JP7402468B2 - 血液検体の血液凝固特性の分析方法 - Google Patents
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Description
〔1〕被検血液検体と凝固時間測定試薬とが混和されてなる試料についての凝固速度又は凝固加速度に関する波形を取得することと、
該凝固速度又は凝固加速度に関する波形を特徴付ける複数のパラメータを抽出することと、
該複数のパラメータに基づいて、該被検血液検体における凝固因子の活性レベル又は活性異常を判定することと、
を含む、血液検体の分析方法。
〔2〕前記複数のパラメータが、前記凝固速度に関する波形の複数の演算対象域をそれぞれ特徴付ける複数のパラメータを含むか、前記凝固加速度に関する波形の複数の演算対象域をそれぞれ特徴付ける複数のパラメータを含むか、又はそれらの組み合わせを含む、〔1〕記載の分析方法。
〔3〕前記複数のパラメータが、下記:
前記凝固速度に関する波形の複数の演算対象域についての加重平均時間vT、加重平均高さvH、ピーク幅vB、加重平均ピーク幅vW、加重平均高さについてのB扁平率vAB、加重平均高さについてのW扁平率vAW、加重平均時間についてのB時間率vTB、加重平均時間についてのW時間率vTW、平均時間vTa、平均高さvHa、平均高さについてのB扁平率vABa、平均高さについてのW扁平率vAWa、領域始点時間vTs、領域終点時間vTe、領域中央時間vTm、領域時間幅vTr、主ピーク始点時間vNs、主ピーク終点時間vNe、及び主ピーク幅vN;
前記凝固加速度に関する波形のプラスピークの複数の演算対象域についての加重平均時間pT、加重平均高さpH、ピーク幅pB、加重平均ピーク幅pW、加重平均高さについてのB扁平率pAB、加重平均高さについてのW扁平率pAW、加重平均時間についてのB時間率pTB、加重平均時間についてのW時間率pTW、主ピーク始点時間pNs、主ピーク終点時間pNe、及び主ピーク幅pN;ならびに、
前記凝固加速度に関する波形のマイナスピークの複数の演算対象域についての加重平均時間mT、加重平均高さmH、ピーク幅mB、加重平均ピーク幅mW、加重平均高さについてのB扁平率mAB、加重平均高さについてのW扁平率mAW、加重平均時間についてのB時間率mTB、加重平均時間についてのW時間率mTW、主ピーク始点時間mNs、主ピーク終点時間mNe、及び主ピーク幅mN、
からなる群より選択される1つ以上を含む、〔2〕記載の分析方法。
〔4〕前記凝固速度に関する波形をF(t)(tは時間)、F(t)が所定値xである時間をt1、t2(t1<t2)とするとき、前記演算対象域はF(t)≧xを満たす領域であり、前記vT及びvHは下記式で表され、
前記vWが、前記t1からt2までのF(t)≧vHとなる時間長であり、
前記vTs、vTeが、それぞれt1、t2であり、
前記vTrが、vTsからvTeまでの時間長であり、
前記vNsが、該演算対象域中で、F(t)が最大値を示す時間よりも小さく且つF(t)=xを示す時間のうち、最大の時間であり、
前記vNeが、該演算対象域中で、F(t)が最大値を示す時間よりも大きく且つF(t)=xを示す時間のうち、最小の時間であり、
前記vNが、vNsからvNeまでの時間長であり、
前記vABが、該vHと該vBとの比を表し、
前記vAWが、該vHと該vWとの比を表し、
前記vTBが、該vTと該vBとの比を表し、
前記vTWが、該vTと該vWとの比を表し、
前記vABaが、該vHaと該vBとの比を表し、
前記vAWaが、該vHaと該vWとの比を表す、
〔3〕記載の分析方法。
〔5〕前記凝固加速度に関する波形をF’(t)(tは時間)、F’(t)が所定値xである時間をt1、t2(t1<t2)とするとき、前記演算対象域はF’(t)≧xを満たす領域であり、前記pT及びpHは下記式で表され、
前記pWが、前記t1からt2までのF’(t)≧pHとなる時間長であり、
前記pNsが、該演算対象域中で、F’(t)が最大値を示す時間よりも小さく且つF’(t)=xを示す時間のうち、最大の時間であり、
前記pNeが、該演算対象域中で、F’(t)が最大値を示す時間よりも大きく且つF’(t)=xを示す時間のうち、最小の時間であり、
前記pNが、pNsからpNeまでの時間長であり、
前記pABが、該pHと該pBとの比を表し、
前記pAWが、該pHと該pWとの比を表し、
前記pTBが、該pTと該pBとの比を表し、
前記pTWが、該pTと該pWとの比を表す、
〔3〕記載の分析方法。
〔6〕前記凝固加速度に関する波形をF’(t)(tは時間)、F’(t)が所定値xである時間をt1、t2(t1<t2)とするとき、前記演算対象域はF’(t)≦xを満たす領域であり、前記mT及びmHは下記式で表され、
前記mWが、前記t1からt2までのF’(t)≦mHとなる時間長であり、
前記mNsが、該演算対象域中で、F’(t)が最小値を示す時間よりも小さく且つF’(t)=xを示す時間のうち、最大の時間であり、
前記mNeが、該演算対象域中で、F’(t)が最小値を示す時間よりも大きく且つF’(t)=xを示す時間のうち、最小の時間であり、
前記mNが、mNsからmNeまでの時間長であり、
前記mABが、該mHと該mBとの比を表し、
前記mAWが、該mHと該mWとの比を表し、
前記mTBが、該mTと該mBとの比を表し、
前記mTWが、該mTと該mWとの比を表す、
〔3〕記載の分析方法。
〔7〕前記所定値xが、前記F(t)の最大値の0.5~99%であるか、前記F’(t)のプラスピークの最大値の0.5~99%であるか、又は前記F’(t)のマイナスピークの最小値の0.5~99%である〔4〕~〔6〕のいずれか1項記載の分析方法。
〔8〕前記複数の演算対象域が5~20個の異なる領域である、〔2〕~〔7〕のいずれか1項記載の分析方法。
〔9〕前記判定が、前記複数のパラメータ群を、複数のテンプレート血液検体についての対応するパラメータ群と比較することと、該比較の結果に基づいて、前記被検血液検体における凝固因子の活性レベル又は活性異常を判定することとを含み、
