CN106062208A - 用于评估肾移植中急性排斥反应的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了使用分类基因集的基因表达谱来诊断肾移植急性排斥的方法、组合物和试剂盒。这样的方法和组合物不依赖于外界混淆因素例如受者年龄、移植中心、RNA来源、检测、终末期肾病的原因、共病现象、免疫抑制剂的使用，等等。

Description

用于评估肾移植中急性排斥反应的组合物和方法

对相关申请的交叉引用

本申请要求于2013年9月6日提交的美国临时申请No.61/874,970以及于2014年5月1日提交的美国临时申请No.61/987,342的优先权益，其全部内容通过引用并入本文。

发明领域

本公开涉及使用分类基因集的基因表达谱对肾移植急性排斥反应进行评估的方法、组合物和试剂盒。所述的方法和组合物不依赖于外界混淆因素例如受者年龄、移植中心、RNA来源、检测、终末期肾病的原因、共病现象、免疫抑制剂的使用，等等。

发明背景

从供者到宿主受者的器官移植是某些医疗程序和治疗方案的组成部分。移植之后，避免受者对移植物的排斥是必要的。为了维持供者器官的存活，通常会采取免疫抑制治疗。然而，实体器官移植排斥仍会发生。

器官移植排斥分为超急性、急性、边缘型急性、亚临床急性或慢性。对于大部分器官，包括肾，器官排斥仅通过对该器官进行活组织切片检查即可明确诊断。然而从实用性考虑，疑似发生急性排斥时，并不总是进行活组织切片检查。此外，活组织切片检查可能由于取样及判读而出现偏差(Furness，P.N.et al.Transplantation 2003，76，969-973；Furness，P.N.Transplantation2001，71，SS31-36)，并且它们不具有预见性。以及时的方式检测损伤对于保证同种异体移植物的健康和长期存活至关重要。

器官移植受者面临的主要临床问题之一就是缺少用来连续监控患者同种免疫阈值和急性移植物排斥风险的敏感、特异且非侵入性的检测。高度冗余的和非特异性功能标志物的增加(例如血清肌酐的增加作为指示移植物功能异常的方法)可能提示急性排斥。然而，现在已经越来越多地认识到(Lerut，E.et al.Transplantation 2007，83，1416-1422；Sigdel，T.K.et al.J.Am.Soc.Nephrol.2012，23，750-763；Moreso，F.etal.Am.J.Transplant.2006，6，747-752；Moreso，F.et al.Transplantation 2012，93，41-46；Heilman，R.L.et al.Am.J.Transplant.2010，10，563-570)，在肾移植中，不被血清肌酐的偏移所检出的损伤会一直持续(亚临床急性排斥)，直到进行监测性活组织切片检查的时候被未预料地诊断出来(Racusen，L.C.et al.Kidney International 1999，55，713-723；Solez，K.et al.Am.J.Transplant.2008，8，753-760；Naesens，M.etal.Am.J.Transplant.2012，12，2730-2743)。

能够以高度特异性(从而减少对低AR风险患者的侵入性方案活组织切片检查)以及高度敏感性(以增加对高AR风险患者的临床监控)比目前所可能的化验更早地检测急性移植排斥(AR)的一系列化验，会导致及时的临床干预从而减轻AR，并减少对于无症状和稳定患者的免疫抑制方案。许多检测可能依赖于受者年龄、共病现象、移植中心、免疫抑制剂的使用，和/或终末期肾病的原因，等等。本文所述的是通过开发不依赖于这些变量的检测而解决该问题的方法。

本文引用的所有专利、专利申请、出版物、文件和文章，其全部内容均通过引用并入本文，除非另行声明。

发明简述

本文公开的是用于将个体划分为肾移植急性排斥(AR)风险高和/或风险低或无急性排斥风险(no-AR)的组合物和方法。这些组合物和方法可以用于对儿科和成人患者的此种分类，其包含分类基因集的基因表达水平。

因此，在一方面，本发明提供用于诊断急性排斥(AR)，用于诊断no-AR，或用于诊断接受了肾移植的个体发生急性排斥(AR)风险的方法，该方法包含：a)测量来自所述个体的生物样品中的CEACAM4以及选自CFLAR，DUSP1，IFNGR1，ITGAX，MAPK9，NAMPT，NKTR，PSEN1，RNF130，RYBP，EPOR，GZMK，RARA，RHEB，RXRA，及SLC25A37中的6到16个其它基因的水平，从而得到基因表达结果；以及b)使用参考标准品，其包含针对每个基因的来自AR样品的单个参考表达载体，以及针对每个基因的来自no-AR样品的单个参考表达载体，其中所述基因表达结果将与参考标准品相关联。在本文的任一实施方案中，个体可以为23岁或年龄更大的成年人。在本文的任一实施方案中，个体可以为儿童或未满23岁的年轻人。在本文的任一实施方案中，6到16个其它基因可以包含CFLAR，DUSP1，IFNGR1，ITGAX，MAPK9，NAMPT，NKTR，PSEN1，RNF130，RYBP，EPOR，GZMK，RARA，RHEB，RXRA以及SLC25A37。在本文的任一实施方案中，检测步骤可以包括在微阵列芯片上分析所述样品的基因表达结果。在本文的任一实施方案中，检测步骤可以包括使用qPCR分析所述样品的基因表达结果。在本文的任一实施方案中，检测步骤可以包括在微球上分析所述样品的基因表达结果。在本文的任一实施方案中，检测步骤可以包括在纳米颗粒上分析所述样品的基因表达结果。在本文的任一实施方案中，检测步骤可以包括在多孔的或无孔的且可大小不一的固相表面上分析所述样品的基因表达结果。在本文的任一实施方案中，生物样品可以为全血样品。在本文的任一实施方案中，生物样品可以为血液样品。在本文的任一实施方案中，血液样品可以为外周血白细胞。在本文的任一实施方案中，血液样品可以为外周血单核细胞。在本文的任一实施方案中，所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较可以包括对AR的预测，其敏感性大于70％。在本文的任一实施方案中，所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较可以包括对AR的预测，其特异性大于70％。在本文的任一实施方案中，所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较可以包括对AR的预测，其阳性预测值(ppv)大于70％。在本文的任一实施方案中，所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较可以包括对AR的预测，其阴性预测值(npv)大于70％。

在另一方面，本发明提供用于鉴别肾移植中需要治疗急性排斥(AR)的个体的方法，该方法包含：a)测量来自所述个体的生物样品中的CEACAM4以及选自CFLAR，DUSP1，IFNGR1，ITGAX，MAPK9，NAMPT，NKTR，PSEN1，RNF130，RYBP，EPOR，GZMK，RARA，RHEB，RXRA及SLC25A37中的6到16个其它基因的水平，从而得到基因表达结果；以及b)使用参考标准品，其包含针对每个基因的来自AR样品的单个参考表达载体，以及针对每个基因的来自no-AR样品的单个参考表达载体，其中所述基因表达结果将与鉴定所用的参考标准品相关联。在本文的任一实施方案中，个体可以为23岁或年龄更大的成年人。在本文的任一实施方案中，个体可以为儿童或未满23岁的年轻人。在本文的任一实施方案中，6到16个其它基因可以包含CFLAR，DUSP1，IFNGR1，ITGAX，MAPK9，NAMPT，NKTR，PSEN1，RNF130，RYBP，EPOR，GZMK，RARA，RHEB，RXRA以及SLC25A37。在本文的任一实施方案中，检测步骤可以包括在微阵列芯片上分析所述样品的基因表达结果。在本文的任一实施方案中，检测步骤可以包括在微球上分析所述样品的基因表达结果。在本文的任一实施方案中，检测步骤可以包括在纳米颗粒上分析所述样品的基因表达结果。在本文的任一实施方案中，检测步骤可以包括在多孔的或无孔的且可大小不一的固相表面上分析所述样品的基因表达结果。在本文的任一实施方案中，生物样品可以为血液样品。在本文的任一实施方案中，血液样品可以为外周血白细胞。在本文的任一实施方案中，血液样品可以为外周血单核细胞。在本文的任一实施方案中，生物样品可以为全血样品。在本文的任一实施方案中，所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较可以包括对AR的预测，其敏感性大于70％。在本文的任一实施方案中，所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较可以包括对AR的预测，其特异性大于70％。在本文的任一实施方案中，所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较可以包括对AR的预测，其阳性预测值(ppv)大于70％。在本文的任一实施方案中，所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较可以包括对AR的预测，其阴性预测值(npv)大于70％。

在另一方面，本发明提供用于诊断接受了肾移植的个体的急性排斥(AR)的系统，该系统包含：a)基因表达评价单元，其用于测量来自所述个体的生物样品中的CEACAM4以及选自CF CFLAR，DUSP1，IFNGR1，ITGAX，MAPK9，NAMPT，NKTR，PSEN1，RNF130，RYBP，EPOR，GZMK，RARA，RHEB，RXRA及SLC25A37中的6到16个其它基因的水平，从而得到基因表达结果；以及b)参考标准品单元，其包含针对每个基因的来自AR样品的单个参考表达载体以及针对每个基因的来自no-AR样品的单个参考表达载体，用于将所述基因表达结果将与参考标准品相关联，从而进行诊断。在本文的任一实施方案中，基因表达评价单元可以包含微阵列芯片。在本文的任一实施方案中，基因表达评价单元可以包含微球。在本文的任一实施方案中，基因表达评价单元可以包含纳米颗粒。在本文的任一实施方案中，检测步骤可以包括在多孔的或无孔的且可大小不一的固相表面上分析所述样品的基因表达结果。在本文的任一实施方案中，参考标准品单元可以是计算机生成的。在本文的任一实施方案中，所述基因表达结果与所述参考标准品的比较可以由计算机或人来进行。在本文的任一实施方案中，个体可以为23岁或年龄更大的成年人。在本文的任一实施方案中，个体可以为儿童或未满23岁的年轻人。在本文的任一实施方案中，6到16个其它基因可以包含CFLAR，DUSP1，IFNGR1，ITGAX，MAPK9，NAMPT，NKTR，PSEN1，RNF130，RYBP，EPOR，GZMK，RARA，RHEB，RXRA以及SLC25A37。在本文的任一实施方案中，生物样品可以为血液样品。在本文的任一实施方案中，血液样品可以为外周血白细胞。在本文的任一实施方案中，血液样品可以为外周血单核细胞。在本文的任一实施方案中，生物样品可以为全血样品。在本文的任一实施方案中，所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较可以预测AR，其敏感性大于70％。在本文的任一实施方案中，所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较可以预测AR，其特异性大于70％。在本文的任一实施方案中，所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较可以预测AR，其阳性预测值(ppv)大于70％。在本文的任一实施方案中，所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较可以预测AR，其阴性预测值(npv)大于70％。

在另一方面，本发明提供用于诊断接受了肾移植的个体的急性排斥(AR)的试剂盒，该试剂盒包含：a)基因表达评价单元，其用于测量来自所述个体的生物样品中的CEACAM4以及选自CFLAR，DUSP1，IFNGR1，ITGAX，MAPK9，NAMPT，NKTR，PSEN1，RNF130，RYBP，EPOR，GZMK，RARA，RHEB，RXRA及SLC25A37中的6到16个其它基因的水平，从而得到基因表达结果；b)参考标准品单元，对于单个移植中心其包含针对每个基因的来自AR样品的单个参考表达载体以及来自no-AR样品的单个参考表达载体；以及c)用于诊断AR的指令集，其包含所述基因表达结果与参考标准品的关联。在本文的任一实施方案中，个体可以为23岁或年龄更大的成年人。在本文的任一实施方案中，个体可以为儿童或未满23岁的年轻人。在本文的任一实施方案中，6到16个其它基因可以包含CFLAR，DUSP1，IFNGR1，ITGAX，MAPK9，NAMPT，NKTR，PSEN1，RNF130，RYBP，EPOR，GZMK，RARA，RHEB，RXRA以及SLC25A37。在本文的任一实施方案中，基因表达评价单元可以包含在微阵列芯片上分析所述样品的基因表达结果。在本文的任一实施方案中，基因表达评价单元可以包含在微球上分析所述样品的基因表达结果。在本文的任一实施方案中，基因表达评价单元可以包含在纳米颗粒上分析所述样品的基因表达结果。在本文的任一实施方案中，检测步骤可以包括在多孔的或无孔的且可大小不一的固相表面上分析所述样品的基因表达结果。在本文的任一实施方案中，生物样品可以为血液样品。在本文的任一实施方案中，生物样品可以为全血样品。在本文的任一实施方案中，血液样品可以为外周血白细胞。在本文的任一实施方案中，血液样品可以为外周血单核细胞。在本文的任一实施方案中，所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较可以预测AR，其敏感性大于70％。在本文的任一实施方案中，所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较可以预测AR，其特异性大于70％。在本文的任一实施方案中，所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较可以预测AR，其阳性预测值(ppv)大于70％。在本文的任一实施方案中，所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较可以预测AR，其阴性预测值(npv)大于70％。在本文的任一实施方案中，所述基因表达结果与所述参考标准品的比较可以由计算机或人来进行。

在另一方面，本发明提供包含参考标准品的制品，其用于与通过测量来自接受肾移植个体的生物样品中的CEACAM4以及选自CFLAR，DUSP1，IFNGR1，ITGAX，MAPK9，NAMPT，NKTR，PSEN1，RNF130，RYBP，EPOR，GZMK，RARA，RHEB，RXRA及SLC25A37中的6到16个其它基因的水平所得到的基因表达结果进行比较，其包含在单个肾移植中心针对每个基因的来自AR样品的单个参考表达载体以及在单个肾移植中心针对每个基因的来自no-AR样品的单个参考表达载体，其中所述基因表达与参考标准品的相关性将用于诊断急性排斥(AR)，诊断no-AR，或诊断在所述个体中发生AR的风险。在本文的任一实施方案中，个体可以为23岁或年龄更大的成年人。在本文的任一实施方案中，个体可以为儿童或未满23岁的年轻人。在本文的任一实施方案中，6到16个其它基因可以包含CFLAR，DUSP1，IFNGR1，ITGAX，MAPK9，NAMPT，NKTR，PSEN1，RNF130，RYBP，EPOR，GZMK，RARA，RHEB，RXRA以及SLC25A37。在本文的任一实施方案中，检测CEACAM4和6到16个其它基因的水平可以包含在微阵列芯片上分析所述样品的基因表达结果。在本文的任一实施方案中，检测CEACAM4和6到16个其它基因的水平可以包含在微球上分析所述样品的基因表达结果。在本文的任一实施方案中，检测CEACAM4和6到16个其它基因的水平可以包含在纳米颗粒上分析所述样品的基因表达结果。在本文的任一实施方案中，检测步骤可以包括在多孔的或无孔的且可大小不一的固相表面上分析所述样品的基因表达结果。在本文的任一实施方案中，生物样品可以为血液样品。在本文的任一实施方案中，生物样品可以为全血样品。在本文的任一实施方案中，血液样品可以为外周血白细胞。在本文的任一实施方案中，血液样品可以为外周血单核细胞。在本文的任一实施方案中，所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较可以包括对AR的预测，其敏感性大于70％。在本文的任一实施方案中，所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较可以包括对AR的预测，其特异性大于70％。在本文的任一实施方案中，所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较可以包括对AR的预测，其阳性预测值(ppv)大于70％。在本文的任一实施方案中，所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较可以包括对AR的预测，其阴性预测值(npv)大于70％。

在另一方面，本发明提供治疗肾移植患者的方法，其包含进行包含以下内容的检验：a)测量来自所述个体的生物样品中的CEACAM4以及选自CFLAR，DUSP1，IFNGR1，ITGAX，MAPK9，NAMPT，NKTR，PSEN1，RNF130，RYBP，EPOR，GZMK，RARA，RHEB，RXRA及SLC25A37中的6到16个其它基因的水平，从而得到基因表达结果；b)使用参考标准品，其包含针对每个基因的来自AR样品的单个参考表达载体以及针对每个基因的来自no-AR样品的单个参考表达载体，其中所述基因表达结果将与参考标准品进行比较从而鉴别受试者有肾移植AR或没有肾移植AR；以及c)对于有肾移植AR的受试者，增加施用治疗有效量的一种或多种治疗剂，对于没有肾移植AR的受试者，维持施用治疗有效量的一种或多种治疗剂，或对于没有肾移植AR的受试者，减少施用治疗有效量的一种或多种治疗剂。在本文的任一实施方案中，个体可以为23岁或年龄更大的成年人。在本文的任一实施方案中，个体可以为儿童或未满23岁的年轻人。在本文的任一实施方案中，6到16个其它基因可以包含CFLAR，DUSP1，IFNGR1，ITGAX，MAPK9，NAMPT，NKTR，PSEN1，RNF130，RYBP，EPOR，GZMK，RARA，RHEB，RXRA以及SLC25A37。在本文的任一实施方案中，检测步骤可以包括在微阵列芯片上分析所述样品的基因表达结果。在本文的任一实施方案中，检测步骤可以包括在微球上分析所述样品的基因表达结果。在本文的任一实施方案中，检测步骤可以包括在纳米颗粒上分析所述样品的基因表达结果。在本文的任一实施方案中，检测步骤可以包括在多孔的或无孔的且可大小不一的固相表面上分析所述样品的基因表达结果。在本文的任一实施方案中，生物样品可以为血液样品。在本文的任一实施方案中，血液样品可以为外周血白细胞。在本文的任一实施方案中，血液样品可以为外周血单核细胞。在本文的任一实施方案中，生物样品可以为全血样品。在本文的任一实施方案中，所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较可以包括对AR的预测，其敏感性大于70％。在本文的任一实施方案中，所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较可以包括对AR的预测，其特异性大于70％。在本文的任一实施方案中，所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较可以包括对AR的预测，其阳性预测值(ppv)大于70％。在本文的任一实施方案中，所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较可以包括对AR的预测，其阴性预测值(npv)大于70％。

在另一方面，本发明提供用于诊断接受了肾移植的个体中无急性排斥(no-AR)的方法，该方法包含：a)测量来自所述个体的生物样品中的CEACAM4以及选自CFLAR，DUSP1，IFNGR1，ITGAX，MAPK9，NAMPT，NKTR，PSEN1，RNF130，RYBP，EPOR，GZMK，RARA，RHEB，RXRA及SLC25A37中的6到16个其它基因的水平，从而得到基因表达结果；以及b)使用参考标准品，其包含针对每个基因的来自AR样品的单个参考表达载体，以及针对每个基因的来自no-AR样品的单个参考表达载体，其中所述基因表达结果将与参考标准品相关联。在本文的任一实施方案中，个体可以为23岁或年龄更大的成年人。在本文的任一实施方案中，个体可以为儿童或未满23岁的年轻人。在本文的任一实施方案中，6到16个其它基因可以包含CFLAR，DUSP1，IFNGR1，ITGAX，MAPK9，NAMPT，NKTR，PSEN1，RNF130，RYBP，EPOR，GZMK，RARA，RHEB，RXRA以及SLC25A37。在本文的任一实施方案中，检测步骤可以包括在微阵列芯片上分析所述样品的基因表达结果。在本文的任一实施方案中，检测步骤可以包括在微球上分析所述样品的基因表达结果。在本文的任一实施方案中，检测步骤可以包括在纳米颗粒上分析所述样品的基因表达结果。在本文的任一实施方案中，检测步骤可以包括在多孔的或无孔的且可大小不一的固相表面上分析所述样品的基因表达结果。在本文的任一实施方案中，生物样品可以为全血样品。在本文的任一实施方案中，生物样品可以为血液样品。在本文的任一实施方案中，血液样品可以为外周血白细胞。在本文的任一实施方案中，血液样品可以为外周血单核细胞。在本文的任一实施方案中，所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较可以包括对no-AR的预测，其敏感性大于70％。在本文的任一实施方案中，所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较可以包括对no-AR的预测，其特异性大于70％。在本文的任一实施方案中，所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较可以包括对no-AR的预测，其阳性预测值(ppv)大于70％。在本文的任一实施方案中，所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较可以包括对no-AR的预测，其阴性预测值(npv)大于70％。

在另一方面，本发明提供用于鉴别肾移植中需要治疗无急性排斥(no-AR)的个体的方法，该方法包含：a)测量来自所述个体的生物样品中的CEACAM4以及选自CFLAR，DUSP1，IFNGR1，ITGAX，MAPK9，NAMPT，NKTR，PSEN1，RNF130，RYBP，EPOR，GZMK，RARA，RHEB，RXRA及SLC25A37中的6到16个其它基因的水平，从而得到基因表达结果；以及b)使用参考标准品，在一个单独的肾移植中心其包含针对每个基因的来自AR样品的单个参考表达载体，以及针对每个基因的来自no-AR样品的单个参考表达载体，其中所述基因表达结果将与鉴定所用的参考标准品相关联。在本文的任一实施方案中，个体可以为23岁或年龄更大的成年人。在本文的任一实施方案中，个体可以为儿童或未满23岁的年轻人。在本文的任一实施方案中，6到16个其它基因可以包含CFLAR，DUSP1，ITGAX，NAMPT，NKTR，PSEN1，EPOR，GZMK，RARA，RHEB以及SLC25A37。在本文的任一实施方案中，检测步骤可以包括在微阵列芯片上分析所述样品的基因表达结果。在本文的任一实施方案中，检测步骤可以包括在微球上分析所述样品的基因表达结果。在本文的任一实施方案中，检测步骤可以包括在纳米颗粒上分析所述样品的基因表达结果。在本文的任一实施方案中，检测步骤可以包括在多孔的或无孔的且可大小不一的固相表面上分析所述样品的基因表达结果。在本文的任一实施方案中，生物样品可以为全血样品。在本文的任一实施方案中，生物样品可以为血液样品。在本文的任一实施方案中，血液样品可以为外周血白细胞。在本文的任一实施方案中，血液样品可以为外周血单核细胞。在本文的任一实施方案中，所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较可以包括对no-AR的预测，其敏感性大于70％。在本文的任一实施方案中，所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较可以包括对no-AR的预测，其特异性大于70％。在本文的任一实施方案中，所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较可以包括对no-AR的预测，其阳性预测值(ppv)大于70％。在本文的任一实施方案中，所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较可以包括对no-AR的预测，其阴性预测值(npv)大于70％。

