WO2021177452A1 - 血液凝固時間測定方法 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a method for measuring blood coagulation time.
- the blood coagulation test is a test for diagnosing a patient's blood coagulation ability by adding a predetermined reagent to the patient's blood sample and measuring the blood coagulation time or the like.
- Typical examples of blood coagulation time include prothrombin time (PT), activated partial thromboplastin time (APTT), and thrombin time.
- a blood coagulation test can be used to examine a patient's hemostatic ability and fibrinolytic ability.
- Abnormal blood coagulation ability mainly causes prolongation of coagulation time. For example, prolonged coagulation time is due to the effects of coagulation inhibitors, reduction of coagulation-related components, congenital deficiency of blood coagulation factors, autoantibodies that inhibit the acquired coagulation reaction, and the like.
- an automatic analyzer that automatically measures a blood coagulation test has become widespread, and it is possible to easily carry out a blood coagulation test.
- a mixture obtained by adding a reagent to a blood sample is irradiated with light, and the coagulation reaction of the blood sample is measured based on the change in the amount of light obtained.
- the amount of scattered light when a certain amount of time has passed since the addition of the reagent to the blood sample, the amount of scattered light rapidly increases due to the progress of coagulation, and then the amount of scattered light becomes saturated as the coagulation reaction approaches the end. And reach the plateau.
- the blood coagulation time can be measured based on such a temporal change in the amount of scattered light.
- the percentage method typically calculates the time until the measured amount of scattered light reaches a certain ratio of the maximum value as the solidification time.
- the percentage method enables fairly accurate calculation of coagulation time not only for normal specimens but also for abnormal specimens such as low fibrinogen specimens, chyle specimens, and hemolytic specimens.
- the time until the differential value of the amount of scattered light reaches the peak or a certain ratio thereof is calculated as the coagulation time.
- a clear peak may not be seen in the differential value of the amount of scattered light.
- two or more differential value peaks may occur.
- methods of calculating the coagulation time based on the single peak peak curve created by fitting the differential value curve may be used, the fitting may impair accurate information about the coagulation ability of the sample.
- the photometric data in the analyzer contains various noises due to the state of the device, reagents, specimens, etc., which can lead to false detection of the coagulation time.
- the automatic analysis of blood samples it is required to eliminate the adverse effects of noise and calculate a reliable coagulation time.
- the present invention relates to a blood coagulation time measuring method capable of accurately measuring the coagulation time of a blood sample showing various blood coagulation reaction curves.
- the present invention provides the following.
- [1] A method for measuring blood coagulation time. To measure the coagulation reaction of a sample obtained by mixing the test sample and the coagulation time measurement reagent, From the obtained measurement data, calculate the weighted average time for the calculation target area of the waveform related to the coagulation rate, and determine the blood coagulation time of the test sample based on the weighted average time. Including The calculation target area is a region of the waveform related to the solidification rate in which the waveform is equal to or higher than a predetermined lower limit value.
- Method [2] The method according to [1], wherein the waveform relating to the solidification rate is a solidification reaction curve or a first derivative curve of a relative value thereof.
- the weighted average time is a predetermined value in which the waveform related to the solidification rate is set to F (t) (t is time) and F (t) is x% of the maximum value (x is a predetermined value set in the range of 5 to 95).
- Is t1, t2 (t1 ⁇ t2) the following formula: The method according to [1] or [2] represented by.
- [4] The method according to any one of [1] to [3], wherein the test sample is plasma.
- the blood coagulation time is the activated partial thromboplastin time (APTT), prothrombin time (PT)), and the coagulation time in measuring the fibrinogen concentration.
- a coagulation factor including measuring the coagulation factor concentration of the test sample based on the blood coagulation time of the test sample measured by the method according to any one of the above [1] to [5]. How to measure the concentration.
- the method according to [8], wherein the blood coagulation time is the coagulation time in the measurement of fibrinogen concentration.
- the method of the present invention it is possible to accurately measure the coagulation time of a blood sample showing various blood coagulation reaction curves including a normal sample and an abnormal sample. Further, when a large number of samples are analyzed in real time by an automatic analyzer, the method of the present invention can shorten the analysis time per sample as compared with the conventional percentage method, and can improve the analysis efficiency. ..
- FIG. 1 An embodiment of the procedure of the data analysis step shown in FIG.
- the conceptual diagram which shows the calculation target area and the weighted average point.
- the slope (A), intercept (B), and correlation coefficient (C) of the first-order regression line of vT (vT5% to vT95%) in the 5 to 95% calculation target area with respect to APTT by the percentage method.
- the cells shown in gray in the table indicate that the difference between the weighted average time and the control is within ⁇ 5% (A) and ⁇ 2.5% (B) of the control.
- the cells shown in gray in the table indicate that the difference between the weighted average time and the control is within ⁇ 5% (A) and ⁇ 2.5% (B) of the control.
- Correlation coefficient (C) The error of the [Fbg] calculated value in the 5 to 95% calculation target area for the concentration series sample data for 20 samples with respect to the expected value.
- the cells shown in gray in the table indicate that the error between the calculated value and the expected value is within ⁇ 10% (A) and within ⁇ 5% (B).
- a predetermined reagent is added to a blood sample, the subsequent blood coagulation reaction is measured, and the blood coagulation time is measured from the coagulation reaction.
- a blood sample may be referred to as a sample.
- general means for example, an optical means for measuring the amount of scattered light, a transmittance, an absorbance, or the like, a mechanical means for measuring the viscosity of plasma, or the like is used.
- the coagulation reaction curve of a normal sample depends on the measuring means, but basically shows a sigmoid shape.
- the coagulation reaction curve based on the amount of scattered light of a normal sample usually rises sharply due to the progress of coagulation when a certain amount of time has passed from the addition of the reagent, and then reaches a plateau as the coagulation reaction approaches the end.
- the coagulation reaction curve of an abnormal sample having a coagulation abnormality shows various shapes depending on the cause of the abnormality, such as a delay in the rise time of the curve and a gradual rise.
- the variety of coagulation reaction curves of abnormal specimens makes it difficult to accurately measure the coagulation time with an automatic analyzer.
- the coagulation time is calculated based on the acquired data. For example, in the case of calculating the coagulation time based on the amount of scattered light, after determining that the time when the amount of scattered light is saturated is the end of the coagulation reaction, the coagulation reaction curve has the maximum speed or 1 / N thereof from the time of adding the reagent to the time of the end of the coagulation reaction.
- a method of determining the time when the solidification time is reached (differential method), a method of determining the time when the amount of scattered light reaches 1 / N at the end of the solidification reaction as the solidification time (percentage method, see Patent Document 1), etc. be.
- the peak of the coagulation reaction rate and the erroneous detection of the end of the coagulation reaction occur. May be done. Such false positives lead to inaccurate calculation of coagulation time.
- the present invention prevents erroneous detection of the coagulation time due to the abnormal shape of the coagulation reaction curve as described above, and enables accurate measurement of the coagulation time. Further, according to the present invention, the minimum coagulation reaction measurement time required for measuring each coagulation time can be applied to various blood samples including normal samples and abnormal samples, so that the analysis time per sample can be applied. Can be shortened.
- the present invention relates to a method for measuring blood coagulation time of a blood sample.
- the blood coagulation time measuring method of the present invention (hereinafter, also referred to as the method of the present invention) measures the coagulation reaction of a sample obtained by mixing a test sample and a coagulation time measuring reagent, and obtained measurement data. From, the weighted average time for a predetermined calculation target area of the waveform relating to the coagulation rate is calculated.
- An embodiment of the method of the present invention will be described with reference to FIG. In this method, a sample is first prepared from the test sample, and then the coagulation reaction measurement for the sample is executed (step 1).
- the obtained measurement data is analyzed to obtain a waveform related to the solidification rate of the sample, and then the weighted average time for a predetermined calculation target area of the waveform is calculated (step 2).
- the coagulation time of the test sample is determined based on the obtained weighted average time (step 3).
- coagulation reaction measurement the coagulation reaction of a test sample mixed with reagents is measured.
- the blood coagulation time is measured from the time series data of the coagulation reaction obtained by this measurement.
- examples of the blood coagulation time measured by the method of the present invention include prothrombin time (PT), activated partial thromboplastin time (APTT), and coagulation time measured by fibrinogen concentration (Fbg).
- PT prothrombin time
- APTT activated partial thromboplastin time
- Fbg fibrinogen concentration
- the method of the present invention will be described mainly by taking the activated partial thromboplastin time (APTT) as an example of the coagulation time. Modifications of the method of the invention to other coagulation times (eg, prothrombin time (PT)) can be performed by one of ordinary skill in the art.
- the plasma of the subject is preferably used as the test blood sample.
- An anticoagulant commonly used for coagulation tests can be added to the sample.
- plasma is obtained by collecting blood using a blood collection tube containing sodium citrate and then centrifuging it.
- a reagent for measuring the coagulation time is added to the test sample to start the blood coagulation reaction.
- the coagulation reaction of the mixed solution after the addition of the reagent can be measured.
- the coagulation time measuring reagent used can be arbitrarily selected according to the measurement purpose.
- Reagents for measuring various coagulation times are commercially available (for example, APTT reagent Coagupia APTT-N; manufactured by Sekisui Medical Co., Ltd.).
- general means for example, an optical means for measuring the amount of scattered light, a transmittance, an absorbance, or the like, or a mechanical means for measuring the viscosity of plasma may be used.
- the reaction start time of the coagulation reaction can be typically defined as the time when the reagent is mixed with the sample to start the coagulation reaction, but other timings may be defined as the reaction start time.
- the time for continuing the measurement of the coagulation reaction can be, for example, about several tens of seconds to 7 minutes from the time of mixing the sample and the reagent. This measurement time may be a fixed value arbitrarily determined, but may be up to the time when the end of the coagulation reaction of each sample is detected.
- measurement of the progress of the solidification reaction (photometry in the case of optical detection) may be repeated at predetermined intervals. For example, the measurement may be performed at intervals of 0.1 seconds.
- the temperature of the mixed solution during the measurement is under normal conditions, for example, 30 ° C. or higher and 40 ° C. or lower, preferably 35 ° C. or higher and 39 ° C. or lower. Further, various measurement conditions can be appropriately set according to the test sample, the reagent, the measurement means, and the like.
- the series of operations in the above-mentioned coagulation reaction measurement can be performed using an automatic analyzer.
- An example of the automatic analyzer is the blood coagulation automatic analyzer CP3000 (manufactured by Sekisui Medical Co., Ltd.).
- some operations may be performed manually.
- a human can prepare a test sample, and subsequent operations can be performed by an automatic analyzer.
- the data analysis in step 2 may be performed in parallel with the coagulation reaction measurement in step 1, or may be performed later using the data of the coagulation reaction measurement measured in advance.
- the data analysis in step 2 is performed in parallel with the measurement of the coagulation reaction in step 1, and when the data necessary for calculating the coagulation time of the test sample can be obtained, the measurement of the coagulation reaction of the sample is completed. , Move on to the measurement of the coagulation reaction of the next sample.
- step 2a the measurement data in the coagulation reaction measurement is acquired.
- This data is data that reflects, for example, the coagulation reaction process of the sample obtained by the APTT measurement in step 2 described above.
