KR20210016373A - 아급성 (subacute) 이식 거부 및 다른 이식 상태들의 검출을 위한 전-게놈 (genome-wide) 분류자 - Google Patents

아급성 (subacute) 이식 거부 및 다른 이식 상태들의 검출을 위한 전-게놈 (genome-wide) 분류자 Download PDF

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KR20210016373A
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kidney transplant
subar
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KR1020207035518A
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수닐 엠. 쿠리안
마이클 엠. 아베카시스
존 제이. 프레드발트
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더 스크립스 리서치 인스티튜트
노오쓰웨스턴 유니버시티
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Abstract

본 개시는 유전자 발현 마커들의 고유의 세트들을 사용하여 아급성 거부 및 다른 카테고리들의 거부를 검출하는 방법들을 제공한다.

Description

아급성 (SUBACUTE) 이식 거부 및 다른 이식 상태들의 검출을 위한 전-게놈 (GENOME-WIDE) 분류자
교차-참조 성명
본 출원은 2018년 5월 10일 출원된 미국 특허 가출원 번호 제 62/669,518 호의 이익을 주장하고, 이는 전체가 본 명세서에 참조로서 인용된다.
정부 지원의 성명
본 발명은 미국 국립 보건원이 수여하는 보조금 번호 U01 AI084146, 3 U01 AI063594-07S1, 1U01AI088635, 2U19 AI063603, R34 AI118493 하의 정부 지원으로 이루어졌다.
신장 이식은 말기 신장 질환을 앓는 환자들의 기대 수명 및 삶의 질에 상당한 개선을 제안한다. 조직-적합 검사/매칭 기술의 개선들에도 불구하고, 동종 이식편 기능 장애 또는 다른 불확실한 병인들로 인한 이식 손실들이 신장 이식의 치료 가능성을 상당히 방해하였다. 더욱이, (보통 고통스러운 생검을 수반하는) 반복된 이식 모니터링은 시간에 걸쳐 이식 기능의 변화들을 관리하고/예측하기 위한 일반적인 접근방법이 여전히 남아 있다.
신장 이식에 이어, 임상적으로 검출되지 않은 (그리고 따라서 치료되지 않은) 무증상 급성 거부 (sub-clinical acute rejection; subAR) 가 처음 12 개월의 환자들의 20 내지 25 ％에서 발생하였고, dnDSA (de novo donor-specific antibody) 형성, 보다 나쁜 24-개월 이식 결과들, IFTA (interstitial fibrosis and tubular atrophy), 만성 거부, 및 이식 손실과 연관된다. 신장 이식 수여자들을 거의 독점적으로 모니터링하기 위해 사용된, 혈청 크레아티닌 및 면역억제 레벨들은, 인센서티브하고 (insensitive) 비-특이적이다. 감시 생검들이 안정한 신장 기능을 갖는 환자들을 모니터링하기 위해 사용될 수 있지만, 이들은 침습성이고, 샘플링 에러와 연관되고, (특히, '경계선상 변화들'에 대한) 조직학적 해석 및 치료의 유효성 모두에 관한 합의가 결여된다. 게다가, 감시 생검들의 대부분 (75 내지 80 ％) 은 정상 조직을 보이고 (즉, subAR의 부재) 따라서 환자들을 불필요한 생검 위험들에 노출시킨다. 이에 따라, 신장 이식 기능 및 면역 상태를 모니터링하기 위한 최소 침습 방법들에 대한 수요가 있다.
일부 양태들에서, 본 개시는 면역억제제 치료 요법 (immunosuppressant treatment regimen) 중인 신장 이식 수여자 (recipient) 의 이식 우수 신장으로부터 비-이식 우수 신장을 구별하는 방법에 있어서, (a) 면역억제제 치료 요법 중인 신장 이식 수여자로부터의 혈액 샘플로부터 도출된 mRNA 또는 면역억제제 치료 요법 중인 신장 이식 수여자로부터의 혈액 샘플로부터 도출된 mRNA의 cDNA 보체들 (complements) 을 제공하는 단계로서, 신장 이식 수여자는 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는, mRNA 및 mRNA의 cDNA 보체들을 제공하는 단계; (b) 혈액 샘플의 유전자 발현 레벨들을 결정하기 위해 면역억제제 치료 요법 중인 신장 이식 수여자로부터의 혈액 샘플로부터 도출된 mRNA 또는 면역억제제 치료 요법 중인 신장 이식 수여자로부터의 혈액 샘플로부터 도출된 mRNA의 cDNA 보체들에 대한 마이크로어레이 분석 또는 서열 분석을 수행하는 단계; 및 (c) 적어도 단계 (b) 에서 결정된 유전자 발현 레벨들의 서브세트에 훈련된 알고리즘을 적용함으로써 비-이식 우수 신장 또는 이식 우수 신장을 검출하는 단계로서, 훈련된 알고리즘은 비-이식 우수 신장으로부터 이식 우수 신장을 구별하고, 비-이식 우수 신장은 급성 거부, 아급성 거부 (sub-acute Rejection; subAR), 거부 없이 급성 기능 부전 (dysfunction), 및 신장 손상을 가진 신장을 포함하는, 비-이식 우수 신장 또는 이식 우수 신장을 검출하는 단계를 포함하는, 신장 이식 수여자의 이식 우수 신장으로부터 비-이식 우수 신장을 구별하는 방법을 제공한다. 일부 실시예들에서, 훈련된 알고리즘은 이식 우수 신장과 비-이식 우수 신장 사이의 이진 분류를 수행한다. 일부 실시예들에서, 훈련된 알고리즘은 이식 우수 신장과 비-이식 우수 신장 사이의 이진 분류를 수행한다. 일부 실시예들에서, 유전자 발현 레벨들은 표 3 또는 표 4로부터 선택된 적어도 5 개의 유전자들의 레벨들을 포함한다. 일부 실시예들에서, 유전자 발현 레벨들은 표 3 또는 표 4의 적어도 10 개의 유전자들, 적어도 20 개의 유전자들, 적어도 40 개의 유전자들, 적어도 50 개의 유전자들, 적어도 60 개의 유전자들, 적어도 70 개의 유전자들, 적어도 80 개의 유전자들, 적어도 90 개의 유전자들 또는 모든 유전자들의 레벨들을 포함한다. 일부 실시예들에서, 방법은 40 ％ 초과, 65 ％, 70 ％ 초과, 75 ％ 초과, 80 ％ 초과, 85 ％ 초과, 90 ％ 초과, 또는 95 ％ 초과의 PPV (positive predictive value) 를 갖는다. 일부 실시예들에서, 방법은 65 ％ 초과, 70 ％ 초과, 75 ％ 초과, 80 ％ 초과, 85 ％ 초과, 90 ％ 초과, 또는 95 ％ 초과의 NPV (negative predictive value) 를 갖는다. 일부 실시예들에서, 방법은 신장 이식 수여자의 이식 우수 상태를 검출하는 단계를 포함하고, 방법은 검출된 이식 우수 상태에 기초하여 신장 이식 수여자에 치료를 시행하는 (administer) 단계를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 치료는 신장 이식 수여자에 신규 면역억제제를 투여하는 단계, 신장 이식 수여자의 면역억제제 치료 요법을 계속하는 단계, 또는 면역억제제 도즈량 (dosage) 을 증가시키거나 면역억제제 도즈량을 감소시킴으로써, 신장 이식 수여자의 면역억제제 치료 요법을 조정하는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에서, 치료는 신장 이식 수여자로부터 혈액 샘플들을 주기적으로 획득하는 단계 및 비-이식 우수 상태의 마커들 (markers) 에 대해 혈액 샘플들을 모니터링하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 혈액 샘플들을 모니터링하는 단계는 표 3 또는 표 4에 열거된 유전자들로부터 적어도 5 개의 유전자들의 발현 레벨들을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에서, 치료는 이식 우수 상태가 적어도 1회, 적어도 연속하여 2 회, 또는 적어도 연속하여 3 회 신장 이식 수여자로부터의 혈액 샘플에서 검출된 후 신장 이식 수여자의 신장 이식의 프로토콜 생검 (protocol biopsy) 을 수행하는 것을 자제하는 것을 포함한다. 일부 실시예들에서, 방법은 상이한 시기에 신장 이식 수여자로부터 획득된 혈액 샘플 내 유전자 발현 생성물들을 모니터링하는 단계를 포함하고, 마커들은 표 3 또는 표 4로부터 적어도 5 개의 유전자들, 적어도 10 개의 유전자들, 적어도 20 개의 유전자들, 적어도 30 개의 유전자들, 적어도 50 개의 유전자들, 적어도 100 개의 유전자들 또는 모든 유전자들의 mRNA 발현 생성물들이다. 일부 실시예들에서, 치료는 주기적으로 신장 이식 수여자로부터 혈액 샘플들을 획득하는 단계 및 신장 이식 수여자에서 subAR을 검출하기 위해 혈액 샘플들을 모니터링하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 신장 이식 수여자에서 subAR을 검출하기 위해 혈액 샘플들을 모니터링하는 단계는 표 5, 표 6 또는 표 8의 적어도 5 개의 유전자들, 적어도 10 개의 유전자들, 적어도 20 개의 유전자들, 적어도 30 개의 유전자들, 적어도 50 개의 유전자들, 또는 모든 유전자들의 mRNA 발현 생성물들을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에서, 방법은 신장 이식 수여자에서 비-이식 우수 상태를 검출하고, 그리고 방법은 검출된 비-이식 우수 상태에 기초하여 신장 이식 수여자에 치료를 시행하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 치료는 검출된 비-이식 우수 상태를 더 식별하기 위해 신장 이식 수여자에 대한 생검을 수행하는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에서, 방법은 비-이식 우수 상태를 검출하기 위해 신장 이식 수여자로부터의 혈액 샘플들을 모니터링하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 비-이식 상태는 적어도 2 일 또는 적어도 3 일의 상이한 시기에 신장 이식 수여자로부터 획득된 혈액 샘플들의 표 3 또는 표 4로부터 적어도 5 개의 유전자들, 적어도 10 개의 유전자들의 mRNA 발현 레벨들을 검출함으로써 모니터링되고, 그리고 비-이식 우수 상태로부터 이식 우수 상태를 구별하기 위해 검출된 발현 레벨들에 훈련된 알고리즘을 적용하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 치료는 신장 이식 수여자의 subAR을 검출하기 위해 혈액 샘플들을 모니터링하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 신장 이식 수여자에서 subAR을 검출하기 위해 혈액 샘플들을 모니터링하는 단계는 표 5, 표 6, 또는 표 8의 적어도 5 개의 유전자들, 적어도 10 개의 유전자들, 적어도 20 개의 유전자들, 적어도 30 개의 유전자들, 적어도 50 개의 유전자들, 또는 모든 유전자들의 mRNA 발현 생성물들을 검출하는 단계 및 검출된 mRNA 발현 생성물들에 훈련된 알고리즘을 적용하는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에서, 방법은 검출된 subAR 또는 검출된 비-이식 우수 상태를 치료하기 위해 신장 이식 수여자에 면역억제제 약물을 투여하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 검출된 비-이식 우수 상태 또는 검출된 subAR을 치료하거나 예방하기 위해 신장 이식 수여자에 증가되거나 감소된 도즈의 면역억제제 약물을 투여하는 단계 또는 검출된 비-이식 우수 상태 또는 검출된 subAR을 치료하거나 예방하기 위해 신장 이식 수여자에 신규 면역억제제 약물을 투여하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 면역억제제 약물 또는 신규 면역억제제 약물은 칼시네우린 억제제 (calcineurin inhibitor) 인, 신장 이식 수여자의 이식 우수 신장으로부터 비-이식 우수 신장을 구별한다. 일부 실시예들에서, 면역억제제 약물 또는 신규 면역억제제 약물은 아자티오프린 (azathioprine), 레플루노마이드 (leflunomide), 마이코페놀산 (mycophenolic acid), 마이코페놀레이트 모페틸 (mycophenolate mofetil), 프레드니솔론 (prednisolone), 히드로코르티손 (hydrocortisone), 바실릭시맙 (basiliximab), 알렘투주맙 (alemtuzumab), 다클리주맙 (daclizumab), 벨라타셉트 (belatacept), 올소클론 (orthoclone), 항흉선세포 글로불린 (anti-thymocyte globulin), 항림프구 글로불린 (anti lymphocyte globulin), 항증식 (anti-proliferative) 약물, 및 항-T 세포 항체로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시예들에서, 방법은 신장 이식 수여자로부터의 혈액 샘플의 혈청 크레아티닌 레벨 또는 eGFR을 검출하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 방법은 검출된 subAR, 검출된 비-이식 우수 상태, 또는 검출된 이식 우수 상태를 더 확인하기 위해 혈청 크레아티닌 레벨 또는 eGFR을 사용하는 단계를 더 포함한다.
일부 양태들에서, 본 개시는 면역억제제 약물 요법 중인 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자의 아급성 거부 (subAR) 를 검출하는 방법이 제공되고, 방법은 (a) 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자로부터의 혈액 샘플로부터 도출된 mRNA 또는 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자로부터의 혈액 샘플로부터 도출된 mRNA의 cDNA 보체들을 제공하는 단계; (b) 유전자 발현 레벨들을 결정하기 위해 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자로부터의 혈액 샘플로부터 도출된 mRNA 또는 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자로부터의 혈액 샘플로부터 도출된 mRNA의 cDNA 보체들에 대한 마이크로어레이 분석 또는 서열 분석을 수행하는 단계로서, 유전자 발현 레벨들은, (i) 표 5, 표 6, 또는 표 8로부터 적어도 5 개의 유전자들; 또는 (ii) 표 5, 표 6, 또는 표 8의 적어도 10 개의 유전자들, 적어도 20 개의 유전자들, 적어도 30 개의 유전자들, 적어도 40 개의 유전자들, 적어도 50 개의 유전자들, 또는 모든 유전자들의 레벨들을 포함하는, 분석을 수행하는 단계; 및 (c) 단계 (b) 에서 결정된 유전자 발현 레벨들에 훈련된 알고리즘을 적용함으로써 subAR을 검출하거나 subAR의 부재를 검출하는 단계로서, 훈련된 알고리즘은 적어도 60 ％의 NPV 또는 적어도 30 ％의 PPV, 또는 모두를 갖는 subAR 신장으로부터 적어도 이식 우수 신장을 구별하는, subAR 또는 subAR의 부재를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에서, 유전자 발현 레벨들은 표 5, 표 6 또는 표 8의 유전자들 중 적어도 5 개의 레벨들을 포함한다. 일부 실시예들에서, 훈련된 알고리즘은 78 ％ 초과의 NPV를 갖는 이식 우수 신장으로부터 subAR 신장을 구별한다. 일부 실시예들에서, 훈련된 알고리즘은 47 ％ 초과의 PPV를 갖는 이식 우수 신장으로부터 subAR 신장을 구별한다. 일부 실시예들에서, 신장 이식 수여자는 2.3 ㎎/dL 미만의 혈청 크레아티닌 레벨을 갖는다. 일부 실시예들에서, 방법은 검출된 subAR을 치료하거나 예방하기 위해 조정된 도즈, 증가된 도즈 또는 감소된 도즈의 면역억제제 약물을 신장 이식 수여자에 투여하는 단계 또는 검출된 subAR을 치료하거나 예방하기 위해 신규 면역억제제 약물을 신장 이식 수여자에 투여하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 면역억제제 약물 또는 신규 면역억제제 약물은 칼시네우린 억제제이다. 일부 실시예들에서, 면역억제제 약물 또는 신규 면역억제제 약물은 mTOR 억제제이다. 일부 실시예들에서, 면역억제제 약물 또는 신규 면역억제제 약물은 아자티오프린, 레플루노마이드, 마이코페놀산, 마이코페놀레이트 모페틸, 프레드니솔론, 히드로코르티손, 바실릭시맙, 알렘투주맙, 다클리주맙, 벨라타셉트, 올소클론, 항흉선세포 글로불린, 항림프구 글루불린, 항증식 약물, 및 항-T 세포 항체로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시예들에서치료는 2 이상의 시점들에서 신장 이식 수여자에서 subAR 또는 이식 우수 상태를 검출하기 위해 혈액 샘플들을 모니터링하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 혈액 샘플들을모니터링하는 단계는 신장 이식 수여자에서 subAR 또는 이식 우수 상태를 검출하기 위해 표 5, 표 6, 또는 표 8의 적어도 5 개의 유전자들, 적어도 10 개의 유전자들, 적어도 20 개의 유전자들, 적어도 30 개의 유전자들, 적어도 50 개의 유전자들, 또는 모든 유전자들의 mRNA 발현 생성물들을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에서, 치료는 이식 우수 상태가 적어도 1회, 적어도 연속하여 2 회, 또는 적어도 연속하여 3 회 신장 이식 수여자로부터의 혈액 샘플에서 검출된 후 신장 이식 수여자의 신장 이식의 프로토콜 생검을 수행하는 것을 자제하는 것을 포함한다. 일부 실시예들에서, 방법은 상이한 시기에 신장 이식 수여자로부터 획득된 혈액 샘플 내 유전자 발현 생성물들을 모니터링하는 단계를 포함하고, 마커들은 표 5, 표 6 또는 표 8로부터 적어도 5 개의 유전자들, 적어도 10 개의 유전자들, 적어도 20 개의 유전자들, 적어도 30 개의 유전자들, 적어도 50 개의 유전자들, 적어도 100 개의 유전자들 또는 모든 유전자들의 mRNA 발현 생성물들이다. 일부 실시예들에서, 치료는 신장 이식 수여자로부터 혈액 샘플들을 주기적으로 획득하는 단계 및 신장 이식 수여자에서 subAR 또는 이식 우수 상태를 검출하기 위해 혈액 샘플들을 모니터링하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 방법은 신장 이식 수여자에서 검출된 이식 우수 상태, 검출된 비-이식 우수 상태, 또는 검출된 아급성 거부, 또는 이들의 임의의 조합을 모니터링하기 위해 방법을 적어도 1 회, 적어도 2 회, 적어도 3 회, 또는 적어도 4 회 반복하는 단계를 더 포함한다.
일부 양태들에서, 본 개시는 신장 이식 수여자를 치료하는 방법을 제공하고, 방법은 (a) 최초 면역억제제 약물 요법을 신장 이식 수여자에 시행하는 단계; (b) 신장 이식 수여자로부터의 혈액 샘플로부터 도출된 mRNA 또는 신장 이식 수여자로부터의 혈액 샘플로부터 도출된 mRNA의 cDNA 보체들을 제공하는 단계로서, 혈액 샘플은 신장 이식 수여자가 최초 면역억제제 약물 요법을 따르는 동안 획득되는, mRNA 또는 mRNA의 cDNA 보체들을 제공하는 단계; (c) 유전자 발현 레벨들을 결정하기 위해, 적어도 신장 이식 수여자로부터 mRNA의 서브세트 또는 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자로부터 mRNA의 DNA 보체들에 대한 마이크로어레이 분석 또는 서열 분석을 수행하는 단계로서, 유전자 발현 레벨들은, (i) 표 5, 표 6 또는 표 8로부터 적어도 5 개의 유전자들; 또는 (ii) 표 5, 표 6, 또는 표 8의 적어도 10 개의 유전자들, 적어도 20 개의 유전자들, 적어도 30 개의 유전자들, 적어도 40 개의 유전자들, 적어도 50 개의 유전자들, 또는 모든 유전자들의 레벨들을 포함하는, 분석을 수행하는 단계; (d) 단계 (c) 에서 결정된 유전자 발현 레벨들 (i) 또는 (ii) 에 훈련된 알고리즘을 적용함으로써 신장 이식 수여자의 이식 우수 신장을 식별하는 단계로서, 훈련된 알고리즘은 적어도 60 ％의 NPV 또는 적어도 30 ％의 PPV, 또는 모두를 갖는 subAR 신장으로부터 이식 우수 신장을 구별하는, 식별 단계; 및 (e) 이식 우수 신장을 갖는 것으로 식별된 신장 수여자에 최초 면역억제제 약물 요법의 시행을 적어도 1 개월 동안 유지하는 단계 또는 이식 우수 신장을 갖는 것으로 식별된 신장 이식 수여자에 시행된 최초 면역억제제 약물 요법을 조정하는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에서, 최초 면역억제제 약물 요법의 시행은 단계 (d) 에서 이식 우수 신장의 식별에 이어 적어도 3 개월, 적어도 5 개월, 적어도 6 개월, 적어도 8 개월 또는 적어도 1 년 동안 유지된다. 일부 실시예들에서, 최초 면역억제제 약물 요법은 신장 이식 수여자에서 급성 거부 또는 subAR이 검출되거나 추측된 (suspect) 후 시행된다. 일부 실시예들에서, 최초 면역억제제 약물 요법을 조정하는 단계는 단계 (d) 에서 이식 우수 상태가 식별된 후 최초 면역억제제 약물 요법의 도즈량을 감소시키는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에서, 최초 면역억제제 약물 요법을 조정하는 단계는 단계 (d) 에서 이식 우수 상태가 식별된 후 신규 면역억제제 약물로 신장 이식 수여자를 치료하는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에서, 최초 면역억제제 약물 또는 신규 면역억제제 약물은 칼시네우린 억제제, mTOR 억제제, 아자티오프린, 레플루노마이드, 마이코페놀산, 마이코페놀레이트 모페틸, 프레드니솔론, 히드로코르티손, 바실릭시맙, 알렘투주맙, 다클리주맙, 벨라타셉트, 올소클론, 항흉선세포 글로불린, 항-림프구 글로불린, 항증식 약물, 및 항-T 세포 항체, 또는 이들의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시예들에서, 방법은 방법은 단계 (d) 에서 이식 우수 상태가 식별된 후 신장 이식 수여자에 대한 생검을 수행하는 것을 자제하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 방법은 방법이 적어도 연속하여 2 회, 적어도 연속하여 3 회, 적어도 연속하여 4 회, 또는 적어도 연속하여 5 회 수행된 후, 단계 (d) 에서 이식 우수 상태가 식별된 후 신장 이식 수여자의 생검을 수행하는 것을 자제하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 방법은 며칠, 몇 주, 또는 몇 개월의 기간에 걸쳐 단계 (a), 단계 (b) 및 단계 (c) 를 적어도 1 회, 적어도 2 회, 적어도 3 회, 또는 적어도 4 회 반복하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 방법이 적어도 연속하여 2 회, 적어도 연속하여 3 회, 적어도 연속하여 4 회, 또는 적어도 연속하여 5 회 수행된 후 단계 (d) 에서 subAR 상태가 훈련된 알고리즘을 사용하여 검출된다. 일부 실시예들에서, 방법은 subAR 상태가 적어도 연속하여 2 회, 적어도 연속하여 3 회, 적어도 연속하여 4 회, 또는 적어도 연속하여 5 회 검출된 후 신장 이식 수여자에 대한 생검을 수행하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 방법은 제 1 이식 우수 상태가 검출된 후, subAR 상태가 적어도 연속하여 2 회, 적어도 연속하여 3 회, 적어도 연속하여 4 회, 또는 적어도 연속하여 5 회 검출된 후 면역억제제 약물 요법을 상승시키거나 변화시키는 단계를 더 포함한다.
일부 양태들에서, 본 개시는 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자에 대한 신장 생검을 수행하는 방법이 제공되고, 방법은 (a) 신장 이식 수여자로부터의 혈액 샘플로부터 도출된 mRNA 또는 신장 이식 수여자로부터의 혈액 샘플로부터 도출된 mRNA의 cDNA 보체들을 제공하는 단계로서, 혈액 샘플은 신장 이식 수여자가 면역억제제 약물 요법 중인 동안 획득되는, mRNA 또는 mRNA의 cDNA 보체들을 제공하는 단계; (b) 유전자 발현 레벨들을 결정하기 위해 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자로부터의 mRNA 또는 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자로부터의 mRNA의 DNA 보체들의 적어도 서브세트에 대한 마이크로어레이 분석 또는 서열 분석을 수행하는 단계로서, 유전자 발현 레벨들은, (i) 표 5, 표 6, 또는 표 8로부터 적어도 5 개의 유전자들; 또는 (ii) 표 5, 표 6 또는 표 8의 적어도 10 개의 유전자들, 적어도 20 개의 유전자들, 적어도 30 개의 유전자들, 적어도 40 개의 유전자들, 적어도 50 개의 유전자들, 또는 모든 유전자들의 레벨들을 포함하는, 분석을 수행하는 단계; (c) 단계 (b) 에서 결정된 유전자 발현 레벨들에 훈련된 알고리즘을 적용함으로써 아급성 거부 (subAR) 를 검출하는 단계로서, 훈련된 알고리즘은 적어도 60 ％의 NPV 또는 적어도 30 ％의 PPV, 또는 모두를 갖는 subAR 신장으로부터 이식 우수 신장을 구별하는, subAR을 검출하는 단계; 및 (d) 신장 이식 수여자는 subAR을 갖는다는 것을 확인하기 위해 검출된 subAR을 갖는 신장 이식 수여자에 대한 신장 생검을 수행하는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에서, 방법은 신장 생검에 의해 검출된 subAR을 치료하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 검출된 subAR을 치료하는 단계는 검출된 subAR을 치료하기 위해 신장 이식 수여자에 증가되거나 감소된 도즈의 면역억제제 약물을 투여하거나 검출된 subAR을 치료하기 위해 신장 이식 수여자에 신규 면역억제제 약물을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에서, 면역억제제 약물 또는 신규 면역억제제 약물은 칼시네우린 억제제이다. 일부 실시예들에서, 면역억제제 약물 또는 신규 면역억제제 약물은 mTOR 억제제이다. 일부 실시예들에서, 면역억제제 약물 또는 신규 면역억제제 약물은 아자티오프린, 레플루노마이드, 마이코페놀산, 마이코페놀레이트 모페틸, 프레드니솔론, 히드로코르티손, 바실릭시맙, 알렘투주맙, 다클리주맙, 벨라타셉트, 올소클론, 항흉선세포 글로불린, 항-림프구 글로불린, 항증식 약물, 및 항-T 세포 항체로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시예들에서, 유전자 발현 생성물들을 프로브들 (probes) 과 콘택트시키는 단계를 더 포함하고, 프로브들은 표 5, 표 6 또는 표 8로부터 적어도 5 개의 유전자들에 특이적 (specific) 이다.
일부 양태들에서, 본 개시는 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자에 대한 신장 생검을 수행하는 방법을 제공하고, 방법은 (a) 신장 이식 수여자로부터의 혈액 샘플로부터 도출된 mRNA 또는 신장 이식 수여자로부터의 혈액 샘플로부터 도출된 mRNA의 cDNA 보체들을 제공하는 단계로서, 혈액 샘플은 신장 이식 수여자가 면역억제제 약물 요법 중인 동안 획득되는, mRNA 또는 mRNA의 cDNA 보체들을 제공하는 단계; (b) 유전자 발현 레벨들을 결정하기 위해 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자로부터의 mRNA 또는 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자로부터의 mRNA의 DNA 보체들의 적어도 서브세트에 대한 마이크로어레이 분석 또는 서열 분석을 수행하는 단계로서, 유전자 발현 레벨들은, (i) 표 3 또는 표 4로부터 적어도 5 개의 유전자들; 또는 (ii) 표 3 또는 표 4의 적어도 10 개의 유전자들, 적어도 20 개의 유전자들, 적어도 30 개의 유전자들, 적어도 40 개의 유전자들, 적어도 50 개의 유전자들, 또는 모든 유전자들을 포함하는, 분석을 수행하는 단계; (c) 단계 (b) 에서 결정된 유전자 발현 레벨들에 훈련된 알고리즘을 적용함으로써 비-이식 우수 상태로부터 이식 우수 상태를 구별하는 단계로서, 훈련된 알고리즘은 비-이식 우수 상태로부터 적어도 60 ％의 NPV 또는 적어도 30 ％의 PPV, 또는 모두를 갖는, 이식 우수 신장을 구별하는, 이식 우수 상태를 구별하는 단계; 및 (d) 신장 이식 수여자가 비-이식 우수 상태를 갖는다는 것을 확인하기 위해 검출된 비-이식 우수 상태를 갖는 신장 이식 수여자에 대한 신장 생검을 수행하는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에서, 방법은 신장 생검에 의해 검출된 비-이식 우수 상태를 치료하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 검출된 비-이식 우수 상태를 치료하는 단계는 검출된 비-이식 우수 상태를 치료하기 위해 신장 이식 수여자에 증가되거나 감소된 도즈의 면역억제제 약물을 투여하거나 검출된 비-이식 우수 상태를 치료하기 위해 신장 이식 수여자에 신규 면역억제제 약물에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에서, 방법은 적어도 5 개의 유전자들에 대해 신장 이식 수여자가 subAR이 발생할 위험을 갖거나 위험에 있는지 여부, 급성 거부 (AR) 위험을 갖거나 위험에 있는지 여부, 잘 기능하는 정상 이식 (TX) 을 갖는지 여부, 또는 비-이식 우수 상태를 갖는 위험을 갖거나 위험에 있는지 여부, 이의 임의의 조합의 지표 (indication) 를 제공하는 값 또는 다른 자격 (designation) 을 신장 이식 수여자의 유전자의 발현 레벨에 할당하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 방법은 신장 이식 수여자 내로 이식의 도입에 이어 신장 이식 수여자에 대해 상이한 시간들, 예컨대 주간, 월간, 2 개월, 또는 3 개월 인터벌들 (intervals) 로 반복된다. 일부 실시예들에서, 신장 이식 수여자는 약물을 수용하고, 그리고 결합된 값 또는 자격의 변화는 시간에 따라 약물의 유효성의 지표를 제공한다. 일부 실시예들에서, 신장 이식 수여자는 단계 (a) 를 수행한 1 개월, 3 개월, 1 년, 2 년, 3 년 또는 5 년 이내에 신장 이식을 겪는다. 일부 실시예들에서, 단계 (a) 의 신장 이식 수여자로부터의 샘플은 혈액 샘플이고, 전혈 (whole blood), 말초 혈액 (peripheral blood), 혈청, 혈장, PBL들, PBMC들, T 세포들, CD4 T 세포들 CD8 T 세포들, 또는 대식세포들을 포함한다. 일부 실시예들에서, 방법은 검출 단계에 응답하여, 신장 이식 수여자의 치료 방식을 변화시키는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 신장 이식 수여자는 방법들을 수행하기 전 약물을 수용했고, 그리고 치료 방식을 변화시키는 단계는 부가적인 약물을 투여하는 단계, 보다 높은 도즈의 동일한 약물을 투여하는 단계, 보다 낮은 도즈의 동일한 약물을 투여하는 단계 또는 동일한 약물을 투여를 중단하는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에서, 방법은 단계 (c) 에서의 검출이 신장 이식 수여자가 subAR의 위험을 갖거나 위험에 있다는 지표를 제공하면, subAR 또는 이의 위험을 검출하기 위한 부가적인 절차를 수행하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 부가적인 절차는 신장 생검이다. 일부 실시예들에서, 단계 (c) 는 컴퓨터에 의해 수행된다. 일부 실시예들에서, 신장 이식 수여자는 인간이다. 일부 실시예들에서, 적어도 5 개의 유전자들 각각에 대해, 단계 (c) 는 신장 이식 수여자의 유전자의 발현 레벨을 subAR과 연관된 유전자의 하나 이상의 기준 발현 레벨들 또는 이식 거부 (TX) 의 결핍과 비교하는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에서, 훈련된 알고리즘은 50 개 미만의 유전자들, 80 개 미만의 유전자들, 100 개 미만의 유전자들, 150 개 미만의 유전자들, 200 개 미만의 유전자들, 300 개 미만의 유전자들, 500 개 미만의 유전자들, 또는 1000 개 미만의 유전자들의 발현 레벨들에 적용된다. 일부 실시예들에서, 100 개까지 또는 1000 개까지의 유전자들의 발현 레벨들이 결정된다. 일부 실시예들에서, 발현 레벨들은 mRNA 레벨로 또는 단백질 레벨로 결정된다. 일부 실시예들에서, 발현 레벨들은 정량적 PCR, 어레이에 대한 혼성화 (hybridization) 또는 서열 분석에 의해 결정된다.
일부 양태들에서, 본 개시는 면역억제제 약물 요법 중인 신장 이식 수여자를 치료하는 방법을 제공하고, 방법은 (a) 관심 있는 핵산들을 획득하는 단계로서, 관심 있는 핵산들은 이식 수여자로부터의 혈액 샘플로부터 도출된 mRNA 또는 이식 수여자로부터의 혈액 샘플로부터 도출된 mRNA의 cDNA 보체들을 포함하고, 이식 수여자는 안정한 혈청 크레아티닌을 갖는, 관심 있는 핵산들을 획득하는 단계; (b) 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 또는 표 8로부터 선택된 적어도 5 개의 유전자들의 발현 레벨들을 검출하도록 단계 (a) 에서 획득된 관심 있는 핵산들에 대한 마이크로어레이 분석 또는 차세대 서열 분석을 수행하는 단계; (c) 단계 (b) 에서 검출된 발현 레벨들에 기초하여 무증상 (subclinical) 급성 거부를 검출하는 단계; 및 (d) 단계 (c) 에서 검출된 무증상 급성 거부를 치료하기 위해 이식 수여자에 신규 면역억제제 약물 또는 보다 높은 도즈의 면역억제제 약물을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에서, 방법은 관심 있는 핵산들을 프로브들과 콘택트시키는 단계를 더 포함하고, 프로브들은 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 또는 표 8로부터 선택된 적어도 5 개의 유전자들에 대해 특이적이다. 일부 실시예들에서, 방법은 단계 (a) 내지 단계 (c) 를 반복한 후 신규 면역억제제 약물의 투여를 중단하는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에서, 방법은 단계 (a) 에서 획득된 핵산들의 마이크로어레이 분석을 수행하는 단계를 더 포함한다.
일부 양태들에서, 본 개시는 개선된 샘플 분류의 자동화된, 컴퓨터 구현된 방법을 제공하고, 방법은 (a) 안정한 크레아티닌 값을 갖는 신장 이식 수여자로부터의 혈액 샘플로부터 도출된 샘플 유전자 발현 데이터를 제공하는 단계; (b) 적어도 2-웨이 (two-way) 분류자 세트를 제공하는 단계로서, 2-웨이 분류자 세트는 이식 우수 신장과 아급성 임상 거부를 갖는 신장 사이를 구별할 수 있고, 분류자 세트는, (i) 표 5, 표 6 또는 표 8로부터 적어도 5 개의 유전자들; 또는 (ii) 표 5, 표 6, 또는 표 8의 적어도 10 개의 유전자들, 적어도 20 개의 유전자들, 적어도 30 개의 유전자들, 적어도 40 개의 유전자들, 적어도 50 개의 유전자들, 또는 모든 유전자들을 포함하는, 2-웨이 분류자 세트를 제공하는 단계; (c) 분류 규칙 또는 확률 유사 방정식을 사용하여 적어도 2-웨이 분류자 세트를 샘플 데이터에 적용하는 단계; 및 (d) 샘플에 대한 분류를 출력하기 위해 분류 규칙 또는 확률 유사 방정식을 사용하는 단계로서, 분류는 적어도 60 ％의 NPV 또는 적어도 30 ％의 PPV, 또는 모두를 갖는 무증상 급성 거부를 가질 확률을 갖는 샘플로 분류하는, 분류 규칙 또는 확률 유사 방정식을 사용하는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에서, 분류는 DLDA, 최근접 중심 (Nearest Centroid), 랜덤 포레스트 (Random Forest), 또는 PAMs (Prediction Analysis of Microarrays) 에 의해 달성된다. 일부 실시예들에서, 적어도 2-웨이 분류자 세트는 이식 우수 신장과 아급성 임상 거부 신장 사이를 구별하는 능력에 관한 p-값에 의해 프로브 세트들의 랭크를 결정함으로써 (rank) 획득된다. 일부 실시예들에서, 방법은 샘플에 대한 분류를 출력하는 단계는 컴퓨터 네트워크를 통해 최종 사용자로의 송신을 포함한다. 일부 실시예들에서, 최종 사용자는 혈액 샘플이 도출된 환자, 또는 샘플이 도출된 환자의 의사 또는 간병인이다. 일부 실시예들에서, 컴퓨터 네트워크는 Internet, Internet과 통신하는, 인터넷 또는 엑스트라넷 (extranet), 또는 인트라넷 (intranet) 및/또는 엑스트라넷이다. 일부 실시예들에서, 최종 사용자로의 송신은 로컬 컴퓨터 상의 웹-기반 애플리케이션 (web-based application) 으로의 송신 또는 모바일 디지털 프로세싱 디바이스로 제공된 모바일 애플리케이션으로의 송신을 포함한다.