該テンプレート血液検体が、該凝固因子の活性レベル又は活性異常の有無が既知である血液検体である、
〔1〕~〔8〕のいずれか1項記載の分析方法。
〔10〕前記比較が、前記被検血液検体についてのパラメータ群と、前記複数のテンプレート血液検体についての対応するパラメータ群の各々との間での相関を求めることを含む、〔9〕記載の分析方法。
〔11〕前記判定が、前記相関が所定の条件を満たすテンプレート血液検体を選出することと、選出したテンプレート血液検体における前記凝固因子の活性レベル又は活性異常を、前記被検血液検体における凝固因子の活性レベル又は活性異常と判定することを含む、〔10〕記載の分析方法。
〔12〕前記凝固因子が血液凝固第VIII因子または血液凝固第IX因子である、〔1〕~〔11〕のいずれか1項記載の分析方法。
〔13〕前記判定が、前記血友病A患者由来の被検血液検体を判定することを含む、〔12〕記載の分析方法。
〔14〕前記判定が、重症、中等症又は軽症の血友病A患者由来の被検血液検体を判定することを含む、〔12〕記載の分析方法。
〔15〕前記判定が、Very-Severe Haemophilia A、Modestly-Severe Haemophilia A、中等症又は軽症の血友病A患者由来の被検血液検体を判定することを含む、〔12〕記載の分析方法。
〔16〕前記判定が、前記血友病B患者由来の被検血液検体を判定することを含む、〔12〕記載の分析方法。
〔17〕前記判定が、重症、中等症又は軽症の血友病B患者由来の被検血液検体を判定することを含む、〔12〕記載の分析方法。
〔18〕血液凝固第VIII因子が異常ではないと判定された被検血液検体における血液凝固第IX因子の活性レベル又は活性異常を判定することを含む第2の判定工程をさらに含み、
該第2の判定工程が、該被検血液検体についての前記パラメータ群を、血液凝固第IX因子の活性レベル又は活性異常の有無が既知である複数のテンプレート血液検体についての対応するパラメータ群と比較することと、該比較の結果に基づいて、前記被検血液検体における血液凝固第IX因子の活性レベル又は活性異常を判定することとを含む、
〔12〕記載の分析方法。
〔19〕前記判定が、前記血友病B患者由来の被検血液検体を判定することを含む、〔18〕記載の分析方法。
〔20〕前記判定が、重症、中等症又は軽症の血友病B患者由来の被検血液検体を判定することを含む、〔18〕記載の分析方法。
〔21〕〔1〕~〔20〕のいずれか1項記載の血液検体の分析方法を行うためのプログラム。
〔22〕〔1〕~〔20〕のいずれか1項記載の血液検体の分析方法を行うための装置。
1.1.方法の概要
本発明による血液検体の分析方法(以下、本発明の方法ともいう)は、被検検体と凝固時間測定試薬とが混和されてなる試料についての凝固速度又は凝固加速度に関する波形を取得することと、該凝固速度又は凝固加速度に関する波形を特徴付ける複数のパラメータを抽出することと、該複数のパラメータに基づいて、該被検検体における血液凝固時間延長要因成分の活性レベル又は活性異常を判定することとを含む。本発明の方法の一実施形態を、図1を参照して説明する。本方法では、まず被検検体から試料が調製され(ステップ1)、次いで該試料についての凝固反応計測が実行される(ステップ2)。得られた計測データから、該試料について凝固速度又は凝固加速度に関する波形が取得され、次いで波形に対して所定の解析が行われる(ステップ3)。解析で得られたパラメータに基づいて、被検検体の判定(血液凝固時間延長要因成分の活性レベル又はその活性異常の判定)が行われる(ステップ4)。
ステップ1における被検検体からの試料の調製と、ステップ2における該試料についての凝固反応計測について説明する。ここでは、凝固反応計測として、活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)の測定を例に挙げて説明するが、それ以外の凝固反応計測(例えばプロトロンビン時間(PT)測定)への変更は、当業者であれば実施可能である。
1.3.1.データの1次処理及び補正処理
次に、ステップ3のデータ解析について説明する。データ解析のフローを図2に示す。ステップ3でのデータ解析は、ステップ2の凝固反応計測と並行して行われてもよく、又は予め測定した凝固反応計測のデータを用いて、後から行われてもよい。
P(t)=[(D(t)-Dmin)/Drange]×A (1)
ステップ3dでは、凝固速度又は凝固加速度に関する波形が算出される。本明細書において、該凝固速度に関する波形には、未補正1次曲線と、補正1次曲線とが含まれる。未補正1次曲線は、凝固反応曲線(未補正0次曲線)を1次微分して得られる値、すなわち任意の凝固反応時間における凝固反応量の変化率(凝固速度)を表す。補正1次曲線は、補正凝固反応曲線(補正0次曲線)を1次微分して得られる値、すなわち任意の凝固反応時間における凝固反応量の相対変化率を表す。したがって、該凝固速度に関する波形は、試料の凝固反応における凝固速度又はその相対値を表す波形であり得る。本明細書では、1次曲線で表される該凝固速度及びその相対値を含む血液凝固の進行を表す値を、1次微分値と総称する。また本明細書において、該凝固加速度に関する波形には、未補正2次曲線及び補正2次曲線が含まれる。本明細書では、該凝固加速度に関する波形で表される値を、2次微分値と総称する。凝固反応曲線又は補正凝固反応曲線(未補正及び補正0次曲線)の1次微分及び2次微分は、公知の手法を用いて行うことができる。図7は、図6に示す補正0次曲線を一次微分して得られる補正1次曲線を示す。図7の横軸は凝固反応時間を表し、縦軸は1次微分値を表す。
ステップ3eでは、当該試料についての凝固速度又は凝固加速度に関する波形を特徴付ける複数のパラメータの抽出が行われる。一実施形態において、該複数のパラメータは、各々が凝固速度に関する波形を特徴付ける、複数のパラメータを含む。別の一実施形態において、該複数のパラメータは、各々が凝固加速度に関する波形を特徴付ける、複数のパラメータを含む。別の一実施形態においては、該各々が凝固速度に関する波形を特徴付ける複数のパラメータと、該各々が凝固加速度に関する波形を特徴付ける複数のパラメータとが、組み合わせて使用される。
