CN106103744A - 用于预测脓毒症发作的设备、试剂盒和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于分析来自动物的生物样品以预测(症状出现之前地)和监测脓毒症发展的试剂盒、方法和装置，其利用生物标志物特征，尤其是能够提供至少92％的平均预测准确性来区分脓毒症和非脓毒症发展的生物标志物特征。

Description

用于预测脓毒症发作的设备、试剂盒和方法
本发明涉及用于分析来自动物的生物样品以预测和监测脓毒症发展的试剂盒、方法和设备，其利用生物标志物特征(biomarker signatures)/生物标志物列表来预测动物是否有可能发展脓毒症的症状，尤其是能够提供至少92％的平均预测准确性来区分脓毒症和非脓毒症发展，及至少95％的平均预测准确性来区分脓毒症和SIRS发展的生物标志物特征。
暴露于生物制剂后，脓毒症症状出现前通常有一个滞后期。临床症状发作后，治疗的有效性往往随着病情的进展而降低，因此作出任何诊断的时间是至关重要的。检测或诊断检测可能将是脓毒症的第一确认指标。因此这些检测的可用性、快速性和预测准确性在确定结果时将是至关重要的。任何节省的时间将加快医疗对策的实施并将对康复产生重大影响。
方便快速检测生物制剂感染的技术的发展是对于所有的风险的关键问题。在感染的初始阶段，许多生物制剂在典型的临床样品(如血液)中是不存在的，或以非常低的浓度存在。因此可能是，在临床症状出现之前，制剂特异性检测限制了其在检测感染中的使用。在先研究表明，感染引起涉及指示制剂类型的多种生物标志物表达变化的免疫反应模式。生物标志物的这种表达模式已被证明用于多种传染原的诊断。现在可以使用全转录组分析区分来自由四种常见的人类病原体(甲型流感、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌和大肠杆菌)引起的急性感染症状的患者的血液白细胞的基因表达模式。最近，研究人员已经能够减少做出诊断所需的宿主生物标志物的数量，其通过使用适当的生物信息学分析技术来选择用于传染病诊断的重要生物标志物。
虽然宿主生物标志物特征代表了对生物制剂感染进行症状出现之前检测的有吸引力的解决方案，但它们的发现依赖于感染实验室模型的开发，其保真度与人类疾病的发病机制的不同。在人类中发现症状出现之前的生物标志物的另一种方法是探索生物制剂感染的常见后遗症；危及生命的病症脓毒症。脓毒症的传统定义为对感染应答的全身炎症响应性综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，当与急性器官功能障碍有关时，最终可引起严重的危及生命的并发症。此广泛定义依赖于观察全身性疾病的明显症状(温度、血压、心率等)，及通过来自临床样品中的微生物培养指示感染性微生物的存在。其已描述在炭疽(炭疽杆菌)、兔热病(土拉弗朗西斯菌)、瘟疫(鼠疫杆菌)、鼻疽病(鼻疽伯克霍尔德氏菌)、类鼻疽(类鼻疽伯克氏菌)、出血性线状病毒和甲病毒感染的动物(主要是鼠类和NHP)模型中。更重要的是，脓毒症是由人类中相同的生物制剂直接引起的。
天然生物原感染的发病率一般是极低的，使得在人群中进行疾病发病的前瞻性研究是不可行的。然而，与器官功能障碍、低灌注或低血压相关的严重脓毒症的发展，是重症监护病房(intensive care units，ICU)中发病率和死亡率的主要原因。在英国，严重脓毒症占所有ICU进入的27％。在整个欧洲，ICU中严重脓毒症的平均发病率为30％，其中死亡率为27％。在美国，医院相关的来自脓毒症的死亡率在18％至30％的范围内；估计所有死亡中的9.3％出现在脓毒症患者中。显然有十分便利的患者群体可以被用来研究脓毒症发作的预测标志物。
尽管诊断、治疗和支持得到了很大的提高，严重感染和脓毒症仍然是死亡的重要原因，且通常导致急性发作期存活的患者的慢性健康不佳或残疾。尽管突然的、暴发性感染在健康成体中是比较罕见的，它在免疫功能低下的个体、重症监护中的严重不良患者、烧伤患者和儿童中构成增加的风险。在相当比例的病例中，明显可治疗的感染导致脓毒症的发展；对感染失调、不适当的应答以渐进循环衰竭导致肾和呼吸衰竭、异常凝血、完全和无反应性低血压为特征，其占约30％的死亡病例。每年北美人群中脓毒症的发病率为人群的约0.3％(约750,000例)，其中在老年人中死亡率上升到40％，在最严重形式的脓毒性休克的情况下上升至50％。
应该指出的是，临床脓毒症也可能由某些病毒和真菌的感染导致(例如委内瑞拉马脑炎病毒，Venezuelan Equine Encephalitis Virus，VEEV)，以及可能涉及这种病例的其他机制。
尽可能早的检测潜在的严重感染的能力，尤其是在易感个体中预测脓毒症的发病是有明显的优势的。多年来进行了相当大的努力来尝试建立定义诸如休克、脓毒症、脓毒性休克、毒性休克和全身炎性反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)等临床实体的明确标准。类似地，已经进行了许多尝试来设计鲁棒性预测模型，其基于测量一系列临床、化学、生化、免疫和细胞计数参数，且提出不同预后成功和复杂性的多个评分系统。
根据美国胸科医师协会(American College of Chest Physicians，ACCP)1991共识会议和危重病医学会(Society of Critical Care Medicine，SCCM)，当患者具有多于一个下列情况时，认为存在“SIRS”：体温高于38℃或低于36℃、心率大于90/min、涉及呼吸率的换气过度高于20/min或PaCO2低于32mm Hg、白细胞计数大于12000个细胞/μl或少于4000个细胞/μl。
“脓毒症”已被定义为由感染引起的SIRS。人们承认，SIRS可在没有感染的情况下发生，例如，在烧伤、胰腺炎和其他疾病状态下。“感染”被定义为一种病理过程，其是由致病性或潜在致病的微生物侵袭正常无菌组织、液体或体腔引起的。
“严重脓毒症”被定义为并发器官功能障碍的脓毒症。
“脓毒性休克”是指(成体)脓毒症加急性循环衰竭的状态，其特征是由其他原因引起的不明原因的持续性动脉低血压。
以开发特异性诊断和预后试验的观点，脓毒症和许多特异性血清标志物的相关性已被广泛研究。
然而，虽然这些标志物中的许多与脓毒症相关，且某些指示病症的严重性，但尚无单一标志物或标志物的组合显示是可靠的诊断测试，更不用说预测脓毒症的发展。
在复杂变量集中，随着时间的变化提取可靠的诊断模式和鲁棒性预后指示需要精致的分析方法，所述变量包括传统的临床观察、临床化学、生化、免疫学和细胞计数数据。使用专家系统和人工智能(包括神经网络)用于医疗诊断应用已经开发了一段时间。
