JP2020039344A - 腎臓移植における急性拒絶を評価するための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本明細書では、ある個人を腎臓移植の急性拒絶(AR)のリスクが高いとして、および/または急性拒絶のリスクが低いもしくはリスクが無い(非AR)として分類するための組成物および方法が開示される。これらの組成物および方法は、分類子遺伝子セットの遺伝子発現レベルを含んでなり、小児患者および成人患者の両方でこのような分類に使用できる。
本明細書を説明する目的で、以下の定義が当てはまり、適切な場合、単数で用いられる用語はその複数も含み、逆もそうである。以下に示される定義が、引用することにより本明細書の一部とされる文書と矛盾する場合には、以下に示される定義が優位とすべきである。
そうではないことが定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の熟練者により共通に理解されているものと同じ意味を有する。
腎臓同種移植レシピエントは、いずれの年齢であってもよい。いくつかの実施形態では、個人は小児である。一実施形態では、小児は乳児である。別の実施形態では、小児は幼児である。他の実施形態では、個人は23歳未満の若年成人である。いくつかの実施形態では、個人はおよそ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、または22歳である。さらなる実施形態では、個人は23歳を超える成人である。いくつかの実施形態では、個人は、およそ23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、67、68、69、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100歳である。一実施形態では、腎臓同種移植レシピエントは女性である。別の実施形態では、腎臓同種移植レシピエントは男性である。
生体サンプルは、腎臓同種移植を受けた個人から採取する。いくつかの実施形態では、腎臓同種移植レシピエントは、ARの外面的症状はない。他の実施形態では、腎臓同種移植レシピエントは、ARの症状を示す。限定されるものではないが、全血、血液、血清、血漿、尿、粘液、唾液、脳脊髄液、組織、生検およびそれらの組合せを含むいずれのタイプの生体サンプルを採取してもよい。一実施形態では、生体サンプルは全血である。一実施形態では、生体サンプルは血液である。いくつかの実施形態では、血液サンプルは末梢血である。別の実施形態では、生体サンプルは末梢血単核細胞である。いくつかの実施形態では、生体サンプルは末梢血リンパ球である。いくつかの実施形態では、生体サンプルは組織生検である。
腎臓同種移植レシピエントから採取された生体サンプルは、AR応答を受けている個人で差次的に発現される遺伝子のレベルを評価するために使用することができる。遺伝子発現を測定する種々の技術は当業者に公知である。1つの非限定的方法は、採取した生体サンプルからRNAを抽出し、cDNAを合成することである。cDNAは、標的遺伝子(すなわち、AR応答を受けている個人において差次的に発現される遺伝子)に特異的なプライマーまた標識プライマーを用いて増幅し、次に、定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)を用いて分析することができる。BioMark(フリューダイム、サザンサンフランシスコ、CA)またはABI viia7(Life Technologies、フォスターシティ、CA)などのqPCRプラットフォームが使用可能である。
本発明は、年齢、移植センター、RNAソース、アッセイ、末期腎疾患の原因、併存症、および/または免疫抑制使用に依存しない参照発現ベクターの作出を提供する。これらの参照発現ベクターの使用は、Partekなどの市販のソフトウエアパッケージまたはRなどのオープンソースソフトウエアによって一般に必要とされるバッチ効果の除を必要としない。
本発明はさらに、ARの診断、検出、および予測のアッセイキットを提供する。本キットは、腎臓同種移植を受けた個人由来の生体サンプルにおいてARに関連する差次的発現遺伝子のレベルを測定するための遺伝子発現評価素子を含んでなる。いくつかの実施形態では、本キットは、生体サンプルにおいて対象とする差次的発現遺伝子のレベルを測定するための試薬を含んでなる。いくつかの実施形態では、本キットは、生体サンプルにおける差次的発現遺伝子の測定のための1以上の固相表面を含んでなる組成物を含んでなる。一実施形態では、固相表面は、マイクロアレイチップを含んでなる。別の実施形態では、固相表面は、ビーズを含んでなる。さらなる実施形態では、固相表面は、ナノ粒子を含んでなる。一実施形態では、本キットは、CEACAM4、ならびにCFLAR、DUSP1、ITGAX、RNF130、PSEN1、NKTR、RYBP、NAMPT、MAPK9、IFNGR1、RHEB、GZMK、RARA、SLC25A37、EPOR、およびRXRAから選択される少なくとも6、7、8、9、10、または11の他の遺伝子の測定のための1以上の固相表面を含んでなる組成物を含んでなる。いくつかの実施形態では、合計17の遺伝子の発現レベルが測定される。
本発明はさらに、ARの診断、検出、および予測のためのシステムを提供する。本システムは、腎臓同種移植を受けた個人由来の生体サンプルにおいてARに関連する差次的発現遺伝子のレベルを測定するための遺伝子発現評価素子を含んでなる。一実施形態では、本システムは、マイクロアレイチップを含んでなる。別の実施形態では、システムは、ビーズを含んでなる。さらなる実施形態では、システムは、ナノ粒子を含んでなる。種々の実施形態では、システムは、CEACAM4、ならびにCFLAR、DUSP1、ITGAX、RNF130、PSEN1、NKTR、RYBP、NAMPT、MAPK9、IFNGR1、RHEB、GZMK、RARA、SLC25A37、EPOR、およびRXRAから選択される少なくとも6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、または16の他の遺伝子の測定のための遺伝子発現評価素子を含んでなる。いくつかの実施形態では、合計17の遺伝子の発現レベルが測定される。
本発明は、腎臓同種移植を受けた個人由来の生体サンプルにおいてARに関連する差次的発現遺伝子のレベルを測定するための1以上の固相表面を含んでなる組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は製品である。一実施形態では、製品は、腎臓同種移植を受けた個人由来の生体サンプルにおいて差次的発現遺伝子のレベルを測定するための参照標準を含んでなる。いくつかの実施形態では、固相表面は、差次的発現遺伝子のcDNAの付着を提供する。他の実施形態では、固相表面は、差次的発現遺伝子の増幅のためのプライマーまたは標識プライマーの付着を提供する。特定の実施形態では、固相表面は、本明細書に開示される少なくとも1、1以上、2以上、3以上、4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上、10以上、11以上、12以上、13以上、14以上、15以上、16以上、17以上、18以上、19以上、20以上、21以上、22以上、23以上、24以上、25以上、26以上、27以上、28以上、29以上、30以上、31以上、32以上、33以上、34以上、35以上、36以上、37以上、38以上、39以上、40以上、41以上、42以上、43以上、44以上、45以上、46以上、47以上、48以上、49以上、50以上、51以上、52以上、53以上、54以上、55以上、56以上、57以上、58以上、59以上、60以上、61以上、62以上、63以上、64以上、65以上、66以上、67以上、68以上、69以上、70以上、71以上、72以上、73以上、74以上、75以上、76以上、77以上、78以上、79以上、80以上、81以上、82以上、83以上、84以上、85以上、86以上、87以上、88以上、89以上、90以上、91以上、92以上、93以上、94以上、95以上、96以上、97以上、98以上、99以上、100以上、101以上、またはさらには102の遺伝子の測定を可能とする。一実施形態では、表1からの、明示された範囲内の遺伝子の数の整数の全ての反復を含む約1〜約43の遺伝子が、ARの評価のために、腎臓同種移植を受けた個人由来の生体サンプルにおいて測定される。別の実施形態では、表3からの、明示された範囲内の遺伝子の数の整数の全ての反復を含む約1〜約102の遺伝子が、ARの評価のために、腎臓同種移植を受けた個人由来の生体サンプルにおいて測定される。別の実施形態では、最低7つの遺伝子が、ARの評価のために測定される。別の実施形態では、最大17の遺伝子が、ARの評価のために測定される。
本明細書に記載の相関に基づく分析は、AltAnalyzeバージョン2.0.8以降を用いて行うことができる。LineageProfilerは、オープンソースソフトウエアAltAnalyze(http://code.google.com/p/altanalyze/downloads, version 2.0.8 or higher)のグラフィック・ユーザー・インターフェースから、また、スタンドアロンpythonスクリプトとして(https://github.com/nsalomonis/LineageProfilerIterate)入手可能である。AltAnalyzeは、http://www.altanalyze.orgからダウンロードし、ハードドライブに抽出し、初回起動の後にプロンプト(現在、EnsMart65)が表示された際に最新のヒトデータベースとともにインストールすることができる。あるいは、LineageProfiler・ファンクションは、このソフトウエアのコマンドラインバージョンを、https://github.com/nsalomonis/LineageProfilerIterateで入手可能なgene model discoveryのオプションとともに用いて実行することもできる。LineageProfilerのスタンドアロン・グラフィック・ユーザー・インターフェース・バージョンおよびコマンド・ライン・バージョンの実行命令は、http://code.google.com/p/altanalyze/wiki/SampleClassificationに記載されている。LineageProfilerのソースコードは、本明細書に記載の実施形態で使用するために修正され、LineageProfiler Iterateとなっている。本明細書で使用する場合、修正版LineageProfilerであるLineageProfiler IterateおよびkSASは互換的に使用される。kSASのソースコードは、付表Cに示されている。このソフトウエアを用いて、所与のサンプルセットに関する定量的発現値を、特定の疾患クラス、表現型、または処置カテゴリーに属すとして分類することができる。簡単に述べると、このアルゴリズムはこれを、所与のサンプルに関する発現値の入力セットを2以上参照条件と相関させることにより行う。このサンプルを参照と直接相関させるというよりも、既知のクラスに属するサンプルを用いて高い程度の予測成功をもたらすことが従前に確認されているモデルファイルから遺伝子のサブセットを選択することができる。このアルゴリズムはまた、別のまたは新たな遺伝子モデルを発見するために新たなデータに適用することもできる。
異なる年齢、異なる免疫抑制、および移植センター特異的プロトコールを受けたレシピエントにおける急性拒絶(AR)診断および予測のための簡単な血液QPCR検査を開発するために、腎臓移植における急性拒絶(AART)の評定試験を、世界8か所の腎臓移植センターでの共同努力において計画し、438名の成人および小児腎臓移植患者由来の558の末梢血(PB)サンプルを使用した。
ユニークな小児(移植時のレシピエントの年齢=0.8〜21.9歳;n=200)および成人(移植時のレシピエントの年齢=23〜78歳;n=315)腎臓移植レシピエントに由来する末梢血サンプル(n=518)を、生検により確認された急性腎臓同種移植片拒絶の非侵襲的診断のための一般末梢血遺伝子パネルの開発に用いた。200サンプルの小児コホートのうち177サンプルは、12の米国移植センターから組織学的にグレード分類されたARを有する患者と有さない患者の両方が組み入れられた前向き多施設共同NIH/NIAID助成臨床試験の一環として従前に得られたものであった(SNS01;NCT00141037;www.ClinicalTrials.gov; Li, L., et al. Am. J. Transplant. 2012, 12, 2710-2718)。残りの23サンプルは、本試験のためにthe Laboratorio de Investigacion en Nefrologia、Hospital Infantil de Mexicoからのみ得られたものであった。315サンプルの成人コホートのうち、米国およびヨーロッパの6か所の移植センターからサンプルが得られた(n=48:エモリー大学、アトランタ、ジョージア州、外科(エモリー);n=97:カリフォルニア大学ロサンゼルス校、ロサンゼルス、CA、免疫遺伝学センター(UCLA);n=92:ピッツバーグ大学、ピッツバーグ、PA、E.Starzl移植センター(ピッツバーグ);n=39:カリフォルニア・パシフィック・メディカルセンター、サンフランシスコ、CA(CPMC);n=23:カリフォルニア大学サンフランシスコ校、サンフランシスコ、CA、腎臓科(UCSF);n=16:ベルビッジェ大学病院、腎臓移植ユニット バルセロナ、スペイン(バルセロナ))。本試験は全ての現地IRB委員会により承認され、全患者がインフォームド・コンセントにより参加に同意した。