本発明の方法におけるパラメータの抽出に関し、凝固速度又は凝固加速度に関する波形から複数の演算対象域を抽出する手順を説明する。
演算対象域、及び該演算対象域の加重平均点について、図8を参照して説明する。図8には、補正1次曲線F(t)(t=時間)が示されている。また図8には、F(t)の最大値Vmax、ならびに下記に説明するパラメータである、演算対象域値SがVmaxのx%であるときの加重平均点(vTx, vHx)、及び演算対象域のピーク幅を表すvBが表示されている。演算対象域は、F(t)の値が演算対象域値S以上且つ1次微分値の最大値Vmax以下(F(t)≧S(S=x%)である)領域である。加重平均点(vTx, vHx)は、F(t)の演算対象域の「重み付き平均値」に相当する。
反応時間が加重平均時間vTより短い領域において1次微分値が演算対象域値S以上となる最少の反応時間から、反応時間が加重平均時間vTより長い領域において1次微分値が演算対象域値S以上となる最大の反応時間までの時間のうち、1次曲線F(t)≧Sとなる時間長(F(t)≧Sとなるデータ点数に測光時間間隔を乗じて得られた値)を、1次曲線のピーク幅vBとする。図8に示す例では、時間vTsから時間vTeまでがピーク幅vBとなる。同様に、2次曲線F’(t)のプラスピークにおける2次微分値が演算対象域値S以上となる反応時間の最小値及び最大値はそれぞれpTs、pTeであり、pTsからpTeまでの時間のうち、F’(t)≧Sとなる時間長(F’(t)≧Sとなるデータ点数に測光時間間隔を乗じて得られた値)を2次曲線のプラスピークのピーク幅pBとする。同様に、2次曲線F’(t)のマイナスピークにおける2次微分値が演算対象域値S以下となる反応時間の最小値及び最大値はそれぞれmTs、mTeであり、mTsからmTeまでの時間のうち、F’(t)≦Sとなる時間長(F’(t)≦Sとなるデータ点数に測光時間間隔を乗じて得られた値)を2次曲線のマイナスピークのピーク幅mBとする。
vAB=vH/vB (8a)
vAW=vH/vW (8b)
vABa=vHa/vB (8c)
vAWa=vHa/vW (8d)
vTB=vT/vB (9a)
vTW=vT/vW (9b)
本発明で用いられる該演算対象域を特徴付けるパラメータのさらなる例としては、1次曲線又は2次曲線の演算対象域における曲線下面積(AUC)が挙げられる。2次曲線はプラスピークとマイナスピークを有するため、演算対象域における曲線下面積(AUC)は、プラスピークについての演算対象域におけるAUC(pAUC)とマイナスピークの演算対象域におけるAUC(mAUC)があり得る。本明細書においては、異なる演算対象域に由来するAUCを識別するため、それが由来する演算対象域値Sに従って、AUCxと称することがある。例えば、Sが5%である演算対象域のvAUC、pAUC、及びmAUCは、それぞれvAUC5%、pAUC5%、及びmAUC5%である。
ステップ4で行われる判定の一例について説明する。
上記のとおり、凝固速度又は凝固加速度に関する波形の演算対象域の各々について、該演算対象域を特徴付けるパラメータが抽出される。該演算対象域を特徴付けるパラメータとしては、後述する表Aに示す、1次曲線の加重平均点に関係するパラメータ(加重平均時間vT、加重平均高さvH、平均時間vTa、平均高さvHa、ピーク幅vB、加重平均ピーク幅vW、それらから求められた扁平率vAB、vAW、vABa、vAWa、及び時間率vTB、vTW、ならびにvAUC、vTs、vTe、vTr、vTm、vNs、vNe、vN)、2次曲線の加重平均点に関係するパラメータ(加重平均時間pT、mT、加重平均高さpH、mH、ピーク幅pB、mB、加重平均ピーク幅pW、mW、それらから求められた扁平率pAB、pAW、mAB、mAW及び時間率pTB、pTW、mTB、mTW、ならびにpAUC、mAUC、pNs、pNe、pN、mNs、mNe、mN、pTs、pTe、pTm、mTs、mTe、mTm、)が挙げられる。本発明においては、これらのパラメータのいずれか1つ以上が抽出されればよいが、これらの2つ以上を含むパラメータセットが抽出されてもよい。例えば、該パラメータは、vT、vH、vB、vAB及びvTBからなる群より選択される少なくとも1つであればよいが、これらの2つ以上を含むパラメータセットであってもよい。好ましい一実施形態において、該パラメータは、vT、vH、vB、vAB及びvTBを含むパラメータセットである。別の好ましい一実施形態において、該パラメータは、vB、vAB及びvTBを含むパラメータセットである。別の好ましい一実施形態において、該パラメータは、vB及びvABを含むパラメータセットである。別の好ましい一実施形態において、該パラメータは、pH、pAB、又はvHである。別の好ましい一実施形態において、該パラメータは、pABとpNeのパラメータセット、pTWとvTのパラメータセット、pTBとvABaのパラメータセット、pABとvNsのパラメータセット、又はpTWとvTsとvWのパラメータセットである。但し、本発明の方法で用いられる各演算対象域を特徴付けるパラメータの構成は、これらの実施形態に限定されない。
本発明の方法で活性レベル又は活性異常が判定される標的の血液凝固時間延長要因成分としては、血液凝固時間の延長をもたらす内因性又は外因性の任意の凝固反応関与成分が挙げられる。好ましくは、該標的の血液凝固時間延長要因成分は凝固因子である。該凝固因子は、好ましくはFVIII及びFIXを含む凝固因子から選択される少なくとも1種であり、より好ましくは少なくともFVIIIである。FVIIIとFIXを共に標的としてもよい。