神经网络是能够在复杂的数据系统中鉴定模式的非线性函数。这是通过使用一些数学函数实现，所述函数使网络能够在噪声数据集内鉴定结构。这是因为来自系统的数据可以根据数据中的变量之间的关系而产生模式。如果神经网络在被称为“训练”的阶段中看到此类数据点的足够的实例，它是能够“学习”这种结构，然后在未来数据点或测试数据鉴定这些模式。在这种方式中，神经网络通过对在它所看到的数据内存在的模式建模而能够预测或分类未来的实例。然后网络的性能通过其正确预测或分类测试数据的能力而进行评估，若具有高的准确性评分，表明网络在数据内已经成功鉴定了真正的模式。神经网络的并行处理能力依赖于其处理元件的结构，其根据生物神经元的模型交互排列。一个或多个输入是通过连接权重调节的，以改变处理元件内的刺激水平。处理元件的输出与它的激活水平有关，并且该输出可以是非线性的或不连续的。因此神经网络的训练，包括根据元件的传递函数、相互关联结构的细节和系统遵循的学习规则而对相互关联权重进行的调整。这样的系统已被应用到多种临床情况，其包括创伤患者的健康结果模型。
美国专利申请2002/0052557描述了一种基于患者心率变化预测多种灾难性疾病发作的方法。神经网络是建模和分析数据的可能方法之一。
国际专利申请WO 00/52472描述了一种在儿童中使用的基于CD11b或‘CD11b复合体’(Mac-1、CR3)的血清或中性粒细胞的表面水平的快速检测方法。该方法仅使用单标志物，且可以说其是对炎症响应的中性粒细胞激活的公知标志物。
分析其中的数据通常是定性和离散的、而不是定量和连续的这样复杂的数据集的另一种方法，是使用诸如逻辑回归等复杂的统计分析技术。当使用定性的二元因变量的逻辑回归在选择显著性变量方面不足以识别时，可以使用多变量技术。从多元逻辑回归模型和神经网络的输出是连续变量，但是通过神经网络模型计算的可能性通常落在一个极端或另一个，其中极少值落在中间范围内。在临床情况下，这往往是有益的，并且可以给出更清晰的决定。
检测感染和/或脓毒症最早征兆的能力在允许尽早治疗方面是有明显好处的。症状严重性的指示和如果不治疗的可能性结果告知了关于治疗方案的决定。其与易感的住院人群(如那些在重症监护的，或烧伤或免疫功能低下的)，及与严重感染和继发性脓毒症的风险增加的其他组均相关。例如，在战场和平民设施中使用或怀疑使用生物武器是一个实例，其中对在暴露的个体中的最早征兆进行测试的快速和可靠手段会是有利的。
然而，直到现在也没有鉴定/产生具有高预测准确性(例如>75％，但优选>90％)的在症状出现之前可检测或预测脓毒症的测试或生物标志物列表。
因此本发明的目的是提供一种生物标志物特征(生物标志物列表)，以及使用该生物标志物将生物样品分类的方法，从而在症状出现之前高预测准确性地预测/检测脓毒症的发展，尤其提供可以以至少95％的准确性区分脓毒症和SIRS，和/或以至少有92％的准确性区分脓毒症和非脓毒症的生物标志物特征。
为此，申请人已经确定在症状发作前(症状出现之前)预测脓毒症发展的生物标志物特征(生物标志物列表)，其能够以至少75％的平均预测准确性区分脓毒症和非脓毒症、脓毒症和SIRS的发展，其中，生物标志物特征包括选自由表1中列出的266个基因组成的基因列表中的至少25个基因，或由这些基因表达的产物。申请人通过对宿主转录组(其来源于在脓毒症的临床发作前从人类患者中收集的血液样品)的全面分析鉴定了对脓毒症症状的发作而言具有高度显著性的266个基因的组(表1)。其整个组或子集用于多种统计模型，以确定脓毒症和非脓毒症患者的区别，具有脓毒症和SIRS的患者的区别。为了获得大于75％的平均预测准确性，申请人表明，可从表1中列出的266个基因中随机选择至少25个基因生物标志物特征。
特别是通过分析从266个基因的列表中随机选择的44个生物标志物的44,014种组合/生物标志物特征，申请人指出，所有组合的平均预测准确性大于75％。这些结果通过表24中列出的15种特定组合而说明，它们具有图3中所示的准确性。因此在一个实施方式中，生物标志物特征包括从由表1中列出的266个基因组成的基因列表中选择的至少44个基因。
申请人还鉴定了生物标志物特征，其包括至少25个、至少44个，并包括全部266个基因的生物标志物，其能够以至少92％的平均预测准确性区分脓毒症和非脓毒症的发展，以至少95％的平均预测准确性区分脓毒症和SIRS的发展。
申请人制造和训练了人工神经网络(artificial neural network，ANN)，其能够为来自266个生物标志物的任意选择区分脓毒症和非脓毒症和/或脓毒症与SIRS的预测提供预测准确性，由此通过将患者数据集输入到ANN中，而提供患者是否发展脓毒症的可能性。
将例如包括患者血液样品中的266个生物标志物的基因表达水平的患者的数据集，输入到具有所选择的生物标志物特征(生物标志物列表)的ANN中，从而将输出所选择的生物标志物特征的预测准确性，并也指明具体的患者数据集是否表示脓毒症对非脓毒症和/或SIRS的发展。训练的ANN的R脚本在表2中详细说明。
申请人指出，当输入到如表2中详细说明的ANN等数学模型中时，包括选自由表1中列出的266个基因组成的基因列表的至少25个基因(但优选约44个基因)的生物标志物特征(生物标志物列表)，或由这些基因表达的产物，所述基因，可以在症状发作前(症状出现之前)预测脓毒症的发展，且能够以至少92％的平均预测准确性区分脓毒症和非脓毒症的发展。
申请人还指出，当输入到诸如表2中详细说明的ANN等数学模型中时，包括选自由表1中列出的266个基因组成的基因列表的至少25个基因(但优选约44个基因)的生物标志物特征(生物标志物列表)，或由这些基因表达的产物，可以在症状发作(症状出现之前)前预测脓毒症的发展，且能够以至少95％的平均预测准确性区分脓毒症和SIRS的发展。到目前为止尚未鉴定提供如此高预测准确性的生物标志物特征，且显然这些特征的使用可以大大提高试剂盒、设备和方法的下述能力：能够鉴定可能发展脓毒症(即症状出现之前)的患者，并且能够也监测患有脓毒症的患者，并可能告知患者治疗。
表1.预测脓毒症的症状出现之前的发展的266个基因生物标志物，其使用多种数学方法从全转录组缩小选择(down select)。
表2.经训练的人工神经网络(ANN)的R脚本，其用于计算选自266个生物标志物的生物标志物特征区分脓毒症和非脓毒症和/或SIRS的预测准确性，从而表明输入到ANN中的患者数据集是否可以指示脓毒症发展的可能性。
用于本发明的优选的生物标志物特征是产生至少为92％的平均预测准确性来区分脓毒症和非脓毒症发展，或至少为95％的平均预测准确性来区分脓毒症和SIRS发展的那些，其可通过，将生物标志物特征输入诸如表2中详细说明的经训练的ANN等数学模型中的简单的迭代方法鉴定。特别是，申请人使用这种方法鉴定出44个生物标志物的关键生物标志物特征，其能够以100％的预测准确性区分脓毒症和SIRS，以97％的预测准确性区分脓毒症和SIRS。
因此，在第一方面，本发明提供一种用于在症状发作之前(症状出现之前)预测脓毒症发展的诊断试剂盒，所述试剂盒包含用于检测样品中生物标志物特征的每个成员的基因或基因产物水平的装置，其中，生物标志物特征包括至少25个基因，或由这些基因表达的产物，所述基因选自由表1中列出的266个基因组成的基因列表。
生物标志物特征可以是至少为75％的平均预测准确性来区分脓毒症和非脓毒症发展、脓毒症和SIRS发展，但是特别有利的，生物标志物特征能够是至少为92％的平均预测准确性来区分脓毒症和非脓毒症发展，和/或至少为95％的平均预测准确性来区分脓毒症和非脓毒症发展。
使用微阵列技术获得源自症状出现之前脓毒症患者的样品和对照非脓毒症患者样品的基因表达数据。使用无监督式生物信息学方法鉴定在临床症状发作之前表征脓毒症的预后转录组表达模式。进一步分析这些特征生物标志物模式并使用定量RT-PCR验证。