成人および小児セットI
表5は成人および小児セットIを示す。
別の例では、小児サンプルと成人サンプルを合わせたものをトレーニングおよびテスト(n=143名の成人)、バリデーション(n=124;59名の成人、65名の小児)、および独立予測(n=191;130名の成人、61名の小児、表4)のための3群に分けた。
別の例では、小児サンプルと成人サンプルを合わせたものをバリデーションのために100サンプルに分けた(77名の成人、23名の小児、表4)。
血液サンプルの採取
血液は、2.5mLのPAXgene(商標)血液RNAチューブ(PreAnalytiX、Qiagen、バレンシア、CA)または末梢血リンパ球(PBL)単離用のフィコールチューブに採取した。PBLサンプルは、Affymetrixシステムでのマイクロアレイ・ディスカバリーにのみ使用した。PAXgene(商標)チューブにはPreAnalytixの列に基づく方法キット(Qiagen)またはPBLサンプルにはRNeasy(Qiagen)を製造者のプロトコール従って用いて全RNAを抽出した。
全RNAを、2100バイオアナライザーにてRNA 6000 Nano LabChip(登録商標)キット(両方ともAgilent Technologies、サンタクララ、CA)を用いてRNAの完全性に関して評価した。なお、好適なRNAはRNA integrity number(RIN)が7を超える場合と定義される(Fleige, S. and Pfaffl, M. W. Mol. Aspects. Med. 2006, 27, 126-139.; Schroeder, A. et al. BMC Mol. Biol. 2006, 7, 3)。
cDNAの合成は、SuperScript(登録商標)II第1鎖cDNA合成キット(Invitrogen、カールスバッド、CA)を製造者のプロトコールに従って用い、末梢血サンプルからの抽出品質のmRNA250ngを用いて行った。
マイクロ流体QPCRのための全RNAサンプルの調製
マイクロ流体qPCR分析向けのサンプルは、特異的標的増幅のためのcDNA合成からの1.52ng(相対量)の全RNAとサンプル希釈溶液を用い、フリューダイムプロトコール(Fluidgm、サウスサンフランシスコ、CA)に従い、18Sを除く各検討遺伝子に対する個々のABI Taqmanアッセイをプールしたものを用いて調製した。簡単に述べれば、1.52ngのcDNAを用い、プールしたTaqmanアッセイをTaqman PreAmp Master mix(ABI)と複合化して、最終容量5μLで特異的標的増幅を行った。増幅は、サーマルサイクラー(Eppendorf Vapo−Protect、ハンブルク、ドイツ)にて18サイクルの後に達成された。次に、サンプルを無菌水(Gibco、Invitrogen、カールズバッド、CA)で1:5希釈した。
マイクロ流体qPCRは、96.96 Dynamic Array(Fluidigm)にて、製造者のプロトコールに概説されているように、各mRNAに対するTaqman Assays(Applied Biosystems、フォスターシティ、CA)、Taqman Universal master mix(Applied Biosystems)、およびローディング試薬(Fluidigm)とともに、特異的標的増幅から得られた2.25μLの希釈サンプルを用いて行った。このチップをプライムし、HX IFC Controller(Fluidigm)によってロードし、製造者のプロトコール(Fluidigm)に示されているように、BioMark(Fluidgm)にて遺伝子発現データ採取用のデフォルトパラメーターを用い、qPCRを行った。標準比較Ct値を使用し、内部対照参照としての18Sと外部比較参照としてのUniversal Human Total RNAを用い、遺伝子発現の相対的変化倍率値を求めた(Qiagen、Venlo、Limburg)。
標準プロトコールは、ABI 7900 Sequence Detection SystemまたはViiA7(Applied Biosystems)で、標準条件(95℃で10分、95℃で15秒、60℃で30秒の40サイクル)および遺伝子発現アッセイ(Applied Biosystems)を使用するqPCR反応に従った。RNA発現の相対量は比較Ct法を用いて算出した。発現値は、リボソームRNA内部参照およびUniversal Human Total RNA(Qiagen.)を用いて18Sに対して正規化した。
マイクロ流体QPCRデータ/前処置および正規化
フリューダイムハイスループットマイクロ流体qPCR技術を用いて43の遺伝子のより大きな遺伝子パネルの発現を測定するために236の成人および小児サンプルからのRNAで行った42,792のqPCR反応から得られた生のCt値を、6つの96.96マイクロ流体チップ(フリューダイム)から採取した。フリューダイムリアルタイムPCR分析ソフトウエアによりCt値を抽出し、エクセル(Microsoft Office 2012、Microsoft、CA)にアップロードした。テクニカルレプリケートに関する平均Ct値は、反復に関する標準偏差が<0.5であった場合に計算した。Ct値は、ΔCt(dCt)法(Livak, K. J. and Schmittgen, T. D. Methods 2001, 25, 402-408)を用い、内在対照遺伝子に対して正規化した。4つの異なる対照遺伝子、リボゾーム18S、βアクチン(ACTB)、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)、およびβ−2ミクログロブリン(B2M)を検定した。18Sが全てのサンプルで最小の変動を示したことから、それをdCt値の計算のために選択した。欠損値は5個の近傍を用いるK近傍法(K nearest neighbor)(KNN;Troyanskaya, O. et al. Bioinformatics 2001, 17, 520-525)により入力した。生のqPCRデータの可視化は、Partek Genomics Suite v. 6.6(Partek Inc.、USA)にて、教師なしの主成分分析(Principal Component Analysis)(PCA)および階層的クラスタリングを用いて行った。遺伝子発現の交絡因子はPCAおよび分散分析(ANOVA)により特定し、Partek(カテゴリー因子と数値因子を組み合わせた混合モデルANOVA)でのバッチ効果除去のより、また、SVARパッケージ内のコンバットファンクション(combat function)とともに経験ベイズ法を使用することにより補正した。この方法は小規模なサンプルのアウトライアーに対してロバストなものである(Chapelle, O., Haffner, P., and Vapnik, V. N. IEEE Trans. Neural Netw. 1999, 10, 1055-1064)。次に、43遺伝子のより大きなパネルのための正規化発現データを、以下に概略を示すように、ARと非ARの間の差次的発現遺伝子の同定のため、また、異なる年齢群のARの機序のより良い理解のため、また、ARの最高の予測力、感度、および特異度を有する遺伝子の選択ために用いた。
143のARおよび非ARサンプルの成人データセットにおいて、サンプル間の差次的遺伝子発現に対するRNAソース、PCRプレートのテクニカル効果、および移植センターの外的効果を混合ANOVAモデルで評価した。RNAソース、PCRプレート、および移植センターはランダムカテゴリー因子として含まれ、表現型(AR、非AR)はカテゴリー因子として含まれていた。各因子に関してp値を計算し、<0.05のp値は、特定の遺伝子の差次的発現がANOVAに含まれた因子のいずれか1つに関連していたことを示した。ANOVAモデルに基づくPartekのバッチ効果除去の特徴は、マイクロアレイチップが異なるバッチでハイブリダイズされた場合にマイクロアレイデータにおける差次的遺伝子発現の効果を除去するように初期設計されていた。次に、この特徴を用いて、RNAソース、PCRプレート、および移植センターのp値が1となるようにデータを調整する混合4元配置ANOVAモデルを構築することにより、RNAソース、PCR プレート、および移植センターの望ましくないランダム因子に関して補正を行う。この方法では、これらの因子による遺伝子発現の違いは無く、表現型のp値は最大となった(図11A〜D)。
143ARおよび非ARサンプルの成人データセットにおける変数選択の前に、バッチ効果を除去するためにSVA Rパッケージのコンバットファンクションとともに経験ベイズ法を用い、43遺伝子の発現を正規化した。この方法は小規模サンプルのアウトライアーに対してロバストなものである。
17遺伝子の発現を測定するための100の成人および小児サンプルに由来するRNAで行ったABI QPCR反応から得られた生のCt値を、384ウェルプレートから採取した。ABI viia7 PCR分析ソフトウエアによりCt値を抽出し、エクセル(Microsoft Office 2012、Microsoft、CA)にアップロードした。テクニカルレプリケートに関する平均Ct値は、反復に関する標準偏差が<0.5であった場合に計算した。Ct値は、ここに記載の方法(Livak, K. J. and Schmittgen, T. D. Methods 2001, 25, 402-408)を用い、Δt値(dCt)の計算のために内部対照遺伝子としてのリボゾーム18S RNAに対して、さらにまた、ΔΔCt値(ddCt)の計算のためにヒトUniversal RNA(Qiagen)に対して正規化した。
合計43の遺伝子を、ARおよび非AR特異的遺伝子の選択に用いた。遺伝子は、小児および成人移植拒絶における従前のマイクロアレイ試験(Li, L. et al. Am. J. Transplant. 2012, 12, 2710-2718; Naesens, M. et al. Kidney Int. 2011, 80, 1364-1376; Sarwal, M. et al. N. Engl. J. Med. 2003, 349, 125-138)に基づき、安定な同種移植(表2)に比べて差次的に変更されかつARに関連していることが確認されたものである。これら合計43の遺伝子のうち、10(CFLAR、DUSP1、IFNGR1、ITGAX、MAPK9、NAMPT、NKTR、PSEN1、RNF130およびRYBP)は、小児腎臓移植においてARの予測モデルの開発に焦点を当てた従前の研究で同定されたものである(Li, L. et al. Am. J. Transplant. 2012, 12, 2710-2718)。残りの33遺伝子は、種々のタイプの実質臓器移植の安定同種移植に比べてARにおいて、マイクロアレイデータのメタ分析で決定した際に差次的に変更されていた(Khatri et al. JEM, 2013, 出版者受理済み)。
ARと非ARの間で有意に差次的に発現される遺伝子を検出するため、および年齢群間のARの機序理解を助けるために、一元配置および多元配置ANOVA、有意に異なる分散の場合にはウェルチ補正を伴う対応のないスチューデントのt検定、および多重比較に関して補正するための偽陽性率(FDR)の算出を用いた;<0.05のp値またはFDR<5%を有意と見なした(図12)。
143の成人サンプルにおけるこれまでに公開されている遺伝子の評価
より大きな43遺伝子のパネルに由来するこれまでに公開されている10遺伝子パネル(CFLAR、DUSP1、IFNGR1、ITGAX、MAPK9、NAMPT、NKTR、PSEN1、RNF130およびRYBP;Li, L. et al., Am. J. Transplant 2012, 12, 2710-2718)を、143サンプルの成人検定データセットにおいてAR表現型の識別および予測のために用いた(図12)。
年齢、移植センター、およびRNAソースに依存せず、最小数の遺伝子を用いてARの高い予測力を有する新規な遺伝子パネルを定義するために、236サンプルの成人データおよび小児データを合わせたセットに、Shrinking Centroids(Tibshirani, R. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002, 99, 6567-6572; Storey, J. D. and Tibshirani, R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003, 100, 9440-9445)、前進的および後退的選択、および遺伝的アルゴリズム(Zhu, Z. et al., IEEE Trans. Syst. Man. Cybern. B Cybern. 2007, 37, 70-76)を適用した。加えて、徹底的な検索を適用し、236のサンプルにおいて分析した43の遺伝子から5遺伝子のあり得る全ての組合せを検索することによって上位ランク遺伝子を定義した。Shrinking Centroidsアプローチにおいて、43の遺伝子からあり得る全ての遺伝子組合せを、最小数の遺伝子セットを5、最大数の遺伝子セットを20として、1遺伝子刻みで一度に検定した。遺伝子をそれらのAR予測確率に関して交差検証(1−LLOCV)によって検定した。合計1872のモデルを、117の異なるアルゴリズムを用いて検定した。結果を、遺伝子の数、および5遺伝子から43遺伝子の範囲の同じ遺伝子組合せのAUCに従ってランク付けした。結果として最高の平均AUCを有する組合せを選択した。前進的選択(ステップアップ)および遺伝的アルゴリズムにおいて、遺伝子パネルの増加数を検定した:n=5、7、10、12、13、15、17、および20をそれぞれ上記のような117の異なるアルゴリズムを用いて検定した。結果を比較し、これらのモデルの少なくとも50%で選択された最終遺伝子を選んだ。この遺伝的アルゴリズムでは、遺伝子パネルが無作為に選択された初期集団を、各遺伝子が少なくとも50回検定されるように定義した。以下の集団を検定した:下式:
