しく検出することができることが示された。
実施例４　真の凝固反応のリアルタイム検出－３（高閾値、オフライン検出あり）
　実施例１の検体４～９よりも大きな初期反応が出現する場合を想定して、実施例２，１）より高いＡＵＣth1を設定した。ＡＵＣth1を高くすることにより一部の検体（例えば検体１）は図６の手順で真の反応が検出されなくなると予測された。そのため、図６のＳ２４から終了までの間に図１１の手順を組み込んだ。具体的には、下記を変更した以外は実施例２と同様の条件でＶｍａｘのリアルタイム検出を実施した。
　ＡＵＣth1：５１０
　ＡＵＣth2：１００
　Ｓ２４で以下の手順を行う：
　　Ｓ３１：ＡＵＣpre（ｉ）とＡＵＣpost（ｉ）の最大値ＡＵＣpreＭａｘ及びＡＵＣpostＭａｘがいずれも閾値ＡＵＣth2を超えているか判定
　　Ｓ３２：Ｓ３１が成立したとき、ＡＵＣpreＭａｘとなる時間（ＡＵＣpreＭａｘＴ）がｃＶｍａｘＴ（ｉ）と同じ時間かつＡＵＣpostＭａｘとなる時間（ＡＵＣpostＭａｘＴ）がｃＶｍａｘＴ（ｉ）以降であるかを判定
　　Ｓ３３：Ｓ３２が成立したとき、ｃＶｍａｘ（ｉ）をＶｍａｘとして検出
　Ｐｍａｘが最小の検体１を含む１２検体が、Ｓ２４を経てＶｍａｘが検出され、それ以外の全ての検体は、Ｓ２４を経ることなくＶｍａｘが検出された。図１２は、検体１に本実施例の手順を行ったときに算出されたパラメータの時間的変化を示す。図１２Ｂ～Ｄに示すようにｃＶｍａｘＴ（ｉ）は真の最大値の時間ＶｍａｘＴで最大になり、ＡＵＣｐｒｅ（ｉ）はＶｍａｘＴで最大となり、ＡＵＣｐｏｓｔ（ｉ）はＶｍａｘＴより後で最大となった。Ｓ２４を経て検出された検体１を含む１２検体でＶｍａｘが真の反応の最大値を正しく検出したことが確認された。 

Claims (10)

  1. 　血液凝固反応の検出方法であって、
    １）被検血液検体の血液凝固反応を計測して、最新の計測点までの凝固反応の一次微分Ｖ（ｉ）を取得すること、ここでｉは計測点又は時間を表し、ｉ＝ｋ0～ｋであり、ｋは最新のＶ（ｉ）についての最も遅い計測点又は時間を表し、ｋ0はｋ0≦ｋである任意の計測点又は時間を表す、
    ２）ｋまでのＶ（ｉ）の最大値ｃＶｍａｘ（ｋ）をＶ（ｉ）のピークトップとして、Ｖ（ｉ）のピーク前及びピーク後の曲線下面積（ＡＵＣ）を算出すること、
    ３）該ピーク前ＡＵＣ及びピーク後ＡＵＣがいずれも第１の閾値ＡＵＣth1又はそれ以上であってかつそれぞれ一定値であり続けた期間Ｌが、所定の長さに達したときに、ｃＶｍａｘ（ｋ）をＶ（ｉ）の真の最大値Ｖｍａｘとして検出すること、
    を含む、方法。
  2. 　請求項１記載の方法であって、
    　前記２）が、ｃＶｍａｘ（ｋ）、ｃＶｍａｘＴ（ｋ）、ＡＵＣpre（ｋ）、及びＡＵＣpost（ｋ）を算出することを含み、ここで
    　　ｃＶｍａｘ（ｋ）はＶ（ｉ）（ｉ＝ｋ0～ｋ）の最大値を表し、
    　　ｃＶｍａｘＴ（ｋ）はＶ（ｉ）＝ｃＶｍａｘ（ｋ）となる計測点又は時間を表し、