在另一方面，本发明提供用于诊断接受了肾移植的个体中无急性排斥(no-AR)的系统，该系统包含：a)基因表达评价单元，其用于测量来自所述个体的生物样品中的CEACAM4以及选自CFLAR，DUSP1，IFNGR1，ITGAX，MAPK9，NAMPT，NKTR，PSEN1，RNF130，RYBP，EPOR，GZMK，RARA，RHEB，RXRA及SLC25A37中的6到16个其它基因的水平，从而得到基因表达结果；以及b)参考标准品单元，其包含在单个肾移植中心针对每个基因的来自AR样品的单个参考表达载体以及在单个肾移植中心针对每个基因的来自no-AR样品的单个参考表达载体，用于将所述基因表达结果将与参考标准品相关联，从而进行诊断。在本文的任一实施方案中，基因表达评价单元可以包含微阵列芯片。在本文的任一实施方案中，基因表达评价单元可以包含微球。在本文的任一实施方案中，基因表达评价单元可以包含纳米颗粒。在本文的任一实施方案中，检测步骤可以包括在多孔的或无孔的且可大小不一的固相表面上分析所述样品的基因表达结果。在本文的任一实施方案中，参考标准品单元可以是计算机生成的。在本文的任一实施方案中，所述基因表达结果与所述参考标准品的比较可以由计算机或人来进行。在本文的任一实施方案中，个体可以为23岁或年龄更大的成年人。在本文的任一实施方案中，个体可以为儿童或未满23岁的年轻人。在本文的任一实施方案中，6到16个其它基因可以包含CFLAR，DUSP1，IFNGR1，ITGAX，MAPK9，NAMPT，NKTR，PSEN1，RNF130，RYBP，EPOR，GZMK，RARA，RHEB，RXRA以及SLC25A37。在本文的任一实施方案中，生物样品可以为全血样品。在本文的任一实施方案中，生物样品可以为血液样品。在本文的任一实施方案中，血液样品可以为外周血白细胞。在本文的任一实施方案中，血液样品可以为外周血单核细胞。在本文的任一实施方案中，所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较可以预测no-AR，其敏感性大于70％。在本文的任一实施方案中，所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较可以预测no-AR，其特异性大于70％。在本文的任一实施方案中，所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较可以预测no-AR，其阳性预测值(ppv)大于70％。在本文的任一实施方案中，所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较可以预测no-AR，其阴性预测值(npv)大于70％。

在另一方面，本发明提供用于诊断接受了肾移植的个体中无急性排斥(no-AR)的试剂盒，该试剂盒包含：a)基因表达评价单元，其用于测量来自所述个体的生物样品中的CEACAM4以及选自CFLAR，DUSP1，IFNGR1，ITGAX，MAPK9，NAMPT，NKTR，PSEN1，RNF130，RYBP，EPOR，GZMK，RARA，RHEB，RXRA及SLC25A37中的6到16个其它基因的水平，从而得到基因表达结果；b)参考标准品单元，其包含在单个肾移植中心针对每个基因的来自AR样品的单个参考表达载体以及在单个肾移植中心针对每个基因的来自no-AR样品的单个参考表达载体；以及c)用于诊断AR(原文可能有误)的指令集，其包含所述基因表达结果与参考标准品的关联。在本文的任一实施方案中，个体可以为23岁或年龄更大的成年人。在本文的任一实施方案中，个体可以为儿童或未满23岁的年轻人。在本文的任一实施方案中，6到16个其它基因可以包含CFLAR，DUSP1，IFNGR1，ITGAX，MAPK9，NAMPT，NKTR，PSEN1，RNF130，RYBP，EPOR，GZMK，RARA，RHEB，RXRA以及SLC25A37。在本文的任一实施方案中，基因表达评价单元可以包含在微阵列芯片上分析所述样品的基因表达结果。在本文的任一实施方案中，基因表达评价单元可以包含在微球上分析所述样品的基因表达结果。在本文的任一实施方案中，基因表达评价单元可以包含在纳米颗粒上分析所述样品的基因表达结果。在本文的任一实施方案中，检测步骤可以包括在多孔的或无孔的且可大小不一的固相表面上分析所述样品的基因表达结果。在本文的任一实施方案中，生物样品可以为全血样品。在本文的任一实施方案中，生物样品可以为血液样品。在本文的任一实施方案中，血液样品可以为外周血白细胞。在本文的任一实施方案中，血液样品可以为外周血单核细胞。在本文的任一实施方案中，所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较可以预测no-AR，其敏感性大于70％。在本文的任一实施方案中，所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较可以预测no-AR，其特异性大于70％。在本文的任一实施方案中，所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较可以预测no-AR，其阳性预测值(ppv)大于70％。在本文的任一实施方案中，所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较可以预测no-AR，其阴性预测值(npv)大于70％。在本文的任一实施方案中，所述基因表达结果与所述参考标准品的比较可以由计算机或人来进行。

在另一方面，本发明提供包含参考标准品的制品，其用于与通过测量来自接受肾移植个体的生物样品中的CEACAM4以及选自CFLAR，DUSP1，IFNGR1，ITGAX，MAPK9，NAMPT，NKTR，PSEN1，RNF130，RYBP，EPOR，GZMK，RARA，RHEB，RXRA及SLC25A37中的6到16个其它基因的水平所得到的基因表达结果进行比较，其包含在单个肾移植中心针对每个基因的来自AR样品的单个参考表达载体以及在单个肾移植中心针对每个基因的来自no-AR样品的单个参考表达载体，其中所述基因表达与参考标准品的相关性将用于诊断在所述个体中无急性排斥(no-AR)。在本文的任一实施方案中，个体可以为23岁或年龄更大的成年人。在本文的任一实施方案中，个体可以为儿童或未满23岁的年轻人。在本文的任一实施方案中，6到16个其它基因可以包含CFLAR，DUSP1，IFNGR1，ITGAX，MAPK9，NAMPT，NKTR，PSEN1，RNF130，RYBP，EPOR，GZMK，RARA，RHEB，RXRA以及SLC25A37。在本文的任一实施方案中，检测CEACAM4和6到16个其它基因的水平可以包含在微阵列芯片上分析所述样品的基因表达结果。在本文的任一实施方案中，检测CEACAM4和6到16个其它基因的水平可以包含在微球上分析所述样品的基因表达结果。在本文的任一实施方案中，检测CEACAM4和6到16个其它基因的水平可以包含在纳米颗粒上分析所述样品的基因表达结果。在本文的任一实施方案中，检测步骤可以包括在多孔的或无孔的且可大小不一的固相表面上分析所述样品的基因表达结果。在本文的任一实施方案中，生物样品可以为全血样品。在本文的任一实施方案中，生物样品可以为血液样品。在本文的任一实施方案中，血液样品可以为外周血白细胞。在本文的任一实施方案中，血液样品可以为外周血单核细胞。在本文的任一实施方案中，所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较可以包括对no-AR的预测，其敏感性大于70％。在本文的任一实施方案中，所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较可以包括对no-AR的预测，其特异性大于70％。在本文的任一实施方案中，所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较可以包括对no-AR的预测，其阳性预测值(ppv)大于70％。在本文的任一实施方案中，所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较可以包括对no-AR的预测，其阴性预测值(npv)大于70％。

附图简述

图1描述了在来自全世界8个移植中心的438名独立的成人/儿科肾移植患者中进行肾移植急性排斥评估(AART)的研究设计。

图2A-B所示为使用15个基因通过惩罚逻辑回归对来自4个中心的192名患者进行急性排斥(AR)预测的图表。

图3A所示为用15个基因通过惩罚逻辑回归检测细胞和体液排斥的图表。图3B显示使用15个基因通过惩罚逻辑回归对AR和no-AR进行检测不会随移植后的时间而混淆。

图4A-B显示，在其通过活组织切片检查被证实为AR之前2年到0个月或之后0-16个月的时间段所采集的156名儿科及成人样品的AR概率的预测。图4A显示成人样品总体中15个基因的表达通过惩罚逻辑分析可在活组织切片检查证实为AR之前长达3个月及之后直至1个月的时间内指示AR。图4B显示成人样品总体中10个基因中的5个的表达通过逻辑分析可在活组织切片检查证实为AR之前及之后长达3个月的时间内预测AR。

图5描述改进的谱系分析器(kSAS)的工作流程。图5A显示可基于与AR和STA参考的总体相似性对样品进行分类，而无需批次效应校正。图5B显示kSAS(改进的谱系分析器)如何适应从qPCR数据到AR相对风险模型的工作流程。

图6A-B描述使用17个基因通过偏最小二乘法判别分析(plsDA)在143例成人样品中对AR和No-AR进行分类。这17个基因用于通过plsDA在来自四个地点的143例成人血液样品(队列1)中预测AR。6A显示在每个收集地点，AR对比No-AR的平均[％]预测概率，AR均显著更高(p＜0.0001)，且在No-AR样品中均未达到AR预测的阈值(预测概率AR＝50％)。6B显示训练集中AR的受者操作特征(ROC)AUC为0.94(95％Cl为0.91-0.98)。

图7A-C显示使用17个基因在124例成人和儿科样品中对AR和No-AR进行分类。使用固定在富鲁达(Fluidigm)芯片上的plsDA 17-基因模型在124例成人和儿科AR和No-AR血液样品(队列2)中进行独立验证。22/23例AR被正确分类为AR，100/101例No-AR被正确分类为No-AR。7A：显示每个样品由表型(AR对比No-AR)以及患者年龄(成人；儿科)造成离析的(segregated)[％]预测AR概率。7B：所有样品的平均预测AR概率中，AR显著高于No-AR(p＜0.0001)。7C：对17基因AR模型进行ROC分析证明AR预测具有高敏感性和特异性(AUC＝0.95[95％Cl为0.88到1.0])。

图8显示使用17个基因在191例成人和儿科样品中进行AR预测。在活组织切片检查证实为AR之前(前-AR)或之后(后-AR)6个月内所采集的191例连续的血液样品(队列3)被用图表表示出来。图中显示了每个组，包括74例AR样品以及117例前-和后-AR活组织切片样品以及216例No-AR/稳定样品，AR和No-AR的平均发生率。在柱内显示了由分析计算出的平均预测AR概率得分。该17基因肾AR预测模型在62.9％的前-AR3个月内收集的样品中以非常高的平均AR得分(96.4％±0.08)预测了AR。AR得分在51.6％的后-AR小于3个月内收集的样品中还以非常高的平均预测AR得分(94.6％±0.14)持续；83.8％的No-AR样品总是被预测为No-AR(平均预测AR概率＝8.2％±0.12)。平均AR得分在前-AR样品(0-3个月)对比No-AR/稳定样品之间具有显著性差异(p＝3.72E-47)。(三处数字与图中数字不一致？)

图9A-C显示使用17基因的kSAS算法的开发。kSAS被开发以提供个体样品AR风险得分及AR风险种类。图9A显示将未知样品中17基因肾AR预测分析模型的表达值与相应的AR及No-AR参考值通过皮尔逊相关进行关联；图9B显示为了开发17基因AR分析，来自100例样品的QPCR数据被分为训练(n＝32)和独立验证集(n＝68)；来自17基因肾AR预测分析模型的1312-基因模型为每个样品生成用数值表示的聚合AR风险得分并且将他们分为三组高风险AR(聚合AR风险得分≥9)，低风险AR(聚合AR风险得分≤-9)以及不确定(聚合AR风险得分＜9，且＞-9)类型9C。

图10A-C显示在100例样品中使用kSAS进行17基因AR预测分析的性能。图10A显示为每个样品计算预测聚合AR风险得分：AR预测分析正确地将全部4个不同样品收集地点的无论成人/儿科受者年龄的36/39例AR划分为高风险AR(92.3％；风险得分≥9)以及43/46例No-AR划分为低风险AR(93.5％，风险得分≤-9)；剩余11例样品被划分为不确定(AR风险得分＜9，＞-9)。图10B显示聚合AR风险得分[％]在AR中显著高于No-AR(p＜0.0001)。图10C显示ROC分析证明AR预测分析具有高度敏感性和特异性；AUC＝0.93(95％Cl为0.86-0.9)。

图11A-D显示在富鲁达QPCR数据中进行混淆因素的分析和数据标准化。对来自143例AR及No-AR成人样品(队列1)的43个排斥基因的QPCR数据的主成分分析(PCA)显示样品离析是由于样品收集地点(图11A)而不是表型(图11B)造成的。通过混合ANOVA对QPCR数据进行标准化矫正了样品收集地点对于基因表达的显性效应(图11C)且导致样品离析为AR和No-AR(图11D)。使用相对基因表达值(dCt 18S)对43个基因进行PCA。将样品收集地点，RNA来源和芯片作为随机分类因素并将表型作为分类因素建立混合ANOVA模型。每个球代表一个样品；符号表示样品收集地点(*＝UPMC；A＝UCLA；X＝CPMC；#＝EMORY)；本图还反映出基于活组织切片诊断的患者表型(AR；No-AR)。

图12显示在267例成人和儿科样品中鉴定AR和No-AR特异基因的方法。从对总共43个基因(我们之前已鉴定的10个儿科AR基因；成人和儿科移植排斥中的33个新发现候选基因)进行的微流体高通量富鲁达QPCR所得到的来自267例成人和儿科血液样品(队列1，队列2)的基因表达数据中最终发现了用于AR预测的17个肾AR基因。在143例成人AR和No-AR样品集中确定这10个儿科基因正确预测了AR，正确率为87.4％。在267例AR和No-AR样品的成人和儿科组合数据集(队列1，队列2)中进行新发现和验证。学生T检验、ANOVA和惩罚逻辑回归所确定的另外7个基因与10基因的排斥集界定了最终用于AR预测的17个基因。通过偏最小二乘判别分析，使用相等先验概率，这17个基因在143例样品(队列1；AUC＝0.944)的训练集以及未纳入之前任何分析中的124例样品的独立验证集(队列2；AUC＝0.948)中高度敏感和特异的预测了AR。分析中使用的基因表达数据代表来自富鲁达QPCR平台的相对于18S的dCt值，并且使用混合ANOVA模型对样品收集地点、RNA来源以及运行另外进行了标准化。

图13A-D显示使用17基因对每个参与中心中AR和No-AR进行个体分类。对纳入AART研究的每个移植中心进行了ROC分析以评价不同样品收集地点肾AR预测分析的性能。计算得到在埃默里大学收集的样品AR对比No-AR的AUC为0.8765(95％Cl为0.7538到0.9993)(图13A；n＝42)；在UPMC收集的样品AR对比No-AR的AUC为0.9825(95％Cl为0.9608到1.0)(13B；n＝81)，在UCLA收集的样品AR对比No-AR的AUC为0.9360(95％Cl为0.8648到1.0)(13C，n＝44)，而在CPMC收集的样品AR对比No-AR的AUC为1.0(95％Cl为1.0到1.0)(图13D，n＝35)。后者是一个不平衡的数据集，其仅有2例AR样品，且肾AR预测分析的性能似乎拟合过度。每条ROC曲线旁边的表格展示了每个被评估中心的样品群集。

图14A-B显示17基因通过plsDA检测抗体和细胞介导的AR且AR和No-AR的分类不依赖于移植后的时间。图14A显示将使用固定17基因肾AR预测分析模型在一个19名明确的只有抗体介导的排斥的患者(AMR，C4D阳性活组织切片染色，DSA+)的子集中与在一个51名细胞介导的排斥的患者(ACR，C4d-且DSA-)的子集中得到的预测AR概率进行比较；固定17基因模型检测到体液和细胞AR概率相同(14A，plsDA，p＝0.9906；平均ACR＝80.84％±4.4；平均AMR＝80.75％±6.6)。图14B显示该17固定基因plsDA模型预测AR同样不依赖于移植后的时间，在No-AR患者中AR的预测概率持续很低而在AR患者组中AR预测概率持续很高(图14B显示平均AR预测概率加SEM)。计算落入移植后3个时间范畴(0-6个月，6个月-1年，＞1年)之一的样品的平均AR预测概率，并通过学生T检验进行比较；p值未达到显著性(p＞0.05)。

图15A-C显示这17个基因的生物学基础。通路和网络分析证明了基因的强生物学相关性，其支持通过QPCR得到的AR和No-AR样品的基因表达中所见的相关性。图15A显示与这17个基因显著(p＜0.05)相关的是凋亡调控、免疫表型以及细胞表面蛋白；图15B显示创新通路分析(IPA，Qiagen，雷德伍德城，CA)进一步证实了这17个基因中的11个在肿瘤、细胞死亡及细胞存活中的共同作用(p＜0.05)。图15C显示附加的网络分析显示这17个基因中的7个形成单一个直接相互作用的网络。

图16显示在器官移植排斥中发现被超表达的12个基因，其代表多种不同类型的器官移植排斥中的共同排斥模块。

发明详述

本发明人已发现多组基因表达谱，其能够确定接受了肾移植的个体是否正在经受，或将会经受，移植器官的急性排斥(AR)。该基因表达谱不依赖于受者年龄，移植中心，RNA来源，检测，终末期肾病的原因，共病现象，免疫抑制剂的使用，等等。本发明在此所述提供了评估接受了肾移植的个体中AR或No-AR的方法，以及确认在肾移植中需接受AR治疗的个体的方法。本发明还描述了用于评估肾移植中AR的系统，包括使用微阵列芯片作为这些系统的组件。本发明进一步提供了基于这些系统的试剂盒，以评估接受了肾移植的个体中AR及AR的概率。

定义

为了解释这个说明书的目的，以下定义将是适用的，并且只要适当时以单数使用的术语也将包括复数，反之亦然。如果以下陈述的任何定义与通过引用并入本文的任何文件相冲突，以以下陈述的定义为准。

“急性排斥”“急性同种异体移植物排斥”或“AR”是指当移植组织为免疫异质时，组织/器官移植受者的免疫系统的排斥反应。AR的特征为移植组织被受者的免疫细胞浸润，后者执行他们的效应功能并破坏移植组织。AR的特征还有供者特异性抗体的生成，该诊断被称为抗体介导的排斥(AMR)。AR可进一步被分为超急性、急性、临界急性或亚临床急性AR。超急性排斥的发生通常很迅速且通常出现在患者接受移植手术后的数分钟到数小时。AR的发生通常出现在患者接受移植手术后的几个月内，通常为大约6-12个月。临界急性和亚临床AR是低等级炎症性同种异体反应的结果。通常，AR可以通过使用免疫抑制药物如雷帕霉素、环孢菌素A，抗CD40L单克隆抗体等被治疗，控制或抑制。

“无急性排斥”或“no-AR”或“稳定的”或“STA”在本文中可交换使用。No-AR/STA表示患者接受移植后AR风险低或无AR风险。No-AR的特征可以是对于组织移植受者来说免疫异质的移植组织的长期移植存活。

术语“肾同种异体移植”指将肾从一个个体移植到另一个个体。

如本文所用，“基因”指包含编码多肽的开放读码框的核酸，包括外显子和(可选的)内含子序列。术语“内含子”指存在于特定基因中不被翻译成蛋白质的DNA序列，在DNA分子中通常位于外显子之间。此外，基因还可选择性地包括它的天然启动子(即在非重组细胞中与该基因的外显子和内含子操作性连接的启动子)，以及相关的调控序列，并可能包括也可能不包括AUG起始位点上游序列，非翻译前导序列，信号序列，下游非翻译序列，转录起始和终止序列，多聚腺苷酸化信号，翻译起始和终止序列，核糖体结合位点，等等。

术语“参考”指一个或一组已知数值，观测值可与其进行比较。在一个实施方案中，参考是移植物存活表型中基因的基因表达数值(或水平)。在另一个实施方案中，参考是移植物失功表型中基因的基因表达数值(或水平)。

如本文所用，“参考表达载体”指参考标准品。在一个实施方案中，参考表达载体是在特定的移植中心中为AR样品建立的针对每个表达基因的参考标准品。在另一个实施方案中，参考表达载体是在特定的移植中心中为no-AR样品建立的针对每个表达基因的参考标准品。在另一个实施方案中，参考表达载体是所有移植中心为AR样品建立的针对每个表达基因的参考标准品。在另一个实施方案中，参考表达载体是所有移植中心为no-AR样品建立的针对每个表达基因的参考标准品。