変数選択の前に、バッチ効果を除去するために、経験ベイズ法をSVA Rパッケージのコンバットファンクションとともに用いることによって遺伝子を正規化した。この方法は小規模なサンプルのアウトライアーに対してロバストなものである。このデータは、143の観測値および43の遺伝子と、疎であることから、本発明者らは、Rパッケージを用いて患者サンプルを分類するためにペナルティ付きロジスティック回帰を使用した。このアプローチにより、回帰係数の正確な推定値だけでなく、各患者の確率推定値も得られる。本発明者らは、評価のためのCoordinate Descentによる一般線形モデルに関する正側化パスを用いた(図12)。
遺伝子選択を、ARの判別および予測に関して、等しいおよび比例する事前確率を有する判別分析(Discriminant Analyses)(DA)、サポートベクターマシーン(Support Vector Machine)(SVM)、ロジスティック回帰(logistic regression)(LR)および等しい事前確率の部分最小二乗DA(Chapelle, O. et al., IEEE Trans. Neural Netw. 1999, 10, 1055-1064; Brown, M. P. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 2000, 97, 262-267)の、核関数ラジアル基底関数(radial basis function)(rbf)、部分最小二乗(partial least square)(pls)DA(Perez-Enciso, M. and Tenenhaus, M. Hum. Genet. 2003, 112, 581-592; Gottfries, J. et al., Dementia 1995, 6, 83-88)との併用によって評価した。SVM分類では、経験分類誤差の最小化と幾何学幅の最大化を同時に行うことによってARと非ARの最も広い分離を与えた決定面を定義する最良の一般非線形ベクター(「サポートベクター」)を見出すために、正側化パスラジアル基底関数(rbf)を使用する。SVMは、特徴(遺伝子)およびサンプル数の希薄なデータセットに対して十分な性能を示す(Nouretdinov, I. et al., Neuroimage 2011, 56, 809-813)。第一種過誤を最小にするために、データセットを分離したトレーニングセットとテストセットに分けるのではなく、10分の1レベル一個抜き交差検証(a ten-fold one level leave one-out cross validation)(1−LLOCV)を行った。成人データセットと小児データセットを合わせたものでこれらの遺伝子による予測力、感度、および特異度を評定するために、各分類法にARの曲線下面積(AUC)および事後確率を与えた。各遺伝子選択アプローチから最高のAR予測力、最高の感度、および最高の特異度を有する遺伝子を、ABIプラットフォーム(Abi viia7、Life Technologies、フォスターシティ、CA)でのqPCR用の17遺伝子の最終選択のために比較した。必要な場合には、ARと非ARを比較するスチューデントのT検定およびANOVAからのp値およびFDR値を使用した。最終遺伝子選択のワークフローを図12に示す。
17遺伝子を用いた236の小児および成人サンプルにおけるアルゴリズムの同定
合計122の分類アルゴリズムを、選択された遺伝子(合計17)を用い、2レベル一個抜きネステッド交差検証(two level-leave one out nested cross validation)(2−LLOCV)および5アウター、5インナーのデータ分割で検定した。「インナー」交差検証(cross validation)(CV)は、予測因子変数と最適モデルパラメーター選択のために行い、「アウター」CVは、分類子に関して総合的精度推定値を得るために用いた。「インナー」CVは、テストセットの提供に適用される最適モデルを選択するために、テストデータとして提供されなかったトレーニングデータで行った。236サンプルで検定された分類モデルは、判別関数および等しいまたは比例する事前確率、ユークリッド距離測度、平均ユークリッド距離測度またはコサイン非類似性距離測度および5個の近傍を用いるKNN、等しいまたは比例する事前確率、LR、およびSVMを用いる最近傍重心を含んだ。
合計122の分類アルゴリズムを、143の成人サンプルにおいて、選択された遺伝子(合計17)を用い、2レベル一個抜きネステッド交差検証(2−LLOCV)および10アウター、10インナーのデータ分割で検定した。「インナー」交差検証(CV)は、予測因子変数と最適モデルパラメーター選択のために行い、「アウター」CVは、分類子に関して総合的精度推定値を得るために用いた。「インナー」CVは、テストセットの提供に適用される最適モデルを選択するために、テストデータとして提供されなかったトレーニングデータで行った。143サンプルで検定された分類モデルは、等しいまたは比例する事前確率を用いる部分最小二乗判別分析および線形判別分析、サポートベクターマシーン、ユークリッド距離測度、平均ユークリッド距離測度またはコサイン非類似性距離測度および5個の近傍を用いるKNN、等しいまたは比例する事前確率、およびLRを用いる最近傍重心を含んだ。上位モデルを143サンプルにおいて、1−LLOCVを用いて評価した。精度の尺度は、正解率、感度、特異度、NPV、PPV、および受信者動作者曲線下面積(AUC)であった。
本発明者らは、ARと非ARを分類するために、ブートストラップサンプル(29テスト、114トレーニング、置換によるサンプリング)を用い、100のElastic Netロジスティック回帰モデルを43の遺伝子に当てはめた。各ブートストラップに関して、ネステッド交差検証ループは、逸脱度に従ってλの最良値を推定した。Elastic−Netのαパラメーターは推奨値の.95に固定された。これらの遺伝子のランク付けを行うために、本発明者らは、各遺伝子が100ブートストラップにおいてElastic−Netにより選択された回数を数えた。ブートストラップサンプルのそれぞれについて、Elastic−Netは43の遺伝子のサブセットを非ゼロ係数に当てはめる。100のブートストラップモデルの実行の後、本発明者らは最大数の非ゼロ係数を有するK遺伝子を選択した。第2工程において、予測成績(分類率、感度、特異度、PPv、NPv)のバイアスのない推定を得るために、本発明者らは、λに対するネステッド交差検証を用い、この場合には工程1で選択されたK遺伝子のセットのみを用いて、別のセットの100ブートストラップElastic−Net分類を復興した。本発明者らは分類率、感度、特異度、陽性的中率(PPv)および陰性的中率(NPv)を報告する。
相関に基づくARおよび非AR分類の開発
各患者サンプルについてピアソンの相関係数(ρ)を計算するために、ΔCt値をクエリーサンプルとして用い、AR分類サンプルまたは非AR分類サンプルのいずれかに関する平均遺伝子ΔCt値と比較した
LineageProfiler(LP)の名称の新たな相関に基づくオープンソースのアルゴリズムを用い、さらなるqPCR評価のために最適な遺伝子モデルの発見のためにさらなる修正を行った。LPの入力はΔΔCt正規化患者サンプルqPCR値および2つの参照qPCRプロファイル(AR参照プロファイルおよび非AR参照プロファイル)である。この分析は5つの工程からなる:工程1:評価した遺伝子のパネルに対してRNA発現値のマトリックスをインポートする;工程2:各遺伝子について、全ARサンプルからの単一の参照発現ベクター(平均)および全非ARサンプルに対する単一の参照発現ベクターを作出し、保存する;工程3:各qPCRセット(遺伝子セット)に関して分析した遺伝子のあり得る全ての組合せを同定する;工程4:患者サンプルを分類するために、各遺伝子セットについて各患者RNAプロファイルを参照ARプロファイルおよび参照非ARプロファイルと直接比較する(LPを使用);および工程5:関連の参照プロファイルに関して上位予後リストを同定するために、既知のARおよび非AR状態に基づく遺伝子セットをランク付けする。17遺伝子由来の、4〜12の範囲の数種類の長さの遺伝子セットを、各独特な測定プラットフォーム(フリューダイムまたはABI)のため、およびあり得る全ての組合せのために作出した。フリューダイム分析については、全遺伝子で開始して上位スコアモデルを反復同定し、さらにその後の全てのモデルの導出を分析する最適化関数が書かれていた。最も成績のよい遺伝子セットを同定した後、これらの遺伝子セットを固定し、別個のバリデーションデータセットに適用した。対応する参照発現プロファイルを用いた既存のまたは新たなデータセットの分析は、オープンソースソフトウエアAltAnalyzeバージョン2.0.8(http://www.altanalyze.org)にてLP関数を用いて行うことができる(図4A〜B)。
サンプルのARまたは非ARとしてのロバストなリスク層別化のため、kSASという名称の新規な相関に基づくアルゴリズムを開発した。大規模なデータセットが評価される発見および交差検証における好適なアプローチである経験ベイズ法およびANOVAなどの方法により外的交絡因子を補正するのではなく、数、サンプル採取場所に依存しない、従って通常の臨床現場により適用度の高いサンプルの正確な前向き予測を可能とする、17遺伝子パネルに固定されたARおよび非AR QPCR参照プロファイルを適用するためにkSASを開発した。kSASでは、患者サンプル、および2つの参照QPCRプロファイル(1つは既知のAR用、1つは既知の非AR用)においてQPCR dCt(18S)値を使用する。kSAS分析は、トレーニングおよびテストのために5つの主要工程を含んでなる:1)全サンプルに対して17遺伝子dCt(18S)発現マトリックスをインポートする、2)各遺伝子に対する既知のAR発現ベクターおよび非AR発現ベクターを定義する;3)全遺伝子で開始して上位スコアモデルを反復同定する最適化関数を用いてあり得る全ての遺伝子の組合せを同定する;4)各患者について得られた全てのモデルを参照ARおよび非ARプロファイルと比較して、相関度(ピアソン相関係数)に基づき患者サンプルを分類する;5)上位予後リストを同定するために、相関により遺伝子セットをランク付けする。各患者サンプルについてピアソンの相関係数(ρ)を計算するために、本発明者らは、クエリーサンプルの各遺伝子のdCt(18S)値を、ARまたは非ARいずれかの参照の同じ遺伝子の平均dCt(18S)値と比較する。得られた各遺伝子モデルについて、AR ρ−非AR ρ×10を計算することによりリスクスコアを算出した。得られた全てのモデルリスクスコアを合計し、各サンプルに関する統合ARリスクスコアを得た。サンプルは、サンプルARおよび非ARリスクスコア(ARまたは非ARにおいてより大きな相関)の比較に基づきARまたは非ARとして分類された。相関分析は、適用可能であれば、4、5、6、7、8、9、10、11および12遺伝子セットのあり得る全ての組合せについて行った。最良レポートモデルを、サイズの異なる遺伝子セットを比較する場合には、全てのサンプルのうち正確に分類された患者サンプルのパーセンテージに基づきスコア化した。遺伝子セットの例は表2にある。ARおよび非ARプロファイルにおける採取場所に関連する変動に取り組むためには、各採取場所に対する個別のAR参照および非AR参照は、各モデルについての相関により導かれたリスクスコアを算定する場合には、各個人サンプル比較のための最も相関の高い場所参照対を選択するために単一の表に示した(図9A〜C)。
新規移植センターに関して参照を使用するためには、未知のサンプルの分析の前に、同じ方法で未知のサンプルとして採取されARまたは非ARとして分類される血液を採取し、推奨される12遺伝子モデルセット(下記参照)を用いてプロファイリングを行うべきである。機械およびサンプル採取センターのバイアスがこれまでに見られていたことから、これらのサンプルは移植センター特異的参照として役立つ。十分な数のサンプルに対してqPCRプロファイルを得た後に、全てのARサンプルおよび非ARサンプルの平均発現を個別に採り、アッセイした全ての遺伝子について2列参照を作成した。あるいは、個々のサンプルの代わりにプールしたRNA参照の使用でも十分なはずである。このデータは、第1列が遺伝子IDを含み、第2および第3列がそれぞれAR参照および非AR参照を含む、3列タブ区切りテキストファイルとして保存する。まず、これらの参照サンプル間に有意な変動性が存在するかどうか(例えば、ARサンプルと非ARサンプル間の不十分な分類スコア)を決定するためのこの参照に用いたオリジナルサンプルの再分析が奨励される。
非移植データにおけるkSASの評価
kSASをAR患者および非AR患者のデータに適用する前に、本発明者らは、従前に記載されている、GEICAM/9906臨床試験から得られた814サンプルに適用された50の乳癌予後マーカー遺伝子のQPCR分析に対してこのアプローチを評価した。kSASは、無作為に選択した患者テストセット(272の患者サンプル)を、残りのサンプルで参照作成(トレーニング)を行った後に、5つの明瞭に異なる予後乳癌群に上手く分類することができ、50全てのマーカー遺伝子を用いて成功率は>85%であった。24および25遺伝子のより小さな予後遺伝子モデルもまた、トレーニングセットにおいてより高いパーセンテージ(90.0%対85.6%)およびテストセットにおいて同等の精度(83.1〜83.8%)で患者を分類することができた。