- data showing the time change of the progress of the coagulation reaction for example, the amount of scattered light
- the data obtained by these coagulation reaction measurements are also referred to as coagulation reaction information in the present specification.
- FIG. 3 shows an example of the coagulation reaction information acquired in step 2a.
- FIG. 3 is a coagulation reaction curve based on the amount of scattered light.
- the horizontal axis shows the elapsed time (coagulation reaction time) after the addition of the calcium chloride solution, and the vertical axis shows the amount of scattered light.
- the amount of scattered light increases.
- a curve showing such a change in the amount of coagulation reaction with respect to the coagulation reaction time is referred to as a coagulation reaction curve.
- the coagulation reaction curve based on the amount of scattered light as shown in FIG. 3 is usually sigmoid.
- the coagulation reaction curve based on the amount of transmitted light is usually inverted sigmoid.
- the solidification reaction curve may be pretreated (step 2b).
- the pretreatment may include a smoothing treatment for removing noise or a zero point adjustment.
- FIG. 4 shows an example of the coagulation reaction curve of FIG. 3 that has been pretreated (smoothing treatment and zero point adjustment). Any known noise removing method can be used for the smoothing process.
- the amount of scattered light at the start of measurement time 0
- FIG. 5A and 5B show partially enlarged views of the coagulation reaction curve of FIG. 3 before and after the pretreatment, respectively.
- smoothing processing and zero point adjustment are performed on the data of FIG. 5A.
- the height of the coagulation reaction curve depends on the fibrinogen concentration of the test sample. On the other hand, since the fibrinogen concentration varies from person to person, the height of the coagulation reaction curve differs depending on the test sample. Therefore, in this method, if necessary, a correction process for converting the coagulation reaction curve after the pretreatment into a relative value is performed in step 2c. By the correction treatment, a coagulation reaction curve independent of the fibrinogen concentration can be obtained, whereby the difference in the shape of the coagulation reaction curve after the pretreatment between the samples can be quantitatively compared.
- the correction process corrects the coagulation reaction curve after the pretreatment so that the maximum value becomes a predetermined value.
- the correction solidification reaction curve P (t) is obtained from the coagulation reaction curve after the pretreatment according to the following equation (1).
- D (t) represents the coagulation reaction curve after pretreatment
- Dmax and Dmin represent the maximum and minimum values of D (t), respectively
- Drange is the change width of D (t). (Ie, Dmax-Dmin), where A is an arbitrary value representing the maximum value of the corrected coagulation reaction curve.
- P (t) [(D (t) -Dmin) / Drange] ⁇ A (1)
- FIG. 6 shows data corrected so that the coagulation reaction curve shown in FIG. 4 has a maximum value of 100.
- the correction process as described above may be performed on a waveform related to the solidification rate, which will be described later, or a parameter extracted from the waveform.
- a parameter extracted from the waveform For example, after calculating the waveform related to the coagulation rate for the coagulation reaction curve D (t) after the pretreatment in which the correction process is not performed, this can be converted into a value corresponding to P (t).
- the value of the parameter can be converted into a value corresponding to P (t).
- the corrected coagulation reaction curve and the uncorrected coagulation reaction curve as described above are also referred to as a corrected zero-order curve and an uncorrected zero-order curve, respectively, and these are collectively referred to as a “zero-order curve”. Also called.
- the corrected zero-order curve and the first-order differential curve of the uncorrected zero-order curve are also referred to as a corrected first-order curve and an uncorrected first-order curve, respectively, and these are collectively referred to as "1". Also called "next curve”.
- a waveform related to solidification rate is calculated.
- the waveform relating to the solidification rate includes an uncorrected linear curve and a corrected linear curve.
- the uncorrected linear curve represents a value obtained by linearly differentiating the solidification reaction curve (uncorrected 0th order curve), that is, the rate of change (solidification rate) of the solidification reaction amount at an arbitrary solidification reaction time.
- the corrected first-order curve represents a value obtained by first-order differentiating the corrected solidification reaction curve (corrected zero-order curve), that is, the relative rate of change of the solidification reaction amount at an arbitrary solidification reaction time.
- the waveform relating to the coagulation rate may be a waveform representing the coagulation rate in the coagulation reaction of the sample or its relative value.
- a value representing the progress of blood coagulation including the coagulation rate represented by a linear curve and its relative value may be collectively referred to as a linear differential value.
- Differentiation of the coagulation reaction curve or the corrected coagulation reaction curve (uncorrected and corrected zero-order curve) can be performed using a known method.
- FIG. 7 shows a corrected first-order curve obtained by first-order differentiating the corrected zero-order curve shown in FIG.
- the horizontal axis of FIG. 7 represents the coagulation reaction time, and the vertical axis represents the first derivative value.
- step 2e parameters that characterize the waveform related to the solidification rate are extracted. More specifically, in the parameter extraction step, a predetermined calculation target area is extracted from the waveform related to the solidification rate, and then the weighted average time for the calculation target area is calculated. The blood coagulation time of the test sample can be determined based on the weighted average time (step 3). The parameters will be described below.
- Vmax x x% represents the lower limit of the calculation target area.
- the calculation target area is an area where F (t) is above the baseline and below Vmax (F (t) ⁇ Vmax ⁇ x%, t1 ⁇ t ⁇ t2).
- the weighted average point (vT, vH) corresponds to the "weighted average value" of the calculation target area.
- the coagulation reaction time (t) at the weighted average point is defined as the weighted average time vT. That is, the weighted average time vT is the time from the solidification reaction start time to the weighted average point, and is the x-coordinate of the weighted average point.
- VT is the center of gravity of the calculation target area in the horizontal axis direction.
- the weighted average height vH is the y-coordinate of the weighted average point.
- the calculation target area based on a predetermined lower limit value, and vT and vH derived from the calculation target area may be expressed according to the percentage of the lower limit value with respect to Vmax.
- the calculation target area having x% of Vmax as the lower limit value may be referred to as "x% calculation target area”
- vT and vH derived from the "x% calculation target area” are vTx% and vH, respectively.
- vHx% a calculation target area whose lower limit is 20% of Vmax
- vT for the calculation target area is expressed as vT 20%.
- the weighted average points (vTx%, vHx%) for the calculation target area of F (t) at the lower limit value x% are displayed.
- the lower limit of the calculation target area can be determined in the range greater than 0% of Vmax and less than Vmax.
- the calculation target area reflects the shape of the linear curve, and the larger the lower limit value, the higher the calculation target area reflects the shape of the linear curve.
- FIG. 9 shows the relationship between the calculation target area of the linear curve and the calculated weighted average point.
- the upper, middle, and lower rows show the calculation target areas of the linear curve when the lower limit values are 5%, 40%, and 75% of Vmax, respectively, and the weighted average points (black circles).
- the position of the weighted average point changes as shown in FIG.
- the weighted average time vT calculated by the above procedure has a high correlation with the blood coagulation time of the test sample. Therefore, the coagulation time of the test sample can be determined based on the weighted average time vT. For example, in the case of APTT or PT, the weighted average time vT can be determined as the coagulation time.
- the measurement noise, the bimodal peak caused by the abnormal coagulation, etc. it enables more reliable coagulation time measurement that is less affected.
- the method of the present invention it is possible to measure the coagulation time when the linear curve of the coagulation reaction reaches the maximum value Vmax and then falls below the lower limit value (Vmax ⁇ x%) of the calculation target area. become. Therefore, in the method of the present invention, it is not necessary to continue the measurement until the solidification reaction reaches the plateau as in the conventional percentage method. Further, even when a large number of samples are analyzed by an automatic analyzer, according to the method of the present invention, it is necessary to set a long measurement time in preparation for an abnormal sample having a low coagulation ability as in the conventional percentage method. No. Therefore, according to the present invention, the analysis time of a sample can be shortened or optimized to improve the efficiency of analysis.
- coagulation factor concentration Normal blood contains coagulation factors such as coagulation factors I to XIII, and abnormalities or deficiencies in these coagulation factors cause abnormal coagulation ability.
- the coagulation factor concentration of the test sample can be measured based on the coagulation time of the measurement sample prepared from the test sample using a dedicated reagent for each coagulation factor. Therefore, the coagulation factor concentration of the test sample can be measured using the coagulation time of the measurement sample measured based on the weighted average time by the method of the present invention.
- the coagulation factor concentration is measured based on a calibration curve showing the relationship between the coagulation time and the coagulation factor concentration.
- the coagulation factor concentration of the test sample can be measured by applying the coagulation time of the measurement sample measured by the method of the present invention to the calibration curve prepared in advance.
- Preferred examples of the coagulation factor measured by the method of the present invention include factor I (fibrinogen), factor VIII, factor IX and the like.
- the blood coagulation time measurement method of the present invention has been described above by taking the case of coagulation reaction measurement based on the amount of scattered light as an example.
- those skilled in the art can apply the method of the present invention to a blood coagulation time measuring method using another coagulation reaction measuring method (for example, a blood coagulation reaction measuring method based on permeability, absorbance, viscosity, etc.).
- a blood coagulation reaction measuring method based on permeability, absorbance, viscosity, etc.
- the linear curve F (t) obtained from the inverse sigmoid-like coagulation reaction curve based on the amount of transmitted light has the opposite positive and negative directions to those based on the amount of scattered light described above.
- Example 1 Measurement of coagulation time (APTT) based on weighted average time 1.
- Method 1.1 Samples A total of 24 samples, 9 normal plasma samples and 15 abnormal plasma samples with extended APTT, were used as test samples.
- Normal Donor Plasma manufactured by CliniSys Associates, Ltd. was used.
- Abnormal plasma includes two samples each of factor FVIII-deficient plasma, factor FIX-deficient plasma, factor FXI-deficient plasma, and factor FXII-deficient plasma as factor-deficient plasma (Factor Deficient Plasma), and lupus anticoagrant-positive plasma (Lupus anticoagrant-positive plasma).
- Two Lupus Anticoagulant Plasma) samples and five unfractionated heparin-containing Plasma (Anticoagulant Plasma) samples were used (both manufactured by CliniSys Associates, Ltd.).
- Reagent Coagupia APTT-N (manufactured by Sekisui Medical Co., Ltd.) was used as the APTT reagent.
- the coagulation reaction measurement was performed using a blood coagulation automatic analyzer CP3000 (manufactured by Sekisui Medical Co., Ltd.). 50 ⁇ L of the sample was dispensed into a cuvette (reaction vessel) and then heated at 37 ° C. for 45 seconds, then 50 ⁇ L of APTT reagent heated to about 37 ° C. was added to the cuvette, and 50 ⁇ L of calcium chloride solution was further added after 171 seconds. It was added to initiate a coagulation reaction. The reaction was carried out while maintaining the temperature at about 37 ° C.
- the solidification reaction was measured (photometry) by irradiating the cuvette with light from an LED light having a wavelength of 660 nm and measuring the amount of scattered 90-degree laterally scattered light at 0.1 second intervals.
- the maximum measurement time was 360 seconds (3600 data, 0.1 second interval).
- APTT measurement (percentage method) The APTT of each sample was measured by the percentage method. That is, the time when the scattered light amount reached the maximum value within the measurement time was determined as the coagulation reaction end point, and the time when 50% of the scattered light amount at the coagulation reaction end point was reached was determined as APTT. Table 1 shows the types and numbers of test samples, and the minimum and maximum values of APTT in each type of sample.