일부 양태들에서, 본 개시는 개선된 샘플 분류의 자동화된, 컴퓨터 구현된 방법을 제공하고, 방법은, (a) 안정한 크레아티닌 값을 갖는 신장 이식 수여자로부터의 혈액 샘플로부터 도출된 샘플 유전자 발현 데이터를 제공하는 단계; (b) 적어도 2-웨이 분류자 세트를 제공하는 단계로서, 2-웨이 분류자 세트는 이식 우수 신장과 비-이식 우수 신장 사이를 구별할 수 있고, 분류자 세트는, (i) 표 3 또는 표 4로부터 적어도 5 개의 유전자들; 또는 (ii) 표 3 또는 표 4의 적어도 10 개의 유전자들, 적어도 20 개의 유전자들, 적어도 30 개의 유전자들, 적어도 40 개의 유전자들, 적어도 50 개의 유전자들, 또는 모든 유전자들을 포함하는, 적어도 2-웨이 분류자 세트를 제공하는 단계; (c) 분류 규칙 또는 확률 유사 방정식을 사용하여 샘플 데이터에 적어도 2-웨이 분류자 세트를 적용하는 단계; 및 (d) 샘플에 대한 분류를 출력하기 위해 분류 규칙 또는 확률 유사 방정식을 사용하는 단계로서 분류는 비-이식 우수 신장으로부터 이식 우수 신장을 구별하고, 비-이식 우수 신장은 급성 거부, 아급성 거부, 거부 없이 급성 기능 부전, 및 신장 손상을 가진 신장을 포함하는, 분류 규칙 또는 확률 유사 방정식을 사용하는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에서, 분류는 DLDA, 최근접 중심, 랜덤 포레스트, 또는 PAM들에 의해 달성된다. 일부 실시예들에서, 적어도 2-웨이 분류자 이식 우수 신장과 비-이식 우수 신장 사이를 구별하는 능력에 관한 p-값에 의해 프로브 세트들의 랭크를 결정함으로써 획득된다. 일부 실시예들에서, 샘플에 대한 분류를 출력하는 컴퓨터 네트워크를 통해 최종 사용자로의 송신을 포함한다. 일부 실시예들에서, 최종 사용자는 혈액 샘플이 도출된 환자, 또는 샘플이 도출된 환자의 의사 또는 간병인이다. 일부 실시예들에서, 컴퓨터 네트워크는 Internet, Internet과 통신하는, 인터넷 또는 엑스트라넷, 또는 인트라넷 및/또는 엑스트라넷이다. 일부 실시예들에서, 최종 사용자로의 송신은 로컬 컴퓨터 상의 웹-기반 애플리케이션으로의 송신 또는 모바일 디지털 프로세싱 디바이스로 제공된 모바일 애플리케이션으로의 송신을 포함한다.
일부 양태들에서, 본 개선된 샘플 분류 애플리케이션을 생성하기 위해 적어도 하나의 프로세서에 의해 실행가능한 인스트럭션들 (instructions) 을 포함하는 컴퓨터 프로그램으로 인코딩된 비일시적 컴퓨터 판독가능 저장 매체를 제공하고, 비일시적 컴퓨터 판독가능 저장 매체는 (a) 안정한 크레아티닌 값을 갖는 신장 이식 수여자로부터의 혈액 샘플로부터 도출된 샘플 데이터를 수신하기 위한 소프트웨어 모듈; (b) 매체 상에 저장된 적어도 2-웨이 분류자 세트로서, 2-웨이 분류자 세트는 이식 우수 신장과 아급성 임상 거부 신장 사이를 구별할 수 있고, 분류자 세트는, (i) 표 5, 표 6 또는 표 8로부터 적어도 5 개의 유전자들; 또는 (ii) 표 5, 표 6, 또는 표 8의 적어도 10 개의 유전자들, 적어도 20 개의 유전자들, 적어도 30 개의 유전자들, 적어도 40 개의 유전자들, 적어도 50 개의 유전자들, 또는 모든 유전자들을 포함하는, 2-웨이 분류자 세트; (c) 분류 규칙 또는 확률 유사 방정식을 사용하여 적어도 2-웨이 분류자 세트를 샘플 데이터에 적용하기 위한 소프트웨어 모듈; 및 (d) 샘플에 대한 분류를 출력하기 위해 분류 규칙 또는 확률 유사 방정식을 사용하기 위한 소프트웨어 모듈을 포함하고, 분류는 적어도 60 ％의 NPV 또는 적어도 30 ％의 PPV, 또는 모두를 갖는 무증상 급성 거부를 가질 확률을 갖는 샘플로 분류된다. 일부 실시예들에서, 적어도 2-웨이 분류자 세트는 이식 우수 신장과 아급성 임상 거부 신장 사이를 구별하는 능력에 관한 p-값에 의해 프로브 세트들의 랭크를 결정함으로써 획득된다.
일부 양태들에서, 본 개시는 개선된 샘플 분류 애플리케이션을 생성하기 위해 적어도 하나의 프로세서에 의해 실행가능한 인스트럭션들을 포함하는 컴퓨터 프로그램으로 인코딩된 비일시적 컴퓨터 판독가능 저장 매체를 제공하고, 비일시적 컴퓨터 판독가능 저장 매체는 (a) 안정한 크레아티닌 값을 갖는 신장 이식 수여자로부터의 혈액 샘플로부터 도출된 샘플 데이터를 수신하기 위한 소프트웨어 모듈; (b) 매체 상에 저장된 적어도 2-웨이 분류자 세트로서, 2-웨이 분류자 세트는 이식 우수 신장과 비-이식 우수 신장 사이를 구별할 수 있고, 분류자 세트는, (i) 표 3 또는 표 4로부터 적어도 5 개의 유전자들; 또는 (ii) 표 3 또는 표 4의 적어도 10 개의 유전자들, 적어도 20 개의 유전자들, 적어도 30 개의 유전자들, 적어도 40 개의 유전자들, 적어도 50 개의 유전자들, 또는 모든 유전자들을 포함하는, 적어도 2-웨이 분류자 세트; (c) 분류 규칙 또는 확률 유사 방정식을 사용하여 샘플 데이터에 적어도 2-웨이 분류자 세트를 적용하기 위한 소프트웨어 모듈; 및 (d) 샘플에 대한 분류를 출력하기 위해 분류 규칙 또는 확률 유사 방정식을 사용하기 위한 소프트웨어 모듈을 포함하고, 분류는 비-이식 우수 신장으로부터 이식 우수 신장을 구별하고, 비-이식 우수 신장은 급성 거부, 아급성 거부, 거부 없이 급성 기능 부전, 및 신장 손상을 가진 신장을 포함한다. 일부 실시예들에서, 적어도 2-웨이 분류자 세트는 이식 우수 신장과 아급성 임상 거부 신장 사이를 구별하는 능력에 관한 p-값에 의해 프로브 세트들의 랭크를 결정함으로써 획득된다.
일 양태에서, 본 개시는 신장 이식을 받은 인간 환자에서 비-이식 우수 신장을 검출하는 방법을 제공하고, 방법은: (a) 혈액 샘플을 획득하는 단계로서, 혈액 샘플은 신장 이식 수여자로부터의 mRNA 또는 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자로부터 mRNA의 DNA 보체들을 포함하는, 혈액 샘플을 획득하는 단계; (b) 유전자 발현 레벨들을 결정하기 위해 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자로부터 mRNA 또는 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자로부터 mRNA의 DNA 보체들의 서브세트에 대한 마이크로어레이 분석 또는 서열 분석을 수행하는 단계; 및 (c) 단계 (b) 에서 결정된 유전자 발현 레벨들에 훈련된 알고리즘을 적용함으로써 신장 이식 고통의 지표들을 검출하는 단계를 포함하고, 훈련된 알고리즘은 비-이식 우수 신장으로부터 이식 우수 신장을 구별하고, 비-이식 우수 신장은 급성 거부, subAR, 거부 없이 급성 기능 부전, 및 신장 손상을 갖는 신장을 포함한다. 일부 실시예들에서, 훈련된 알고리즘은 이식 우수 신장과 비-이식 우수 신장 사이의 이진 분류를 수행한다. 일부 실시예들에서, 유전자 발현 레벨들은 표 1로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 5, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 또는 적어도 52 개의 유전자들의 레벨들을 포함한다. 일부 실시예들에서, 유전자 발현 레벨들은 표 1의 모든 유전자들의 레벨들을 포함한다. 일부 실시예들에서, 유전자 발현 레벨들은 표 1로 구성된 그룹으로부터 선택된 프로브들에 의해 콘택트된 적어도 5, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 또는 적어도 52 개의 유전자들의 레벨들을 포함한다. 일부 실시예들에서, 유전자 발현 레벨들은 표 1로 구성된 그룹으로부터 선택된 프로브들에 의해 콘택트된 모든 유전자들의 레벨들을 포함한다. 일부 실시예들에서, 유전자 발현 레벨들은 표 2로 구성된 그룹으로부터 선택된 5 이상의 유전자들의 레벨들을 포함한다. 일부 실시예들에서, 유전자 발현 레벨들은 표 2로 구성된 그룹으로부터 선택된 프로브들에 의해 콘택트된 5 이상의 유전자들의 레벨들을 포함한다. 일부 실시예들에서, 유전자 발현 레벨들은 표 3으로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 5, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 또는 적어도 52 개의 유전자들의 레벨들을 포함한다. 일부 실시예들에서, 유전자 발현 레벨들은 표 3의 모든 유전자들의 레벨들을 포함한다. 일부 실시예들에서, 유전자 발현 레벨들은 표 3으로 구성된 그룹으로부터 선택된 프로브들에 의해 콘택트된 적어도 5, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 또는 적어도 52 개의 유전자들의 레벨들을 포함한다. 일부 실시예들에서, 유전자 발현 레벨들은 표 3으로 구성된 그룹으로부터 선택된 프로브들에 의해 콘택트된 모든 유전자들의 레벨들을 포함한다. 일부 실시예들에서, 유전자 발현 레벨들은 표 4로 구성된 그룹으로부터 선택된 5 이상의 유전자들의 레벨들을 포함한다. 일부 실시예들에서, 유전자 발현 레벨들은 표 4로 구성된 그룹으로부터 선택된 프로브들에 의해 콘택트된 5 이상의 유전자들의 레벨들을 포함한다. 일부 실시예들에서, 유전자 발현 레벨들은 표 4로 구성된 그룹으로부터 선택된 프로브들에 의해 콘택트된 적어도 5, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 또는 적어도 52 개의 유전자들의 레벨들을 포함한다. 일부 실시예들에서, 유전자 발현 레벨들은 표 4로 구성된 그룹으로부터 선택된 프로브들에 의해 콘택트된 모든 유전자들의 레벨들을 포함한다.
일 양태에서, 본 개시는 신장 이식을 받은 인간 환자에서 비-이식 우수 신장을 검출하는 방법을 제공하고, 방법은: (a) 혈액 샘플을 획득하는 단계로서, 혈액 샘플은 신장 이식 수여자로부터의 mRNA 또는 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자로부터 mRNA의 DNA 보체들을 포함하는, 혈액 샘플을 획득하는 단계; (b) 유전자 발현 레벨들을 결정하기 위해 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자로부터 mRNA 또는 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자로부터 mRNA의 DNA 보체들의 서브세트에 대한 마이크로어레이 분석 또는 서열 분석을 수행하는 단계로서, 유전자 발현 레벨들은 (i) 표 5로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 또는 적어도 50 개의 유전자들, (ii) 표 5로 구성된 그룹으로부터 선택된 프로브들에 의해 콘택트된 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 또는 적어도 50 개의 유전자들, (iii) 표 6으로 구성된 그룹으로부터 선택된 5 이상의 유전자들, (iv) 표 6으로 구성된 그룹으로부터 선택된 프로브들에 의해 콘택트된 5 이상의 유전자들, 또는 (v) 표 8의 모든 유전자들의 레벨들을 포함하는, 마이크로어레이 분석 또는 서열 분석을 수행하는 단계; 및 (c) 단계 (b) 에서 결정된 유전자 발현 레벨들에 훈련된 알고리즘을 적용함으로써 subAR을 검출하는 단계를 포함하고, 훈련된 알고리즘은 subAR 신장으로부터 적어도 이식 우수 신장을 구별하고, 신장 이식 수여자는 정상이거나 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는다. 일부 실시예들에서, 유전자 발현 레벨들은 표 5로 구성된 그룹으로부터 선택된 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 또는 적어도 50 개의 유전자들의 레벨들을 포함한다. 일부 실시예들에서, 유전자 발현 레벨들은 표 5로 구성된 그룹으로부터 선택된 프로브들에 의해 콘택트된 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 또는 적어도 50 개의 유전자들의 레벨들을 포함한다. 일부 실시예들에서, 유전자 발현 레벨들은 표 6으로 구성된 그룹으로부터 선택된 5 이상의 유전자들의 레벨들을 포함한다. 일부 실시예들에서, 유전자 발현 레벨들은 표 6으로 구성된 그룹으로부터 선택된 프로브들에 의해 콘택트된 5 이상의 유전자들의 레벨들을 포함한다. 일부 실시예들에서, 유전자 발현 레벨들은 표 8의 모든 유전자들의 레벨들을 포함한다. 일부 실시예들에서, 훈련된 알고리즘은 78 ％ 초과의 NPV를 갖는 이식 우수 신장으로부터 subAR 신장을 구별한다. 일부 실시예들에서, 훈련된 알고리즘은 47 ％ 초과의 PPV를 갖는 이식 우수 신장으로부터 subAR 신장을 구별한다. 일부 실시예들에서, 신장 이식 수여자는 정상 또는 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는다. 일부 실시예들에서, 신장 이식 수여자는 2.3 ㎎/dL 미만의 혈청 크레아티닌 레벨을 갖는다. 일부 실시예들에서, 신장 이식 수여자는 면역억제제 약물 투여되고, 방법은 단계 (c) 에서 검출된 subAR을 치료하거나 예방하기 위해 신장 이식 수여자에게 증가된 도즈의 면역억제제 약물을 또는 단계 (c) 에서 인간 피험자의 이식된 신장에서 예측된, 진단된, 또는 모니터링된 subAR을 치료하거나 예방하기 위해 인간 피험자에게 신규 면역억제제 약물을 투여하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 면역억제제 약물 또는 신규 면역억제제 약물은 칼시네우린 억제제이다. 일부 실시예들에서, 면역억제제 약물 또는 신규 면역억제제 약물은 mTOR 억제제이다. 일부 실시예들에서, 면역억제제 약물 또는 신규 면역억제제 약물은: 아자티오프린, 레플루노마이드, 마이코페놀산, 마이코페놀레이트 모페틸, 프레드니솔론, 히드로코르티손, 바실릭시맙, 알렘투주맙, 다클리주맙, 벨라타셉트, 올소클론, 항흉선세포 글로불린, 항-림프구 글로불린, 항증식 약물, 및 항-T 세포 항체로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
참조로서 인용
본 명세서에 언급된 모든 문헌들, 특허들 및 특허 출원들은 개별 문헌, 특허 및 특허 출원 각각이 참조로서 인용되는 것으로 구체적으로 그리고 개별적으로 나타내더라도, 동일한 정도로 이들의 전체를 참조로서 본 명세서에 인용된다.
본 발명의 새로운 특징들은 첨부된 청구항들에서 자세하게 진술된다. 본 발명의 특징들 및 장점들의 보다 우수한 이해가, 본 발명의 원리들이 활용되는 예시적인 실시예들을 진술하는 이하의 상세한 기술 및 첨부된 도면들을 참조하여 획득될 수 있다.
도 1은 본 개시에 따른 진단 방법들이 어떻게 이식 수여자들로부터 샘플들을 분류하기 위해 사용될 수 있는지의 개략적인 개괄을 제공하는 플로우차트이다.
도 2는 본 개시에 따른 이식 진단 방법들을 구현하고 결과들을 다양한 당사자들에게 전달하기 위한 시스템을 예시하는 플로우차트이다.
도 3 은 의료진들에 의해 관찰된 징후들의 면에서 상이한 이식 상태들 사이의 관계를 예시하는 플로우차트이다.
도 4는 본 개시에 따른 이식 진단 방법들을 구현하기 적합한 컴퓨터 시스템을 예시하는 차트이다.
도 5는 CTOT-08 및 NU 생체저장소 쌍 샘플 집단들에 대한 집단 선택 및 분할 그리고 이들로부터 도출된 발견 및 검증 집단들을 도시하는 도표이고; 이들 집단들은 본 명세서에 기술된 분류 방법들을 개발하기 위해 활용된다.
도 6은 CTOT “발견 (discovery)” 집단으로부터 530 CTOT-08 쌍 말초 혈액 및 감시 생검 샘플들 집단에 기초하여 subAR 분류자 바이오마커에 대한 개량 프로세스를 예시하는 ROC 곡선 및 동반되는 표이다.
도 7은 138 (좌측) 및 129 (138의 서브세트 - 우측) NU 쌍 샘플 (말초 혈액 및 감시 생검) 샘플들 집단들의 subAR 유전자 발현 프로파일 분류자 바이오마커의 외부 검증을 도시하는 차트이다.
도 8은 예 1에 기술된 subAR 유전자 발현 프로파일 분류자의 발견을 위해 사용된 워크플로우를 예시하는 도면이다. PAXGene 튜브들에서 수집된 말초 혈액은 보정 및 정규화 파라미터들을 사용하여 배치들 (batch) 에서 프로세싱되었다. 대용 변수 분석을 사용하여 배치 효과에 대한 ComBat 조정에 이어, 차동 유전자 발현 분석이 수행되고, 이어서 데이터가 랜덤 포레스트 (Random Forest) 모델들을 추가하기 위해 (populate) 사용된다. 지니 중요도 (gini importance) 가 AUC를 위해 최적화된 톱 모델을 선택하도록 사용된다. 이어서 상이한 확률 역치들이 바이오마커의 성능을 최적화하도록 평가된다.
도 9는 예 5에서 개발된 subAR 유전자 발현 프로파일 분류자에 의해 결정될 때 subAR의 의 분해능을 도시하는 차트 (상단) 및 표 (하단) 이다.
도 10은 예 5에 기술된 CTOT-08 연구 설계를 도시하는 도면이다. 피험자들은 주기적 감시 신장 생검 (상부 청색 화살표들) 과 결합된 일련의 혈액 샘플링 (적색 화살표들) 된다. 피험자들이 무증상 급성 거부 (subAR) 를 갖는 것으로 진단되면, 보다 빈번한 혈액 샘플링 (하단 적색 화살표들) 및 8 주 후 후속 생검 (얇은 청색 화살표들) 되었다. 피험자들이 신장 기능장애를 나타내면, “원인을 찾기 위한” 생검을 겪었다. 임상 급성 거부 증상 발현들은 또한 8 주 동안 보다 빈번하게 혈액 샘플링되지만, 생검이 이어지지 않는다. 모든 환자들이 CCE (clinical composite endpoint) 의 일부로서 이식 후 24 개월에 생검이 예정된다 (schedule).
도 11은 24 개월 CCE들과 임상 표현형의 연관을 도시하는 차트이다. 종점 (합성 종점 중 하나 ― CCE) 에 도달한 피험자들의 백분율 또는 CCE의 개별 컴포넌트 (24-개월 생검에서 Grade 2 IFTA, BPAR (biopsy proven acute rejection) 의 임의의 임상 발현, 또는 4 내지 24 개월에 10 ml/min/1.73m2보다 큰 GFR의 강하) 각각이 도시된다. 피험자들은 임상 표현형들에 의해 감시 생검들에 대해 (생검들 상의 TX만을 갖는 (그룹 각각에서 청색 막대들/제 1 막대들), subAR 또는 TX 를 갖는 피험자들 (그룹 각각에서 주황색 막대들/제 2 막대들), subAR의 적어도 하나의 임상 발현을 갖는 피험자들 (그룹 각각에서 회색 막대들, 제 3 막대들), 그리고 이어서 subAR (그룹 각각에서 노랑색 막대들, 제 4 막대들) 만을 갖는 피험자들로 분할된다.
도 12는 이식 후 아무때나 dnDSA (de novo donor-specific antibody) 와 임상 표현형들의 연관을 도시한다. 패널 A (상단) 는 24-개월 실험에서 임상 표현형 그룹 (생검들에서 TX만, 생검에서 subAR만의 적어도 일 증상 발현, 또는 감시 생검에서 subAR만 갖는 피험자들) 에 기초하여, 연구 중 아무때나 dnDSA가 발생된 피험자들의 백분율, 클래스 I (청색 막대들) 또는 클래스 II (주황색 막대들) 을 도시한다. 패널 B (하단) 는 이식 후 첫 해에 획득된 생검 결과들에 제한되지 않고, dnDSA와 임상 표현형들 사이의 연관과 함께 패널 1에 유사한 도면을 도시한다.
도 13은 24-개월 결과들 및 dnDSA와 예 5에서 발생된 subAR 유전자 발현 프로파일 (gene expression profile; GEP) 의 연관을 도시한다. 패널 A (상단) 는 24 개월 결과들과 subAR GEP의 연관을 도시한다. 종점 (합성 종점 중 하나 ― CCE) 에 도달한 피험자들의 백분율 또는 CCE의 개별 컴포넌트 (24-개월 생검에서 Grade 2 IFTA, BPAR (biopsy proven acute rejection) 의 임의의 임상 발현, 또는 4 내지 24 개월에 10 ml/min/1.73m2보다 큰 GFR의 강하) 각각이 도시된다. 피험자들은 이들의 GEP 검사 결과들에 의해 분할된다. GEP 상에 TX만을 갖는 피험자 (그룹 각각에서 청색 막대들/제 1 막대), subAR 또는 TX를 갖는 피험자 (그룹 각각에서 주황색 막대들/제 2 막대), 적어도 subAR로 검사된 피험자 (그룹 각각에서 회색 막대들/제 3 막대), 그리고 이어서 subAR 검사들만 한 피험자들 (그룹 각각에서 노랑색 막대/제 4 막대). 패널 B (중간) 는 이식 후 아무때나 subAR GEP 검사와 dnDSA의 발생 사이의 연관을 도시한다. 이는 24-개월 연구 기간의 아무때나 이루어진 GEP 검사들을 포함한다. GEP 검사에 기초하여 클래스 I (그룹 각각에서 청색 막대들/제 1 막대) 및 클래스 II (그룹 각각에서 주황색 막대들/제 2 막대) 모두로 그룹화된 dnDSA가 발생된 피험자들의 백분율이 도시된다. 피험자 그룹들은 TX 혈액 검사만, 적어도 하나는 subAR 혈액 검사되거나, subAR 혈액 검사만 된다. 모든 혈액 검사들은 감시 생검들과 한 쌍이다. 패널 C (하단) 는 이식 후 첫 해로 제한되는 것을 제외하고, 패널 B (GEP 검사와 dnDSA의 발생 사이의 연관) 에 유사한 분석을 도시한다.
Ⅰ. 개요
본 개시는 생검을 필요로 하지 않는 특정한 신장 이식 상태들을 검출하기 위해 사용될 수 있는 유전자 발현 마커들의 고유의 세트들을 제공한다. 구체적으로, 본 개시는 종래의 실험 방법들 (예를 들어, 혈청 크레아티닌, eGFR) 과 비교하여 보다 높은 센서티비티 (sensitivity) 로 비정상 이식 상태 및/또는 면역 거부를 검출하도록 사용될 수 있는 유전자 발현 마커들 (marker) 의 고유의 세트들을 제공한다. 일부 경우들에서, 방법들은 상대적으로 안정하거나 정상인 혈액 내 크레아티닌 레벨들을 특징으로하는, 무증상 급성 거부 (“subAR”) 면역 거부 상태의 검출을 가능하게 한다. 일부 경우들에서, 방법들은 의료진들에 의한 후속 조치를 필요로 하는 다양한 상태들 (급성 거부, 아급성 거부/subAR, 거부 없이 급성 기능 부전, 및 신장 손상) 을 포괄하는 카테고리인, 신장 동종이식편의 비-이식 우수 상태들 (“non-TX”) 의 검출을 가능하게 하여, 부가적인 진단 또는 치료 절차들을 필요로 하는 환자들의 우선순위를 매길 수 있게 한다.
본 명세서에 제공된 유전자 발현 마커들의 세트들 중 일부의 사용은 “비정상 (non-normal)” 또는 “이상 (abnormal)” 이식 상태의 검출 또는 감소된 위음성율로 면역 활성화를 보조할 수도 있다. 이는 본 명세서에 제공된 검사들 중 일부에서 사용될 때 “이상”의 지정이 급성 거부 (AR), 거부 없이 급성 기능 부전 (acute dysfunction without rejection; ADNR), subAR 및 신장 손상을 포함하는 광범위한 부정 이식 상태들을 포괄하기 때문이다. 본 명세서에 제공된 유전자 발현 마커들의 고유의 세트들이 혈액 샘플들로부터 상태들의 검출에 적합하기 때문에, 최소 침습 방식 (예를 들어, 조직의 외과적 절제 없이) 의 이식 상태의 평가에 특히 유용하고 연속적인 모니터링을 따른다 (amenable). 본 방법들은 또한 이러한 검사들이 종종 양성으로 기록하기 전에 신장 기능을 상당히 손상시킬 수 있는 질병의 상대적으로 발전된 단계를 필요로 하기 때문에, 요 단백질 또는 혈청 크레아티닌 레벨들과 같은 종래의 혈액 검사들보다 우수하다.
본 개시에 따른 특정한 방법들의 개요가 도 1에 제공된다. 일부 예들에서, 방법은 사혈을 통해서와 같이, 최소 침습 방식으로 정상 또는 안정한 신장 기능을 갖는 이식 수여자로부터 샘플을 획득하는 단계 (110) 를 포함한다. 샘플은 이식의 상태 (예를 들어, subAR, 비-이식 우수, 이식 우수, 무 subAR) 와 연관된 유전자 발현 생성물들 (예를 들어, 전혈로부터 분리된 mRNA) 을 포함할 수도 있다. 일부 예들에서, 방법은 본 명세서에 기술된 방법들을 사용하여 분석될 수 있는 cDNA를 획득하기 위해 샘플 내 RNA를 역-전사하는 (reverse-transcribing) 단계를 수반할 수도 있다. 방법은 또한 마이크로어레이 또는 서열 기술과 같은 방법들을 사용하여 유전자 발현 생성물들 (또는 대응하는 DNA) 의 레벨을 분석하는 단계 (120) 를 포함할 수도 있다. 이어서 방법은 subAR 또는 비-TX 대 TX를 검출하기 위해, 분석된 유전자 발현 레벨들에 알고리즘들을 적용하는 단계 (130) 를 포함할 수도 있다. 알고리즘은 이하의 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6 및/또는 표 8로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 52 개의 유전자들, 또는 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6 및/또는 표 8로 구성된 그룹으로부터 선택된 프로브들로 콘택트된 적어도 5 개의 유전자들과 같은 유전자들의 특정한 세트들의 레벨들을 수반할 수도 있다. 이식 수여자가 subAR 또는 비-TX로 지정되면, 혈청 크레아티닌 레벨을 평가하는 것, eGFR을 평가하는 것, 요 단백질 레벨들, 및/또는 신장 생검을 수행하는 것과 같은 추가 검사가 이식 상태를 확인하기 위해 수행될 수도 있다. 비-TX로 지정된 수여자 (recipient) 의 추가 검사시, 면역억제 요법은 상향 또는 하향조정될 수도 있고, 또는 신규 면역억제제들 또는 다른 약물들이 이식 상태를 처리하도록 투여될 수도 있다. 이식 수여자가 subAR로 지정되면, 피험자의 면역억제 요법이 조정될 수도 있고, 또는 부가적인 면역억제제들이 이식된 장기에서 발생하는 면역 거부를 치료하거나 방지하기 위해 투여될 수도 있고; 대안적으로, 바이오마커-촉발된 생검이 획득될 수도 있고 필요하다면 필요한 개입 후 반복된다. 대안적으로, 생검으로부터 바이오마커-촉발된 자제 (abstention) 는 시간 기간 (예를 들어, 1 주, 1 개월, 2 개월, 3 개월) 동안 발생할 수도 있다. 본 명세서에 기술된 생검에 의해 관찰가능한 진단 상태들을 식별하기 위해 혈액 유전자 발현 마커들을 식별하기 위한 연구의 설계가, CTOT-08 연구를 위한 연구 설계를 도시하는, 도 10 및 피험자 특성들을 예시하는 표 7 에 예시된다. 연구 피험자들은 주기적인 신장 생검들 (“감시 생검들”) (연회색 화살표들) 과 결합된 연속적인 혈액 샘플링 (진회색 화살표들) 을 겪는다. 무증상 급성 거부 (“subAR”) 로 진단된 피험자들은 보다 빈번하게 혈액 샘플링되고 (하부 진회색 화살표들), 8 주 후 후속 생검된다 (가는 연회색 화살표들). 신장 기능 장애를 나타내는 피험자들은 “원인을 찾기 위해” 생검들을 겪는다 (가장 아래쪽 연회색 화살표들). 임상 급성 거부 (“cAR”) 의 증상 발현들이 또한 8 주 동안 보다 빈번한 혈액 샘플링되지만, 후속 생검은 없다. 모든 환자들이 CCE (clinical composite endpoint) 의 일부로서 이식 후 24 개월에 생검이 예정된다. 본 명세서에 기술된 바이오마커 패널들의 유용성을 통지하기 위해 사용된 임상 종점들은 24 개월 CCE와 임상 표현형의 연관을 도시하는, 도 11 에 예시된다. 차트는 종점 (임상 합성 종점 중 하나 ― CCE) 에 도달한 피험자들의 백분율 또는 CCE의 개별 컴포넌트 (24-개월 생검에서 Grade 2 IFTA[“IFTA≥II”]; [“BPAR”] 의 임의의 임상 발현, 또는 4 내지 24 개월에 10 ml/min/1.73m2보다 큰 GFR의 강하 [“ΔeGFR”] 각각을 예시한다. 피험자들은 임상 표현형들에 의해 감시 생검들에 대해 (생검들 상의 TX만 (only) 을 갖는 (그룹 각각에서 청색 막대들/제 1 막대들), subAR 또는 TX 를 갖는 피험자들 (그룹 각각에서 주황색 막대들/제 2 막대들), subAR의 적어도 하나의 임상 발현을 갖는 피험자들 (그룹 각각에서 회색 막대들, 제 3 막대들), 그리고 이어서 subAR (그룹 각각에서 노란색 막대들, 제 4 막대들) 만을 갖는 피험자들로 분할된다. 도 12a 및 도 12b는 이식 후 아무때나 “dnDSA”와 임상 표현형들의 연관들을 도시한다. 도 12a (상단 패널) 는 24-개월 실험에서 임상 표현형 그룹 (생검들에서 TX만, 생검에서 subAR의 적어도 일 증상 발현, 또는 감시 생검에서 subAR만 갖는 피험자들) 에 기초하여, 연구 중 아무때나 dnDSA가 발생된 피험자들의 백분율, 클래스 I 그룹 각각의 좌측 막대들/진회색) 또는 클래스 II (그룹 각각의 우측 막대들/연회색) 을 도시한다. 도 12b (하단 패널) 는 이식 후 첫 해에 획득된 생검 결과들에 제한되지 않고, dnDSA와 임상 표현형들 사이의 연관과 함께 도 12a에 유사한 도면을 도시한다. 도 13a 내지 도 13c는 24-개월 결과들 및 dnDSA과 본 명세서에서 발생된 무증상 급성 거부 (“subAR”) 유전자 발현 프로파일 (GEP) 의 연관을 도시한다. 도 13a (상단 패널) 는 24 개월 결과들과 subAR GEP의 연관을 도시한다. 종점 (합성 종점 중 하나 ― CCE) 에 도달한 피험자들의 백분율 또는 CCE의 개별 컴포넌트 (24-개월 생검에서 Grade 2 [“IFTA≥II”]; [“BPAR”] 의 임의의 임상 발현, 또는 4 내지 24 개월에 10 ml/min/1.73m2보다 큰 GFR의 강하 [“ΔeGFR”]) 각각이 도시된다. 피험자들은 이들의 GEP 검사 결과들에 의해 분할된다. GEP 상에 TX만을 갖는 피험자 (그룹 각각에서 청색 막대들/제 1 막대), subAR 또는 TX를 갖는 피험자 (그룹 각각에서 주황색 막대들/제 2 막대), 적어도 subAR로 검사된 피험자 (그룹 각각에서 회색 막대들/제 3 막대), 그리고 이어서 subAR 검사들만 한 피험자들 (그룹 각각에서 노랑색 막대/제 4 막대). 도 13b (중간 패널) 는 이식 후 아무때나 subAR GEP 검사와 dnDSA의 발생 사이의 연관을 도시한다. 이는 24-개월 연구 기간의 아무때나 이루어진 GEP 검사들을 포함한다. GEP 검사들에 기초하여 클래스 I (그룹 각각에서 청색 막대들/제 1 막대) 및 클래스 II (그룹 각각에서 주황색 막대들/제 2 막대) 모두로 그룹화된 dnDSA가 발생된 피험자들의 백분율이 도시된다. 피험자 그룹들은 TX 혈액 검사만, 적어도 하나는 subAR 혈액 검사되거나, subAR 혈액 검사만된다. 모든 혈액 검사들은 감시 생검들과 한 쌍이다. 도 13c (하단 패널)) 는 이식 후 첫 해로 제한되는 것을 제외하고, 패널 B (GEP 검사와 dnDSA의 발생 사이의 연관) 에 유사한 분석을 도시한다. 도 6은 subAR 분류자 바이오마커를 식별하기 위한 프로세스를 예시하는 ROC 곡선을 도시한다. CTOT “발견” 집단으로부터 530 CTOT-08 쌍 말초 혈액 및 감시 생검 샘플들 집단이 사용되었다.
Ⅱ. 정의들
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 관련된 당업자에게 일반적으로 이해되는 동일한 의미를 갖는다. 이에 더하여, 이하의 정의들은 발명의 실시시, 독자를 보조하도록 제공된다.
본 명세서 및 본 개시 전반에 사용된 용어 “또는 (or)”은 “및/또는”을 의미하는 포괄적 “또는”으로 의도된다.
이식 (transplantation) 은 공여자로부터 수여자로 조직들, 세포들, 또는 장기의 이전이다. 공여자 및 수여자가 동일한 사람이면, 이식 (graft) 은 보통의 경우 동종의 상이한 개인들 사이 동종이식편 (allograft) 이기 때문에, 자가이식편 (autograft) 으로 참조된다. 종 간 조직의 이전은 이종 이식 (xenograft) 으로 참조된다.
생검 (biopsy) 은 진단 또는 예후 평가를 위해 살아 있는 환자로부터 획득된 견본이다. 신장 생검들은 바늘로 획득될 수 있다.