本発明者らは、143の成人サンプル(コホート1)の同じ正規化データセットでkSASを評価した。参照ARプロファイルおよび参照非ARプロファイルをコホート1のランダム2/3トレーニングサンプルセットから、43全ての遺伝子について得た。次に、このトレーニングセットを、上位スコア遺伝子モデルを同定するために、サイズの等しい10のAR/非AR 2/3および1/3セットにプログラムによりさらに再分割した。このトレーニングセットからの最高スコアモデルを、トレーニングセットAR参照プロファイルおよび非AR参照プロファイルを用いて、オリジナル1/3トレーニングセットで評価した。
本発明者らは、100の成人および小児サンプルにおいて、kSASにより定義された13全ての12遺伝子モデルの、単一の遺伝子モデルに基づくものではないが13全ての12遺伝子モデルを含む、各患者についての単一の信頼スコアを提供する組合せ能を評価した。本発明者らは、100のARおよび非ARサンプル(26のAR、42の非AR)の合わせたデータセットに関する統合ARリスクスコアを算出した。統合ARリスク分析 は、13の12遺伝子モデルによって患者が非ARと予測された回数を、同じ患者がARと予測された回数から差し引くことによって、各患者に関する数的ARリスクスコア(−13〜13)を生成した。この統合リスクスコアに基づき、患者は高リスクAR、低リスクARまたは中リスクとして類別することができる。高リスクARのカットオフは統合スコア≧9であり、低リスクARは統合スコア≦−9であった。統合スコア≧−7および≦7の患者は中リスクと見なされた(図9C)。
本明細書に記載の相関に基づく分析は、AltAnalyzeバージョン2.0.8以降を用いて行うことができる。LineageProfilerは、オープンソースソフトウエアAltAnalyze(http://code.google.com/p/altanalyze/downloads, version 2.0.8 or higher)のグラフィック・ユーザー・インターフェースから、また、スタンドアロンpythonスクリプトとして(https://github.com/nsalomonis/LineageProfilerIterate)入手可能である。AltAnalyzeは、http://www.altanalyze.orgからダウンロードし、ハードドライブに抽出し、初回起動の後にプロンプト(現在、EnsMart65)が表示された際に最新のヒトデータベースとともにインストールすることができる。あるいは、LineageProfiler・ファンクションは、このソフトウエアのコマンドラインバージョンを、https://github.com/nsalomonis/LineageProfilerIterateで入手可能なgene model discoveryのオプションとともに用いて実行することもできる。LineageProfilerのスタンドアロン・グラフィック・ユーザー・インターフェース・バージョンおよびコマンド・ライン・バージョンの実行命令は、http://code.google.com/p/altanalyze/wiki/SampleClassificationに記載されている。LineageProfilerのソースコードは、本明細書に記載の実施形態で使用するために修正され、LineageProfiler Iterateとなっている。本明細書で使用する場合、修正版LineageProfilerであるLineageProfiler IterateおよびkSASは互換的に使用される。kSASのソースコードは、付表Cに示されている。このソフトウエアを用いて、所与のサンプルセットに関する定量的発現値を、特定の疾患クラス、表現型、または処置カテゴリーに属すとして分類することができる。簡単に述べると、このアルゴリズムはこれを、所与のサンプルに関する発現値の入力セットを2以上参照条件と相関させることにより行う。このサンプルを参照と直接相関させるというよりも、既知のクラスに属するサンプルを用いて高い程度の予測成功をもたらすことが従前に確認されているモデルファイルから遺伝子のサブセットを選択することができる。このアルゴリズムはまた、別のまたは新たな遺伝子モデルを発見するために新たなデータに適用することもできる。
AR分類は、ARおよび非AR判別遺伝子のパネルに関するqPCRにより誘導される発現値を対照18S遺伝子とともに用いて実行される。ABI viia7プラットフォームにてqPCRから生成したΔCt値(18Sと比較)がこのアルゴリズムの未知のサンプル入力として使用される。さらに、参照ARプロファイルおよび参照非ARプロファイル(dCt)を含む参照ファイルもこのソフトウエアに供給される。
AR分類は、ARおよび非AR判別遺伝子のパネルに関するQPCRにより誘導される発現値を、対照18S遺伝子とともに用いて実行される。ABI viia7プラットフォームにてQPCRから生成した、18SおよびユニバーサルヒトRNAとの比較によるΔΔCt値がこのアルゴリズムの未知のサンプル入力として使用される。さらに、参照ARプロファイルおよび参照非ARプロファイル(ddCt)を含む参照ファイルもQPCRデータから導かれる。
発現ファイルは、file extension .txt.を有するタブ区切りテキストファイル形式の正規化発現値(qPCRΔCt値)からなる。このファイルの第1列は、参照ファイルの第1列に一致するID(遺伝子記号)を含み、第1行はサンプル名を含み、残りのデータは正規化発現値(すなわち、ΔCt値)からなる。
発現ファイルは、file extension .txt.を有するタブ区切りテキストファイル形式の正規化発現値(qPCRΔΔCt値)からなる。このファイルの第1列は、参照ファイルの第1列に一致するID(遺伝子記号)を含み、第1行はサンプル名を含み、残りのデータは正規化発現値(すなわち、ΔΔCt値)からなる。
このアルゴリズムもまた、オープンソース分析パッケージAltAnalyzeで利用可能であり、別にインストールする必要はない。AltAnalyzeは、いくつかの異なる分析機能を含む大きなトランスクリプトーム分析ツールキットである。AltAnalyzeは大規模データベースのインストールを必要とするので、スクリプトのコマンドラインバージョンの使用が勧められる。
LineageProfilerIterate/kSASスクリプトがダウンロードされれば、それを容易にアクセス可能な場所に移動するべきである。次に、ターミナルウィンドウを開かなければならない(PCでのコマンドプロンプトとも呼ばれる)。ターミナルまたはコマンドプロンプトウィンドウを開くための所与のオペレーティングシステムに対する命令は、オンラインで容易に見つけることができる。次に、ターミナルウィンドウでは、ディレクトリからLineageProfilerIterate/kSASスクリプトを含むフォルダにアクセスすべきである。
上記の手順を用いてAltAnalyzeをインストールした後、入力データの分析を実行することができる。このために、適当な発現、参照、およびモデルファイルが必要である。
複数のフィールドがフォルダサンプル分類内の結果ファイルに提示される。タブ区切りテキストファイルはエクセルで開くことができる。データは次のように提示される:
A列:サンプル−サンプル名を示す
B列:AR予測ヒット−ARが予測されるモデルの数を示す
C列:非AR予測ヒット−非ARが予測されるモデルの数を示す
D列:コンポジット予後スコア−B〜C列のスコアを合わせたもの
E列:Zスコアの差の中央値−G〜S列のZスコアの中央値
F列:予後リスク−総合的予測リスク評定
G〜S列:AR予測ヒット−各サンプルおよびモデルについての個々のスコア
236の成人および小児ARサンプルと非ARサンプルの間で差次的に発現される遺伝子 成人と小児の両方でAR患者を非AR患者から識別し、ARの非侵襲的検出のためのロバストなバイオマーカーを提供した遺伝子を同定するために、マイクロ流体ハイスループットqPCRプラットフォームフリューダイム(Biomark、Fluidigm Inc.)にて、成人および小児患者由来の236の血液サンプルで、上記で定義された43遺伝子(42遺伝子とハウスキーピング遺伝子であるリボソームRNA18S)の発現の同時測定を行った。教師なしのPCAおよびANOVAによって評価した場合、患者が同種移植を受けた特定の移植センター(「センター」)は、拒絶状態に関する患者の分離を説明する最大の変数であることが判明した。教師なしのPCAによれば、移植センターにより分離したサンプルは、未補正のデータセットにおいて表現型(ARと非AR)により推論される遺伝子発現の違いを無効にすることが判明した。除去されるランダムカテゴリー因子として移植センター、RNAソース、およびqPCRチップ、残すカテゴリー因子として表現型(AR、非AR)が含まれた混合ANOVAモデルを用いてデータを補正すると、移植センターによりサンプルを分離することなく、むしろ表現型によりサンプルを分離した遺伝子発現が得られた。この正規化セットの分析により、これらの遺伝子の大規模サブセットがARと非ARの間で差次的に発現されたことが示された(スチューデントのT検定:n=32、p<0.05)。
サポートベクターマシーンによる10遺伝子を用いた成人ARサンプルと非ARサンプルの分類
異なる採取センター、性別、血液RNAサンプルソース、およびレシピエント年齢でのAR分類に関するこれらの遺伝子セットの潜在的有効性を評価するために、PartekおよびRにおいて利用可能な2つの異なる分類アプローチを利用した。Partekでは、SVMアルゴリズム(コストパラメーターc=701、核関数=ラジアル基底関数exp(-gamma ||x-y||^2)ここでgamma=3)、Rでは、Elastic−Netを用いるペナルティ付きロジスティック回帰を、サンプルのARまたは非ARへの分類に適用した。両分類アルゴリズムとも二元分類子であり、SVMは2つのクラスを分離する境界を最大化するように設計され、従って、トレーニングされたモデルは、所見のデータに対して、データを過剰適合することなく、十分な一般化を行う。しかしながら、SVMは非確率論的分類子であり、個々の予測精度スコアを提供しない。ロジスティック回帰は、各サンプルに対して予測的確率スコアを提供する。これらの方法は、生検読み取りと臨床機能が一致した143の成人AR(n=47)および非AR(n=96)サンプルのテストセットにおいて、小児および若年成人血液サンプルでのAR検出に関して従前にバリデートされた(AR検出に関して92%精度、91%感度、および94%特異度)、従前に公表された10遺伝子小児モデル(CFLAR、DUSP1、IFNGR1、ITGAX、MAPK9、NAMPT、NKTR、PSEN1、RNF130、およびRYBP)を用いて、センターに関して正規化されたデータに適用した。上記のSVMを用い、同じ10遺伝子は、143サンプルの成人データセットに適用した場合に、87%精度、70%感度、および96%特異度で成人におけるARを検出した。
生検により証明されたARを有する40名の患者について、AR生検の最大7か月前(n=27)および6か月後まで(n=30)に採取した小児同種移植レシピエントからの一連のサンプルが利用可能であった。小児5遺伝子発現モデル(DUSP1、NAMPT、PSEN1、MAPK9、およびNKTR)により、ARの生検の最大6か月前(平均スコア0〜3か月=88%;平均スコア3〜6か月=58%)および1か月後まで(平均スコア=63%)、高いAR予測スコアが明らかになった。40の適合ARサンプルの平均スコアは91%であった。AR生検後1か月以降に採取されたサンプルでは、ARの平均予測スコアは3か月で42%、>3か月後で48%であった(図3B)。
ペナルティ付きロジスティック回帰による15遺伝子を用いた143の成人ARサンプルと非ARサンプルの分類
精度および感度を改善するために、さらに32遺伝子の成人検定セットに対する影響を、年齢非依存的AR予測アルゴリズムを開発するために含めることができるさらなる遺伝子の選択のためのペナルティ付きロジスティック回帰を用いて調べた。結果として、32遺伝子から15のさらなる遺伝子が選択された(CEACAM4、SLC25A37、RARA、CXCL10、GZB、IL2RB、RHEB、C1orf38、EPOR、GZMK、ABTB1、NFE2、FOXP3、MPP1、およびMAP2K3)。これらのさらなる遺伝子の使用により、ペナルティ付きロジスティック回帰による成人データセットにおけるARの予測に改善がもたらされた(92%精度、86%感度、および94%特異度)。5サンプル(非ARが2、ARが3)だけが不正確な分類であった。このペナルティ付きロジスティック回帰モデルにおけるAR予測のθは50%であり、これらのサンプルの分類が、サンプルをARと表示するために>50%の確率スコアで、また、サンプルを非ARと表示するために<50%の確率スコアで達成されたことを示した(図2A)。