    　　ＡＵＣpre（ｋ）は、ｋでのピーク前ＡＵＣであって、ｋ1からｃＶｍａｘＴ（ｋ）までのＶ（ｉ）のＡＵＣを表し、
    　　ＡＵＣpost（ｋ）は、ｋでのピーク後ＡＵＣであって、ｃＶｍａｘＴ（ｋ）からｋ2までのＶ（ｉ）のＡＵＣを表し、
    　　ｋ1は、ｃＶｍａｘＴ（ｋ）以前にＶ（ｉ）≦ｃＶｍａｘ（ｋ）×Ｈｒ％となる計測点又は時間のうち最も遅い計測点又は時間であり、
    　　ｋ2は、ｃＶｍａｘＴ（ｋ）以後にＶ（ｉ）≦ｃＶｍａｘ（ｋ）×Ｈｒ％を満たす計測点又は時間のうち最も早い計測点又は時間であり、
    　　０＜Ｈｒ＜１００であり；
    かつ、該方法が、
    　前記３）で真の最大値Ｖｍａｘを検出しなかった場合に、ｋ＝ｋ＋ｘ（ｘ＞０）として、前記１）～３）を繰り返すこと、
    を含む、方法。
  3. 　前記３）が、
    　ＡＵＣpre（ｋ）及びＡＵＣpost（ｋ）がいずれもＡＵＣth1またはそれ以上であって、かつＡＵＣpre（ｋ）＝ＡＵＣpre（ｋ－ｘ）、及びＡＵＣpost（ｋ）＝ＡＵＣpost（ｋ－ｘ）であった場合はＬ＝Ｌ＋１とし、そうでない場合はＬ＝０とすること；
    　Ｌが所定値に達した場合に、ｃＶｍａｘ（ｋ）をＶ（ｉ）の真の最大値Ｖｍａｘとして検出すること、
    を含む、請求項２記載の方法。
  4. 　１０≦Ｈｒ≦７０である、請求項２又は３記載の方法。
  5. 　前記３）において、ｃＶｍａｘ（ｋ）となる計測点又は時間が検出除外域に含まれている場合にＶｍａｘを検出しない、請求項１～４のいずれか１項記載の方法。
  6. 　真の最大値Ｖｍａｘを検出することなくｋが計測終了点又は時間を超えた場合に、ｋでのピーク前ＡＵＣが第１の閾値ＡＵＣth1又はそれ以上であれば、ｃＶｍａｘ（ｋ）をＶ（ｉ）の真の最大値Ｖｍａｘとして検出することをさらに含む、請求項１～５のいずれか１項記載の方法。
  7. 　真の最大値Ｖｍａｘを検出することなくｋが計測終了点又は時間を超えた場合に、ｋでのピーク前ＡＵＣ及びピーク後ＡＵＣがいずれも第２の閾値ＡＵＣth2又はそれ以上であり、ピーク前ＡＵＣが最大である計測点又は時間がｃＶｍａｘ（ｋ）となる計測点又は時間と同じであり、かつピーク後ＡＵＣが最大である計測点又は時間がｃＶｍａｘ（ｋ）となる計測点又は時間よりも遅い場合、ｃＶｍａｘ（ｋ）をＶ（ｉ）の真の最大値Ｖｍａｘとして検出することをさらに含む、請求項１～６のいずれか１項記載の方法。
  8. 　前記最新の計測点までの凝固反応を反応Ｐ（ｉ）として求めることをさらに含む、請求項１～７のいずれか１項記載の方法。
  9. 　前記Ｐ（ｉ）又はＶ（ｉ）に基づいて前記被検血液検体の血液凝固時間を算出することをさらに含む、請求項８記載の方法。
  10. 　ｉ≧ｋ1である、請求項９記載の方法。 
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