“个体”或“受试者”可以是“患者”。“患者”指在治疗医师管理之下的“个体”。患者可以是男性或女性。在一个实施方案中，患者已经接受了肾移植。在另一个实施方案中，患者已经接受了肾移植并且正在经受器官排斥。在另一个实施方案中，患者已经接受了肾移植并且正在经受AR。

“患者亚群”及其语法的变化，如本文所用，指患者的子集，其特征为具有一种或多种区别性的可检测的和/或可确认的，可将其与其所属的较广疾病类型中的其他患者区别开来的特征。

术语“样品”，如本文所用，指从包含基因组信息的个体中获得或取得的组合物。在一个实施方案中，样品为全血。在另一个实施方案中，样品为血液。在另一个实施方案中，样品为外周血白细胞。在另一个实施方案中，样品为外周血单核细胞。在另一个实施方案中，样品为组织活体切片。在另一个实施方案中，样品为来自移植器官的组织活体切片。在另一个实施方案中，样品为来自受者移植前器官的组织活体切片。

如本文所用，“微阵列”指将一批核酸序列的集合排列在一个集中的位置。阵列可以在固相基质上，如由玻璃、塑料或硅组成的表面。核酸序列可以是DNA、RNA或任何其变换。核酸序列还可以是来自基因、引物、全基因序列、非编码序列、编码序列、公布的序列、已知序列或新序列的部分序列。

如本文所用“预测”和“预测”并不意味着该结果100％必然出现。相反，它的意思是指出现该结果的可能性比不出现大。“预测”或“做出预测”所采取的行动可以包括确定一个结果出现比不出现的可能性大的可能性。对本文所述的多种因素的评估可以用于做出这样的确定或预测。

“比较”或“进行比较”是指以任何方式，将第一次分析的结果与第二次和/或第三次分析的结果相关联。例如，可以用第一次分析的结果将该结果分类为更类似第二次的结果而不是第三次的结果。至于来自个体的生物样品的AR评估的实施方案，可以使用该结果来确定该个体是否正在经受AR反应。至于来自个体的生物样品的no-AR评估的实施方案，可以使用该结果来确定该个体是否正在经受no-AR反应。

术语“评估”和“确定”可交换使用，指任何形式的检测，并且包括定量和定性检测。例如，“评估”可以是相对的或绝对的。

本文所用的术语“诊断”指确认或区分分子或病例状态、疾病或健康状况。例如，“诊断”可以指确认器官排斥。“诊断”还可以指区分器官排斥的特定亚型，如AR。

如本文所用，“治疗”指试图改变被治疗个体的自然病程的临床干预。治疗的满意效果包括阻止疾病或其病情或症状的发生或复发，缓解疾病的病情或症状，减少疾病的任何直接或间接的病理后果，降低疾病进展速度，改善或减轻疾病状态，和实现改善的预后。在某些实施方案中，治疗指在个体中降低疾病进展速度，改善或减轻疾病状态，和实现改善的AR预后。在某些实施方案中，治疗指修改或改变受试者治疗方案中一种或多种治疗剂的施用方法。

本文涉及数值或参数的“约”包括(且描述)涉及该数值或参数自身的实施方案。例如，涉及“约X”的描述包括描述“X”。术语“约”用于通过假定一个指定值可以“稍高”或“稍低”于端点而不影响期望结果，从而为数值范围的端点提供灵活性。浓度、数量和其它数据可以范围的方式表示或出现在本文中。应理解，使用这样的范围方式仅为了便利性和简便性，因此其应灵活地解释为不仅包括明确被列举为范围界限的数值，而且包括包含在此范围内的所有单独数值或子范围，就好像每个数值和子范围被明确列举出来一样。

应理解本文中所述的本发明的方面和实施方案包括“包含/包括”，“由…组成”和“基本上由…组成”方面和实施方案。对于本文所述的所有组合物，以及本文所述的使用组合物的所有方法，组合物要么可以包含列出的成分或步骤，要么可以“基本上由…组成”列出的成分或步骤。当组合物被描述为“基本上由…组成”列出的组合物，则该组合物含有列出的成分，并且可以含有其它基本上不影响在治疗的疾病的成分，但不含有任何其它基本上影响在治疗的疾病的除明确列出的那些成分之外的成分；或者，如果该组合物确实含有那些列出的成分之外的基本上影响在治疗的疾病的额外成分，那么该组合物也不含有足够浓度或量的该额外成分以在基本上影响在治疗的疾病。当方法被描述为“基本上由…组成”列出的步骤，则该方法包含列出的步骤，并且可以包含其它基本上不影响在治疗的疾病的步骤，但是该方法不包含任何其它基本上影响在治疗的疾病的除明确列出的那些步骤之外的步骤。作为一个非限定性的具体实施例，当组合物被描述为“基本上包括”一种成分，则该组合物可以额外包含任意量的药物学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂以及其它基本上不影响在治疗的疾病的此类成分。

如本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一种(a)”、“一种(an)”和“这种(the)”包括复数指示物，除非上下文中另有清楚的指示。

一般技术

除非另外限定，本文中使用的技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。

除非另外指出，本发明的实践将使用蛋白质生物学、蛋白质化学、分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，其在本领域技术人员的能力范围内。这样的技术在文献中有充分解释，例如“Molecular Cloning：A LaboratoryManual(分子克隆：实验室手册)”，第2版(Sambrook等，1989)；“Current Protocols inMolecular Biology(分子生物学通用实验方案)”(Ausubel等编辑，1987，周期性更新)；“PCR：The Polymerase Chain Reaction(聚合酶链反应)”，(Mullis等，编辑，1994)；以及Singleton等，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(微生物学和分子生物学词典)，第2版，J.Wiley&Sons(纽约，N.Y.1994)。

肾移植受者

肾移植受者可以为任何年龄。在某些实施方案中，个体为儿童。在一个实施方案中，儿童为婴儿。在另一个实施方案中，儿童为婴幼儿。在另外的实施方案中，个体为不满23岁的年轻成年人。在某些实施方案中，个体约为1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，或22岁。在进一步的实施方案中，个体为超过23岁的成年人。在某些实施方案中，个体为约23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，67，68，69，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，或100岁。在一个实施方案中，肾移植受者为女性。在另一个实施方案中，肾移植受者为男性。

肾移植术/手术可以在专门制定的治疗设施或移植中心进行。移植中心可以位于世界的任何地方。在一个实施方案中，移植中心在美国。在某些实施方案中，移植中心是埃默里大学(亚特兰大，乔治亚州)，加利福尼亚大学洛杉矶分校(洛杉矶，CA)，匹兹堡大学(匹兹堡，PA)，加州太平洋医疗中心(旧金山，CA)，或加利福尼亚大学旧金山分校(旧金山，CA)。在另外的实施方案中，移植中心在欧洲。在一个实施方案中，移植中心是大学医院(巴塞罗那，西班牙)。在一个进一步的实施方案中，移植中心在墨西哥。在一个实施方案中，移植中心是墨西哥婴幼儿医院肾内科研究实验室(墨西哥城，墨西哥)。

来自肾移植受者的生物样品的收集

生物样品收集自已经接受了同种异体肾移植的个体。在某些实施方案中，肾移植受者没有AR的明显症状。在另外的实施方案中，肾移植受者表现出AR的症状。任意类型的生物样品都可以被收集，包括但不限于全血，血液，血清，血浆，尿液，粘液，唾液，脑脊液，组织，活组织切片以及它们的组合。在一个实施方案中，血液样品为外周血。在另一个实施方案中，生物样品为外周血单核细胞。在某些实施方案中，生物样品为外周血淋巴细胞。在某些实施方案中，生物样品为组织活体切片。

来自肾移植受者的生物样品的收集可以发生在器官移植之后任何时间。在某些实施方案中，生物样品可以收集于PAXgene^TM试管(可向Qiagen购买)。在另外的实施方案中，生物样品可以被收集于含RNA酶抑制剂的收集管以防止RNA降解。在某些实施方案中，生物样品在常规方案监测检查过程中收集。在另外的实施方案中，生物样品在治疗的临床医生有理由怀疑该个体正在经受AR反应时收集。

为AR或no-AR样品创建参考时，收集自肾移植受者的生物样品可以与同时收集的来自同一名患者的移植肾活组织切片配对。通常，移植肾活组织切片在收集生物样品的48小时内收集自受者。在某些实施方案中，活组织切片在移植时收集。在另外的实施方案中，活组织切片在移植后最长24个月内收集。在一个实施方案中，活组织切片可以在移植后约3个月收集；移植后约6个月收集；移植后约12个月收集；移植后约18个月收集；或移植后约24个月收集。这些时间点不应该被视为限定，因为活组织切片和/或生物样品可以在移植后任何时间点收集。不如说，提供这些时间点是为了显示大多数肾移植受者移植后常规监测最有可能发生的时期。此外，这些时间点还显示了移植后AR反应最有可能发生的时期。

每一例收集的移植肾活组织切片可以依据班夫分类系统评分(Solez，K.etal.Am.J.Transplant.，2008，8，753-760；Mengel，M.et al.Am.J.Transplant.2012，12，563-570)。该系统将肾器官活组织切片样品的观测病理学分为正常组织，超急性排斥，临界改变，急性排斥，慢性移植肾病，以及其它改变。班夫分类在肾移植病理学中设置了标准并且被广泛用于新的抗排斥药物的国际临床试验。如本文所述，“急性排斥”(AR)被定义为活组织切片样品的班夫肾小管损伤得分(t)小于等于1，且间质浸润得分小于等于0；“稳定的”(“STA”)/“no-AR”被定义为活组织切片样品未显示AR(no-AR)或其它任何实质性病理改变；而“其它”被定义为样品未显示出班夫分级的AR，但是符合慢性移植损伤、慢性钙调神经磷酸酶抑制剂毒性、BK病毒感染或其它移植损伤的班夫标准。

生物样品中基因表达的评价

取自肾移植受者的生物样品可以被用于评价在经受AR反应的个体中差异化表达的基因的水平。检测基因表达的各种技术为本领域技术人员所公知。一个非限制性的方法是从收集的生物样品中提取RNA并合成cDNA。而后可以使用特异针对靶基因(即，在经受AR反应的个体中差异化表达的基因)的引物或标记的引物对cDNA进行扩增，并且随后使用定量聚合酶链反应(qPCR)进行分析。可以使用qPCR平台如BioMark(富鲁达，南旧金山，CA)或ABI viia7(美国生物技术公司，福斯特城，CA)。

在某些实施方案中，基因特异的引物或dNTP之一，优选为dNTP，会被标记从而使合成的cDNA被标记。标记是指实体包含信号产生系统的一个成员并因而可被检测，或者直接地或者通过与信号产生系统的一个或多个另外的成员的共同作用。直接可检测的例子包括纳入，通常是共价结合于，核苷酸单体单元例如dNTP或引物的单体单元，的同位素或荧光基团。感兴趣的同位素基团或标记包括32 P，33 P，35 S，125 I，等等。感兴趣的荧光基团或标记包括香豆素及其衍生物，例如7-氨基-4-甲基香豆素，氨基香豆素，氟化硼络合二吡咯甲川类染料，例如Bodipy FL，级联蓝，荧光素及其衍生物，如异硫氰酸荧光素，俄勒冈绿，罗丹明染料，如德克萨斯红、四甲基罗丹明、伊红和赤藓红，菁染料，例如Cy3和Cy5，镧系离子大环螯合物，例如量子染料.TM.，能量转移荧光染料，如噻唑橙-乙啡啶异源二聚体，TOTAB，等。标记还可以是信号产生系统的成员，其与同系统的一个或多个另外的成员配合从而提供可检测的信号。这类标记的例子是特异性结合对的成员，比如配体，如生物素，荧光素，地高辛，抗原，多价阳离子，螯合基团等等，在那里这些成员特异性的结合于信号产生系统的另外的成员，在那里另外的成员提供可直接或间接检测的信号，例如结合了荧光部分或能将底物转化为显色产物的酶部分的抗体，如碱性磷酸酶结合的抗体；等等。标记的核酸也可以通过在标记的引物存在的条件下进行PCR而产生。美国专利号5,994,076通过引用并入本文，仅因其对修饰的引物及其dNTP的教导。

经受AR反应的肾移植受者中示例性的差异表达基因列于表1中。在一个实施方案中，差异表达基因通过p值小于等于0.05，或错误发现率小于等于5％来指示，且可以被认为具有显著性并用于建立预测模型。在另一个实施方案中，绝对倍数变化大于等于1.5且p值小于等于0.05，或错误发现率小于等于5％的基因可被认为具有显著性并用于建立预测模型。多种类型的软件可被用于统计分析。这类软件的一个例子是Partek基因组学套件。基因可以经过统计分析从而为检测和/或预测AR选择一个稳健模型。可以使用多种分类模型如惩罚逻辑回归，支持向量机，以及使用相等先验概率的偏最小二乘判别分析。在进一步详细的例子中，主成分分析可用于显示未加工的qPCR数据，ANOVA和学生T检验可以检测显著性差异表达的基因，收缩质心可被用于确定可区别AR和no-AR样品的基因。

从列于表1的基因中，一个17基因的子集被确认可以将患者分为AR或no-AR，无论患者年龄、移植中心、RNA来源、检测、终末期肾病的原因，共病现象，和/或免疫抑制剂的使用。该17-基因集由之前被证明可指示儿科患者中AR的10个基因(CFLAR，DUSP1，ITGAX，RNF130，PSEN1，NKTR，RYBP，NAMPT，MAPK9，和IFNGR1)，新确定的指示成人患者中AR的6个基因(CEACAM4，RHEB，GZMK，RARA，SLC25A37，和EPOR)，以及维甲类X受体α(RXRA)组成。这些基因的序列在附录A和B中提供。本文中公开的基因可用于在接受了肾移植的个体中诊断AR的多种方法，用于选择需要治疗的患者，以及用于本文所述的其它用途。

检测基因表达的另一种非限制性方法是Northern印迹。编码蛋白质的基因的基因表达水平还可以使用蛋白质定量方法如Western印迹来确定。使用蛋白质组学试验来检测差异表达基因的水平也被包含在本文中。本领域专业技术人员会知道怎样使用标准的蛋白质组学试验来检测基因表达水平。

参考表达载体

本发明提供不依赖于年龄、移植中心、RNA来源、检测、终末期肾病的原因，共病现象，和/或免疫抑制剂的使用的参考表达载体的构建。使用这些参考表达载体不需要去除批次效应，而商业软件包如Partek或开放资源软件如R通常需要去除批次效应。

对于数据的显著随机效应由不同的移植中心推断。这些随机效应是由不同移植中心的生物样品收集程序和免疫抑制方案的差异引起的。因此，单个移植中心特异的AR预测模型比所有移植中心共用一个AR预测模型更准确。

如实施例和附录中所举例说明，对于特定的移植中心，可以通过为在该移植中心收集的AR样品构建每个基因的第一个参考表达载体，并为在同一移植中心收集的no-AR样品构建每个基因的第二个参考表达载体，从而获得AR预测模型。用于构建参考表达载体的样品可以使用移植物活组织切片检查进行分类。随后，从同一移植中心所收集的来自肾移植受者的生物样品(即“未知”样品)中所获得的差异表达基因的表达水平可以与AR和no-AR样品的两个参考表达载体进行比较。计算机程序如kSAS，谱系分析器(Lineage Profiler)的改良版本，可被用于给每个被评价的基因集分配分类值或得分和/或数字值或得分，其指示AR的风险或no-AR的风险(源代码在附录C中提供)。可以使用多基因集模型。使用多基因集模型的一个优势是每个基因集被分配不同的值或得分，从而使基于单个基因模型的偏差风险降至最低。

在一个实施方案中，有2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，或17个参考表达载体用于AR的诊断。在一个相关的实施方案中，有2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，或17个参考表达载体用于no-AR的诊断。在一个具体的实施方案中，有17个参考表达载体用于AR的诊断以及17个参考表达载体用于no-AR的诊断。在另一个具体的实施方案中，有16个参考表达载体用于AR的诊断以及16个参考表达载体用于no-AR的诊断。在另一个具体的实施方案中，有15个参考表达载体用于AR的诊断以及15个参考表达载体用于no-AR的诊断。在另一个具体的实施方案中，有12个参考表达载体用于AR的诊断以及12个参考表达载体用于no-AR的诊断。

在一个实施方案中，为了生成参考表达载体，在分析未知样品之前，生物样品被收集并使用12基因模型集进行分析。表2中提供了示例性的12基因模型。在另一个实施方案中，在分析未知样品之前，生物样品被收集并使用包含BASP1，CD6，CD7，CXCL10，CXCL9，INPP5D，ISG20，LCK，NKG7，PSMB9，RUNX3和TAP1的12基因模型集进行分析。在一个实施方案中该12基因集由CFLAR，PSEN1，CEACAM4，NAMPT，RHEB，GZMK，NKTR，DUSP1，RARA，ITGAX，SLC25A37和EPOR组成。在一个实施方案中该12基因集由CFLAR，PSEN1，CEACAM4，NAMPT，RHEB，GZMK，NKTR，DUSP1，ITGAX，SLC25A37，RXRA和EPOR组成。在一个实施方案中该12基因集由CFLAR，PSEN1，CEACAM4，RHEB，GZMK，NKTR，DUSP1，RARA，ITGAX，SLC25A37，RXRA和EPOR组成。在一个实施方案中该12基因集由CFLAR，PSEN1，CEACAM4，NAMPT，GZMK，NKTR，DUSP1，ITGAX，SLC25A37，RYBP，RXRA和EPOR组成。在一个实施方案中该12基因集由CFLAR，MAPK9，PSEN1，CEACAM4，GZMK，NKTR，DUSP1，RARA，SLC25A37，RYBP，RXRA和EPOR组成。在一个实施方案中该12基因集由CFLAR，PSEN1，CEACAM4，GZMK，NKTR，DUSP1，RARA，ITGAX，SLC25A37，RYBP，RXRA和EPOR组成。在一个实施方案中该12基因集由CFLAR，MAPK9，PSEN1，CEACAM4，NAMPT，GZMK，NKTR，DUSP1，ITGAX，SLC25A37，RXRA和EPOR组成。在一个实施方案中该12基因集由CFLAR，PSEN1，CEACAM4，NAMPT，GZMK，NKTR，DUSP1，RARA，ITGAX，SLC25A37，RYBP和EPOR组成。在一个实施方案中该12基因集由CFLAR，PSEN1，CEACAM4，NAMPT，GZMK，NKTR，DUSP1，RARA，ITGAX，SLC25A37，RXRA和EPOR组成。在一个实施方案中该12基因集由CFLAR，MAPK9，PSEN1，CEACAM4，GZMK，NKTR，DUSP1，RARA，ITGAX，SLC25A37，RXRA和EPOR组成。在一个实施方案中该12基因集由CFLAR，MAPK9，PSEN1，CEACAM4，GZMK，NKTR，DUSP1，RARA，ITGAX，SLC25A37，RYBP和EPOR组成。在一个实施方案中该12基因集由CFLAR，MAPK9，PSEN1，CEACAM4，NAMPT，GZMK，NKTR，ITGAX，SLC25A37，RYBP，RXRA和EPOR组成。在一个实施方案中该12基因集由CFLAR，MAPK9，PSEN1，CEACAM4，NAMPT，GZMK，NKTR，DUSP1，RARA，ITGAX，SLC25A37和EPOR组成。在一个实施方案中该12基因集由BASP1，CD6，CD7，CXCL10，CXCL9，INPP5D，ISG20，LCK，NKG7，PSMB9，RUNX3和TAP1组成。

表2：肾AR预测分析性能——从选定的17个基因中选出的14个的12基因模型

得到这些样品的qPCR数据资料之后，分别提取所有AR和no-AR样品的表达平均值为分析的所有基因创建双栏参考。或者，使用合并的RNA参考而不是单个样品也可以是足够的。数据被保存为三栏参考文件，第一栏包含基因标识，第二栏包含AR参考，而第三栏包含no-AR参考。对用于此参考的原始样品进行重新分析可以确定这些参考样品之间是否由于，例如，AR和no-AR样品之间分类得分较低，而存在显著性变异。

在另一个实施方案中，为了生成参考表达载体，在分析未知样品之前，生物样品被收集并使用包含CEACAM4，CFLAR，DUSP1，ITGAX，RNF130，PSEN1，NKTR，RYBP，NAMPT，MAPK9，IFNGR1，RHEB，GZMK，RARA，SLC25A37，EPOR和RXRA的17基因模型集进行分析。在某些方面，生物样品被收集并使用表2中的12基因模型集进行分析，其包含BASPI，CD6，CD7，CXCL10，CXCL9，INPP5D，ISG20，LCK，NKG7，PSMB9，RUNX3和TAP1。这些样品作为移植中心特异的参考。得到这些样品的qPCR数据资料之后，分别提取所有AR和no-AR样品的表达平均值为分析的所有基因创建双栏参考。或者，使用合并的RNA参考而不是单个样品也可以是足够的。数据被保存为三栏参考文件，第一栏包含基因标识，第二栏包含AR参考，而第三栏包含no-AR参考。对用于此参考的原始样品进行重新分析可以确定这些参考样品之间是否由于，例如，AR和no-AR样品之间分类得分较低，而存在显著性变异。