- FIG. 10 shows a linear regression line of vT20% in the 20% calculation target area with respect to APTT by the percentage method for 24 samples.
- vT20% had a high correlation with the percent APTT.
- FIG. 11 shows the slope, intercept, and correlation coefficient of the first-order regression line with respect to the percentage method APTT of vT (vT5% to vT95%) in the 5 to 95% calculation target area.
- the slope of the regression line was 0.95 to 1.01
- the intercept was -2.0 to 0.4
- the correlation coefficient was 0.998 to 1.000 between the 5 to 95% calculation target areas (FIGS. 11A to 11C).
- the APTT measurement method based on the weighted average time is the in-vitro diagnostic drug approval standard by the Ministry of Health, Labor and Welfare, "Compared with the control measurement method, the correlation coefficient is 0.9 or more. In addition, it was confirmed that it has the performance of satisfying the slope of the regression line equation 0.9 to 1.1 ”. From these results, it was shown that APTT can be measured based on vT.
- Example 2 Measurement of coagulation time (PT) based on weighted average time 1.
- Method 1.1 Samples A total of 23 samples, 9 normal plasma samples and 14 abnormal plasma samples with extended PT, were used as test samples. As normal plasma, healthy person plasma was used. For the abnormal plasma, patient plasma to which the anticoagulant warfarin was administered was used, and 5 samples having a PT-INR value indicating the blood warfarin concentration of 1 to 2 and 5 samples of 2 to 3 and 3 to 3 4 samples up to 4 were used.
- the coagulation reaction measurement was performed using a blood coagulation automatic analyzer CP3000 (manufactured by Sekisui Medical Co., Ltd.). After dispensing 50 ⁇ L of the sample into a cuvette (reaction vessel), the cuvette was heated at 37 ° C. for 45 seconds, and then 100 ⁇ L of a thromboplastin solution heated to about 37 ° C. was added to the cuvette to start the coagulation reaction. The reaction was carried out while maintaining the temperature at about 37 ° C.
- the solidification reaction was measured (light measurement) by irradiating the cuvette with light from an LED light having a wavelength of 660 nm and measuring the amount of scattered 90-degree laterally scattered light at 0.1 second intervals.
- the maximum measurement time was 300 seconds (3000 data, 0.1 second interval).
- PT measurement (percentage method) The PT of each sample was measured by the percentage method. The time when the scattered light amount reached the maximum value within the measurement time was determined as the coagulation reaction end point, and the time when 45% of the scattered light amount at the coagulation reaction end point was reached was determined as PT. Table 2 shows the types and numbers of test samples, and the minimum and maximum values of PT in each type of sample.
- FIG. 13 shows a linear regression line of vT30% in the 30% calculation target area with respect to PT by the percentage method for 23 samples.
- vT30% had a high correlation with percentage PT.
- FIG. 14 shows the slope, intercept, and correlation coefficient of the first-order regression line with respect to the percentage method PT of vT (vT5% to vT95%) in the 5 to 95% calculation target area. Between the 5 to 95% calculation target areas, the slopes of the regression lines were 0.94 to 1.05, the intercepts were -0.1 to 0.7, and the correlation coefficients were all 1.000 (FIGS. 14A to 14C).
- the PT measurement method based on the weighted average time has a correlation coefficient of 0.9 or more compared to the control measurement method, which is the approval standard for in vitro diagnostics by the Ministry of Health, Labor and Welfare. In addition, it was confirmed that it has the performance of satisfying the slope of the regression line equation 0.9 to 1.1 ”. From these results, it was shown that PT can be measured based on vT.
- Example 3 Measurement of fibrinogen concentration based on weighted average time 1.
- Method 1.1 Sample Human Fibrinogen (Human Fibrinogen manufactured by Enzyme Research Laboratories, product name: FIB 2) was added to human fibrinogen-depleted plasma (Fibrinogen Deficient Human Plasma manufactured by Affinity Biologicals Inc., product name: Fg Deficient Plasma).
- sample 10 and physiological saline were mixed at volume ratios of 1: 9, 7: 3 and 10: 0, and the fibrinogen concentration ([Fbg]) was 98 mg / dL and 686 mg / dL, respectively.
- fibrinogen concentration [Fbg]
- the sample 10 and the human fibrinogen-depleted plasma were mixed at a volume ratio of 1: 9 to 10: 0 to prepare 10 concentration-series samples in which the fibrinogen concentration ([Fbg]) was stepwise different (Table 3).
- the fibrinogen measurement reagent As the fibrinogen measurement reagent, the thrombin reagent and sample diluent supplied with Coagupia Fbg (manufactured by Sekisui Medical Co., Ltd.) were used. The coagulation reaction was measured using an automatic blood coagulation analyzer CP3000 (manufactured by Sekisui Medical Co., Ltd.). 10 ⁇ L of the sample and 90 ⁇ L of the sample diluent were dispensed into the cuvette and heated at 37 ° C. for 45 seconds, and then 50 ⁇ L of the thrombin reagent heated to about 37 ° C. was added to the cuvette to start the coagulation reaction.
- an automatic blood coagulation analyzer CP3000 manufactured by Sekisui Medical Co., Ltd.
- the reaction was carried out while maintaining the temperature at about 37 ° C.