평균 값은 임의의 평균, 중간 값 또는 모드를 지칭할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 TX 또는 “이식 우수”는 환자가 장기 기능 장애 또는 거부의 징후 또는 검사 결과들을 나타내지 않는 상태를 의미하도록 사용되고; TX 상태에서 이식은 정상적으로 기능하는 이식으로 간주된다. TX 환자는 감시 생검 (예를 들어, 거부의 증거가 없다 - Banff i=0 그리고 t=0, g=0, ptc=0; ci=0 또는 1 그리고 ct=0 또는 1) 및 안정한 신장 기능 (예를 들어, 평균 기간 및 132 그리고 75 내지 187 일의 범위에 걸쳐 2 내지 3우선 값들의 최소 값과 비교하여, 혈청 크레아티닌 <2.3 ㎎/dl 및 크레아티닌의 20 ％ 미만의 상승) 에 대한 정상 조직검사된다. 반대로, 비-TX는 급성 거부, 무증상 급성 거부, 거부 없이 급성 기능 부전, 및 신장 손상과 같은 상태들을 포괄한다. 일부 실시예들에서, 비-TX는 신장 이식 고통의 상태들을 포괄한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 “무증상 급성 거부” (또한 “subAR”) 는 조직학적으로 정의된 거부를 지칭하고 - 특히, 조직학적으로 정의된 급성 세포 거부 -- 동시 기능 저하 없이 (예를 들어, 평균 기간 및 132 그리고 75 내지 187 일의 범위에 걸쳐 2 내지 3우선 값들의 최소 값과 비교하여, 혈청 크레아티닌 <2.3 ㎎/dl 및 크레아티닌의 20 ％ 미만의 상승) (예를 들어, 감시 생검에 대한 조직학은 Banff 경계선 세포 거부 및/또는 항체 매개 거부 이상의 급성 거부와 일관되는) 생검 견본으로부터 식별된 관간 단핵 침투 (tubule-interstitial mononuclear infiltration) 를 특징으로 한다. subAR의 일부 예들은 프로토콜 샘플링에 의해 우연히 진단된 동종 면역 침투 (alloimmune infiltrate) 의 시작 또는 종료를 나타낼 수도 있고, 임상 거부의 일부 증상 발현들은 실제로 동시 칼시네우린 억제제 (calcineurin inhibitor; CNI) 신독성 (nephrotoxicity) 과 같은, 기능 감퇴의 대안적인 원인을 갖는 subAR을 나타낼 수도 있다. subAR 피험자가 정상적이고 안정한 장기 기능을 가질 수도 있다. 급성 거부는 급성 신장 장애를 특징으로 하기 때문에, subAR은 급성 거부로 구별된다. (제한된 샘플에서 조직학적으로 구별되지 않는 것으로 나타날 수도 있는) subAR과 급성 거부 사이의 차들은 신피질 발병의 실제 정량적 차들, 정성적 차들 (예컨대 상승된 퍼포린 (perforin), 그란자임 (granzyme), c-Bet 발현 또는 대식세포 마커들) 에 의해 또는 면역 손상을 견딜 수 있는 ('순응 (accommodation)') 동종이식편의 상승된 능력에 의해 설명될 수 있다. subAR은 임상 징후로 구동되는 대신, 이식 후 고정된 시간에 프로토콜에 따라 체취된 생검들만으로 진단된다. 이의 진단은 혈청 크레아티닌 및 사구체 여과율과 같은 종래의 신장 기능 측정에 의존할 수 없다.
급성 거부 (AR) 또는 임상 급성 거부는 면역억제가 달성되지 않는 한, 이식된 조직을 손상시키거나 파괴시키는, 이식된 조직이 수여자의 면역 체계에 의해 거부될 때 발생할 수도 있다. T-세포들, B-세포들 및 다른 면역 세포들뿐만 아니라 가능하면 수여자의 항체들은 이식 세포들로 하여금 다른 염증 세포들을 구성하는 (recruit) 사이토카인들을 분리하거나 생성하게 할 수도 있어서, 결국 동종이식편 조직의 괴사를 유발한다. 일부 예들에서, AR은 이식된 장기의 생검에 의해 진단될 수도 있다. 신장 이식 수여자들의 경우, AR은 혈청 크레아티닌 레벨들의 상승과 연관될 수도 있다. AR은 이식 후 처음 3 개월 내지 12 개월에 보다 빈번하게 발생하지만, 이식 후 첫 5년 동안 그리고 환자의 면역억제가 이식의 수명에 임의의 이유로 부적절해질 때마다 AR의 계속된 위험 및 빈도가 있다.
유전자 발현 레벨이 통계적으로 상당한 정도로 표현형이 결여된 환자에 대해 표현형을 갖는 환자에서 유전자가 차동적으로 발현하면, 특정한 표현형 예를 들어, subAR 또는 AR의 존재와 연관된다. 문맥으로부터 달리 분명하지 않는 한, 유전자 발현 레벨이 mRNA 및/또는 단백질 레벨에서 측정될 수 있다.
프로브 또는 폴리뉴클레오티드 프로브는 하나 이상의 타입들의 화학적 결합들을 통해, 보통 상보적 염기 쌍을 통해, 보통 수소 결합 형성을 통해, 상보적 서열의 타깃 핵산에 바인딩할 수 있는 핵산이어서, 이중 구조를 형성한다. 프로브는 “프로브 바인딩 사이트 (probe binding site)”에 바인딩하거나 혼성화된다 (hybridize). 프로브는 천연 (예를 들어, A, G, C, U, 또는 T) 또는 개질된 염기들 (예를 들어, 7-디아자구아노신, 이노신) 을 포함할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오티드일 수 있고 단일 표준 DNA 또는 RNA일 수도 있다. 폴리뉴클레오티드 프로브들은 자연 발생하는 폴리뉴클레오티드들로부터 합성되거나 생성될 수 있다. 이에 더하여, 프로브의 염기들은 혼성화와 간섭하지 않는 한, 인산디에스터 (phosphodiester) 결합 이외의 링크에 의해 결합될 수 있다. 따라서, 프로브들은, 예를 들어, 인산디에스터 링크 이외의 펩타이드 결합들에 의해 구성 염기들이 결합되는 펩타이드 핵산들을 포함할 수 있다. 일부 프로브들은 상보성 영역 옆의 비-상보성 서열들을 리딩하고 그리고/또는 트레일링할 (trailing) 수 있다.
완전히 매칭된 프로브가 특정한 타깃 서열에 완전히 상보적인 서열을 갖는다. 프로브는 통상적으로 타깃 서열의 일부 (서열) 에 완전히 상보적이다.
통계적 유의성은 p < 0.05 또는 < 0.01 또는 심지어 < 0.001 레벨을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 “샘플을 획득하는 것”은 샘플을 직접적으로 또는 간접적으로 획득하는 것을 포함한다. 일부 실시예들에서, 샘플은 후속하여 샘플로부터 바이오마커 데이터를 획득하는 동일 당사자 (예를 들어, 검사 실험실) 에 의해 피험자로부터 체취된다. 일부 실시예들에서, 샘플은 피험자 (예를 들어, 의사, 간호사, 채혈 전문의 (phlebotomist), 또는 의료 간병인) 으로부터 수집되는 또 다른 엔티티로부터 (예를 들어, 검사 실험실에 의해) 수신된다. 일부 실시예들에서, 샘플은 별도의 엔티티 (예를 들어, 검사 실험실) 의 지시 하의 의료진에 의해 피험자로부터 체취되고 후속하여 상기 엔티티 (예를 들어, 검사 실험실) 에 제공된다. 일부 실시예들에서, 샘플은 집에서 피험자 또는 피험자의 간병인에 의해 체취되고 후속하여 샘플로부터 바이오마커 데이터를 획득하는 당사자 (예를 들어, 검사 실험실) 에게 제공된다.
Ⅲ. 환자 모집단 (Patient Populations)
본 개시에 따른 방법들의 적용에 바람직한 피험자들은 이식 수여자들이다. 이식 수여자는 고형 장기 (solid organ) 또는 신장과 같은 고형 장기의 단편의 수여자일 수도 있다. 바람직하게, 이식 수여자는 신장 이식 또는 동종이식편 수여자이다. 일부 예들에서, 이식 수여자는 조직 또는 세포의 수여자일 수도 있다. 일부 특정한 예들에서, 이식된 신장은 만능 줄기 세포(들) (예를 들어, 유도된 만능 줄기 세포들 또는 배아 줄기 세포들) 로부터 인비트로 (in vitro) 구별된 신장일 수도 있다.
방법들은 신장 이식을 겪은 인간 피험자들에 특히 유용하지만, 또한 다른 타입들의 이식 (예를 들어, 심장, 간, 폐, 줄기 세포) 을 겪는 피험자들 또는 신장 또는 다른 이식을 겪는 비-인간에서 사용될 수 있다.
공여자 장기, 조직, 또는 세포들이 수여자 피험자와 특정한 유사성들 또는 호환성들을 갖는 피험자로부터 도출될 수도 있다. 예를 들어, 공여자 장기, 조직, 또는 세포들은 수여자 피험자와 연령-매칭되거나, 민족-매칭되거나, 성별-매칭되거나, 혈액형 호환가능하거나 HLA-타입 호환가능한 공여자 피험자로부터 도출될 수도 있다. 어떤 환경들에서, 공여자 장기, 조직, 또는 세포들은 장기 이용가능성으로 인해 이식 수여자와 연령, 민족, 성별, 혈액형, 또는 HLA 마커들에서 하나 이상의 미스매칭들을 갖는 공여자 피험자로부터 도출될 수도 있다. 장기는 살아 있거나 사망한 공여자로부터 도출될 수도 있다.
용어 피험자 (subject) 또는 환자는 인간 또는 비-인간 동물들을 포함할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기술된 방법들은 인간 및 가축 질병 및 동물 모델들 모두에 적용가능하다. 바람직한 피험자들은 “환자들”, 즉 질병 또는 상태에 대한 의료적 관리를 받는 살아 있는 인간들이다. 이는 병리학적 사인들에 대해 조사 받는 정의되지 않은 질환을 갖는 사람들을 포함한다. 용어 피험자 또는 환자는 이식 수여자들 또는 공여자들 또는 건강한 피험자들을 포함할 수 있다. 방법들은 신장 이식을 겪은 인간 피험자들에 특히 유용할 수 있지만, 또한 다른 타입들의 이식 (예를 들어, 심장, 간, 폐, 줄기 세포, 등) 을 겪은 피험자들에 사용될 수 있다. 피험자들은 포유류이거나 또는 비-포유류일 수도 있다. 바람직하게 피험자는 인간이지만, 일부 경우들에서 피험자는 비-인간 포유류, 예컨대 비-인간 영장류 (예를 들어, 유인원, 원숭이, 침팬지), 고양이, 개, 토끼, 염소, 말, 소, 돼지, 설치류, 쥐, SCID 쥐, 랫 (rat), 기니 피그, 또는 양이다. 피험자는 남성 또는 여성일 수도 있고; 그리고, 일부 경우들에서, 피험자는 유아, 어린이, 청소년, 10대 또는 성인일 수도 있다. 일부 경우들에서, 본 명세서에 제공된 방법들은 아직 이식 받지 못한 피험자, 예컨대 조직 또는 장기 이식을 대기하는 피험자에 사용될 수 있다. 다른 경우들에서, 피험자는 이식 공여자이다. 일부 경우들에서, 피험자는 이식 받지 않았고 이러한 이식을 받으려고 기대하지 않는다. 일부 경우들에서, 피험자는 잠재적인 기능 부전 (failure) 또는 기능 장애에 대해 특정한 장기들의 모니터링이 필요한 질병을 앓는 피험자일 수도 있다. 일부 경우들에서, 피험자는 건강한 피험자일 수도 있다.
다양한 실시예들에서, 본 발명의 방법들에 적합한 피험자들은 subAR의 검출과 같이, 본 명세서에 개시된 방법들에 의해 획득된 분류를 받기 전, 6 시간, 12 시간, 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 10 일, 15 일, 20 일, 25 일, 1 개월, 2 개월, 3 개월, 4 개월, 5 개월, 7 개월, 9 개월, 11 개월, 1 년, 2 년, 4 년, 5 년, 10 년, 15 년, 20 년 또는 보다 긴 기간 내에 장기 이식을 겪은 환자들이다.
종종, 피험자는 치료 요법을 겪는, 또는 치료 요법 (예를 들어, 면역억제 테라피) 에 대해 평가되는 환자 또는 다른 개인이다. 그러나, 일부 예들에서, 피험자는 치료 요법을 겪지 않는다. 해당 방법들에 의해 검출되거나 식별된 이식 내성 표현형의 특징은 예를 들어, 면역억제 테라피를 받지 않은 피험자 내에 존재하는, 면역억제 테라피 없이 발생하는 표현형이다.
본 개시의 방법들은 이식 환자들에서 비-TX 또는 subAR 상태들을 검출하기 적합하고, 조직학 분석에 의존하거나 생검을 얻지 않고 비-TX 또는 subAR을 검출하는데 특히 유용하다.
일부 예들에서, 정상 혈청 크레아티닌 레벨 및/또는 정상 사구체 여과 속도 추정 (estimated glomerular filtration rate; eGFR) 은 건강한 이식 (TX) 또는 무증상 거부 (subAR) 를 나타내거나 상관될 수도 있다. 예를 들어, 혈청 크레아티닌의 통상적인 기준 범위들은 여성에 대해 0.5 내지 1.0 ㎎/dL이고 남성에 대해 0.7 내지 1.2 ㎎/dL이지만, 통상적인 신장 이식 환자들은 여성에 대해 0.8 내지 1.5 ㎎/dL 범위이고 남성에 대해 1.0 내지 1.9 ㎎/dL 범위의 혈청 크레아티닌 농도를 갖는다. 이는 대부분의 신장 이식 환자들이 단일 신장을 갖는다는 사실로 인한 것일 수도 있다. 일부 예들에서, 시간에 따른 혈청 크레아티닌 레벨들의 경향은 수여자의 장기를 평가하기 위해 사용될 수 있다. 이는 의료적 판단들을 할 때, 검사 결과들을 해석할 때, 생검을 하기로 결정하거나 면역억제제 약물들을 변경하는 것을 포함하는 테라피 변경 결정들을 할 때 “정상” 혈청 크레아티닌 레벨들 및 “안정” 혈청 크레아티닌 레벨들 모두를 고려하는데 중요할 수도 있기 때문이다. 예를 들어, 이식 수여자는 상승된 혈청 크레아티닌 레벨 및/또는 하락된 eGFR에 의해 나타낸 바와 같이 이식 기능 장애 또는 거부의 사인들을 보일 수도 있다. 일부 예들에서, 특정한 이식 상태 (예를 들어, subAR, 비-TX, TX, 등) 를 갖는 이식 피험자는 적어도 0.1 ㎎/dL, 0.2 ㎎/dL, 0.3 ㎎/dL, 0.4 ㎎/dL, 0.5 ㎎/dL, 0.6 ㎎/dL, 0.7 ㎎/dL 0.8 ㎎/dL, 0.9 ㎎/dL, 1.0 ㎎/dL, 1.1 ㎎/dL, 1.2 ㎎/dL, 1.3 ㎎/dL, 1.4 ㎎/dL, 1.5 ㎎/dL, 1.6 ㎎/dL, 1.7 ㎎/dL, 1.8 ㎎/dL, 1.9 ㎎/dL, 2.0 ㎎/dL, 2.1 ㎎/dL, 2.2 ㎎/dL, 2.3 ㎎/dL, 2.4 ㎎/dL, 2.5 ㎎/dL, 2.6 ㎎/dL, 2.7 ㎎/dL, 2.8 ㎎/dL, 2.9 ㎎/dL, 3.0 ㎎/dL, 3.1 ㎎/dL, 3.2 ㎎/dL, 3.3 ㎎/dL, 3.4 ㎎/dL, 3.5 ㎎/dL, 3.6 ㎎/dL, 3.7 ㎎/dL, 3.8 ㎎/dL, 3.9 ㎎/dL, 또는 4.0 ㎎/dL의 혈청 크레아티닌 레벨의 상승을 가질 수도 있다. 일부 예들에서, 특정한 이식 상태 (예를 들어, subAR, 비-TX, TX, 등) 를 갖는 이식 피험자는 기준으로부터 적어도 10 ％, 20 ％, 30 ％, 40 ％, 50 ％, 60 ％, 70 ％, 80 ％, 90 ％, 또는 100 ％의 혈청 크레아티닌 레벨의 상승을 가질 수도 있다. 일부 예들에서, 특정한 이식 상태 (예를 들어, subAR, 비-TX, TX, 등) 를 갖는 이식 피험자는 기준으로부터 적어도 1-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 6-배, 7-배, 8-배, 9-배, 또는 10 내지 배의 혈청 크레아티닌 레벨의 상승을 가질 수도 있다. 일부 경우들에서, 혈청 크레아티닌의 상승 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 혈청 크레아티닌의 농도의 임의의 상승) 은 약 0.25 일, 0.5 일, 0.75 일, 1 일, 1.25 일, 1.5 일, 1.75 일, 2.0 일, 3.0 일, 4.0 일, 5.0 일, 6.0 일, 7.0 일, 8.0 일, 9.0 일, 10.0 일, 15 일, 30 일, 1 개월, 2 개월, 3 개월, 4 개월, 5 개월, 또는 6 개월, 또는 그 이상에 걸쳐 발생할 수도 있다. 일부 예들에서, 특정한 이식 상태 (예를 들어, subAR, 비-TX, TX, 등) 를 갖는 이식 피험자는 기준으로부터 적어도 10 ％, 20 ％, 30 ％, 40 ％, 50 ％, 60 ％, 70 ％, 80 ％, 90 ％, 또는 100 ％의 eGFR의 하락을 가질 수도 있다. 일부 경우들에서, eGFR의 하락은 0.25 일, 0.5 일, 0.75 일, 1 일, 1.25 일, 1.5 일, 1.75 일, 2.0 일, 3.0 일, 4.0 일, 5.0 일, 6.0 일, 7.0 일, 8.0 일, 9.0 일, 10.0 일, 15 일, 30 일, 1 개월, 2 개월, 3 개월, 4 개월, 5 개월, 또는 6 개월, 또는 그 이상에 걸쳐 발생할 수도 있다. 일부 예들에서, 이식의 결과 또는 상태 또는 상태를 진단, 예측 또는 모니터링하는 것은 이식 수여자-특이 기준 및/또는 역치들을 결정하는 것을 포함한다.
이와 같이, 본 발명의 방법들은 침습 생검들을 따르지 않고 숨겨진 subAR을 진단 또는 전망하기 위해 정상적이고 안정한 크레아티닌 레벨들을 갖는 환자들에서 사용될 수 있다. 일부 경우들에서, 이식 수여자의 혈청 크레아티닌 레벨들은 적어도 10 일, 20 일, 30 일, 40 일, 50 일, 60 일, 90 일, 100 일, 200 일, 300 일, 400 일 또는 그 이상에 걸쳐 안정하다. 일부 경우들에서, 이식 수여자는 0.2 ㎎/dL 미만, 0.3 ㎎/dL 미만, 0.4 ㎎/dL 미만, 0.5 ㎎/dL 미만, 0.6 ㎎/dL 미만, 0.7 ㎎/dL less than 0.8 ㎎/dL 미만, 0.9 ㎎/dL 미만, 1.0 ㎎/dL 미만, 1.1 ㎎/dL 미만, 1.2 ㎎/dL 미만, 1.3 ㎎/dL, 1.4 ㎎/dL 미만, 1.5 ㎎/dL 미만, 1.6 ㎎/dL 미만, 1.7 ㎎/dL 미만, 1.8 ㎎/dL 미만, 1.9 ㎎/dL 미만, 2.0 ㎎/dL 미만, 2.1 ㎎/dL 미만, 2.2 ㎎/dL 미만, 2.3 ㎎/dL 미만, 2.4 ㎎/dL 미만, 2.5 ㎎/dL 미만, 2.6 ㎎/dL 미만, 2.7 ㎎/dL 미만, 2.8 ㎎/dL 미만, 2.9 ㎎/dL 미만, 또는 3.0 ㎎/dL 미만의 혈청 크레아티닌 레벨을 갖는다.
Ⅳ. 샘플들
본 개시의 방법들은 피험자로부터 도출된 샘플들로부터의 생체 분자들을 세트스한 것에 기초하여 복수의 카테고리들 (예를 들어, TX, 비-TX, subAR, AR) 중 하나로 피험자들의 분류를 수반한다. 분석을 위해 바람직한 샘플 타입은, 전혈 또는 혈장, 림프구들, 말초 혈액 림프구들 (peripheral blood lymphocytes; PBLs), 말초 혈액 단핵 세포들 (peripheral blood mononuclear cells; PBMCs), 혈청, T 세포들, B 세포들, CD3 세포들, CD8 세포들, CD4 세포들, 또는 다른 면역 세포들과 같은 이들의 분획들 (fraction) 을 지칭하는, 혈액 샘플이다. 분석될 수 있는 다른 샘플들은 소변, 대변, 타액, 및 신장 생검으로부터 조직을 포함한다. 특별히 말초 혈액을 획득하기 위해 생검을 필요로 하지 않는 샘플들이 바람직하다. 그러나, 샘플은 검사될 피험자의 조직들, 세포들, 핵산들, 유전자들, 유전자 단편들, 발현 생성물들, 폴리펩타이드류, 엑소좀류, 유전자 발현 생성물들, 또는 유전자 발현 생성물 단편들을 포함하는 임의의 시료일 수도 있다. 일부 경우들에서, 샘플은 단일 환자이다. 일부 경우들에서, 방법은 예를 들어, 대량 병렬 서열분석 (massively-parallel sequencing) 을 통해 복수의 샘플들을 한번에 분석하는 단계를 포함한다.
샘플은 사혈과 같은 최소 침습 방법에 의해 획득될 수도 있다. 샘플은 정맥 천자에 의해 획득될 수도 있다. 다른 예들에서, 샘플은 이로 제한되는 것은 아니지만, 생검, 페포 또는 폐 세척, 또는 바늘 흡인 (needle aspiration) 을 포함하는 침습성 절차에 의해 획득된다. 생검의 방법은 외과적 생검, 절개 생검, 절제 생검, 펀치 생검, 표층 생검 또는 피부 생검을 포함할 수도 있다. 샘플은 포르말린 고정 절편들일 수도 있다. 바늘 흡인 방법은 세침 흡인 (fine needle aspiration), 중심 바늘 생검, 진공 보조 생검, 또는 대핵 생검 (large core biopsy) 을 더 포함할 수도 있다. 일부 실시예들에서, 복수의 샘플들이 충분한 양의 생물학적 시료를 보장하기 위해 본 명세서의 방법들에 의해 획득될 수 있다. 일부 예들에서, 샘플은 생검에 의해 획득되지 않는다. 일부 예들에서, 샘플은 신장 생검이 아니다.
일부 경우들에서 방법들은 생검 샘플 (예를 들어, 신장 생검) 을 획득하거나 분석하는 단계를 수반한다. 생검들이 획득되는 경우들에서, 생검들은 용기 (예를 들어,튜브, 유리병 (vial), 마이크로원심분리 튜브 (microfuge tube), 등) 에 샘플들을 넣고 생체저장소와 같은 특정한 위치에 이들을 저장함으로써 프로세싱될 수도 있다. 샘플들은 또한 핵산 열화 또는 저하를 방지하는 작용제 (agent), 특히 RNA (예를 들어, RNALater) 또는 DNA를 보호하는 작용제와 같은 특정한 작용제로 처리하여 프로세싱될 수도 있다. 일부 경우들에서, 생검들은 착색 (예를 들어, H&E (hematoxylin and eosin) 착색) 프로브 (예를 들어, 염료에 부착된 프로브, 형광 라벨에 부착된 프로브) 를 포함하여 조직학적 분석을 받는다. 일부 경우들에서, 착색 (예를 들어, H&E) 은 BANFF 기준과 같은 기준을 사용하여, 맹목적인 병리학자 (blinded pathologist) 와 같은 맹목적인 의사 또는 적어도 2 명의 맹목적인 병리학자들에 의해 분석될 수도 있다. 일부 경우들에서, 조직학적 진단은 바이오마커 분석들 전에 하나 이상의 임상의들 (예를 들어, 적어도 2 명의 임상의들) 에 의해 실험실 데이터 및 임상 과정들로 조정된다.
Ⅴ. 생체 분자 발현 프로파일들
본 명세서에 개시된 방법들, 키트들 및 시스템들은 발현 프로파일을 결정하기 위해 생물학적 샘플들에 있는 생체 분자들 (예를 들어, 핵산들, DNA, RNA, 폴리펩타이드류, 등) 을 특수하게 검출, 프로파일링, 또는 정량화하는 것을 포함할 수도 있다. 일부 예들에서, RNA, 또는 폴리펩타이드류를 포함하는 게놈 발현 생성물들이 생물학적 샘플들로부터 분리될 수도 있다. 일부 경우들에서, 핵산들, DNA, RNA, 폴리펩타이드류가 무-세포 소스 (cell-free source) 로부터 분리될 수도 있다. 일부 경우들에서, 핵산들, DNA, RNA, 폴리펩타이드류는 이식 수여자로부터 도출되는 세포들로부터 분리될 수도 있다. 일부 경우들에서, 검출된 분자들은 효소 프로세스를 통해 (예를 들어, 생물학적 샘플로부터 RNA의 역전사로부터 도출되고 증폭된 cDNA) 샘플 내에 내인성으로 존재하는 분자들로부터 도출된다.
발현 프로파일들은 바람직하게 핵산 레벨로 측정되고, 이로부터 도출된 mRNA 또는 핵산 (예를 들어, cDNA 또는 cRNA) 레벨들이 측정된다는 것을 의미한다. 발현 프로파일은 샘플에서 복수의 유전자들의 발현 레벨들을 참조한다. mRNA로부터 도출된 핵산은 템플릿으로서 mRNA를 사용하여 합성된 핵산을 의미한다. mRNA의 분리 및 증폭 방법들은 예를 들어, Chapter 3 of Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, (P. Tijssen, ed.) Elsevier, N.Y. (1993) 에 기술된다. 이로부터의 mRNA 또는 핵산이 증폭되면, 증폭은 증폭된 핵산들의 레벨들이 mRNA들을 나타내는 표현형 연합을 확립하도록 사용될 수 있도록 원래 샘플들의 mRNA의 상대적인 비율들을 대략적으로 보존하는, 상태들 하에서 수행된다.
일부 실시예들에서, 발현 레벨들은 프로브 어레이를 사용하여 결정된다. 다수의 구별된 어레이 포맷들이 이용가능하다. 일부 어레이들, 예컨대 Affymetrix HG-U133 PM 마이크로어레이 또는 다른 Affymetrix GeneChip®어레이가 근접한 지지부의 이산적인 공지의 영역들을 점유하는 상이한 프로브들을 갖는다. 예시적인 마이크로어레이들은, 이로 제한되지 않지만, Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 GeneChip 또는 HT HG-U133+ PM Array Plate를 포함한다.
어레이는 샘플의 다른 mRNA들로부터 이를 구별하기 위해, 특정한 타깃 mRNA에 완전히 상보적이거나 타깃 mRNA에 충분히 상보적인 하나 이상의 프로브들을 포함하고, 이러한 타깃 mRNA의 존재는 선택가능하게 어레이에 포함된 미스매칭 또는 다른 대조 프로브들과의 비교에 의해, 이러한 프로브들의 혼성화 신호로부터 결정될 수 있다. 통상적으로, 타깃은 혼성화 강도가 예를 들어, 광자 카운팅 모드 (counting mode) 에서 주사 공초점 현미경에 의해 결정될 수 있는 경우, 형광 라벨을 품는다. 적절한 주사 디바이스들이 예를 들어, U.S. 5,578,832, 및 U.S. 5,631,734에 기술된다. 특정한 mRNA 또는 이의 증폭 생성물에 대한 혼성화 프로브들의 라벨링 강도는 발현 레벨의 미가공 (raw) 측정값을 제공한다.
다른 방법들에서, 발현 레벨들은 정량적 PCR 또는 Taqman으로 또한 공지된 소위 “실시간 증폭” 방법들에 의해 결정된다. 이 방법의 근거는 검출될 템플릿의 영역에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브들/올리고를 사용하여 템플릿과 PCR 반응 동안 형성된 증폭 생성물의 형성을 모니터링하는 것이다. 일부 실시예들에서, 분리된 세포 mRNA에 역전사 반응이 수행된 직후 qPCR 또는 Taqman이 사용되고; 이 다양성은 qPCR 동안 개별 mRNA들의 레벨들을 정량화하도록 기능한다.
Taqman은 듀얼-라벨링된 불소 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한다. 이러한 분석들에 사용된 듀얼 라벨링된 불소 프로브는 통상적으로, 2 개의 상이한 형광 염료들로 라벨링된 짧은 (약 20 내지 25 염기) 폴리뉴클레오티드이다. 프로브의 5' 말단은 통상적으로 리포터 (reporter) 염료에 부착되고 3' 말단은 퀀칭 염료 (quenching dye) 에 부착된다. 라벨링 여부와 무관하게, qPCR 프로브는 타깃 mRNA 또는 이로부터 도출된 핵산 상의 사이트와 실질적인 서열 상보성을 갖도록 설계된다. 유전자좌 (locus) 의 옆 영역들에 바인딩하는 업스트림 및 다운스트림 PCR이 또한 반응 혼합물에 첨가된다. 프로브가 온전하면, 2 개의 형광단들 사이의 에너지 전달이 발생하고 퀀처가 리포터로부터 발광을 퀀칭한다. PCR의 확장 페이즈 동안, 프로브는 Taq 폴리머라제와 같은 핵산 폴리머라제의 5' 뉴클레아제 활성에 의해 쪼개지고, 따라서, 폴리뉴클레오티드-퀀처로부터 리포터를 릴리즈하고 적절한 검출기에 의해 측정될 수 있는 리포터 발광 강도의 상승을 발생시킨다. 이어서 기록된 값들이 연속적인 기준으로 정규화된 리포터 발광 강도의 상승을 계산하도록 사용될 수 있고 궁극적으로 증폭될 mRNA의 양을 정량화할 수 있다. mRNA 레벨들은 또한, 예를 들어, QuantiGene®Reagent System from Panomics와 같은 분기된 핵산 프로브를 사용하여, 프로브에 혼성화함으로써 증폭 없이 측정될 수 있다.
qPCR은 또한 dsDNA 증폭된 특정 업스트림 및 다운스트림 올리고뉴클레오티드 프라이머들의 축적을 반영하는, dsDNA에 특이적인 형광 염료 (예를 들어, SYBR Green) 를 사용함으로써 듀얼-라벨링된 불소 프로브없이 수행될 수 있다. 증폭 반응 동안 형광의 상승은 연속적인 기준으로 이어지고, 증폭될 mRNA의 양을 정량화하기 위해 사용될 수 있다.
qPCR 또는 Taqman에 대해, 특정한 유전자들의 레벨들은 동일한 검출 방법을 사용하여 동일한 샘플로부터 측정된 하나 이상의 내부 대조 유전자에 대해 발현될 수 있다. 내부 대조 유전자들이 소위 “하우스키핑 (housekeeping)” 유전자들 (예를 들어, ACTB, B2M, UBC, GAPD 및 HPRT1) 을 포함할 수도 있다. 일부 실시예들에서, 하나 이상의 내부 대조 유전자는 TTC5, C2orf44, 또는 Chr3이다.
일부 실시예들에서, qPCR 또는 Taqman 검출을 위해, “전-증폭 (pre-amplification)” 단계가 정량적으로 모니터링된 PCR 반응 전에 세포 RNA로부터 전사된 cDNA에 대해 수행된다. 이는 검출될 RNA/cDNA의 자연 레벨이 매우 낮은 상태들의 신호를 상승시키도록 기능한다. 전-증폭을 위해 적합한 방법들은 이로 제한되지 않지만, LM-PCR, 랜덤 올리고뉴클레오티드 프라이머들을 갖는 PCR (예를 들어, 랜덤 헥사머 (random hexamer) PCR), 폴리-A 특이 프라이머들을 갖는 PCR, 및 이들의 임의의 조합을 포함한다.
다른 방법들에서, 발현 레벨들은 서열분석에 의해, 예컨대 (예를 들어, 샘플로부터의 역전사 RNA (예를 들어, mRNA) 로부터 생성된 cDNA의) DNA 서열분석에 의해 또는 RNA 서열분석에 의해 결정된다. 서열분석 임의의 이용가능한 방법 또는 기법에 의해 수행될 수도 있다. 서열분석 방법들은: 차세대 서열분석, 고 처리량 서열분석 (high-throughput sequencing), 파이로서열분석 (pyrosequencing), 전통적인 Sanger 서열분석 방법들, 라이게이션에 의한 서열분석 (sequencing-by-ligation), 합성에 의한 서열분석 (sequencing by synthesis), 혼성화에 의한 서열분석, RNA-Seq (Illumina), Digital Gene Expression (Helicos), 차세대 서열분석, SMSS (single molecule sequencing by synthesis) (Helicos), Ion Torrent Sequencing Machine (Life Technologies/Thermo-Fisher), 대량 병렬 서열분석, 클론 단일 분자 어레이 (clonal single molecule Array) (Solexa), 샷건 서열분석 (shotgun sequencing), 단일 분자 나노기공 서열분석, 라이게이션에 의한 서열분석, 혼성화에 의한 서열분석, 나노기공 전류 제한에 의한 서열분석, Maxim-Gilbert 서열분석, 프라이머 워킹 (primer walking), 또는 이들의 조합을 포함할 수도 있다. 합성에 의한 서열분석은 가역 말단 서열 분석 (reversible terminator sequencing), 진화성 단일 분자 서열분석 (processive single molecule sequencing), 순차 뉴클레오티드 플로우 서열분석 (sequential nucleotide flow sequencing), 또는 이들의 조합을 포함할 수도 있다. 순차 뉴클레오티드 플로우 서열분석은 파이로서열분석, pH-매개 서열분석, 또는 이들의 조합을 포함할 수도 있다. 하나 이상의 서열분석 반응들을 수행하는 단계는 전 (whole) 게놈 서열분석 또는 엑소좀 서열분석을 포함할 수도 있다.
서열분석 반응들이 하나 이상의 탐침 프로브들 또는 탐침 프로브들의 라이브러리들을 포함할 수도 있다. 하나 이상의 탐침 프로브 라이브러리들 중 적어도 하나는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250 또는 이상의 게놈 영역들에 대한 하나 이상의 탐침 프로브들을 포함할 수도 있다. 탐침 프로브들의 라이브러리들은 적어도 부분적으로 상보적일 수도 있다. 탐침 프로브들의 라이브러리들은 완전히 상보적일 수도 있다. 탐침 프로브들의 라이브러리들은 적어도 약 5 ％, 10 ％, 15 ％, 20 ％, ％, 25 ％, 30 ％, 35 ％, 40 ％, 45 ％, 50 ％, 55 ％, 60 ％, 70 ％, 80 ％, 90 ％, 95 ％, 97 ％ 또는 이상 상보적일 수도 있다.
유전자 발현 레벨들을 측정하는 단계는 cDNA를 생성하기 위해 샘플 내에서 역전사 RNA (예를 들어, mRNA) 를 포함할 수도 있다. 이어서 cDNA는 본 명세서에 기술된 임의의 방법들을 사용하여 측정될 수도 있다 (예를 들어, qPCR, 마이크로어레이, 서열분석, 등).
대안적으로, 또는 부가적으로, 유전자들의 발현 레벨들은 단백질 레벨에서 결정될 수 있고, 단백질류의 레벨들이 상기 논의된 유전자들에 의해 암호화된다는 것을 의미한다 다. 몇몇 방법들 및 디바이스들은 관심 있는 단백질 피분석물의 존재 또는 양과 관련되는, 신호를 생성하도록, 샌드위치, 경합형 또는 비경합형 분석 포맷들과 같은 면역 분석들을 포함하는, 단백질류의 레벨들을 결정하는데 공지되었다. 면역 분석들은 이로 제한되는 것은 아니지만, 예컨대 ELISA (enzyme-linked immunoassays), RIAs (radioimmunoassays), 및 경합형 바인딩 분석이 활용될 수도 있다. 항체 어레이들에 대한 다수의 포맷들이 항체들을 채용하여 기술되고 제안되었다. 이러한 어레이들은 통상적으로 검출되도록 의도된 상이한 단백질류에 대해 특수성을 갖는 상이한 항체들을 포함한다. 예를 들어, 보통 적어도 100 개의 상이한 항체들이 100 개의 상이한 단백질 타깃들을 검출하도록 사용되고, 항체 각각은 일 타깃에 특이도다. 특정한 단백질 타깃에 특이도를 갖는 다른 리간드들이 또한 합성 항체들과 같이 사용될 수 있다. 목표된 바인딩 특이도를 갖는 다른 화합물들이 펩타이드류 또는 작은 분자들의 랜덤 라이브러리들로부터 선택될 수 있다. 어레이의 복수의 타깃 항원들을 검출하기 위해 멤브레인 상의 고정된 항체들의 복수의 이산적인 존들을 활용하는, “단백질 어레이”, 디바이스가 활용될 수도 있다. 마이크로티터 플레이트들 (microtiter plates) 또는 자동화가 많은 수의 상이한 단백질류의 검출을 용이하게 하도록 사용될 수 있다. 단백질 레벨들은 또한 예들에 기술된 바와 같이 질량 분석법에 의해 결정될 수 있다.