为了将“未知”样品分类为AR或no-AR，将该“未知”样品的表达特征直接与参考AR特征及参考no-AR特征进行比较。如果样品的表达特征与参考AR的表达特征的匹配度比与参考no-AR的表达特征的匹配度更紧密，则该样品被分类为AR。可计算z得分作为精确度的衡量标准(见实施例2)。表达谱可以通过评价mRNA和cDNA(逆转录自mRNA)的表达来进行评估。

使用基因表达评估肾移植受者中AR/no-AR的方法

本文所述的差异表达基因可被用于诊断或帮助诊断正在经受AR或将会经受AR的个体。表达基因还可以用于监测AR的进展，监测AR的消退，确认哪些患者应接受AR的治疗或继续接受AR的治疗，评估AR治疗的效果，确认应对哪些患者进行AR监测，和/或确认没有AR风险的个体。本文所述的差异表达基因可以被用于诊断或帮助诊断个体未在经受AR，诊断或帮助诊断个体未在经受AR，诊断或帮助诊断个体会或不会经受AR的风险预测。

诊断阵列可被用于对取自肾移植受者的生物样品中存在的差异表达基因进行定量。该阵列可包括DNA包被的基质，该基质包含多个离散的、已知的区域。阵列可以包含颗粒、纳米颗粒、微球、纳米微球或其它多孔或无孔的且可大小不一的固相表面。在一个实施方案中，阵列为微阵列芯片。在另一个实施方案中，诊断阵列包含微球。在一个进一步的实施方案中，诊断阵列包含纳米颗粒。在一个进一步的实施方案中，诊断阵列包含微流体。

使用本文所述的差异表达基因的一个好处是对AR的确认精确度非常高。精确度可以分别用敏感性(被正确确认的AR患者的精确度)和特异性(被正确确认的no-AR患者的精确度)；阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)来描绘。

在本文提供的实施方案中，使用差异表达基因确定AR对于检测或预测AR高度精确。在本文提供的实施方案中，方法提供了至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％的精确度。此外，本文提供的实施方案中，对于检测或预测AR，方法提供了至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％的精确度。

在本文提供的实施方案中，使用差异表达基因确定AR对于检测或预测AR高度敏感。在本文提供的实施方案中，方法提供了至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％的敏感性。此外，本文提供的实施方案中，对于检测或预测AR，方法提供了至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％的敏感性。

此外，在本文提供的实施方案中，使用差异表达基因分析AR对于检测或预测AR高度特异。在本文提供的实施方案中，方法提供了至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％的特异性。此外，本文提供的实施方案中，对于检测或预测AR，方法提供了至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％的特异性。

此外，在本文提供的实施方案中，使用差异表达基因分析AR对于检测或预测AR有阳性预测值(PPV；阳性测试结果中为真阳性/正确诊断的比例)。在本文提供的实施方案中，对于检测或预测AR，方法提供了至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％的PPV。同样，在本文提供的实施方案中，使用差异表达基因分析AR对于检测或预测AR阴阳性预测值(NPV；测试结果为阴性的受试者中被正确诊断的比例)。在本文提供的实施方案中，对于检测或预测AR，方法提供了至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％的PPV。

对来自肾移植受者的生物样品的分析包括评价1或更多，2或更多，3或更多，4或更多，5或更多，6或更多，7或更多，8或更多，9或更多，10或更多，11或更多，12或更多，13或更多，14或更多，15或更多，16或更多，17或更多，18或更多，19或更多，20或更多，21或更多，22或更多，23或更多，24或更多，25或更多，26或更多，27或更多，28或更多，29或更多，30或更多，31或更多，32或更多，33或更多，34或更多，35或更多，36或更多，37或更多，38或更多，39或更多，40或更多，41或更多，42或更多，43或更多，44或更多，45或更多，46或更多，47或更多，48或更多，49或更多，50或更多，51或更多，52或更多，53或更多，54或更多，55或更多，56或更多，57或更多，58或更多，59或更多，60或更多，61或更多，62或更多，63或更多，64或更多，65或更多，66或更多，67或更多，68或更多，69或更多，70或更多，71或更多，72或更多，73或更多，74或更多，75或更多，76或更多，77或更多，78或更多，79或更多，80或更多，81或更多，82或更多，83或更多，84或更多，85或更多，86或更多，87或更多，88或更多，89或更多，90或更多，91或更多，92或更多，93或更多，94或更多，95或更多，96或更多，97或更多，98或更多，99或更多，100或更多，101或更多，或甚至102个本文所公开的差异表达基因的组合。在某些实施方案中，使用本文所述的方法对来自肾移植受者的生物样品中的约1个到约43个基因，包括表1中指定范围内的基因数的所有迭代次数，进行检测。在某些实施方案中，使用本文所述的方法对来自肾移植受者的生物样品中的约1个到约12个基因，包括表2中指定范围内的基因数的所有迭代次数，进行检测。在某些实施方案中，使用本文所述的方法对来自肾移植受者的生物样品中的约1个到约102个基因，包括表3中指定范围内的基因数的所有迭代次数，进行检测。

在一个实施方案中，分析来自肾移植受者的差异表达基因包括检测CEACAM4以及选自下组CFLAR，DUSP1，ITGAX，RNF130，PSEN1，NKTR，RYBP，NAMPT，MAPK9，IFNGR1，RHEB，GZMK，RARA，SLC25A37，EPOR和RXRA中的6个基因的水平。在另一个实施方案中，分析来自肾移植受者的差异表达基因包括检测CEACAM4以及选自CFLAR，DUSP1，ITGAX，RNF130，PSEN1，NKTR，RYBP，NAMPT，MAPK9，IFNGR1，RHEB，GZMK，RARA，SLC25A37，EPOR和RXRA中的7个基因的水平。在一个进一步的实施方案中，分析来自肾移植受者的差异表达基因包括检测CEACAM4以及选自CFLAR，DUSP1，ITGAX，RNF130，PSEN1，NKTR，RYBP，NAMPT，MAPK9，IFNGR1，RHEB，GZMK，RARA，SLC25A37，EPOR和RXRA中的8个基因的水平。在另一个实施方案中，分析来自肾移植受者的差异表达基因包括检测CEACAM4以及选自下组CFLAR，DUSP1，ITGAX，RNF130，PSEN1，NKTR，RYBP，NAMPT，MAPK9，IFNGR1，RHEB，GZMK，RARA，SLC25A37，EPOR和RXRA中的9个基因的水平。在另一个实施方案中，分析来自肾移植受者的差异表达基因包括检测CEACAM4以及选自下组CFLAR，DUSP1，ITGAX，RNF130，PSEN1，NKTR，RYBP，NAMPT，MAPK9，IFNGR1，RHEB，GZMK，RARA，SLC25A37，EPOR和RXRA中的10个基因的水平。在一个进一步的实施方案中，分析来自肾移植受者的差异表达基因包括检测CEACAM4以及选自下组CFLAR，DUSP1，ITGAX，RNF130，PSEN1，NKTR，RYBP，NAMPT，MAPK9，IFNGR1，RHEB，GZMK，RARA，SLC25A37，EPOR和RXRA中的11个基因的水平。在另一个实施方案中，分析来自肾移植受者的差异表达基因包括检测CEACAM4以及选自下组CFLAR，DUSP1，ITGAX，RNF130，PSEN1，NKTR，RYBP，NAMPT，MAPK9，IFNGR1，RHEB，GZMK，RARA，SLC25A37，EPOR和RXRA中的12个基因的水平。在进一步的实施方案中，分析来自肾移植受者的差异表达基因包括检测CEACAM4以及选自下组CFLAR，DUSP1，ITGAX，RNF130，PSEN1，NKTR，RYBP，NAMPT，MAPK9，IFNGR1，RHEB，GZMK，RARA，SLC25A37，EPOR和RXRA中的13个基因的水平。在另一个实施方案中，分析来自肾移植受者的差异表达基因包括检测CEACAM4以及选自下组CFLAR，DUSP1，ITGAX，RNF130，PSEN1，NKTR，RYBP，NAMPT，MAPK9，IFNGR1，RHEB，GZMK，RARA，SLC25A37，EPOR和RXRA中的14个基因的水平。在进一步的实施方案中，分析来自肾移植受者的差异表达基因包括检测CEACAM4以及选自下组CFLAR，DUSP1，ITGAX，RNF130，PSEN1，NKTR，RYBP，NAMPT，MAPK9，IFNGR1，RHEB，GZMK，RARA，SLC25A37，EPOR和RXRA中的15个基因的水平。在另一个实施方案中，分析来自肾移植受者的差异表达基因包括检测BASP1，CD6，CD7，CXCL10，CXCL9，INPP5D，ISG20，LCK，NKG7，PSMB9，RUNX3和TAP1的水平。

在一个进一步的实施方案中，分析来自肾移植受者的差异表达基因包括检测选自表2中的12基因组合的水平。

在一个进一步的实施方案中，分析来自肾移植受者的差异表达基因包括检测基因CEACAM4，CFLAR，DUSP1，ITGAX，RNF130，PSEN1，NKTR，RYBP，NAMPT，MAPK9，IFNGR1，RHEB，GZMK，RARA，SLC25A37，EPOR和RXRA的水平。该17基因集正确的预测88％的AR样品以及95％的no-AR样品。在某些实施方案中，检测了总共17个基因的表达水平。

在进一步的实施方案中，分析来自肾移植受者的差异表达基因包括检测基因BASP1，CD6，CD7，CXCL10，CXCL9，INPP5D，ISG20，LCK，NKG7，PSMB9，RUNX3和TAP1的水平。

在另一个实施方案中，分析来自肾移植受者的差异表达基因包括检测基因CEACAM4，CFLAR，DUSP1，ITGAX，NAMPT，NKTR，PSEN1，EPOR，GZMK，RARA，RHEB，and SLC25A37的水平。该基因集对AR进行分类的敏感性为86％，特异性为90％。

在另一个实施方案中，本文所述的对差异表达基因的分析可用于预测移植肾的慢性损伤。慢性损伤通常被描述为移植器官中长期功能缺失，最常见的是通过针对供者器官的持续的免疫反应。一方面，来自受试者的组织活体切片样品中的差异表达基因被评估。另一方面，组织活体切片中差异表达基因的检测可以通过免疫组织化学技术，本文所述的核酸方法，或蛋白检测方法(如Western印迹)或本领域公知的其它常用基因表达方法。在另一方面，对来自接受了肾移植的个体的组织活体切片中的CEACAM4以及选自CFLAR，DUSP1，IFNGR1，ITGAX，MAPK9，NAMPT，NKTR，PSEN1，RNF130，RYBP，EPOR，GZMK，RARA，RHEB，RXRA及SLC25A37中的6到16个其它基因的水平进行检测，从而评估AR。在另一方面，对来自接受了肾移植的个体的组织活体切片中的CEACAM4以及选自BASP1，CD6，CD7，CXCL10，CXCL9，INPP5D，ISG20，LCK，NKG7，PSMB9，RUNX3及TAP1中的6到16个其它基因的水平进行检测，从而评估AR。在另一方面，对来自接受了肾移植的个体的组织活体切片中的表1中的约1个到约43个基因，包括其指定范围内的基因数的所有迭代次数，进行检测，从而评估AR。在另一个实施例中，对来自接受了肾移植的个体的组织活体切片中的表3中的约1个到约102个基因，包括其指定范围内的基因数的所有迭代次数，进行检测，从而评估AR。

在某些实施方案中，使用了聚合基因模型。即，使用了上述的多个基因集，每个基因集提供一个分类值或得分和/或数字值或得分。这样，聚合模型不会偏重单个的基因集。在AR风险高的患者中，91％被正确分类为AR。在AR风险很低的患者中，92％被正确分类为no-AR。

本发明的差异表达基因还可用于确认需接受AR治疗的个体。在某些实施方案中，该个体被监测AR症状的进展或消退。在某些实施方案中，该个体在AR症状出现前或刚出现时便接受了AR治疗。在某些实施方案中，治疗是糖皮质激素治疗。在另外的实施方案中，治疗是给与抗T细胞抗体，如莫罗单抗-CD3(Orthoclone OKT3)。在进一步的实施方案中，治疗为血浆置换和给与抗CD20抗体的结合。在某些情况下，进行监测以确定治疗是否应继续或观察治疗是否有效。

在本文所述的方法的某些实施方案中，方法可用于预测AR反应。在这些方法中，受试者首先依据受试者方法被监测AR，而后使用至少部分基于监测结果所确定的程序进行治疗。在一个实施方案中，依据本文所述的方法之一监测受试者是否存在急性排斥。随后可对受试者进行治疗，所使用的治疗程序的适用性由监测步骤的结果确定。例如，在受试者被预测会在接下来的1到6个月发生急性排斥反应的情况下，免疫抑制治疗可进行调整，例如，增加或换药，如本领域所公知，以治疗/预防急性排斥。同样，在受试者被预测目前及近期不会发生急性排斥的情况下，免疫抑制治疗可以减少以降低药物毒性的可能。在本文所述的方法的某些实施方案中，受试者接受移植或移植物后即进行急性排斥的监测。该受试者接受移植后可进行一次或连续筛查，例如，每周一次，每月一次，两月一次，半年一次，一年一次，等。在某些实施方案中，受试者在急性排斥发生前接受监测。在另外的实施方案中，受试者在急性排斥发生之后接受监测。

在本文所述的方法的某些实施方案中，方法可用于变更或改变需要治疗AR的受试者的治疗方式或方案。示例性的用于治疗有需要的受试者的非限制性免疫抑制疗法或治疗剂包括类固醇(如强的松(去氢可的松)，强的松，甲基强的松龙(甲基强的松龙，琥钠甲强龙))，抗体(如莫罗单抗-CD3(Orthoclone-OKT3)，抗胸腺细胞免疫球蛋白(ATGAM，抗胸腺细胞球蛋白)，达利珠单抗(赛尼哌)，巴利昔单抗(舒莱)，利妥昔单抗，巨细胞病毒免疫球蛋白(巨细胞病毒免疫球蛋白)，免疫球蛋白(Polygam)，钙调神经磷酸酶抑制剂(如环孢素(山地明)，他克莫司(普乐可复))，抗增殖剂(例如，霉酚酸酯(骁悉)、硫唑嘌呤(依木兰))，TOR抑制剂(如雷帕霉素(雷帕鸣，西罗莫司)，依维莫司(卓定康))，或它们的联合治疗。

在某些实施方案中，其中受试者通过使用本文所述方法被确定没有AR，该受试者可以继续保持免疫抑制治疗的维持治疗，包括给与抗增殖剂(例如，霉酚酸酯和/或硫唑嘌呤)，钙调神经磷酸酶抑制剂(如环孢素和/或他克莫司)，类固醇(如强的松，强的松龙，和/或甲基强的松龙)或它们的组合。例如，使用本文所述方法确定无AR的受试者可置于维持治疗，包括给与低剂量强的松(例如，约0.1mg·kg^-1·d^-1至约1mg·kg^-1·d^-1)，低剂量的环孢素(例如，约4mg·kg^-1·d^-1至约8mg·kg^-1·d^-1)，和低剂量的霉酚酸酯(例如，约1-1.5g，每日2次)。在另一个实施例中，使用本文所述方法确定无AR的受试者可去掉类固醇治疗并置于维持治疗，包括给与低剂量的环孢素(例如，约4mg·kg^-1·d^-1至约8mg·kg^-1·d^-1)，和低剂量的霉酚酸酯(例如，约1-1.5g，每日2次)。在另一个实施例中，使用本文所述方法确定无AR的受试者可免去本文所述的所有免疫抑制治疗。

在某些实施方案中，其中受试者通过使用本文所述方法被确定有AR，该受试者可以被置于补救治疗或增加免疫抑制剂，包括给与高剂量的类固醇(例如，强的松，强的松龙，和/或甲基强的松龙)，高剂量的多克隆或单克隆抗体(例如，莫罗单抗-CD3(OKT3)，抗胸腺细胞免疫球蛋白，达利珠单抗，利妥昔单抗，巴利昔单抗，巨细胞病毒免疫球蛋白，和/或免疫球蛋白)，高剂量的抗增殖剂(例如，霉酚酸酯和/或硫唑嘌呤)，或它们的组合。

在某些实施方案中，治疗的过程，其中受试者通过使用本文所述方法被确定没有AR或有AR，依赖于移植后的时间和排斥的严重程度，治疗医生，以及移植中心。

因此，使用本发明的差异表达基因和本文所述的方法，本领域的技术人员可以在肾移植受者中诊断AR，在肾移植受者中诊断no-AR，帮助诊断AR，帮助诊断AR的风险，监测AR的进展，监测AR的消退，确认应该接受AR治疗或继续接受AR治疗的个体，评估AR的治疗效果，和/或确认应接受AR症状监测的个体。

在某些实施方案中，本发明的差异表达基因和本文所述的方法，可用于分层或鉴别抗体介导的AR。在另外的实施方案中，本发明的差异表达基因和本文所述的方法，可用于分层或鉴别T细胞介导的AR。本文提供的基因可用于在某些方面鉴别B细胞或T细胞介导的AR，因为它们或者表达在B细胞上或者表达在T细胞上或者是活化的T细胞的已知标志物。

诊断、检测或预测AR的试剂盒

本发明进一步提供了用于诊断、检测和预测AR的检测试剂盒。试剂盒包含基因表达评价单元，其用于检测来自已接受肾移植的个体的生物样品中与AR相关的差异表达基因的水平。在某些实施方案中，试剂盒包含用于检测生物样品中感兴趣的差异表达基因水平的试剂。在某些实施方案中，试剂盒包含由一种或多种固相表面组成的组合物，用于检测生物样品中感兴趣的差异表达基因的水平。在一个实施方案中，固相表面包含微阵列芯片。在另一个实施方案中，固相表面包含微球。在一个进一步的实施方案中，固相表面包含纳米颗粒。在一个实施方案中，试剂盒包含由一种或多种固相表面组成的组合物，用于检测CEACAM4和选自CFLAR，DUSP1，ITGAX，RNF130，PSEN1，NKTR，RYBP，NAMPT，MAPK9，IFNGR1，RHEB，GZMK，RARA，SLC25A37，EPOR及RXRA中的至少6，7，8，9，10或11个其它基因。在某些实施方案中，总共17个基因的表达水平被检测。

试剂盒进一步包含参考标准品单元，用于在已接受肾移植的个体中诊断AR。在某些实施方案中，参考标准品单元包含从来自单个移植中心或所有移植中心的肾移植受者中得到的每个差异表达基因的来自AR样品的单个参考表达载体。在某些实施方案中，参考标准品单元包含从来自单个移植中心或所有移植中心的肾移植受者中得到的每个差异表达基因的来自no-AR样品的单个参考表达载体。参考标准品单元用于与来自肾移植受者的基因表达进行比较从而诊断有AR的受者。

在某些实施方案中，比较由计算机进行。在另外的实施方案中，比较由个体进行。在一个实施方案中，比较由医生进行。每个移植中心的参考标准品可如上所述进行制备。

在某些实施方案中，计算机被配置成对用户输出至少以下之一：发生AR反应的预测，AR反应的诊断，以及受试者中AR反应的特征，其中输出是通过将7，8，9，10，11，12，13，14，15，16或17个基因的基因表达结果与对照参考表达特征进行比较来确定。

试剂盒还包含检测的使用说明。

诊断、检测或预测AR的系统

本发明进一步提供诊断、检测和预测AR的系统。系统包含基因表达评价单元，其用于检测来自已接受肾移植的个体的生物样品中与AR相关的差异表达基因的水平。在一个实施方案中，系统包含微阵列芯片。在另一个实施方案中，系统包含微球。在一个进一步的实施方案中，系统包含纳米颗粒。在不同的实施方案中，系统包含基因表达评价单元，用于检测CEACAM4和选自CFLAR，DUSP1，ITGAX，RNF130，PSEN1，NKTR，RYBP，NAMPT，MAPK9，IFNGR1，RHEB，GZMK，RARA，SLC25A37，EPOR及RXRA中的至少6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或16个其它基因。在某些实施方案中，总共17个基因的表达水平被检测。

在某些实施方案中基因表达评价单元包含为选择性扩增CEACAM4和选自CFLAR，DUSP1，ITGAX，RNF130，PSEN1，NKTR，RYBP，NAMPT，MAPK9，IFNGR1，RHEB，GZMK，RARA，SLC25A37，EPOR及RXRA中的至少6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或16个其它基因以产生基因表达结果而设计的标记的基因引物或标记的探针。在某些实施方案中，标记是非自然的出现的。在另外的实施方案中，基因引物或探针被共价修饰以包含标记。在相关的实施方案中，标记可以从包含荧光团或放射性标记的基团中选择。