- the solidification reaction was measured by irradiating the cuvette with light from an LED light having a wavelength of 660 nm and measuring the amount of scattered 90-degree laterally scattered light at 0.1 second intervals.
- the maximum measurement time was 300 seconds (3000 data, 0.1 second interval).
- the coagulation reaction was measured twice for each of the three standard samples and the ten concentration series samples.
- the first-order regression line of the [Fbg] calculated value (mg / dL) by the weighted average time calculated from vT35% in the region is shown.
- the [Fbg] calculated value based on vT35% had a high correlation with the [Fbg] calculated value by the percentage method.
- FIG. 17 shows the slope, intercept, and phase of the first-order regression line of the [Fbg] calculated value calculated from vT (vT5% to vT95%) in the 5 to 95% calculation target area with respect to the [Fbg] calculated value by the percentage method. Shows the number of relationships. Between the 5 to 95% calculation target areas, the slope of the regression line was 0.94 to 1.02, the intercept was -31.5 to 51.0, and the correlation coefficient was 0.990 to 0.996 (FIGS. 17A to 17C).
- the weighted average time-based fibrinogen concentration measurement method produces results equivalent to the standard method based on the percentage method under all conditions from 5% to 95%, and therefore, an in vitro diagnostic drug by the Ministry of Health, Labor and Welfare.
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Abstract
様々な凝固反応を示す血液検体の凝固時間を正確に測定する方法の提供。被検検体と凝固時間測定試薬とが混和されてなる試料についての凝固反応を計測すること、得られた計測データから凝固速度に関する波形の演算対象域についての加重平均時間を算出すること、及び、該加重平均時間を血液凝固時間として決定すること、を含む、血液凝固時間測定方法。
Description
本発明は、血液凝固時間測定方法に関する。
血液凝固検査は、患者の血液検体に所定の試薬を添加して血液凝固時間等を測定することにより、患者の血液凝固能を診断するための検査である。血液凝固時間の典型的な例としては、プロトロンビン時間（ＰＴ）、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）、トロンビン時間などがある。血液凝固検査によって患者の止血能力や線溶能力を調べることができる。血液凝固能の異常は、主に凝固時間の延長を引き起こす。例えば、凝固時間の延長は、凝固阻害薬剤の影響、凝固関与成分の減少、先天的な血液凝固因子の欠乏、後天的な凝固反応を阻害する自己抗体などを原因とする。
近年では、血液凝固検査の自動計測を行う自動分析装置が汎用されており、血液凝固検査を簡便に実施することが可能である。例えば、ある種の自動分析装置では、血液検体に試薬を添加して得られる混合液に光を当て、得られた光量の変化に基づいて該血液検体の凝固反応を計測する。例えば、散乱光量を計測する場合、血液検体への試薬添加からある程度の時間が経過した時点で、凝固の進行により散乱光量が急激に上昇し、その後、凝固反応が終了に近づくとともに散乱光量は飽和し、プラトーに達する。このような散乱光量の時間的変化に基づいて血液凝固時間を測定することができる。
自動分析装置による凝固時間の算出法としては、パーセント法、微分法などいくつかの手法が用いられている（特許文献１参照）。散乱光量に基づく凝固時間算出の場合、パーセント法では、典型的には、計測した散乱光量がその最大値の一定割合に達する時点までの時間を凝固時間として算出する。パーセント法は、正常検体だけでなく、低フィブリノーゲン検体、乳び検体、溶血検体などの異常検体でもかなり正確な凝固時間の算出を可能にする。その一方で、パーセント法に基づく自動分析では、低フィブリノーゲン検体などの凝固能の低い異常検体でも最大散乱光量を検出できるように検体の計測時間を長く設定する必要があるため、分析に時間がかかる。
微分法では、典型的には、散乱光量の微分値がピーク又はその一定割合に達する時点までの時間を凝固時間として算出する。しかし、低フィブリノーゲン検体などの凝固能の低い異常検体では散乱光量の微分値に明瞭なピークがみられないことがある。また異常検体では、微分値のピークが２つ以上生じることがある。微分値曲線のフィッティングにより作成した単峰ピークの曲線に基づいて凝固時間を算出する手法が使用されることがあるが、フィッティングは検体の凝固能に関する正確な情報を損なうことがある。
さらに、分析装置での測光データには、装置、試薬、検体の状態などに起因する様々なノイズが含まれ、それらは凝固時間の誤検出をもたらし得る。血液検体の自動分析では、ノイズの悪影響を除去して信頼性のある凝固時間を算出することが求められる。
本発明は、様々な血液凝固反応曲線を示す血液検体の凝固時間を正確に測定することができる、血液凝固時間測定方法に関する。
すなわち、本発明は、以下を提供する。
〔１〕血液凝固時間測定方法であって、
被検検体と凝固時間測定試薬とが混和されてなる試料についての凝固反応を計測すること、
得られた計測データから、凝固速度に関する波形の演算対象域についての加重平均時間を算出すること、及び
該加重平均時間に基づいて、該被検検体の血液凝固時間を決定すること、
を含み、
該演算対象域が、該凝固速度に関する波形における、該波形が所定の下限値以上である領域である、
方法。
〔２〕前記凝固速度に関する波形が、凝固反応曲線又はその相対値の１次微分曲線である、〔１〕記載の方法。
〔３〕前記加重平均時間が、前記凝固速度に関する波形をF(t)（tは時間）、F(t)が最大値のx％（xは、5～95の範囲で設定される所定値）であるときの時間をt1、t2（t1<t2）とするとき、下記式：
で表される、〔１〕又は〔２〕記載の方法。
〔４〕前記被検検体が血漿である、〔１〕～〔３〕のいずれか１項記載の方法。
〔５〕前記血液凝固時間が活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）、プロトロンビン時間（ＰＴ））、フィブリノーゲン濃度測定での凝固時間である、〔１〕～〔４〕のいずれか１項記載の方法。
〔６〕前記〔１〕～〔５〕のいずれか１項記載の方法によって測定された被検検体の血液凝固時間に基づいて該被検検体の凝固因子濃度を測定することを含む、凝固因子濃度の測定方法。
〔７〕前記被検検体が血漿である、〔６〕記載の方法。
〔８〕前記凝固因子がフィブリノーゲンである、〔６〕又は〔７〕記載の方法。
〔９〕前記血液凝固時間がフィブリノーゲン濃度測定での凝固時間である、〔８〕記載の方法。
〔１〕血液凝固時間測定方法であって、
被検検体と凝固時間測定試薬とが混和されてなる試料についての凝固反応を計測すること、
得られた計測データから、凝固速度に関する波形の演算対象域についての加重平均時間を算出すること、及び
該加重平均時間に基づいて、該被検検体の血液凝固時間を決定すること、
を含み、
該演算対象域が、該凝固速度に関する波形における、該波形が所定の下限値以上である領域である、
方法。
〔２〕前記凝固速度に関する波形が、凝固反応曲線又はその相対値の１次微分曲線である、〔１〕記載の方法。
〔３〕前記加重平均時間が、前記凝固速度に関する波形をF(t)（tは時間）、F(t)が最大値のx％（xは、5～95の範囲で設定される所定値）であるときの時間をt1、t2（t1<t2）とするとき、下記式：
〔４〕前記被検検体が血漿である、〔１〕～〔３〕のいずれか１項記載の方法。
〔５〕前記血液凝固時間が活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）、プロトロンビン時間（ＰＴ））、フィブリノーゲン濃度測定での凝固時間である、〔１〕～〔４〕のいずれか１項記載の方法。
〔６〕前記〔１〕～〔５〕のいずれか１項記載の方法によって測定された被検検体の血液凝固時間に基づいて該被検検体の凝固因子濃度を測定することを含む、凝固因子濃度の測定方法。
〔７〕前記被検検体が血漿である、〔６〕記載の方法。
〔８〕前記凝固因子がフィブリノーゲンである、〔６〕又は〔７〕記載の方法。
〔９〕前記血液凝固時間がフィブリノーゲン濃度測定での凝固時間である、〔８〕記載の方法。
本発明の方法によれば、正常検体や異常検体を含む様々な血液凝固反応曲線を示す血液検体の凝固時間を正確に測定することができる。また自動分析装置でリアルタイムに多数の検体を分析する場合に、本発明の方法は、従来のパーセント法と比べて、１検体あたりの分析時間を短縮化することができ、分析効率を向上させ得る。
血液凝固検査では、血液検体に所定の試薬を添加し、その後の血液凝固反応を計測し、凝固反応から血液凝固時間を測定する。以下の本明細書において、血液検体を検体と称する場合がある。血液凝固反応の計測には、一般的な手段、例えば、散乱光量、透過度、吸光度等を計測する光学的な手段、又は血漿の粘度を計測する力学的な手段などが用いられる。正常検体の凝固反応曲線は、計測手段に依存するが、基本的にはシグモイド形状を示す。例えば、正常検体の散乱光量に基づく凝固反応曲線は、通常、試薬添加からある程度の時間が経過した時点で凝固の進行により急激に上昇し、その後、凝固反応が終了に近づくとともにプラトーに達する。一方で、凝固異常を有する異常検体の凝固反応曲線は、曲線の立ち上がり時間の遅れ、緩やかな上昇など、異常原因に依存して様々な形状を示す。異常検体の凝固反応曲線の多様さは、自動分析装置での凝固時間の正確な測定を困難にしている。
従来の一般的な血液凝固時間測定では、少なくとも凝固反応終了までのデータを取得し、取得したデータに基づいて凝固時間を算出する。例えば、散乱光量に基づく凝固時間算出の場合、散乱光量が飽和した時点を凝固反応終了と判断した後、試薬添加時点から凝固反応終了時点までの間で凝固反応曲線が最大速度又はその１／Ｎに達した時点を凝固時間として決定する手法（微分法）、凝固反応終了時点の散乱光量の１／Ｎに達した時点を凝固時間として決定する手法（パーセント法、特許文献１参照）、などがある。しかしながら、上述のような異常検体の凝固反応曲線の異常な形状やノイズにより、凝固反応速度のピークや凝固反応終了の誤検知が起こり、例えば、反応速度のピークや反応終了が早過ぎる時点で検知されることがある。このような誤検知は、不正確な凝固時間の算出につながる。
自動分析装置では、多数の検体を効率よく分析するため、１つの検体について必要なデータが取得されたら速やかに計測を終了し、次の検体の計測を開始することが望まれる。しかし、こうした手法には、上述した早過ぎる時点での凝固反応終了の誤検知が、早過ぎる計測終了を招き、必要なデータの取り逃しをもたらすリスクがある。一方、一検体あたりの凝固反応計測時間を十分に長い時間に固定しておけば、凝固反応終了の誤検知によるデータ取り逃しを防止できる。しかし、こうした手法は、多くの検体にとって計測時間が必要以上に長くなるため、全体的な分析効率を低下させる。