Ⅵ. 생체 분자 시그니처들 ( Biomolecule Signatures)
본 발명에 따라 피험자들로부터 샘플들을 하나 이상의 진단 카테고리들로 분류하기 위해 활용된 유전자들 또는 발현 생성물들 (예를 들어, mRNA, RNA, DNA, 단백질) 의 선택은 특정한 적용예 (예를 들어, TX vs 비-TX 장기 구별, 또는 TX vs subAR 장기 구별) 에 종속된다. 일반적으로, 유전자들은 적용예에 적절하게 이하에 나타낸 표들 중 하나로부터 선택된다. 일부 방법들에서, 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6 및/또는 표 8에 도시된 적어도 2, 3, 4, 5, 10, 20, 25, 50, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 또는 250 (예를 들어, 100 내지 250) 개의 유전자들의 발현 레벨들이 결정된다. 일부 방법들에서, 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6 및/또는 표 8에 도시된 최대 25, 50, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 또는 250 개의 유전자들의 발현 레벨들이 결정된다. 일부 방법들에서, 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6 및/또는 표 8에 도시된 약 5, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 또는 250 (예를 들어, 100 내지 250) 개의 유전자들의 발현 레벨들이 결정된다. 방법들은 표 1에 제공된 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 또는 210 개의 유전자들 또는 프로브들에 의해 콘택트된 유전자들에 대응하는 유전자 발현 생성물들을 사용할 수도 있다. 방법들은 표 2에 제공된 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 또는 모든 유전자들 또는 프로브들에 의해 콘택트된 유전자들에 대응하는 유전자 발현 생성물들을 사용할 수도 있다. 방법들은 표 3에 제공된 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 또는 120 개의 유전자들 또는 프로브들에 의해 콘택트된 유전자들에 대응하는 유전자 발현 생성물들을 사용할 수도 있다. 방법들은 표 4에 제공된 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 또는 모든 유전자들 또는 프로브들에 의해 콘택트된 유전자들에 대응하는 유전자 발현 생성물들을 사용할 수도 있다. 방법들은 표 5에 제공된 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 또는 모든 유전자들 또는 프로브들에 의해 콘택트된 유전자들에 대응하는 유전자 발현 생성물들을 사용할 수도 있다. 방법들은 표 6에 제공된 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 또는 모든 유전자들 또는 프로브들에 의해 콘택트된 유전자들 에 대응하는 유전자 발현 생성물들을 사용할 수도 있다. 방법들은 표 8에 제공된 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 또는 모든 유전자들 또는 프로브들에 의해 콘택트된 유전자들에 대응하는 유전자 발현 생성물들을 사용할 수도 있다. 방법들은 표 1에 제공된 최대 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 또는 210 개의 유전자들 또는 프로브들에 의해 콘택트된 유전자들에 대응하는 유전자 발현 생성물들을 사용할 수도 있다. 방법들은 표 2에 제공된 최대 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 또는 모든 유전자들 또는 프로브들에 의해 콘택트된 유전자들에 대응하는 유전자 발현 생성물들을 사용할 수도 있다. 방법들은 표 3에 제공된 최대 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 또는 120 개의 유전자들 또는 프로브들에 의해 콘택트된 유전자들에 대응하는 유전자 발현 생성물들을 사용할 수도 있다. 방법들은 표 4에 제공된 최대 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 또는 모든 유전자들 또는 프로브들에 의해 콘택트된 유전자들에 대응하는 유전자 발현 생성물들을 사용할 수도 있다. 방법들은 표 5에 제공된 최대 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 또는 모든 유전자들 또는 프로브들에 의해 콘택트된 유전자들에 대응하는 유전자 발현 생성물들을 사용할 수도 있다. 방법들은 표 6에 제공된 최대 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 또는 모든 유전자들 또는 프로브들에 의해 콘택트된 유전자들에 대응하는 유전자 발현 생성물들을 사용할 수도 있다. 방법들은 표 8에 제공된 최대 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 또는 모든 유전자들 또는 프로브들에 의해 콘택트된 유전자들에 대응하는 유전자 발현 생성물들을 사용할 수도 있다.
일부 방법들에서, 유전자들은 몇몇 상이한 경로들로부터의 유전자들이 나타나도록 선택된다. 경로 내 유전자들은 조정된 발현으로 발현되도록 의도되지만, 상이한 경로들의 유전자들은 보다 독립적으로 발현되는 경향이 있다. 따라서, 상이한 경로들로부터 유전자들의 총체적 변화들에 기초한 발현의 변화들이 경로 내 유전자들의 총체적 변화들보다 큰 통계적 의의를 가질 수 있다. 일부 경우들에서, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 7에 도시된 상위 5, 상위 10, 상위 15, 상위 20, 상위 25, 상위 30, 상위 35, 상위 40, 상위 45, 상위 50, 상위 55, 상위 60, 상위 65, 상위 70, 상위 75, 상위 80, 상위 85, 상위 90, 상위 95, 상위 100, 상위 150, 또는 상위 200 개의 유전자들의 발현 레벨들이 결정된다.
채택된 포맷과 무관하게, 본 방법들은 전 게놈 레벨 발현 분석과 비교된 상대적으로 적은 수의 유전자들 또는 단백질류의 발현 레벨들의 검출에 의해 실시될 수 있다. 일부 방법들에서, 발현 레벨들이 결정되는 유전자들의 총 수는 5000, 1000, 500, 200, 100, 50, 25, 10, 5 또는 3 미만이다. 일부 방법들에서, 발현 레벨이 결정되는 유전자들의 총 수는 100 내지 1500, 100 내지 250, 500 내지 1500 또는 750 내지 1250이다. 일부 방법들에서, 발현 레벨들이 결정되는 단백질류의 총 수는 5000, 1000, 500, 200, 100, 50, 25, 10, 5 또는 3 미만이다. 일부 방법들에서, 발현 레벨이 결정되는 단백질류의 총 수는 100 내지 1500, 100 내지 250, 500 내지 1500 또는 750 내지 1250이다. 대응하여, 어레이 형태가 발현 레벨들의 검출을 위해 사용될 때, 어레이는 5000, 1000, 500, 200, 100, 50, 25, 10, 5 또는 3 개 미만의 유전자들에 대한 프로브들 또는 프로브들 세트들을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 어레이를 모니터링하는 Affymetrix GeneChip®발현은 관심 있는 유전자 각각을 모니터링하기 위해 약 20 내지 50 개의 올리고뉴클레오티드 프로브들 (반-매칭 및 반-미스매칭) 의 세트를 포함한다. 이러한 어레이 설계는 5000, 1000, 500, 200, 100, 50, 25, 10, 5 또는 3 개 미만의 유전자들을 검출하기 위해, 5000, 1000, 500, 200, 100, 50, 25, 10, 5 또는 3 개 미만의 이러한 프로브들 세트들을 포함할 것이다. 추가 예로서, 발현 레벨이 검출될 유전자 각각에 대해 일 cDNA를 포함하는 대안적인 어레이는 5000, 1000, 500, 200, 100, 50, 25, 10, 5 또는 3 개 미만의 유전자들을 분석하기 위해 5000, 1000, 500, 200, 100, 50, 25, 10, 5 또는 3 개 미만의 이러한 cDNA들을 포함할 것이다. 추가 예로서, 검출될 단백질 각각에 대해 상이한 항체를 포함하는 어레이는 5000, 1000, 500, 200, 100, 50, 25, 10, 5 또는 3 개 미만의 유전자 생성물들을 분석하기 위해 5000, 1000, 500, 200, 100, 50, 25, 10, 5 또는 3 개 미만의 상이한 항체들을 포함할 것이다.
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Ⅶ. 발현 프로파일들의 분석 및 샘플들의 분류
발현 프로파일들이 본 개시의 방법들에 따라 샘플들을 분류하도록 사용될 수 있기 전에, 결정된 발현 레벨들로부터 데이터가 변환될 수도 있다. 발현 레벨들의 분석은 처음에 몇몇 개별 유전자들 각각의 발현 레벨의 측정을 제공한다. 발현 레벨은 발현 생성물의 농도의 면에서 절대적일 수 있고, 또는 샘플의 또 다른 발현 생성물에 대한 관심 있는 발현 생성물의 상대적인 농도의 면에서 상대적일 수 있다. 예를 들어, 유전자들의 상대적 발현 레벨들은 샘플의 하우스키핑 유전자의 발현 레벨에 대해 표현될 수 있다. 상대적인 발현 레벨들은 또한 동일한 어레이에 대해 혼성화된 차동적으로 라벨링된 샘플들을 동시에 분석함으로써 결정될 수 있다. 발현 레벨들은 또한 예를 들어, 신호 강도에 관련된, 임의의 단위들로 표현될 수 있다.
절대적 또는 상대적이든, 개별 발현 레벨들이 하나 이상의 기준 점들과 비교에 의해 TX, 비-TX, 또는 subAR의 존재 또는 위험의 지표를 제공하는 값들 또는 다른 지정들로 변환될 수 있다. 바람직하게, 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6 및/또는 표 8의 유전자들이 이러한 분석을 위해 사용된다. 기준 점들은 subAR 또는 TX를 갖지 않는 신장 이식된 피험자들의 유전자의 평균 (average) 또는 평균 (mean) 발현 레벨의 측정값, subAR 또는 비-TX를 갖는 신장 이식된 피험자들의 발현 레벨들의 평균 또는 평균 값, 및/또는 급성 거부를 갖는 신장 이식된 피험자들에서 발현 레벨들의 평균/평균 값을 포함할 수 있다. 기준 점들은 subAR 또는 비-TX를 갖는 환자들 및 갖지 않는 환자들을 포함하여, 신장 이식 환자들에서 발견된 값들의 크기를 또한 포함할 수 있다. 기준 점들은 또한 또는 대안적으로 신장 이식 전 피험자의 기준 값, 또는 신장 이식을 겪지 않은 환자들의 모집단의 기준 값을 포함할 수 있다. 이러한 기준 점들은 샘플의 측정된 값들에 대해 유전자 생성물들의 절대적 또는 상대적 농도들의 면에서 표현될 수 있다.
측정된 발현 레벨과 레벨(들) 사이의 비교를 위해, 측정된 레벨은 때때로 기준 레벨(들)과 비교를 위해 정규화되거나 반대로 될 필요가 있다. 정규화는 (예를 들어, 환자의 전체 건강 또는 샘플 조제 (preparation) 의 차들로부터) subAR 또는 비-TX 상태들에 관련되지 않은 발현 레벨의 변화들을 제거하거나 적어도 최소화하도록 역할을 한다. 정규화는 샘플의 상이한 유전자들로부터 측정된 발현 레벨들의 프로파일과 기준 레벨들이 결정되는 기준 샘플들의 세트의 이들 유전자들의 발현 레벨들을 균등화하기 위해 어떤 인자가 필요한지를 결정함으로써 수행될 수 있다. 상업적 소프트웨어가 발현 레벨들의 상이한 세트들 사이의 이러한 정규화를 수행하기 위해 이용가능하다.
환자 샘플로부터 도출된 데이터 (예를 들어, 발현 레벨 또는 발현 프로파일) 는 상이한 시간들에 동일한 환자들로부터의 샘플들 또는 상이한 환자들로부터의 샘플들일 수도 있는, 하나 이상의 대조군 샘플들에 관련한 데이터에 비교될 수도 있다. 일부 경우들에서, 하나 이상의 대조군 샘플들은 건강한 피험자들, 건강하지 않은 피험자들, 또는 이들의 조합로부터 하나 이상의 샘플들을 포함할 수도 있다. 하나 이상의 대조군 샘플들은 건강한 (TX) 피험자들, 불안정 신장 이식 기능을 앓는 (비-TX) 피험자들, 또는 무증상 급성 이식 거부 (subAR) 를 앓는 피험자들, 또는 이들의 조합으로부터 하나 이상의 샘플들을 포함할 수도 있다. 건강한 피험자들은 정상 이식 기능을 갖는 피험자들일 수도 있다. 샘플에 관련한 데이터는 2 이상의 클래스들의 샘플들과 순차적으로 비교될 수도 있다. 샘플에 관련한 데이터는 3 이상의 클래스들의 샘플들과 순차적으로 비교될 수도 있다. 샘플들의 클래스들은 정상 이식 기능 (TX) 을 갖는 피험자들로 분류된 대조군 샘플들, 불안정 신장 이식 기능을 앓는 피험자들로부터 분류될 대조군 샘플들, 무증상 급성 이식 거부 (subAR) 를 앓는 피험자들로 분류된 대조군 샘플들, 또는 이들의 조합을 포함할 수도 있다.
성능의 센서티비티, 특이도, 정확도 및 다른 측정값들
본 명세서에 제공된 방법들은 환자가 고도의 정확도, 센서티비티, 및/또는 특이도를 갖는 subAR 또는 비-TX의 향상된 위험을 갖거나 위험이 있는지 여부를 결정하는 것을 보조할 수 있다. 일부 경우들에서, (예를 들어, subAR 또는 비-TX를 검출하기 위해, TX와 SubAR 사이를 구별하기 위해, 또는 TX와 비-TX 사이를 구별하기 위해) 정확도는 75 ％, 90 ％, 또는 95 ％보다 크다. 일부 경우들에서, (예를 들어, subAR 또는 비-TX를 검출하기 위해, subAR vs TX를 구별하기 위해, 또는 TX와 비-TX 사이를 구별하기 위해) 센서티비티는 75 ％, 85 ％, 또는 90 ％보다 크다. 일부 경우들에서, (예를 들어, subAR 또는 비-TX를 검출하기 위해, TX와 SubAR 사이를 구별하기 위해, 또는 TX와 비-TX 사이를 구별하기 위해) 특이도는 75 ％, 85 ％, 90 ％, 또는 95 ％보다 크다. 일부 경우들에서, (예를 들어, subAR 또는 비-TX를 검출하기 위해, subAR vs TX를 구별하기 위해, 또는 TX와 비-TX 사이를 구별하기 위해) 방법의 양성 예측 값 (positive predictive value) 또는 PPV은 75 ％, 85 ％, 90 ％, 또는 95 ％보다 크다. 본 명세서에 제공된 임의의 방법들에서 역치를 넘은 후 AUC는 0.9, 0.91, 0.92, 0.93, 0.94, 0.95. 0.96, 0.97, 0.98, 0.99, 0.995, 또는 0.999보다 클 수도 있다.
(예를 들어, subAR 또는 비-TX를 검출하기 위해, subAR vs TX를 구별하기 위해, 또는 TX와 비-TX 사이를 구별하기 위해) 본 명세서에 기술된 샘플을 식별, 분류, 또는 특징화하는데 사용하기 위한 방법들 및 시스템들은 적어도 약 50 ％, 55 ％, 57 ％, 60 ％, 62 ％, 65 ％, 67 ％, 70 ％, 72 ％, 75 ％, 77 ％, 80 ％, 82 ％, 85 ％, 87 ％, 90 ％, 92 ％, 95 ％, 또는 97 ％의 특이도를 가짐으로써 특징화될 수도 있다.
(예를 들어, subAR 또는 비-TX를 검출하기 위해, subAR vs TX를 구별하기 위해, 또는 TX와 비-TX 사이를 구별하기 위해) 본 명세서에 기술된 샘플을 식별, 분류, 또는 특징화하는데 사용하기 위한 방법들 및 시스템들은 적어도 약 50 ％, 55 ％, 57 ％, 60 ％, 62 ％, 65 ％, 67 ％, 70 ％, 72 ％, 75 ％, 77 ％, 80 ％, 82 ％, 85 ％, 87 ％, 90 ％, 92 ％, 95 ％, 또는 97 ％의 센서티비티를 가짐으로써 특징화될 수도 있다.
(예를 들어, subAR 또는 비-TX를 검출하기 위해, subAR vs TX를 구별하기 위해, 또는 TX와 비-TX 사이를 구별하기 위해) 본 명세서에 기술된 샘플을 식별, 분류, 또는 특징화하는데 사용하기 위한 방법들 및 시스템들은 90 ％ 이상의 음성 예측 값 (negative predictive value; NPV) 을 가짐으로써 특징화될 수도 있다. NPV는 적어도 약 60 ％, 65 ％, 70 ％, 75 ％, 80 ％, 85 ％, 90 ％, 91 ％, 92 ％, 93 ％, 94 ％, 95 ％, 95.2 ％, 95.5 ％, 95.7 ％, 96 ％, 96.2 ％, 96.5 ％, 96.7 ％, 97 ％, 97.2 ％, 97.5 ％, 97.7 ％, 98 ％, 98.2 ％, 98.5 ％, 98.7 ％, 99 ％, 99.2 ％, 99.5 ％, 99.7 ％, 또는 100 ％일 수도 있다. NPV는 적어도 약 95 ％일 수도 있다. NPV는 적어도 약 60 ％일 수도 있다. NPV는 적어도 약 70 ％일 수도 있다. NPV는 적어도 약 80 ％일 수도 있다.
샘플을 식별, 분류, 또는 특징화하는데 사용하기 위해 본 명세서에 개시된 방법들 및/또는 시스템들은 (예를 들어, subAR 또는 비-TX를 검출하기 위해, subAR vs TX를 구별하기 위해, 또는 TX와 비-TX 사이를 구별하기 위해) 적어도 약 30 ％의 PPV를 가짐으로써 특징화될 수도 있다. PPV는 적어도 약 32 ％, 35 ％, 40 ％, 45 ％, 50 ％, 55 ％, 60 ％, 65 ％, 70 ％, 75 ％, 80 ％, 85 ％, 90 ％, 95 ％, 95.2 ％, 95.5 ％, 95.7 ％, 96 ％, 96.2 ％, 96.5 ％, 96.7 ％, 97 ％, 97.2 ％, 97.5 ％, 97.7 ％, 98 ％, 98.2 ％, 98.5 ％, 98.7 ％, 99 ％, 99.2 ％, 99.5 ％, 99.7 ％, 또는 100 ％일 수도 있다. PPV는 95 ％ 이상일 수도 있다. PPV는 96 ％ 이상일 수도 있다. PPV는 97 ％ 이상일 수도 있다. PPV는 98 ％ 이상일 수도 있다.
분류자들
방법들은 샘플 데이터를 분석하기 위해, 특히 subAR 또는 비-TX 상태들을 검출하기 위해 트레이닝된 분류자 또는 알고리즘을 사용하는 것을 포함한다. 예를 들어, 샘플이: a) TX, b) 비-TX, 및/또는 c) subAR으로 분류, 또는 예측될 수 있다. 많은 통계적 분류 기법들이 당업자에게 공지된다. 지도 (supervised) 학습 접근방법들에서, 2 이상의 그룹들 (예를 들어, TX 및 subAR) 로부터 샘플들의 그룹이 통계적 분류 방법에 의해 분석된다. 차동 유전자 발현 데이터가 2 이상의 그룹들 사이를 구별하는 분류자를 구축하도록 사용될 수 있다는 것을 알수 있다. 이어서 분류자가 2 이상의 그룹들 중 하나와 신규 샘플을 연관시킬 수 있도록 신규 샘플이 분석될 수 있다. 일반적으로 사용된 지도 분류자들은 제한 없이, 신경망 (다층 퍼셉트론 (multi-layer perceptron)), SVMs (support vector machines), k-최근접 이웃들 (nearest neighbours), Gaussian 혼합물 모델, Gaussian, 연령브 베이시안 (naive Bayes), 결정 트리 및 RBF (radial basis function) 분류자들을 포함한다. 선형 분류 방법들은 Fisher's 선형 판별 (linear discriminant), LDA, 로지스틱 회귀, 연령브 베이시안 분류자, 퍼셉트론, 및 SVM들을 포함한다. 본 발명에 사용하기 위한 다른 분류자들은 이차 분류자들 (quadratic classifiers), k-최근접 이웃, 부스팅 (boosting), 결정 트리들, 랜덤 포레스들, 신경망들, 패턴 인식, Elastic Net, Golub Classifier, Parzen-윈도우, Iterative RELIEF, Classification Tree, Maximum Likelihood Classifier, Nearest Centroid, Prediction Analysis of Microarrays (PAM), Fuzzy C-Means Clustering, Bayesian 네트워크들 및 Hidden Markov 모델들을 포함한다. 당업자는 이들 중 임의의 개선들을 포함하여, 이들 또는 다른 분류자들, 뿐만 아니라 전술한 것들의 임의의 조합들이 본 발명의 범위 내로 고려된다는 것을 인식할 것이다.
지도 방법들을 사용한 분류는 일반적으로 이하의 방법론에 의해 수행된다:
지도 학습 (예를 들어, 손글씨를 인식하도록 학습) 의 미리 결정된 문제를 해결하기 위해, 다양한 단계들을 고려해야 한다:
1. 트레이닝 세트 수집. 이들은, 예를 들어, TX 환자들로부터의 샘플들, 비-TX 환자들로부터의 샘플들, 및/또는 subAR 환자들로부터의 샘플들을 포함할 수 있다. 트레이닝 샘플들은 분류자를 “트레이닝”하도록 사용된다.
2. 학습된 기능의 입력된 “특징” 표현을 결정. 학습된 기능의 정확도는 입력된 객체를 어떻게 표현할 지에 종속된다. 통상적으로, 입력된 객체는 객체의 기술인 다수의 특징들을 포함하는, 특징 벡터로 변환된다. 차원의 저주 (curse of dimensionality) 로 인해, 특징들의 수는 너무 크지 않아야 하지만, 출력을 정확하게 예측하도록 충분히 커야 한다.
3. 학습된 기능 및 대응하는 학습 알고리즘의 구조 결정. 학습 알고리즘, 예를 들어, 인공 신경망들, 결정 트리들, 베이시안 분류자들 (Bayes classifiers) 또는 SVMs이 선택된다. 학습 알고리즘은 분류자를 구축하도록 사용된다.
4. 분류자 (예를 들어, 분류 모델) 구축. 학습 알고리즘이 수집된 트레이닝 세트에 대해 실행된다. 학습 알고리즘의 파라미터들이 트레이닝 세트의 서브세트 (소위 검증 세트) 의 성능을 최적화함으로써, 또는 교차 검증을 통해 조정될 수도 있다. 파라미터 조정 및 학습 후, 알고리즘의 성능이 트레이닝 세트로부터 분리되는 연령브 (na
Figure pct00053
ve) 샘플들의 검사 세트에 대해 측정될 수 있다.
일단 분류자 (예를 들어, 분류 모델) 가 상기 기술된 바와 같이 결정되면, 예를 들어, 본 발명의 방법들에 의해 분석된 신장 이식 수여자의 샘플을 분류하도록 사용될 수 있다. 일부 예들에서, 유전자 발현 레벨들은 이식 수여자 (또는 건강한 또는 이식 우수 대조군) 로부터의 샘플에서 측정되고 분류자/분류 모델 또는 알고리즘 (예를 들어, 훈련된 알고리즘) 이 이식 상태의 위험 (예를 들어, subAR, 비-TX) 을 검출, 예측, 모니터링 또는 추정하기 위해, 발생하는 데이터에 적용된다.
다차원 분류자들 (예를 들어, 알고리즘들) 의 트레이닝은 다수의 샘플들을 사용하여 수행될 수도 있다. 예를 들어, 다차원 분류자의 트레이닝은 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 또는 그 이상의 샘플들을 사용하여 수행될 수도 있다. 일부 경우들에서, 다차원 분류자의 트레이닝이 적어도 약 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 350, 400, 450, 500 또는 그 이상의 샘플들을 사용하여 수행될 수도 있다. 일부 경우들에서, 다차원 분류자의 트레이닝이 적어도 약 525, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 2000 이상의 샘플들을 사용하여 수행될 수도 있다.
하나 이상의 분류자 세트들 (예를 들어, 분류 모델을 생성하기 위해 사용된 유전자들의 제한된 세트들) 을 생성하는 분류자 세트들 및 방법들이 본 명세서에 더 개시된다. 분류자 세트는 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6 및/또는 표 8로부터 하나 이상의 유전자들, 특정한 유전자들을 포함할 수도 있다. 일부 경우들에서, 분류자 세트는 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6 및/또는 표 8로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 또는 그 이상의 유전자들을 포함할 수도 있다. 하나 이상의 분류자들을 포함하는 분류 시스템의 사용이 본 명세서에 개시된다. 일부 예들에서, 분류자들은 2-웨이, 3-웨이, 4-웨이, 5-웨이, 6-웨이, 7-웨이, 8-웨이, 9-웨이, 또는 10-웨이 분류자들이다. 일부 바람직한 실시예들에서, 분류자는 2-웨이 분류자다. 일부 실시예들에서, 분류자는 3-웨이 분류자다.
2-웨이 분류자가 피험자로부터의 샘플을 두 클래스들 중 하나로 분류할 수도 있다. 일부 예들에서, 2-웨이 분류자가 장기 이식 수여자로부터 샘플을 subAR 및 정상 이식 기능 (TX) 을 포함하는 두 클래스들 중 하나로 분류할 수도 있다. 일부 예들에서, 2-웨이 분류자는 장기 이식 수여자로부터 샘플을 비-TX 및 TX (정상 이식 기능) 을 포함하는 두 클래스들 중 하나로 분류할 수도 있다.
3-웨이 분류자가 세 클래스들 중 하나로 피험자로부터 샘플을 분류할 수도 있다. 3-웨이 분류자는 장기 이식 수여자로부터 샘플을 AR, subAR, 및 TX를 포함하는 세 클래스들 중 하나로 분류할 수도 있다. 일부 경우들에서, 분류자는 2 또는 그 이상의 분류자들을 순차적으로 적용함으로써 작동할 수도 있다. 예를 들어, 제 1 분류자는 AR+subAR 및 TX를 분류할 수도 있고, 이는 (1) TX 또는 (2) AR 또는 subAR로 분류되는 샘플들의 세트를 발생시킨다. 일부 경우들에서, AR과 subAR 사이를 구별할 수 있는 제 2 분류자가 subAR 샘플들을 검출하기 위해 AR 또는 subAR을 갖는 것으로 분류된 샘플들에 적용된다.
분류자들 및/또는 분류자 프로브 세트들은 샘플을 건강한 것으로 고려 (rule-in) 또는 판독하도록 사용될 수도 있다. 예를 들어, 분류자는 건강한 피험자로부터 샘플인 것으로 샘플을 분류하도록 사용될 수도 있다. 대안적으로, 분류자는 건강하지 않은 피험자로부터 샘플인 것으로 샘플을 분류하도록 사용될 수도 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 분류자들은 샘플을 이식 거부로 고려 또는 판독하도록 사용될 수도 있다. 예를 들어, 분류자는 이식 거부를 앓는 피험자로부터 샘플인 것으로 샘플을 분류하도록 사용될 수도 있다. 또 다른 예에서, 분류자는 이식 거부를 앓지 않는 피험자로부터 샘플인 것으로 샘플을 분류하도록 사용될 수도 있다. 분류자들은 무증상 급성 거부로 샘플을 고려 또는 판독하도록 사용될 수도 있다. 분류자들은 비-TX로 샘플을 고려 또는 판독하도록 사용될 수도 있다.
비지도 (unsupervised) 학습 접근 방법들이 또한 본 발명과 함께 사용될 수 있다. 클러스터링이 비지도 학습 접근방법이고, 클러스터링 알고리즘은 라벨들을 사용하지 않고 일련의 샘플들을 상관시킨다. 가장 유사한 샘플들이 “클러스터들”로 소팅된다 (sort). 신규 샘플이 클러스터로 소팅될 수 있고 따라서 가장 가깝게 연관되는 다른 부재들로 분류된다.
컴퓨터 구현된 방법들
발현 레벨들은 디지털 컴퓨터에서 피험자의 상태 (예를 들어, subAR 또는 비-TX에 존재 또는 민감도 (susceptibility)) 와 연관되고 분석될 수 있다. 도 1에 도시된 바와 같이, 샘플 (110) 이 먼저 피험자로부터 (예를 들어, 이식 수여자로부터) 수집된다. 샘플은 분석되고 (120) 유전자 발현 생성물들이 생성된다. 컴퓨터 시스템 (130) 이 결과들에 기초하여 데이터를 분석하고 분류하기 (140) 위해 사용된다. 선택가능하게, 이러한 컴퓨터는 발현 레벨들과 관련된 실험적으로결정된 신호들을 수신하는 스캐너 등에 직접 링크된다. 대안적으로, 발현 레벨들은 다른 수단에 의해 입력될 수 있다. 컴퓨터는 상기 기술된 바와 같이, 로 (raw) 신호들을 (절대적 또는 상대적) 발현 레벨들로 변환하고, 하나 이상의 기준 발현 레벨들 또는 이러한 값들의 범위와 측정된 발현 레벨들을 비교하도록 프로그래밍될 수 있다. 컴퓨터는 하나 이상의 기준 발현 레벨들과의 비교에 기초하여 발현 레벨들에 값들 또는 지정들을 할당하고, 발현 프로파일의 복수의 유전자들에 대해 이러한 값들 또는 지정들을 집합하도록, 프로그래밍될 수 있다. 컴퓨터는 또한 subAR 또는 비-TX에 대한 존재 또는 민감도의 지표를 제공하는 값 또는 다른 지정뿐만 아니라 값 또는 지정을 결정하는데 사용된 임의의 로 데이터 또는 중간 데이터 을 출력하도록 프로그래밍될 수 있다.
통상적인 컴퓨터 (예를 들어, US 6,785,613 도 4 및 도 5 참조) 는 중앙 처리 장치 (central processor), 시스템 메모리, 입력/출력 제어기, 외부 디바이스 예컨대 병렬 포트를 통해 프린터, 디스플레이 어댑터를 통해 디스플레이 스크린, 직렬 포트, 키보드, 플로피 디스크를 수용하도록 동작가능한 고정 디스크 드라이브 및 플로피 디스크 드라이브와 같은 주요 서브시스템들을 상호연결하는 버스를 포함한다. 많은 다른 디바이스들이 예컨대 I/O 제어기를 통해 스캐너, 직렬 포트 또는 네트워크 인터페이스에 연결된 마우스에 연결될 수 있다. 컴퓨터는 컴퓨터로 하여금 다양한 기능들을 수행하게 하도록 코드를 홀딩하는 컴퓨터 판독가능 매체를 포함한다. 이들 기능들은 상기 기술된 바와 같이 자동화된 장치를 제어하고, 입력을 수신하고 출력을 전달하는 것을 포함한다. 자동화된 장치는 발현 레벨들을 결정하기 위해 시약들을 전달하기 위한 로봇 암, 뿐만 아니라 작은 용기들, 예를 들어, 발현 분석을 수행하기 위한 마이크로티터 웰들을 포함할 수 있다.
본 명세서에 제공된 방법들, 시스템들, 키트들 및 조성들이 또한 컴퓨터 네트워크를 통해 결과들을 생성하고 송신할 수 있다. 도 2에 도시된 바와 같이, 샘플 (220) 이 먼저 피험자 (예를 들어, 이식 수여자, (210)) 로부터 수집된다. 샘플은 분석되고 (230) 유전자 발현 생성물들이 생성된다. 컴퓨터 시스템 (240) 은 데이터를 분석하고 샘플의 분류를 하는데 사용된다. 결과는 컴퓨터 네트워크 (250) 를 통해 상이한 타입들의 최종 사용자들에 송신될 수 있다. 일부 예들에서, 피험자 (예를 들어, 환자) 는 인터넷 (260) 에 액세스할 수 있는 로컬 컴퓨터 상의 독립형 소프트웨어 및/또는 웹-기반 애플리케이션을 사용함으로써 결과에 액세스할 수도 있다. 일부 예들에서, 결과는 모바일 디지털 프로세싱 디바이스 (예를 들어, 모바일 폰, 태블릿, 등) 에 제공된 모바일 애플리케이션 (270) 을 통해 액세스될 수 있다. 일부 예들에서, 결과는 의료진에 의해 액세스될 수도 있고 그들의 환자들 (280) 의 상태들을 식별하고 추적하는 것을 보조할 수도 있다. 일부 예들에서, 결과는 교육 및 연구와 같은 다른 목적들 (290) 을 위해 사용될 수도 있다.
컴퓨터 프로그램
본 명세서에 개시된 방법들, 키트들, 및 시스템들은 적어도 일 컴퓨터 프로그램, 또는 이의 사용을 포함할 수도 있다. 컴퓨터 프로그램은 디지털 프로세싱 디바이스의 CPU에서 실행가능하고, 특정한 태스크를 수행하도록 작성된 인스트럭션들의 시퀀스를 포함할 수도 있다. 컴퓨터 판독가능 인스트럭션들은 특정한 태스크들을 수행하거나 특정한 추상 데이터 타입들을 구현하는, 프로그램 모듈들, 예컨대 기능들, 객체들, APIs (Application Programming Interfaces), 데이터 구조, 등으로 구현될 수도 있다. 본 명세서에 제공된 개시의 면에서, 당업자는 컴퓨터 프로그램이 다양한 언어들의 다양한 버전들로 작성될 수도 있다는 것을 인식할 것이다.
컴퓨터 판독가능 인스트럭션들의 기능성은 다양한 환경들에서 목표된 바와 같이 조합되거나 분산될 수도 있다. 컴퓨터 프로그램은 보통 일 위치 또는 복수의 위치들로부터 인스트럭션들의 시퀀스를 제공할 것이다. 다양한 실시예들에서, 컴퓨터 프로그램은 하나 이상의 웹 애플리케이션들, 하나 이상의 모바일 애플리케이션들, 하나 이상의 독립형 애플리케이션들, 하나 이상의 웹 브라우저 플러그-인들, 확장, 및 애드-인 (add-ins), 또는 애드-온 (add-ons), 또는 이들의 조합들을 부분적으로 또는 전체적으로 포함한다.
하나 이상의 샘플들 및 이들의 사용들을 분류하기 위한 시스템들이 본 명세서에 더 개시된다. 시스템은 (a) 실행가능한 인스트럭션들을 수행하도록 구성된 운영 체제 (operating system) 및 메모리 디바이스를 포함하는 디지털 프로세싱 디바이스; (b) (i) 피험자로부터의 샘플로부터 하나 이상의 유전자들 (예를 들어, 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6 및/또는 표 8로부터 임의의 유전자들) 의 유전자 발현 프로파일을 수신하도록 구성된 제 1 소프트웨어 모듈; (ii) 피험자로부터의 유전자 발현 프로파일을 분석하도록 구성된 제 2 소프트웨어 모듈; 및 (iii) 2 이상의 클래스들 (예를 들어, TX vs 비-TX, TX vs SubAR, TX vs SubAR vs AR) 을 포함하는 분류 시스템에 기초하여 피험자로부터의 샘플을 분류하도록 구성된 제 3 소프트웨어 모듈을 포함하는, 피험자로부터 샘플을 분류하기 위해 디지털 프로세싱 디바이스에 의해 실행가능한 인스트럭션들을 포함하는, 컴퓨터 프로그램을 포함할 수도 있다. 클래스들 중 적어도 하나가 TX, 비-TX, subAR, 및 AR로부터 선택될 수도 있다. 클래스들 중 적어도 2 개가 TX, 비-TX, subAR, 및 AR로부터 선택될 수도 있다. 클래스들 중 3 개가 TX, 비-TX, subAR, 및 AR로부터 선택될 수도 있다. 피험자로부터 유전자 발현 프로파일을 분석하는 것은 알고리즘을 적용하는 것을 포함할 수도 있다. 유전자 발현 프로파일을 분석하는 것은 피험자로부터 유전자 발현 프로파일로부터 정규화하는 것을 포함할 수도 있다. 일부 예들에서, 유전자 발현 프로파일을 정규화하는 단계는 분위 (quantile) 정규화를 포함하지 않는다.