系统进一步包含参考标准品单元，用于在已接受肾移植的个体中诊断AR。在某些实施方案中，参考标准品单元包含从来自单个移植中心的肾移植受者中得到的每个差异表达基因的来自AR样品的单个参考表达载体。在某些实施方案中，参考标准品单元包含从来自单个移植中心的肾移植受者中得到的每个差异表达基因的来自no-AR样品的单个参考表达载体。参考标准品单元用于与来自肾移植受者的基因表达进行比较从而诊断有AR的受者。在某些实施方案中，比较由计算机进行。在另外的实施方案中，比较由个体进行。在一个实施方案中，比较由医生进行。每个移植中心的参考标准品可如上所述进行制备。

用于诊断、检测或预测AR的组合物

本发明提供包含一种或多种固相表面的组合物，用于检测来自已接受肾移植的个体的生物样品中与AR相关的差异表达基因的水平。在某些实施方案中，组合物为制品。在一个实施方案中，制品包含参考标准品，用于检测来自已接受肾移植的个体的生物样品中差异表达基因的水平。在某些实施方案中，固相表面提供差异表达基因的cDNA的附着物。在另外的实施方案中，固相表面提供用于扩增差异表达基因的引物或标记引物的附着物。在某些实施方案中，固相表面允许检测本文公开的至少1，1或更多，2或更多，3或更多，4或更多，5或更多，6或更多，7或更多，8或更多，9或更多，10或更多，11或更多，12或更多，13或更多，14或更多，15或更多，16或更多，17或更多，18或更多，19或更多，20或更多，21或更多，22或更多，23或更多，24或更多，25或更多，26或更多，27或更多，28或更多，29或更多，30或更多，31或更多，32或更多，33或更多，34或更多，35或更多，36或更多，37或更多，38或更多，39或更多，40或更多，41或更多，42或更多，43或更多，44或更多，45或更多，46或更多，47或更多，48或更多，49或更多，50或更多，51或更多，52或更多，53或更多，54或更多，55或更多，56或更多，57或更多，58或更多，59或更多，60或更多，61或更多，62或更多，63或更多，64或更多，65或更多，66或更多，67或更多，68或更多，69或更多，70或更多，71或更多，72或更多，73或更多，74或更多，75或更多，76或更多，77或更多，78或更多，79或更多，80或更多，81或更多，82或更多，83或更多，84或更多，85或更多，86或更多，87或更多，88或更多，89或更多，90或更多，91或更多，92或更多，93或更多，94或更多，95或更多，96或更多，97或更多，98或更多，99或更多，100或更多，101或更多，或甚至102个基因。在一个实施方案中，在来自接受了肾移植的个体的生物样品中对来自表1的约1个到约43个基因，包括指定范围内的基因数的所有迭代次数，进行检测以评估AR。在另一个实施方案中，在来自接受了肾移植的个体的生物样品中对来自表3的约1个到约102个基因，包括指定范围内的基因数的所有迭代次数，进行检测以评估AR。在另一个实施方案中，对至少7个基因进行检测以评估AR。在另一个实施方案中，在另一个实施方案中，对至多17个基因进行检测以评估AR。

在一个具体的实施方案中，本发明提供了包括一种或多种固相表面的组合物，用于检测CEACAM4和选自下组CFLAR，DUSP1，ITGAX，RNF130，PSEN1，NKTR，RYBP，NAMPT，MAPK9，IFNGR1，RHEB，GZMK，RARA，SLC25A37，EPOR及RXRA的6个基因的基因表达水平。在另一个实施方案中，组合物包括一种或多种固相表面，用于检测CEACAM4和选自下组CFLAR，DUSP1，ITGAX，RNF130，PSEN1，NKTR，RYBP，NAMPT，MAPK9，IFNGR1，RHEB，GZMK，RARA，SLC25A37，EPOR及RXRA的7个基因的基因表达水平。在一个进一步的实施方案中，组合物包括一种或多种固相表面，用于检测CEACAM4和选自包含CFLAR，DUSP1，ITGAX，RNF130，PSEN1，NKTR，RYBP，NAMPT，MAPK9，IFNGR1，RHEB，GZMK，RARA，SLC25A37，EPOR及RXRA的组中的8个基因的基因表达水平。在另一个实施方案中，组合物包括一种或多种固相表面，用于检测CEACAM4和选自包含CFLAR，DUSP1，ITGAX，RNF130，PSEN1，NKTR，RYBP，NAMPT，MAPK9，IFNGR1，RHEB，GZMK，RARA，SLC25A37，EPOR及RXRA的组中的9个基因的基因表达水平。在另一个实施方案中，组合物包括一种或多种固相表面，用于检测CEACAM4和选自包含CFLAR，DUSP1，ITGAX，RNF130，PSEN1，NKTR，RYBP，NAMPT，MAPK9，IFNGR1，RHEB，GZMK，RARA，SLC25A37，EPOR及RXRA的组中的10个基因的基因表达水平。在一个进一步的实施方案中，组合物包括一种或多种固相表面，用于检测CEACAM4和选自包含CFLAR，DUSP1，ITGAX，RNF130，PSEN1，NKTR，RYBP，NAMPT，MAPK9，IFNGR1，RHEB，GZMK，RARA，SLC25A37，EPOR及RXRA的组中的11个基因的基因表达水平。在另一个实施方案中，组合物包括一种或多种固相表面，用于检测CEACAM4和选自包含CFLAR，DUSP1，ITGAX，RNF130，PSEN1，NKTR，RYBP，NAMPT，MAPK9，IFNGR1，RHEB，GZMK，RARA，SLC25A37，EPOR及RXRA的组中的12个基因的基因表达水平。在一个进一步的实施方案中，组合物包括一种或多种固相表面，用于检测CEACAM4和选自包含CFLAR，DUSP1，ITGAX，RNF130，PSEN1，NKTR，RYBP，NAMPT，MAPK9，IFNGR1，RHEB，GZMK，RARA，SLC25A37，EPOR及RXRA的组中的13个基因的基因表达水平。在另一个实施方案中，组合物包括一种或多种固相表面，用于检测CEACAM4和选自包含CFLAR，DUSP1，ITGAX，RNF130，PSEN1，NKTR，RYBP，NAMPT，MAPK9，IFNGR1，RHEB，GZMK，RARA，SLC25A37，EPOR及RXRA的组中的14个基因的基因表达水平。在进一步的实施方案中，组合物包括一种或多种固相表面，用于检测CEACAM4和选自包含CFLAR，DUSP1，ITGAX，RNF130，PSEN1，NKTR，RYBP，NAMPT，MAPK9，IFNGR1，RHEB，GZMK，RARA，SLC25A37，EPOR及RXRA的组中的15个基因的基因表达水平。在进一步的实施方案中，组合物包括一种或多种固相表面，用于检测CEACAM4，CFLAR，DUSP1，ITGAX，RNF130，PSEN1，NKTR，RYBP，NAMPT，MAPK9，IFNGR1，RHEB，GZMK，RARA，SLC25A37，EPOR及RXRA的基因表达水平。在某些实施方案中，总共17个基因的表达水平被检测。在另一个实施方案中，组合物包括一种或多种固相表面，用于检测CEACAM4，CFLAR，DUSP1，ITGAX，NAMPT，NKTR，PSEN1，EPOR，GZMK，RARA，RHEB及SLC25A37的基因表达水平。

用于AR和No-AR分类的基于相关的算法软件

本文所述的基于相关的分析可在AltAnalyze 2.0.8或更晚版本中进行。LineageProfiler可通过开放源代码软件AltAnalyze(http://code.google.eom/p/altanalyze/downloads，2.0.8或更高版本)中的图形用户界面且作为独立的python脚本(https://github.com/nsalomonis/LineageProfiler Iterate)获得。

AltAnalyze可从http://www.altanalyze.org下载，提取到硬盘驱动器中，并使用最新的人类数据库(目前为EnsMart65，初次启动后遇提示时选择)进行安装。或者，LineageProfiler功能可以通过使用该软件的命令行版本连同基因模型发现选项(可在https://github.com/nsalomonis/LineageProfiler Iterate获得)来执行。LineageProfiler的独立图形用户界面版本以及命令行版本的运行说明在http://code.google.com/p/altanalyze/wiki/SampleClassification进行描述。为了用于本文所述的实施方案，LineageProfiler的源代码被进行了修改，结果产生了LineageProfiler迭代(LineageProfiler Iterate)。如本文所用，LineageProfiler Iterate，改良的LineageProfiler和kSAS可交换使用。kSAS的源代码在附录C中提供。该软件可用于将特定样品集的定量表达值归类为属于特定的疾病种类，表型或治疗范畴。简言之，该算法通过将特定样品的表达值输入集与2个或更多参考条件进行关联从而完成此任务。不是将样品直接与参考相关联，而是可以从模型文件中选择一个基因子集，之前使用属于未知分类的样品已证明其可产生高度的预测成功。该算法还可用于新数据以发现备选的或新的基因模型。

提供以下实施例用于说明目的。这些实施例旨在显示本发明的某些方面和实施方案，而不是用来以任何方式限制本发明。

实施例

实施例1：开发用于评估肾移植急性排斥的组合物和方法的研究设计

评估肾移植急性排斥(AART)的研究是全世界8个肾移植中心合作努力设计的，使用了来自438名成人和儿科肾移植患者的558例外周血(PB)样品以开发用于在不同年龄、不同免疫抑制状态以及接受移植中心特定程序治疗的受者中进行急性排斥(AR)诊断和预测的简单血液QPCR检测。

图1描述了在来自全世界8个移植中心的438名独立的成人/儿科肾移植患者中进行肾移植急性排斥评估(AART)的研究设计。埃默里，UCLA，UPMC，CPMC，UCSF和巴塞罗那提供成人样品，墨西哥和斯坦福提供儿科样品。对于AR QPCR分析，样品被分为4个队列：队列1 n＝143成人样品用于基因建模；队列2 n＝124成人/儿科样品用于独立AR验证；队列3 n＝191成人/儿科样品用于AR预测；队列4 n＝100成人/儿科样品用于最终AR分析锁定和临床转化。

血液样品是在临床随访过程中横断性地收集自移植受者，并与同时采集的移植肾活组织切片相匹配。参与AART研究的中心有斯坦福大学(Stanford，n＝162儿科样品)；墨西哥婴幼儿医院肾内科研究实验室(Mex；n＝23儿科样品)；埃默里大学，亚特兰大，乔治亚州，(Emory，n＝43成人样品)；加利福尼亚大学洛杉矶分校，洛杉矶，CA，(UCLA，n＝105成人样品)；匹兹堡大学，匹兹堡，PA(UPMC，n＝132)，加州太平洋医疗中心，旧金山，CA(CPMC，n＝37成人样品)；加利福尼亚大学旧金山分校，旧金山，CA(UCSF，n＝40成人样品)。在另外的实施方案中，移植中心在欧洲。在一个实施方案中，移植中心是Bellvitage大学医院，巴塞罗那，西班牙(巴塞罗那，n＝16样品)。样品被分为包含143例AR和No-AR成人样品的训练集(队列1)用于基因选择和模型训练，包含124例AR和No-AR成人(＞21岁)和儿科(＜21岁)样品的第一验证集(队列2)用于验证用于AR检测的基因，包含在活组织切片检查确认排斥之前和之后长达6个月内连续收集的191例成人和儿科样品的第二预测性验证集(队列3)用于评价AR预测。在微流体高通量富鲁达QPCR平台(Biomark，富鲁达公司，旧金山，CA)上同时检测组成这3个队列的血液样品中总共43个基因。用于非侵入性AR检测的最终的17基因肾AR预测分析在包含100例成人和儿科样品(队列4)的独立验证集中在ABI QPCR平台上使用新开发的数学算法(kSAS)被锁定(图1-研究设计，以及表4，表5，患者统计资料)。

表4：438名独立患者的统计资料

HLA＝人白细胞抗原；PRA＝群体反应性抗体；P＝儿科；A＝成人；UPMC＝匹兹堡大学医疗中心；UCLA＝加利福尼亚大学洛杉矶分校；CPMC＝加州太平洋医疗中心，Stanford U＝斯坦福大学，Emory U＝埃默里大学；CNI＝钙调神经蛋白抑制剂，DAC＝达利珠单抗，Thymo＝抗胸腺细胞免疫球蛋白，MMF＝霉酚酸酯；CS＝皮质类固醇。

表5：用于验证基因集的659例独立的儿科(n＝293)和成人(n＝366)样品的患者和样品统计资料

^aDac＝达利珠单抗；^bThymo＝抗胸腺细胞免疫球蛋白；^cCNI＝钙调神经蛋白抑制剂；^dMMF＝霉酚酸酯；^eCS＝皮质类固醇。

实施例2：血液样品

来自独立的儿科(移植时受者年龄＝0.8-21.9岁；n＝200)及成人(移植时受者年龄＝23-78岁；n＝315)肾移植受者的外周血样品(n＝518)被用于开发对活组织切片检查确定的急性肾移植排斥进行非侵入性诊断的通用外周血基因群组。在儿科队列的200例样品中，177例样品是之前作为一项NIH/NIAID资助的前瞻性多中心临床试验的一部分获得的，该临床试验从美国的12家移植中心招募了有和没有组织学分级的AR的患者(SNS01；NCT00141037；www.Clinical Trials.gov；Li，L.，et al.Am.J.Transplant.2012，12，2710-2718)。其余的23例样品专门为本研究从墨西哥婴幼儿医院肾内科研究实验室获得。在成人队列的315例样品中，样品从美国和欧洲的6家移植中心获得(n＝43：埃默里大学，亚特兰大，乔治亚州，外科(Emory)；n＝97：加利福尼亚大学洛杉矶分校，洛杉矶，CA，免疫遗传中心(UCLA)；n＝92：匹兹堡大学，匹兹堡，PA，E.Starzl移植中心(Pittsburgh)；n＝39：加州太平洋医疗中心，旧金山，CA(CPMC)；n＝23：加利福尼亚大学旧金山分校，旧金山，CA，肾脏科(UCSF)；n＝16：Bellvitage大学医院，肾移植中心单位，巴塞罗那，西班牙(巴塞罗那))。该研究经所有当地IRB委员会批准，并且所有患者通过知情同意书同意参与。

本研究中每例外周血样品均与同时(48小时内)收集的来自相同患者的肾移植物活组织切片配对。监测性活组织切片在所有患者移植时，移植后3、6、12及24个月，以及怀疑出现移植物功能障碍时获得。只要每个活组织切片检查都有确定的表型诊断，来自同一患者的多对外周血-活组织切片样品均被使用。每个活组织切片都由每个参与的临床基地的中心病理学医师依据班夫分类(Solez，K.et al.Am.J.Transplant.，2008，8，753-760；Mengel，M.et al.Am.J.Transplant.2012，12，563-570)进行打分。外周血-活组织切片对被分类为“急性排斥”(AR，n＝130)，“稳定的”(no-AR)或“其它”诊断(Other)。“急性排斥”被定义为样品的班夫肾小管损伤得分(t)≥1，且间质浸润得分≥0。“稳定的”被定义为样品未显示AR或其它任何实质性病理改变。“其它”被定义为样品未显示出班夫分级的AR，但是符合慢性移植损伤(CAI；样品IFTA等级≥1；n＝51)、慢性钙调神经磷酸酶抑制剂毒性(CNIT；n＝19)、BK病毒感染(BKV；n＝3)或其它移植损伤(OGI；n＝153)的班夫标准(标准与63段的不同)。

实施例3：患者

成人和儿科集I

表5显示成人和儿科集I。

在一个实施例中，组合的儿科和成人样品被分为两组进行测试(n＝236；143例成人，93例儿科)和验证(n＝292；208例成人，84例儿科，表5)。

成人和儿科集II

在另一个实施例中，组合的儿科和成人样品被分为三组进行训练和测试(n＝143例成人)，验证(n＝124；59例成人，65例儿科)和独立预测(n＝191；130例成人，61例儿科，表4)。

成人和儿科集III

在另一个实施例中，组合的儿科和成人样品被分为100例样品用于验证(77例成人，23例儿科，表4)。

实施例4：血液样品收集和RNA处理

血液样品收集

血液被收集于2.5mL PAXgene^TM血液RNA试管(PreAnalytiX，Qiagen，Valencia，CA)或Ficoll试管用于分离外周血淋巴细胞(PBL)。PBL样品仅用于在Affymetrix系统上进行微阵列发现。对于PAXgene^TM试管使用PreAnalytix的基于柱的方法试剂盒(Qiagen)，或对于PBL样品使用RNeasy(Qiagen)，依据制造商的实验程序提取总RNA。

RNA提取

使用RNA 6000 Nano试剂盒在2100 Bioanalyzer(均来自安捷伦科技，圣克拉拉，CA)上检测总RNA的RNA完整性，适合的RNA被定义为RNA完整性数值(RIN)超过7(Fleige，S.and Pfaffl，M.W.Mol.Aspects.Med.2006，27，126-139.；Schroeder，A.etal.BMC Mol.Biol.2006，7，3)。

cDNA合成

使用250ng从外周血样品中提取的高品质mRNA，使用II第一链cDNA合成试剂盒(英潍捷基，卡尔斯巴德，CA)依据制造商的实验程序进行cDNA合成。

实施例5：QPCR

微流体QPCR的总RNA样品制备

用于微流体qPCR的样品依据富鲁达公司的实验程序(富鲁达，南旧金山，CA)制备，使用1.52ng(相对量)来自cDNA合成的总RNA用于特定靶基因扩增和样品稀释，对除18S外的每个待研究基因使用合并的单个ABI Taqman检测。简而言之，在合并的多通道Taqman检测中使用1.52ng cDNA与Taqman PreAmp Master混合物(ABI)在5μL终体积中对特定靶基因进行扩增。在热循环仪(Eppendorf Vapo-Protect，汉堡，德国)中进行18个循环之后扩增即完成。样品随后用无菌水(Gibco，Invitrogen，Carlsbad，CA)进行1∶5稀释。

QPCR

微流体qPCR在96.96动力学阵列(富鲁达)上进行，使用2.25μL来自特异靶基因扩增的稀释样品，以及针对每条mRNA的Taqman检测(应用生物系统公司，福斯特城，CA)，Taqman Universal master混合物(应用生物系统公司)和上样试剂(富鲁达)，如制造商的实验程序中所列举。通过HX IFC Controller(富鲁达)准备和装载芯片，而qPCR在BioMark(富鲁达)中进行，使用系统默认参数收集基因表达数据，如制造商的实验程序(富鲁达)中所示。标准比较Ct值被用于确定基因表达的相对倍数变化值，使用18S作为内部内源性对照参考以及通用人总RNA作为外部比较参考(Qiagen，芬洛，林堡)。

ABI QPCR

在ABI 7900序列检测系统或ViiA7(应用生物系统公司)上进行的qPCR反应遵循标准程序，使用标准条件(95℃10分钟，40个如下循环：95℃15秒，60℃30秒)和基因表达检测(应用生物系统公司)。使用比较Ct方法计算RNA表达的相对量。使用核糖体RNA内源性参考和通用人总RNA将表达值相对于18S进行标准化。

实施例6：数据预处理和标准化

微流体QPCR数据/预处理和标准化

使用富鲁达高通量微流体qPCR技术对来自236例成人和儿科样品的RNA进行42，792个qPCR反应以检测43个基因的较大基因群组的表达所得到的未加工Ct值收集自六个96.96微流体芯片(富鲁达)。Ct值通过富鲁达实时PCR分析软件提取并上传至Excel(Microsoft Office 2012，微软公司，CA)。如果平行测值的标准偏差＜0.5则计算技术性平行测值的平均Ct值。使用ΔCt(dCt)方法(Livak，K.J.and Schmittgen，T.D.Methods2001，25，402-408)将Ct值相对于内源性对照基因进行标准化。四个不同的对照基因，核糖体18S，β肌动蛋白(ACTB)，磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)，和β2微球蛋白(B2M)被检测。因为18S在所有样品中表现出最小的变异性，它被选择用于计算dCt值。缺失值通过K最邻近结点(KNN；Troyanskaya，O.et al.Bioinformatics2001，17，520-525)与5个邻近结点一起被输入。未加工qPCR数据的可视化在Partek基因组学套件v.6.6(Partek公司，USA)中使用无监督主成分分析(PCA)和分级聚类来实现。影响基因表达的混淆因素由PCA和方差分析(ANOVA)确定，并且通过Partek中的批次效应去除(混合模型ANOVA结合分类和数值因素)以及通过使用经验贝叶斯方法与SVAR软件包中的combat函数进行校正。该方法对于小样本中的离群值很稳健(Chapelle，O.，Haffner，P.，and Vapnik，V.N.IEEE Trans.Neural Netw.1999，10，1055-1064)。43基因的较大群组的标准化表达数据随后被用于鉴定AR和no-AR之间的差异表达基因，以便更好的理解不同年龄组AR的机制及选择对于AR预测力、敏感性和特异性最高的基因，如下所示。

使用Partek中的批次效应去除校正微流体QPCR数据中的混淆因素。

在包含143例AR和no-AR样品的成人数据集中，RNA来源、PCR板以及移植中心的外部效应对样品间差异基因表达的技术影响在混合ANOVA模型中被评价。RNA来源、PCR板和移植中心作为随机分类因素被纳入，而表型(AR，no-AR)作为分类因素被纳入。计算每个因素的p值，且p值＜0.05即表明特定基因的差异表达与纳入ANOVA的任何一个因素有关。Partek中的批次效应去除特性，基于ANOVA模型，最初设计用于在微阵列芯片分不同批次进行杂交时去除微阵列数据中差异基因表达的影响。随后，该特性通过建立混合四因素ANOVA模型，调整数据使RNA来源、PCR板和移植中心的p值成为1，从而用于校正RNA来源、PCR板和移植中心这些多余的随机因素。以这种方式，由于这些因素的基因表达无差异被显示，而表型p-值被最大化(图11 A-D)。