49サンプルの独立セットでの成人15遺伝子モデルの成績を検定した。サンプルは、採血時に生検により確認された病状レポートを有する8名のAR患者と6名の非AR患者を含んだ。残りの20サンプルは、血液サンプル採取時に適合した生検を持たなかった患者(N.A.、n=22)、またはBK腎症患者(BK、n=2)に加え、急性尿細管腎炎(ATN、n=3)、急性薬物毒性(CNIT、n=4)を含む、もしくは生検時に慢性同種移植損傷を示していた(IF/TA、n=4)、他の形態の移植片機能不全を受けていた患者(n=13)から採取された。未知の表現型の患者に由来するこれら22サンプルに、サンプル採取の前または後に生検により証明された拒絶を持っていたものは無かった。遺伝子発現を用いたところ、全ての非ARサンプルが正確に非ARと予測され、8のうち5のARサンプルが正確にARと分類された。ARと他起源の移植片機能不全の間の予測スコアは、ARの方が有意に高かった(p=0.0162)。未知の表現型(N.A.)を有する患者由来の全てのサンプルは非ARと予測された(図2B)。
大部分のARサンプルは、細胞性拒絶と体液性拒絶の混合型である。ドナー特異的抗体(donor specific antibody)(DSA)データは、全ての場合で生検時には得られなかった。抗体媒介性拒絶(antibody-mediated rejection)(AMR、C4D陽性生検染色、DSA+)のみを示した患者5名のサブセットを用い、予測スコアを、明らかな細胞媒介性拒絶(ACR、C4d−、DSA−;n=33)のみを有する患者と比較した。純粋な抗体媒介性拒絶エピソードおよび細胞媒介性拒絶エピソードの数は比較的少なかったものの、2つのARサブグループにおける平均AR予測スコアの比較により、このモデルはAMRおよびACRを、高い予測確率(平均スコアAMR=82.9%±0.16;平均スコアACR=89.5%±0.12;p=0.413)で均等に検出したことが明らかになった(図2)。図2Aは、143のARおよび非AR成人患者におけるARの予測確率を示す。図2Bは、49の独立した患者(AR8、非AR6、移植片不全13、および未知22)におけるARの予測確率を示す。
生検により証明されたARを有する患者のサブセット(n=59)に関して、AR生検の最大2年前(n=23)および1.5年後(n=19)に採取した一連の血液サンプルが利用可能であった。遺伝子発現により、ARは、この成人集団においてARに関する生検の最大3か月前および1か月後まで示された(平均AR確率0〜3か月前=43%;平均AR確率0〜1か月後=50%)。AR生検の3か月前または1か月後を超えて採取された血液サンプルでは、本遺伝子発現モデルを用いてARを検出する確率がそれぞれ24%および24%の確率に落ちた。17の適合ARサンプルの平均スコアは82%であった(図3A)。
レシピエント年齢に依存せずにARを検出するために、93の末梢血サンプル(AR22、非AR71)からなる小児および若年成人患者の独立したサブセットからのqPCRデータ(Li, L. et al. Am. J. Transplant. 2012, 12, 2710-2718)を、成人移植レシピエントからの143のサンプル(AR47、非AR96)と合わせた。Shrinking Centroidsを用い、患者をARまたは非ARに分類した17遺伝子のセットを、SVMアルゴリズムを分類のためのコストパラメーター=701、カーネル=rbf、およびγ=3とともに用いて同定した。この17遺伝子モデルは、SVMを用い、236の小児、若年成人、および成人患者の複合データセットで、94%精度、88%感度、および95%特異度でARを検出した。この17遺伝子セットは10の小児遺伝子(CFLAR、DUSP1、ITGAX、RNF130、PSEN1、NKTR、RYBP、NAMPT、MAPK9、およびIFNGR1)の組合せ、新たに定義された15の成人遺伝子のうち6(CEACAM4、RHEB、GZMK、RARA、SLC25A37、およびEPOR)、ならびにレチノイドX受容体α(RXRA)を使用した。これらの17遺伝子を用いたところ、69のARサンプルのうち8サンプルだけが不正確に非ARと予測され、169の非ARサンプルのうち8サンプルだけが不正確にARと予測された。明らかに、成人特異的遺伝子と小児特異的遺伝子の組合せは、高い精度、感度、および特異度を持った年齢非依存性のARの予測の開発に必要である。
等しい事前確率の部分最小二乗判別分析による17遺伝子を用いた143の成人ARサンプルと非ARサンプルの分類
腎臓AR予測アッセイを定義するための最終的な17遺伝子は、小児10遺伝子パネル(DUSP1、CFLAR、ITGAX、NAMPT、MAPK9、RNF130、IFNGR1、PSEN1、RYBP、NKTR)と成人拒絶に有益なさらなる7遺伝子(SLC25A37、CEACAM4、RARA、RXRA、EPOR、GZMK、RHEB)からなった(図12);これらの17遺伝子は、レシピエント異年齢間でARを識別するために最適な成績を示し:143の成人サンプルのトレーニングセット(コホート1)では、17遺伝子は39/47のサンプルを正確にAR予測し、87/96のサンプルを正確に非ARと予測し、等しい事前確率の部分最小二乗判別分析において感度83%、および特異度91%が得られた(plsDA;図6A〜B)。平均予測AR確率は、各センターにおいてARと非ARを比較すると高い有意性で異なっていた(CPMC:p<0.0001;エモリー:p=0.002;UPMC:p<0.0001;UCLA:p<00001)(図6A)。17遺伝子の受信者動作特性(ROC)曲線下の総面積は、plsDAによればAUC=0.94(95%CI0.91〜0.98;p<0.0001)であった(図6B)。
成人および小児の両レシピエントにおいて非AR表現型からARを識別するための17遺伝子腎臓AR予測アッセイモデルを独立にバリデートするために、本発明者らは、フリューダイムプラットフォームでも行った、成人(n=59)および小児(n=65)を合わせた124の独立したサンプルのセット(コホート2;後向きバリデーション)におけるその成績を検定した。17遺伝子腎臓AR予測アッセイモデルは、21/23のサンプルをARとして正確に予測し、BKウイルス腎炎患者4名を含む100/101のサンプルを非ARと正確に予測し(図7A)、アッセイ感度91.3%および特異度99.01%が得られた。2つの誤分類ARサンプルのうちの1つは、重度の慢性傷害を有し(IF/TAグレードIII)、拒絶時に生検サンプルにおけるグローバルな退縮は>33%であった。トレーニングセット(コホート1)で見られるように、ARの平均予測確率は、バリデーションセット(コホート2)のARサンプル(80.55%)と非ARサンプル(9.2%)の間でも有意に異なっており(p<0.0001;図7B);BKV群のARの平均予測確率は12.76%と低かった。124サンプルのROC分析の結果はAUC=0.9479(95%CI0.88〜1.0)であった(図7C)。各サンプル採取場所における17遺伝子腎臓AR予測アッセイモデルの成績を評価するために、本発明者らは、コホート1およびコホート2からのエモリー(n=42)、UPMC(n=81)、UCLA(n=44)およびCPMC(n=35)における予測のためのROC AUCを計算した。移植センターによるアッセイの成績は、個々のROC AUCは4か所全てのセンターについて>0.8であることを示した(図13A〜D)。
フリューダイムプラットフォームで分析された大部分のARサンプルは、いくらかの細胞性拒絶と体液性拒絶の混合状態または関連の慢性変化を示した。固定された17遺伝子モデルによって評定した場合、明らかな抗体媒介拒絶(AMR、C4D+生検染色、DSA+)のみを有する19名の患者と明らかな細胞媒介性拒絶(ACR、C4d−およびDSA−、およびBanff t−およびiスコア>1)を有する51名の患者の間でAR予測スコアに違いは見られなかった(plsDA;p=0.9906;平均ACR=80.84%±4.4;平均AMR=80.75%±6.6;図14A)。
移植後拒絶の時間が17遺伝子の予測精度に影響をしたかどうかを評価するために、移植後0〜6か月、6〜12か月の間、および>1年に採取されたARサンプルおよび非ARサンプルにおける予測AR確率を評価したところ、移植後の時間による影響を認めなかった(図14B)。
17遺伝子腎臓AR予測アッセイモデルの予測性を評価するために、生検適合ARエピソード(n=74)の前(0.2〜6.8か月、n=65)または後(0.2〜7か月;n=52)のいずれかに採取した191の血液サンプル(コホート3;前向きバリデーション)を分析した。AR生検の0〜3か月前の血液サンプルを有する患者(n=35)のうち、安定な移植片機能の時点で、62.9%(22/35)が極めて高いAR予測スコア(96.4%±0.8)を有しており(図8)、経過観察時に安定な移植片機能を有しかつARを示さない患者のスコアよりも有意に高かった(19.4%±0.3;p<0.0001)。AR処置の0〜3か月後に採取された血液サンプルを有する患者(n=31)のうち、51.6%(16/31)はなお高いARスコアを有しており(86%±0.17);15/31サンプルはAR処置の0〜3か月後にAR閾値より低いARスコアを示した(6.59%±0.13%)。低いAR予測スコアを有する患者のクレアチニンレベルが1.8±0.4mg/dLであるのに対して、高いAR予測スコアを有する患者の血清クレアチニンレベルは2.04±0.4mg/dLであったことから、前者はAR処置に奏効した患者n相当すると思われる(図8)。
標準的QPCRのためのABI viia7 QPCRプラットフォームの選択
フリューダイムプラットフォームなどのハイスループットQPCRプラットフォームは、診断用バイオマーカーパネルの発見および初期開発のために極めて好適であるが、費用効果がある性能を得るためには大きなサンプルサイズおよび遺伝子数が必要である。従って、変動のあるより少ないサンプル数のための、カスタマイズ可能な形式と費用効果のある性能を有する臨床適用可能なアッセイを開発するために、17遺伝子モデルを44名のAR患者および56名の非AR患者から採取した100サンプルを用い、標準的qPCR(ABI viia7、Life Technologies、フォスターシティ、CA)により分析した。これらの遺伝子セットを臨床分析(スケーラビリティ、コスト、マシンアベイラビリティ、プロトコールの簡素性)に関して最適化するため、下流での発見およびバリデーションのためにABI qPCRプラットフォームを用いた。
発見のため、kSAS分析は2か所の成人センター(UCSFおよびピッツバーグ)と1か所の小児センター(SNS)に制限した。この分析により、両成人センターおよび小児センターで89%の割合でAR状態を分類することができた7遺伝子モデル(CFLAR、DUSP1、IFNGR1、ITGAX、MAPK9、NKTR、およびRYBP)が得られた。もう1つの3〜10遺伝子のモデルサイズは、最終的な7遺伝子のセットよりも全体的な成績が低かった。成人に関して合わせた分類率は、16のARサンプルおよび16の非ARサンプル(感度=88%、特異度=75%)に基づけば81%精度となり、小児セットでは、22のARサンプルおよび155の非ARサンプル(感度=91%、感度=90%)に基づけば、90%精度となった。
従前に発見された10の小児遺伝子に加え、フリューダイム分析から同定された7つの成人分類子遺伝子(CEACAM4、EPOR、GZMK、RARA、RHEB、RXRA、およびSLC25A37)をABI遺伝子パネルに加えた。これら17遺伝子の配列をゲノムDNA配列として付表Aに示す。これらの遺伝子のほとんど全てが、143の患者フリューダイムqPCRデータセットを、kSASを用いて再分析した際にも高い値の予後マーカーとして同定された。この大きなABI遺伝子セット分析は、最初は、ARまたは非AR状態が確認された成人患者の血液サンプルに限られた。これら17の小児および成人遺伝子から性能の改良された遺伝子サブセットを同定するために、まず、2か所のセンター(UCSFおよびピッツバーグ)から採取されたkSAS qPCRデータを再適用した。あり得る全ての17遺伝子の組合せ(1モデル当たり3〜17遺伝子)に関してこれらのセンターからの総合分類率を合わせると、90%の割合(88%感度、94%特異度)で性能を発揮する12の異なる遺伝子の組合せをそれぞれ含む13のモデルセットが得られた表2。
複数のモデルアプローチが各遺伝子セットに対して異なるスコアを与えたことから、各患者の単一の遺伝子モデルを偏らせない信頼スコアを提供するこれらのモデルの組み合わせた能力を評価した。この統合ARリスク分析は各患者についてスコア(−13〜13)を生成し、ARのリスクを示す(13=高リスク、−13=極めて低リスク)。「高リスクのAR」の患者のうち、91%(34名中31)が正確にARと分類され、「極めて低リスクのAR」の患者については、92%(38名中35)が正確に非ARと分類された。残りの患者(n=15)は不確定リスクを有すると予測された(図10A)。
経験的に予測される相互作用に関して評価した場合、過半数の遺伝子は共通の分子経路、特に、アポトーシスの調節、免疫表現型および細胞表面により直接的または間接的に互いに関連付けられた(図15a〜15c)。小児ARに関して末梢バイオマーカーとして従前に評価された、大部分が単球系譜の末梢血細胞で発現されることが知られている10遺伝子に加え、さらなる末梢7AR遺伝子のうち6遺伝子はまた、末梢循環中の活性化単球(RXRA、RARA、CEACAM4)、内皮細胞(EPOR、SLC25A37)およびT細胞(GZMK)によっても発現された。17のうち11の遺伝子は細胞死、および細胞生存ネットワークに共通の役割を果たしていた(フィッシャーの正確確率検定、p<0.05;IPA;図15c)。