申请人表明全部的266个生物标志物的使用提供了超过95％的预测准确性来区分脓毒症和非脓毒症及脓毒症和SIRS发展。从266个中选择44个生物标志物可潜在提供高达100％的预测准确性来区分脓毒症和SIRS发展，至少97％的预测准确性来区分脓毒症和非脓毒症。
特别是，申请人鉴定了包含44个生物标志物的生物标志物特征，由这些生物标志物组成的列表在表3中，当全部44个生物标志物用于预测，其能够以100％的预测率预测脓毒症与SIRS。如表3所列出的，使用从这45个标志物的缩小选择的25个生物标志物的具体列表，能够以至少为92％的预测准确性来区分脓毒症和非脓毒症发展，和至少为95％的预测准确性来区分脓毒症和SIRS发展。虽然使用其他的数学模型和其他人工神经网络也可以获得这样的准确性，但是这些预测准确性使用表2中详细说明的人工神经网络，尤其能够获得。
表3.由选自266个基因生物标志物的44个生物标志物组成的具体的(第一)生物标志物特征，及进一步缩小选择的25个生物标志物列表。
表4中详细列出了选自266个列表的45个基因生物标志物的另一个列表，其也显示高于92％的预测性来区分脓毒症和非脓毒症，特别是用具体向下选择的25个生物标志物的列表。
表4.选自266个基因生物标志物的由45个生物标志物组成的另一个(第二)具体的生物标志物特征，及进一步向下选择的25个生物标志物列表。
45个和25个这两种另外的(第二)生物标志物特征与第一种44个基因的生物标志物特征分别共同具有11个和6个生物标志物。申请人还详细评估了44个生物标志物的14种其他组合，其中所有的组合至少具有75％的平均预测准确性，但其中6个组合具有至少92％的平均预测准确性。表5中列出了这些特征。这六个特征与表3中的第一种44个基因生物标志物特征共有至少5个基因，因此在一个实施方式中，选自266个生物标志物的44个生物标志物或25个生物标志物的任何组合可以包括来自第一种44个生物标志物的至少5个生物标志物，以提供至少92％的平均预测准确性。
在另一实施方式中，所述至少25个基因包括选自第一种44个基因生物标志物特征的至少11个基因。在第三实施方式中，所述至少25个基因包括至少完整的第一种25个生物标志物特征(表3中列出)。在第四实施方式中，本发明包含完整的第一种44个基因生物标志物特征(表3中列出)。
表5.选自266个生物标志物列表的44个生物标志物的六种组合，通过使用表2中详细说明的人工神经网络，其对脓毒症和非脓毒症的预测准确性至少为92％。
在第二方面，本发明提供一种用于分析来自动物的生物样品来预测和监测脓毒症发展的方法，尤其是在症状发作以前预测和监测脓毒症发展的方法，所述方法包括监测、测量和/或检测所选择生物标志物特征(生物标志物列表)中全部生物标志物的表达，并评价/评估从监测、测量和/或检测产生的数据来预测和监测脓毒症的发展。
所述方法优选能够以高准确性水平(诸如>75％，但优选>90％的准确性，或高达>92％)区分脓毒症和非脓毒症，也可能以相同的预测度区分脓毒症和SIRS。
所述动物可能是人，并且所述生物样品最有可能是血液或血清样品。
本发明的诊断试剂盒提供了一种用于检测包含上述生物标志物的基因或基因产物水平的装置。虽然基因表达可能通过检测基因产物(包括蛋白质和肽)的存在来确定，但这样的过程可能是复杂的。在特定的实施方式中，该装置包括用于检测核酸(特别是DNA)，或基因产物(其为RNA，例如mRNA)的装置。
所述监测、测量或检测可以使用任何合适的技术，其包括使用识别元件，或基于微阵列的方法。因此，在特定的实施方式中，本发明的试剂盒包括在其上为固定探针的微阵列，所述探针适合与由生物标志物特征的各基因表达的RNA结合。
在备选实施方式中，所述试剂盒至少包括适合于执行生物标志物特征基因或其区域扩增的某些试剂。
在一个实施方式中，生物标志物表达的监测、测量或检测使用实时(real-time，RT)聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)。在这种情况下，该装置可以包括用于扩增所述基因或其区域的引物。所述试剂盒可以进一步包括标记，特别是荧光标记和/或寡核苷酸探针以允许使用任何已知的检验以使PCR被实时监测，所述检验如TaqMan、LUX等。所述试剂盒还可以包含执行核酸扩增反应必需的试剂，诸如缓冲液、酶、如MgCl的盐等。
有利地是第二方面的方法是计算机执行的，以处理在监测和分析多种生物标志物和它们各自相互关系时的复杂性。当回答时，这样的计算机执行的发明可以对是否有可能发展脓毒症给出是/否答案，或至少提供脓毒症发展有多大的可能性的指示。
所述方法优选使用数学建模工具和/或算法对生物标志物的表达定性和定量地进行监测和评估。特别是，该工具包括支持向量机(support vector machine，SVM)算法、决策树、随机森林、人工神经网络、二次判别分析、和贝叶斯分类器。在优选的实施方式中，通过人工神经网络装置，例如表2中详细说明的训练的人工神经网络评估来自监测生物标志物特征中的全部生物标志物的数据。
第二方面的一个实施方式中的方法是一种计算机执行的方法，其中，监测、测量和/或检测包括产生定量的(和可选的定性的)全部生物标志物的数据，将所述数据输入到计算机上的分析过程中，使用至少一种将所述数据与参考数据进行比较的数学方法，并且从所述分析过程中产生输出，其提供了发展脓毒症可能性的预测，或可以监测脓毒症的病症。参考数据可以包括来自健康受试者、被诊断患有脓毒症的受试者、患有SIRS但没有感染的受试者的数据。
来自分析过程的输出可以使得症状发作的时间是可预测的，如在症状发作之前的1、2、或3天，因此作为结果，其对于医师在建议治疗疗程时是特别有价值和有用的，尤其是对治疗疗程的选择依赖于疾病的进展时。所述方法也能够监测任何治疗的成功性，评估在治疗过程中症状发作可能性是否降低减少。
在第三方面，本发明提供一种用于分析来自动物的生物样品以预测和监测脓毒症发作的设备，所述设备包括用于监测、测量或检测如上所述的生物标志物特征的全部生物标志物的表达的装置，如使用对生物标志物特征中的生物标志物具有特异性的试剂的RT-PCR，及用于分析从监测、测量或检测装置产生的数据的装置，如包含适当的分析数据用数学模型(如人工神经网络)的计算机，及用于从所述分析提供输出的装置，所述输出是提供动物患有脓毒症可能性的预测的输出，或者是也可通过适当的编程计算机提供的能够监测脓毒症的输出。
本发明现在将参考以下非限制性实施例和附图进行描述，其中
图1是用于对RNA样品制备进行随机选择的生化分析仪结果的显示；
图2是描述样品选择、特别是对照样品的选择的基本原理，并将其与脓毒症患者样品匹配的说明；
图3是详细介绍在表24中详细说明的15种组合对脓毒症和非脓毒症的预测准确性的图表；及
图4是表明选自表1的266个生物标志物的生物标志物的不同子集的预测准确性的图表和表格。
实施例-脓毒症症状出现之前的生物标志物的预测组(panel)的开发