도 4는 본 개시의 방법들을 구현하기 위해, 예컨대 선택기 세트를 생성하고 그리고/또는 데이터 분석을 위해 프로그램되거나 구성된 컴퓨터 시스템 (또한 본 명세서에서 “시스템”) (401) 을 도시한다. 시스템 (401) 은 병렬 프로세싱을 위해 싱글 코어 또는 멀티 코어 프로세서, 또는 복수의 프로세서들일 수 있는, 중앙 처리 장치 (CPU, 또한 본 명세서에서 “프로세서” 및 “컴퓨터 프로세서”) (405) 를 포함한다. 시스템 (401) 은 또한 메모리 (410) (예를 들어, RAM (random-access memory), ROM (read-only memory), 플래시 메모리), 전자 저장 유닛 (415) (예를 들어, 하드 디스크), 하나 이상의 다른 시스템들과 통신하기 위한 통신 인터페이스 (420) (예를 들어, 네트워크 어댑터), 및 주변 디바이스들 (425), 예컨대 캐시, 다른 메모리, 데이터 저장 장치 및/또는 전자 디스플레이 어댑터들을 포함한다. 메모리 (410), 저장 유닛 (415) 인터페이스 (420) 및 주변 디바이스들 (425) 은 통신 버스 (실선) 를 통해 마더보드와 같은, CPU (405) 와 통신한다. 저장 유닛 (415) 은 데이터를 저장하기 위한 데이터 저장 유닛 (또는 데이터 저장부) 일 수 있다. 시스템 (401) 은 통신 인터페이스 (420) 의 도움으로 컴퓨터 네트워크 (“네트워크”) (430) 에 동작가능하게 커플링된다. 네트워크 (430) 는 Internet, 인터넷 및/또는 엑스트라넷 (extranet), 또는 Internet와 통신하는 인트라넷 및/또는 엑스트라넷일 수 있다. 네트워크 (430) 는 일부 예들에서 전기통신 및/또는 데이터 네트워크이다. 네트워크 (430) 는 클라우드 컴퓨팅과 같은 분산 컴퓨팅을 인에이블할 수 있는, 하나 이상의 컴퓨터 서버들을 포함할 수 있다. 네트워크 (430) 는 일부 예들에서, 시스템 (401) 의 도움으로, 시스템 (401) 에 커플링된 디바이스들로 하여금 클라이언트 또는 서버로서 거동하게 할 수도 있는, 피어-투-피어 네트워크를 구현할 수 있다.
시스템 (401) 은 프로세싱 시스템 (435) 와 통신한다. 프로세싱 시스템 (435) 은 본 명세서에 개시된 방법들을 구현하도록 구성될 수 있다. 일부 예들에서, 프로세싱 시스템 (435) 은 마이크로어레이 스캐너이다. 일부 예들에서, 프로세싱 시스템 (435) 은 실시간 PCR 머신이다. 일부 예들에서, 프로세싱 시스템 (435) 은 예를 들어, 차세대 서열분석 시스템 (예를 들어, Illumina sequencer, Ion Torrent sequencer, Pacific Biosciences sequencer) 과 같은 핵산 서열분석 시스템이다. 프로세싱 시스템 (435) 은 네트워크 (430) 를 통해 또는 직접 (예를 들어, 유선, 무선) 연결에 의해 시스템 (401) 과 통신할 수 있다. 프로세싱 시스템 (435) 은 핵산 서열 분석과 같은 분석을 위해 구성될 수 있다.
본 명세서에 기술된 바와 같은 방법들은 예를 들어, 메모리 (410) 또는 전자 저장 유닛 (415) 상과 같이, 시스템 (401) 의 전자 저장 위치에 저장된 코드 (또는 소프트웨어) 실행가능한 머신 (또는 컴퓨터 프로세서) 에 의해 구현될 수 있다. 사용 동안, 코드는 프로세서 (405) 에 의해 실행될 수 있다. 일부 예들에서, 코드는 저장 유닛 (415 ) 으로부터 검색될 수 있고 프로세서 (405) 에 의한 빠른 액세스를 위해 메모리 (410) 에 저장될 수 있다. 일부 상황들에서, 전자 저장 유닛 (415) 은 배제될 수 있고, 머신-실행가능한 인스트럭션들 메모리 (410) 에 저장된다.
디지털 프로세싱 디바이스
본 명세서에 개시된 방법들, 키트들, 및 시스템들은 디지털 프로세싱 디바이스, 또는 이의 사용을 ?l마할 수도 있다. 다른 실시예들에서, 디지털 프로세싱 디바이스는 디바이스의 기능들을 수행하는 하나 이상의 하드웨어 CPU (central processing units) 를 포함한다. 또 다른 실시예들에서, 디지털 프로세싱 디바이스는 실행가능한 인스트럭션들을 수행하도록 구성된 운영 체제를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 디지털 프로세싱 디바이스는 선택가능하게 컴퓨터 네트워크에 연결된다. 다른 실시예들에서, 디지털 프로세싱 디바이스는 선택가능하게 World Wide Web에 액세스하도록 Internet 에 연결된다. 또 다른 실시예들에서, 디지털 프로세싱 디바이스는 선택가능하게 클라우드 컴퓨팅 인프라스트럭처에 연결된다. 다른 실시예들에서, 디지털 프로세싱 디바이스는 선택가능하게 인트라넷에 연결된다. 다른 실시예들에서, 디지털 프로세싱 디바이스는 선택가능하게 데이터 저장 디바이스에 연결된다.
본 명세서의 기술에 따라, 적합한 디지털 프로세싱 디바이스들은 비제한적인 예들로서, 서버 컴퓨터들, 데스크탑 컴퓨터들, 랩탑 컴퓨터들, 노트북 컴퓨터들, 서브-노트북 컴퓨터들, 넷북 컴퓨터들, 넷패드 컴퓨터들, 셋-탑 컴퓨터들, 휴대용 컴퓨터들, Internet 기기들, 모바일 스마트폰들, 태블릿 컴퓨터들, PDA (personal digital assistants), 비디오 게임 콘솔들, 및 전달 매체 (vehicles) 를 포함한다. 당업자는 많은 스마트폰들이 본 명세서에 기술된 시스템에서 사용하기 적합하다는 것을 인식할 것이다. 당업자는 또한 텔레비전들, 비디오 플레이어들, 및 선태가능한 컴퓨터 네트워크 연결을 갖는 디지털 뮤직 플레이어들이 본 명세서에 기술된 시스템에 사용하기 적합하다는 것을 인식할 것이다. 적합한 태블릿 컴퓨터들은 당업자에게 공지된 부클릿 (booklet), 슬레이트 (slate), 및 전환가능 구성들을 갖는 태블릿 컴퓨터들을 포함한다.
디지털 프로세싱 디바이스는 보통 실행가능한 인스트럭션들을 수행하도록 구성된 운영 체제를 포함할 것이다. 운영 체제는, 예를 들어, 디바이스의 하드웨어를 관리하고 애플리케이션들의 실행을 위한 서비스들을 제공하는, 프로그램들 및 데이터를 포함하는 소프트웨어이다. 당업자는 적합한 서버 운영 체제들은 비제한적인 예들로서, FreeBSD, OpenBSD, NetBSD®, Linux, Apple® Mac OS X Server®, Oracle® Solaris®, Windows Server ®, 및 Novell® NetWare®를 포함한다는 것을 인식할 것이다. 적합한 PC 운영 체제들은, 비제한적인 예들로서, Microsoft® Windows ®, Apple® Mac OS X®, UNIX®, 및 GNU/Linux®와 같은 UNIX-유사 운영 체제들을 포함한다. 일부 실시예들에서, 운영 체제는 클라우드 컴퓨팅에 의해 제공된다. 당업자는 또한 적합한 모바일 스마트 폰 운영 체제들이, 비제한적인 예들로서, Nokia® Symbian® OS, Apple® iOS®, Research In Motion® BlackBerry OS®, Google® Android®, Microsoft® Windows Phone® OS, Microsoft® Windows Mobile® OS, Linux®, and Palm® WebOS®을 포함한다는 것을 인식할 것이다.
디바이스는 일반적으로 저장장치 및/또는 메모리 디바이스를 포함한다. 저장장치 및/또는 메모리 디바이스는 일시적 또는 영구적 기초로 데이터 또는 프로그램들을 저장하도록 사용된 하나 이상의 물리적 장치들이다. 일부 실시예들에서, 디바이스는 휘발성 메모리이고 저장된 정보를 유지하기 위해 전력을 필요로 한다. 일부 실시예들에서, 디바이스는 비-휘발성 메모리이고 디지털 프로세싱 디바이스가 전력공급되지 않을 때 저장된 정보를 지속한다. 다른 실시예들에서, 비-휘발성 메모리는 플래시 메모리를 포함한다. 일부 실시예들에서, 비-휘발성 메모리는 DRAM (dynamic random-access memory) 을 포함한다. 일부 실시예들에서, 비-휘발성 메모리는 FRAM (ferroelectric random access memory) 을 포함한다. 일부 실시예들에서, 비-휘발성 메모리는 PRAM (phase-change random access memory) 을 포함한다. 다른 실시예들에서, 디바이스는 비제한적인 예들로서, CD-ROMs, DVDs, 플래시 메모리 디바이스들, 자기 디스크 드라이브들, 자기 테이프 드라이브들, 광학 디스크 드라이브들, 및 클라우드 컴퓨팅 기반 저장장치를 포함하는, 저장 디바이스이다. 다른 실시예들에서, 저장장치 및/또는 메모리 디바이스는 본 명세서에 개시된 바와 같은 디바이스들의 조합이다.
사용자에게 시각적 정보를 전송하기 위한 디스플레이는 보통 초기화될 것이다. 디스플레이들의 예들은 CRT (cathode ray tube), LCD (liquid crystal display), 및 TFT-LCD (thin film transistor liquid crystal display), OLED (organic light emitting diod) 디스플레이를 포함한다. 다양한 다른 실시예들에서, OLED 디스플레이는 PMOLED (passive-matrix OLED) 또는 AMOLED (active-matrix OLED) 디스플레이이다. 일부 실시예들에서, 디스플레이는 플라즈마 디스플레이, 비디오 프로젝터 또는 본 명세서에 개시된 바와 같은 디바이스들의 조합일 수도 있다.
디지털 프로세싱 디바이스는 사용자로부터 정보를 수신하기 위한 입력 디바이스를 포함할 수도 있다. 입력 디바이스는 예를 들어, 키보드, 비제한적인 예들로서, 마우스, 트랙볼, 트랙 패드, 조이스틱, 게임 컨트롤러, 또는 스타일러스를 포함하는 포인팅 디바이스; 터치 스크린, 또는 멀티 터치 스크린, 음성 또는 다른 사운드 입력을 캡처하기 위한 마이크로폰, 모션 또는 시각적 입력을 캡처하기 위한 비디오 카메라, 또는 본 명세서에 개시된 바와 같은 디바이스들의 조합일 수도 있다.
비일시적인 컴퓨터 판독가능 저장 매체
본 명세서에 개시된 방법들, 키트들, 및 시스템들은 본 명세서에 기술된 검사를 수행하고 분석하도록 운영 체제에 의해 실행가능한 인스트럭션들을 포함하는 프로그램으로 인코딩되고; 바람직하게 네트워크된 디지털 프로세싱 디바이스에 연결된, 하나 이상의 비일시적인 컴퓨터 판독가능 저장 매체를 포함할 수도 있다. 컴퓨터 판독가능 저장 매체는 디지털 프로세싱 디바이스로부터 선택가능하게 이동가능한 디지털 유형의 컴포넌트이다. 컴퓨터 판독가능 저장 매체는 비제한적인 예들로서, CD-ROMs, DVDs, 플래시 메모리 디바이스들, 고체 상태 메모리, 자기 디스크 드라이브들, 자기 테이프 드라이브들, 광학 디스크 드라이브들, 클라우드 컴퓨팅 시스템들 및 서비스들, 등을 포함한다. 일부 예들에서, 프로그램 및 인스트럭션들은 매체 상에 영구적으로, 실질적으로 영구적으로, 반영구적으로, 또는 비일시적으로 인코딩된다.
비일시적 컴퓨터 판독가능 저장 매체가 분류 시스템을 생성 또는 사용하도록 프로세서에 의해 실행가능한 인스트럭션들을 포함하는 컴퓨터 프로그램으로 인코딩될 수도 있다. 저장 매체는 (a) 컴퓨터 메모리 내, (i) 2 이상의 대조군 샘플들은 2 이상의 피험자들로부터 대조군 샘플들일 수도 있고; 그리고 (ii) 2 이상의 대조군 샘플들은 2 이상의 클래스들을 포함하는 분류 시스템에 기초하여 상이하게 분류될 수도 있는, 2 이상의 대조군 샘플들의 하나 이상의 임상 특징들의 데이터베이스; (b) 2 이상의 대조군 샘플들의 하나 이상의 임상 특징들을 비교하도록 구성된 제 1 소프트웨어 모듈; 및 (c) 하나 이상의 임상 특징들의 비교에 기초하여 분류자 세트를 생성하도록 구성된 제 2 소프트웨어 모듈을 포함할 수도 있다.
클래스들 중 적어도 2 개는 TX, 비-TX, SubAR, 및 AR로부터 선택될 수도 있다. 클래스들 중 3 개는 TX, 비-TX, SubAR, 및 AR로부터 선택될 수도 있다. 저장 매체는 피험자로부터 샘플을 분류하도록 구성된 하나 이상의 부가적인 소프트웨어 모듈들을 더 포함할 수도 있다. 피험자로부터 샘플을 분류하는 것은 2 이상의 클래스들을 포함하는 분류 시스템을 포함할 수도 있다.
웹 애플리케이션
일부 실시예들에서, 컴퓨터 프로그램이 웹 애플리케이션을 포함한다. 본 명세서에 제공된 개시의 면에서, 당업자는 다양한 실시예들에서, 웹 애플리케이션이 하나 이상의 소프트웨어 프레임워크들 및 하나 이상의 데이터베이스 시스템들을 활용한다는 것을 인식할 것이다. 일부 실시예들에서, 웹 애플리케이션이 Microsoft® .NET 또는 Ruby on Rails (RoR) 과 같은 소프트웨어 프레임 워크 상에서 생성된다. 일부 실시예들에서, 웹 애플리케이션은, 비제한적인 예들로서, 관계형, 비-관계형, 객체 지향, 연상형, 그리고 XML 데이터베이스 시스템들을 포함하는 하나 이상의 데이터베이스 시스템들을 활용한다. 다른 실시예들에서, 적합한 관계형 데이터베이스 시스템들은, 비제한적인 예들로서, Microsoft® SQL Server, mySQL™ 및 Oracle®을 포함한다. 당업자는 또한 다양한 실시예들에서, 웹 애플리케이션이 하나 이상의 언어들의 하나 이상의 버전들로 작성된다는 것을 인식할 것이다. 웹 애플리케이션이 하나 이상의 마크업 언어들, 프리젠테이션 정의 언어들, 클라이언트-측 스크립트 언어들, 서버-측 코딩 언어들, 데이터베이스 쿼리 언어들, 또는 이들의 조합들로 작성될 수도 있다. 일부 실시예들에서, 웹 애플리케이션이 HTML (Hypertext Markup Language), XHTML (Extensible Hypertext Markup Language), 또는 XML (eXtensible Markup Language) 과 같은 마크업 언어로 어느 정도 작성된다. 일부 실시예들에서, 웹 애플리케이션은 CSS (Cascading Style Sheets) 와 같은 프리젠테이션 정의 언어로 어느 정도 작성된다. 일부 실시예들에서, 웹 애플리케이션은 AJAX (Asynchronous Javascript and XML), Flash® Actionscript, Javascript, 또는 Silverlight®와 같은 클라이언트-측 스크립트 언어로 어느 정도 작성된다. 일부 실시예들에서, 웹 애플리케이션은 ASP (Active Server Pages), ColdFusion®, Perl, Java™, JSP (JavaServer Pages), PHP (Hypertext Preprocessor), Python™, Ruby, Tcl, Smalltalk, WebDNA®, 또는 Groovy와 같은 서버-측 코딩 언러로 어느 정도 작성된다. 일부 실시예들에서, 웹 애플리케이션은 SQL (Structured Query Language) 과 같은 데이터베이스 쿼리 언어로 어느 정도 작성된다. 일부 실시예들에서, 웹 애플리케이션은 IBM® Lotus Domino®와 같은 기업 서버 제품들과 통합한다. 일부 실시예들에서, 웹 애플리케이션은 미디어 플레이어 엘리먼트를 포함한다. 다양한 다른 실시예들에서, 미디어 플레이어 엘리먼트는 비제한적인 예들로서, Adobe® Flash®, HTML 5, Apple® QuickTime®, Microsoft® Silverlight®, Java™및 Unity®를 포함하는 하나 이상의 많은 적합한 멀티미디어 기술들을 활용한다.
모바일 애플리케이션
일부 실시예들에서, 컴퓨터 프로그램은 모바일 디지털 프로세싱 디바이스에 제공된 모바일 애플리케이션을 포함한다. 일부 실시예들에서, 모바일 애플리케이션은 생산될 때 모바일 디지털 프로세싱 디바이스에 제공된다. 다른 실시예들에서, 모바일 애플리케이션은 본 명세서에 기술된 컴퓨터 네트워크를 통해 모바일 디지털 프로세싱 디바이스에 제공된다.
본 명세서에 제공된 개시의 관점에서, 모바일 애플리케이션은 당업자에게 공지된 기법들에 의해 당업계에 공지된 하드웨어, 언어들, 및 개발 환경들을 사용하여 생성된다. 당업자는 모바일 애플리케이션들이 몇몇 언어들로 작성된다는 것을 인식할 것이다. 적합한 프로그래밍 언어들은, 비제한적인 예들로서, C, C++, C#, Objective-C, Java™, Javascript, Pascal, Object Pascal, Python™, Ruby, VB.NET, WML, 및 CSS를 갖는 XHTML/HTML 또는 CSS를 갖지 않는 XHTML/HTML, 또는 이들의 조합들을 포함한다.
적합한 모바일 애플리케이션 개발 환경들은 몇몇 소스들로부터 이용가능하다. 상업적으로 입수가능한 개발 환경들은, 비제한적인 예들로서, AirplaySDK, alcheMo, Appcelerator®, Celsius, Bedrock, Flash Lite, .NET Compact Framework, Rhomobile, 및 WorkLight Mobile Platform을 포함한다. 다른 개발 환경들은, 비제한적인 예들로서, Lazarus, MobiFlex, MoSync, 및 Phonegap을 포함하여 무상으로 입수가능하다. 또한, 모바일 디바이스 제조사들은, 비제한적인 예들로서, iPhone 및 iPad (iOS) SDK, Android™ SDK, BlackBerry® SDK, BREW SDK, Palm® OS SDK, Symbian SDK, webOS SDK, 및 Windows ® Mobile SDK를 포함하는 소프트웨어 개발자 키트들을 배포한다.
몇몇 상업적 포럼들이, 비제한적인 예들로서, Apple® App Store, Android™Market, BlackBerry® App World, App Store for Palm devices, App Catalog for webOS, Windows® Marketplace for Mobile, Ovi Store for Nokia® devices, Samsung® Apps, 및 Nintendo® DSi Shop을 포함하는, 모바일 애플리케이션들의 배포를 위해 이용가능하다.
독립형 애플리케이션
일부 실시예들에서, 컴퓨터 프로그램이, 기존 프로세스에 애드-온 (add-on) 이 아닌, 예를 들어, 플러그-인 (plug-in) 은 아닌, 독립 컴퓨터 프로세스들로서 실행되는 프로그램인, 독립형 애플리케이션을 포함한다. 당업자는 독립형 애플리케이션들이 종종 컴파일링된다는 것을 인식할 것이다. 컴파일러는 프로그래밍 언어로 작성된 소스 코드를 이진 객체 코드, 예컨대 어셈블리어 또는 머신 코드로 변환하는 컴퓨터 프로그램(들)이다. 적합한 컴파일된 프로그래밍 언어들은, 비제한적인 예들로서, C, C++, Objective-C, COBOL, Delphi, Eiffel, Java™, Lisp, Python™, Visual Basic, 및 VB .NET, 또는 이들의 조합들을 포함한다. 컴파일링은 실행가능한 프로그램을 생성하도록 종종 적어도 부분적으로 수행된다. 일부 실시예들에서, 컴퓨터 프로그램이 하나 이상의 실행가능한 컴파일링된 애플리케이션들을 포함한다.
웹 브라우저 플러그-인
일부 실시예들에서, 컴퓨터 프로그램은 웹 브라우저 플러그-인을 포함한다. 컴퓨팅시, 플러그-인은 보다 큰 소프트웨어 애플리케이션에 기능성을 부가하는 하나 이상의 소프트웨어 컴포넌트들이다. 소프트웨어 애플리케이션들은 제 3 자 개발자들로 하여금 신규 피처들을 부가하는 것을 용이하게 지지하도록, 그리고 애플리케이션의 사이즈를 감소시키도록, 애플리케이션을 확장하는 능력들을 생성하게 하도록 플러그-인들을 지원한다. 지원될 때, 플러그-인들은 소프트웨어 애플리케이션의 기능성의 커스터마이징을 인에이블한다. 예를 들어, 플러그-인들은 비디오를 재생하고, 상호작용을 생성하고, 바이러스들을 스캔하고, 그리고 특정한 파일 타입들을 디스플레이하기위해 웹 브라우저들에서 일반적으로 사용된다. 당업자는 Adobe® Flash® Player, Microsoft® Silverlight®, 및 Apple® QuickTime®을 포함하는, 몇몇 웹 브라우저 플러그-인에 친숙할 것이다. 일부 실시예들에서, 툴바는 하나 이상의 웹 브라우저 확장, 애드-인, 또는 애드-온을 포함한다. 일부 실시예들에서, 툴바는 하나 이상의 탐색 바들, 툴 밴드들, 또는 데스크 밴드들 (desk bands) 을 포함한다.
본 명세서에 제공된 개시의 관점에서, 당업자는, 비제한적인 예들로서, C++, Delphi, Java™, PHP, Python™, 및 VB .NET, 또는 이들의 조합들을 포함하는, 다양한 프로그래밍 언어들로 플러그-인들의 개발을 인에이블하는 몇몇 플러그-인 프레임워크들이 입수가능하다는 것을 인식할 것이다.
웹 브라우저들 (또한 소위 Internet 브라우저들) 은 World Wide Web 상에서 정보 리소스들을 검색하고, 프리젠팅하고 가로지르기 위한 네트워크-연결된 디지털 프로세싱 디바이스들과 함께 사용하기 위해 설계된 소프트웨어 애플리케이션들이다. 적합한 웹 브라우저들은, 비제한적인 예들로서, Microsoft® Internet Explorer®, Mozilla® Firefox®, Google® Chrome, Apple® Safari®, Opera Software® Opera®, 및 KDE Konqueror를 포함한다. 일부 실시예들에서, 웹 브라우저는 모바일 웹 브라우저이다. 모바일 웹 브라우저들 (또한 소위 마이크로브라우저들, 미니-브라우저들, 및 무선 브라우저들) 이, 비제한적인 예들로서, 휴대용 컴퓨터들, 태블릿 컴퓨터들, 넷북 컴퓨터들, 서브노트북 컴퓨터들, 스마트폰들, 뮤직 플레이어들, PDAs (personal digital assistants), 및 휴대용 비디오 게임 시스템들을 포함하는, 모바일 디지털 프로세싱 디바이스들에서 사용하기 위해 설계된다. 적합한 모바일 웹 브라우저들은, 비제한적인 예들로서, Google® Android® 브라우저, RIM BlackBerry® Browser, Apple® Safari®, Palm® Blazer, Palm® WebOS® Browser, 모바일용 Mozilla® Firefox®, Microsoft® Internet Explorer® Mobile, Amazon® Kindle® Basic Web, Nokia® Browser, Opera Software® Opera® Mobile, 및 Sony® PSP™ 브라우저를 포함한다.
소프트웨어 모듈들
본 명세서에 개시된 방법들, 키트들, 및 시스템들은 소프트웨어, 서버, 및/또는 데이터베이스 모듈들 또는 이의 사용을 포함할 수도 있다. 본 명세서에 제공된 개시의 관점에서, 소프트웨어 모듈들은 당업자에게 공지된 머신들, 소프트웨어, 및 언어들을 사용하여 당업자에게 공지된 기법들에 의해 생성된다. 본 명세서에 개시된 소프트웨어 모듈들은 다수의 방식들로 구현된다. 다양한 실시예들에서, 소프트웨어 모듈은 파일, 코드의 섹션, 프로그래밍 객체, 프로그래밍 구조, 또는 이들의 조합들을 포함한다. 다른 다양한 실시예들에서, 소프트웨어 모듈은 복수의 파일들, 복수의 코드들의 섹션들, 복수의 프로그래밍 객체들, 복수의 프로그래밍 구조들, 또는 이들의 조합들을 포함한다. 다양한 실시예들에서, 하나 이상의 소프트웨어 모듈은, 비제한적인 예들로서, 웹 애플리케이션, 모바일 애플리케이션, 및 독립형 애플리케이션을 포함한다. 일부 실시예들에서, 소프트웨어 모듈들은 일 컴퓨터 프로그램 또는 애플리케이션으로 있다. 다른 실시예들에서, 소프트웨어 모듈들은 2 이상의 컴퓨터 프로그램 또는 애플리케이션으로 있다. 일부 실시예들에서, 소프트웨어 모듈들은 일 머신에 호스팅된다 (host). 다른 실시예들에서, 소프트웨어 모듈들은 2 이상의 머신에 호스팅된다. 다른 실시예들에서, 소프트웨어 모듈들은 클라우드 컴퓨팅 플랫폼들에 호스팅된다. 일부 실시예들에서, 소프트웨어 모듈들은 일 위치의 하나 이상의 머신들에 호스팅된다. 다른 실시예들에서, 소프트웨어 모듈들은 2 이상의 위치의 하나 이상의 머신들에 호스팅된다.
데이터베이스들
본 명세서에 개시된 방법들, 키트들 및 시스템들은 하나 이상의 데이터베이스들, 또는 이들의 사용을 포함할 수도 있다. 본 명세서에 제공된 개시의 관점에서, 당업자는 많은 데이터베이스들이 유전자 발현 프로파일들, 서열 데이터, 분류자들, 분류 시스템들, 치료 요법들, 또는 이들의 조합에 관련한 정보를 저장하고 검색하기 적합하다는 것을 인식할 것이다. 다양한 실시예들에서, 적합한 데이터베이스들은 비제한적인 예들로서, 관계형 데이터베이스들, 비-관계형 데이터베이스들, 객체 지향 데이터베이스들, 객체 데이터베이스들, 엔티티-관계 모델 데이터베이스들, 연광성 데이터베이스들, 및 XML 데이터베이스들을 포함한다. 일부 실시예들에서, 데이터베이스는 인터넷 기반이다. 다른 실시예들에서, 데이터베이스는 웹 기반이다. 또 다른 실시예들에서, 데이터베이스는 클라우드 컴퓨팅 기반이다. 다른 실시예들에서, 데이터베이스는 하나 이상의 로컬 컴퓨터 저장 디바이스들에 기반한다.
데이터 송신
본 명세서에 개시된 방법들, 키트들 및 시스템들은 하나 이상의 리포트들을 송신하도록 사용될 수도 있다. 하나 이상의 리포트들은 하나 이상의 피험자들로부터 하나 이상의 샘플들의 분류 및/또는 식별에 관한 정보를 포함할 수도 있다. 하나 이상의 리포트들은 피험자의 이식 상태 또는 결과에 관련한 정보를 포함할 수도 있다. 하나 이상의 리포트들은 치료가 필요한, 피험자의 이식 거부를 치료하는데 사용하기 위한 치료 요법들에 관련한 정보를 포함할 수도 있다. 하나 이상의 리포트들은 치료가 필요한, 피험자의 이식 기능 장애를 치료하는데 사용하기 위한 치료 요법들에 관련한 정보를 포함할 수도 있다. 하나 이상의 리포트들은 치료가 필요한, 피험자의 면역 반응을 억제 하는데 사용하기 위한 치료 요법들에 관련한 정보를 포함할 수도 있다.
하나 이상의 리포트들은 피험자 또는 피험자의 의료진에게 송신될 수도 있다. 피험자의 의료진은 의사, PA (physician's assistant), 간호사, 또는 다른 의료 직원일 수도 있다. 피험자의 의료진은 피험자의 가족 구성원일 수도 있다. 피험자의 가족 구성원은 부모, 후견인, 자녀, 형제자매, 이모, 삼촌, 사촌, 또는 배우자일 수도 있다. 피험자의 의료진은 피험자의 법률 대리인일 수도 있다.
Ⅷ. 치료법 결정 지침
일부 예들에서, 본 명세서에 기술된 방법들, 조성들, 시스템들 및 키트들은 치료법 결정을 하는데 유용할 수 있는 정보를 개업의 (medical practitioner) 에게 제공한다. 치료법 결정들은: 특정한 테라피를 계속하도록 결정, 특정한 테라피를 수정하도록 결정, 특정한 테라피의 도즈량 (dosage) 을 변경하도록 결정, 특정한 테라피를 중지하거나 중단하도록 결정, 테라피의 빈도를 변경하도록 결정, 신규 테라피를 도입하도록 결정, 현재 테라피와 조합하여 사용될 신규 테라피를 도입하도록 결정, 또는 임의의 상기 조합을 포함할 수도 있다. 일부 예들에서, 이식 수여자의 상태를 진단, 예측 또는 모니터링한 결과들이 이식의 제거와 같은 테라피 결정에 정보를 제공하는데 유용할 수도 있다. 일부 예들에서, 이식의 제거는 즉시 제거일 수 있다. 다른 예들에서, 치료법 결정은 재이식일 수도 있다. 치료 요법의 다른 예들은 이식 수여자가 면역 억제 또는 항체 테라피에 내성이 있는 예들에서 수혈을 포함할 수 있다.
환자가 AR, subAR, 또는 비-TX를 갖거나 이의 향상된 위험성이 있다는 것을 나타내면, 의료진은 환자로 하여금 신장 생검을 수행하는 것 또는 증가된 빈도로 크레아티닌, BUN, 또는 사구체여과율과 같은 다른 분석들을 수행하는 것을 포함하는 부가적인 검사를 겪을 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 의료진은 환자에게 시행될 치료 방식을 변화시킬 수 있다. 치료 방식의 변화는 환자에게 부가적이거나 상이한 약물을 투여하는 것, 또는 환자에게 이미 투여된 약물의 보다 높은 도즈량 또는 빈도로 투여하는 것을 포함할 수 있다.
많은 상이한 약물들이 이식 거부 칼시네우린 억제제들 (예를 들어, 시클로스포린 (cyclosporine), 타크로리무스 (tacrolimus)), mTOR 억제제들 (예를 들어, 시롤리무스 (sirolimus) 및 에베로리무스 (everolimus)), 항증식들 (예를 들어, 아자티오프린, 마이코페놀산, 마이코페놀레이트 모페틸 또는 MMF), 코르티코스테로이드류 (corticosteroids)(예를 들어, 프레드니솔론 및 히드로코르티손),항체들 (예를 들어, 바실릭시맙, 다클리주맙, 올소클론, 알렘투주맙, 항흉선세포 글로불린 및 항-림프구 글로불린), 및 생물학적 제제 (biologics) (예를 들어, 벨라타셉트) 을 치료하기 위해 사용된 면역억제제 약물들과 같은 치료 거부에 이용가능하다.
대안적으로, 환자가 AR, subAR, 또는 비-TX를 갖거나 이의 향상된 위험성이 있다는 것을 나타내지 않으면, 환자의 요법은 AR, subAR, 또는 이식 기능 장애 상태들의 불필요한 치료를 방지하는 방식으로 관리될 수도 있다. 예를 들어, subAR 또는 AR이 검출되지 않을 때, 적합한 관리는 예를 들어, 1 주, 2 주, 3 주, 4 주, 2 개월, 3 개월, 4 개월, 5 개월, 또는 6 개월과 같은, 시간의 특정한 기간 동안 생검 절차들 또는 면역억제제 요법 조정들로부터 삼가는 것을 포함할 수도 있다. 일부 경우들에서, subAR이 검출되지 않고 환자가 특정한 시간 기간 (예를 들어, 1 주, 2 주, 3 주, 4 주, 2 개월, 3 개월, 4 개월, 5 개월, 또는 6 개월) 내에 자신의 요법의 특정한 면역억제제의 도즈의 증가를 이전에 받았다거나 특정한 시간 기간 (예를 들어, 1 주, 2 주, 3 주, 4 주, 2 개월, 3 개월, 4 개월, 5 개월, 또는 6 개월) 내 신규 면역억제제의 투여를 받았다면, 도즈 또는 면역억제제 투여의 현재 상승이 유지될 수도 있다 (예를 들어, 1 주, 2 주, 3 주, 4 주, 2 개월, 3 개월, 4 개월, 5 개월, 6 개월, 1 년, 1.5 년, 2 년, 3 년, 4 년, 5 년, 또는 무기한).
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 “안정한 (stable)”은 피험자의 신장 기능을 참조하도록 사용될 때 각각 132 및 75 내지 187 일의 평균 기간 및 범위에 걸쳐 2.3 ㎎/dl 미만의 혈청 크레아티닌 레벨 및 2 내지 3의 이전 값들의 최소 값에 비교된 크레아티닌의 20 ％ 미만의 상승을 참조한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 “정상 (normal)”은 피험자의 신장 동종이식편 상태를 참조하도록 사용될 때 감시 생검 (예를 들어, 무 거부 증거 - Banff i=0이고 t=0, g=0, ptc=0; ci=0 또는 1 그리고 ct=0 또는 1) 및 안정한 신장 기능에 대한 정상 조직학을 참조한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 “정상”은 피험자의 크레아티닌 레벨들을 참조하도록 사용될 때 2.3 ㎎/dl 미만의 혈청 크레아티닌 레벨을 참조한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어들 “면역억제제 약물 요법” 또는 “면역억제제 치료 요법”은, 동종이식편 거부를 치료 또는 예방하기 위해 환자에게 상시 (ongoing basis) 시행되는 면역억제제 활성을 갖는 적어도 일 약물의 세트를 지칭한다. 면역억제제 약물 요법들은 이로 제한되는 것은 아니지만, “유도 (induction)” 요법 (이식 직전 및 선택가능하게 이식 직후 환자에게 시행되는, 예를 들어, Kasiske et al. Am J Transplant. 2009 Nov; 9 Suppl 3:S1-155 참조), 초기 유지 요법, 장기 유지 요법, 브레이크아웃 요법 (breakout regimen), 또는 이들의 조합을 포함할 수도 있다.
신장 이식 수여자들의 면역억제 테라피에 대해, 2009 KDIGO (Kidney Disease: Improving Global Outcomes) 가이드라인들 (예를 들어, 본 명세서에 참조로서 인용된 Kasiske et al. Am J Transplant. 2009 Nov; 9 Suppl 3:S1-155 참조) 이 신장 이식 수여자에 대한 예시적인 면역억제 요법을 개괄한다. 이식 전, 환자는 IL-2 수용체 길항제 (예를 들어, 바실릭시맙 또는 다클리주맙) 또는 림프구-퇴화제 (lymphocyte-depleting agent) (예를 들어, 항흉선세포 글로불린 (antithymocyte globulin), 항림프구 글로불린 (antilymphocyte globulin), 알렘투주맙, 및/또는 모노무랍-CD3) 와 같은 생물학적 제제를 이상적으로 포함하는, 면역억제제들의 “유도” 조합을 받고, 이식 직후 계속될 수도 있다. 림프구-퇴화제의 사용은 면역-매개 거부의 위험에 있는 것으로 간주된 환자들에게 권고될 수도 있다. 칼시네우린 억제제들 (CNIs, 예를 들어, 타크로리무스) 이 부가적으로 “유도” 페이즈에 사용될 수도 있다. 이식 후, 환자는 칼시네우린 억제제 (예를 들어, 타크로리무스) 또는 mTOR 억제제 (예를 들어, 시롤리무스) 및 항증식제 (예를 들어, 마이코페놀레이트 모페틸 또는 MMF) 를 이상적으로 포함하는 초기 유지 면역억제 요법으로 치료될 수도 있다. 초기 유지 요법은 선택가능하게 부가적으로 코르티코스테로이드를 포함할 수도 있다. 이식 후 급성 거부 없이 2 내지 4 개월 이내, 면역억제 요법은 장기 유지 페이즈로 조정될 수도 있고, 면역억제제들의 가장 낮은 계획된 도즈들이 사용되고, 칼시네우린 억제제 테라피가 계속되고 (원래 사용되었다면), 코르티코스테로이드 테라피가 계속된다 (이식 1 주 넘게 사용된다면).
주의해야 할 부가적인 면역억제제 요법은 장기 이식 후 발생하는 모든 거부 증상 발현들의 치료를 위해 사용된 “브레이크아웃 (breakout)” 요법이다. 이는 급성 거부 증상 발현 동안 손상을 최소화하도록 사용된 유지 요법 또는 일시적인 약물 테라피에 대한 영구 조정일 수도 있다. 조정은 코르티코스테로이드의 일시적 또는 장기 부가, 림프구 퇴하제의 일시적 사용, 및 항증식제들 (예를 들어, 이미 수용하지 않는 환자들에 대해 마이코페놀레이트 모페틸/MMF 또는 아자티오프린) 의 장기 부가, 및 이들의 임의의 조합을 포함할 수도 있다. 치료는 또한 혈장 교환, 혈소판 면역글로불린, 및 항-CD-20 항체 테라피, 및 이들의 임의의 조합을 포함할 수도 있다.