共通拒絶モジュールは、腎臓、肺、心臓、および肝臓移植患者由来の236の独立した生検サンプルからの全ゲノム発現データを分析することにより同定した。各データセットはgcRMA正規化を行った(Irizarray, E. et al. Nucleic Acids Res. 2003, 31, e15参照)。移植データベースを、サイズ効果を組み合わせる、また、≦20%のFDRで102の遺伝子(表3に列挙)を同定するp値を組み合わせるメタ分析法により分析した。異なる臓器の反復組合せが得られる、一度に一臓器を抜き取る反復をそれぞれメタ分析により分析したところ、全ての臓器で過剰発現される、BASP1、CD6、CD7、CXCL10、CXCL9、INPP5D、ISG20、LCK、NKG7、PSMB9、RUNX3、およびTAP1を含んでなる12遺伝子が明らかになった(図16)。
このスクリプトは、1以上の遺伝子モデルが与えられた場合に、2つの参照のうち1つと比較してサンプルタイプを同定するためにLineageProfilerアルゴリズム(相関に基づく分類法)を反復する。主関数はrunLineageProfilerである。
1)3列(ID、生物学的群1、群2)およびヘッダー行(生物学的群の名称)を含むタブ区切り参照発現ファイルをインポートする。
2)遺伝子ID(列1)、サンプル名(行1)および正規化発現値(例えばΔCT値)を含むタブ区切り発現ファイルをインポートする。
3)(任意選択−既存モデルのインポート)カンマ区切りの分析用遺伝子モデルを含むタブ区切りファイルをインポートする。
4)(任意選択−新たなモデルの発見)供給されたモデルサイズ変数(例えば−−s 7)に対して遺伝子モデルのあり得る全ての組合せを同定する。
5)供給されたまたは同定された遺伝子モデルを反復して、新規なまたは既知のサンプルタイプに関して予測を得る。
6)全ての分析モデルに関する予測結果をフォルダSampleClassificationにエクスポートする。
7)(任意選択)サイズ−−sのあり得る全てのモデル組合せに関する上位20スコアおよびモデルを印刷する。
[1] 腎臓同種移植を受けた個人(被験体)において(AR)の診断に使用するため、非ARの診断に使用するため、またはARを発症するリスクの診断に使用するための方法であって、
a)前記個人からの生体サンプルにおいてCEACAM4、ならびにCFLAR、DUSP1、IFNGR1、ITGAX、MAPK9、NAMPT、NKTR、PSEN1、RNF130、RYBP、EPOR、GZMK、RARA、RHEB、RXRA、およびSLC25A37から選択される6〜16の間の他の遺伝子のレベルを測定して遺伝子発現結果を得ること;ならびに
b)各遺伝子に対するARサンプル由来の単一の参照発現ベクターと各遺伝子に対する非ARサンプル由来の単一の参照発現ベクターとを含んでなる参照標準を使用し、診断のために前記遺伝子発現結果が前記参照標準と比較されることを含んでなる、方法。
[2] 前記個人が23歳以上の成人である、実施形態1に記載の方法。
[3] 前記個人が小児または23歳未満の若年成人である、実施形態1に記載の方法。
[4] 6〜16の間の他の遺伝子がCFLAR、DUSP1、IFNGR1、ITGAX、MAPK9、NAMPT、NKTR、PSEN1、RNF130、RYBP、EPOR、GZMK、RARA、RHEB、RXRA、およびSLC25A37を含んでなる、実施形態1〜3のいずれかに記載の方法。
[5] 前記測定工程が前記サンプルの遺伝子発現結果をマイクロアレイチップでアッセイすることまたは前記サンプルの遺伝子発現結果をqPCRを用いてアッセイすることを含んでなる、実施形態1〜4のいずれかに記載の方法。
[6] 前記測定工程が前記サンプルの遺伝子発現結果をビーズでアッセイすることを含んでなる、実施形態1〜5のいずれかに記載の方法。
[7] 前記測定工程が前記サンプルの遺伝子発現結果をナノ粒子でアッセイすることを含んでなる、実施形態1〜6のいずれかに記載の方法。
[8] 前記生体サンプルが血液サンプルである、実施形態1〜7のいずれかに記載の方法。
[9] 前記血液サンプルが末梢血白血球または末梢血単核サンプルである、実施形態8に記載の方法。
[10] 前記血液サンプルが全血である、実施形態8に記載の方法。
[11] 前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が、70%を超える感度でのARの予測を含んでなる、実施形態1〜10のいずれかに記載の方法。
[12] 前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が、70%を超える特異度でのARの予測を含んでなる、実施形態1〜11のいずれかに記載の方法。
[13] 前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が、70%を超える陽性的中率(ppv)でのARの予測を含んでなる、実施形態1〜12のいずれかに記載の方法。
[14] 前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が、70%を超える陰性的中率(npv)でのARの予測を含んでなる、実施形態1〜13のいずれかに記載の方法。
[15] 腎臓移植の急性拒絶(AR)の処置のための個人の同定において使用する方法であって、
a)前記個人からの生体サンプルにおいてCEACAM4、ならびにCFLAR、DUSP1、IFNGR1、ITGAX、MAPK9、NAMPT、NKTR、PSEN1、RNF130、RYBP、EPOR、GZMK、RARA、RHEB、RXRA、およびSLC25A37から選択される6〜16の間の他の遺伝子のレベルを測定して遺伝子発現結果を得ること;および
b)各遺伝子に対するARサンプル由来の単一の参照発現ベクターと各遺伝子に対する非ARサンプル由来の単一の参照発現ベクターとを含んでなる参照標準を使用し、同定のために前記遺伝子発現結果が前記参照標準と比較されることを含んでなる、方法。
[16] 前記個人が23歳以上の成人である、実施形態15に記載の方法。
[17] 前記個人が小児または23歳未満の若年成人である、実施形態15に記載の方法。
[18] 6〜16の間の他の遺伝子がCFLAR、DUSP1、IFNGR1、ITGAX、MAPK9、NAMPT、NKTR、PSEN1、RNF130、RYBP、EPOR、GZMK、RARA、RHEB、RXRA、およびSLC25A37を含んでなる、実施形態15〜17のいずれかに記載の方法。
[19] 前記測定工程が前記サンプルの遺伝子発現結果をマイクロアレイチップでアッセイすることまたは前記サンプルの遺伝子発現結果をqPCRを用いてアッセイすることを含んでなる、実施形態15〜18のいずれかに記載の方法。
[20] 前記測定工程が前記サンプルの遺伝子発現結果をビーズでアッセイすることを含んでなる、実施形態15〜19のいずれかに記載の方法。
[21] 前記測定工程が前記サンプルの遺伝子発現結果をナノ粒子でアッセイすることを含んでなる、実施形態15〜20のいずれかに記載の方法。
[22] 前記生体サンプルが血液サンプルである、実施形態15〜21のいずれかに記載の方法。
[23] 前記血液サンプルが末梢血白血球または末梢血単核細胞である、実施形態22に記載の方法。
[24] 前記血液サンプルが全血である、実施形態22に記載の方法。
[25] 前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が、70%を超える感度でのARの予測を含んでなる、実施形態15〜24のいずれかに記載の方法。
[26] 前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が、70%を超える特異度でのARの予測を含んでなる、実施形態15〜25のいずれかに記載の方法。
[27] 前記比較工程が、70%を超える陽性的中率(ppv)でのARの予測を含んでなる、実施形態15〜26のいずれかに記載の方法。
[28] 前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が、70%を超える陰性的中率(npv)でのARの予測を含んでなる、実施形態15〜27のいずれかに記載の方法。
[29] 腎臓同種移植を受けた個人において急性拒絶(AR)の診断に使用するためのシステムであって、
a)前記個人由来の生体サンプルにおいてCEACAM4、ならびにCF CFLAR、DUSP1、IFNGR1、ITGAX、MAPK9、NAMPT、NKTR、PSEN1、RNF130、RYBP、EPOR、GZMK、RARA、RHEB、RXRA、およびSLC25A37から選択される6〜16の他の遺伝子のレベルを測定して遺伝子発現結果を得るための遺伝子発現評価素子;ならびに
b)診断のために前記遺伝子発現結果と前記参照標準を比較するための、単一の腎臓移植センターにおける各遺伝子に対するARサンプル由来の単一の参照発現ベクターと、単一の腎臓移植センターにおける各遺伝子に対する非ARサンプル由来の単一の参照発現ベクターとを含んでなる参照標準素子と
を含んでなる、システム。
[30] 前記遺伝子発現評価素子がマイクロアレイチップまたはqPCR装置を含んでなる、実施形態29に記載のシステム。
[31] 前記遺伝子発現評価素子がビーズを含んでなる、実施形態30に記載のシステム。
[32] 前記遺伝子発現評価素子がナノ粒子を含んでなる、実施形態29〜31のいずれかに記載のシステム。
[33] 前記参照標準素子がコンピューター生成される、実施形態29〜32のいずれかに記載のシステム。
[34] 前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較がコンピューターまたは個人により行われる、実施形態29〜33のいずれかに記載のシステム。
[35] 前記個人が23歳以上の成人である、実施形態29〜34のいずれかに記載のシステム。
[36] 前記個人が小児または23歳未満の若年成人である、実施形態29〜34のいずれかに記載のシステム。
[37] 6〜16の他の遺伝子がCFLAR、DUSP1、IFNGR1、ITGAX、MAPK9、NAMPT、NKTR、PSEN1、RNF130、RYBP、EPOR、GZMK、RARA、RHEB、RXRA、およびSLC25A37を含んでなる実施形態29〜36のいずれかに記載のシステム。
[38] 前記生体サンプルが血液サンプルである、実施形態29〜37のいずれかに記載のシステム。
[39] 前記血液サンプルが末梢血白血球または末梢血単核細胞である、実施形態38に記載のシステム。
[40] 前記血液サンプルが全血である、実施形態38に記載のシステム。
[41] 前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が70%を超える感度でARを予測する、実施形態29〜40のいずれかに記載のシステム。
[42] 前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が70%を超える特異度でARを予測する、実施形態29〜41のいずれかに記載のシステム。
[43] 前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が70%を超える陽性的中率(ppv)でARを予測する、実施形態29〜42のいずれかに記載のシステム。
[44] 前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が70%を超える陰性的中率(npv)でARを予測する、実施形態29〜43のいずれかに記載のシステム。
[45] 腎臓同種移植を受けた個人において急性拒絶(AR)の診断に使用するためのキットであって、
a)前記個人由来の生体サンプルにおいてCEACAM4、ならびにCFLAR、DUSP1、IFNGR1、ITGAX、MAPK9、NAMPT、NKTR、PSEN1、RNF130、RYBP、EPOR、GZMK、RARA、RHEB、RXTA、およびSLC25A37から選択される6〜16の他の遺伝子のレベルを評価して遺伝子発現結果を得るための遺伝子発現評価素子;
b)単一の腎臓移植センターにおける各遺伝子に対するARサンプル由来の単一の参照発現ベクターと、単一の腎臓移植センターにおける各遺伝子に対する非ARサンプル由来の単一の参照発現ベクターとを含んでなる参照標準素子;および
c)前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較を含んでなるARを診断するための説明書一式
を含んでなる、キット。
[46] 前記個人が23歳以上の成人である、実施形態45に記載のキット。
[47] 前記個人が23歳未満の小児または若年成人である、実施形態45に記載のキット。
[48] 6〜16の他の遺伝子がCFLAR、DUSP1、IFNGR1、ITGAX、MAPK9、NAMPT、NKTR、PSEN1、RNF130、RYBP、EPOR、GZMK、RARA、RHEB、RXRA、およびSLC25A37を含んでなる、実施形態45〜47のいずれかに記載のキット。
[49] 前記遺伝子発現評価素子がマイクロアレイチップで前記サンプルの遺伝子発現結果をアッセイすることを含んでなる、実施形態45〜48のいずれかに記載のキット。
[50] 前記遺伝子発現評価素子がビーズで前記サンプルの遺伝子発現結果をアッセイすることを含んでなる、実施形態45〜49のいずれかに記載のキット。
[51] 前記遺伝子発現評価素子がナノ粒子で前記サンプルの遺伝子発現結果をアッセイすることを含んでなる、実施形態45〜50のいずれかに記載のキット。
[52] 前記生体サンプルが血液サンプルである、実施形態45〜50のいずれかに記載にキット。
[53] 前記血液サンプルが末梢血白血球または末梢血単核細胞である、実施形態52に記載のキット。
[54] 前記血液サンプルが全血である、実施形態52に記載のキット。
[55] 前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が70%を超える感度でARを予測する、実施形態45〜54のいずれかに記載のキット。