此工作程序的目的是通过对来源于在脓毒症的临床发作之前从人类患者收集的血液样品的宿主转录组进行全面分析，开发用于脓毒症的症状出现之前生物标志物的预测组，并开发可以指明是否和何时临床症状会在感染后出现的生物标志物特征。在这样做的时候，它会产生基于转录组生物标志物特征区分脓毒症患者和对照患者的适当有力的生物信息学模型。进而，这将有助于开发用于脓毒症预测的RT-PCR方法，其中当医疗对策最有效时，这种能力应该提供对感染的及时诊断和治疗。
我们采用微阵列技术获得来自症状出现之前脓毒症患者的样品和对照非脓毒症患者的样品的基因表达数据。使用无监督性生物信息学方法鉴定预后转录组表达模式，其在临床症状发作前表征脓毒症。进一步分析这些特征性生物标志物模式并在FluidigmBioMarkTM实时PCR阵列平台上使用定量RT-PCR进行验证。
通过显著性测试，获得了266个生物标志物最终的组。然后将其完整组和子集用于多种的统计模型中，以确定在脓毒症和非脓毒症患者之间的区别。人工神经网络给出了最高的预测准确性，其具有44个生物标志物作为最优子集。
技术总结
患者样品的获得和存储-当他们知情同意后将患者纳入研究，其年龄在18和80岁之间，并且正在经历在临床医生的意见中有引起感染和最终脓毒症的风险的过程。所述过程通常是腹部和胸部外科手术。然而，也允许和包括其他外科手术过程，其中一种情况为大面积颌面部过程导致脓毒症。如果他们怀孕、被已知病原体感染(HIV、甲、乙、丙型肝炎)、免疫抑制或在他们参与的任意时间撤回参与研究的同意，排除这样的患者。一旦参加，所有患者均接受正常标准的护理。
根据策略收集血液样品。简而言之，两个4ml等份的患者血液被收集到无菌EDTA真空采血管中，然后立即转入含有10.5ml(RNA稳定介质)(Life Technologies，美国)的无RNA酶的小瓶中。然后将其储存在-20℃，并最终在干冰上运输。另外，4ml患者血液被收集到血清分离管中，旋转，分离并在20℃储存。血液采集在外科手术前1至7天发生一次，然后在外科手术后每日一次。在病人出院后、或外科术后7天后、或一旦由临床医生证实脓毒症，手术后的采血停止。使用ItemTracker(英国)提供的定制的数据库获取另外的病人信息(如每日病人指标、手术类型和微生物学结果)。
我们招募了2273名择期外科手术患者到本研究中，其中1842名患者的时程在存储中，其中72名患者继续发展脓毒症。因此，我们患者群中脓毒症的发病率是3.91％。剩下的超过600名患者符合针对SIRS的标准设定(以下四个症状中的2个：增加的/降低的温度；增加的心率；增加的换气次数，增加的/减少的白细胞计数)。然而，许多这些“SIRS”患者的症候学具有非常短暂的变化。我们怀疑通过中心的临床工作人员的鉴定出的这438名病人，更能反映具有延长的SIRS患者的数量。
所述患者招募是足以满足30名脓毒症患者的时程(加上匹配的非脓毒症患者对照组)的要求，其用于2011期间发现的生物标志物，以及另一个40名脓毒症患者的时程(加上匹配的非脓毒症患者对照组)，其用于2012期间生物标志物的验证。
分析首批61名SIRS患者的血液样品。在这些样品中，2个被鉴定为在血液中存在微生物DNA(一名患者具有大肠杆菌(E.coli)及另一名具有金黄色葡萄球菌(S.aureus))。这些患者被重新归类为属于继续发展脓毒症的患者群体。其余的59名患者具有不可检测水平的微生物DNA水平存在于他们的血液中。这表明，这些患者真正属于SIRS患者组。然后将来自两组患者的生物标志物特征用于生物标志物的发现分析，其提供用于外科择期手术患者中脓毒症的症状出现之前诊断的生物标志物特征。含有来自发展SIRS或脓毒症的患者的样品，及来自不发生任何外科手术后症状患者的样品(术后对照)的第二批190名患者的样品使用Sepsitest再次进行分析。通过Sepsitest，所有术后对照患者样品被确认为阴性。此外，分离自具有血液传播感染的脓毒症患者的全部患者样品也被正确鉴定。所有的SIRS患者的确诊为不是脓毒性的。
从稳定介质提取RNA-选择用于进一步微阵列和Fluidigm阵列分析的来自全部患者的RNA使用RiboPureTM-血液试剂盒(Life Technologies，美国)提取，接下来用TURBODNA-freeTM(Life Technologies，美国)进行处理。为了确保样品制备的品质，在Agilent2100BioAnalyser(Agilent，美国)上使用Agilent BioAnalyser RNA 6000Nano试剂盒(Agilent，美国)评估全部RNA产物的品质。关于图1，使用Agilent 2100BioAnalyser(Agilent，美国)，采用12个随机选择的样品显示100个RNA样品的定性指示。在每个泳道的双条带表明降解很少的品质良好RNA。进一步测量RNA制备的品质和数量，如RNA完整数(RNAintegrity number，RIN)，和每个制备中的RNA浓度，表明RNA分离策略是适用于目的的(表6)。
表6.典型的RNA样品的定量和完整性
超过99％的RNA样品达到7以上的RIN，其收率2μg以上。这对于在这些样品上进行微阵列和定量RT-PCR分析的品质和数量是足够的。在罕见的情况下，当样品制备给出不满意的收率时，重复四次此过程，且所述产物仅用于定量RT-PCR(即有足够的RNA来产生cDNA和随后进行PCR)。
对继续发展脓毒症和不发展脓毒症的那些患者的选择是每个中心的主要研究者(Principal Investigators，PIs)的责任。他们都是有多年的临床经验的重症监护医师，在他们之间有超过265篇同行评议出版物。来自这四个中心的四个PLs中的两个是欧洲和美国的期刊和资助机构的主要顾问。临床医生的选择是由项目组进行双重检查的，以确保所有的患者符合定义脓毒症的先前商定的标准。围手术期抗生素的使用是最小化的，在脓毒症诊断之前，在85.7％的脓毒症患者病例中仅给予一剂广谱抗生素。其余的患者接受每日剂量的抗生素，但仍发展脓毒症的临床证据。在临床指导下，我们将这些患者包括在研究中，因为他们尽管接受治疗仍发展脓毒症，虽然其这样的治疗可能影响微生物培养结果。本研究中导致脓毒症的感染原的范围是相当广泛的，并在表7中列出。
表7.本研究中的从I期和II期脓毒症患者中分离的感染源。
一旦患者被确认为脓毒症，选择与每个脓毒症患者的年龄、性别和过程相匹配的比较者。作为其外科手术结果，这些患者不发展SIRS。关于图2，说明了比较选择的基本原理以及分析了哪些患者样品，及不同外科手术后天数的患者样品的时间框架如何归一化。应该指出的是，主要分析工作是集中在脓毒症的诊断3天前，因为这些最有可能产生有用的症状出现之前生物标志物特征。患者中脓毒症的发展的时程由脓毒症患者#1条指示。从在外科手术后不继续发展脓毒症的大量患者中，鉴定了合适的年龄/性别/过程的匹配对照并作为比较者。在此实施例中，脓毒症诊断的天数为感染后第7天。因此，脓毒症诊断前的3天为外科手术后的第4、5和6天。以症状出现之前的诊断方面，其可以也指第-3、-2和-1天。为了提供脓毒症诊断前3天的每一天的鲁棒性相关的术后比较，使用等效的术后血液样品。在这种情况下，取自术后第4、5和6天的血液样品用于比较，作为第-3、-2和-1天对照。将继续发展脓毒症的患者的症状出现之前的血液样品与它们最适当的术后比较者匹配的过程在I期和II期研究中进行重复，这样继续发展脓毒症的30名和40名患者的时程分别与30名和40名术后比较者患者相比较。