본 개시에 사용된 방법들 및 시스템들은 이들 치료 요법들의 결정점을 안내할 수도 있다 (예를 들어, 증가된 위험 평가로 인해, 면역억제 요법에 제재의 첨가). 예를 들어, 이들은 subAR 또는 AR을 갖고, 상기 기술된 바와 같이, 면역억제 요법의 조정을 입증하는 것으로 저 이식 시간 위험 인자들 (예를 들어, 수여자와 공여자 장기 사이의 고 HLA 매칭) 을 갖는 환자의 평가를 가능하게 할 수도 있다.
반대로, 환자가 AR 또는 subAR의 저 위험을 갖는 것으로 표시되거나, TX로 식별되면, 의료진은, 특히 생검과 같은 침습성이 아닌, 추가 진단 절차들을 지시할 필요가 없다. 또한, 의료진은 기존의 치료 방식을 계속할 수 있고, 또는 심지어 투여된 약물의 도즈 또는 빈도를 감소시킬 수 있다.
일부 방법들에서, 발현 레벨들은 특정한 환자에서 인터벌들 (intervals) 로 결정된다 (즉, 모니터링). 바람직하게, 모니터링은 사혈과 같은 일련의 최소 침습 검사들에 의해 수행되지만, 일부 경우들에서, 모니터링은 또한 신장 생검을 조직학적으로 또는 분자 프로파일을 분석함으로써 분석하는 단계를 또한 수반할 수도 있다. 모니터링은 상이한 시간 인터벌들로 발생할 수도 있고, 예를 들어 모니터링은 시간별로, 날짜별로, 주별로, 월별로, 년별로 또는 한 달에 2회, 한 달에 3 회, 2 개월마다, 3 개월마다, 4 개월마다, 5 개월마다, 6 개월마다, 7 개월마다, 8 개월마다, 9 개월마다, 10 개월마다, 11 개월마다, 또는 12 개월마다와 같이, 일부 다른 시간 기간일 수도 있다.
이러한 방법들은 특정한 환자의 총 발현 레벨들이 subAR을 겪는 환자들 또는 subAR을 겪지 않는 환자들, 또는 TX 상태 신장 또는 비-TX 상태 신장을 갖는 환자들의 발현 레벨들에 보다 가까운지 여부를 나타내는 시간에 따라 변화하는 일련의 값들을 제공할 수 있다. subAR 또는 비-TX를 향해 또는 이로부터 멀어지는 값의 이동이 기존의 면역억제 요법이 작동하는지 여부, 면역억제 요법이 (예를 들어, 이식 수여자에게 신규 면역억제제의 투여 또는 이식 수여자에게 현재 투여되는 면역억제제의 도즈의 증가를 통해) 변화되어야 하는지 여부 또는 생검 또는 크레아티닌 또는 사구체여과율과 같은 마커들에 의한 증가된 모니터링이 수행되어야 하는지 여부의 지표를 제공할 수 있다. 일부 경우들에서, 본 명세서에 기술된 바와 같이 subAR 또는 비-TX에 대해 양성인 연속적 (예를 들어, 적어도 2) 검사들이, 예를 들어, 면역억제 요법의 (예를 들어, 이식 수여자에게 신규 면역억제제의 투여 또는 이식 수여자에게 현재 투여되는 면역억제제의 도즈의 증가를 통한) 조정, 신장 생검의 수집 및 평가, 또는 혈청 크레아티닌 및/또는 eGFR 검사의 시행을 나타낸다. 일부 경우들에서, 본 명세서에 기술된 바와 같이 subAR 또는 비-TX에 대해 모호한 (ambiguous) 연속적 (예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) 검사들은 취해져야 할 부가적인 확인 동작, 예를 들어, 신장 생검의 수집 및 평가, 또는 혈청 크레아티닌 및/또는 eGFR 검사의 시행을 나타낸다. 연속적 (예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) 검사들은 검사들이 경향을 정확하게 나타낸다는 것을 보장하도록, 적절한 시간 기간 (예를 들어, 하루, 1 주, 2 주, 3 주, 1 개월, 2 개월, 3 개월, 4 개월, 5 개월, 6 개월, 또는 1 년) 으로 분리될 수도 있다.
본 명세서에 제공된 방법들은 신장의 감시 또는 프로토콜 생검을 이미 겪고 조직학적 분석 또는 분자 프로파일링 분석의 형태의 생검 결과를 받은 이식 수여자에게 혈액 검사 (예를 들어, 무증상 급성 거부를 검출하기 위한 검사) 를 시행하는 단계를 포함한다. 일부 특정한 예들에서, (예를 들어, 조직학에 의한 또는 분자 프로파일링에 의한) 신장 생검의 분석은 모호하고, 결정적이지 않고, 또는 경계선상 결과들을 발생시킬 수도 있다. 이러한 경우들에서, 본 명세서에 제공된 혈액 검사는 이식 수여자가 무증상 급성 거부를 갖는지 또는 생검을 해석하는지 여부를 결정하는 간병인을 보조할 수도 있다. 다른 경우들에서 생검 자체는 결정적이지 않거나 모호할 수도 있고, 이러한 경우들에서 생검의 분자 분석은 진단을 확인하기 위해 조직학에 부수적으로 사용될 수도 있다. 일부 예들에서, 신장 생검의 분석은 음성 결과를 산출할 수도 있다. 이러한 경우들에서, 피험자는 음성 결과를 확인하기 위해, 또는 무증상 급성 거부를 검출하기 위해 본 명세서에 제공된 혈액 검사를 받을 수도 있다. 일부 경우들에서, 임의의 타입 (예를 들어, 음성 결과, 모호, 비결정적, 경계선, 양성) 의 생검 결과 수신 후, 환자는 무증상 급성 거부와 상관된 분자 마커들의 변화들을 모니터링하기 위해 복수의, 일련의 혈액 검사들을 받을 수도 있다.
본 명세서에 제공된 방법들은 또한 분자 혈액 프로파일링 검사를 받은 이식 수여자에게 (예를 들어, 조직학적 또는 분자 프로파일링) 생검 검사를 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 이식 수여자는 혈액 분자 프로파일링 검사에 대한 모호성, 비결정적, 또는 경계선 결과를 수신할 수도 있다. 이러한 경우들에서, 환자의 건강관리 직원은 피험자가 무증상 급성 거부를 경험하는지 여부를 결정하기 위한 혈액 검사에 상보적인 것으로 신장 생검 검사의 결과들을 사용할 수도 있다. 또 다른 예에서, 이식 수여자는 이식 수여자는 무증상 급성 거부를 갖거나 갖기 쉽고, 또는 심지어 시간에 걸쳐 복수의 양성 결과들을 갖는다는 것을 나타내는, 혈액 분자 프로파일링 검사에 대한 양성 결과를 수신할 수도 있다. 이러한 경우들에서, 환자의 의료진 또는 다른 건강관리 직원은 subAR을 검출하기 위해 환자의 신장을 생검하기로 결정할 수도 있다. 이러한 신장 생검 검사는 본 명세서에 기술된 바와 같이, 환자의 신장의 분자 프로파일링 분석일 수도 있다. 일부 경우들에서, 신장 생검의 조직학적 분석이 생검의 분자 분석 대신, 또는 이에 더하여 수행될 수도 있다. 도 3에 도시된 바와 같이, 피험자 (예컨대 신장 이식 수여자) 는 의료진을 방문한다. 의료진은 단백뇨의 증거 (예를 들어, >1.0g/24 h) 그리고/또는 고 크레아티닌 레벨들 (예를 들어, 1.0 ㎎/dL 이상의 혈청 크레아티닌 레벨들) 가 있는지 여부를 결정한다. 단백뇨의 증거 및/또는 고 크레아티닌 레벨들이 있다면, 가능한 이식 손상 (예를 들어, 급성 거부) 이 있을 수도 있다. 단백뇨의 증거 및/또는 고 크레아티닌 레벨들이 있다면, 이는 정상 이식 또는 subAR이다. 거부의 조직학적 증거는 어떤 경우에서든 획득될 수 있다. 가능한 이식 손상에 이어지는 거부의 조직학적 증거가 있다면, 이는 급성 거부이다. 가능한 이식 손상에 이어지는 거부의 조직학적 증거가 없다면, 이는 급성 기능 부전이다. 정상 이식에 이어지는 거부의 조직학적 증거 또는 subAR이 있다면, 이는 subAR이다. 정상 이식에 이어지는 거부의 조직학적 증거 또는 subAR이 없다면, 이는 정상 이식이다. 일부 경우들에서, 의료진은 생검 검사를 수행하기 위한 양성 혈액 결과 수신 후 특정한 시간 기간 대기하도록 결정할 수도 있다.
본 명세서에 제공된 방법들은 종종 subAR의 조기 검출을 제공할 수도 있고 환자가 면역억제 테라피를 받거나 기존의 면역억제 요법을 증가시키는 것과 같은 조기 치료를 받는 것을 도울 수도 있다. 이러한 조기 치료는 환자로 하여금 동종이식편 손실 또는 신장 투석과 같은 절차들과 같은, 시간 상 후속된 급성 거부와 연관된 보다 심각한 결과들을 방지하게 할 수도 있다. 일부 경우들에서, 환자가 분자 프로파일링에 의해 또는 조직학적으로 분석된 분자 프로파일링 혈액 검사 및 생검 모두를 받은 후, 이러한 조기 처리들이 시행될 수도 있다.
이식 수여자의 상태의 진단 또는 검출은 환자에게 시행되는 침습성 진단 개입의 수를 제한하는데 특히 유용할 수도 있다. 예를 들어, 본 명세서에 제공된 방법들은 이식 수여자 (예를 들어, 신장 이식 수여자) 가 생검 (예를 들어, 신장 생검들) 을 받거나 복수의 생검들을 받을 필요를 제한하거나 제거할 수도 있다. 다른 실시예에서, 본 명세서에 제공된 방법들은, 신장 동종이식편 거부의 생검 분석의 결과들, 생검 샘플의 조직병리학적 결과들, 혈청 크레아티닌 레벨, 크레아티닌 제거 (clearance), 초음파, 신장에 대한 방사선 촬영 결과들, 소변검사 결과들, 네오프테린 및 림포카인류와 같은 염증 분자들의 상승된 레벨들, 아자티오프린-치료 환자들의 상승된 혈장 인터류킨 (IL)-1, 시클로스포린-치료 환자들의 상승된 IL-2, 혈청 및 소변 내 상승된 IL-6, 세포독성 분자들 (그란자임 B 및 퍼포린) 의 신장내 발현 및 면역조절 사이토카인류 (IL-2, IL-4, IL-10, 인터페론 감마 및 형질전환 성장 인자-b1) 와 같은 이식 수여자의 상태를 검출하거나 진단하기 위해 단독으로 또는 현재 사용된 다른 표준 진단 방법들과 조합하여 사용될 수 있다.
본 명세서의 방법들은 CBC (complete blood count), (나트륨, 칼륨, 클로라이드, 중탄산염, 칼슘 및 인을 포함하는) 혈청 전해질 검사들, 혈액 요소 검사, 혈액 질소 검사, 혈청 크레아티닌 검사, 요 전해질 검사, 요 크레아티닌 검사, 요 단백질 검사, 요 FENA (fractional excretion of sodium) 검사, 사구체여과율 (GFR) 검사와 같은 신장 기능 검사들과 함께 사용될 수도 있다. 신장 기능은 또한 신장 생검에 의해 평가될 수도 있다. 신장 기능은 또한 하나 이상의 유전자 발현 검사들에 의해 평가될 수도 있다.
예들
예 1. -면역억제 치료 중인 신장 이식 수여자의 subAR의 검출
유지 면역억제제 요법에 대해 안정한 동종이식편 기능 (예를 들어, 칼시네우린 억제제 또는 mTOR 억제제 + 마이코페놀레이트 모페틸) 을 갖는 유도 후 신장 이식 수여자들은 규정된 스케줄의 말초 혈액 인출 (예를 들어, 1 내지 3 개월 당 1 인출 (draw)) 로 검사된다. 마이크로어레이 플랫폼에 의해 유전자 발현 분석 혈액 샘플들이 본 명세서에서 상기 기술된 바와 같이 (예를 들어, HT_HG-U133_Plus_PM 마이크로어레이를 사용하여) 수행된다.
subAR을 검출하기 위한 분류자는 (예를 들어, 표 5, 표 6 또는 표 8로부터 적어도 5 개의 유전자들, 또는 표 5, 표 6 또는 표 8로부터 프로브들에 콘택트된 적어도 5 개의 유전자들을 사용하여) TX 와 subAR 사이에 차동적으로 발현된 유전자들로 구성된다. 분류자는 subAR 또는 subAR의 결여 (예를 들어, 이식 정상 상태, TX) 를 갖는 것을 환자 샘플을 식별하기 위해 상기 마이크로어레이 유전자 발현 데이터에 적용된다.
subAR을 갖는 것으로 식별된 환자들은 코르티코스테로이드의 일시적 또는 장기 부가, 림프 퇴화제의 일시적 사용, 혈장 교환, 혈소판 면역글로불린, 항-CD-20 항체 테라피, 또는 항증식제들(예를 들어, 이미 받지 않는 환자들에 대한 마이코페놀레이트 모페틸 또는 아자티오프린) 의 장기 부가와 같은 면역억제 요법에 대한 조정을 받는다. 대안적으로, 환자들은 확인 생검을 겪는다. 반대로, TX를 갖는 환자들은 생검이 필요 없이 이식 중심 프로토콜에 따라 모니터링을 계속한다.
예 2. - 면역억제제 치료 중인 이식된 신장의 검출
유지 면역억제제 요법에 대해 안정한 동종이식편 기능 (예를 들어, 칼시네우린 억제제 또는 mTOR 억제제 + 마이코페놀레이트 모페틸) 을 갖는 유도 후 신장 이식 수여자들은 규정된 스케줄의 말초 혈액 인출 (예를 들어, 1 내지 3 개월 당 1 인출 (draw)) 로 검사된다. 혈액 샘플들의 유전자 발현 분석은 본 명세서에 상기 기술된 바와 같이 (예를 들어, HT_HG-U133_Plus_PM 마이크로어레이를 사용하여) 수행된다.
비-TX를 검출하기 위한 분류자는 (예를 들어, 표 1, 표 2, 표 3, 또는 표 4로부터 5 이상의 유전자들 또는 표 1, 표 2, 표 3, 또는 표 4로부터 프로브들에 의해 콘택트된 적어도 5 개의 유전자들을 포함하는 분류자 유전자 세트를 포함하는) TX와 비-TX 사이에서 차동적으로 발현된 유전자들로 구성된다. 분류자는 비-TX 장기를 갖는 환자 샘플을 식별하기 위해 상기 마이크로어레이 유전자 발현 데이터에 적용된다.
비-TX 장기를 갖는 것으로 검출된 환자들은 장기 거부에 대한 조직병리학적 분석이 이어지는, 혈청 크레아티닌, 혈액 요소 질소, 사구체여과율, 및/또는 신장 생검을 포함하는 후속 검사를 겪는다. 비-TX 환자들은 신장 손상, 거부 없이 급성 기능 부전, subAR, 또는 급성 거부를 갖는 환자들을 포함할 수도 있다. 손상된 신장 여과 측정 및 생검을 통한 면역 거부의 사인이 없는 환자들은 신장 손상 또는 거부 없이 급성 기능 부전을 가질 수도 있다. 손상된 신장 여과 측정 및 생검을 통한 면역 거부의 사인을 갖는 환자들이 급성 거부를 갖는다. 손상된 신장 여과 측정 및 생검을 통한 면역 거부의 사인이 없는 환자들은 subAR을 갖는다. 반대로, TX를 갖는 환자들은 생검이 필요 없이 이식 중심 프로토콜에 따라 모니터링/치료가 계속될 것이다.
예 3. - subAR을 갖는 신장 이식 환자의 subAR vs TX 검사 분류
무증상 급성 거부를 갖는 신장 이식 환자로부터 혈액 샘플을 획득한다. 신장 이식 환자의 혈청 크레아티닌 레벨들은 정상 또는 안정하다. 마이크로어레이 플랫폼에 의한 혈액 샘플의 유전자 발현 분석은 상기 기술된 바와 같이 수행된다. (예를 들어, 표 5, 표 6 또는 표 8로부터 적어도 5 개의 유전자들 또는 표 5, 표 6 또는 표 8로부터 프로브들에 의해 콘택트된 적어도 5 개의 유전자들을 사용하여) TX로부터 subAR을 구별하기 위한 분류자는 마이크로어레이 분석으로부터 유전자 발현 데이터에 적용된다. 환자는 subAR로 분류된다.
예 4. - AR을 갖는 신장 이식 환자 내 비-TX vs TX 검사 분류
급성 거부를 갖는 신장 이식 환자로부터 혈액 샘플이 획득된다. 마이크로어레이 플랫폼에 의한 혈액 샘플의 유전자 발현 분석은 상기 기술된 바와 같이 수행된다.
(예를 들어, 표 1, 표 2, 표 3, 또는 표 4로부터 적어도 5 개의 유전자들 또는 표 1, 표 2, 표 3, 또는 표 4로부터 프로브들에 의해 콘택트된 적어도 5 개의 유전자들을 사용하여) 비-TX로부터 TX를 구별하기 위한 분류자는 마이크로어레이 분석으로부터 유전자 발현 데이터에 적용된다. 환자는 비-TX로 분류된다.
예 5. -임상 설정에서 혈액-기반 subAR 유전자 발현 프로파일 분류자의 발생 및 평가
멀티-센터 연구 (the Clinical Trials in Organ Transplantation 08, “CTOT-08”) 가 subAR vs. 무 subAR에 대한 유전자 발현 프로파일 바이오마커를 발생시키고 임상적 타당성을 평가하기 위해 수행되었다. 발견 및 집단들 모두의 정밀하게 표현된 신장 수여자들로부터 감시 생검들과 일련의 혈액 샘플 쌍은 바이오마커 발생 및 검증에 사용된다. 도 10은 CTOT-08 연구를 위한 연구 설계를 도시한다. 연구 중인 피험자들 주기적 신장 생검들 (“감시 생검들”) (연회색 화살표들) 에 커플링된 일련의 혈액 샘플링 (진회색 화살표들) 을 겪는다. 무증상 급성 거부 (“subAR”) 로 진단된 피험자들은 보다 빈번하게 혈액 샘플링되고 (하부 진회색 화살표들), 8 주 후 후속 생검된다 (가는 연회색 화살표들). 신장 기능 장애를 나타내는 피험자들은 “원인을 찾기 위해” 생검들을 겪는다 (가장 아래쪽 연회색 화살표들). 임상 급성 거부 (“cAR”) 의 증상 발현들이 또한 8 주 동안 보다 빈번한 혈액 샘플링되지만, 후속 생검은 없다. 모든 환자들이 CCE (clinical composite endpoint) 의 일부로서 이식 후 24 개월에 생검이 예정된다. 도 11은 24 개월 CCE와 임상 표현형의 연관을 도시한다. 차트는 종점 (임상 합성 종점 중 하나 ― CCE) 에 도달한 피험자들의 백분율 또는 CCE의 개별 컴포넌트 (24-개월 생검에서 Grade 2 IFTA[“IFTA≥II”]; [“BPAR”] 의 임의의 임상 발현, 또는 4 내지 24 개월에 10 ml/min/1.73m2보다 큰 GFR의 강하 [“ΔeGFR”] 각각을 예시한다. 피험자들은 임상 표현형들에 의해 감시 생검들에 대해 (생검들 상의 TX만을 갖는 (그룹 각각에서 청색 막대들/제 1 막대들), subAR 또는 TX 를 갖는 피험자들 (그룹 각각에서 주황색 막대들/제 2 막대들), subAR의 적어도 하나의 임상 발현을 갖는 피험자들 (그룹 각각에서 회색 막대들, 제 3 막대들), 그리고 이어서 subAR (그룹 각각에서 노란색 막대들, 제 4 막대들) 만을 갖는 피험자들로 분할된다. 도 12a 및 도 12b는 이식 후 아무때나 “dnDSA”와 임상 표현형들의 연관들을 도시한다. 도 12a (상단 패널) 는 24-개월 실험에서 임상 표현형 그룹 (생검들에서 TX만, 생검에서 subAR의 적어도 일 증상 발현, 또는 감시 생검에서 subAR만 갖는 피험자들) 에 기초하여, 연구 중 아무때나 dnDSA가 발생된 피험자들의 백분율, 클래스 I 그룹 각각의 좌측 막대들/진회색) 또는 클래스 II (그룹 각각의 우측 막대들/연회색) 을 도시한다. 도 12b (하단 패널) 는 이식 후 첫 해에 획득된 생검 결과들에 제한되지 않고, dnDSA와 임상 표현형들 사이의 연관과 함께 도 12a에 유사한 도면을 도시한다. 도 13a 내지 도 13c는 24-개월 결과들 및 dnDSA과 본 명세서에서 발생된 무증상 급성 거부 (“subAR”) 유전자 발현 프로파일 (GEP) 의 연관을 도시한다. 도 13a (상단 패널) 는 24 개월 결과들과 subAR GEP의 연관을 도시한다. 종점 (합성 종점 중 하나 ― CCE) 에 도달한 피험자들의 백분율 또는 CCE의 개별 컴포넌트 (24-개월 생검에서 Grade 2 [“IFTA≥II”]; [“BPAR”] 의 임의의 임상 발현, 또는 4 내지 24 개월에 10 ml/min/1.73m2보다 큰 GFR의 강하 [“ΔeGFR”] 각각이 도시된다. 피험자들은 이들의 GEP 검사 결과들에 의해 분할된다. GEP 상에 TX만을 갖는 피험자 (그룹 각각에서 청색 막대들/제 1 막대), subAR 또는 TX를 갖는 피험자 (그룹 각각에서 주황색 막대들/제 2 막대), 적어도 subAR로 검사된 피험자 (그룹 각각에서 회색 막대들/제 3 막대), 그리고 이어서 subAR 검사들만 한 피험자들 (그룹 각각에서 노랑색 막대/제 4 막대). 도 13b (중간 패널) 는 이식 후 아무때나 subAR GEP 검사와 dnDSA의 발생 사이의 연관을 도시한다. 이는 24-개월 연구 기간의 아무때나 이루어진 GEP 검사들을 포함한다. GEP 검사들에 기초하여 클래스 I (그룹 각각에서 청색 막대들/제 1 막대) 및 클래스 II (그룹 각각에서 주황색 막대들/제 2 막대) 모두로 그룹화된 dnDSA가 발생된 피험자들의 백분율이 도시된다. 피험자 그룹들은 TX 혈액 검사만, 적어도 하나는 subAR 혈액 검사되거나, subAR 혈액 검사만된다. 모든 혈액 검사들은 감시 생검들과 한 쌍이다. 도 13c (하단 패널)) 는 이식 후 첫 해로 제한되는 것을 제외하고, 패널 B (GEP 검사와 dnDSA의 발생 사이의 연관) 에 유사한 분석을 도시한다. 도 6은 subAR 분류자 바이오마커를 식별하기 위한 프로세스를 예시하는 ROC 곡선을 도시한다. CTOT “발견” 집단으로부터 530 CTOT-08 쌍 말초 혈액 및 감시 생검 샘플들 집단이 사용되었다.
발견 및 집단들 모두의 정밀하게 표현된 신장 수여자들로부터 감시 생검들과 일련의 혈액 샘플 쌍은 바이오마커 발생에 사용된다. 차동으로 발현된 유전자들이 두 집단들에서 동종이식편 거부의 생물학적으로 관련한 분자 경로들에 맵핑된다. 발견 데이터 세트에 대해 트레이닝된 랜덤 포레스트 모델이 subAR (AUC 0·85) 에 대해 유전자 발현 프로파일 (GEP) 을 산출한다. GEP는 잠금된 모델 (locked model) 및 규정된 역치를 사용하여 외부 집단에 대해 더 검증된다. 이 분자 바이오마커는 KT 수여자들 (NPV: 78 내지 88 ％) 의 72 내지 75 ％가 subAR가 부재라고 진단하는 한편, 나머지 25 내지 28 ％은 잠재적으로 번식하는 subAR (PPV: 47 내지 61 ％) 로 식별된다. 이식 후 처음 12 개월 이내 subAR 임상 표현형 및 양성 바이오마커 검사 모두가 24 개월에서 dnDSA 및 불량한 이식 결과들의 발생과 독립적으로 그리고 상당히 연관된다. 데이터는 혈액-기반 바이오마커가 subAR의 존재 또는 부재에 대한 안정한 신장 기능을 갖는 신장 이식 수여자들을 비-침습성으로 모니터링하도록 사용될 수 있는 것을 암시한다. 일련의 바이오마커-통지 모니터링 전략의 사용은 환자들을 위험-계층화할 것이고 따라서 종종 불필요하게 음성인, 생검들의 사용을 제한하고, 모두 면역억제 및 이식 결과들을 능동적으로 관리하는 임상의의 능력을 개선한다.
본 명세서에 제시된 접근방법은 다수의 분석, 통계 및 실시 강도들을 갖는다. 첫째로, 본 명세서에서 검증된 유전자 발현 프로파일은 임상적으로 상당한 결과들에 (예를 들어, dnDSAs의 발생 및 불량한 이식 결과) 에 관련된 생물학적으로 타당한 메커니즘을 갖는다. 둘째로, 이 접근방법은 센서티비티/PPV에 대한 subAR의 특이도/NPV를 강조하는 확률 역치 선택을 가능하게 하고, subAR의 부재를 평가하고 대부분의 환자들에서 무분별하고 잠재적으로 불필요한 감시 생검들에 대한 필요성을 제거하는 임상적 실시에서 일련의 사용에 적합하게 한다. 마지막으로, 사용된 환자 집단 설계 및 분석적 프로세스 (예를 들어, 면역상 위험 또는 면역억제 요법에 대해 다양한 집단 애그노스틱 (agnostic) 을 갖는 중심들의 사용, 바이오마커 발생을 깨닫지 못하는 임상 알고리즘들의 사용, 1차 분석들을 오염시키는 것으로 공지된 교란들의 포함, 적용된 센터 생검 판독, 및 ComBat 조정) 는 다른 이식 거부 연구들에서 일반적인 교란 요인들을 최소화한다.
A. 발견/검증을 위해 선택된 환자 집단들의 특징들
307명의 성인 신장 이식 수여자들이 5 개의 미국 이식 센터들에 2011년 3월과 2014년 5월 사이에 CTOT-08에 선제적으로 등록되었고 24 개월 동안 추적되었다. 연구 포함 기준: 18 세 이상의 남성 또는 여성 신장 이식 수여자들 (등록 6 주 이내 임신 검사 음성); 사전 동의할 수 있고; 사망하거나 살아있는 공여자들로부터 처음으로 또는 후순위로 신장 이식된 수여자들이다. 결합되고 '일괄적인 (en-bloc)' 신장 이식된 피험자들, 및 HIV (Human Immunodeficiency Virus) 또는 C 형 감염 바이러스 감염된 피험자들은 배제된다. 감시 생검들을 일상적으로 수행하는 참가 사이트들은 인종 및 민족 다양성을 제공하기 위해 지리적으로 선택된다.
신장 이식 수여자들은 CTOT-08과 동일한 자격 기준을 갖는, NU 이식 프로그램의 생체저장 연구에 동시에 등록된다. 환자들은 CTOT-08와 유사한 빈도로 NU에서 감시 생검들을 겪는다. NU에서 감시 생검들을 겪지만 CTOT-08에 참여하지 않는 환자들 NU 생체저장 연구에 등록된다.
CTOT-08 집단 및 NU 생체저장소 집단으로 이식 수여자들의 배치, 뿐만 아니라 발견 및 검증 집단들 내로 하위 선택이 도 5에 제시된다. 도 5에서 입증된 바와 같이, NU 저장 집단은 혈액 기반 subAR 유전자 발현 프로파일 분류자의 검증에 사용되는 한편, CTOT-08 집단은 발견을 위해 사용된다. 나머지 551 명이 subAR (n= 136[24.7 ％]; 79 ％ '경계선상 변화들', 21 ％ >1A 거부) 또는 TX (무 거부 또는 다른 조직학적 발견들 없음; n=415[75.3 ％]) 의 임상 표현형들을 갖는 것으로 분류된다. 이용가능한 주변 혈액 샘플들의 쌍으로 530명의 감시 생검들이 바이오마커 발견을 위해 사용된다. 감시 생검에 대해 거부 또는 무 거부의 보다 일반적인 정의를 만족함에도 불구하고, 나머지 21 쌍 샘플들은 미리 규정된 표현형 알고리즘에 기초하여 TX 또는 subAR에 대한 엄격한 기준을 만족하지 않고 따라서 배제된다. 530 개의 생검들 중에 BK 바이러스 신장해 (nephropathy) 의 예들이 없다는 것이 중요하다. 반대로 CTOT-08 발견 집단에 대해, NU (Northwestern University) 생체저장소에 공헌하는 환자들은 일련의 샘플링을 겪지 않는다. 대신, 바이오마커의 검증에 사용된 이들 쌍 샘플들은 NU 이식 센터에서 수행된 감시 생검시 획득되고 신장 이식 후 24 개월 이내의 단일 시점들을 나타낸다.
CTOT-08에 등록된 307 명의 피험자들 중, 283 명은 감시 생검들 및 연속 임상 데이터가 센터에서 판독된, 안정한 신장 기능을 갖고, 253/283명은 바이오마커 발견에 사용된 쌍 (감시 생검 및 말초 혈액) 샘플 각각에 대해 subAR 또는 이식 우수 (TX) (즉, 무 subAR) 의 임상 표현형을 규정하기에 충분한 데이터를 갖는다. 24-개월 관찰 기간 동안, 이들 253 명의 피험자들이 742 센터에서 판독된 생검들을 겪고; 191명은 (급성 신장 기능 장애와 연관된) '원인을 찾기 위해' 생검되고 따라서 안정한 신장 기능의 설정으로만 수행된 감시 생검들로 간주되지 않는다.
CTOT-08 및 NU 이식 생체저장소 연구들 모두의 환자들 모두에 대한 임상 파라미터들은 표 7에 제시된다. 그룹들 간 면역억제 타입을 포함하는 인구 통계의 뚜렷한 차이들이 없다. 2 이상의 감시 생검들을 겪은 안정한 신장 기능을 갖는 253 명의 정밀 표현형 CTOT-08 피험자들 중, 33 (13.0 ％) 명 만이 subAR (무 TX) 을 입증하고, 146 명의 피험자들 (57.71 ％) 만이 TX (무 subAR) 이고, 74 (29.2 ％) 명의 피험자들이 subAR 또는 TX (즉, 24-개월 연구 동안 적어도 1 사례의 subAR) 의 개별 사례들을 입증한다. subAR만 (연구 기간 동안 감시 생검들마다 TX의 사례들 없음) 그리고 subAR 또는 TX 그룹들이 집합적으로 subAR의 적어도 1 증상 발현 (>1 subAR) 피험자들을 나타낸다. 환자-레벨에서, subAR의 2 이상의 생검-검증 사례(들)의 일반적인 발생은 42.3 ％ (107/253) 인 한편 TX만에 대해 57.7 ％이다. NU 생체저장소의 피험자들이 연속 샘플링을 겪지 않고 따라서 2 개의 그룹들만이 있기 때문에, subAR의 샘플-레벨 일반적인 발생은 TX 에 대해 72.1 ％ (93/129) 인 것에 비교하여 27.9 ％ (36/129) 이다.
CTOT-08 피험자들은 24 개월 연구 동안 복수의 감시 생검들을 겪었다. 일부 피험자들은 subAR 또는 TX 표현형들만을 입증하지만, 다른 피험자들은 상이한 시간들에 2 이상의 표현형을 입증한다. 따라서, 피험자들을 3 개의 표현형 그룹들: subAR 만 (무 TX) 을 입증하는 감시 생검들을 갖는 피험자들, TX 만 (무 subAR) 을 입증하는 감시 생검들을 갖는 피험자들, 및 subAR 또는 TX를 입증하는 감시 생검들을 갖는 피험자들로 분류하였다. 따라서 이 제 3 그룹은 연구 기간 동안 subAR의 사례를 2 이상 (적어도 1) 그리고 TX의 사례를 2 이상 (적어도 1) 경험한 피험자들로 구성된다.
CTOT-08 연구 기간 동안, 임상적 관리가 면역억제 및 예방 요법들을 위해 센터 각각에서 표준 실무에 따른다. 모든 생검들이 일상적 조직학, Simian Virus-40 (SV40) 및 c4d 착색로 처리되고, Banff 2007 기준을 사용하여 임상 과정을 깨닫지 못하는 센터 의료진에 의해 판독된다 (Solez et al. Am. J. Transplant. 8, 753-760 (2008)).
모든 생검들은 센터에서 판독된다. 임상 표현형들은 이하의 미리 규정된 알고리즘을 사용하여 발견 및 검증 집단들에 대해 DCC (Rho Federal Systems의 Data Coordinating Center) 에 의해 할당된다:
샘플-레벨:
SubAR: 급성 거부 (≥ Banff 경계선 세포 거부 그리고/또는 항체 매개 거부) 및 각각 132 및 75 내지 187 일의 평균 기간 및 범위에 걸쳐, 2 내지 3의 초기 값들의 최소 값에 대해 비교하여 혈청 크레아티닌 <2.3 ㎎/dl 이고 크레아티닌의20 ％ 초과하는 상승으로 규정된, 안정한 신장 기능에 일치하는 감시 생검에 대한 조직학;
TX (Transplant eXcellence): 감시 생검 (거부 증거가 없음 - Banff i=0 이고 t=0, g=0, ptc=0; ci=0 또는 1 이고 ct=0 또는 1) 및 상기 규정된 바와 같이 안정한 신장 기능에 대한 정상 조직학. 감시 생검들은 이식 후 2 내지 6, 12 및 24 개월에 모든 피험자들에 대해 수행된다.
피험자 레벨:
CTOT-08 피험자들은 24 개월 연구 동안 복수의 감시 생검들을 겪는다. 일부 피험자들은 subAR 또는 TX 표현형들만을 입증하지만, 다른 피험자들은 상이한 시간들에 2 이상의 표현형을 입증한다. 따라서, 피험자들을 3 개의 표현형 그룹들: subAR 만 (무 TX) 을 입증하는 감시 생검들을 갖는 피험자들, TX 만 (무 subAR) 을 입증하는 감시 생검들을 갖는 피험자들, 및 subAR 또는 TX를 입증하는 감시 생검들을 갖는 피험자들로 분류하였다. 따라서 이 제 3 그룹은 연구 기간 동안 subAR의 사례를 2 이상 (적어도 1) 그리고 TX의 사례를 2 이상 (적어도 1) 경험한 피험자들로 구성된다.
감시 생검에 대해 subAR을 갖는 것으로 진단된 피험자들은 국소 실시에 따라 사이트 각각의 조직병리학적 해석에 기초하여 관리되고, 후속하여 2 주마다 혈액 샘플 수집 및 주 8에 반복 생검으로 구성된 집중적 모니터링을 겪는다. 집중적인 모니터링은 피험자 당 1 subAR 증상 발현으로 제한된다.
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B. 규정된 확률 역치를 사용하여 환자들을 계층화하기 위한 subAR 유전자 발현 프로파일 분류자의 발생
안정한 신장 기능을 갖는 환자들에 대한 감시 생검에서 subAR vs 무 subAR (TX) 과 상관시키도록 설계된 바이오마커 패널이 530 명으로부터 차동 유전자 발현 데이터 CTOT-08 말초 혈액 샘플들 (subAR 130 [24.5 ％]: TX 400) 쌍과 250 명의 피험자들로부터 감시 생검들을 사용하여 발생된다.