本発明の方法では、上述した被検検体の凝固速度又は凝固加速度に関する波形の複数の演算対象域からそれぞれ抽出された複数のパラメータを含むパラメータ群(以下、被検パラメータ群という)を、テンプレート血液検体(以下、単にテンプレート検体とも称する)についての対応するパラメータ群(本明細書において、テンプレートパラメータ群とも称する)と比較する。該比較の結果に基づいて、被検検体の凝固特性、好ましくは被検検体における血液凝固時間延長要因成分の活性レベル又は活性異常が判定される。好ましくは、本発明では、1つ以上のテンプレート検体が準備される。該テンプレート検体は、本発明の方法における標的の血液凝固時間延長要因成分の活性レベル又は活性異常の有無が既知の血液検体である。
本発明の方法においては、被検パラメータ群と、各テンプレート検体由来のテンプレートパラメータ群それぞれとの間で、対応するパラメータの回帰分析を行う。
次いで、回帰分析の結果に基づいて、被検検体における凝固特性を判定する。好ましくは、該凝固特性の判定は、標的の血液凝固時間延長要因成分の活性レベル、又はその活性異常についての判定である。以下、標的の血液凝固時間延長要因成分がFVIIIである場合を例にして、判定の手順を説明する。FIX等の他の因子についても同様の手順による判定を行えばよい。
次いで、該選出されたテンプレート検体におけるFVIIIの状態(すなわち、FVIIIの活性レベル又は活性異常)を、該被検検体におけるFVIIIの状態と判定する。複数のテンプレート検体が選出された場合は、被検検体におけるFVIIIの状態が、該複数のテンプレート検体における状態のいずれかに相当すると判定してもよく、又は、該複数のテンプレート検体についての平均的な状態を、被検検体におけるFVIIIの状態と判定してもよい。
例えば、選出されたテンプレート検体がFVIII正常検体であれば、該被検検体におけるFVIIIの状態は異常なしと判定され得、一方、選出されたテンプレート検体がFVIII異常検体であれば、該被検検体はFVIII活性の異常を有すると判定され得る。また例えば、選出されたテンプレート検体が重症、中等症、及び軽症の血友病A患者由来の検体であれば、該被検検体はそれぞれ、重症、中等症、及び軽症の血友病Aであると判定され得る。さらに、テンプレート検体がVS-HA及びMS-HAの重症血友病A患者由来の検体を含む場合に、VS-HA又はMS-HA患者由来のテンプレート検体が選出されれば、該被検検体はVS-HA又はMS-HAであると判定され得る。あるいは、該被検検体におけるFVIII活性レベルを判定する場合、選出されたテンプレート検体のFVIII活性レベルが、該被検検体におけるFVIII活性レベルとして判定され得る。
一方、テンプレート検体が重症、中等症及び軽症の血友病A患者由来の検体を含み、且つ上記相関性の評価で「テンプレート検体選出なし」であれば、該被検検体は「FVIII活性異常を有さない」、又は被検検体の「血液凝固時間の延長要因がFVIII活性異常によるものではない」と判定され得る。
例えば、選出されたテンプレート検体のなかでFVIII正常検体の数が最も多ければ、該被検検体におけるFVIIIの状態は異常なしと判定され得る。一方、選出されたテンプレート検体のなかでFVIII異常検体の数が最も多ければ、該被検検体はFVIII活性の異常を有すると判定され得る。また例えば、選出されたテンプレート検体のなかで重症、中等症、及び軽症の血友病A患者由来の検体が最も多いとき、該被検検体はそれぞれ、重症、中等症、及び軽症の血友病Aであると判定され得る。また例えば、選出されたテンプレート検体のなかでVS-HA及びMS-HAの重症血友病A患者由来の検体が最も多いとき、該被検検体はそれぞれ、VS-HA及びMS-HAであると判定され得る。また例えば、選出されたテンプレート検体のなかでFVIII異常でない血液凝固時間延長検体が最も多いとき、該被検検体は、血友病A患者(重症、中等症、及び軽症)以外の異常検体と判定され得る。あるいは、該被検検体におけるFVIII活性レベルを判定する場合、選出されたテンプレート検体の中で最も高頻度に見出されるFVIII活性レベルが、該被検検体におけるFVIII活性レベルとして判定され得る。
選出されたテンプレート検体を、FVIII活性レベルに従って、FVIII活性の低い血友病A患者(重症、中等症、及び軽症)由来の検体と、それ以外の検体に分ける。前者の数が後者の数より多い場合、前者の検体のなかで最も多く見られる重症度(重症、中等症、及び軽症のいずれか)を、該被検検体の状態と判定する。異なる重症度の検体が同数存在する場合には、より重症な方を該被検検体の状態と判定してもよく、又は該所定の条件を変更して再度テンプレート検体の選出を行ってもよい。一方、後者の数が前者の数より多い場合、該被検検体は血友病A患者(重症、中等症、及び軽症)以外のものと判定される。
上述の本発明の血液検体の分析方法は、コンピュータプログラムを用いて自動的に行われ得る。したがって、本発明の一態様は、上述の本発明の血液検体の分析方法を行うためのプログラムである。また、被検検体からの試料の調製及び凝固時間の測定も含め、上述した本発明の方法の一連の工程は、自動分析装置によって自動的に行われ得る。したがって、本発明の一態様は、上述の本発明の血液検体の分析方法を行うための装置である。
(1)方法
測定用試薬として、APTT測定用試薬であるコアグピアAPTT-N(積水メディカル株式会社製)を、塩化カルシウム液として、コアグピアAPTT-N 塩化カルシウム液(積水メディカル株式会社製)を用いた。検体を含む試料の凝固反応計測は、血液凝固自動分析装置CP3000(積水メディカル株式会社製)を用いて行った。キュベット内にて37℃で45秒間加温した検体50μLに、約37℃の測定用試薬50μLを添加し、さらに171秒経過後に25mM塩化カルシウム液50μLを添加して凝固反応を開始させた。反応は37℃で行った。凝固反応の測定では、キュベットにLEDを光源とする波長660nmの光を照射し、0.1秒間隔で90度側方散乱光の散乱光量を計測した。計測時間は360秒間とした。得られた経時的計測データから、凝固反応曲線を得た。