除了非脓毒症对照组外，通过开发每个患者的手术前样品以及发展SIRS和非脓毒症患者的样品，提供了其他对照。这确保脓毒症患者转录组中观察到的任何变化是外科手术过程中获得的感染的直接结果。本研究的I期和II期中使用的患者的总结在表8中给出。应该指出的是，抗生素的使用取决于个案基础和临床医生的判断。研究策略不影响患者的管理；伦理学上在研究中我们无法决定医疗对策的使用。
表8.患者年龄、性别、脓毒症的延迟及I期和II期使用的外科手术类型的总结
微阵列分析(I期生物标志物的发现)-对来自60名I期患者(30名脓毒症&30名比较者)、80名II期患者(40名脓毒症&40名比较者)和40名II期SIRS患者的样品运行Human HT12v4Beadarrays。其相当于本研究中I期中分析的192个转录组和II期中的433个转录组。收集30名脓毒症患者和30名年龄、性别和外科手术相匹配的对照(或基线)的数据。从192个血液样品中收集微阵列数据。其代表了对应于手术前和脓毒症发作前1、2和3天的4个不同的时间点。基于脓毒症样品发作的相应天数，对于每个配对的基线获得样品，其总结在表9中。
表9.本研究中I期中使用的样品数量。
比较者 脓毒症
手术前 30 30
发作第-1天 30 30
发作第-2天 21 21
发作第-3天 15 15
Human v4芯片包含48,804个探针，描绘了超过27,000个参考序列数量。每个探针为50个碱基对长，其提供对每个基因的高度特异性。对于每个样品，从总RNA中制备珠蛋白降低RNA(GlobinClearTM,Life Technologies,美国)。使用Bioanalyzer 2100(Agilent,美国)测量RNA完整性，且使用NanoQuantTM(Tecan,美国)评估RNA浓度。cRNA通过使用TotalPrepTM RNA扩增试剂盒(Life Technologies)进行扩增和标记而制备，并且杂交到人类HT-12v4Beadarrays(美国)。然后用HighScanHQTM对各芯片成像，所得强度表明各探针相应基因的表达水平。然后使用GenomeStudioTM软件(美国)产生减去背景的数据。
进行I期的微阵列数据的多种初步或探索性分析，以确定是否：
1.有任何批次处理影响数据。
2.外科手术前和外科手术后转录组之间有差异。
3.继续发展脓毒症的患者和其基线比较者的转录组之间有总的差异。
批次影响
使用3D主成分分析(Principal Component Analyses，PCA)来检查在本研究中样品杂交天数是否对患者的转录组有影响。
数据表明，在不同天数杂交的样品没有分成不同的组。这表明，根据杂交天数在样品中间不存在批次影响。
外科手术前和外科手术后转录组
也使用3D PCA来指明在外科手术前和外科手术后的患者的转录组中是否存在任何差异。分析表明，外科手术前患者的转录组群聚。这表明它们比外科手术后的患者的转录组彼此之间更相似。此外，整个外科手术后的患者样品的转录组群远离外科手术前的转录组群聚，这表明与外科手术前患者的转录组相比，他们彼此之间也有更多的共同。
继续发展脓毒症的患者和其比较者之间的区别
与PCA类似，分级群聚(Hierarchical Clustering)是用于数据集的无监督性分析的工具。通过使用热图，其用于描述两组患者的转录组。分级群聚涉及数据集中的基因的重新排序，从而类似的转录组模式(表达谱)彼此相邻放置。实际上，它是有助于鉴定彼此相关的样品的工具。
热图的初步勘验表明，外科手术前样品以及第-1、-2和-3比较天的基线患者的转录组群聚在彼此附近，通常在热图的上半部分。相反，在第-1、-2和-3天继续发展的患者转录组似乎在热图的底部群聚在彼此附近。这表明，继续发展脓毒症的患者和其基线比较者的转录组之间存在区别。
收集192个样品的转录组数据后，需要进行进一步分析以阐明关键的生物标志物，其表达在两组患者之间存在显著性差异。这些宿主应答基因将形成生物标志物特征的基础，其可以用来指明可能发展与威胁生命的疾病相关的症状的个体。
生物标志物的发现-微阵列(I期)-
数据预处理
数据预处理中主要有三个主要步骤：
1.对数变换-对转录组数据进行loge变换以符合进一步分析所需的正态假设
2.外科手术前减法(Pre-surgery subtraction)-由于对手术的应答，为了获得每个样品的对数表达，将所有样品归一化为与外科手术前表达水平相比的差。
3.中位数减法-考虑到系统变化，这在每个基因探针内是重要的。
确定感兴趣基因的多假设检验
对于脓毒症诊断前3天，我们使用多重t检验来辨别基因表达的显著性差异的证据(低于指定的阈值p值)。分析表明，在脓毒症诊断前全部3天，452个基因在两组患者中间有显著性差异。我们还确定了有证据表明，在脓毒症诊断前的每一天，两组之间具有显著性差异。分别在脓毒症诊断前3、2和1天，91个、1022个和938个基因的表达有证据表明有显著性差异。
然后我们采取类似的方法，执行如斯坦福大学R.Tibshiriani发表的微阵列(SAM)分析方法方法(Tusher VG,Tibshirani R,Chu,X.2001.Significance analysis ofmicroarrays applied to the ionizing radiation response.Proc Nat Am Sci 98:5116-5121)的显著性分析。这种方法常用于微阵列分析。我们感觉这种替代方法是值得探索的，因为它们有可能提供第一发现的独立验证，从而信任用于症状出现之前诊断的生物标志物的最终选择。
表达分析和随后的SAM
基于已知的响应变量(诸如脓毒症的发作)，使用表达分析作为受试者组之间基因表达的差异测试。使用表10中的患者组限定，响应变量产生了4个不同的测试。
表10.用于表达分析的患者分类
比较者 脓毒症
发作第-1天 B1 S1
发作第-2天 B2 S2
发作第-3天 B3 S3
四个测试为：
S1+S2+S3vs.B1+B2+B3
S1vs.B1+B2+B3
S2vs.B1+B2+B3
S3vs.B1+B2+B3
使用在R统计语言软件中的SAM包进行上述的4个测试中的每一个的表达分析。对于每个基因i，表达统计d是从两个响应组之间的表达平均差异计算的。根据下面的公式，此平均差异r是以标准差s为比例的：
d i = r i s i + s 0 ; i = 1 , 2 , ... p
基于量级，此统计具有自然排序，因为其测量基因表达和响应变量之间的关系强度。
为了确定哪些基因是差异性表达的，SAM使用置换分析以多种不同的测试统计阈值(Δ)来估计局部错误发现率(false discovery rate，FDR)。
对于每个测试，FDR固定在1％，以确保错误识别的显著性基因的一致风险。然而，作为阈值变化的FDR的变化依赖于表达统计的分布，且对于Δ给定的范围，通常具有最小的FDR。
例如，表11显示在症状发作前2天脓毒症诊断的预估错误发现率。
表11.对于第2天脓毒症的Δ值的范围，第90个百分位的预估错误发现率。
第90个百分位用作可能的错误发现率(FDR)的上限。1％的FDA(0.01)被认为是可接受的风险。但从上表中明显看出，当我们增加Δ超过1.47，其再次增加。因为这也满足FDR<1％，选择1.47的Δ，对于此诊断总共鉴定109个显著性基因。