[56] 前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が70%を超える特異度でARを予測する、実施形態45〜55のいずれかに記載のキット。
[57] 前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が70%を超える陽性的中率(ppv)でARを予測する、実施形態45〜56のいずれかに記載のキット。
[58] 前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が70%を超える陰性的中率(npv)でARを予測する、実施形態45〜57のいずれかに記載のキット。
[59] 前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較がコンピューターまたは個人により行われる、実施形態45〜58のいずれかに記載のキット。
[60] 腎臓同種移植を受けた個人由来の生体サンプルにおいてCEACAM4、ならびにC CFLAR、DUSP1、IFNGR1、ITGAX、MAPK9、NAMPT、NKTR、PSEN1、RNF130、RYBP、EPOR、GZMK、RARA、RHEB、RXRA、およびSLC25A37から選択される6〜16の他の遺伝子のレベルを測定することにより得られる遺伝子発現結果と比較するための参照標準を含んでなり、単一の腎臓移植センターにおける各遺伝子に対するARサンプル由来の単一の参照発現ベクターと、単一の腎臓移植センターにおける各遺伝子に対する非ARサンプル由来の単一の参照発現ベクターとを含んでなり、前記遺伝子発現と前記参照標準の比較が、前記個人において急性拒絶(AR)の診断に使用するため、非ARの診断に使用するため、またはARを発症するリスクの診断に使用するためのものである、製品。
[61] 前記個人が23歳以上の成人である、実施形態60に記載の製品。
[62] 前記個人が小児または23歳未満の若年成人である、実施形態60に記載の製品。
[63] 6〜16の他の遺伝子がCFLAR、DUSP1、IFNGR1、ITGAX、MAPK9、NAMPT、NKTR、PSEN1、RNF130、RYBP、EPOR、GZMK、RARA、RHEB、RXRA、およびSLC25A37を含んでなる、実施形態60〜62のいずれかに記載の製品。
[64] CEACAM4および6〜16の他の遺伝子のレベルを測定することが、前記サンプルの遺伝子発現結果をマイクロアレイチップでアッセイすること、または前記サンプルの遺伝子発現結果をqPCRを用いてアッセイすることを含んでなる、実施形態60〜63のいずれかに記載の製品。
[65] CEACAM4および6〜16の他の遺伝子のレベルを測定することが、前記サンプルの遺伝子発現結果をビーズでアッセイすることを含んでなる、実施形態60〜64のいずれかに記載の製品。
[66] CEACAM4および6〜16の他の遺伝子のレベルを測定することが、前記サンプルの遺伝子発現結果をナノ粒子でアッセイすることを含んでなる、実施形態60〜65のいずれかに記載の製品。
[67] 前記生体サンプルが血液サンプルである、実施形態60〜66のいずれかに記載の製品。
[68] 前記血液サンプルが末梢血白血球または末梢血単核細胞である、実施形態67に記載の製品。
[69] 前記血液サンプルが全血である、実施形態67に記載の製品。
[70] 前記遺伝子発現と前記参照標準の比較が、70%を超える感度でのARの予測を含んでなる、実施形態60〜69のいずれかに記載の製品。
[71] 前記遺伝子発現と前記参照標準の比較が、70%を超える特異度でのARの予測を含んでなる、実施形態60〜70のいずれかに記載の製品。
[72] 前記遺伝子発現と前記参照標準の比較が、70%を超える陽性的中率(ppv)でのARの予測を含んでなる、実施形態60〜71のいずれかに記載の製品。
[73] 前記遺伝子発現と前記参照標準の比較が、70%を超える陰性的中率(npv)でのARの予測を含んでなる、実施形態60〜72のいずれかに記載の製品。
[74] 腎臓移植患者のための処置の方法であって、
a)前記個人からの生体サンプルにおいてCEACAM4、ならびにCFLAR、DUSP1、IFNGR1、ITGAX、MAPK9、NAMPT、NKTR、PSEN1、RNF130、RYBP、EPOR、GZMK、RARA、RHEB、RXRA、およびSLC25A37から選択される6〜16の間の他の遺伝子のレベルを測定して遺伝子発現結果を得ること;
b)各遺伝子に対するARサンプル由来の単一の参照発現ベクターと各遺伝子に対する非ARサンプル由来の単一の参照発現ベクターとを含んでなる参照標準を使用し、前記遺伝子発現結果が前記参照標準と比較され、それにより、被験者を腎臓移植のARを有するまたは腎臓移植のARを有なさいとして同定すること;
c)腎臓移植のARを有する被験者では治療上有効な量の1種類以上の治療薬の投与を増やし、腎臓移植のARを有さない被験者では治療上有効な量の1種類以上の治療薬の投与を維持し、または腎臓移植のARを有さない被験者では治療上有効な量の1種類以上の治療薬の投与を減らすことを含んでなる試験を指示することを含んでなる、方法。
[75] 前記個人が23歳以上の成人である、実施形態74に記載の方法。
[76] 前記個人が小児または23歳未満の若年成人である、実施形態74に記載の方法。
[77] 6〜16の他の遺伝子がCFLAR、DUSP1、IFNGR1、ITGAX、MAPK9、NAMPT、NKTR、PSEN1、RNF130、RYBP、EPOR、GZMK、RARA、RHEB、RXRA、およびSLC25A37を含んでなる、実施形態74〜76のいずれかに記載の方法。
[78] 前記測定工程が前記サンプルの遺伝子発現結果をマイクロアレイチップでアッセイすること、または前記サンプルの遺伝子発現結果をqPCRを用いてアッセイすることを含んでなる、実施形態74〜77のいずれかに記載の方法。
[79] 前記測定工程が前記サンプルの遺伝子発現結果をビーズでアッセイすることを含んでなる、実施形態74〜78のいずれかに記載の方法。
[80] 前記測定工程が前記サンプルの遺伝子発現結果をナノ粒子でアッセイすることを含んでなる、実施形態74〜79のいずれかに記載の方法。
[81] 前記生体サンプルが血液サンプルである、実施形態74〜80のいずれかに記載の方法。
[82] 前記血液サンプルが末梢血白血球または末梢血単核細胞である、実施形態81に記載の方法。
[83] 前記血液サンプルが全血である、実施形態81に記載の方法。
[84] 前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が、70%を超える感度でのARの予測を含んでなる、実施形態74〜83のいずれかに記載の方法。
[85] 前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が、70%を超える特異度でのARの予測を含んでなる、実施形態74〜84のいずれかに記載の方法。
[86] 前記比較工程が70%を超える陽性的中率(ppv)でのARの予測を含んでなる、実施形態74〜85のいずれかに記載の方法。
[87] 前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が、70%を超える陰性的中率(npv)でのARの予測を含んでなる、実施形態74〜86のいずれかに記載の方法。
Claims (87)
- 腎臓同種移植を受けた個人において(AR)の診断に使用するため、非ARの診断に使用するため、またはARを発症するリスクの診断に使用するための方法であって、
a)前記個人からの生体サンプルにおいてCEACAM4、ならびにCFLAR、DUSP1、IFNGR1、ITGAX、MAPK9、NAMPT、NKTR、PSEN1、RNF130、RYBP、EPOR、GZMK、RARA、RHEB、RXRA、およびSLC25A37から選択される6〜16の間の他の遺伝子のレベルを測定して遺伝子発現結果を得ること;ならびに
b)各遺伝子に対するARサンプル由来の単一の参照発現ベクターと各遺伝子に対する非ARサンプル由来の単一の参照発現ベクターとを含んでなる参照標準を使用し、診断のために前記遺伝子発現結果が前記参照標準と比較されることを含んでなる、方法。 - 前記個人が23歳以上の成人である、請求項1に記載の方法。
- 前記個人が小児または23歳未満の若年成人である、請求項1に記載の方法。
- 6〜16の間の他の遺伝子がCFLAR、DUSP1、IFNGR1、ITGAX、MAPK9、NAMPT、NKTR、PSEN1、RNF130、RYBP、EPOR、GZMK、RARA、RHEB、RXRA、およびSLC25A37を含んでなる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記測定工程が前記サンプルの遺伝子発現結果をマイクロアレイチップでアッセイすることまたは前記サンプルの遺伝子発現結果をqPCRを用いてアッセイすることを含んでなる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記測定工程が前記サンプルの遺伝子発現結果をビーズでアッセイすることを含んでなる、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記測定工程が前記サンプルの遺伝子発現結果をナノ粒子でアッセイすることを含んでなる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生体サンプルが血液サンプルである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記血液サンプルが末梢血白血球または末梢血単核サンプルである、請求項8に記載の方法。
- 前記血液サンプルが全血である、請求項8に記載の方法。
- 前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が、70%を超える感度でのARの予測を含んでなる、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が、70%を超える特異度でのARの予測を含んでなる、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が、70%を超える陽性的中率(ppv)でのARの予測を含んでなる、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が、70%を超える陰性的中率(npv)でのARの予測を含んでなる、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 腎臓移植の急性拒絶(AR)の処置のための個人の同定において使用する方法であって、
a)前記個人からの生体サンプルにおいてCEACAM4、ならびにCFLAR、DUSP1、IFNGR1、ITGAX、MAPK9、NAMPT、NKTR、PSEN1、RNF130、RYBP、EPOR、GZMK、RARA、RHEB、RXRA、およびSLC25A37から選択される6〜16の間の他の遺伝子のレベルを測定して遺伝子発現結果を得ること;および
b)各遺伝子に対するARサンプル由来の単一の参照発現ベクターと各遺伝子に対する非ARサンプル由来の単一の参照発現ベクターとを含んでなる参照標準を使用し、同定のために前記遺伝子発現結果が前記参照標準と比較されることを含んでなる、方法。 - 前記個人が23歳以上の成人である、請求項15に記載の方法。
- 前記個人が小児または23歳未満の若年成人である、請求項15に記載の方法。
- 6〜16の間の他の遺伝子がCFLAR、DUSP1、IFNGR1、ITGAX、MAPK9、NAMPT、NKTR、PSEN1、RNF130、RYBP、EPOR、GZMK、RARA、RHEB、RXRA、およびSLC25A37を含んでなる、請求項15〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記測定工程が前記サンプルの遺伝子発現結果をマイクロアレイチップでアッセイすることまたは前記サンプルの遺伝子発現結果をqPCRを用いてアッセイすることを含んでなる、請求項15〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記測定工程が前記サンプルの遺伝子発現結果をビーズでアッセイすることを含んでなる、請求項15〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記測定工程が前記サンプルの遺伝子発現結果をナノ粒子でアッセイすることを含んでなる、請求項15〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生体サンプルが血液サンプルである、請求項15〜21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記血液サンプルが末梢血白血球または末梢血単核細胞である、請求項22に記載の方法。
- 前記血液サンプルが全血である、請求項22に記載の方法。
- 前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が、70%を超える感度でのARの予測を含んでなる、請求項15〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が、70%を超える特異度でのARの予測を含んでなる、請求項15〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記比較工程が、70%を超える陽性的中率(ppv)でのARの予測を含んでなる、請求項15〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が、70%を超える陰性的中率(npv)でのARの予測を含んでなる、請求項15〜27のいずれか一項に記載の方法。