34検体(血漿)を分析した。該34検体は、24件のFVIII欠乏検体(重症(FVIII<1%)13件、中等症(FVIII=1-5%)8件、軽症(FVIII=5-40%)3件)、及び10件のVIII欠乏検体以外の検体(Other)を含んでいた。(1)の手順に従って、各検体についての凝固反応曲線を得た。
分析に用いたテンプレート検体の構成を表1に示す。FVIII活性が異なる43検体、及びFVIII活性は正常であるが他の要因によって血液凝固時間が延長する88検体を調製した。前者43検体のFVIII活性は、血友病A重症(FVIII<1%)、中等症(FVIII=1-5%)、及び軽症(FVIII=5-40%)、ならびにその他(FVIII>40%はOther)のいずれかに属している。後者88検体は、FVIII活性が異常ではないため、表1の分類では「Other」に属する。これらの計131検体をテンプレート検体として分析に用い、(1)の手順に従って、各検体についての凝固反応曲線を得た。
(4-1)1次曲線の算出
(2)で得られた被検検体由来の凝固反応曲線から補正1次曲線を算出した。まず、凝固反応曲線に対して前処理を行った。すなわち、凝固反応曲線に対してノイズ除去を含む平滑化処理を行い、測定開始時点の散乱光量が0となるように調整した。続いて、凝固反応曲線の最大高さが100となるように補正し、得られた補正凝固反応曲線(補正0次曲線)を一次微分して、補正1次曲線を算出した。
(パラメータ群A)
得られた補正1次曲線から、10個の演算対象域を抽出した。演算対象域値Sは、補正1次曲線の最大高さ値Vmax(100%)に対して、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、及び90%にそれぞれ設定した。各Sでの演算対象域について、ピーク幅vB、ならびに上記式(2)、(3)及び(4)を用いて加重平均時間vT及び加重平均高さvHを算出した。求めたvT及びvHから、下記式により扁平率vAB及び時間率vTBを算出した。
vAB=(vH/vB)K1(K1=100)
vTB=(vT/vB)K2(K2=1)
以上の手順で、10個の演算対象域(S=5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%及び90%)についてのパラメータ:vB [vB5%, vB10%, vB20%, vB30%, vB40%, vB50%, vB60%, vB70%, vB80%, vB90%]、vT [vT5%, vT10%, vT20%, vT30%, vT40%, vT50%, vT60%, vT70%, vT80%, vT90%]、vH [vH5%, vH10%, vH20%, vH30%, vH40%, vH50%, vH60%, vH70%, vH80%, vH90%]、vAB [vAB5%, vAB10%, vAB20%, vAB30%, vAB40%, vAB50%, vAB60%, vAB70%, vAB80%, vAB90%]、及びvTB [vTB5%, vTB10%, vTB20%, vTB30%, vTB40%, vTB50%, vTB60%, vTB70%, vTB80%, vTB90%]を算出した。
(パラメータ群A-1)vB [vB5%, vB10%, …, vB90%]、vT [vT5%, vT10%, …, vT90%]、vH [vH5%, vH10%, …, vH90%]、vAB [vAB5%, vAB10%, …, vAB90%]、及びvTB [vTB5%, vTB10%, …, vTB90%]の50パラメータからなるパラメータ群;
(パラメータ群A-2)vB [vB5%, vB10%, …, vB90%]、vAB [vAB5%, vAB10%, …, vAB90%]、及びvTB [vTB5%, vTB10%, …, vTB90%]の30パラメータからなるパラメータ群;
(パラメータ群A-3)vB [vB5%, vB10%, …, vB90%]及びvAB [vAB5%, vAB10%, …, vAB90%]の20パラメータからなるパラメータ群。
(パラメータ群A-4)パラメータA-1に、Vmax、Amax、VmaxT及びAmaxTを追加した54パラメータからなるパラメータ群;
(比較パラメータ群1)Vmax、Amax、VmaxT及びAmaxTの4パラメータからなるパラメータ群。
さらに、5個の演算対象域(S=5%、20%、40%、60%及び80%)についてのvB、vT、vH、vAB及びvTBを用いて、以下のとおり被検パラメータ群を作成した:
(パラメータ群B-1)vB [vB5%, vB20%, vB40%, vB60%, vB80%]、vT [vT5%, vT20%, vT40%, vT60%, vT80%]、vH [vH5%, vH20%, vH40%, vH60%, vH80%]、vAB [vAB5%, vAB20%, vAB40%, vAB60%, vAB80%]、及びvTB [vTB5%, vTB20%, vTB40%, vTB60%, vTB80%]の25パラメータからなるパラメータ群;
(パラメータ群B-2)vB [vB5%, vB20%, vB40%, vB60%, vB80%]、 [vAB5%, vAB20%, vAB40%, vAB60%, vAB80%]、及びvTB [vTB5%, vTB20%, vTB40%, vTB60%, vTB80%]の15パラメータからなるパラメータ群;
(パラメータ群B-3)vB [vB5%, vB20%, vB40%, vB60%, vB80%]及びvAB [vAB5%, vAB20%, vAB40%, vAB60%, vAB80%]の10パラメータからなるパラメータ群;
(パラメータ群B-4)パラメータB-1に、Vmax、Amax、VmaxT及びAmaxTを追加した29パラメータからなるパラメータ群。
(3)で得られた各テンプレート検体由来の凝固反応曲線から、(4-1)~(4-2)の手順に従って、補正1次曲線を算出し、次いで上述したパラメータ群A-1~A-4、B-1~B-4、及び比較パラメータ群1の構成をそれぞれ有するテンプレートパラメータ群A-1~A-4、B-1~B-4、及び比較テンプレートパラメータ群1を作成した。