作为此方法的结果，我们鉴定了在脓毒症发作前的全部3天在两组患者之间的表达不同的458个基因。此外，发现167、179和266个基因的表达分别在第-3、-2和-1天于两组患者之间特异性差异性表达。基因总数的中163个对这样的测试是独特的，第-1天18个，第-2天12个，第-3天51个。
模型
必须将选择用于进一步验证的任何生物标志物进行数学建模，这样可以对其性能进行定性和定量评估。然而，重要的是通过下述来确定有用的模型：
·确保任何假设都符合分析的目的，
·确定模型选择的先例，除非所述分析是新方法，
·进行适当的敏感性分析，以确定模型的局限性，
·用科学的原理把模型本身联系在一起。
在生物统计学和生物信息学领域内，多种分析途径和算法(或模型)是可用的。使用所有这些方法来帮助选择和验证对于脓毒症的症状出现之前诊断而言最合适的生物标志物是不可能的。在此项目的背景下，使用的分析标准描述在表12中，由于可能性模型的要求，其中多种方法逐步被忽视。
表12.用于生物标志物选择和分析的模型的缩小选择(down-selection)。
为确定最佳拟合，产生了一些模型。
分析1
使用支持向量机(SVM)、随机森林和差别分析来对Fluidigm阵列鉴定用于靶向qRT-PCR的用于缩小选择的基因。也使用利用纵向信息的生存分析。全部分析通过R2.14.0和相关R包进行。
SVM和随机森林是监督性机器学习算法，常用作生物信息学工具。由这些方法提供的变量(基因)选择的易用性是适用所述方法的关键因素。SVM使用观察来发现最佳分离两个经标记组的超平面。随机森林算法是一个集合分类器(ensemble classfier)，其使用袋来创建许多独立的分类树。每个树具有其自身的训练数据集，原始观测的子集大约是样品的66％，剩余的样品用来确定树的准确性。每个分类树使用随机变量子集创建，使基因基于其对树的准确性产生多大影响的测量进行排名，其被称为平均Gini系数。随机森林是产生0和1之间的值的概率分类器，其指明给定的样品属于特定的分类的可能性。
也使用生存分析以发现在脓毒症发展中发挥作用的探针。该方法的主要吸引力是，它允许来自不同天数的微阵列数据被纳入到模型中，而机器学习方法只使用一个点来寻找重要的基因。然而，对于每个基因，此技术未被开发用于预测并创建单独的模型。与标准差异性表达的t统计相似，对每个基因计算检验统计，然后其用于将基因排序。
当分析I期微阵列数据时，SVM、随机森林、差异性表达、和生存分析方法显示在基因选择中具有显著性重叠，如表13中详细说明。使用全部术后时间样品，通过随机森林和SVM和生存分析发现的在脓毒症前的前531个基因与通过差异性表达基因发现的基因有很大的重叠。所有的重叠是高度显著的(P值＜0.001)且重叠基因的数量在表13中给出。
表13.表达的基因的差异性表达分析-不同模型之间的重叠基因。
方法 SVM 生存分析 差异性表达
随机森林 154 140 59
SVM 255 98
生存分析 91
使用此数据的预测率然后通过随机森林和支持向量机(SVMs)进行计算。每个天数(术前，第1天等)被分为脓毒症和对照组。第-1、-2、和-3天的预测通过除法、减法的术前归一化，及不进行归一化进行。也考虑天数的平均值，例如对于每个患者第-1天和第-2天的平均。为了保持样品是独立的假设，没有天数被一起分组到meta组(无论是脓毒症或对照)。对于生存分析，在每个时间点是等距的错误假设下使用所有数据(术前和第-3天之间的时间是可变的)。
脓毒症的随机森林预测
随机森林是由许多简单的树分类器组成，每一个基于用于训练和测试每个树的样品的不同随机子集(70％对30％)，从而允许错误率的准确估计。下面是每个时间组中用于预测脓毒症的敏感性和特异性。注意到第-2天和第-3天(D-2和D-3)具有较小的样品尺寸。通过术前(用未记录的数据相除)归一化以及组合天数显示第-1天和第-2天的平均，获得最准确的结果。通过减法进行的归一化(未显示)不如通过除法进行的归一化。
表14.使用随机森林鉴定的基因的性能
过滤的 敏感性 特异性 错误率
术前 0.667 0.643 0.345 20
D-3 0.786 0.8 0.207
D-2 0.95 0.857 0.0976
D-1 0.778 0.786 0.218
为了提供与随机森林的比较，使用具有允许非正态分布探针的Wilcoxon检验的支持向量机(SVM)(表15)。我们关注第-1天和第-2天的平均，考虑到其表现是最佳的，且使用20％的测试采用5倍交叉验证。标准误差显示在括号中。
表15.使用支持向量机的鉴定的基因的性能
这两种方法都证明是可以接受的，但两组患者之间的差异不显著。这表明，当尝试对这些数据集建模时，其他技术可能是有用的。
分析2
人工神经网络(ANNs)提供预测数据分类的能力，给出了实例数据集的未知模式，并已成功地应用在试点研究中。神经网络分析通过以下过程进行描述。其分别进行了5次，以显示预测能力的可能变化。
1.对各单独的测试，所有脓毒症、脓毒症第-1、-2和-3天，基于SAM分析鉴定基因表达数据。对于每个基因，此数据通过减去中位数和通过标准偏差衡量而归一化。
2.归一化的数据被分为用于训练的70％的子集和用于验证神经网络的30％的子集。
3.对神经网络进行训练，且使用每个隐藏单元的权重来形成新数据的预测器。
4.30％的子集通过预测器，且对于分配给两组的每一个概率是给定的。(脓毒症、非脓毒症)
5.神经网络的预测能力是基于从30％的未知数据集评估的特异性和敏感性。
然后平均特异性和敏感性从五个独立的神经网络中获得，且所述结果总结在表16中。
表16.基于五个重复预测器的标准偏差，关于有间隔的不同天数的脓毒症预测的结果总结，其基于通过SAM分析鉴定的基因。
神经网络分析受可以用来评估敏感性/特异性的样品数量的限制，因为新数据必须通过预测器。我们完全接受，用此数据集，基于更大量多患者，其他分类技术可能能够提供更准确的结果。然而，它确实比在分析1中使用的技术有更好的表现。
关于SAM分析中鉴定的458个基因，且由于测试统计量级的自然排序，可以选择从此列表的顶部选择基因以找到具有类似预测能力的较小的子集(数据未显示)。
作为分析1和分析2中进行不同分析的结果，进行生物标志物的缩小选择。使用Fluidigm q RT-PCR阵列系统，选择通过上述的任意技术鉴定为最具预测性的这些生物标志物进行进一步分析。基于所有样品的一致表达，选择总共270个基因，以及具有6个管家基因(BRD7、PWWP2A、RANBP3、TERF2、SCMH1、FAM105B)。