对来自143例AR和No-AR成人样品(队列1)中43个排斥基因的QPCR数据的主成分分析(PCA)显示样品离析是由样品收集地点(图11A)而不是表型(图11B)造成的。通过混合ANOVA对QPCR数据进行标准化矫正了样品收集地点对于基因表达的显性效应(图11C)且导致样品离析为AR和No-AR(图11D)。使用相对基因表达值(dCt 18S)对43个基因进行PCA。将样品收集地点，RNA来源和芯片作为随机分类因素并将表型作为分类因素建立混合ANOVA模型。每个球代表一个样品；符号表示样品收集地点(*＝UPMC；A＝UCLA；X＝CPMC；#＝EMORY)；本图还反映出基于活组织切片诊断的患者表型(AR；No-AR)。

使用R中的经验贝叶斯方法校正微流体QPCR数据中的混淆因素

在包含143例AR和NO-AR样品的成人数据集中进行变量选择之前，使用经验贝叶斯方法与SVA R软件包中的combat函数对这43个基因的表达进行标准化从而去除批次效应。该方法对于小样本中的离群值很稳健

Abi QPCR数据的处理和标准化

使用来自100例成人和儿科样品的RNA所进行的检测17个基因表达的ABI QPCR反应所得到的未加工Ct值收集自384孔板。Ct值通过ABI viia7PCR分析提取并被上传至Excel(Microsoft Office 2012，微软公司，CA)。如果平行测值的标准偏差＜0.5则计算技术性平行测值的平均Ct值。使用此次所述方法(Livak，K.J.and Schmittgen，T.D.Methods2001，25，402-408)，将Ct值相对于作为内源性对照基因的核糖体18S RNA进行标准化从而计算ΔCt(dCt)，并额外相对于人通用RNA(Qiagen)进行标准化从而计算ΔΔCt(ddCt)。

实施例7：选择AR和No-AR特异性基因的方法

总共43个基因被用于挑选AR和No-AR特异性基因。基于之前在儿科和成人移植排斥中的微阵列研究(Li，L.et al.Am.J.Transplant.2012，12，2710-2718；Naesens，M.etal.Kidney Int.2011，80，1364-1376；Sarwal，M.et al.N.Engl.J.Med.2003，349，125-138)，基因被确定与稳定的移植物相比其被差异化改变并与AR相关(表2)。在这总共43个基因中，10个基因(CFLAR，DUSP1，IFNGR1，ITGAX，MAPK9，NAMPT，NKTR，PSEN1，RNF130和RYBP)在之前专注于儿科肾移植中AR预测模型的开发的工作(Li，L.et al.Am.J.Transplant.2012，12，2710-2718)中被确认。其余33个基因，如微阵列数据的荟萃分析所确定，在不同类型的实体器官移植中与稳定的移植物相比在AR中被差异化改变(Khatri et al.JEM，2013，被接受用于发表)。

实施例8：确定AR和No-AR之间差异表达基因的方法

单或多因素ANOVA，非配对学生t检验在方差显著不齐的情况下使用Welch矫正，以及计算错误发现率(FDR)以校正多重比较被用于检测AR和No-AR之间显著性差异表达的基因，并用于帮助理解不同年龄组中AR的机制；p值＜0.05或FDR＜5％被认为有统计学差异(图12)。

实施例9：鉴别AR和No-AR的基因的确定方法

在143例成人样品中评价之前发表的基因

来自43基因的更大群组的之前发表的10基因群组(CFLAR，DUSP1，IFNGR1，ITGAX，MAPK9，NAMPT，NKTR，PSEN1，RNF130和RYBP；Li，L.et al，Am.J.Transplant 2012，12，2710-2718)被用于在143例样品的成人测试数据集中鉴别和预测AR表型(图12)。

在236例成人和儿科样品中确定新基因

为了确定不依赖与年龄、移植中心和RNA来源并且使用最少基因却对于AR具有高度预测力的新基因群组，收缩质心(Tibshirani，R.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2002，99，6567-6572；Storey，J.D.and Tibshirani，R.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2003，100，9440-9445)，前向和后向选择，以及遗传算法(Zhu，Z.et al，IEEETrans.Syst.Man.Cybern.B Cybern.2007，37，70-76)被应用于236例成人和儿科组合数据集。此外，穷举搜索通过搜索在236例样品中分析的43个基因中的所有可能的5基因组合，被用于确定排序最靠前的基因。在收缩质心方法中，通过每次增加1个基因，最小基因数设为5而最大基因数设为20，对43个基因中所有可能的基因组合进行测试。通过交叉验证(1-LLOCV)测试基因的AR预测概率。使用117中不同的算法对总共1872个模型进行了测试。依据基因数对结果进行排序，并对从5基因到43基因不等的相同基因组合的AUC取平均值。结果平均AUC最高的组合被选出。在前向选择(增加)和遗传算法中，数量增加的基因群组被测试：n＝5，7，10，12，13，15，17，和20使用如上所述的117种不同算法被各个测试。将结果进行比较并选出了最终的基因，其在至少50％的模型中进行选择。在遗传算法中，从中随机选出一个基因组群的初始群体被定义为每个基因至少被测试50次。以下群体被测试：对n＝5，7，10，12，13，17，和20的基因群组分别测试430，308，215，180，166，127，和108的群体，依据方程：

$N=\frac{43*50}{n}$

其中N为初始群体大小，n为基因群组大小，50代表一个基因必须出现在初始群体中的次数，而43为从中得到的总基因数(图12)。

在143例成人样品中确定新基因

在变量选择之前，通过使用经验贝叶斯方法与SVA R软件包中的combat函数去除批次效应从而对基因进行标准化。该方法对于小样本中的离群值很稳健。因为只有143个观察值和43个基因的数据不足，我们使用了惩罚逻辑回归以使用glmnet R软件包对患者样品进行分类。该方法不仅为回归系数提供了精确的估计值而且为每个患者提供了概率估计值。通过估计值的坐标下降法我们对广义线性模型使用正则化路径(图12)。

实施例10：鉴别AR和No-AR的基因的评价方法

通过具有相等或成比例的先验概率的判别分析(DA)，支持向量机(SVM)，逻辑回归(LR)以及相等先验概率的偏最小二乘法DA(Chapelle，O.et al，IEEE Trans.NeuralNetw.1999，10，1055-1064；Brown，M.P.et al，Proc.Nat.Acad.Sci.2000，97，262-267)，核函数径向基函数(rbf)，偏最小二乘法(pls)DA(Perez-Enciso，M.and Tenenhaus，M.Hum.Genet.2003，112，581-592；Gottfries，J.et al，Dementia 1995，6，83-88)，评价基因选择对AR的鉴别和预测。SVM分类使用正则化路径径向基函数(rbf)来发现最佳的广义非线性向量(“支持向量”)，其定义通过同时最小化经验分类错误和最大化几何间隔从而提供AR和no-AR的最远地分开的决策平面。SVM对于特征(基因)和样品数量不足的数据集表现良好(Nouretdinov，I.et al，Neuroimage2011，56，809-813)。为了最小化1型错误，十倍的一级留一法交叉验证(1-LLOCV)被执行而不是将数据集分为单独的训练和测试集。对于每种分类方法，给出曲线下面积(AUC)和AR的后验概率以评估在成人和儿科组合数据集中这些基因对AR的预测能力、敏感性和特异性。将来自每种基因选择方法的对AR预测能力最高、敏感性最高以及特异性最高的基因进行比较以最终选出用于ABI平台(Abi viia7，生命技术公司，福斯特城，CA)qPCR的17个基因。用于比较AR和no-AR的学生T检验及ANOVA的p值和FDR值在需要时被使用。最终基因选择的工作流程如图12所示。

实施例11：在富鲁达QPCR数据中用于对AR和no-AR进行分类的算法的开发方法

在236例儿科和成人样品中使用17基因的算法的鉴定

使用选出的基因(共17个)通过二级留一法嵌套交叉验证(2-LLOCV)及5外部和5内部数据拆分对总共122种分类算法进行测试。进行“内部”交叉验证(CV)以选出预测变量和最佳模型参数，而“外部”CV被用于为分类器产生总体精度估计。“内部”CV在未被外部CV留存为检测数据的训练数据中进行以选出用于留存测试集的最佳模型。在236例样品中测试的分类模型包括判别函数和相等或成比例先验概率，使用欧氏距离、平均欧氏距离或余弦相异距离测度及5个邻近结点的KNN，使用相等或成比例先验概率的最近质心，LR，以及SVM。

在143例成人样品中使用17基因的算法的鉴定

在143例成人样品中使用选出的基因(共17个)通过二级留一法嵌套交叉验证(2-LLOCV)及10外部和10内部数据拆分对总共122种分类算法进行测试。进行“内部”交叉验证(CV)以选出预测变量和最佳模型参数，而“外部”CV被用于为分类器产生总体精度估计。“内部”CV在未被外部CV留存为检测数据的训练数据中进行以选出用于留存测试集的最佳模型。在143例样品中测试的分类模型包括使用相等或成比例先验概率的偏最小二乘法及线性判别分析，支持向量机，使用欧氏距离、平均欧氏距离或余弦相异距离测度及5个邻近结点的KNN，使用相等或成比例先验概率的最近质心，以及LR。在143例样品中使用1-LLOCV对顶级模型进行评价。精度的检测有正确率、敏感性、特异性、NPV、PPV以及受试者工作曲线(AUC)。

在143例成人样品中使用15基因的算法的鉴定

我们通过使用自助样品(29例测试，114例训练，回置抽样)使100个弹性网逻辑回归模型与43基因相适应，从而分类AR对比No-AR。对于每个自助模型，嵌套交叉验证环依据偏差估算出λ的最佳值。弹性网的α参数固定为推荐值.95。为了对基因进行排序，我们计数了每个基因在100个自助模型中被弹性网选出的次数。对于每个自助样品，弹性网为43个基因的子集提供非零系数。运行过100个自助模型之后，我们选出有最大数量非零系数的K基因。第二步，为了得到预测性能(分类率、敏感性、特异性、PPv、NPv)的无偏估计，我们运行另一个集合的100个自助弹性网分类，使用嵌套交叉验证估算λ，这次仅使用步骤1中选出的K基因集。我们报告了分类率、敏感性、特异性、阳性预测值(PPv)和阴性预测值(NPv)。

实施例12：在富鲁达和ABI QPCR数据中用于对AR和no-AR进行鉴别和预测的算法的开发方法

基于相关的AR和No-AR分类的开发

为了计算每个患者样品的皮尔逊相关系数(ρ)，查询样品的ΔCt值被用于与AR或no-AR分类样品的平均基因ΔCt值相比较。

为了计算每个患者样品的皮尔逊相关系数(ρ)，查询样品的ΔΔCt值被用于与AR或no-AR分类样品的平均基因ΔΔCt值相比较。

对于每个样品ρ计算Z得分，相对于来自所有样品比较的所有ρ值的平均值(μ)和标准偏差(σ)，如下：

$z=\frac{x-{\mathrm{\μ}}_{global}}{{\mathrm{\σ}}_{global}}$

基于样品AR和no-AR的z得分的比较(AR还是no-AR中z更大)将样品分为AR或no-AR。这些功能可以在AltAnalyze中的LineageProfiler Iterate.py模块中找到。

在适用情况下，对所有可能的4，5，6，7，8，9，10，11和12基因集组合进行相关性分析。当比较不同大小的基因集时，基于总样品中被正确分类的患者样品的百分比对ABI分析的最佳报告模型进行打分。

将LineageProfiler开发为基于相关的算法用于AR和No-AR分类

一个新的基于相关的，开放源代码的名为LineageProfiler(LP)的算法被使用，且被进一步改良以发现用于进一步qPCR评价的最佳基因模型。LP的输入为ΔΔCt标准化得患者样品qPCR值和两个参考qPCR配置文件(一个AR参考配置文件和一个no-AR参考配置文件)。该分析包括5个步骤：步骤1：为待评价的基因群组导入RNA表达值；步骤2：对每个基因，创建并保存一个来自所有AR样品的参考表达载体(均值)和一个来自所有no-AR样品的参考表达载体；步骤3：对于每个qPCR集(基因集)确定所有可能的所分析基因的组合；步骤4：对每个基因集，直接将每个患者的RNA特征与参考AR特征和参考no-AR特征进行比较从而对患者样品进行分类(使用LP)；步骤5：基于已知的AR和no-AR状态对基因集进行排序从而为相关的参考特征确定顶级预后列表。对于每个不同的检测平台(富鲁达或ABI)以及所有可能的组合，创建了来自这17个基因的不同长度的基因集，从4到12基因。对于富鲁达分析，优化函数被写出，其迭代的确定从所有基因开始的得分最高的模型，并进一步分析所有随后推导出的模型。表现最好的基因集被确定后，这些基因集被固定并应用于不同的验证数据集。对具有相应的参考表达特征的现有或新数据集的分析可以在开放源代码软件AltAnalyze版本2.0.8(http://www.altanalyze.org)中使用LP功能实现(图4A-B)。

开发基于相关的算法kSAS用于AR和No-AR分类

对于样品AR或No-AR的稳健风险分层，新的基于相关的算法kSAS被开发出来。不同于通过例如经验贝叶斯方法和ANOVA这些在对大数据集进行评价时适用于发现和交叉验证分析的方法对外部混杂因素进行校正，kSAS被开发以将固定的AR和No-AR的QPCR参考配置文件应用于17基因群组，从而可以不依赖于数量和样品采集位点而对样品进行准确的前瞻性预测，因此其更适合用于常规临床设置。kSAS在患者样品及两个参考QPCR配置文件(一个针对已知的AR，一个针对已知的No-AR)中使用QPCR dCt(18S)。kSAS分析包括用于训练和测试的5个主要步骤：1)为所有样品输入17基因dCt(18S)表达矩阵，2)为每个基因定义已知的AR和No-AR表达载体；3)使用迭代的确定从所有基因开始的得分最高的模型的的优化函数来确定所有可能的基因组合4)将针对每个患者所产生的所有模型与参考AR和No-AR配置文件进行比较从而根据相关程度(皮尔逊相关系数)对患者样品进行分类；5)根据相关性对基因集进行排序从而确定排名最高的预后模型。为了计算每个患者样品的皮尔逊相关系数(ρ)，我们将查询样品中的每个基因的dCt(18S)值与AR或No-AR参考中相同基因的平均dCt(18S)值进行比较。对于每个产生的基因模型，通过计算ARρ减去No-ARρ乘以10计算风险得分。将所有产生的模型的风险得分求和从而为每个模型提供合计AR风险得分。根据对样品AR与No-AR风险得分的比较(在AR还是No-AR中相关性更大)，样品被分类为AR或No-AR。对于所有可能的4，5，6，7，8，9，10，11和12基因集组合进行相关性分析。当比较不同大小的基因集时，根据总样品中被正确分类的患者样品所占的百分比对最佳报告模型进行打分。示例性基因集列于表2中。为了解决AR和No-AR配置文件中收集地点相关的变异，在计算每个模型的相关性衍生风险得分时，在一个单独表格中提供了每个收集地点的各自的AR和No-AR参考，以选出用于每个个体样品比较的相关性最高的地点参考对(图9A-C)

创建新的参考数据用于基于相关性的AR和No-AR分类

为了对一个新的移植中心使用参考，以与未知样品相同的方式收集的分类为AR或no-AR的血液，在分析未知样品之前应该被收集并使用推荐的12基因模型集(如下)进行分析。由于机器和样品收集中心偏差之前已被观察到，因此将这些样品作为移植中心特异的参考。得到足够数量的样品的qPCR特征之后，所有AR和no-AR样品的平均表达被分别采纳以创建所有分析基因的双栏参考。或者，使用合并的RNA参考而不是单个样品应该是足够的。数据被保存为三栏制表符分隔的文本文件，第一栏包含基因ID，而第二栏和第三栏分别包含AR和no-AR参考。首先推荐对用于此参考的原始样品进行重新分析以确定这些参考样品中是否存在显著变异(例如，AR和no-AR样品之间分类得分较低)。

实施例13：在富鲁达和ABI QPCR数据中鉴别和预测AR和No-AR的基于相关性的算法的评价方法

在非移植数据中评价kSAS

在将kSAS运用于AR和No-AR患者数据之前，基于之前所述的对用于814例GEICAM/9906临床试验样品的50个乳腺癌预后标志基因的QPCR分析，我们对该方法进行了评价。kSAS可以根据在其余样品上创建的参考(训练)，成功的将随机选出的患者测试集(272例患者样品)分类为五个不同预后的乳腺癌组，使用全部50个标志基因的成功率＞85％。24和25基因的较小预后基因模型也可以更高的百分比在训练集中(90.0％对比85.6％)以及相等的精确度在测试集中(83.1-83.8％)对患者进行分类。

在143例成人富鲁达QPCR数据中评价kSAS

我们在143例成人样品(队列1)的相同标准化数据集中评价kSAS。全部43个基因的参考AR和No-AR配置文件从来自队列1的随机2/3训练样品集中获得。而后该训练集进一步通过程序被再分为10个AR/No-AR相同大小2/3和1/3集以确定得分最高的基因模型。使用训练集AR和No-AR参考配置文件，在原始的1/3训练集上对来自该训练集的得分最高的模型进行评价。

在100例成人和儿科ABI viia QPCR数据中评价kSAS

我们评价了kSAS所确定的所有13个12基因模型的组合能力从而为每个患者提供一个单独的置信度，其不是基于100例成人和儿科样品中的单个基因模型而是包括所有13个12基因模型。我们计算100例AR和No-AR样品(26例AR，42例No-AR)的组合数据集的合计AR风险得分。合计AR风险分析为每个患者产生一个数值的AR风险得分(-13到13)，通过从患者被13个12基因模型预测为AR的次数中减去同一患者被预测为No-AR的次数。根据合计AR风险得分患者可以被分为高风险AR，低风险AR或不确定风险。高风险AR的界线为合计得分≥9，低风险AR的界线为合计得分≤-9。合计得分≥-7且≤7的患者被认为处于不确定风险(图9C)

实施例14：用于AR和No-AR分类的基于相关性的算法软件的开发方法

本文所述的基于相关性的分析可以在AltAnalyze版本2.0.8或更晚版本中进行。LineageProfiler可通过开放源代码软件AltAnalyze(http://code.google.eom/p/altanalyze/downloads，2.0.8或更高版本)中的图形用户界面且作为独立的python脚本(https://github.com/nsalomonis/LineageProfiler Iterate)获得。

AltAnalyze可从http://www.altanalyze.org下载，提取到硬盘驱动器中，并使用最新的人类数据库(目前为EnsMart65，初次启动后遇提示时选择)进行安装。或者，LineageProfiler功能可以通过使用该软件的命令行版本连同基因模型发现选项(可在https://github.com/nsalomonis/LineageProfiler Iterate获得)来执行。LineageProfiler的独立图形用户界面版本以及命令行版本的运行说明在http://code.google.com/p/altanalyze/wiki/SampleClassification进行描述。为了用于本文所述的实施方案，LineageProfiler的源代码被进行了修改，结果产生了LineageProfiler迭代(LineageProfiler Iterate)。如本文所用，LineageProfiler Iterate，改良的LineageProfiler和kSAS可交换使用。kSAS的源代码在附录C中提供。该软件可用于将特定样品集的定量表达值归类为属于特定的疾病种类，表型或治疗范畴。简言之，该算法通过将特定样品的表达值输入集与2个或更多参考条件进行关联从而完成此任务。不是将样品直接与参考相关联，而是可以从模型文件中选择一个基因子集，之前使用属于未知分类的样品已证明其可产生高度的预测成功。该算法还可用于新数据以发现备选的或新的基因模型。

在kSAS中使用ΔCt值(dCt)对AR和No-AR进行分类的表达文件的开发

使用由qPCR得出的一组AR和No-AR鉴别基因以及对照18S基因的表达值进行AR分类。在ABI viia7平台上进行qPCR所产生的ΔCt值(相对于18S)被用作该算法的未知样品输入。此外，包含参考AR和参考no-AR特征(dCt)的参考文件也被提供给软件。

在kSAS中使用ΔCt值(dCt)进行AR和No-AR分类所需表达文件的开发

使用由QPCR得出的一组AR和No-AR鉴别基因以及对照18S基因的表达值进行AR分类。在ABI viia7平台上进行QPCR所产生的相对于18S和通用人RNA的ΔΔCt值被用作该算法的未知样品输入。此外，包含参考AR和参考no-AR特征(ddCt)的参考文件从QPCR数据中产生。

生成在kSAS中使用ΔCt值进行AR分类所需的表达文件

表达文件包含标准化表达值(qPCR ΔCt值)，使用制表符分隔的文本文件格式，文件扩展名为.txt。该文件的第一栏包含与参考文件第一栏相匹配的ID(基因符号)，第一行包含样品名称，其余数据包含标准化表达值(即ΔCt值)。