(1)FVIII活性の判定
被検検体から得られた被検パラメータ群と、各テンプレート検体から得られた対応するテンプレートパラメータ群との間で回帰分析を行った。パラメータ群には実施例1で取得したパラメータ群A-1を用いた。図16に、FVIII活性が0.2%未満である重症血友病A(VS-HA)患者に由来する被検検体(Sample AF、APTT時間:118.1秒、FVIII<0.2%)との回帰分析結果のうち、相関係数が高い順に上位5件の結果を示す。また、図16の各図の横軸と縦軸のラベルには、それぞれテンプレート検体及び被検検体のFVIII活性及びAPTT時間を示す。この5件の相関係数は0.98以上であることから、被検検体Sample AFとの間でパラメータ群に関して高い相関性を有するテンプレート検体の存在が確認された。また、選出された5つのテンプレート検体(Template A~Template E)は、いずれもFVIII活性が0.2%未満であるVS-HA患者に由来する検体であることが確認された。
実施例1で取得したパラメータ群A-1~A-4、B-1~B-4、及び比較パラメータ群1のそれぞれについて、34個の被検検体と、各テンプレート検体との回帰分析を行った。被検検体と全てのテンプレート検体との間でパラメータ群についての直線回帰式を求め、その中から回帰直線の傾きが0.87から1.13の範囲であったテンプレート検体を選出した。次に選出したテンプレート検体の中から、最も相関係数の高いものを相関性が最も高いテンプレート検体として選出した。選出したテンプレート検体のFVIII活性を、被検検体のFVIII活性と判定した。判定結果をもとに、被検検体のFVIII活性レベルを4段階(FVIII活性:<1%、1-5%、5-40%、及びOther)に分類した。分類された被検検体のFVIII活性レベルと、凝固一段法で求めた実際の被検検体のFVIII活性レベルから、本判定におけるFVIII活性レベル一致率及びFVIII欠乏一致率を次式により計算した。FVIII活性レベル一致率は、判定による被検検体のFVIII活性レベルが実際の被検検体のFVIII活性レベルと一致した割合を示し、FVIII欠乏一致率は、判定による被検検体のFVIII欠乏の有無が実際の被検検体のFVIII欠乏の有無と一致した割合を示す。
相関性の評価基準の違いによる判定結果の差異を確認するため、相関性の評価基準のみが異なる比較検討を以下の2条件で実施した。パラメータ群はA-4を使用した。
相関性評価基準1:全てのテンプレート検体と被検検体との間でパラメータ群についての直線回帰式を求め、その中から回帰直線の傾きが0.87から1.13の範囲に含まれるテンプレート検体を選出し、選出した中から最も相関係数の高いテンプレート検体を選出した(実施例2と同じ評価基準)。
相関性評価基準2:全てのテンプレート検体と被検検体との間でパラメータ群についての直線回帰式を求め、その中から最も相関係数の高いテンプレート検体を選出した。
被検検体のうちOther(FVIII>40%)と判定されたがFIX欠乏である8件の検体について、FIX活性の判定を実施した。テンプレート検体には表9のものを用いた。パラメータ群に実施例1で取得したパラメータ群A-1を、相関性の評価には実施例3の相関性評価基準1を用いた。実施例2(2)と同様の手順で、FIX活性レベル一致率及びFIX欠乏一致率を計算した。評価結果を表10に示す。高い一致率で被検検体のFIX活性レベルを判定することができた。
(1)被検血液検体及びテンプレート検体
被検血液検体として、FVIII活性又はFIX活性が低下している患者血漿46検体を用いた。該46検体は、30件のFVIII欠乏検体(重症(FVIII<1%)10件、中等症(FVIII=1-5%)10件、軽症(FVIII=5-40%)10件)、FVIII>40%検体(Other)の1件、及び15件のFIX欠乏検体(Other)からなるものであった。
各検体について、凝固反応曲線から未補正1次曲線、未補正2次曲線、補正1次曲線、及び補正2次曲線を算出した。各曲線について、10個の演算対象域値S(該曲線の最大高さの5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、及び90%)に基づく10個の演算対象域を抽出し、各演算対象域を特徴づけるパラメータを取得した。さらに、従来パラメータである曲線の最大値とそれに到達するまでの時間(Vmax、RVmax、VmaxT、Amax、RAmax、AmaxT)を取得した。取得したパラメータを表12に示す。
(3-1)単一パラメータを用いた判定
表12に示したパラメータからパラメータ群を構成した。演算対象域を特徴づけるパラメータを用いる場合は、10個の演算対象域値(x=5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、及び90%)に基づく10個の演算対象域から抽出された同種のパラメータのセットをパラメータ群として用いた。例えば、パラメータ「vHx」を用いる場合、[vH5%、vH10%、vH20%、vH30%、vH40%、vH50%、vH60%、vH70%、vH80%、vH90%]のセットをパラメータ群として用いた。従来パラメータを用いる場合は、実施例2の比較例と同じパラメータ群を用いた。
表12に示した演算対象域を特徴づけるパラメータを複数種組み合わせて、組み合わせパラメータ群を構成した。10個の演算対象域値(x=5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、及び90%)に基づく10個の演算対象域から抽出された同種のパラメータのセットを2個以上組み合わせて、パラメータ群として用いた。例えば、パラメータ「vT」と「vB」の組み合わせを用いる場合、[vT5%、vT10%、vT20%、vT30%、vT40%、vT50%、vT60%、vT70%、vT80%、vT90%]のセットと[vB5%、vB10%、vB20%、vB30%、vB40%、vB50%、vB60%、vB70%、vB80%、vB90%]のセットを組み合わせてパラメータ群として用いた。