PAXGene (BD BioSciences, San Jose CA) 튜브들에서 수집된 말초 혈액은 TSRI (The Scripps Research Institute) 로 운송되고 배치들에서 프로세싱된다. RNA는 Paxgene Blood RNA 시스템 (PreAnalytiX GmbH, Hombrechtikon, Switzerland) 을 사용하여 Paxgene 튜브들 및 Ambion GLOBINclear (Life Technologies, Carlsbad, CA) 로부터 추출된다. Biotinylated cRNA는 Ambion MessageAmp Biotin II 키드 (Ambion) 로 조제되고 Affymetrix HT HG-U133+PM Array Plates 및 Peg Arrays 및 유전자 Titan MC 장비 (Thermo Fisher Scientific, Waltham MA) (GEO Accession #GSE107509) 를 사용하여 모든 샘플들에 대해 저장되고 적용된다.
도 8은 subAR 유전자 발현 프로파일 분류자의 발견을 위해 사용된 워크플로우를 예시한다. PAXGene 튜브들에서 수집된 말초 혈액은 보정 및 정규화 파라미터들을 사용하여 배치들 내에서 프로세싱된다. 대용 변수 분석을 사용한 배치 효과에 대한 이하의 ComBat 조정에 이어, 차동 유전자 발현 분석이 수행되고, 이어서 데이터는 Random Forest 모델들을 형성하도록 사용된다. 지니 중요도는 AUC에 대해 최적화된 상위 모델을 선택하도록 사용된다. 이어서 상이한 확률 역치들이 바이오마커의 성능을 최적화하도록 평가된다.
대용 변수 분석 (Leek et al. Bioinformatics 28, 882-883 (2012)) 을 사용한 배치 효과에 대한 이하의 ComBat (Johnson et al. Biostatistics 8, 118-127 (2007)) 조정에 이어, 차동 유전자 발현 분석이 수행되고 (Linear Models for Microarray data - LIMMA) 그리고 FDR (False Discovery Rate) <0.05 이 선택된다. 차동 유전자 발현 데이터의 생물학적 관련성을 검사하고 검증하기 위해, 1) Ingenuity Pathway Analysis (Qiagen), 2) DAVID (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery) (Huang et al. Genome Biol. 8, R183.1-R183.16 (2007)), 및 3) GSEA (Gene Set Enrichment Analysis) (Subramanian et al. Genome Biol. 8, R183.1-R183.16 (2007)) 를 사용하여 두 집단들 사이의 유전자 경로 맵핑 (LIMMA; FDR <0.05) 이 비교된다. 이어서 차동 유전자 발현 데이터가 Random Forests 모델들을 수용하도록 사용된다. 지니 중요도는 AUC에 대해 최적화된 상위 모델을 선택하도록 사용된다. 부트스트랩 재샘플링 (54) 이 최종 모델의 오버피팅 (overfit) 을 검사하기 위해 사용된다. 역치 선택은 발견 집단의 모델 성능 매트릭들에 기초한다. 이들의 양분된 결과 (subAR 또는 TX) 에 기초하여, 분류자들의 성능을 결정하기 위해, 이들 프로파일들이 임상 표현형들과 비교된다. 독립 NU 생체저장소 집단의 subAR 유전자 발현 프로파일의 잠금된 모델/역치, CTOT-08 독립된, 제 2 집단 (NU 생체저장소) 을 검증한다. 유전자 발현 프로파일들이 또한 임상 종점들 및 이식 결과들과 연관을 결정하기 위해 샘플-레벨 분류자 및 환자-레벨 분류자에 대해 사용된다.
Random Forests 모델이 100,000 개의 트리들, 5의 발현 역치, FDR (0.01) 을 사용하여 바이오마커 패널 (AUC 0.85; 부트스트랩 재샘플링 내부 검증 후0.84) 에 대해 선택되었다. 이어서 센서티비티 및 PPV (각각 64 ％ 및 61 ％) 에 대해 특이도 및 NPV (87 ％ 및 88 ％) 를 촉진하는, 최상의 전체 성능에 기초하여 0.375의 예측된 확률 역치를 선택한다. 이 모델 선택 절차의 ROC 곡선-기반 분석이 도 6에 제시된다. 제 1 모델 선택에 대한 분류자들은 57 개의 유전자들에 맵핑된 61 개의 프로브 세트들로 구성된다. 흥미있는, 38/57 유전자들이 subAR에 대해 상향 조절되고 vs. TX (19 하향 조절되고), PKM 및 IFNAR1에 대한 것을 제외하고, 7/57만이 염증 경로에 맵핑되고 (Ingenuity), FDR<5 ％에서 상당하고; 염증 경로들에 맵핑되는 7, 2/7만이 상향 조절되고 나머지 5 개가 하향 조절된다 (표 8은 이 잠금된 모델에 대해 유전자 분류자들을 도시한다).
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Figure pct00062
C. subAR 유전자 발현 프로파일 분류자의 분류 성능의 검증
이어서 잠금된 모델 분류자들이 감시 생검들 (subAR 42 [30.4 ％]: TX 96) 을 겪은 NU 생체저장소 (검증 세트 #1) 로부터 처음 138 명의 피험자들에 대해 규정된 역치 (0.375) 에서 검사된다. 성능 메트릭들이 NPV 78 ％, PPV 51 ％로 구성된다. 동일한 잠금된 모델/역치 subAR 및 TX (검증 세트 #2) 의 임상 표현형 정의들에 대해 엄격한 연구 CTOT-08 기준을 만족하는 129/138 (subAR 36 [27.9 ％]: TX 93) 의 서브세트; NPV 80 ％; PPV 47 ％로 구성된 성능 매트릭스에 대해 검사된다 (좌측 패널의 검증 세트 1에 대한 결과들 우측 패널의 검증 2를 도시하는 도 7 참조). 바이오마커 검사 결과들은 확률이 0.375 역치를 초과하면 '양성' (즉, subAR의 임상 표현형과 상관) 그리고 0.375 보다 작으면 '음성' (즉, TX와 상관) 으로 이분법적으로 해석된다.
바이오마커의 성능을 임상 애플리케이션에 보다 관련된 묘사로 변환하도록, 바이오마커를 사용하여 임의의 미리 결정된 샘플에서 subAR의 존재 또는 부재를 진단하는 능력이 계산되고, 정확한 양성 vs. 음성 바이오마커 검사 결과의 빈도와 비교하여 subAR 및 TX 모두의 일반적인 발생을 고려한다. 이에 따라, 환자들의 72 내지 75 ％에서 음성 호출 (무 subAR) (NPV 78 내지 88 ％) vs. 시간의 25 내지 28 ％의 양성 호출 (subAR) (PPV 47 내지 61 ％) 이 발생된다. 이 검증의 성능 매트릭들이 표 9에 제시된다.
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따라서, 연속 모니터링을 위해 사용되면, 바이오마커는 대부분 (72 내지 75 ％) 의 환자들의 감시 생검들의 무분별한 일상적 사용을 방지하는, 상대적으로 높은 정도의 확실성으로 subAR을 숨기는 저 위험도로 안정한 신장 기능을 갖는 환자들을 계층화하도록 사용될 수 있다. 나머지 25 내지 28 ％에서, 바이오마커-촉발된 생검의 사용을 포함하여, 보다 정보제공된 관리 결정들이 모든 다른 임상 및 실험실 데이터에 종속되는 것으로 간주될 수 있다.
예 6. subAR 유전자 발현 프로파일을 발생시키도록 사용된 차동적으로 발현된 유전자들의 생물학적 관련도의 평가
예 5에서 발생된 SubAR에 대한 유전자 발현 프로파일 바이오마커가 이를 발생시키기 위해 사용되는 차동적으로 발생된 유전자들의 생물학적 관련도에 대해 평가된다. Random Forests 모델들을 수용하도록 사용된 530 명의 CTOT-08 발견 샘플들로부터 0.05 미만의 FDR을 갖는 LIMMA에 의해 결정된 차동적으로 표현된 유전자들 (Smyth et al. Statistics for Biology and Health 23, 397-420. Springer, New York (2005)) 이 3 개의 잘 확립된 소프트웨어 패키지들을 사용한 생물학적 맵핑을 겪는다:
1) IPA (Ingenuity Pathway Analysis) (Qiagen)
a) IPA는 46 개의 중요한 표준 경로들을 식별함 (Benjamini-Hochberg 보정된 p-값 <0.05), 몇몇은 T 세포 수용체를 포함하여, CD28, 세포독성 T 림프구의 CTLA4, IL-2 발현의 조절, PKCθ, iCOS-iCOSL, B 세포 수용체, Natural Killer Cell, 및 면역 응답 시그널링 경로들의 NFAT 조절을 포함하여, T-세포 및 B-세포 면역성에 링크된다. 3958 개의 프로브 세트들이 530 CTOT-08 샘플들 (표 10) 로부터 3060 개의 차동으로 발현된 유전자들 (FDR <0.1) 에 대해 맵핑된다.
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b) 부가적으로, NU 검증 세트에서, 공유된 유전자들의 IPA 식별된 15 개의 공유 경로 유전자들 이 방향성으로 검증된다 (표 11). 이 분석은 871 개의 프로브 세트들이 129 개의 NU 생체저장소 샘플들로부터 687 개의 차동 발현된 유전자들 (FDR <0.1) 에 맵핑된다는 것을 나타낸다. 경로 각각에 대한 이하의 리스트 (표 11) 는 두 집단들에 존재하고 또한 방향성으로 검증되는 공유된 유전자들만을 도시한다 (48 ％의 평균 방향상 일치하여 두 집단들에서 상향-조절되거나 하향-조절된; 17 내지 89 ％의 범위).
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2) CTOT-08 데이터 세트에서, DAVID (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery) (Huang et al. Genome Biol . 8, R183.1-R183.16 (2007)) 는 또한 GO (Gene Ontology) 생물학적 프로세스에 의해, 뿐만 아니라 CTOT-08 데이터세트에서 표준 (canonical) T-세포 수용체 (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) KEGG 경로 (p<0.001), 그리고 검증 세트 (129/138 NU 샘플들) 에서 중요하게 (p<0.0001) T-세포 수용체 경로를 식별하고, DAVID는 다시 표준 KEGG 경로들에 의해 중요하게 (각각 p=0.0002, 0.01 및 0.03) B-세포 수용체, T-세포 수용체 및 IL-2 수용체 베타 체인 경로들을 식별한다.
3) 사전-랭크된 GSEA (Gene Set Enrichment Analysis) (25) (Version 3.0 built 0160)
a) GSEA는, Hallmark 유전자 세트들 및 랭킹 기반 배수 변화를 사용하여, CTOT-08 데이터세트에서 상위 양성으로 풍부하고 중요한 유전자 세트 (q 값 <0.019) 로서 동종이식편 거부로 식별한다 (표 12). 이 분석에서, 차동 유전자 발현 데이터, 랭킹 기반 배수-변화가 GSEA의 (특정한 잘 규정된 생물학적 상태들 또는 프로세스들을 나타내고 가장 일관된 발현을 디스플레이하는) Hallmark 유전자 세트들에 대해 검사된다. 양성으로 풍부한 유전자 세트들 중에서, 동종이식편 거부 유전자 세트는 CTOT 차동 발현된 유전자들의 리스트에 나타낸 유전자들 중 60 개를 갖는, 중요한 후보자 (q 값 <0.019) 로 식별된다.
Figure pct00079
b) 사전 랭킹된 GSEA는 또한 NU 검증 세트에서 상위 2 개의 양성으로 풍부한 후보자들로서 TNFα-시그널링/NFκB-시그널링 및 '동종이식편 거부' 유전자 세트들로 식별된다 (표 13). 이 분석에서, 차동 유전자 발현 데이터, 랭킹 기반 배수-변화가 GSEA의 Hallmark 유전자 세트들에 대해 검사된다. TNFα-시그널링 및 동종이식편 거부 유전자 세트를 상위 2 개의 양성으로 풍부한 후보들로 식별된다.
Figure pct00080
예 7. subAR 유전자 발현 프로파일 분류자의 임상적 관련성의 평가.
(a) subAR의 조직학적 진단, 및 (b) 예 5에서 발생된 유전자 발현 프로파일 바이오마커와 상관하는 임상 결과들이 결정되고 비교되고; 이 데이터는 표 14에 나타내고 통계적으로 상당한 차들은 밑줄이 있다.
subAR을 경험한 피험자들이 불량한 이식 결과들을 갖는지 여부를 평가하기 위해, 1차 CCE (clinical composite endpoint) 가 이하의 기준에 기초하여 고안된다:
만성적인 손상 증거를 보이는 24-개월 생검 (센터 판독) - IFTA (Interstitial Fibrosis/Tubular Atrophy) (Banff ≥ Grade II IFTA [ci ≥ 2 또는 ct ≥ 2], 또는
임의의 '원인을 찾기 위한 생검' (센터 판독) 에 대한 BPAR (biopsy-proven acute rejection) central read), 또는
4 내지 24 개월 이식 후 10 ml/min/1.73m2 (CKD-EPI) 보다 크게 추정된 사구체여과율의 감소 (eGFR).
dnDSA (de novo Donor Specific Antibodies) 는 실시에 따라 참여하는 사이트 각각에 의해 클래스 I 및 클래스 II 모두에 대해 측정되고 사이트 각각의 컷-오프 값들이 따라 양성 또는 음성으로 기록된다. 연구 프로토콜은 12 및 24 개월 생검들의 시간에 결정들을 필요로 하지만, 연구 동안 임의의 시간에 획득되고 기록된 다른 값들이 또한 분석들에 사용된다.
24 개월에서 이식 결과 (임상 조성 또는 개별 종점들) 의 처음 12 개월에서 임상 표현형 및 유전자 발현 프로파일 모두의 영향을 평가하기 위해, OR (odds ratios) 및 Fisher의 정확도 검사에 사용된다. 2-샘플 t-검사가 반복 생검에 기초하여 subAR의 분해능을 검출하기 위해 집중적인 모니터링 동안 유전자 발현 프로파일 예측된 확률들의 능력을 평가하도록 사용된다. 공분산 분석이 기준에서 예측된 확률들의 차들을 조정하도록 사용된다.
표 14의 패널 A 및 패널 B는 subAR 및 임상 영향의 임상 표현형의 유병률을 도시한다. 패널 14A는 사전 규정된 CCE (clinical composite endpoint) 에 의해 결정된 바와 같이 subAR 임상 표현형의 유병률 및 이식 결과에 대한 영향을 도시한다: 1) 24-개월 생검에 대한 Grade 2 IFTA (Banff 기준) 보다 크고, 또는 2) 24-개월 연구 기간 동안 임의의 시간에 BPAR (biopsy-proven acute rejection), 또는 3) 이식 후 4 내지 24 개월 사이의 eGFR >10 ml/min의 감소의 발생. 피험자들은 3 임상 표현형 그룹들로 분할된다 (표 7 참조): 감시 생검들 각각은 subAR만, TX만, 또는 적어도 1 TX와 2 이상의 subAR의 사례를 도시한다. KT 후 첫 해에, 243 명의 피험자들은 subAR 또는 TX의 임상 표현형을 규정하는 기준을 만족한다. 3 개의 그룹들 사이에서 균등하게 분배된, 183/243 (75.3 ％) 은 CCE를 만족하도록 충분한 데이터를 갖고; subAR만으로 73.9 ％는 TX 만으로 35.5 ％에 CCE 비교된 만족 (또는 5.1 [1.7, 16.9]; p<0.001); 2 이상의 사례의 subAR을 갖는 53.2 ％는 TX 만으로 35.5 ％ 에 대해 비교된 CCE를 만족한다 (또는 2.1 [1.1, 4.0]; p=0.027). CCE의 개별 컴포넌트들 (IFTA, BPAR, 또는 eGFR) 이 조사될 때, BPAR만이 subAR 만의 그룹을 TX 만의 그룹과 비교할 때 상당하다고 (p<0.001) 결정된다. 표 14 패널B는 또한, subAR이 24-개월 기간 내 임의의 시간 지점으로 표기될 때 (클래스 I p=0.01; 클래스 II p=0.01) 24-개월 기간 내 dnDSA의 발생과 subAR 만 vs. TX 만의 임상 표현형 사이의 강한 연관이 있고; 클래스 II dnDSA는 TX 만과 비교할 때 subAR (p<0.01) 의 1 이상의 사례로 피험자들과 상당히 연관된다는 것을 도시한다. 이에 더하여, dnDSA의 발생은 임상 표현형이 subAR 만 vs. TX (클래스 I p<0.01; 클래스 II p=0.02) 와 비교할 때 1 이상의 사례의 subAR (클래스 I p=0.02; 클래스 II p<0.01) 및 환자들 KT에 이어 처음 12 개월 내에 발생될 때로 주지된다.
표 14 패널C 및 표 14 패널D 는 유전자 발현 프로파일 (GEP) 및 임상 영향의 유병률을 도시한다. 패널 14C는 양성 GEP 바이오마커 검사 (0.375 역치 이상) 및 동일한 사전-규정된 CCE의 영향의 유병률을 도시한다. 피험자들은 바이오마커 검사(들) 의 결과들에 따라 3 개의 그룹들: 양성만, 음성만, 또는 적어도 1 음성으로 2 이상의 사례의 양성 바이오마커 검사로 분할된다. 116/250 (46.4 ％) 은 양성 유전자 발현 프로파일의 2 이상의 사례를 갖는다. KT에 이어 처음 12 개월 내에, 239 명의 피험자들이 12 및 24 개월 모두에서 양성 또는 음성으로 GEP를 규정하는 기준을 만족한다; 3 개의 그룹들 사이에 균등하게 분배된, 182/239 (76.2 ％) 는 또한 CCE를 규정하도록 충분한 임상 데이터를 갖는다. 양성 검사만의 66.7 ％는 음성 검사만의 37.3 ％의 피험자들과 비교하여 CCE를 만족하고 (또는 3.4 [1.3, 9.3]; p=0.009); 2 이상의 양성 검사들의 48.6 ％가 음성 검사만으로 37.3 ％와 비교된 CCE를 검사한다 (또는 1.6 [0.8, 3.0]; p=0.17). 임상 종점의 개별 컴포넌트들의 분석 (IFTA, BPAR, 또는 eGFR) 은 BPAR만이 양성 vs. 음성 검사 (p=0.003) 로 피험자들을 비교할 때 상당한 차이를 보인다는 것을 드러낸다. 패널 14D는 24-개월 연구 기간 내 dnDSA의 발생과 연구 기간 내 임의의 시간 지점에서 표기된 양성만 vs. 음성만 GEP 바이오마커 검사들 사이에 강한 연관이 있다는 것을 보이고 (클래스 I p=0.01; 클래스 II p=0.04); 클래스 II dnDSA는 또한 양성만 vs. 음성만의 1 이상의 사례들과 상당히 연관된다 (p=0.01). 마지막으로, 바이오마커 검사가 KT에 이어 처음 12 개월 내 양성으로 주지될 때, dnDSA 클래스 I는 양성 검사 vs. 음성 검사된 피험자들에서 상당히 보다 높다 (p=0.03).
Figure pct00081
Figure pct00082
Figure pct00083
Figure pct00084
예 8. 치료에 대한 임상 응답의 subAR 유전자 발현 프로파일 분류자의 평가
예 5에서 규정된 subAR 유전자 발현 프로파일 분류자가 불량한 장기 결과들과 상관되는 것으로 확인됨에 따라, 치료에 대한 응답의 상관으로서 분석이 바이오마커 세트를 평가하도록 수행된다.
23 명의 피험자들은 2 주마다 연속 말초 혈액 샘플링을 사용하여 반복되는 8-주 생검을 사용하여, 감시 생검에 이어 subAR의 임상 진단에 이어 집중적인 모니터링을 겪는다. 이 분석의 결과들은 도 9 에 제시된다. 기준과 8-주 생검들 사이의 센터 조직학 판독들이 비교된다: 11 (47.8 ％) (3 치료되지 않은) 명이 조직학 분해능 ('분해된'), 및 12 (52.2 ％) (1 치료되지 않은) 지속성 또는 악화 거부 ('비분해'); 치료를 받은 11/19 (58 ％) 를 포함하여, 12/23의 subAR의 지속성 또는 악화를 입증하였다. subAR 분류자를 사용하여 예측된 확률의 상당한 2 개의 그룹들 사이의 4 (p=0.014) 및 8 (p=0.015) 주에 관찰된다. 값들이 기준 확률들의 차들에 대해 조정될 때, 이들 비교들은 중요하게 남는다. 기준과 4 (p=0.045) 및 8 주 (p=0.023) 사이의 확률 스코어들 (기울기) 의 변화의 변화들이 또한 두 그룹들 사이에 다르다. 두 그룹들에서 기준에서 이식 조직학에 기초하여, '비분해' 그룹은 다른 그룹의 기준선에서 9/11 경계선 및 2 등급 1A 거부들과 비교하여 경계 거부들 (3 등급 (three grade) 1A, 2 AMR, 및 1 경계선 + AMR) 보다 큰 수 및 보다 낮은 비율의 경계 (6/12) 가 입증된다. 2 그룹들 사이의 확률 스코어들의 차들이 통계적 상당성 (p=0.073) 에 도달하지 못하지만, 기준선의 subAR을 갖는 7/11의 환자들이 '분해된” 그룹에서 역치 이하 (바이오마커 음성) 이지만, 8/12는 비분해' 그룹에서 역치 이상 (바이오마커 양성) 이라는 것을 주의한다.
따라서, 바이오마커 데이터는 연속적인 확률 스코어들이 조직학적 분해능과 통계적으로 상관된다는 것을 보여준다. 게다가, 환자들 대부분에서, 기준의 바이오마커가 분해능을 예측하지만, 이 데이터 지점은 통계적 상당성에 도달하지 않는다. 샘플 사이즈가 상대적으로 작지만, 이들 에이터는 subAR의 치료에 대한 응답을 예측하고 연속적으로 모니터링하기 위해 바이오마커의 잠재적 사용을 제안한다. 이들 발견들은 안정한 크레아티닌의 맥락에서, 침습성 생검들의 연속적인 사용 외의 응답을 모니터링하기 위해 현재 이용가능한 대안적인 방법이 없다는 점에서 특히 중요하다.
이들 결과들은 신장 생검들의 “경계선” 변화들 및 IFTA/항체-매개 만성 거부의 발생의 해석에 대한 다른 영향들을 갖는다. 첫째, 본 명세서에 제공된 결과들은 조직학적 subAR의 80 ％ 까지가 두 집단들에서 경계선상 변화들로 구성되지만, 이들은 dnDSA 및 불량 이식 결과들 모두와 연관된다는 것을 명확하게 나타낸다. 둘째, subAR과 발생 dnDSA 및 불량 이식 결과들 사이의 상관은 T-세포 매개 급성 거부가 IFTA 및 만성 거부의 발생에서 연속적인 부분이라는 것을 암시한다.
본 발명의 바람직한 실시예들이 본 명세서에 도시되고 기술되지만, 이러한 실시예들이 단지 예로서 제공되었다는 것이 당업자에게 자명할 것이다. 다수의 변동들, 변화들 및 치환들이 이제 본 발명으로부터 벗어나지 않고 당업자에게 발생할 수 있다. 본 명세서에 기술된 발명의 실시예들에 대한 다양한 대안들이 본 발명을 실시하는데 채용될 수도 있다는 것이 이해되어야 한다. 이하의 청구항들이 본 발명의 범위를 규정하고 방법들 및 구조체들이 이들 청구항들의 범위 및 이들에 의해 커버되는 등가물들 내이도록 의도된다.

Claims (102)

  1. 면역억제제 치료 요법 (immunosuppressant treatment regimen) 중인 신장 이식 수여자 (recipient) 의 이식 우수 신장으로부터 비-이식 우수 신장을 구별하는 방법에 있어서,
    (a) 면역억제제 치료 요법 중인 신장 이식 수여자로부터의 혈액 샘플로부터 도출된 mRNA 또는 상기 면역억제제 치료 요법 중인 상기 신장 이식 수여자로부터의 혈액 샘플로부터 도출된 mRNA의 cDNA 보체들 (complements) 을 제공하는 단계로서, 상기 신장 이식 수여자는 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는, 상기 mRNA 및 mRNA의 cDNA 보체들을 제공하는 단계;
    (b) 상기 혈액 샘플의 유전자 발현 레벨들을 결정하기 위해 상기 면역억제제 치료 요법 중인 상기 신장 이식 수여자로부터의 상기 혈액 샘플로부터 도출된 상기 mRNA 또는 상기 면역억제제 치료 요법 중인 상기 신장 이식 수여자로부터의 혈액 샘플로부터 도출된 mRNA의 상기 cDNA 보체들에 대한 마이크로어레이 분석 또는 서열 분석을 수행하는 단계; 및
    (c) 적어도 상기 단계 (b) 에서 결정된 상기 유전자 발현 레벨들의 서브세트에 훈련된 알고리즘을 적용함으로써 비-이식 우수 신장 또는 이식 우수 신장을 검출하는 단계로서, 상기 훈련된 알고리즘은 비-이식 우수 신장으로부터 이식 우수 신장을 구별하고, 비-이식 우수 신장은 급성 거부, 아급성 거부 (sub-acute Rejection; subAR), 거부 없이 급성 기능 부전 (dysfunction), 및 신장 손상을 가진 신장을 포함하는, 상기 비-이식 우수 신장 또는 이식 우수 신장을 검출하는 단계를 포함하는, 신장 이식 수여자의 이식 우수 신장으로부터 비-이식 우수 신장을 구별하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 훈련된 알고리즘은 이식 우수 신장과 비-이식 우수 신장 사이의 이진 분류를 수행하는, 신장 이식 수여자의 이식 우수 신장으로부터 비-이식 우수 신장을 구별하는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 유전자 발현 레벨들은 표 3 또는 표 4로부터 선택된 적어도 5 개의 유전자들의 레벨들을 포함하는, 신장 이식 수여자의 이식 우수 신장으로부터 비-이식 우수 신장을 구별하는 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 유전자 발현 레벨들은 표 3 또는 표 4의 적어도 10 개의 유전자들, 적어도 20 개의 유전자들, 적어도 40 개의 유전자들, 적어도 50 개의 유전자들, 적어도 60 개의 유전자들, 적어도 70 개의 유전자들, 적어도 80 개의 유전자들, 적어도 90 개의 유전자들 또는 모든 유전자들의 레벨들을 포함하는, 신장 이식 수여자의 이식 우수 신장으로부터 비-이식 우수 신장을 구별하는 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 40 ％ 초과, 65 ％, 70 ％ 초과, 75 ％ 초과, 80 ％ 초과, 85 ％ 초과, 90 ％ 초과, 또는 95 ％ 초과의 PPV (positive predictive value) 를 갖는, 신장 이식 수여자의 이식 우수 신장으로부터 비-이식 우수 신장을 구별하는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 65 ％ 초과, 70 ％ 초과, 75 ％ 초과, 80 ％ 초과, 85 ％ 초과, 90 ％ 초과, 또는 95 ％ 초과의 NPV (negative predictive value) 를 갖는, 신장 이식 수여자의 이식 우수 신장으로부터 비-이식 우수 신장을 구별하는 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 상기 신장 이식 수여자의 이식 우수 상태를 검출하는 단계를 포함하고, 상기 방법은 상기 검출된 이식 우수 상태에 기초하여 신장 이식 수여자에 치료를 시행하는 단계를 더 포함하는, 신장 이식 수여자의 이식 우수 신장으로부터 비-이식 우수 신장을 구별하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 치료는 상기 신장 이식 수여자에 신규 면역억제제 를 투여하는 단계, 상기 신장 이식 수여자의 상기 면역억제제 치료 요법을 계속하는 단계, 또는 상기 면역억제제 도즈량 (dosage) 을 증가시키거나 상기 면역억제제 도즈량을 감소시킴으로써, 상기 신장 이식 수여자의 상기 면역억제제 치료 요법을 조정하는 단계를 포함하는, 신장 이식 수여자의 이식 우수 신장으로부터 비-이식 우수 신장을 구별하는 방법.
  9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
    상기 치료는 상기 신장 이식 수여자로부터 혈액 샘플들을 주기적으로 획득하는 단계 및 비-이식 우수 상태의 마커들 (markers) 에 대해 상기 혈액 샘플들을 모니터링하는 단계를 더 포함하는, 신장 이식 수여자의 이식 우수 신장으로부터 비-이식 우수 신장을 구별하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 혈액 샘플들을 모니터링하는 단계는 표 3 또는 표 4에 열거된 유전자들로부터 적어도 5 개의 유전자들의 발현 레벨들을 검출하는 단계를 포함하는, 신장 이식 수여자의 이식 우수 신장으로부터 비-이식 우수 신장을 구별하는 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 치료는 상기 이식 우수 상태가 적어도 1회, 적어도 연속하여 2 회, 또는 적어도 연속하여 3 회 상기 신장 이식 수여자로부터의 혈액 샘플에서 검출된 후 상기 신장 이식 수여자의 상기 신장 이식의 프로토콜 생검 (protocol biopsy) 을 수행하는 것을 자제하는 것을 포함하는, 신장 이식 수여자의 이식 우수 신장으로부터 비-이식 우수 신장을 구별하는 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 상이한 시기에 신장 이식 수여자로부터 획득된 혈액 샘플 내 유전자 발현 생성물들을 모니터링하는 단계를 포함하고, 상기 마커들은 표 3 또는 표 4로부터 적어도 5 개의 유전자들, 적어도 10 개의 유전자들, 적어도 20 개의 유전자들, 적어도 30 개의 유전자들, 적어도 50 개의 유전자들, 적어도 100 개의 유전자들 또는 모든 유전자들의 mRNA 발현 생성물들인, 신장 이식 수여자의 이식 우수 신장으로부터 비-이식 우수 신장을 구별하는 방법.
  13. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
    상기 치료는 주기적으로 상기 신장 이식 수여자로부터 혈액 샘플들을 획득하는 단계 및 상기 신장 이식 수여자에서 subAR을 검출하기 위해 상기 혈액 샘플들을 모니터링하는 단계를 더 포함하는, 신장 이식 수여자의 이식 우수 신장으로부터 비-이식 우수 신장을 구별하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 신장 이식 수여자에서 subAR을 검출하기 위해 상기 혈액 샘플들을 모니터링하는 단계는 표 5, 표 6 또는 표 8의 적어도 5 개의 유전자들, 적어도 10 개의 유전자들, 적어도 20 개의 유전자들, 적어도 30 개의 유전자들, 적어도 50 개의 유전자들, 또는 모든 유전자들의 mRNA 발현 생성물들을 검출하는 단계를 포함하는, 신장 이식 수여자의 이식 우수 신장으로부터 비-이식 우수 신장을 구별하는 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 상기 신장 이식 수여자에서 비-이식 우수 상태를 검출하고, 그리고 상기 방법은 상기 검출된 비-이식 우수 상태에 기초하여 상기 신장 이식 수여자에 치료를 시행하는 단계를 더 포함하는, 신장 이식 수여자의 이식 우수 신장으로부터 비-이식 우수 신장을 구별하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서,
    상기 치료는 상기 검출된 비-이식 우수 상태를 더 식별하기 위해 상기 신장 이식 수여자에 대한 생검을 수행하는 단계를 포함하는, 신장 이식 수여자의 이식 우수 신장으로부터 비-이식 우수 신장을 구별하는 방법.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 비-이식 우수 상태를 검출하기 위해 상기 신장 이식 수여자로부터의 혈액 샘플들을 모니터링하는 단계를 더 포함하는, 신장 이식 수여자의 이식 우수 신장으로부터 비-이식 우수 신장을 구별하는 방법.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 비-이식 상태는 적어도 2 일 또는 적어도 3 일의 상이한 시기에 상기 신장 이식 수여자로부터 획득된 혈액 샘플들의 표 3 또는 표 4로부터 적어도 5 개의 유전자들, 적어도 10 개의 유전자들의 mRNA 발현 레벨들을 검출함으로써 모니터링되고, 그리고 비-이식 우수 상태로부터 이식 우수 상태를 구별하기 위해 상기 검출된 발현 레벨들에 훈련된 알고리즘을 적용하는 단계를 더 포함하는, 신장 이식 수여자의 이식 우수 신장으로부터 비-이식 우수 신장을 구별하는 방법.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 치료는 상기 신장 이식 수여자의 subAR을 검출하기 위해 상기 혈액 샘플들을 모니터링하는 단계를 더 포함하는, 신장 이식 수여자의 이식 우수 신장으로부터 비-이식 우수 신장을 구별하는 방법.
  20. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 신장 이식 수여자에서 subAR을 검출하기 위해 상기 혈액 샘플들을 모니터링하는 단계는 표 5, 표 6, 또는 표 8의 적어도 5 개의 유전자들, 적어도 10 개의 유전자들, 적어도 20 개의 유전자들, 적어도 30 개의 유전자들, 적어도 50 개의 유전자들, 또는 모든 유전자들의 mRNA 발현 생성물들을 검출하는 단계 및 상기 검출된 mRNA 발현 생성물들에 훈련된 알고리즘을 적용하는 단계를 포함하는, 신장 이식 수여자의 이식 우수 신장으로부터 비-이식 우수 신장을 구별하는 방법.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 상기 검출된 subAR 또는 상기 검출된 비-이식 우수 상태를 치료하기 위해 상기 신장 이식 수여자에 면역억제제 약물을 투여하는 단계를 더 포함하는, 신장 이식 수여자의 이식 우수 신장으로부터 비-이식 우수 신장을 구별하는 방법.
  22. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에서,
    상기 검출된 비-이식 우수 상태 또는 검출된 subAR을 치료하거나 예방하기 위해 상기 신장 이식 수여자에 증가되거나 감소된 도즈의 상기 면역억제제 약물을 투여하는 단계 또는 상기 검출된 비-이식 우수 상태 또는 상기 검출된 subAR을 치료하거나 예방하기 위해 상기 신장 이식 수여자에 신규 면역억제제 약물을 투여하는 단계를 더 포함하는, 신장 이식 수여자의 이식 우수 신장으로부터 비-이식 우수 신장을 구별하는 방법.
  23. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역억제제 약물 또는 상기 신규 면역억제제 약물은 칼시네우린 억제제 (calcineurin inhibitor) 인, 신장 이식 수여자의 이식 우수 신장으로부터 비-이식 우수 신장을 구별하는 방법.
  24. 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역억제제 약물 또는 상기 신규 면역억제제 약물은 mTOR 억제제인, 신장 이식 수여자의 이식 우수 신장으로부터 비-이식 우수 신장을 구별하는 방법.
  25. 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역억제제 약물 또는 신규 면역억제제 약물은 아자티오프린 (azathioprine), 레플루노마이드 (leflunomide), 마이코페놀산 (mycophenolic acid), 마이코페놀레이트 모페틸 (mycophenolate mofetil), 프레드니솔론 (prednisolone), 히드로코르티손 (hydrocortisone), 바실릭시맙 (basiliximab), 알렘투주맙 (alemtuzumab), 다클리주맙 (daclizumab), 벨라타셉트 (belatacept), 올소클론 (orthoclone), 항흉선세포 글로불린 (anti-thymocyte globulin), 항림프구 글로불린 (anti lymphocyte globulin), 항증식 (anti-proliferative) 약물, 및 항-T 세포 항체로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 신장 이식 수여자의 이식 우수 신장으로부터 비-이식 우수 신장을 구별하는 방법.
  26. 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 상기 신장 이식 수여자로부터의 혈액 샘플의 혈청 크레아티닌 레벨 또는 eGFR을 검출하는 단계를 더 포함하는, 신장 이식 수여자의 이식 우수 신장으로부터 비-이식 우수 신장을 구별하는 방법.
  27. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 상기 검출된 subAR, 상기 검출된 비-이식 우수 상태, 또는 상기 검출된 이식 우수 상태를 더 확인하기 위해 혈청 크레아티닌 레벨 또는 eGFR을 사용하는 단계를 더 포함하는, 신장 이식 수여자의 이식 우수 신장으로부터 비-이식 우수 신장을 구별하는 방법.