参考文件是与表达文件中数值范围相同的AR和no-AR qPCR ΔCt值的汇聚。该文件中所有基因符号应该与出现在表达文件中的基因符号相匹配。运行软件时，如果参考和表达文件中的值整体相关性低(＜90％)则会给出警告。理想的，相关系数的报告范围应该为0.92-0.96或更大。如果它们不在此范围，实验则需重复或评估额外的质量控制。

生成在kSAS中使用ΔΔCt值进行AR分类所需的表达文件

表达文件包含标准化表达值(qPCR ΔΔCt值)，使用制表符分隔的文本文件格式，文件扩展名为.txt。该文件的第一栏包含与参考文件第一栏相匹配的ID(基因符号)，第一行包含样品名称，其余数据包含标准化表达值(即ΔΔCt值)。

参考文件是与表达文件中数值范围相同的AR和no-AR qPCR ΔCt值的汇聚。该文件中所有基因符号应该与出现在表达文件中的基因符号相匹配。运行软件时，如果参考和表达文件中的值整体相关性低(＜90％)则会给出警告。理想的，相关系数的报告范围应该为0.92-0.96或更大。如果它们不在此范围，实验则需重复或评估额外的质量控制。

在kSAS中通过图形用户界面使用kSAS进行AR和No-AR分类

该算法还可以在开放源代码的分析软件包AltAnalyze中获得，其不需要任何依赖安装。AltAnalyze是一个大型转录组分析工具包，其包含许多不同的分析函数。因为AltAnalyze需要安装大数据库并且包含大量菜单，因此建议使用该脚本的命令行版本。

为了安装当前版本的AltAnalyze，应遵循以下五个步骤：1)访问http://code.google.eom/p/altanalyze/downloads；2)查找最新的适合特定操作系统的版本并追踪下载链接；3)提取.zip或.dmg文件至硬盘驱动器及可访问的位置；4)打开AltAnalyze程序文件夹并双击可执行文件AltAnalyze.exe(Windows)或等价文件；5)继续下载小数据库(例如，玉米)并取消选择“下载/更新全部基因集分析数据库”的选项(提供的基因注释对于样品分类没有必要)。

输入文件包含未知样品的表达文件。参考文件包含参考AR和No-AR样品的表达文件。

模型文件包含与参考和表达输入文件中的基因符号都匹配的基因符号，但是相当于基因集的子集。标准AR分类群组包含13个12基因模型。该文件可以重复用于每个分析。

kSAS的输出为制表符分隔的文本文件，包含与所有参考特征相关的得分。产生该该结果文件用于对训练集样品的分析。

通过命令行选项使用kSAS进行AR和No-AR分类

一旦LineageProfiler Iterate/kSAS被下载后，应当将它移动至易于访问的位置。然后，应打开终端窗口(在个人电脑上也被称为命令提示)。打开终端或命令提示窗口的说明很容易的在网上找到。然后，在终端窗口中，应访问包含LineageProfiler Iterate/kSAS脚本的文件夹的目录。

生成三个文件：输入文件，参考文件，及模型文件。

为了分析ΔCt表达值，为LineageProfiler Iterate/kSAS提供包含ΔCt值的三个文件的位置用于输入和参考文件。命令-i用于样品ΔCt表达值。命令-r用于参考表达文件。命令-m用于提供的十三个12基因模型。输入该命令后，会看到不同的打印输出。现在可以将结果保存至指定的结果目录。

为了分析ΔΔCt表达值，为LineageProfiler Iterate/kSAS提供包含ΔΔCt值的三个文件的位置用于输入和参考文件。命令-i用于样品ΔΔCt表达值。命令-r用于参考表达文件。命令-m用于提供的十三个12基因模型。输入该命令后，会看到不同的打印输出。现在可以将结果保存至指定的结果目录。

在AltAnalyze中运行kSAS

使用以上步骤安装AltAnalyze之后，即可运行对输入数据的分析。为此，需要合适的表达、参考和模型文件。

为了使用ΔCt值运行kSAS，可以遵循以下6个步骤：1)打开AltAnalyze并选择“开始分析”；2)在平台分析菜单中选择“继续”；3)选择“附加分析”并继续；4)选择“谱系分析”并继续；4)提供表达文件(dCt)，参考文件(dCt)及模型文件，并继续；5)分类分析的进度会被打印输出；和6)结束时，选择继续，结果文件夹就会出现在表达文件的位置。

为了使用ΔΔCt值运行kSAS，可以遵循以下6个步骤：1)打开AltAnalyze并选择“开始分析”；2)在平台分析菜单中选择“继续”；3)选择“附加分析”并继续；4)选择“谱系分析”并继续；4)提供表达文件(ddCt)，参考文件(ddCt)及模型文件，并继续；5)分类分析的进度会被打印输出；和6)结束时，选择继续，结果文件夹就会出现在表达文件的位置。

对kSAS中生成的结果的解读

结果文件在样品分类文件夹中，其中会出现多个字段。制表符分隔的文本文件可在Excel中打开。结果显示如下：

A栏：样品——显示样品名称

B栏：AR预测采样数——显示预测AR的模型数量

C栏：No-AR预测采样数——显示预测no-AR的模型数量

D栏：综合预后得分——B-C栏的综合得分

E栏：中位Z得分差异——G-S栏的中位Z得分。

F栏：预后风险——整体预测风险评估

G-S栏：AR预测采样数——每个样品和模型的单独得分。

预后风险(F栏)将样品标为“高风险AR”，“不确定风险AR”和“低风险AR”。“低风险AR”被认为与组织学证实稳定移植的个体最相似，而“高风险AR”与活组织切片检查证实的AR移植最相似。不确定风险被分配给在预后评价方面13个模型之间有任何不一致的样品。

在来自UCSF的40例样品中，一个样品，活组织切片检查证实的AR，在总共13个基因集中有8个基因集预测为AR而5个基因集预测为no-AR，每个基因集由12个基因组成。因此，该样品被认为处于不确定风险。

实施例15：成人和儿科AR与No-AR之间差异表达的基因

在236例成人和儿科AR与No-AR样品之间差异表达的基因

为了确定能区分成人和儿科AR与no-AR患者并为AR的非侵入性检测提供稳健的生物标志物的基因，在富鲁达微流体高通量qPCR平台(BioMark，富鲁达公司)上同时检测了来自成人和儿科患者的236例血液样品中上述43个基因(42个基因加上持家基因核糖体RNA18S)的表达。用无监督PCA和ANOVA进行评价时，发现患者接受移植的特定移植中心(“中心”)，超过排斥状态，是整个排斥状态中造成患者离析(segregation)的最大变量。通过无监督PCA，发现因为移植中心而离析的样品在不正确的数据集中克服了由表型(AR对比no-AR)推断出的基因表达差异。使用混合ANOVA模型对数据进行校正，其将移植中心、RNA来源和qPCR芯片纳入作为要去除的随机分类因素而将表型(AR，no-AR)作为要保留的分类因素，导致基因表达不是因为移植中心而将样品离析，而是根据表型而将样品离析。分析该标准化集显示这些基因的一个大的子集在AR和no-AR之间差异表达(学生T检验：n＝32，p＜0.05)。

267例成人和儿科AR与No-AR样品之间差异表达的基因

共有31个基因在267例成人和儿科AR与No-AR样品之间差异表达(队列1，n＝143；队列2，n＝124；FDR＜5％，使用Bonferroni事后检验进行ANOVA)。有趣的是，8/10基因儿科群组在成人样品中有显著性差异(p＜0.05)

实施例16：使用10基因对AR和No-AR样品进行分类

使用10基因通过支持向量机对AR和No-AR样品进行分类

为了评价在收集中心、性别、血液RNA样品来源以及受者年龄不同的各种情况下将这些基因集用于AR分类的潜在有效性，可在Partek和R中获得的两种不同分类方法被使用。Partek中的SVM算法(成本参数c＝701，核函数＝径向基函数指数(-Y||x-y||^2)其中Y＝3)以及R中使用弹性网的惩罚逻辑回归，被用于将样品分类为AR或no-AR。这两种分类算法都是二进制的分类器，并且SVM被设计为使间隔最大化以使两类分开，因此训练模型可以很好的推广至不可见数据而不对数据过度拟合。然而，SVM为非概率分类器并且不提供单个预测精度得分。逻辑回归为每个样品提供预测概率得分。这些方法通过使用之前发表的10基因儿科模型(CFLAR，DUSP1，IFNGR1，ITGAX，MAPK9，NAMPT，NKTR，PSEN1，RNF130及RYBP)被用于中心标准化数据，该模型之前在儿科和年轻成人血液样品中被验证可用于AR检测(检测AR的精确度为92％，敏感性为91％，特异性为94％)，该验证使用了143例成人AR(n＝47)和no-AR(n＝96)样品的测试集并有匹配的活组织切片检查阅读以及临床功能。使用上述的SVM，相同的10基因应用于143例样品的成人数据集中时在成人中检测AR的精确度为87％，敏感性为70％，特异性为96％。

使用10基因通过逻辑回归在AR活组织切片之前长至6个月及之后1个月的儿科样品中检测AR

来自儿科移植受者的连续样品可获得自40名经活组织切片检查证实为AR的患者，在AR活组织切片之前长至7个月(n＝27)及之后直至6个月(n＝30)被收集。儿科5基因表达模型(DUSP1，NAMPT，PSEN1，MAPK9和NKTR)在AR活组织切片检查之前长至6个月(0-3个月平均得分＝88％；3-6个月平均得分＝58％)及之后直至1个月(平均得分＝63％)都显示出高AR预测得分。40例匹配的AR样品的平均得分为91％。在AR活组织切片检查之后大于1个月所收集的样品中，AR的平均预测得分为之后3个月42％，之后＞3个月48％(图3B)。

实施例17：使用15基因对AR和No-AR进行分类

使用15基因通过惩罚逻辑回归对143例成人AR和No-AR进行分类

为了提高精确度和敏感性，另外32个基因对于成人测试集的影响通过惩罚逻辑回归被检测，以选出可以被纳入用于开发年龄不依赖的AR预测算法的额外基因。作为结果，从32个基因(CEACAM4，SLC25A37，RARA，CXCL10，GZB，IL2RB，RHEB，Clorf38，EPOR，GZMK，ABTB1，NFE2，FOXP3，MPP1及MAP2K3)中选出了另外15个基因。使用这些额外基因导致成人数据集中通过惩罚逻辑回归进行AR预测的改进(精确度为92％，敏感性为86％，特异性为94％)。只有5例样品(2例no-AR和3例AR)被不正确分类。在该惩罚逻辑回归模型中AR预测的θ为50％，表明概率得分为＞50％时将样品标明为AR，而概率得分为＜50％时将样品标明为no-AR，从而实现样品分类(图1A)

使用15基因通过惩罚逻辑回归对49例成人AR和No-AR进行分类

在49例样品的独立集中对成人15基因模型的性能进行了测试。样品包括8例AR和6例no-AR患者，他们在采血时有活组织切片检查确定的病理学报告。其余20例样品收集自或者在收集血液样品时没有匹配的的活组织切片检查(N.A.，n＝22)的患者，或者正在经历其它形式的移植物功能障碍(n＝13)包括急性肾小管肾炎(ATN，n＝3)，急性药物中毒(CNIT，n＝4)，或者在活组织切片检查中表现为慢性移植物损伤(IF/TA，n＝4)的患者，此外还有BK肾病患者(BK，n＝2)。来自未知表型患者的22例样品在样品收集前后都没有活组织切片检查证实的排斥。使用基因表达，所有no-AR样品被正确预测为no-AR，而8例AR样品中的5例被正确分类为AR。在AR和其它来源的移植物功能障碍之间，AR中的预测得分显著更高(p＝0.0162)。来自未知表型(N.A.)患者的所有样品都被预测为no-AR(图1B)。

使用15基因通过惩罚逻辑回归对抗体介导的和细胞介导的急性排斥进行同等的检测

大部分AR样品表现为细胞和体液排斥的混合。在所有情况下都无法得到活组织切片检测时供者特异的抗体(DSA)数据。使用仅表现为抗体介导的排斥(AMR，C4D阳性活组织切片染色，DSA+)的5名患者的子集，与完全为细胞介导的排斥(ACR，C4d-，DSA-；n＝33)的患者的预测得分进行比较。尽管纯抗体和细胞介导的排斥发作的数量相对较小，对这2个AR亚群中平均AR预测得分的比较显示该模型以高预测概率(平均得分AMR＝82.9％±0.16；平均得分ACR＝89.5％±0.12；p＝0.413)同等的检测到AMR和ACR。(图2)。图2A所示为143名AR和no-AR成人患者中AR的预测概率。图2B显示49名独立患者中(8例AR，6例No-AR，13例移植物功能障碍，以及22例未知)AR的预测概率。

使用15基因通过惩罚逻辑回归在AR活组织切片之前长至3个月及之后1个月的成人肾受者血液中预测AR

对于经活组织切片检查证实为AR的患者的一个子集(n＝59)可获得连续血液样品，在AR活组织切片之前长至2年(n＝23)及之后1.5年(n＝19)被收集。通过基因表达，AR在成年人群中AR活组织切片检查之前长至3个月及之后直至1个月被指示(之前0-3个月平均AR概率＝43％；之后0-1个月平均AR概率＝50％)。在AR活组织切片检查之前大于3个月或之后大于1个月所收集的血液样品中，使用基因表达模型检测AR的概率分别降至24％和24％。17例匹配AR样品的平均得分为82％(图3A)。

实施例18：使用17基因通过支持向量机对AR和No-AR进行分类

为了不依赖于受者年龄的检测AR，来自包含93例外周血样品(22例AR，71例no-AR)的儿科和年轻成人患者的独立子集的qPCR数据(Li，L.et al.Am.J.Transplant.2012，12，2710-2718)与143例来自成人移植受者(47例AR，96例no-AR)的样品合并。使用收缩质心，确定了将患者分类为AR或no-AR的一组17个基因，使用SVM算法，其中成本参数＝701，核函数＝rbf，γ＝3用于分类。该17基因模型在236例儿科、年轻成人和成人患者的组合数据集中使用SVM检测AR的精确度为94％，敏感性为88％，特异性为95％。该17基因集使用了10个儿科基因(CFLAR，DUSP1，ITGAX，RNF130，PSEN1，NKTR，RYBP，NAMPT，MAPK9和IFNGR1)，新确定的15个成人基因中的6个(CEACAM4，RHEB，GZMK，RARA，SLC25A37和EPOR)，以及维甲类X受体α(RXRA)的组合。使用这17个基因，69例AR样品中仅有8例被错误的预测为no-AR，而169例no-AR样品中仅有8例被错误的预测为AR。很明显，成人特异基因和儿科特异基因的组合对于高准确性、灵敏性和特异性的对AR进行不依赖年龄的预测是必要的。

实施例19：使用17基因通过相等先验概率的偏最小二乘法判别分析对AR和No-AR进行分类

使用17基因通过相等先验概率的偏最小二乘法判别分析对143例成人AR和No-AR样品进行分类

确定肾AR预测分析的最终17个基因包括10基因群组(DUSP1，CFLAR，ITGAX，NAMPT，MAPK9，RNF130，IFNGR1，PSEN1，RYBP，NKTR)和另外7个为成人排斥提供信息的基因(SLC25A37，CEACAM4，RARA，RXRA，EPOR，GZMK，RHEB)(图12)；这17个基因在鉴别不同受者年龄的AR中表现出最佳的性能：在143例成人样品(队列1)的训练集中这17个基因正确的预测了39/47样品为AR以及正确的预测了87/96样品为No-AR，导致在相等先验概率的偏最小二乘法判别分析(plsDA；图6A-B)中敏感性为83％且特异性为91％。在每个中心对AR对比No-AR进行比较，平均预测AR概率具有高度显著性差异(CPMC：p＜0.0001；Emory：p＝0.002；UPMC：p＜0.0001；UCLA：p＜0.0001原文此处没有小数点)(图6A)。通过plsDA，17基因的受试者工作特征(ROC)曲线下的总面积为AUC＝0.94(95％Cl为0.91-0.98；p＜0.0001)(图6B)。

使用17基因通过相等先验概率的偏最小二乘法判别分析对独立的124例成人和儿科受者进行分类

为了独立验证17基因肾AR预测分析模型从而在成人和儿科受者中鉴别AR和No-AR表型，我们在也在富鲁达平台上进行过检测的124例独立样品(队列2；回顾性验证)的成人(n＝59)和儿科(n＝65)的组合集中测试了他的性能。17基因肾AR预测分析模型正确的预测21/23例样品为AR以及正确预测100/101例样品为No-AR(图7A)，包括4例BK病毒性肾病患者，产生的分析敏感度为91.3％，特异性为99.01％。2例错误分类的AR之一在排斥时的活组织切片样品中有＞33％的全面退化的严重慢性损伤(IF/TA III级)。如训练集(队列1)中所见，在验证集(队列2)中平均AR预测概率在AR(80.55％)和No-AR(9.2％)中也有显著性差异(p＜0.0001；图7B)；在BKV组中平均AR预测概率很低为12.76％。在124例样品中的ROC分析结果为AUC＝0.9479(95％Cl为0.88-1.0)(图7C)。为了评价17基因肾AR预测分析模型在每个样品收集地点的性能，我们计算队列1和队列2的ROC AUC用来在Emory(n＝42)，UPMC(n＝81)，UCLA(n＝44)和CPMC(n＝35)中进行预测。移植中心所进行的分析的性能显示所有4个中心的单独ROC AUC＞0.8(图13 A-D)。

使用17基因通过相等先验概率的偏最小二乘法判别分析对抗体介导的和细胞介导的急性排斥进行同等的检测

在富鲁达平台上分析的大部分AR样品表现出某些细胞和体液排斥的混合特征或相关的慢性改变。当使用固定17基因模型进行评价时，19例只有明确的抗体介导的排斥的患者(AMR，C4D阳性活组织切片染色，DSA+)和51例明确的细胞介导的排斥的患者(ACR，C4d-且DSA-，且Banff t-和i-scores＞1)之间在AR预测得分上没有观察到差异(plsDA；p＝0.9906；平均ACR＝80.84％±4.4；平均AMR＝80.75％±6.6；图14A)。

使用17基因通过相等先验概率的偏最小二乘法判别分析对AR进行分类不依赖于移植后时间

为了评价移植后排斥的时间是否会影响17基因的预测精度，对移植后0-6个月，6-12个月及＞1年所收集的AR和No-AR样品中的预测AR概率进行评价并且没有发现其被移植后时间影响(图14B)。

17基因通过相等先验概率的偏最小二乘法判别分析在出现临床移植物功能障碍之前在191例样品中预测了活组织切片检查确定的AR

为了评价17基因肾AR预测分析模型的预测本质，取自与活组织切片检查匹配的AR发作(n＝74)之前(0.2-6.8个月，n＝65)或之后(0.2-7个月；n＝52)的191例血液样品(队列3，前瞻性预测)被分析。在血液样品取自活组织切片检查确定为AR之前0-3个月的患者中(n＝35)，在移植物功能稳定时，62.9％(22/35)有很高的AR预测得分(96.4％±0.8)(图8)，显著高于移植物功能稳定且随访中未发生AR的患者的得分(19.4％±0.3；p＜0.0001)。在血液样品取自AR治疗后0-3个月的患者中(n＝31)，51.6％(16/31)仍然有升高的预测AR得分(86％±0.17)；在AR治疗后0-3个月15/31例样品显示出低于AR阈值(6.59％±0.13％)的AR得分。由于AR预测得分升高的患者中血清肌酐的水平为2.04±0.4mg/dL，与AR预测得分下降的患者中1.8±0.4mg/dL的肌酐水平相比，后者可能代表患者对AR治疗有反应(图8)。

实施例20：通过kSAS对AR和No-AR进行分类

选择ABI viia7 QPCR平台进行标准QPCR

高通量QPCR平台如富鲁达平台非常适合诊断生物标志物群组的发现和最初开发，但是需要大样品量和基因数量以提供高性价比。因此，使用收集自44名AR和56名No-AR患者的100例样品通过标准qPCR(ABI viia7，生命技术公司，福斯特城，CA)对17基因模型进行分析以开发可用于临床的检测，其具有可定制的样式并且对于可变的和较小的样品数量具有较高性价比。为了优化用于临床分析(可扩展性，成本，机器的可用性，协议的简单性)的这些基因集，ABI qPCR平台被用于下游的发现和验证。

使用10基因通过kSAS对成人和儿科AR和No-AR进行分类

为了发现，kSAS分析局限于两个成人中心(UCSF和匹兹堡)以及一个儿科中心(SNS)。该分析产生了一个7基因模型(CFLAR，DUSPI，IFNGRI，ITGAX，MAPK9，NKTR，和RYBP)，其可以在所有成人和儿科中心中以89％的比率对AR状态进行分类。3-10个基因大小的备择模型整体性能低于最终的7基因集。根据16例AR和16例no-AR样品，成人的组合分类率产生81％的精确度(敏感性＝88％，特异性＝75％)，根据22例AR和155例no-AR样品，在儿科集中的精确度为90％(敏感性＝91％，特异性＝90％)。