本発明は、上記のような凝固反応曲線の異常な形状に起因する凝固時間の誤検出を防止し、正確な凝固時間測定を可能にする。また本発明によれば、正常検体や異常検体を含む様々な血液検体に対して、それぞれの凝固時間測定に必要最低限な凝固反応計測時間を適用することができるので、１検体あたりの分析時間を短縮化することができる。
〔血液凝固時間測定方法〕
本発明は、血液検体の血液凝固時間測定方法に関する。本発明の血液凝固時間測定方法（以下、本発明の方法ともいう）は、被検検体と凝固時間測定試薬とが混和されてなる試料についての凝固反応を計測することと、得られた計測データから、凝固速度に関する波形の所定の演算対象域についての加重平均時間を算出することを含む。本発明の方法の一実施形態を、図１を参照して説明する。本方法では、まず被検検体から試料が調製され、次いで該試料についての凝固反応計測が実行される（ステップ１）。得られた計測データが解析されて、該試料についての凝固速度に関する波形が取得され、次いで該波形の所定の演算対象域についての加重平均時間が算出される（ステップ２）。得られた加重平均時間に基づいて、被検検体の凝固時間が決定される（ステップ３）。
本発明は、血液検体の血液凝固時間測定方法に関する。本発明の血液凝固時間測定方法（以下、本発明の方法ともいう）は、被検検体と凝固時間測定試薬とが混和されてなる試料についての凝固反応を計測することと、得られた計測データから、凝固速度に関する波形の所定の演算対象域についての加重平均時間を算出することを含む。本発明の方法の一実施形態を、図１を参照して説明する。本方法では、まず被検検体から試料が調製され、次いで該試料についての凝固反応計測が実行される（ステップ１）。得られた計測データが解析されて、該試料についての凝固速度に関する波形が取得され、次いで該波形の所定の演算対象域についての加重平均時間が算出される（ステップ２）。得られた加重平均時間に基づいて、被検検体の凝固時間が決定される（ステップ３）。
１．凝固反応計測
凝固反応計測では、試薬を混合した被検検体の凝固反応を計測する。この計測で得られる凝固反応の時系列データから、血液凝固時間が測定される。本発明の方法で測定される血液凝固時間の例としては、プロトロンビン時間（ＰＴ）、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）、フィブリノーゲン濃度（Ｆｂｇ）測定での凝固時間などが挙げられる。以下の本明細書においては、主に、凝固時間として活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）を例に挙げて、本発明の方法を説明する。その他の凝固時間（例えばプロトロンビン時間（ＰＴ））への本発明の方法の変更は、当業者であれば実施可能である。
凝固反応計測では、試薬を混合した被検検体の凝固反応を計測する。この計測で得られる凝固反応の時系列データから、血液凝固時間が測定される。本発明の方法で測定される血液凝固時間の例としては、プロトロンビン時間（ＰＴ）、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）、フィブリノーゲン濃度（Ｆｂｇ）測定での凝固時間などが挙げられる。以下の本明細書においては、主に、凝固時間として活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）を例に挙げて、本発明の方法を説明する。その他の凝固時間（例えばプロトロンビン時間（ＰＴ））への本発明の方法の変更は、当業者であれば実施可能である。
本発明の方法において、被検血液検体としては、被検者の血漿が好ましく用いられる。該検体には、凝固検査に通常用いられる抗凝固剤が添加され得る。例えば、クエン酸ナトリウム入り採血管を用いて採血された後、遠心分離されることで血漿が得られる。
該被検検体に凝固時間測定試薬が添加され、血液凝固反応を開始させる。試薬添加後の混合液の凝固反応が計測され得る。使用される凝固時間測定試薬は、測定目的に合わせて任意に選択することができる。各種凝固時間測定のための試薬は市販されている（例えば、ＡＰＴＴ試薬コアグピア ＡＰＴＴ－Ｎ；積水メディカル株式会社製）。凝固反応の計測には、一般的な手段、例えば、散乱光量、透過度、吸光度等を計測する光学的な手段、又は血漿の粘度を計測する力学的な手段などを用いればよい。凝固反応の反応開始時点は、典型的には、検体に試薬を混合して凝固反応を開始させた時点として定義され得るが、他のタイミングが反応開始時点として定義されてもよい。凝固反応の計測を継続する時間は、例えば、検体と試薬との混合の時点から数十秒～７分程度であり得る。この計測時間は、任意に定めた固定の値でもよいが、各検体の凝固反応の終了を検出した時点までとしてもよい。該計測時間の間、所定の間隔で凝固反応の進行状況の計測（光学的に検出する場合は測光）が繰り返し行われ得る。例えば、０．１秒間隔で計測が行われればよい。該計測中の混合液の温度は、通常の条件、例えば３０℃以上４０℃以下、好ましくは３５℃以上３９℃以下である。また、計測の各種条件は、被検検体や試薬、計測手段等に応じて適宜設定され得る。
上述の凝固反応計測における一連の操作は、自動分析装置を用いて行うことができる。自動分析装置の一例として、血液凝固自動分析装置ＣＰ３０００（積水メディカル株式会社製）が挙げられる。あるいは、一部の操作が手作業で行われてもよい。例えば、被検検体の調製を人間が行い、それ以降の操作は自動分析装置で行うことができる。
２．データ解析
２．１）データの前処理及び補正処理
次に、ステップ２のデータ解析について説明する。データ解析のフローを図２に示す。ステップ２のデータ解析は、ステップ１の凝固反応計測と並行して行われてもよく、又は予め測定した凝固反応計測のデータを用いて、後から行われてもよい。好ましくは、ステップ２のデータ解析は、ステップ１の凝固反応計測と並行して行われ、被検検体の凝固時間算出に必要なデータが取得できた時点で、該検体の凝固反応計測は終了され、次の検体の凝固反応計測に移行する。
２．１）データの前処理及び補正処理
次に、ステップ２のデータ解析について説明する。データ解析のフローを図２に示す。ステップ２のデータ解析は、ステップ１の凝固反応計測と並行して行われてもよく、又は予め測定した凝固反応計測のデータを用いて、後から行われてもよい。好ましくは、ステップ２のデータ解析は、ステップ１の凝固反応計測と並行して行われ、被検検体の凝固時間算出に必要なデータが取得できた時点で、該検体の凝固反応計測は終了され、次の検体の凝固反応計測に移行する。
ステップ２ａにおいて、凝固反応計測での計測データが取得される。このデータは、例えば上述のステップ２でのＡＰＴＴ測定で得られる試料の凝固反応過程を反映するデータである。例えば、被検検体と凝固時間測定試薬とを含む試料からの、塩化カルシウム液添加後の凝固反応の進行量（例えば散乱光量）の時間変化を示すデータが取得される。これら凝固反応計測で得られたデータを、本明細書において凝固反応情報とも称する。
ステップ２ａで取得される凝固反応情報の一例を図３に示す。図３は散乱光量に基づく凝固反応曲線であり、横軸は塩化カルシウム液の添加後の経過時間（凝固反応時間）を示し、縦軸は散乱光量を示す。時間経過とともに、混合液の凝固反応が進むため、散乱光量は増加している。本明細書では、このような凝固反応時間に対する凝固反応量の変化を示す曲線を、凝固反応曲線と称する。
図３に示すような散乱光量に基づく凝固反応曲線は、通常、シグモイド状である。一方、透過光量に基づく凝固反応曲線は、通常、逆シグモイド状である。以降の本明細書では、凝固反応情報として散乱光量に基づく凝固反応曲線を用いたデータ解析について説明する。
必要に応じて、凝固反応曲線には、前処理が施されていてもよい（ステップ２ｂ）。該前処理には、ノイズを除去するための平滑化処理、又はゼロ点調整が含まれ得る。図４は、前処理（平滑化処理及びゼロ点調整）された図３の凝固反応曲線の一例を示す。平滑化処理には、公知のノイズ除去方法の何れかが用いられ得る。また図３に示すように、被検検体を含む混合液は元々光を散乱させるため、測定開始時点（時間0）での散乱光量は０より大きい。平滑化処理後のゼロ点調整により、図４に示すように時間０での散乱光量が０に調整される。図５Ａ及びＢは、それぞれ、前処理前及び後の図３の凝固反応曲線の部分拡大図を示す。図５Ｂでは、図５Ａのデータに対して、平滑化処理及びゼロ点調整が行われている。
凝固反応曲線の高さは、被検検体のフィブリノーゲン濃度に依存する。一方、フィブリノーゲン濃度には個人差があるため、該凝固反応曲線の高さは被検検体によって異なる。したがって、本方法では、必要に応じて、ステップ２ｃにおいて前処理後の凝固反応曲線を相対値化するための補正処理が行われる。該補正処理によって、フィブリノーゲン濃度に依存しない凝固反応曲線を得ることができ、それにより検体間での前処理後の凝固反応曲線の形状の差異を定量的に比較することができるようになる。
一実施形態において、該補正処理では、前処理後の凝固反応曲線を、最大値が所定値となるように補正する。好適には、該補正処理では、下記式(1)に従って、前処理後の凝固反応曲線から補正凝固反応曲線P(t)を求める。式(1)中、D(t)は前処理後の凝固反応曲線を表し、Dmax及びDminは、それぞれD(t)の最大値及び最小値を表し、Drangeは、D(t)の変化幅（すなわちDmax-Dmin）を表し、Aは、補正凝固反応曲線の最大値を表す任意の値である。
P(t)=[(D(t)-Dmin)/Drange]×A (1)
P(t)=[(D(t)-Dmin)/Drange]×A (1)
一例として、図６に、図４に示す凝固反応曲線が最大値１００となるように補正されたデータを示す。なお、図６では補正後の値が０から１００までとなるように補正したが、他の値（例えば０から１００００まで、すなわち式(1)でA＝１００００）であってもよい。また、この補正処理は必ずしも行われなくてもよい。
あるいは、上述のような補正処理は、後述する凝固速度に関する波形、又は該波形から抽出したパラメータに対して行われてもよい。例えば、補正処理が行われない前処理後の凝固反応曲線D(t)について凝固速度に関する波形を算出した後、これをP(t)に相当する値に変換することができる。あるいは、該凝固速度に関する波形からパラメータを抽出した後、該パラメータの値をP(t)に相当する値に変換することができる。
本明細書においては、上記のような補正凝固反応曲線、及び補正処理なし凝固反応曲線を、それぞれ補正０次曲線、及び未補正０次曲線ともいい、またこれらを総称して「０次曲線」ともいう。また本明細書においては、該補正０次曲線、及び該未補正０次曲線の１次微分曲線を、それぞれ補正１次曲線、及び未補正１次曲線ともいい、またこれらを総称して「１次曲線」ともいう。
２．２）凝固速度に関する波形の算出
ステップ２ｄでは、凝固速度に関する波形が算出される。本明細書において、該凝固速度に関する波形には、未補正１次曲線と、補正１次曲線とが含まれる。未補正１次曲線は、凝固反応曲線（未補正０次曲線）を１次微分して得られる値、すなわち任意の凝固反応時間における凝固反応量の変化率（凝固速度）を表す。補正１次曲線は、補正凝固反応曲線（補正０次曲線）を１次微分して得られる値、すなわち任意の凝固反応時間における凝固反応量の相対変化率を表す。したがって、該凝固速度に関する波形は、試料の凝固反応における凝固速度又はその相対値を表す波形であり得る。本明細書では、１次曲線で表される該凝固速度及びその相対値を含む血液凝固の進行を表す値を、１次微分値と総称することがある。凝固反応曲線又は補正凝固反応曲線（未補正及び補正０次曲線）の微分は、公知の手法を用いて行うことができる。図７は、図６に示す補正０次曲線を１次微分して得られる補正１次曲線を示す。図７の横軸は凝固反応時間を表し、縦軸は１次微分値を表す。