(1)方法
実施例5で用いた検体を用いて、実施例5と同様の手順で、被検パラメータ群とテンプレートパラメータ群との間で一次回帰分析を行った。次いで、以下の異なる判定基準に従って、被検検体のFVIII活性の状態を判定した。
判定基準1:
実施例5と同様に、一次回帰式の傾きが1±0.15以内であり、且つ該回帰式の相関係数が0.90より大きいテンプレート検体のうち、相関係数が最も高かったテンプレート検体におけるFVIII活性の状態を、被検検体のFVIII活性の状態と判定した。上記一次回帰式の傾き及び相関係数の条件に適合するテンプレート検体がない場合、被検検体はOtherと判定された。
判定基準2(最多選出法):
一次回帰式の傾きが1±0.15以内であり、且つ該回帰式の相関係数が0.90より大きいテンプレート検体のうち、相関係数が最も高い5件のテンプレート検体を抽出した。これら5件の検体の中で最も高頻度に見られたFVIII活性の状態を、被検検体のFVIII活性の状態と判定した。異なる状態の検体が同数存在する場合には、より重症な状態を該被検検体の状態と判定した。上記一次回帰式の傾き及び相関係数の条件に適合するテンプレート検体がない場合、被検検体はOtherと判定された。
判定基準3(2段階選出法):
血友病A患者(重症、中等症、及び軽症)由来の検体一次回帰式の傾きが1±0.15以内であり、且つ該回帰式の相関係数が0.90より大きいテンプレート検体のうち、相関係数が最も高い5件のテンプレート検体を抽出した。上記一次回帰式の傾き及び相関係数の条件に適合するテンプレート検体が5件に満たない場合は、満たない件数分をNDとした(表18参照)。これら5件における血友病A患者(重症[L1]:FVIII<1%、中等症[L2]:FVIII=1-5%、及び軽症[L3]:FVIII=5-40%)の合計数、及びその他(Other及びND)の合計数を求めた。血友病A患者の合計数がより多い場合、最も高頻度に見られた状態(重症、中等症、又は軽症)を被検検体の状態と判定した。異なる状態の検体が同数存在する場合には、より重症な状態を被検検体の状態と判定した。その他の合計数がより多い場合、被検検体の状態をOtherと判定した。
表12に示す55種の演算対象域を特徴づけるパラメータから3種のパラメータを任意に組み合わせて、26235通りの組み合わせパラメータ群を構成した。各々の組み合わせパラメータ群を用いて、被検パラメータ群とテンプレートパラメータ群との間で用いた一次回帰分析を行い、次いで判定基準1~3に従って被検検体のFVIII活性の状態を判定した。実施例2と同様の手順でFVIII欠乏一致率又はFVIII活性レベル一致率を計算した。さらにFVIII欠乏一致率又はFVIII活性レベル一致率の平均(平均一致率)を計算した。
実施例6と同様の手順で、判定基準1~3に従って、ただし一次回帰式の傾きの許容幅及び相関係数の閾値を変更して、被検検体のFVIII活性の状態を判定した。パラメータ群には、実施例5で最大のFVIII欠乏一致率及びFVIII活性レベル一致率を示した組み合わせパラメータ群pTW_vTs_vWを用いた。一次回帰式の傾きは、1±0.05から1±0.25まで(すなわち、許容幅0.05から0.25まで)段階的に変更した。また相関係数の閾値は、>0.75から>0.98まで段階的に変更した。各条件でのFVIII欠乏一致率及びFVIII活性レベル一致率を計算した。結果を図19~21に示す。
Claims (21)
- 血液検体の分析方法であって、
被検血液検体と凝固時間測定試薬とが混和されてなる試料についての凝固速度又は凝固加速度に関する波形を取得することと、
該凝固速度又は凝固加速度に関する波形を特徴付ける複数のパラメータを抽出することと、
該複数のパラメータに基づいて、該被検血液検体における凝固因子の活性レベル又は活性異常を判定することと、
を含み、
該複数のパラメータが、該凝固速度に関する波形の複数の演算対象域をそれぞれ特徴付ける複数のパラメータを含むか、該凝固加速度に関する波形の複数の演算対象域をそれぞれ特徴付ける複数のパラメータを含むか、又はそれらの組み合わせを含む、
血液検体の分析方法。 - 前記複数のパラメータが、下記:
前記凝固速度に関する波形の複数の演算対象域についての加重平均時間vT、加重平均高さvH、ピーク幅vB、加重平均ピーク幅vW、加重平均高さについてのB扁平率vAB、加重平均高さについてのW扁平率vAW、加重平均時間についてのB時間率vTB、加重平均時間についてのW時間率vTW、平均時間vTa、平均高さvHa、平均高さについてのB扁平率vABa、平均高さについてのW扁平率vAWa、領域始点時間vTs、領域終点時間vTe、領域中央時間vTm、領域時間幅vTr、主ピーク始点時間vNs、主ピーク終点時間vNe、及び主ピーク幅vN;
前記凝固加速度に関する波形のプラスピークの複数の演算対象域についての加重平均時間pT、加重平均高さpH、ピーク幅pB、加重平均ピーク幅pW、加重平均高さについてのB扁平率pAB、加重平均高さについてのW扁平率pAW、加重平均時間についてのB時間率pTB、加重平均時間についてのW時間率pTW、主ピーク始点時間pNs、主ピーク終点時間pNe、及び主ピーク幅pN;ならびに、
前記凝固加速度に関する波形のマイナスピークの複数の演算対象域についての加重平均時間mT、加重平均高さmH、ピーク幅mB、加重平均ピーク幅mW、加重平均高さについてのB扁平率mAB、加重平均高さについてのW扁平率mAW、加重平均時間についてのB時間率mTB、加重平均時間についてのW時間率mTW、主ピーク始点時間mNs、主ピーク終点時間mNe、及び主ピーク幅mN、
からなる群より選択される1つ以上を含む、請求項1記載の分析方法。 - 前記凝固速度に関する波形をF(t)(tは時間)、F(t)が所定値xである時間をt1、t2(t1<t2)とするとき、前記演算対象域はF(t)≧xを満たす領域であり、前記vT及びvHは下記式で表され、