Fluidigm确认和微阵列生物标志物的定量-使用Fluidigm BioMarkHD来描绘在全部时间点采集的60个I期样品和80个II期样品的270个基因。BioMarkHDTM是在96个样品中运行96个引物-探针对的qPCR检测。具体来说，珠蛋白降低RNA(GlobinClearTM,LifeTechnologies,美国)转化为cDNA(High Capacity RT kit,Life Technologies,美国)并用全部感兴趣的检测(在此情况下，276个检测引物对的池)的引物池(DeltaGene,Fluidigm,美国)通过限制性PCR(PreAmpTM Master Mix,Life Technologies,美国)进行预扩增。用外切酶I(New England Biolabs,美国)处理预扩增cDNA并稀释以移除未使用的引物和dNTPs，从而制备用于qPCR的样品。预扩增样品与具有Low ROX(Bio-Rad,美国)的2x SsoFastEvaGreen Supermix和20x DNA结合染料样品上样试剂(Fluidigm,美国)组合，且检验(引物对)与2x测试上样试剂(Fluidigm,美国)组合。通过BioMarkHDTM(Fluidigm,美国)上实时PCR分析的96个动态阵列IFC，样品和检测的混合被加载到96个之上。使用Fluidigm’s实时PCR分析软件进行预处理，以确定周期阈值(Ct)，使用线性(导数)基线校正和自动检测，检验特异性阈值确定。使用参考或管家基因来归一化每个检验和产生ΔCt值。然后用被称为Δ-ΔCt’s的得到的值，使用参考样品来归一化板上的全部样品。使用96孔板的3个96个孔来描绘全部270个基因加上每个板上的6个管家基因。
来自60个I期患者的总共269个(原I期192个+来自比较者的额外样品)样品和来自80个II期患者(+40SIRS患者样品)的439个样品通过Fluidigm BioMarkTM进行描绘。需要指出的是，首先分析来自研究I期的数据。初始分析使用SVM来评估缩小选择的生物标志物列表的性能。如表17中详细陈述，所述阵列在鉴定非脓毒症比较者患者是非常良好。然而，其对于脓毒症患者的阳性鉴定的性能随着距离脓毒症诊断的时间而减少。此外，当将脓毒症前三天的数据合并时，所述阵列给出的整体预测准确性为78.8％。
表17.使用Fluidigm阵列，在预测关于I期数据的症状出现之前的脓毒症患者和其比较者中，缩小选择的生物标志物的性能(％)
优化生物标志物特征
由于在1期内分类器的性能，决定了生物标志物列表要求根据新知识而更新。基于差异性分析，I期的结果能够对基因列表缩小选择。
用II期样品进行生物标志物验证-具有独立数据集的盲法测试。在研究过程中获得新患者样品集，并用来验证来自I期的缩小选择的基因。全部RNA样品被制备、盲法并送去使用微阵列和Fluidigm阵列分析进行分析。如上所述，266个基因通过多种方法确定，诸如应用SAM分析。然后通过使用此所用分类算法得到测量进一步减少此基因集，所述算法如随机森林分类器中的Gini系数。
然后选择两组分类器，一个具有45个基因，另一个具有25个基因。其在表18中指明。
表18.在本研究的II期中测试预测准确性的45个和25个基因分类器，其对433个盲法RNA样品使用微阵列和Fluidigm阵列分析。
我们对每个非混合的来自和送出样品的患者类型进行预测。这些分类器的性能总结在表19中。
表19.生物标志物分类器的性能(％)–(A)来自比较者患者的样品的预测准确性，(B)来自症状出现之前脓毒症患者的样品的预测准确性
表19证明了进行的分析可以对脓毒症患者和非脓毒症患者及其比较者之间进行分类至给定水平。此表也显示进一步远离脓毒症诊断日期，且随着N的减少，分类器性能增加。
生物标志物评价-在决定从起始Fluidigm阵列中移除某些生物标志物后，我们重新构建了它们的31.5％，其具有更多的候选生物标志物，以用于用更多的候选物来鉴定II期。最终的生物标志物列表仍然有鉴定的180个高度显著性的基因并在I期中用于Fluidigm确认。加入通过SAM分析鉴定出的另外的候选生物标志物，以增加寻找关键症状出现之前生物标志物的可能性。然后，这使基因列表保持哪些是被确定为最佳的基因，并添加差异性分析显示为显著的其他基因到列表中。此最终列表在表20中列出。
表20.在II期中用于Fluidigm阵列的最终缩小选择的基因
为了理解为何这些候选生物标志物在两个患者群中指明脓毒症，采用GeneGo软件分析了受这些缩小选择的基因的表达变化影响的途径和网络。补体、上皮至间充质和细胞骨架重构途径具有最高比例的基因，所述基因在脓毒症诊断前1天在全部宿主途径中过表达。与之相反的是，与免疫细胞和G蛋白信号传导相关的途径在脓毒症诊断前1天的宿主应答途径的下调基因的比例最高。在健康对照患者中，炎症、凋亡细胞和细胞粘附网络上调最多，且因此在脓毒症患者组下调最多。对于控制蛋白翻译、抗原呈递和T细胞受体信号传导的网络，观察到类似的模式。
显著的生物标志物的q RT-PCR验证-具有独立的数据集的盲法测试(II期样品)。鉴于第一缩小选择的生物标志物的性能，决定了我们也将缩小选择具有更少数量基因但会提供良好预测准确性的第二生物标志物集。为了与第一集比较，由44个和25个基因组成的2个症状出现之前的生物标志物分类器通过下述进行缩小选择：取266个基因列表的随机样品，并确定ANN的预测准确性。表21中列出的44个和25个基因是使预测准确性具有最高值的基因列表。
表21.使用433个盲法RNA样品的Fluidigm阵列分析，在研究II期中测试预测准确性的44个和25个基因分类器
探索性分析
对验证群上使用266个基因，对脓毒症、SIRS和比较者患者数据进行主成分分析(PCA)。三组患者的分离允许进行进一步的分析，因为其表明了通过分类算法发现组之间有分离。当对验证群使用利用Dstl44基因分类器的PCA分析用于时，这种分离变得更明显。
ANN结果
进行的ANN方法已作为I期工作的一部分被描述。在相应于术前、脓毒症发作前1、2和3天的不同时间点，使用取自70名脓毒症患者和70名比较者(1期和2期患者的组合)的数据/样品进行训练和测试(70:30)，因此，其使用超过600个样品。基于5个重复预测器的标准误差在间隔的不同天数上脓毒症预测的总结结果显示在表22中，其使用表2中详细说明的人工神经网络。
表22通过使用ANN预测脓毒症的总结结果
所述结果表明，ANN可以以高可信度对脓毒症和非脓毒症患者进行分类。当减少分类器中的基因数量时，例如减少到25，这种可信度几乎没有变化，。研究结果还表明，对于待分类的基因存在最佳数量。
神经网络分析-SIRS
这些结果潜在的混杂因素为发展SIRS而不是脓毒症的患者)的生物标志物特征与脓毒症患者的那些类似或重叠的可能性。这可能会引起错误的阳性结果并破坏脓毒症的症状出现之前生物标志物特征的预测值。这将导致结果缺少可信度。为此，对40名SIRS患者的数据就脓毒症生物标志物特征运行ANN，其结果显示在表23中。
表23.基于5个重复预测器的标准误差，间隔的不同天数上脓毒症对SIRS的预测的总结结果
表23中的结果表明，ANN有效地在脓毒症和SIRS患者生物标志物特征之间进行分类。再次如表22所示，似乎对于分类存在有最佳的基因数量。此外，263个基因和45个基因之间的差异表明263个基因生物标志物列表在其内与SIRS特征具有共性。
通过从266个的列表中随机选择的44个生物标志物的44,014个组合/生物标志物特征的产生，显示所有组合的平均预测准确性大于75％(事实上大于76.1％)。在顶部和底部1000个子集中的个体基因的丰度是不均匀的；在44个顶部子集中基因出现的更频繁，在底部子集中出现不那么频繁，反之亦然。