- 腎臓同種移植を受けた個人において急性拒絶(AR)の診断に使用するためのシステムであって、
a)前記個人由来の生体サンプルにおいてCEACAM4、ならびにCF CFLAR、DUSP1、IFNGR1、ITGAX、MAPK9、NAMPT、NKTR、PSEN1、RNF130、RYBP、EPOR、GZMK、RARA、RHEB、RXRA、およびSLC25A37から選択される6〜16の他の遺伝子のレベルを測定して遺伝子発現結果を得るための遺伝子発現評価素子;ならびに
b)診断のために前記遺伝子発現結果と前記参照標準を比較するための、単一の腎臓移植センターにおける各遺伝子に対するARサンプル由来の単一の参照発現ベクターと、単一の腎臓移植センターにおける各遺伝子に対する非ARサンプル由来の単一の参照発現ベクターとを含んでなる参照標準素子と
を含んでなる、システム。 - 前記遺伝子発現評価素子がマイクロアレイチップまたはqPCR装置を含んでなる、請求項29に記載のシステム。
- 前記遺伝子発現評価素子がビーズを含んでなる、請求項30に記載のシステム。
- 前記遺伝子発現評価素子がナノ粒子を含んでなる、請求項29〜31のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記参照標準素子がコンピューター生成される、請求項29〜32のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較がコンピューターまたは個人により行われる、請求項29〜33のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記個人が23歳以上の成人である、請求項29〜34のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記個人が小児または23歳未満の若年成人である、請求項29〜34のいずれか一項に記載のシステム。
- 6〜16の他の遺伝子がCFLAR、DUSP1、IFNGR1、ITGAX、MAPK9、NAMPT、NKTR、PSEN1、RNF130、RYBP、EPOR、GZMK、RARA、RHEB、RXRA、およびSLC25A37を含んでなる請求項29〜36のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記生体サンプルが血液サンプルである、請求項29〜37のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記血液サンプルが末梢血白血球または末梢血単核細胞である、請求項38に記載のシステム。
- 前記血液サンプルが全血である、請求項38に記載のシステム。
- 前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が70%を超える感度でARを予測する、請求項29〜40のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が70%を超える特異度でARを予測する、請求項29〜41のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が70%を超える陽性的中率(ppv)でARを予測する、請求項29〜42のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が70%を超える陰性的中率(npv)でARを予測する、請求項29〜43のいずれか一項に記載のシステム。
- 腎臓同種移植を受けた個人において急性拒絶(AR)の診断に使用するためのキットであって、
a)前記個人由来の生体サンプルにおいてCEACAM4、ならびにCFLAR、DUSP1、IFNGR1、ITGAX、MAPK9、NAMPT、NKTR、PSEN1、RNF130、RYBP、EPOR、GZMK、RARA、RHEB、RXTA、およびSLC25A37から選択される6〜16の他の遺伝子のレベルを評価して遺伝子発現結果を得るための遺伝子発現評価素子;
b)単一の腎臓移植センターにおける各遺伝子に対するARサンプル由来の単一の参照発現ベクターと、単一の腎臓移植センターにおける各遺伝子に対する非ARサンプル由来の単一の参照発現ベクターとを含んでなる参照標準素子;および
c)前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較を含んでなるARを診断するための説明書一式
を含んでなる、キット。 - 前記個人が23歳以上の成人である、請求項45に記載のキット。
- 前記個人が23歳未満の小児または若年成人である、請求項45に記載のキット。
- 6〜16の他の遺伝子がCFLAR、DUSP1、IFNGR1、ITGAX、MAPK9、NAMPT、NKTR、PSEN1、RNF130、RYBP、EPOR、GZMK、RARA、RHEB、RXRA、およびSLC25A37を含んでなる、請求項45〜47のいずれか一項に記載のキット。
- 前記遺伝子発現評価素子がマイクロアレイチップで前記サンプルの遺伝子発現結果をアッセイすることを含んでなる、請求項45〜48のいずれか一項に記載のキット。
- 前記遺伝子発現評価素子がビーズで前記サンプルの遺伝子発現結果をアッセイすることを含んでなる、請求項45〜49のいずれか一項に記載のキット。
- 前記遺伝子発現評価素子がナノ粒子で前記サンプルの遺伝子発現結果をアッセイすることを含んでなる、請求項45〜50のいずれか一項に記載のキット。
- 前記生体サンプルが血液サンプルである、請求項45〜50のいずれか一項に記載にキット。
- 前記血液サンプルが末梢血白血球または末梢血単核細胞である、請求項52に記載のキット。
- 前記血液サンプルが全血である、請求項52に記載のキット。
- 前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が70%を超える感度でARを予測する、請求項45〜54のいずれか一項に記載のキット。
- 前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が70%を超える特異度でARを予測する、請求項45〜55のいずれか一項に記載のキット。
- 前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が70%を超える陽性的中率(ppv)でARを予測する、請求項45〜56のいずれか一項に記載のキット。
- 前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が70%を超える陰性的中率(npv)でARを予測する、請求項45〜57のいずれか一項に記載のキット。
- 前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較がコンピューターまたは個人により行われる、請求項45〜58のいずれか一項に記載のキット。
- 腎臓同種移植を受けた個人由来の生体サンプルにおいてCEACAM4、ならびにC CFLAR、DUSP1、IFNGR1、ITGAX、MAPK9、NAMPT、NKTR、PSEN1、RNF130、RYBP、EPOR、GZMK、RARA、RHEB、RXRA、およびSLC25A37から選択される6〜16の他の遺伝子のレベルを測定することにより得られる遺伝子発現結果と比較するための参照標準を含んでなり、単一の腎臓移植センターにおける各遺伝子に対するARサンプル由来の単一の参照発現ベクターと、単一の腎臓移植センターにおける各遺伝子に対する非ARサンプル由来の単一の参照発現ベクターとを含んでなり、前記遺伝子発現と前記参照標準の比較が、前記個人において急性拒絶(AR)の診断に使用するため、非ARの診断に使用するため、またはARを発症するリスクの診断に使用するためのものである、製品。
- 前記個人が23歳以上の成人である、請求項60に記載の製品。
- 前記個人が小児または23歳未満の若年成人である、請求項60に記載の製品。
- 6〜16の他の遺伝子がCFLAR、DUSP1、IFNGR1、ITGAX、MAPK9、NAMPT、NKTR、PSEN1、RNF130、RYBP、EPOR、GZMK、RARA、RHEB、RXRA、およびSLC25A37を含んでなる、請求項60〜62のいずれか一項に記載の製品。
- CEACAM4および6〜16の他の遺伝子のレベルを測定することが、前記サンプルの遺伝子発現結果をマイクロアレイチップでアッセイすること、または前記サンプルの遺伝子発現結果をqPCRを用いてアッセイすることを含んでなる、請求項60〜63のいずれか一項に記載の製品。
- CEACAM4および6〜16の他の遺伝子のレベルを測定することが、前記サンプルの遺伝子発現結果をビーズでアッセイすることを含んでなる、請求項60〜64のいずれか一項に記載の製品。
- CEACAM4および6〜16の他の遺伝子のレベルを測定することが、前記サンプルの遺伝子発現結果をナノ粒子でアッセイすることを含んでなる、請求項60〜65のいずれか一項に記載の製品。
- 前記生体サンプルが血液サンプルである、請求項60〜66のいずれか一項に記載の製品。
- 前記血液サンプルが末梢血白血球または末梢血単核細胞である、請求項67に記載の製品。
- 前記血液サンプルが全血である、請求項67に記載の製品。
- 前記遺伝子発現と前記参照標準の比較が、70%を超える感度でのARの予測を含んでなる、請求項60〜69のいずれか一項に記載の製品。
- 前記遺伝子発現と前記参照標準の比較が、70%を超える特異度でのARの予測を含んでなる、請求項60〜70のいずれか一項に記載の製品。
- 前記遺伝子発現と前記参照標準の比較が、70%を超える陽性的中率(ppv)でのARの予測を含んでなる、請求項60〜71のいずれか一項に記載の製品。
- 前記遺伝子発現と前記参照標準の比較が、70%を超える陰性的中率(npv)でのARの予測を含んでなる、請求項60〜72のいずれか一項に記載の製品。
- 腎臓移植患者のための処置の方法であって、
a)前記個人からの生体サンプルにおいてCEACAM4、ならびにCFLAR、DUSP1、IFNGR1、ITGAX、MAPK9、NAMPT、NKTR、PSEN1、RNF130、RYBP、EPOR、GZMK、RARA、RHEB、RXRA、およびSLC25A37から選択される6〜16の間の他の遺伝子のレベルを測定して遺伝子発現結果を得ること;
b)各遺伝子に対するARサンプル由来の単一の参照発現ベクターと各遺伝子に対する非ARサンプル由来の単一の参照発現ベクターとを含んでなる参照標準を使用し、前記遺伝子発現結果が前記参照標準と比較され、それにより、被験者を腎臓移植のARを有するまたは腎臓移植のARを有なさいとして同定すること;
c)腎臓移植のARを有する被験者では治療上有効な量の1種類以上の治療薬の投与を増やし、腎臓移植のARを有さない被験者では治療上有効な量の1種類以上の治療薬の投与を維持し、または腎臓移植のARを有さない被験者では治療上有効な量の1種類以上の治療薬の投与を減らすことを含んでなる試験を指示することを含んでなる、方法。 - 前記個人が23歳以上の成人である、請求項74に記載の方法。
- 前記個人が小児または23歳未満の若年成人である、請求項74に記載の方法。
- 6〜16の他の遺伝子がCFLAR、DUSP1、IFNGR1、ITGAX、MAPK9、NAMPT、NKTR、PSEN1、RNF130、RYBP、EPOR、GZMK、RARA、RHEB、RXRA、およびSLC25A37を含んでなる、請求項74〜76のいずれか一項に記載の方法。
- 前記測定工程が前記サンプルの遺伝子発現結果をマイクロアレイチップでアッセイすること、または前記サンプルの遺伝子発現結果をqPCRを用いてアッセイすることを含んでなる、請求項74〜77のいずれか一項に記載の方法。
- 前記測定工程が前記サンプルの遺伝子発現結果をビーズでアッセイすることを含んでなる、請求項74〜78のいずれか一項に記載の方法。
- 前記測定工程が前記サンプルの遺伝子発現結果をナノ粒子でアッセイすることを含んでなる、請求項74〜79のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生体サンプルが血液サンプルである、請求項74〜80のいずれか一項に記載の方法。
- 前記血液サンプルが末梢血白血球または末梢血単核細胞である、請求項81に記載の方法。
- 前記血液サンプルが全血である、請求項81に記載の方法。
- 前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が、70%を超える感度でのARの予測を含んでなる、請求項74〜83のいずれか一項に記載の方法。
- 前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が、70%を超える特異度でのARの予測を含んでなる、請求項74〜84のいずれか一項に記載の方法。
- 前記比較工程が70%を超える陽性的中率(ppv)でのARの予測を含んでなる、請求項74〜85のいずれか一項に記載の方法。
- 前記遺伝子発現結果と前記参照標準の比較が、70%を超える陰性的中率(npv)でのARの予測を含んでなる、請求項74〜86のいずれか一項に記載の方法。
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