ステップ２ｄでは、凝固速度に関する波形が算出される。本明細書において、該凝固速度に関する波形には、未補正１次曲線と、補正１次曲線とが含まれる。未補正１次曲線は、凝固反応曲線（未補正０次曲線）を１次微分して得られる値、すなわち任意の凝固反応時間における凝固反応量の変化率（凝固速度）を表す。補正１次曲線は、補正凝固反応曲線（補正０次曲線）を１次微分して得られる値、すなわち任意の凝固反応時間における凝固反応量の相対変化率を表す。したがって、該凝固速度に関する波形は、試料の凝固反応における凝固速度又はその相対値を表す波形であり得る。本明細書では、１次曲線で表される該凝固速度及びその相対値を含む血液凝固の進行を表す値を、１次微分値と総称することがある。凝固反応曲線又は補正凝固反応曲線（未補正及び補正０次曲線）の微分は、公知の手法を用いて行うことができる。図７は、図６に示す補正０次曲線を１次微分して得られる補正１次曲線を示す。図７の横軸は凝固反応時間を表し、縦軸は１次微分値を表す。
２．３）パラメータの抽出
ステップ２ｅでは、該凝固速度に関する波形を特徴付けるパラメータの抽出が行われる。より詳細には、該パラメータの抽出工程においては、該凝固速度に関する波形から所定の演算対象域が抽出され、次いで該演算対象域についての加重平均時間が算出される。該加重平均時間に基づいて、被検検体の血液凝固時間を決定することができる（ステップ３）。該パラメータについて以下に説明する。
ステップ２ｅでは、該凝固速度に関する波形を特徴付けるパラメータの抽出が行われる。より詳細には、該パラメータの抽出工程においては、該凝固速度に関する波形から所定の演算対象域が抽出され、次いで該演算対象域についての加重平均時間が算出される。該加重平均時間に基づいて、被検検体の血液凝固時間を決定することができる（ステップ３）。該パラメータについて以下に説明する。
まず、凝固速度に関する波形から所定の演算対象域を抽出する手順を説明する。演算対象域とは、該凝固速度に関する波形のうち、該波形が所定の下限値以上である領域をいう。より詳細には、演算対象域は、凝固速度に関する波形（１次曲線）をF(t)（t=時間）、F(t)の最大値をVmaxとしたときに、F(t)≧Vmax × x％を満たすF(t)の領域（セグメント）である。より詳細には、該演算対象域は、Vmax≧F(t)≧Vmax × x％を満たす１次曲線F(t)の領域（セグメント）である。したがって、「Vmax × x%」は演算対象域の下限値を表す。演算対象域について図８を参照して説明する。図８には、１次曲線F(t)（t=時間）、及びF(t)の最大値Vmaxが示されている。また、Vmax × x％を示す基線が点線で図示されており、F(t)＝Vmax × x％となる時点t1、t2が示されている。演算対象域は、F(t)が基線以上且つVmax以下（F(t)≧Vmax × x%、t1≦t≦t2）の領域である。
加重平均点（vT, vH）は、演算対象域の「重み付き平均値」に相当する。加重平均点での凝固反応時間（t）を加重平均時間vTとする。すなわち、加重平均時間vTは、凝固反応開始時間から加重平均点までの時間であり、加重平均点のx座標である。またvTは、演算対象域の横軸方向に対する重心である。加重平均高さvHは、加重平均点のy座標である。
本明細書においては、所定の下限値に基づく演算対象域、及びその演算対象域に由来するvT及びvHを、該下限値のVmaxに対するパーセンテージに従って表すことがある。例えば、Vmaxのx％を下限値とする演算対象域を、「x％演算対象域」と称することがあり、また該「x％演算対象域」に由来するvT及びvHを、それぞれvTx％及びvHx％と称することがある。例えば、下限値がVmaxの20%である演算対象域は、20％演算対象域と称され、該演算対象域についてのvTは、vT20%と表される。図８には、下限値x%でのF(t)の演算対象域についての加重平均点（vTx％, vHx％）が表示されている。
１次曲線についての加重平均時間vTと加重平均高さvHは、以下の手順で求めることができる。まず、１次曲線F(t)の最大値がVmax、演算対象域の下限値がVmaxのx%であり、F(t)≧Vmax × x%を満たす時間tのデータ群をt[t1, …t2]とする（t1＜t2）。すなわち、F(t1)=Vmax × x%、F(t2)=Vmax × x%、時刻t1～t2のデータ群がt[t1, …t2]（t1＜t2）である。このとき、加重平均時間vT及び加重平均高さvHは、それぞれ次式(2)及び(3)で算出される。求めたvTとvHから、x%演算対象域についての加重平均点（vTx%, vHx%）が導かれる。
演算対象域の下限値は、Vmaxの0％より大きくVmax未満の範囲で決定することができる。演算対象域は１次曲線の形状を反映し、下限値が大きいほど、演算対象域は１次曲線のより上部の形状を反映する。本発明の方法において、凝固時間の測定に用いる加重平均時間を算出するための演算対象域の下限値（「Vmax × x%」）は、好ましくはVmaxの5～95％（すなわちx=5～95）の範囲で設定される所定値である。より詳細には、凝固時間の測定に用いる加重平均時間を算出するための演算対象域の下限値は、凝固時間がＡＰＴＴの場合、好ましくはVmaxの5～95％（x=5～95）、より好ましくはVmaxの5～50％（x=5～50）、さらに好ましくはVmaxの10～35％（x=10～35）の範囲で設定される所定値であり、凝固時間がＰＴの場合、好ましくはVmaxの5～95％（x=5～95）、より好ましくはVmaxの10～80％（x=10～80）、さらに好ましくはVmaxの25～50％（x=25～50）の範囲で設定される所定値である。
図９に、１次曲線の演算対象域と、算出される加重平均点との関係を示す。図９において、上段、中段、及び下段は、下限値がそれぞれVmaxの5%、40%及び75%の場合の１次曲線の演算対象域と、加重平均点（黒丸印）を示す。演算対象域の変化に伴って、加重平均点の位置は、図９に示すように変化する。
上述の図８、９では、補正１次曲線を例として演算対象域、及びその加重平均点について説明したが、未補正１次曲線でも同様のパラメータが算出され得る。
３．凝固時間測定
後述の実施例に示すとおり、上記の手順で算出される加重平均時間vTは、被検検体の血液凝固時間と高い相関を有する。したがって、該加重平均時間vTに基づいて被検検体の凝固時間を決定することができる。例えば、凝固時間がＡＰＴＴやＰＴの場合、該加重平均時間vTを凝固時間として決定することができる。本発明の方法では、凝固反応の１次曲線の加重平均を求めることによって、単純に１次曲線のピークを検出する場合と比べて、計測ノイズや、凝固異常に起因する複峰性ピークなどの影響を受けにくい、より信頼性の高い凝固時間測定が可能になる。
後述の実施例に示すとおり、上記の手順で算出される加重平均時間vTは、被検検体の血液凝固時間と高い相関を有する。したがって、該加重平均時間vTに基づいて被検検体の凝固時間を決定することができる。例えば、凝固時間がＡＰＴＴやＰＴの場合、該加重平均時間vTを凝固時間として決定することができる。本発明の方法では、凝固反応の１次曲線の加重平均を求めることによって、単純に１次曲線のピークを検出する場合と比べて、計測ノイズや、凝固異常に起因する複峰性ピークなどの影響を受けにくい、より信頼性の高い凝固時間測定が可能になる。
さらに、本発明の方法においては、凝固反応の１次曲線が最大値Vmaxに達した後、演算対象域の下限値（Vmax × x％）以下になったときに凝固時間を測定することが可能になる。したがって本発明の方法においては、従来のパーセント法のように凝固反応がプラトーに達するまで計測を続けなくともよい。さらに、自動分析装置により多検体を分析する場合においても、本発明の方法によれば、従来のパーセント法のように、凝固能の低い異常検体に備えて長い計測時間を設定しておく必要がない。したがって、本発明によれば、検体の分析時間を短縮化又は最適化して、分析の効率を向上させることができる。
４．凝固因子濃度測定
通常の血液には、凝固第I～第XIII因子などの凝固因子が含まれ、これらの凝固因子の異常や欠乏は凝固能の異常をもたらす。通常、被検検体の凝固因子濃度は、凝固因子ごとの専用試薬を用いて該被検検体から調製した測定試料の凝固時間に基づいて測定することができる。したがって、本発明の方法により加重平均時間に基づいて測定された該測定試料の凝固時間を用いて、該被検検体の凝固因子濃度を測定することができる。通常、凝固因子濃度は、凝固時間と凝固因子濃度との関係を示す検量線に基づいて測定される。したがって、予め作成した検量線に、本発明の方法で測定した測定試料の凝固時間を当てはめることで、該被検検体の凝固因子濃度を測定することができる。本発明の方法で測定される凝固因子の好ましい例としては、第I因子（フィブリノーゲン）、第VIII因子、第IX因子などが挙げられる。
通常の血液には、凝固第I～第XIII因子などの凝固因子が含まれ、これらの凝固因子の異常や欠乏は凝固能の異常をもたらす。通常、被検検体の凝固因子濃度は、凝固因子ごとの専用試薬を用いて該被検検体から調製した測定試料の凝固時間に基づいて測定することができる。したがって、本発明の方法により加重平均時間に基づいて測定された該測定試料の凝固時間を用いて、該被検検体の凝固因子濃度を測定することができる。通常、凝固因子濃度は、凝固時間と凝固因子濃度との関係を示す検量線に基づいて測定される。したがって、予め作成した検量線に、本発明の方法で測定した測定試料の凝固時間を当てはめることで、該被検検体の凝固因子濃度を測定することができる。本発明の方法で測定される凝固因子の好ましい例としては、第I因子（フィブリノーゲン）、第VIII因子、第IX因子などが挙げられる。
本発明の方法において、凝固因子濃度の測定に用いる凝固時間（加重平均時間）を算出するための演算対象域の下限値（「Vmax × x%」）は、好ましくはVmaxの5～95％（すなわちx=5～95）の範囲で設定される所定値であり、より好ましくはVmaxの30～95％（すなわちx=30～95）、さらに好ましくはVmaxの60～75％（すなわちx=60～75）の範囲で設定される所定値である。
５．他の凝固反応計測法への応用
以上、散乱光量に基づく凝固反応計測の場合を例として、本発明の血液凝固時間測定方法を説明した。しかしながら、当業者であれば、本発明の方法を他の凝固反応計測法（例えば透過度、吸光度、粘度などに基づく血液凝固反応計測法）を用いた血液凝固時間測定方法に応用することが可能である。例えば、透過光量に基づくような逆シグモイド状の凝固反応曲線から得られる１次曲線F(t)は、上述した散乱光量に基づくものに対して正負が逆になる。このような場合に、パラメータの計算においてF(t)の符号が逆転すること、例えば、最大値Vmaxは最小値Vminに置き換えられ、x％演算対象域はF(t)≦Vmin × x％を満たす領域であること等は、当業者に明らかである。
以上、散乱光量に基づく凝固反応計測の場合を例として、本発明の血液凝固時間測定方法を説明した。しかしながら、当業者であれば、本発明の方法を他の凝固反応計測法（例えば透過度、吸光度、粘度などに基づく血液凝固反応計測法）を用いた血液凝固時間測定方法に応用することが可能である。例えば、透過光量に基づくような逆シグモイド状の凝固反応曲線から得られる１次曲線F(t)は、上述した散乱光量に基づくものに対して正負が逆になる。このような場合に、パラメータの計算においてF(t)の符号が逆転すること、例えば、最大値Vmaxは最小値Vminに置き換えられ、x％演算対象域はF(t)≦Vmin × x％を満たす領域であること等は、当業者に明らかである。
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１ 加重平均時間に基づく凝固時間（ＡＰＴＴ）測定
１．方法
１．１）試料
被検検体として、正常血漿９検体と、ＡＰＴＴが延長している異常血漿１５検体の合計２４検体を使用した。正常血漿には、CliniSys Associates, Ltd.製のNormal Donor Plasmaを用いた。異常血漿には、凝固因子欠乏血漿（Factor Deficient Plasma）として第FVIII因子欠乏血漿、第FIX因子欠乏血漿、第FXI因子欠乏血漿及び第FXII因子欠乏血漿を各２検体、ループスアンチコアグラント陽性血漿（Lupus Anticoagulant Plasma）２検体、及び、未分画ヘパリン含有血漿（Anticoagulant Plasma）５検体を用いた（いずれも、CliniSys Associates, Ltd.製）。
１．方法
１．１）試料
被検検体として、正常血漿９検体と、ＡＰＴＴが延長している異常血漿１５検体の合計２４検体を使用した。正常血漿には、CliniSys Associates, Ltd.製のNormal Donor Plasmaを用いた。異常血漿には、凝固因子欠乏血漿（Factor Deficient Plasma）として第FVIII因子欠乏血漿、第FIX因子欠乏血漿、第FXI因子欠乏血漿及び第FXII因子欠乏血漿を各２検体、ループスアンチコアグラント陽性血漿（Lupus Anticoagulant Plasma）２検体、及び、未分画ヘパリン含有血漿（Anticoagulant Plasma）５検体を用いた（いずれも、CliniSys Associates, Ltd.製）。