使用17基因通过kSAS对AR和No-AR进行分类

除之前发现的10个儿科基因外，由富鲁达分析确定的7个成人分类基因(CEACAM4，EPOR，GZMK，RARA，RHEB，RXRA和SLC25A37)被加入到ABI基因群组。这17个基因的序列按照基因组DNA序列被提供于附录A中。使用kSAS重新分析这143名患者的富鲁达qPCR数据集时，几乎所有的这些基因也被确定为高价值预后标志物。该大ABI基因集分析最初局限于具有确定的AR或no-AR状态的成人患者血液样品。为了从这17个儿科和成人基因中鉴定出性能改进的基因子集，从两个中心(UCSF和匹兹堡)收集的kSAS qPCR数据首先被重新应用。结合来自这些中心的所有可能的17基因组合(3-17基因每个模型)的整体分类率，产生了一组十三个模型，每个包含12个不同的基因组合，其分类率为90％(敏感性为88％，特异性为94％)表2。

作为这些基因模型的独立验证，在一个新的成人和儿科患者集(分别来自巴塞罗那和墨西哥)以及来自一个训练中心(UCSF)的另一个独立患者集中对该模型集进行了测试。使用来自发现分析(之前的UCSF样品)AR和no-AR表达参考对UCSF患者进行分析，所产生的验证率从76-86％不等。当把来自所有新样品的结果聚集起来时，产生了最高模型分类率88％(敏感性为86％，特异性为90％)，且在成人和儿科样品之间分类率相似。这个最好的12基因模型(CFLAR，PSEN1，CEACAM4，NAMPT，RHEB，GZMK，NKTR，DUSP1，RARA，ITGAX，SLC25A37和EPOR)包含来自儿科分类集的5个基因(CFLAR，PSEN1，NAMPT，NKTR和DUSP1)，并且对AR状态进行分类时不需考虑年龄、统计学特征、诱导治疗、维持免疫抑制、共病现象，或混杂的移植病理学。当在实验预测的相互作用的背景下进行评价时，这些基因中的半数以上直接或间接相关联。

使用17基因通过kSAS计算100例成人和儿科样品的AR风险得分

由于多个模型方法为每个基因集提供了不同的得分，这些模型为每个患者提供不偏向单个基因模型的置信得分的结合能力被评价。这个汇总的AR风险分析为每个患者产生数值得分(-13到13)，表明AR的风险(13＝高风险，-13＝极低风险)。在具有“高AR风险”的患者中，91％(34例中的31例)被正确分类为AR，而对于具有“极低AR风险”的患者，92％(38例中的35例)被正确分类为no-AR。其余患者(n＝15)被预测为具有不确定风险(图10A)。

使用kSAS，AR中的平均计算AR风险得分显著高于No-AR(p＜0.0001)(图10B)。

对于确定的kSAS调用(高风险AR，低风险AR，n＝85)，计算的AUC为0.93(95％Cl为0.86-0.99)(图10C)。

本分析的一个优势为它在外周血样品中检测AR的高PPV(92.3％)。目前在移植中可获得的唯一诊断性检测可发现不存在中/重度急性细胞性心脏排斥(ISHLT 3A)，但是对于发现存在的AR表现很差(PPV＝6.8％)(Deng et al.，2006，Am J.Transplant 6：150-160)。同样的，用于评价阻塞性冠状动脉疾病的血液基因表达检测(帕洛阿尔托，CA)在一项多中心验证研究(Rosenberg et al，2010，Ann Intern Med 153：425-434)中产生的PPV为46％。除了在临近排斥时(根据目前的金标准诊断)该检测发现AR具有高敏感性外，该检测还在12个病例中发现了亚临床排斥并在移植物功能障碍和组织学AR之前长至3个月所收集的＞60％样品中预测了临床AR；这是排斥检测的一个重要能力，因为亚临床和临床AR是慢性排斥和移植物功能丧失的先兆(Nasesens et al.，2012，Am J Transpalnt 12：2730-2743)。尽管目前用于评价适应性同种免疫反应的免疫监测工具，或者评价循环中的供者特异性抗体或者记忆性T细胞，对于预测潜在的AR风险已经显示出它们的有效性(Loupy et al，2013，N Engl J Med 369：1215-1216；和Bestard et al，2013 Kidney Int84：1226-1236)，但它们的发现不一定会转化为持续的免疫介导的移植物损伤并且此外，这些效应机制不总是能在活组织切片检查证实AR的时候或之前被发现。此外，目前大部分中心不会进行计划性活组织切片检查作为检测亚临床AR的方法，因此这些情况大部分仍然未被发现。使用本文提供的检测进行移植后例行监测能够预测AR，通过及时介入限制了组织的损伤，并能通过最大程度减少会重新接受费用昂贵的透析的患者的数量，从而减轻医疗系统的财政负担。

实施例21：用于AR和No-AR分类的17基因的生物学

当在实验预测的相互作用的背景下进行评价时，这些基因中的半数以上通过常见的分子通路(图15a-15c)，特别是调节凋亡、免疫表型和细胞表面的通路，直接或间接相互关联。除了之前被认为是儿科AR的外周血生物标志物的10个基因，已知它们在外周血单核细胞系表达最高，另外的7个外周血AR基因中的6个也被外周循环中活化的单核细胞(RXRA，RARA，CEACAM4)、内皮细胞(EPOR，SLC25A37)和T细胞(GZMK)表达。这17个基因中的11个在细胞死亡和细胞存活网络中发挥共同的作用(费希尔精确检验，p＜0.05；IPA；图15c)。

实施例21：使用留一法分析鉴定常见的排斥模块(CRM)

通过分析来自236例独立的肾、肺、心脏和肝移植患者的活组织切片检查样品的全基因组表达数据确定了一个常用的排斥模块。每个数据集都经过gcRMA标准化(见，Irizarray，E.et al.Nucleic Acids Res.2003，31，e15)。通过结合样本量影响和结合p值的荟萃分析方法对移植数据库进行分析，确定了102个基因(列于表3中)，FDR≤20％。每次去掉一个器官从而导致不同器官迭代组合的迭代通过荟萃分析被各自分析，揭示出在所有器官中超表达的12个基因，包括BASP1，CD6，CD7，CXCL10，CXCL9，INPP5D，ISG20，LCK，NKG7，PSMB9，RUNX3和TAP1(图16)。

附录C：Lineage Profiler迭代源代码

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该脚本迭代LineageProfiler算法(基于相关的分类方法)来识别相对于给定一个或多个基因模型两个参考中的一个的样本类型。主要功能是运行LineageProfiler。

本程序实施如下操作：

1)导入制表符分隔的具有三栏(ID、生物组1，组2)和一个标题行(生物组名称)的参考表达文件

2)导入制表符分隔的具有基因ID(栏1)，样品名称(行1)和标准化表达值(即ΔCt值)的参考表达文件

3)(可选地-导入已有模型)导入制表符分割的具有逗号分隔的用于分析的基因模型

4)(可选地-找到新模型)为一个提供的模型大小变量识别所有可能的基因模型的结合(即，-s 7)

5)迭代任何提供的或鉴定到的基因模型以获得新的或已知的样品类型预测

6)输出所有分析的模型的预测结果到SampleClassification(样品分类)文件夹

7)(可选地)打印出前20得分和所有可能的大小的模型结合模式-s

Claims (87)

1.用于诊断AR，用于诊断no-AR，或用于诊断接受了肾移植的个体发生AR风险的方法，该方法包含：

a)测量来自所述个体的生物样品中的CEACAM4以及选自CFLAR，DUSP1，IFNGR1，ITGAX，MAPK9，NAMPT，NKTR，PSEN1，RNF130，RYBP，EPOR，GZMK，RARA，RHEB，RXRA及SLC25A37中的6到16个其它基因的水平，从而得到基因表达结果；以及

b)使用参考标准品，其包含针对每个基因的来自AR样品的单个参考表达载体，以及针对每个基因的来自no-AR样品的单个参考表达载体，其中所述基因表达结果将与参考标准品比较，从而进行诊断。

2.权利要求1的方法，其中个体为23岁或年龄更大的成年人。

3.权利要求1的方法，其中个体为儿童或未满23岁的年轻人。

4.权利要求1-3任一项的方法，其中6到16个其它基因包含CFLAR，DUSP1，IFNGR1，ITGAX，MAPK9，NAMPT，NKTR，PSEN1，RNF130，RYBP，EPOR，GZMK，RARA，RHEB，RXRA以及SLC25A37。

5.权利要求1-4任一项的方法，其中检测步骤包括在微阵列芯片上分析所述样品的基因表达结果或使用qPCR分析所述样品的基因表达结果。

6.权利要求1-5任一项的方法，其中检测步骤包括在微球上分析所述样品的基因表达结果。

7.权利要求1-6任一项的方法，其中检测步骤包括在纳米颗粒上分析所述样品的基因表达结果。

8.权利要求1-7任一项的方法，其中生物样品为血液样品。

9.权利要求8的方法，其中血液样品为外周血白细胞或外周血单核细胞样品。

10.权利要求8的方法，其中血液样品为全血。

11.权利要求1-10任一项的方法，其中所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较包括对AR的预测，其敏感性大于70％。

12.权利要求1-11任一项的方法，其中所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较包括对AR的预测，其特异性大于70％。

13.权利要求1-12任一项的方法，其中所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较包括对AR的预测，其阳性预测值(ppv)大于70％。

14.权利要求1-13任一项的方法，其中所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较包括对AR的预测，其阴性预测值(npv)大于70％。

15.用于鉴别肾移植中需要治疗急性排斥(AR)的个体的方法，该方法包含：

a)测量来自所述个体的生物样品中的CEACAM4以及选自CFLAR，DUSP1，IFNGR1，ITGAX，MAPK9，NAMPT，NKTR，PSEN1，RNF130，RYBP，EPOR，GZMK，RARA，RHEB，RXRA及SLC25A37中的6到16个其它基因的水平，从而得到基因表达结果；以及

b)使用参考标准品，其包含针对每个基因的来自AR样品的单个参考表达载体，以及针对每个基因的来自no-AR样品的单个参考表达载体，其中所述基因表达结果将与参考标准品比较，从而进行鉴别。

16.权利要求15的方法，其中个体为23岁或年龄更大的成年人。

17.权利要求15的方法，其中个体为儿童或未满23岁的年轻成人。

18.权利要求15-17任一项的方法，其中6到16个其它基因包含CFLAR，DUSP1，IFNGR1，ITGAX，MAPK9，NAMPT，NKTR，PSEN1，RNF130，RYBP，EPOR，GZMK，RARA，RHEB，RXRA以及SLC25A37。

19.权利要求15-18任一项的方法，其中检测步骤包括在微阵列芯片上分析所述样品的基因表达结果或使用qPCR分析所述样品的基因表达结果。

20.权利要求15-19任一项的方法，其中检测步骤包括在微球上分析所述样品的基因表达结果。

21.权利要求15-20任一项的方法，其中检测步骤包括在纳米颗粒上分析所述样品的基因表达结果。

22.权利要求15-21任一项的方法，其中生物样品为血液样品。

23.权利要求22的方法，其中血液样品为外周血白细胞或外周血单核细胞。

24.权利要求22的方法，其中血液样品为全血。

25.权利要求15-24任一项的方法，其中所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较包括对AR的预测，其敏感性大于70％。

26.权利要求15-25任一项的方法，其中所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较包括对AR的预测，其特异性大于70％。

27.权利要求15-26任一项的方法，其中所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较包括对AR的预测，其阳性预测值(ppv)大于70％。

28.权利要求15-27任一项的方法，其中所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较包括对AR的预测，其阴性预测值(npv)大于70％。

29.用于诊断接受了肾移植的个体的急性排斥(AR)的系统，该系统包含：

a)基因表达评价单元，其用于测量来自所述个体的生物样品中的CEACAM4以及选自CFCFLAR，DUSP1，IFNGR1，ITGAX，MAPK9，NAMPT，NKTR，PSEN1，RNF130，RYBP，EPOR，GZMK，RARA，RHEB，RXRA及SLC25A37中的6到16个其它基因的水平，从而得到基因表达结果；以及

b)参考标准品单元，其包含在单个肾移植中心针对每个基因的来自AR样品的单个参考表达载体以及在单个肾移植中心针对每个基因的来自no-AR样品的单个参考表达载体，用于将所述基因表达结果将与参考标准品比较，从而进行诊断。

30.权利要求29的系统，其中基因表达评价单元包含微阵列芯片或qPCR装置。

31.权利要求30的系统，其中基因表达评价单元包含微球。

32.权利要求29-31任一项的系统，其中表达评价单元包含纳米颗粒。

33.权利要求29-32任一项的系统，其中参考标准品单元是计算机生成的。

34.权利要求29-33任一项的系统，其中所述基因表达结果与所述参考标准品的比较由计算机或人来进行。

35.权利要求29-34任一项的系统，其中个体为23岁或年龄更大的成年人。

36.权利要求29-34任一项的系统，其中个体为儿童或未满23岁的年轻人。

37.权利要求29-36任一项的系统，其中6到16个其它基因包含CFLAR，DUSP1，IFNGR1，ITGAX，MAPK9，NAMPT，NKTR，PSEN1，RNF130，RYBP，EPOR，GZMK，RARA，RHEB，RXRA以及SLC25A37。

38.权利要求29-37任一项的系统，其中生物样品为血液样品。

39.权利要求38的系统，其中血液样品为外周血白细胞或外周血单核细胞。

40.权利要求38的系统，其中血液样品为全血。

41.权利要求29-40任一项的系统，其中所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较包括对AR的预测，其敏感性大于70％。

42.权利要求29-41任一项的系统，其中所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较包括对AR的预测，其特异性大于70％。

43.权利要求29-42任一项的系统，其中所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较包括对AR的预测，其阳性预测值(ppv)大于70％。

44.权利要求29-43任一项的系统，其中所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较包括对AR的预测，其阴性预测值(npv)大于70％。

45.用于诊断接受了肾移植的个体的急性排斥(AR)的试剂盒，该试剂盒包含：

a)基因表达评价单元，其用于测量来自所述个体的生物样品中的CEACAM4以及选自CFLAR，DUSP1，IFNGR1，ITGAX，MAPK9，NAMPT，NKTR，PSEN1，RNF130，RYBP，EPOR，GZMK，RARA，RHEB，RXRA及SLC25A37中的6到16个其它基因的水平，从而得到基因表达结果；

b)参考标准品单元，其包含在单个肾移植中心针对每个基因的来自AR样品的单个参考表达载体以及在单个肾移植中心针对每个基因的来自no-AR样品的单个参考表达载体；以及

c)用于诊断AR的指令集，其包含所述基因表达结果与参考标准品的比较。

46.权利要求45的试剂盒，其中个体为23岁或年龄更大的成年人。

47.权利要求45的试剂盒，其中个体为儿童或未满23岁的年轻人。

48.权利要求45-47任一项的试剂盒，其中6到16个其它基因包含CFLAR，DUSP1，IFNGR1，ITGAX，MAPK9，NAMPT，NKTR，PSEN1，RNF130，RYBP，EPOR，GZMK，RARA，RHEB，RXRA以及SLC25A37。

49.权利要求45-48任一项的试剂盒，其中基因表达评价单元包含在微阵列芯片上分析所述样品的基因表达结果。

50.权利要求45-49任一项的试剂盒，其中基因表达评价单元包含在微球上分析所述样品的基因表达结果。

51.权利要求45-50任一项的试剂盒，其中基因表达评价单元包含在纳米颗粒上分析所述样品的基因表达结果。

52.权利要求45-50任一项的试剂盒，其中生物样品为血液样品。

53.权利要求52的试剂盒，其中血液样品为外周血白细胞或外周血单核细胞。

54.权利要求52的试剂盒，其中血液样品为全血。

55.权利要求45-54任一项的试剂盒，其中所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较包括对AR的预测，其敏感性大于70％。

56.权利要求45-55任一项的试剂盒，其中所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较包括对AR的预测，其特异性大于70％。

57.权利要求45-56任一项的试剂盒，其中所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较包括对AR的预测，其阳性预测值(ppv)大于70％。

58.权利要求45-57任一项的试剂盒，其中所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较包括对AR的预测，其阴性预测值(npv)大于70％。

59.权利要求45-58任一项的试剂盒，其中所述基因表达结果与所述参考标准品的比较由计算机或人来进行。

60.包含参考标准品的制品，其用于与通过测量来自接受肾移植个体的生物样品中的CEACAM4以及选自CFLAR，DUSP1，IFNGR1，ITGAX，MAPK9，NAMPT，NKTR，PSEN1，RNF130，RYBP，EPOR，GZMK，RARA，RHEB，RXRA及SLC25A37中的6到16个其它基因的水平所得到的基因表达结果进行比较，其包含在单个肾移植中心针对每个基因的来自AR样品的单个参考表达载体以及在单个肾移植中心针对每个基因的来自no-AR样品的单个参考表达载体，其中所述基因表达与参考标准品的比较将用于诊断急性排斥(AR)，诊断no-AR，或诊断在所述个体中发生AR的风险。

61.权利要求60的制品，其中个体为23岁或年龄更大的成年人。

62.权利要求60的制品，其中个体为儿童或未满23岁的年轻人。

63.权利要求60-62任一项的制品，其中6到16个其它基因包含CFLAR，DUSP1，IFNGR1，ITGAX，MAPK9，NAMPT，NKTR，PSEN1，RNF130，RYBP，EPOR，GZMK，RARA，RHEB，RXRA以及SLC25A37。

64.权利要求60-63任一项的制品，其中检测CEACAM4和6到16个其它基因的水平包含在微阵列芯片上分析所述样品的基因表达结果或使用qPCR分析所述样品的基因表达结果。

65.权利要求60-64任一项的制品，其中检测CEACAM4和6到16个其它基因的水平包含在微球上分析所述样品的基因表达结果。

66.权利要求60-65任一项的制品，其中检测CEACAM4和6到16个其它基因的水平包含在纳米颗粒上分析所述样品的基因表达结果。

67.权利要求60-66任一项的制品，其中生物样品为血液样品。

68.权利要求67的制品，其中血液样品为外周血白细胞或外周血单核细胞。

69.权利要求67的制品，其中血液样品为全血。

70.权利要求60-69任一项的制品，其中所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较包括对AR的预测，其敏感性大于70％。

71.权利要求60-70任一项的制品，其中所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较包括对AR的预测，其特异性大于70％。

72.权利要求60-71任一项的制品，其中所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较包括对AR的预测，其阳性预测值(ppv)大于70％。

73.权利要求60-72任一项的制品，其中所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较包括对AR的预测，其阴性预测值(npv)大于70％。

74.治疗肾移植患者的方法，其包含进行包括以下内容的检验：

a)测量来自所述个体的生物样品中的CEACAM4以及选自CFLAR，DUSP1，IFNGR1，ITGAX，MAPK9，NAMPT，NKTR，PSEN1，RNF130，RYBP，EPOR，GZMK，RARA，RHEB，RXRA及SLC25A37中的6到16个其它基因的水平，从而得到基因表达结果；

b)使用参考标准品，其包含针对每个基因的来自AR样品的单个参考表达载体以及针对每个基因的来自no-AR样品的单个参考表达载体，其中所述基因表达结果将与参考标准品进行比较从而鉴别受试者有肾移植AR或没有肾移植AR；以及

c)对于有肾移植AR的受试者，增加施用治疗有效量的一种或多种治疗剂，对于没有肾移植AR的受试者，维持施用治疗有效量的一种或多种治疗剂，或对于没有肾移植AR的受试者，减少施用治疗有效量的一种或多种治疗剂。

75.权利要求74的方法，其中个体为23岁或年龄更大的成年人。

76.权利要求74的方法，其中个体为儿童或未满23岁的年轻人。

77.权利要求74-76任一项的方法，其中6到16个其它基因包含CFLAR，DUSP1，IFNGR1，ITGAX，MAPK9，NAMPT，NKTR，PSEN1，RNF130，RYBP，EPOR，GZMK，RARA，RHEB，RXRA以及SLC25A37。

78.权利要求74-77任一项的方法，其中检测步骤包括在微阵列芯片上分析所述样品的基因表达结果或使用qPCR分析所述样品的基因表达结果。

79.权利要求74-78任一项的方法，其中检测步骤包括在微球上分析所述样品的基因表达结果。

80.权利要求74-79任一项的方法，其中检测步骤包括在纳米颗粒上分析所述样品的基因表达结果。

81.权利要求74-80任一项的方法，其中生物样品为血液样品。

82.权利要求81的方法，其中血液样品为外周血白细胞或外周血单核细胞。

83.权利要求81的方法，其中血液样品为全血。

84.权利要求74-83任一项的方法，其中所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较包括对AR的预测，其敏感性大于70％。

85.权利要求74-84任一项的方法，其中所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较包括对AR的预测，其特异性大于70％。

86.权利要求74-85任一项的方法，其中所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较包括对AR的预测，其阳性预测值(ppv)大于70％。

87.权利要求74-86任一项的方法，其中所述基因的表达结果与所述参考标准品的比较包括对AR的预测，其阴性预测值(npv)大于70％。