前記vWが、前記t1からt2までのF(t)≧vHとなる時間長であり、
前記vTs、vTeが、それぞれt1、t2であり、
前記vTrが、vTsからvTeまでの時間長であり、
前記vNsが、該演算対象域中で、F(t)が最大値を示す時間よりも小さく且つF(t)=xを示す時間のうち、最大の時間であり、
前記vNeが、該演算対象域中で、F(t)が最大値を示す時間よりも大きく且つF(t)=xを示す時間のうち、最小の時間であり、
前記vNが、vNsからvNeまでの時間長であり、
前記vABが、該vHと該vBとの比を表し、
前記vAWが、該vHと該vWとの比を表し、
前記vTBが、該vTと該vBとの比を表し、
前記vTWが、該vTと該vWとの比を表し、
前記vABaが、該vHaと該vBとの比を表し、
前記vAWaが、該vHaと該vWとの比を表す、
請求項2記載の分析方法。 - 前記凝固加速度に関する波形をF'(t)(tは時間)、F'(t)が所定値xである時間をt1、t2(t1<t2)とするとき、前記演算対象域はF'(t)≧xを満たす領域であり、前記pT及びpHは下記式で表され、
前記pWが、前記t1からt2までのF'(t)≧pHとなる時間長であり、
前記pNsが、該演算対象域中で、F'(t)が最大値を示す時間よりも小さく且つF'(t)=xを示す時間のうち、最大の時間であり、
前記pNeが、該演算対象域中で、F'(t)が最大値を示す時間よりも大きく且つF'(t)=xを示す時間のうち、最小の時間であり、
前記pNが、pNsからpNeまでの時間長であり、
前記pABが、該pHと該pBとの比を表し、
前記pAWが、該pHと該pWとの比を表し、
前記pTBが、該pTと該pBとの比を表し、
前記pTWが、該pTと該pWとの比を表す、
請求項2記載の分析方法。 - 前記凝固加速度に関する波形をF'(t)(tは時間)、F'(t)が所定値xである時間をt1、t2(t1<t2)とするとき、前記演算対象域はF'(t)≦xを満たす領域であり、前記mT及びmHは下記式で表され、
前記mWが、前記t1からt2までのF'(t)≦mHとなる時間長であり、
前記mNsが、該演算対象域中で、F'(t)が最小値を示す時間よりも小さく且つF'(t)=xを示す時間のうち、最大の時間であり、
前記mNeが、該演算対象域中で、F'(t)が最小値を示す時間よりも大きく且つF'(t)=xを示す時間のうち、最小の時間であり、
前記mNが、mNsからmNeまでの時間長であり、
前記mABが、該mHと該mBとの比を表し、
前記mAWが、該mHと該mWとの比を表し、
前記mTBが、該mTと該mBとの比を表し、
前記mTWが、該mTと該mWとの比を表す、
請求項2記載の分析方法。 - 前記所定値xが、前記F(t)の最大値の0.5~99%であるか、前記F'(t)のプラスピークの最大値の0.5~99%であるか、又は前記F'(t)のマイナスピークの最小値の0.5~99%である請求項3~5のいずれか1項記載の分析方法。
- 前記複数の演算対象域が5~20個の異なる領域である、請求項1~6のいずれか1項記載の分析方法。
- 前記判定が、前記複数のパラメータ群を、複数のテンプレート血液検体についての対応するパラメータ群と比較することと、該比較の結果に基づいて、前記被検血液検体における凝固因子の活性レベル又は活性異常を判定することとを含み、
該テンプレート血液検体が、該凝固因子の活性レベル又は活性異常の有無が既知である血液検体である、
請求項1~7のいずれか1項記載の分析方法。 - 前記比較が、前記被検血液検体についてのパラメータ群と、前記複数のテンプレート血液検体についての対応するパラメータ群の各々との間での相関を求めることを含む、請求項8記載の分析方法。
- 前記判定が、前記相関が所定の条件を満たすテンプレート血液検体を選出することと、選出したテンプレート血液検体における前記凝固因子の活性レベル又は活性異常を、前記被検血液検体における凝固因子の活性レベル又は活性異常と判定することを含む、請求項9記載の分析方法。
- 前記凝固因子が血液凝固第VIII因子または血液凝固第IX因子である、請求項1~10のいずれか1項記載の分析方法。
- 前記判定が、前記血友病A患者由来の被検血液検体を判定することを含む、請求項11記載の分析方法。
- 前記判定が、重症、中等症又は軽症の血友病A患者由来の被検血液検体を判定することを含む、請求項11記載の分析方法。
- 前記判定が、Very-Severe Haemophilia A、Modestly-Severe Haemophilia A、中等症又は軽症の血友病A患者由来の被検血液検体を判定することを含む、請求項11記載の分析方法。
- 前記判定が、前記血友病B患者由来の被検血液検体を判定することを含む、請求項11記載の分析方法。
- 前記判定が、重症、中等症又は軽症の血友病B患者由来の被検血液検体を判定することを含む、請求項11記載の分析方法。
- 血液凝固第VIII因子が異常ではないと判定された被検血液検体における血液凝固第IX因子の活性レベル又は活性異常を判定することを含む第2の判定工程をさらに含み、
該第2の判定工程が、該被検血液検体についての前記パラメータ群を、血液凝固第IX因子の活性レベル又は活性異常の有無が既知である複数のテンプレート血液検体についての対応するパラメータ群と比較することと、該比較の結果に基づいて、前記被検血液検体における血液凝固第IX因子の活性レベル又は活性異常を判定することとを含む、
請求項11記載の分析方法。 - 前記判定が、前記血友病B患者由来の被検血液検体を判定することを含む、請求項17記載の分析方法。
- 前記判定が、重症、中等症又は軽症の血友病B患者由来の被検血液検体を判定することを含む、請求項17記載の分析方法。
- 請求項1~19のいずれか1項記載の血液検体の分析方法を行うためのプログラム。
- 請求項1~19のいずれか1項記載の血液検体の分析方法を行うための装置。
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