１．２）試薬
ＡＰＴＴ試薬としてコアグピア ＡＰＴＴ－Ｎ（積水メディカル株式会社製）を用いた。
ＡＰＴＴ試薬としてコアグピア ＡＰＴＴ－Ｎ（積水メディカル株式会社製）を用いた。
１．３）凝固反応計測
凝固反応計測は、血液凝固自動分析装置ＣＰ３０００（積水メディカル株式会社製）を用いて行った。検体５０μＬをキュベット（反応容器）に分注した後に３７℃で４５秒間加温し、次にキュベットに約３７℃に加温したＡＰＴＴ試薬５０μＬを添加し、さらに１７１秒経過後に塩化カルシウム液５０μＬを添加して凝固反応を開始させた。反応は、約３７℃に維持した状態で行った。凝固反応の計測（測光）は、波長６６０ｎｍのＬＥＤライトを光源とする光をキュベットに照射し、０．１秒間隔で９０度側方散乱光の散乱光量を測光することによって行った。最大計測時間は３６０秒（データ数３６００個、０．１秒間隔）とした。
凝固反応計測は、血液凝固自動分析装置ＣＰ３０００（積水メディカル株式会社製）を用いて行った。検体５０μＬをキュベット（反応容器）に分注した後に３７℃で４５秒間加温し、次にキュベットに約３７℃に加温したＡＰＴＴ試薬５０μＬを添加し、さらに１７１秒経過後に塩化カルシウム液５０μＬを添加して凝固反応を開始させた。反応は、約３７℃に維持した状態で行った。凝固反応の計測（測光）は、波長６６０ｎｍのＬＥＤライトを光源とする光をキュベットに照射し、０．１秒間隔で９０度側方散乱光の散乱光量を測光することによって行った。最大計測時間は３６０秒（データ数３６００個、０．１秒間隔）とした。
１．４）ＡＰＴＴ測定（パーセント法）
パーセント法により各検体のＡＰＴＴを測定した。すなわち、計測時間内で散乱光量が最大値に達した時点を凝固反応終了点として決定し、凝固反応終了点での散乱光量の５０％に到達した時点をＡＰＴＴとして決定した。被検検体の種別と数、及び各種別の検体中でのＡＰＴＴの最小値及び最大値を表１に示す。
パーセント法により各検体のＡＰＴＴを測定した。すなわち、計測時間内で散乱光量が最大値に達した時点を凝固反応終了点として決定し、凝固反応終了点での散乱光量の５０％に到達した時点をＡＰＴＴとして決定した。被検検体の種別と数、及び各種別の検体中でのＡＰＴＴの最小値及び最大値を表１に示す。
１．５）凝固反応曲線の作成
各検体からの測光データに対してノイズ除去を含む平滑化処理を行った後、測光開始時点の散乱光量が０となるようにゼロ点調整処理して凝固反応曲線P(t)を算出した。続いて、凝固反応曲線の最大値Pmaxが100となるように補正し、得られた補正凝固反応曲線（補正０次曲線）を１次微分して、補正１次曲線を算出した。
各検体からの測光データに対してノイズ除去を含む平滑化処理を行った後、測光開始時点の散乱光量が０となるようにゼロ点調整処理して凝固反応曲線P(t)を算出した。続いて、凝固反応曲線の最大値Pmaxが100となるように補正し、得られた補正凝固反応曲線（補正０次曲線）を１次微分して、補正１次曲線を算出した。
１．６）加重平均時間vTの算出
各検体から得た１次曲線から、5～95％演算対象域についての加重平均時間（vT5％～vT95％）を算出した。演算対象域の下限値x％を、１次曲線F(t)の最大高さVmax（100%）の5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%及び95%の１９段階に設定し、それぞれF(t)＝Vmax × x％を満たす時間t1及びt2（t1＜t2）を求めた。上記式(2)を用いて、２４検体のそれぞれから１９個の加重平均時間vT5％～vT95％を算出した。
各検体から得た１次曲線から、5～95％演算対象域についての加重平均時間（vT5％～vT95％）を算出した。演算対象域の下限値x％を、１次曲線F(t)の最大高さVmax（100%）の5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%及び95%の１９段階に設定し、それぞれF(t)＝Vmax × x％を満たす時間t1及びt2（t1＜t2）を求めた。上記式(2)を用いて、２４検体のそれぞれから１９個の加重平均時間vT5％～vT95％を算出した。
２．加重平均時間に基づくＡＰＴＴ測定
２．１）加重平均時間とＡＰＴＴとの相関性
パーセント法によるＡＰＴＴと、加重平均時間との相関性を評価した。5～95％演算対象域についての加重平均時間（vT5％～vT95％）のそれぞれについて、パーセント法によるＡＰＴＴとの一次回帰分析を行い、回帰直線の傾き、切片、及び相関係数を求めた。
２．１）加重平均時間とＡＰＴＴとの相関性
パーセント法によるＡＰＴＴと、加重平均時間との相関性を評価した。5～95％演算対象域についての加重平均時間（vT5％～vT95％）のそれぞれについて、パーセント法によるＡＰＴＴとの一次回帰分析を行い、回帰直線の傾き、切片、及び相関係数を求めた。
図１０に、２４検体についてのパーセント法によるＡＰＴＴに対する、20％演算対象域でのvT20％の一次回帰直線を示す。vT20％は、パーセント法によるＡＰＴＴに対して高い相関を有していた。図１１に、5～95％演算対象域でのvT（vT5％～vT95％）のパーセント法ＡＰＴＴに対する一次回帰直線の傾き、切片、及び相関係数を示す。5～95％演算対象域の間で、回帰直線の傾きは0.95～1.01、切片は-2.0～0.4、相関係数は0.998～1.000であった（図１１Ａ～Ｃ）。演算対象域が5%から95%までの全ての条件において、加重平均時間に基づくＡＰＴＴ測定法が、厚生労働省による体外診断用医薬品承認基準「対照測定方法と比較して、相関係数0.9以上、かつ、回帰直線式の傾き0.9～1.1」を満たす性能を有することが確認された。これらの結果から、vTに基づいてＡＰＴＴを測定することができることが示された。
２．２）測定の正確性
２４検体についての5～95％演算対象域での加重平均時間を、対照（パーセント法によるＡＰＴＴ）と比較した。図１２ＡＢの表の各行は、各検体の加重平均時間（vT5％～vT95％）を表し、加重平均時間と対照との差が対照の±５％以内（図１２Ａ）及び±２．５％以内（図１２Ｂ）に入った場合は、グレーで表されている。5～50％演算対象域で、全ての検体の加重平均時間が±５％以内の誤差で対照と一致し、10～35％演算対象域では、全ての検体の加重平均時間が±２．５％以内の誤差で対照と一致した。
２４検体についての5～95％演算対象域での加重平均時間を、対照（パーセント法によるＡＰＴＴ）と比較した。図１２ＡＢの表の各行は、各検体の加重平均時間（vT5％～vT95％）を表し、加重平均時間と対照との差が対照の±５％以内（図１２Ａ）及び±２．５％以内（図１２Ｂ）に入った場合は、グレーで表されている。5～50％演算対象域で、全ての検体の加重平均時間が±５％以内の誤差で対照と一致し、10～35％演算対象域では、全ての検体の加重平均時間が±２．５％以内の誤差で対照と一致した。
実施例２ 加重平均時間に基づく凝固時間（ＰＴ）測定
１．方法
１．１）試料
被検検体として、正常血漿９検体と、ＰＴが延長している異常血漿１４検体の合計２３検体を使用した。正常血漿には、健常人血漿を用いた。異常血漿には、抗凝固薬のワーファリンが投与された患者血漿を用い、血中ワーファリン濃度を示すＰＴ－ＩＮＲ値が１から２までの５検体、２から３までの５検体、及び、３から４までの４検体を用いた。
１．方法
１．１）試料
被検検体として、正常血漿９検体と、ＰＴが延長している異常血漿１４検体の合計２３検体を使用した。正常血漿には、健常人血漿を用いた。異常血漿には、抗凝固薬のワーファリンが投与された患者血漿を用い、血中ワーファリン濃度を示すＰＴ－ＩＮＲ値が１から２までの５検体、２から３までの５検体、及び、３から４までの４検体を用いた。
１．２）凝固反応計測
凝固反応計測は、血液凝固自動分析装置ＣＰ３０００（積水メディカル株式会社製）を用いて行った。検体５０μＬをキュベット（反応容器）に分注した後に３７℃で４５秒間加温し、次にキュベットに約３７℃に加温したトロンボプラスチン液１００μＬを添加して凝固反応を開始させた。反応は、約３７℃に維持した状態で行った。凝固反応の計測（測光）は、波長６６０ｎｍのＬＥＤライトを光源とする光をキュベットに照射し、０．１秒間隔で９０度側方散乱光の散乱光量を測光することによって行った。最大計測時間は３００秒（データ数３０００個、０．１秒間隔）とした。
凝固反応計測は、血液凝固自動分析装置ＣＰ３０００（積水メディカル株式会社製）を用いて行った。検体５０μＬをキュベット（反応容器）に分注した後に３７℃で４５秒間加温し、次にキュベットに約３７℃に加温したトロンボプラスチン液１００μＬを添加して凝固反応を開始させた。反応は、約３７℃に維持した状態で行った。凝固反応の計測（測光）は、波長６６０ｎｍのＬＥＤライトを光源とする光をキュベットに照射し、０．１秒間隔で９０度側方散乱光の散乱光量を測光することによって行った。最大計測時間は３００秒（データ数３０００個、０．１秒間隔）とした。
１．３）ＰＴ測定（パーセント法）
パーセント法により各検体のＰＴを測定した。計測時間内で散乱光量が最大値に達した時点を凝固反応終了点として決定し、凝固反応終了点での散乱光量の４５％に到達した時点をＰＴとして決定した。被検検体の種別と数、及び各種別の検体中でのＰＴの最小値及び最大値を表２に示す。
パーセント法により各検体のＰＴを測定した。計測時間内で散乱光量が最大値に達した時点を凝固反応終了点として決定し、凝固反応終了点での散乱光量の４５％に到達した時点をＰＴとして決定した。被検検体の種別と数、及び各種別の検体中でのＰＴの最小値及び最大値を表２に示す。
１．４）加重平均時間vTの算出
実施例１の１．５）及び１．６）と同様の手順で、２３検体についての補正１次曲線を算出し、加重平均時間vT5％～vT95％を算出した。
実施例１の１．５）及び１．６）と同様の手順で、２３検体についての補正１次曲線を算出し、加重平均時間vT5％～vT95％を算出した。
２．加重平均時間に基づくＰＴ測定
２．１）加重平均時間とＰＴとの相関性
実施例１の２．１）と同様の手順で、5～95％演算対象域についての加重平均時間（vT5％～vT95％）のそれぞれについて、パーセント法により測定したＰＴとの一次回帰分析を行い、回帰直線の傾き、切片、及び相関係数を求めた。
２．１）加重平均時間とＰＴとの相関性
実施例１の２．１）と同様の手順で、5～95％演算対象域についての加重平均時間（vT5％～vT95％）のそれぞれについて、パーセント法により測定したＰＴとの一次回帰分析を行い、回帰直線の傾き、切片、及び相関係数を求めた。
図１３に、２３検体についてのパーセント法によるＰＴに対する、30％演算対象域でのvT30％の一次回帰直線を示す。vT30％は、パーセント法によるＰＴに対して高い相関を有していた。図１４に、5～95％演算対象域でのvT（vT5％～vT95％）のパーセント法ＰＴに対する一次回帰直線の傾き、切片、及び相関係数を示す。5～95％演算対象域の間で、回帰直線の傾きは0.94～1.05、切片は-0.1～0.7、相関係数は全て1.000であった（図１４Ａ～Ｃ）。演算対象域が5%から95%までの全ての条件において、加重平均時間に基づくＰＴ測定法が、厚生労働省による体外診断用医薬品承認基準「対照測定方法と比較して、相関係数0.9以上、かつ、回帰直線式の傾き0.9～1.1」を満たす性能を有することが確認された。これらの結果から、vTに基づいてＰＴを測定することができることが示された。
２．２）測定の正確性
２３検体についての5～95％演算対象域での加重平均時間を、対照（パーセント法によるＰＴ）と比較した。図１５ＡＢの表の各行は、各検体の加重平均時間（vT5％～vT95％）を表し、加重平均時間と対照との差が対照の±５％以内（図１５Ａ）及び±２．５％以内（図１５Ｂ）に入った場合は、グレーで表されている。10～80％演算対象域で、全ての検体の加重平均時間が±５％以内の誤差で対照と一致し、25～50％演算対象域では、全ての検体の加重平均時間が±２．５％以内の誤差で対照と一致した。
２３検体についての5～95％演算対象域での加重平均時間を、対照（パーセント法によるＰＴ）と比較した。図１５ＡＢの表の各行は、各検体の加重平均時間（vT5％～vT95％）を表し、加重平均時間と対照との差が対照の±５％以内（図１５Ａ）及び±２．５％以内（図１５Ｂ）に入った場合は、グレーで表されている。10～80％演算対象域で、全ての検体の加重平均時間が±５％以内の誤差で対照と一致し、25～50％演算対象域では、全ての検体の加重平均時間が±２．５％以内の誤差で対照と一致した。