这些结果通过表24中列出的15种具体的组合说明，其具有如图3所示的准确性。因此，在一个实施方式中，生物标志物特征包括选自由表1中列出的266个基因组成的基因列表中的至少44个基因。
表24.测试预测准确性的44个生物标志物的十五种组合。预测准确性示于图3中。
关于图4，从266个基因的整个组中形成不同数量的生物标志物的98个子集，其中，每个子集以仅包括选自44,014的顶部1000个子集的特定丰度水平的基因为特征。所述子集范围从单一的基因(LDLR，这是迄今为止最丰富的)到266个生物标志物整个组。其中多个基因具有相同的丰度，它们都包含与所述阈值相关的单一的子集中，这是为什么有较少的子集而不是总的基因。来自更基本的而不是表2中详细说明的ANN的趋势，显示随着子集的大小的增加，预测准确性增加，当子集大小为97个基因时，其开始到达平台期。此处最大预测准确性达到97.0％。当子集大小超过149个基因时，预测准确性开始下降，下降到89.6％。虽然此处我们检查单独定义的子集而不是很多随机的子集，这种趋势与使用随机森林获得的结果不匹配。在达到最大预测准确性的三个子集中，最小的一个(子集50)包含在测试的顶部1000个子集中出现超过165次的基因。
通过使用系统规模分析技术，本研究在相当大的盲法验证集中鉴定了以高准确性预测手术后脓毒症的发展的生物标志物特征。分析复杂数据集的关键是分析方法。我们的方法是在人类中没有一个生物标志物是可能预测脓毒症的结论上进行预测的。症状出现之前生物标志物表达的在先研究显示生物标志物表达的传统线性分析可能不能揭示两组患者(即脓毒症和非脓毒症患者)之间的差异。使用多种非线性技术，它们在区分继续发展脓毒症的患者及其比较者之间具有不同程度的成功。随机森林和SVM证明区分来自不同患者组的转录组的某些使用。然而，使用25个和44个基因的生物标志物特征的ANN分析表现优异。在区分继续发展脓毒症的患者及其比较者之间时，这些给出了高预测准确性以及高敏感性和特异性。此外当测试具有SIRS而不是继续发展脓毒症的患者的可能混淆的转录组时，得到的生物标志物特征是非常鲁棒性的。
非线性技术的强大的性能也许不是出乎意料的，因为免疫标记在整个脓毒症的整个过程中波动很大。使用简单的线性技术的分析可被用作轻易选择关键的生物标志物特征是不可能的。
值得注意的是，通过使用多重q RT-PCR对患者转录组的成功测试表明，这项技术的进一步发展是适宜作为诊断检验的。
转录子集的功能相关性构成了此特征，这与炎症和脓毒症过程中所涉及的事件的协调分子和细胞链广泛相关，给我们的结果灌输了信心。的确，补体途径的激活已显示在脓毒症和炎症反应中发挥重要作用。相反，已显示树突状细胞和其他抗原呈递细胞在脓毒症事件期间从循环中消失，其可能负责所观察到的与MHC基因表达相关的转录物丰度减少。值得注意的是，通过这种公正的全球分析方法鉴定的大多数的候选标志物，还尚未被表征为这些很少的功能丰富的“里程碑”的转录物。

Claims (21)

1.一种用于在症状发作前(症状出现之前)预测脓毒症的发展的诊断试剂盒，所述试剂盒包含用于检测样品中生物标志物特征的每个成员的基因或基因产物的水平的装置，其中，所述生物标志物特征包含选自由表1中列出的266个基因组成的基因列表中的至少25个基因，或由这些基因表达的产物，并且能够以至少92％的平均预测准确性来区分脓毒症和非脓毒症发展。
2.如权利要求1所述的诊断试剂盒，其中，所述生物标志物特征能够以至少95％的预测准确性来区分脓毒症和SIRS发展。
3.根据前述权利要求中任一项所述的诊断试剂盒，其中，所述生物标志物特征包含选自由表1中列出的266个基因组成的组中的至少44个基因，或由这些基因表达的产物。
4.根据前述权利要求中任一项所述的诊断试剂盒，其中，所述生物标志物特征中的至少5个基因选自由表3中的44个基因组成的组。
5.根据前述权利要求中任一项所述的诊断试剂盒，其中，所述生物标志物特征包含表3中的25个基因的选择。
6.根据前述权利要求中任一项所述的诊断试剂盒，其中，所述生物标志物特征包含表3中的44个基因的选择。
7.如权利要求6所述的诊断试剂盒，其中，所述生物标志物特征由表3中的44个基因组成。
8.根据前述权利要求中任一项所述的诊断试剂盒，其中，用于检测基因或基因产物水平的装置包含用于检测核酸的装置。
9.根据前述权利要求中任一项所述的诊断试剂盒，其中，所述装置包含在其上是适合与由所述生物标志物特征的每个基因表达的RNA结合的固定探针的微阵列。
10.如权利要求9所述的诊断试剂盒，其中，所述装置包含至少一些适合对所述生物标志物特征的基因或其区域进行扩增的试剂。
11.如权利要求10所述的诊断试剂盒，其中，所述扩增为实时(RT)聚合酶链式反应，且其中，所述装置包含用于扩增所述基因或其区域的引物。
12.一种用于分析来自动物的生物样品以预测或监测在所述动物中的脓毒症发展的方法，所述方法包括监测、测量和/或检测如权利要求1-7中任一项所限定的生物标志物特征的全部生物标志物的表达，并且评估由所述监测、测量和/或检测产生的数据，从而预测和监测脓毒症的发展。
13.如权利要求12所述的方法，其中，将产生的数据与参考数据进行比较，所述参考数据来源于从选自下列的一组或多组获得的样品：(i)不患有脓毒症的受试者，(ii)之前发展为脓毒症的受试者和(iii)具有SIRS但没有感染的受试者，脓毒症可能性的预测是基于所述样品是否更接近所述结果来源的哪一组而决定的。
14.如权利要求12或13所述的方法，其中，所述方法是计算机执行的，且所述监测、测量和/或检测包括产生所述生物标志物特征中的全部生物标志物的定量的且可选地为定性的数据，将所述数据输入到计算机上的分析过程中，使用至少一种将所述数据与参考数据进行比较的数学方法，并且从所述分析过程中产生输出，其提供了发展脓毒症可能性的预测，或可以监测脓毒症的病症。
15.如权利要求12-14中任一项所述的方法，其中，所述预测是脓毒症对非脓毒症的可能性，且所述预测具有至少92％的平均预测准确性。
16.如权利要求12-15中任一项所述的方法，其中，至少一种数学方法选自支持向量机(SVM)算法、决策树、随机森林、人工神经网络、二次判别分析和贝叶斯分类器。
17.如权利要求16所述的方法，其中，至少一种数学方法是人工神经网络。
18.如权利要求17所述的方法，其中，所述人工神经网络是表2中详细说明的训练的人工神经网络。
19.如权利要求12-18中任一项所述的方法，其中，所述监测、测量和/或检测生物标志物的表达使用实时(RT)聚合酶链式反应(PCR)。
20.一种用于分析来自动物的生物样品以预测或监测脓毒症发展的设备，所述设备包括：用于监测、测量或检测如权利要求1-7中任一项所限定的生物标志物特征中的全部生物标志物的表达水平的装置；用于分析从监测、测量或检测用装置产生的数据的装置；和从所述分析提供输出的装置，所述输出是提供动物患有脓毒症可能性的预测的输出，或者是能够监测脓毒症的输出。
21.在症状发作前(症状出现之前)预测脓毒症的发展且能够以至少92％的平均预测准确性区分脓毒症和非脓毒症发展的生物标志物特征，其中，所述生物标志物特征包含选自由表1中列出的266个基因组成的基因列表中的至少25个基因，或由这些基因表达的产物。
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