実施例３ 加重平均時間に基づくフィブリノーゲン濃度測定
１．方法
１．１）試料
ヒトフィブリノーゲン除去血漿（Affinity Biologicals Inc.製のFibrinogen Deficient Human Plasma、製品名：Fg Deficient Plasma）にヒトフィブリノーゲン（Enzyme Research Laboratories製のHuman Fibrinogen、製品名：FIB 2）を添加してフィブリノーゲン濃度（[Ｆｂｇ]）が９８０ｍｇ／ｄＬの検体（検体１０）を作製した。検量線作成のための標準検体として、検体１０と生理食塩水を容量比１：９、７：３及び１０：０で混合し、フィブリノーゲン濃度（[Ｆｂｇ]）がそれぞれ９８ｍｇ／ｄＬ、６８６ｍｇ／ｄＬ、及び９８０ｍｇ／ｄＬの３つの検体を調製した。また、検体１０と前記ヒトフィブリノーゲン除去血漿を容量比１：９から１０：０で混合し、フィブリノーゲン濃度（[Ｆｂｇ]）が段階的に異なる１０個の濃度系列検体を調製した（表３）。
１．方法
１．１）試料
ヒトフィブリノーゲン除去血漿（Affinity Biologicals Inc.製のFibrinogen Deficient Human Plasma、製品名：Fg Deficient Plasma）にヒトフィブリノーゲン（Enzyme Research Laboratories製のHuman Fibrinogen、製品名：FIB 2）を添加してフィブリノーゲン濃度（[Ｆｂｇ]）が９８０ｍｇ／ｄＬの検体（検体１０）を作製した。検量線作成のための標準検体として、検体１０と生理食塩水を容量比１：９、７：３及び１０：０で混合し、フィブリノーゲン濃度（[Ｆｂｇ]）がそれぞれ９８ｍｇ／ｄＬ、６８６ｍｇ／ｄＬ、及び９８０ｍｇ／ｄＬの３つの検体を調製した。また、検体１０と前記ヒトフィブリノーゲン除去血漿を容量比１：９から１０：０で混合し、フィブリノーゲン濃度（[Ｆｂｇ]）が段階的に異なる１０個の濃度系列検体を調製した（表３）。
１．２）凝固反応計測
フィブリノーゲン測定試薬は、コアグピアＦｂｇ（積水メディカル株式会社製）に付属のトロンビン試薬と検体希釈液を用いた。凝固反応計測は、血液凝固自動分析装置ＣＰ３０００（積水メディカル株式会社製）を用いて行った。検体１０μＬと検体希釈液９０μＬをキュベットに分注し、３７℃で４５秒間加温した後、キュベットに約３７℃に加温したトロンビン試薬５０μＬを添加して凝固反応を開始させた。反応は、約３７℃に維持した状態で行った。凝固反応の計測は、波長６６０ｎｍのＬＥＤライトを光源とする光をキュベットに照射し、０．１秒間隔で９０度側方散乱光の散乱光量を測光することによって行った。最大計測時間は３００秒（データ数３０００個、０．１秒間隔）とした。凝固反応の計測は、３つの標準検体及び１０個の濃度系列検体について、それぞれ２回ずつ行った。
フィブリノーゲン測定試薬は、コアグピアＦｂｇ（積水メディカル株式会社製）に付属のトロンビン試薬と検体希釈液を用いた。凝固反応計測は、血液凝固自動分析装置ＣＰ３０００（積水メディカル株式会社製）を用いて行った。検体１０μＬと検体希釈液９０μＬをキュベットに分注し、３７℃で４５秒間加温した後、キュベットに約３７℃に加温したトロンビン試薬５０μＬを添加して凝固反応を開始させた。反応は、約３７℃に維持した状態で行った。凝固反応の計測は、波長６６０ｎｍのＬＥＤライトを光源とする光をキュベットに照射し、０．１秒間隔で９０度側方散乱光の散乱光量を測光することによって行った。最大計測時間は３００秒（データ数３０００個、０．１秒間隔）とした。凝固反応の計測は、３つの標準検体及び１０個の濃度系列検体について、それぞれ２回ずつ行った。
１．３）凝固時間測定（パーセント法）によるフィブリノーゲン濃度の算出
パーセント法により３つの標準検体及び濃度系列１０検体の凝固時間を測定した。すなわち、凝固反応終了点での散乱光量の６３％に到達した時点を凝固時間として決定した。各検体の凝固時間は、２回の凝固反応計測に基づき、それぞれ２回測定された。３つの標準検体から測定した凝固時間について、２回の測定の平均値を算出し、該平均値の対数を該標準検体の[Ｆｂｇ]（ｍｇ／ｄＬ）の対数に対してプロットして、パーセント法による検量線を作成した。作成した検量線に従って、各濃度系列検体のフィブリノーゲン濃度（パーセント法による[Ｆｂｇ]演算値、ｍｇ／ｄＬ）を算出した。
パーセント法により３つの標準検体及び濃度系列１０検体の凝固時間を測定した。すなわち、凝固反応終了点での散乱光量の６３％に到達した時点を凝固時間として決定した。各検体の凝固時間は、２回の凝固反応計測に基づき、それぞれ２回測定された。３つの標準検体から測定した凝固時間について、２回の測定の平均値を算出し、該平均値の対数を該標準検体の[Ｆｂｇ]（ｍｇ／ｄＬ）の対数に対してプロットして、パーセント法による検量線を作成した。作成した検量線に従って、各濃度系列検体のフィブリノーゲン濃度（パーセント法による[Ｆｂｇ]演算値、ｍｇ／ｄＬ）を算出した。
１．４）加重平均時間vTによるフィブリノーゲン濃度の算出
実施例１の１．５）及び１．６）と同様の手順で、１０個の濃度系列検体についてそれぞれ２回ずつ加重平均時間vT5％～vT95％を算出し、２０検体分の加重平均時間のデータを得た。また３つの標準検体についてそれぞれ２回ずつ加重平均時間vT5％～vT95％を算出し、２回の測定の平均値を算出した。該平均値の対数を該標準検体の[Ｆｂｇ]（ｍｇ／ｄＬ）の対数に対してプロットして、加重平均時間による検量線を作成した。作成した検量線に従って、各濃度系列検体のフィブリノーゲン濃度（加重平均時間による[Ｆｂｇ]演算値、ｍｇ／ｄＬ）を算出した。
実施例１の１．５）及び１．６）と同様の手順で、１０個の濃度系列検体についてそれぞれ２回ずつ加重平均時間vT5％～vT95％を算出し、２０検体分の加重平均時間のデータを得た。また３つの標準検体についてそれぞれ２回ずつ加重平均時間vT5％～vT95％を算出し、２回の測定の平均値を算出した。該平均値の対数を該標準検体の[Ｆｂｇ]（ｍｇ／ｄＬ）の対数に対してプロットして、加重平均時間による検量線を作成した。作成した検量線に従って、各濃度系列検体のフィブリノーゲン濃度（加重平均時間による[Ｆｂｇ]演算値、ｍｇ／ｄＬ）を算出した。
２．加重平均時間に基づくフィブリノーゲン濃度測定の評価
２．１）相関性解析
図１６に、濃度系列検体のデータ（ｎ＝１０×２）に基づく、パーセント法による[Ｆｂｇ]演算値に対する、35％演算対象域でのvT35％から算出した加重平均時間による[Ｆｂｇ]演算値（ｍｇ／ｄＬ）の一次回帰直線を示す。vT35％に基づく[Ｆｂｇ]演算値は、パーセント法による[Ｆｂｇ]演算値に対して高い相関を有していた。図１７に、5～95％演算対象域でのvT（vT5％～vT95％）から算出した[Ｆｂｇ]演算値の、パーセント法による[Ｆｂｇ]演算値に対する一次回帰直線の傾き、切片、及び相関係数を示す。5～95％演算対象域の間で、回帰直線の傾きは0.94～1.02、切片は-31.5～51.0、相関係数は0.990～0.996であった（図１７Ａ～Ｃ）。演算対象域が5%から95%までの全ての条件において、加重平均時間に基づくフィブリノーゲン濃度測定法が、パーセント法に基づく標準的方法と同等の結果をもたらすこと、したがって厚生労働省による体外診断用医薬品承認基準「対照測定方法と比較して、相関係数0.9以上、かつ、回帰直線式の傾き0.9～1.1」を満たす性能を有することが確認された。これらの結果から、vTに基づいてフィブリノーゲン濃度を測定することができることが示された。
２．１）相関性解析
図１６に、濃度系列検体のデータ（ｎ＝１０×２）に基づく、パーセント法による[Ｆｂｇ]演算値に対する、35％演算対象域でのvT35％から算出した加重平均時間による[Ｆｂｇ]演算値（ｍｇ／ｄＬ）の一次回帰直線を示す。vT35％に基づく[Ｆｂｇ]演算値は、パーセント法による[Ｆｂｇ]演算値に対して高い相関を有していた。図１７に、5～95％演算対象域でのvT（vT5％～vT95％）から算出した[Ｆｂｇ]演算値の、パーセント法による[Ｆｂｇ]演算値に対する一次回帰直線の傾き、切片、及び相関係数を示す。5～95％演算対象域の間で、回帰直線の傾きは0.94～1.02、切片は-31.5～51.0、相関係数は0.990～0.996であった（図１７Ａ～Ｃ）。演算対象域が5%から95%までの全ての条件において、加重平均時間に基づくフィブリノーゲン濃度測定法が、パーセント法に基づく標準的方法と同等の結果をもたらすこと、したがって厚生労働省による体外診断用医薬品承認基準「対照測定方法と比較して、相関係数0.9以上、かつ、回帰直線式の傾き0.9～1.1」を満たす性能を有することが確認された。これらの結果から、vTに基づいてフィブリノーゲン濃度を測定することができることが示された。
２．２）測定の正確性
濃度系列検体のデータ（表３の１０検体×２）についての5～95％演算対象域での加重平均時間に基づく[Ｆｂｇ]演算値を期待値（表３に示す検体のＦｂｇ濃度）と比較した。図１８ＡＢの表の各行は、各検体の加重平均時間（vT5％～vT95％）を表し、加重平均時間に基づく[Ｆｂｇ]演算値と期待値との誤差が±１０％以内（図１８Ａ）及び±５％以内（図１８Ｂ）に入った場合は、グレーで表されている。30～95％演算対象域で、全ての検体の[Ｆｂｇ]演算値の誤差は±１０％以内であり、60～75％演算対象域では、全ての検体の[Ｆｂｇ]演算値の誤差は±５％以内であった。
濃度系列検体のデータ（表３の１０検体×２）についての5～95％演算対象域での加重平均時間に基づく[Ｆｂｇ]演算値を期待値（表３に示す検体のＦｂｇ濃度）と比較した。図１８ＡＢの表の各行は、各検体の加重平均時間（vT5％～vT95％）を表し、加重平均時間に基づく[Ｆｂｇ]演算値と期待値との誤差が±１０％以内（図１８Ａ）及び±５％以内（図１８Ｂ）に入った場合は、グレーで表されている。30～95％演算対象域で、全ての検体の[Ｆｂｇ]演算値の誤差は±１０％以内であり、60～75％演算対象域では、全ての検体の[Ｆｂｇ]演算値の誤差は±５％以内であった。
Claims (9)
- 血液凝固時間測定方法であって、
被検検体と凝固時間測定試薬とが混和されてなる試料についての凝固反応を計測すること、
得られた計測データから、凝固速度に関する波形の演算対象域についての加重平均時間を算出すること、及び
該加重平均時間に基づいて、該被検検体の血液凝固時間を決定すること、
を含み、
該演算対象域が、該凝固速度に関する波形における、該波形が所定の下限値以上である領域である、
方法。 - 前記凝固速度に関する波形が、凝固反応曲線又はその相対値の１次微分曲線である、請求項１記載の方法。
- 前記加重平均時間が、前記凝固速度に関する波形をF(t)（tは時間）、F(t)が最大値のx％（xは、5～95の範囲で設定される所定値）であるときの時間をt1、t2（t1<t2）とするとき、下記式：
- 前記被検検体が血漿である、請求項１～３のいずれか１項記載の方法。
- 前記血液凝固時間が活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）、プロトロンビン時間（ＰＴ））、フィブリノーゲン濃度測定での凝固時間である、請求項１～４のいずれか１項記載の方法。
- 請求項１～５のいずれか１項記載の方法によって測定された被検検体の血液凝固時間に基づいて該被検検体の凝固因子濃度を測定することを含む、凝固因子濃度の測定方法。
- 前記被検検体が血漿である、請求項６記載の方法。
- 前記凝固因子がフィブリノーゲンである、請求項６又は７記載の方法。
- 前記血液凝固時間がフィブリノーゲン濃度測定での凝固時間である、請求項８記載の方法。
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| See also references of EP4116714A4 |
| WADA, HIDEO: "APTT waveform", JAPANESE JOURNAL OF THROMBOSIS AND HEMOSTASIS, vol. 29, no. 4, 10 August 2018 (2018-08-10), pages 413 - 420, XP055809543 * |
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