  28. 면역억제제 약물 요법 중인 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자의 아급성 거부 (subAR) 를 검출하는 방법에 있어서,
    (a) 상기 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 상기 신장 이식 수여자로부터의 혈액 샘플로부터 도출된 mRNA 또는 상기 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 상기 신장 이식 수여자로부터의 혈액 샘플로부터 도출된 mRNA의 cDNA 보체들을 제공하는 단계;
    (b) 유전자 발현 레벨들을 결정하기 위해 상기 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 상기 신장 이식 수여자로부터의 혈액 샘플로부터 도출된 상기 mRNA 또는 상기 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 상기 신장 이식 수여자로부터의 혈액 샘플로부터 도출된 mRNA의 cDNA 보체들에 대한 마이크로어레이 분석 또는 서열 분석을 수행하는 단계로서, 상기 유전자 발현 레벨들은,
    (i) 표 5, 표 6, 또는 표 8로부터 적어도 5 개의 유전자들; 또는
    (ii) 표 5, 표 6, 또는 표 8의 적어도 10 개의 유전자들, 적어도 20 개의 유전자들, 적어도 30 개의 유전자들, 적어도 40 개의 유전자들, 적어도 50 개의 유전자들, 또는 모든 유전자들의 레벨들을 포함하는, 상기 분석을 수행하는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b) 에서 결정된 상기 유전자 발현 레벨들에 훈련된 알고리즘을 적용함으로써 subAR을 검출하거나 subAR의 부재를 검출하는 단계로서, 상기 훈련된 알고리즘은 적어도 60 ％의 NPV 또는 적어도 30 ％의 PPV, 또는 모두를 갖는 subAR 신장으로부터 적어도 이식 우수 신장을 구별하는, 상기 subAR 또는 subAR의 부재를 검출하는 단계를 포함하는, 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자의 아급성 거부 (subAR) 를 검출하는 방법.
  29. 제 28 항에 있어서,
    상기 유전자 발현 레벨들은 표 5, 표 6 또는 표 8의 유전자들 중 적어도 5 개의 레벨들을 포함하는, 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자의 아급성 거부 (subAR) 를 검출하는 방법.
  30. 제 28 항에 있어서,
    상기 훈련된 알고리즘은 78 ％ 초과의 NPV를 갖는 이식 우수 신장으로부터 subAR 신장을 구별하는, 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자의 아급성 거부 (subAR) 를 검출하는 방법.
  31. 제 28 항에 있어서,
    상기 훈련된 알고리즘은 47 ％ 초과의 PPV를 갖는 이식 우수 신장으로부터 subAR 신장을 구별하는, 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자의 아급성 거부 (subAR) 를 검출하는 방법.
  32. 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 신장 이식 수여자는 2.3 ㎎/dL 미만의 혈청 크레아티닌 레벨을 갖는, 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자의 아급성 거부 (subAR) 를 검출하는 방법.
  33. 제 1 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 검출된 subAR을 치료하거나 예방하기 위해 조정된 도즈, 증가된 도즈 또는 감소된 도즈의 상기 면역억제제 약물을 상기 신장 이식 수여자에 투여하는 단계 또는 상기 검출된 subAR을 치료하거나 예방하기 위해 신규 면역억제제 약물을 상기 신장 이식 수여자에 투여하는 단계를 더 포함하는, 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자의 아급성 거부 (subAR) 를 검출하는 방법.
  34. 제 33 항에 있어서,
    상기 면역억제제 약물 또는 상기 신규 면역억제제 약물은 칼시네우린 억제제인, 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자의 아급성 거부 (subAR) 를 검출하는 방법.
  35. 제 33 항에 있어서,
    상기 면역억제제 약물 또는 상기 신규 면역억제제 약물은 mTOR 억제제인, 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자의 아급성 거부 (subAR) 를 검출하는 방법.
  36. 제 33 항에 있어서,
    상기 면역억제제 약물 또는 신규 면역억제제 약물은 아자티오프린, 레플루노마이드, 마이코페놀산, 마이코페놀레이트 모페틸, 프레드니솔론, 히드로코르티손, 바실릭시맙, 알렘투주맙, 다클리주맙, 벨라타셉트, 올소클론, 항흉선세포 글로불린, 항림프구 글루불린, 항증식 약물, 및 항-T 세포 항체로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자의 아급성 거부 (subAR) 를 검출하는 방법.
  37. 제 1 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 치료는 2 이상의 시점들에서 상기 신장 이식 수여자에서 subAR 또는 이식 우수 상태를 검출하기 위해 상기 혈액 샘플들을 모니터링하는 단계를 더 포함하는, 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자의 아급성 거부 (subAR) 를 검출하는 방법.
  38. 제 1 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 혈액 샘플들을모니터링하는 단계는 상기 신장 이식 수여자에서 subAR 또는 이식 우수 상태를 검출하기 위해 표 5, 표 6, 또는 표 8의 적어도 5 개의 유전자들, 적어도 10 개의 유전자들, 적어도 20 개의 유전자들, 적어도 30 개의 유전자들, 적어도 50 개의 유전자들, 또는 모든 유전자들의 mRNA 발현 생성물들을 검출하는 단계를 포함하는, 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자의 아급성 거부 (subAR) 를 검출하는 방법.
  39. 제 1 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 치료는 상기 이식 우수 상태가 적어도 1회, 적어도 연속하여 2 회, 또는 적어도 연속하여 3 회 상기 신장 이식 수여자로부터의 혈액 샘플에서 검출된 후 상기 신장 이식 수여자의 상기 신장 이식의 프로토콜 생검을 수행하는 것을 자제하는 것을 포함하는, 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자의 아급성 거부 (subAR) 를 검출하는 방법.
  40. 제 1 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 상이한 시기에 신장 이식 수여자로부터 획득된 혈액 샘플 내 유전자 발현 생성물들을 모니터링하는 단계를 포함하고, 상기 마커들은 표 5, 표 6 또는 표 8로부터 적어도 5 개의 유전자들, 적어도 10 개의 유전자들, 적어도 20 개의 유전자들, 적어도 30 개의 유전자들, 적어도 50 개의 유전자들, 적어도 100 개의 유전자들 또는 모든 유전자들의 mRNA 발현 생성물들인, 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자의 아급성 거부 (subAR) 를 검출하는 방법.
  41. 제 1 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 치료는 상기 신장 이식 수여자로부터 혈액 샘플들을 주기적으로 획득하는 단계 및 상기 신장 이식 수여자에서 subAR 또는 이식 우수 상태를 검출하기 위해 상기 혈액 샘플들을 모니터링하는 단계를 더 포함하는, 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자의 아급성 거부 (subAR) 를 검출하는 방법.
  42. 제 1 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 상기 신장 이식 수여자에서 검출된 이식 우수 상태, 검출된 비-이식 우수 상태, 또는 검출된 아급성 거부, 또는 이들의 임의의 조합을 모니터링하기 위해 상기 방법을 적어도 1 회, 적어도 2 회, 적어도 3 회, 또는 적어도 4 회 반복하는 단계를 더 포함하는, 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자의 아급성 거부 (subAR) 를 검출하는 방법.
  43. 신장 이식 수여자를 치료하는 방법에 있어서,
    (a) 최초 면역억제제 약물 요법을 상기 신장 이식 수여자에 시행하는 단계;
    (b) 상기 신장 이식 수여자로부터의 혈액 샘플로부터 도출된 mRNA 또는 상기 신장 이식 수여자로부터의 혈액 샘플로부터 도출된 mRNA의 cDNA 보체들을 제공하는 단계로서, 상기 혈액 샘플은 상기 신장 이식 수여자가 상기 최초 면역억제제 약물 요법을 따르는 동안 획득되는, 상기 mRNA 또는 mRNA의 cDNA 보체들을 제공하는 단계;
    (c) 유전자 발현 레벨들을 결정하기 위해, 적어도 상기 신장 이식 수여자로부터 상기 mRNA의 서브세트 또는 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 상기 신장 이식 수여자로부터 상기 mRNA의 상기 DNA 보체들에 대한 마이크로어레이 분석 또는 서열 분석을 수행하는 단계로서, 상기 유전자 발현 레벨들은,
    (i) 표 5, 표 6 또는 표 8로부터 적어도 5 개의 유전자들; 또는
    (ii) 표 5, 표 6, 또는 표 8의 적어도 10 개의 유전자들, 적어도 20 개의 유전자들, 적어도 30 개의 유전자들, 적어도 40 개의 유전자들, 적어도 50 개의 유전자들, 또는 모든 유전자들의 레벨들을 포함하는, 상기 분석을 수행하는 단계;
    (d) 상기 단계 (c) 에서 결정된 상기 유전자 발현 레벨들 (i) 또는 (ii) 에 훈련된 알고리즘을 적용함으로써 상기 신장 이식 수여자의 이식 우수 신장을 식별하는 단계로서, 상기 훈련된 알고리즘은 적어도 60 ％의 NPV 또는 적어도 30 ％의 PPV, 또는 모두를 갖는 subAR 신장으로부터 이식 우수 신장을 구별하는, 상기 식별 단계; 및
    (e) 이식 우수 신장을 갖는 것으로 식별된 상기 신장 수여자에 상기 최초 면역억제제 약물 요법의 시행을 적어도 1 개월 동안 유지하는 단계 또는 이식 우수 신장을 갖는 것으로 식별된 상기 신장 이식 수여자에 시행된 상기 최초 면역억제제 약물 요법을 조정하는 단계를 포함하는, 신장 이식 수여자를 치료하는 방법.
  44. 제 43 항에 있어서,
    상기 최초 면역억제제 약물 요법의 상기 시행은 상기 단계 (d) 에서 상기 이식 우수 신장의 식별에 이어 적어도 3 개월, 적어도 5 개월, 적어도 6 개월, 적어도 8 개월 또는 적어도 1 년 동안 유지되는, 신장 이식 수여자를 치료하는 방법.
  45. 제 43 항에 있어서,
    상기 최초 면역억제제 약물 요법은 상기 신장 이식 수여자에서 급성 거부 또는 subAR이 검출되거나 추측된 (suspect) 후 시행되는, 신장 이식 수여자를 치료하는 방법.
  46. 제 43 항에 있어서,
    상기 최초 면역억제제 약물 요법을 조정하는 단계는 상기 단계 (d) 에서 이식 우수 상태가 식별된 후 상기 최초 면역억제제 약물 요법의 도즈량을 감소시키는 단계를 포함하는, 신장 이식 수여자를 치료하는 방법.
  47. 제 43 항에 있어서,
    상기 최초 면역억제제 약물 요법을 조정하는 단계는 상기 단계 (d) 에서 이식 우수 상태가 식별된 후 신규 면역억제제 약물로 상기 신장 이식 수여자를 치료하는 단계를 포함하는, 신장 이식 수여자를 치료하는 방법.
  48. 제 1 항 내지 제 47 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 최초 면역억제제 약물 또는 상기 신규 면역억제제 약물은 칼시네우린 억제제, mTOR 억제제, 아자티오프린, 레플루노마이드, 마이코페놀산, 마이코페놀레이트 모페틸, 프레드니솔론, 히드로코르티손, 바실릭시맙, 알렘투주맙, 다클리주맙, 벨라타셉트, 올소클론, 항흉선세포 글로불린, 항-림프구 글로불린, 항증식 약물, 및 항-T 세포 항체, 또는 이들의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 신장 이식 수여자를 치료하는 방법.
  49. 제 1 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 상기 단계 (d) 에서 상기 이식 우수 상태가 식별된 후 상기 신장 이식 수여자에 대한 생검을 수행하는 것을 자제하는 단계를 더 포함하는, 신장 이식 수여자를 치료하는 방법.
  50. 제 1 항 내지 제 49 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 상기 방법이 적어도 연속하여 2 회, 적어도 연속하여 3 회, 적어도 연속하여 4 회, 또는 적어도 연속하여 5 회 수행된 후, 상기 단계 (d) 에서 상기 이식 우수 상태가 식별된 후 상기 신장 이식 수여자의 생검을 수행하는 것을 자제하는 단계를 더 포함하는, 신장 이식 수여자를 치료하는 방법.
  51. 제 1 항 내지 제 50 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 며칠, 몇 주, 또는 몇 개월의 기간에 걸쳐 상기 단계 (a), 상기 단계 (b) 및 상기 단계 (c) 를 적어도 1 회, 적어도 2 회, 적어도 3 회, 또는 적어도 4 회 반복하는 단계를 더 포함하는, 신장 이식 수여자를 치료하는 방법.
  52. 제 1 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법이 적어도 연속하여 2 회, 적어도 연속하여 3 회, 적어도 연속하여 4 회, 또는 적어도 연속하여 5 회 수행된 후 상기 단계 (d) 에서 subAR 상태가 상기 훈련된 알고리즘을 사용하여 검출되는, 신장 이식 수여자를 치료하는 방법.
  53. 제 1 항 내지 제 52 항 중 어느 한 항에 있어서,
    subAR 상태가 적어도 연속하여 2 회, 적어도 연속하여 3 회, 적어도 연속하여 4 회, 또는 적어도 연속하여 5 회 검출된 후 상기 신장 이식 수여자에 대한 생검을 수행하는 단계를 더 포함하는, 신장 이식 수여자를 치료하는 방법.
  54. 제 1 항 내지 제 53 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제 1 이식 우수 상태가 검출된 후, subAR 상태가 적어도 연속하여 2 회, 적어도 연속하여 3 회, 적어도 연속하여 4 회, 또는 적어도 연속하여 5 회 검출된 후 상기 면역억제제 약물 요법을 상승시키거나 변화시키는 단계를 더 포함하는, 신장 이식 수여자를 치료하는 방법.
  55. 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자에 대한 신장 생검을 수행하는 방법에 있어서,
    (a) 상기 신장 이식 수여자로부터의 혈액 샘플로부터 도출된 mRNA 또는 상기 신장 이식 수여자로부터의 혈액 샘플로부터 도출된 mRNA의 cDNA 보체들을 제공하는 단계로서, 상기 혈액 샘플은 상기 신장 이식 수여자가 면역억제제 약물 요법 중인 동안 획득되는, 상기 mRNA 또는 mRNA의 cDNA 보체들을 제공하는 단계;
    (b) 유전자 발현 레벨들을 결정하기 위해 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자로부터의 상기 mRNA 또는 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자로부터의 상기 mRNA의 상기 DNA 보체들의 적어도 서브세트에 대한 마이크로어레이 분석 또는 서열 분석을 수행하는 단계로서, 상기 유전자 발현 레벨들은,
    (i) 표 5, 표 6, 또는 표 8로부터 적어도 5 개의 유전자들; 또는
    (ii) 표 5, 표 6 또는 표 8의 적어도 10 개의 유전자들, 적어도 20 개의 유전자들, 적어도 30 개의 유전자들, 적어도 40 개의 유전자들, 적어도 50 개의 유전자들, 또는 모든 유전자들의 레벨들을 포함하는, 상기 분석을 수행하는 단계;
    (c) 상기 단계 (b) 에서 결정된 상기 유전자 발현 레벨들에 훈련된 알고리즘을 적용함으로써 아급성 거부 (subAR) 를 검출하는 단계로서, 상기 훈련된 알고리즘은 적어도 60 ％의 NPV 또는 적어도 30 ％의 PPV, 또는 모두를 갖는 subAR 신장으로부터 이식 우수 신장을 구별하는, 상기 subAR을 검출하는 단계; 및
    (d) 상기 신장 이식 수여자는 subAR을 갖는다는 것을 확인하기 위해 상기 검출된 subAR을 갖는 상기 신장 이식 수여자에 대한 신장 생검을 수행하는 단계를 포함하는, 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자에 대한 신장 생검을 수행하는 방법.
  56. 제 1 항 내지 제 55 항에 있어서,
    상기 신장 생검에 의해 검출된 상기 subAR을 치료하는 단계를 더 포함하는, 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자에 대한 신장 생검을 수행하는 방법.
  57. 제 56 항에 있어서,
    상기 검출된 subAR을 치료하는 단계는 상기 검출된 subAR을 치료하기 위해 상기 신장 이식 수여자에 증가되거나 감소된 도즈의 상기 면역억제제 약물을 투여하거나 상기 검출된 subAR을 치료하기 위해 상기 신장 이식 수여자에 신규 면역억제제 약물을 투여하는 단계를 포함하는, 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자에 대한 신장 생검을 수행하는 방법.
  58. 제 57 항에 있어서,
    상기 면역억제제 약물 또는 상기 신규 면역억제제 약물은 칼시네우린 억제제인, 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자에 대한 신장 생검을 수행하는 방법.
  59. 제 57 항에 있어서,
    상기 면역억제제 약물 또는 상기 신규 면역억제제 약물은 mTOR 억제제인, 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자에 대한 신장 생검을 수행하는 방법.
  60. 제 57 항에 있어서,
    상기 면역억제제 약물 또는 신규 면역억제제 약물은 아자티오프린, 레플루노마이드, 마이코페놀산, 마이코페놀레이트 모페틸, 프레드니솔론, 히드로코르티손, 바실릭시맙, 알렘투주맙, 다클리주맙, 벨라타셉트, 올소클론, 항흉선세포 글로불린, 항-림프구 글로불린, 항증식 약물, 및 항-T 세포 항체로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자에 대한 신장 생검을 수행하는 방법.
  61. 제 1 항 내지 제 60 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 유전자 발현 생성물들을 프로브들 (probes) 과 콘택트시키는 단계를 더 포함하고, 상기 프로브들은 표 5, 표 6 또는 표 8로부터 상기 적어도 5 개의 유전자들에 특이적인 (specific), 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자에 대한 신장 생검을 수행하는 방법.
  62. 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자에 대한 신장 생검을 수행하는 방법에 있어서,
    (a) 상기 신장 이식 수여자로부터의 혈액 샘플로부터 도출된 mRNA 또는 상기 신장 이식 수여자로부터의 혈액 샘플로부터 도출된 mRNA의 cDNA 보체들을 제공하는 단계로서, 상기 혈액 샘플은 상기 신장 이식 수여자가 면역억제제 약물 요법 중인 동안 획득되는, 상기 mRNA 또는 mRNA의 cDNA 보체들을 제공하는 단계;
    (b) 유전자 발현 레벨들을 결정하기 위해 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자로부터의 상기 mRNA 또는 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 상기 신장 이식 수여자로부터의 상기 mRNA의 상기 DNA 보체들의 적어도 서브세트에 대한 마이크로어레이 분석 또는 서열 분석을 수행하는 단계로서, 상기 유전자 발현 레벨들은,
    (i) 표 3 또는 표 4로부터 적어도 5 개의 유전자들; 또는
    (ii) 표 3 또는 표 4의 적어도 10 개의 유전자들, 적어도 20 개의 유전자들, 적어도 30 개의 유전자들, 적어도 40 개의 유전자들, 적어도 50 개의 유전자들, 또는 모든 유전자들을 포함하는, 상기 분석을 수행하는 단계;
    (c) 상기 단계 (b) 에서 결정된 상기 유전자 발현 레벨들에 훈련된 알고리즘을 적용함으로써 비-이식 우수 상태로부터 이식 우수 상태를 구별하는 단계로서, 상기 훈련된 알고리즘은 비-이식 우수 상태로부터 적어도 60 ％의 NPV 또는 적어도 30 ％의 PPV, 또는 모두를 갖는, 이식 우수 신장을 구별하는, 상기 이식 우수 상태를 구별하는 단계; 및
    (d) 상기 신장 이식 수여자가 상기 비-이식 우수 상태를 갖는다는 것을 확인하기 위해 상기 검출된 비-이식 우수 상태를 갖는 상기 신장 이식 수여자에 대한 신장 생검을 수행하는 단계를 포함하는, 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자에 대한 신장 생검을 수행하는 방법.
  63. 제 1 항 내지 제 62 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 신장 생검에 의해 검출된 상기 비-이식 우수 상태를 치료하는 단계를 더 포함하는, 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자에 대한 신장 생검을 수행하는 방법.
  64. 제 1 항 내지 제 63 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 검출된 비-이식 우수 상태를 치료하는 단계는 상기 검출된 비-이식 우수 상태를 치료하기 위해 상기 신장 이식 수여자에 증가되거나 감소된 도즈의 상기 면역억제제 약물을 투여하거나 상기 검출된 비-이식 우수 상태를 치료하기 위해 상기 신장 이식 수여자에 신규 면역억제제 약물에 투여하는 단계를 포함하는, 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자에 대한 신장 생검을 수행하는 방법.
  65. 제 1 항 내지 제 64 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 상기 적어도 5 개의 유전자들에 대해 상기 신장 이식 수여자가 subAR이 발생할 위험을 갖거나 위험에 있는지 여부, 급성 거부 (AR) 위험을 갖거나 위험에 있는지 여부, 잘 기능하는 정상 이식 (TX) 을 갖는지 여부, 또는 비-이식 우수 상태를 갖는 위험을 갖거나 위험에 있는지 여부, 이의 임의의 조합의 지표 (indication) 를 제공하는 값 또는 다른 자격 (designation) 을 상기 신장 이식 수여자의 상기 유전자의 상기 발현 레벨에 할당하는 단계를 더 포함하는, 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자에 대한 신장 생검을 수행하는 방법.
  66. 제 1 항 내지 제 65 항에 있어서,
    상기 방법은 상기 신장 이식 수여자 내로 상기 이식의 도입에 이어 상기 신장 이식 수여자에 대해 상이한 시간들, 예컨대 주간, 월간, 2 개월, 또는 3 개월 인터벌들 (intervals) 로 반복되는, 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자에 대한 신장 생검을 수행하는 방법.
  67. 제 1 항 내지 제 66 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 신장 이식 수여자는 약물을 수용하고, 그리고 상기 결합된 값 또는 자격의 변화는 시간에 따라 상기 약물의 유효성의 지표를 제공하는, 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자에 대한 신장 생검을 수행하는 방법.
  68. 제 1 항 내지 제 67 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 신장 이식 수여자는 상기 단계 (a) 를 수행한 1 개월, 3 개월, 1 년, 2 년, 3 년 또는 5 년 이내에 신장 이식을 겪는, 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자에 대한 신장 생검을 수행하는 방법.
  69. 제 1 항 내지 제 68 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 (a) 의 상기 신장 이식 수여자로부터의 상기 샘플은 혈액 샘플이고, 전혈 (whole blood), 말초 혈액 (peripheral blood), 혈청, 혈장, PBL들, PBMC들, T 세포들, CD4 T 세포들 CD8 T 세포들, 또는 대식세포들을 포함하는, 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자에 대한 신장 생검을 수행하는 방법.
  70. 제 1 항 내지 제 69 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 검출 단계에 응답하여, 상기 신장 이식 수여자의 치료 방식을 변화시키는 단계를 더 포함하는, 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자에 대한 신장 생검을 수행하는 방법.
  71. 제 1 항 내지 제 70 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 신장 이식 수여자는 상기 방법들을 수행하기 전 약물을 수용했고, 그리고 상기 치료 방식을 변화시키는 단계는 부가적인 약물을 투여하는 단계, 보다 높은 도즈의 동일한 약물을 투여하는 단계, 보다 낮은 도즈의 동일한 약물을 투여하는 단계 또는 동일한 약물을 투여를 중단하는 단계를 포함하는, 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자에 대한 신장 생검을 수행하는 방법.
  72. 제 1 항 내지 제 71 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 (c) 에서의 검출이 상기 신장 이식 수여자가 subAR의 위험을 갖거나 위험에 있다는 지표를 제공하면, subAR 또는 이의 위험을 검출하기 위한 부가적인 절차를 수행하는 단계를 더 포함하는, 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자에 대한 신장 생검을 수행하는 방법.
  73. 제 1 항 내지 제 72 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 부가적인 절차는 신장 생검인, 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자에 대한 신장 생검을 수행하는 방법.
  74. 제 1 항 내지 제 73 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 (c) 는 컴퓨터에 의해 수행되는, 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자에 대한 신장 생검을 수행하는 방법.
  75. 제 1 항 내지 제 74 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 신장 이식 수여자는 인간인, 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자에 대한 신장 생검을 수행하는 방법.
  76. 제 1 항 내지 제 75 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적어도 5 개의 유전자들 각각에 대해, 상기 단계 (c) 는 상기 신장 이식 수여자의 상기 유전자의 상기 발현 레벨을 subAR과 연관된 상기 유전자의 하나 이상의 기준 발현 레벨들 또는 이식 거부 (TX) 의 결핍과 비교하는 단계를 포함하는, 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자에 대한 신장 생검을 수행하는 방법.
  77. 제 1 항 내지 제 76 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 훈련된 알고리즘은 50 개 미만의 유전자들, 80 개 미만의 유전자들, 100 개 미만의 유전자들, 150 개 미만의 유전자들, 200 개 미만의 유전자들, 300 개 미만의 유전자들, 500 개 미만의 유전자들, 또는 1000 개 미만의 유전자들의 발현 레벨들에 적용되는, 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자에 대한 신장 생검을 수행하는 방법.
  78. 제 1 항 내지 제 77 항 중 어느 한 항에 있어서,
    100 개까지 또는 1000 개까지의 유전자들의 상기 발현 레벨들이 결정되는, 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자에 대한 신장 생검을 수행하는 방법.
  79. 제 1 항 내지 제 78 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 발현 레벨들은 상기 mRNA 레벨 또는 상기 단백질 레벨로 결정되는, 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자에 대한 신장 생검을 수행하는 방법.
  80. 제 1 항 내지 제 79 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 발현 레벨들은 정량적 PCR, 어레이에 대한 혼성화 (hybridization) 또는 서열 분석에 의해 결정되는, 안정한 크레아티닌 레벨을 갖는 신장 이식 수여자에 대한 신장 생검을 수행하는 방법.
  81. 면역억제제 약물 요법 중인 신장 이식 수여자를 치료하는 방법에 있어서,
    (a) 관심 있는 핵산들을 획득하는 단계로서, 상기 관심 있는 핵산들은 상기 이식 수여자로부터의 혈액 샘플로부터 도출된 mRNA 또는 상기 이식 수여자로부터의 혈액 샘플로부터 도출된 mRNA의 cDNA 보체들을 포함하고, 상기 이식 수여자는 안정한 혈청 크레아티닌을 갖는, 상기 관심 있는 핵산들을 획득하는 단계;
    (b) 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 또는 표 8로부터 선택된 적어도 5 개의 유전자들의 발현 레벨들을 검출하도록 상기 단계 (a) 에서 획득된 상기 관심 있는 핵산들에 대한 마이크로어레이 분석 또는 차세대 서열 분석을 수행하는 단계;
    (c) 상기 단계 (b) 에서 검출된 상기 발현 레벨들에 기초하여 무증상 (subclinical) 급성 거부를 검출하는 단계; 및
    (d) 상기 단계 (c) 에서 검출된 상기 무증상 급성 거부를 치료하기 위해 상기 이식 수여자에 신규 면역억제제 약물 또는 보다 높은 도즈의 상기 면역억제제 약물을 투여하는 단계를 포함하는, 면역억제제 약물 요법 중인 신장 이식 수여자를 치료하는 방법.
  82. 제 1 항 내지 제 81 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 관심 있는 핵산들을 프로브들과 콘택트시키는 단계를 더 포함하고, 상기 프로브들은 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 또는 표 8로부터 선택된 상기 적어도 5 개의 유전자들에 대해 특이적인, 면역억제제 약물 요법 중인 신장 이식 수여자를 치료하는 방법.
  83. 제 1 항 내지 제 82 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 (a) 내지 상기 단계 (c) 를 반복한 후 상기 신규 면역억제제 약물의 투여를 중단하는 단계를 포함하는, 면역억제제 약물 요법 중인 신장 이식 수여자를 치료하는 방법.
  84. 제 1 항 내지 제 83 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 (a) 에서 획득된 상기 핵산들의 마이크로어레이 분석을 수행하는 단계를 더 포함하는, 면역억제제 약물 요법 중인 신장 이식 수여자를 치료하는 방법.
  85. 개선된 샘플 분류의 자동화된, 컴퓨터 구현된 방법에 있어서,
    (a) 안정한 크레아티닌 값을 갖는 신장 이식 수여자로부터의 혈액 샘플로부터 도출된 샘플 유전자 발현 데이터를 제공하는 단계;
    (b) 적어도 2-웨이 (two-way) 분류자 세트를 제공하는 단계로서, 상기 2-웨이 분류자 세트는 이식 우수 신장과 아급성 임상 거부를 갖는 신장 사이를 구별할 수 있고, 상기 분류자 세트는,
    (i) 표 5, 표 6 또는 표 8로부터 적어도 5 개의 유전자들; 또는
    (ii) 표 5, 표 6, 또는 표 8의 적어도 10 개의 유전자들, 적어도 20 개의 유전자들, 적어도 30 개의 유전자들, 적어도 40 개의 유전자들, 적어도 50 개의 유전자들, 또는 모든 유전자들을 포함하는, 상기 2-웨이 분류자 세트를 제공하는 단계;
    (c) 분류 규칙 또는 확률 유사 방정식을 사용하여 상기 적어도 2-웨이 분류자 세트를 상기 샘플 데이터에 적용하는 단계; 및
    (d) 상기 샘플에 대한 분류를 출력하기 위해 상기 분류 규칙 또는 확률 유사 방정식을 사용하는 단계로서, 상기 분류는 적어도 60 ％의 NPV 또는 적어도 30 ％의 PPV, 또는 모두를 갖는 무증상 급성 거부를 가질 확률을 갖는 샘플로 분류하는, 상기 분류 규칙 또는 확률 유사 방정식을 사용하는 단계를 포함하는, 개선된 샘플 분류의 자동화된, 컴퓨터 구현된 방법.
  86. 제 1 항 내지 제 85 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 분류는 DLDA, 최근접 중심 (Nearest Centroid), 랜덤 포레스트 (Random Forest), 또는 PAMs (Prediction Analysis of Microarrays) 에 의해 달성되는, 개선된 샘플 분류의 자동화된, 컴퓨터 구현된 방법.
  87. 제 1 항 내지 제 86 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적어도 2-웨이 분류자 세트는 이식 우수 신장과 아급성 임상 거부 신장 사이를 구별하는 능력에 관한 p-값에 의해 프로브 세트들의 랭크를 결정함으로써 (rank) 획득되는, 개선된 샘플 분류의 자동화된, 컴퓨터 구현된 방법.
  88. 제 1 항 내지 제 87 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 샘플에 대한 분류를 출력하는 단계는 컴퓨터 네트워크를 통해 최종 사용자로의 송신을 포함하는, 개선된 샘플 분류의 자동화된, 컴퓨터 구현된 방법.
  89. 제 1 항 내지 제 88 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 최종 사용자는 상기 혈액 샘플이 도출된 환자, 또는 상기 샘플이 도출된 상기 환자의 의사 또는 간병인인, 개선된 샘플 분류의 자동화된, 컴퓨터 구현된 방법.
  90. 제 1 항 내지 제 89 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 컴퓨터 네트워크는 상기 Internet, 상기 Internet과 통신하는, 인터넷 또는 엑스트라넷 (extranet), 또는 인트라넷 (intranet) 및/또는 엑스트라넷인, 개선된 샘플 분류의 자동화된, 컴퓨터 구현된 방법.
  91. 제 1 항 내지 제 90 항 중 어느 한 항에 있어서,
    최종 사용자로의 송신은 로컬 컴퓨터 상의 웹-기반 애플리케이션 (web-based application) 으로의 송신 또는 모바일 디지털 프로세싱 디바이스로 제공된 모바일 애플리케이션으로의 송신을 포함하는, 개선된 샘플 분류의 자동화된, 컴퓨터 구현된 방법.
  92. 개선된 샘플 분류의 자동화된, 컴퓨터 구현된 방법에 있어서,
    (a) 안정한 크레아티닌 값을 갖는 신장 이식 수여자로부터의 혈액 샘플로부터 도출된 샘플 유전자 발현 데이터를 제공하는 단계;
    (b) 적어도 2-웨이 분류자 세트를 제공하는 단계로서, 상기 2-웨이 분류자 세트는 이식 우수 신장과 비-이식 우수 신장 사이를 구별할 수 있고, 상기 분류자 세트는,
    (i) 표 3 또는 표 4로부터 적어도 5 개의 유전자들; 또는
    (ii) 표 3 또는 표 4의 적어도 10 개의 유전자들, 적어도 20 개의 유전자들, 적어도 30 개의 유전자들, 적어도 40 개의 유전자들, 적어도 50 개의 유전자들, 또는 모든 유전자들을 포함하는, 상기 적어도 2-웨이 분류자 세트를 제공하는 단계;
    (c) 분류 규칙 또는 확률 유사 방정식을 사용하여 상기 샘플 데이터에 상기 적어도 2-웨이 분류자 세트를 적용하는 단계; 및
    (d) 상기 샘플에 대한 분류를 출력하기 위해 상기 분류 규칙 또는 확률 유사 방정식을 사용하는 단계로서 상기 분류는 비-이식 우수 신장으로부터 이식 우수 신장을 구별하고, 비-이식 우수 신장은 급성 거부, 아급성 거부, 거부 없이 급성 기능 부전, 및 신장 손상을 가진 신장을 포함하는, 상기 분류 규칙 또는 확률 유사 방정식을 사용하는 단계를 포함하는, 개선된 샘플 분류의 자동화된, 컴퓨터 구현된 방법.
  93. 제 1 항 내지 제 92 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 분류는 DLDA, 최근접 중심, 랜덤 포레스트, 또는 PAM들에 의해 달성되는, 개선된 샘플 분류의 자동화된, 컴퓨터 구현된 방법.
  94. 제 1 항 내지 제 93 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적어도 2-웨이 분류자 이식 우수 신장과 비-이식 우수 신장 사이를 구별하는 능력에 관한 p-값에 의해 프로브 세트들의 랭크를 결정함으로써 획득되는, 개선된 샘플 분류의 자동화된, 컴퓨터 구현된 방법.
  95. 제 1 항 내지 제 94 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 샘플에 대한 분류를 출력하는 컴퓨터 네트워크를 통해 최종 사용자로의 송신을 포함하는, 개선된 샘플 분류의 자동화된, 컴퓨터 구현된 방법.
  96. 제 1 항 내지 제 95 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 최종 사용자는 상기 혈액 샘플이 도출된 환자, 또는 상기 샘플이 도출된 상기 환자의 의사 또는 간병인인, 개선된 샘플 분류의 자동화된, 컴퓨터 구현된 방법.
  97. 제 1 항 내지 제 96 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 컴퓨터 네트워크는 상기 Internet, 상기 Internet과 통신하는, 인터넷 또는 엑스트라넷, 또는 인트라넷 및/또는 엑스트라넷인, 개선된 샘플 분류의 자동화된, 컴퓨터 구현된 방법.
  98. 제 1 항 내지 제 97 항 중 어느 한 항에 있어서,
    최종 사용자로의 송신은 로컬 컴퓨터 상의 웹-기반 애플리케이션으로의 송신 또는 모바일 디지털 프로세싱 디바이스로 제공된 모바일 애플리케이션으로의 송신을 포함하는, 개선된 샘플 분류의 자동화된, 컴퓨터 구현된 방법.
  99. 개선된 샘플 분류 애플리케이션을 생성하기 위해 적어도 하나의 프로세서에 의해 실행가능한 인스트럭션들 (instructions) 을 포함하는 컴퓨터 프로그램으로 인코딩된 비일시적 컴퓨터 판독가능 저장 매체에 있어서,
    (a) 안정한 크레아티닌 값을 갖는 신장 이식 수여자로부터의 혈액 샘플로부터 도출된 샘플 데이터를 수신하기 위한 소프트웨어 모듈;
    (b) 상기 매체 상에 저장된 적어도 2-웨이 분류자 세트로서, 상기 2-웨이 분류자 세트는 이식 우수 신장과 아급성 임상 거부 신장 사이를 구별할 수 있고, 상기 분류자 세트는,
    (i) 표 5, 표 6 또는 표 8로부터 적어도 5 개의 유전자들; 또는
    (ii) 표 5, 표 6, 또는 표 8의 적어도 10 개의 유전자들, 적어도 20 개의 유전자들, 적어도 30 개의 유전자들, 적어도 40 개의 유전자들, 적어도 50 개의 유전자들, 또는 모든 유전자들을 포함하는, 상기 2-웨이 분류자 세트;
    (c) 분류 규칙 또는 확률 유사 방정식을 사용하여 상기 적어도 2-웨이 분류자 세트를 상기 샘플 데이터에 적용하기 위한 소프트웨어 모듈; 및
    (d) 상기 샘플에 대한 분류를 출력하기 위해 상기 분류 규칙 또는 확률 유사 방정식을 사용하기 위한 소프트웨어 모듈을 포함하고, 상기 분류는 적어도 60 ％의 NPV 또는 적어도 30 ％의 PPV, 또는 모두를 갖는 무증상 급성 거부를 가질 확률을 갖는 샘플로 분류하는, 비일시적 컴퓨터 판독가능 저장 매체.
  100. 제 86 항에 있어서,
    상기 적어도 2-웨이 분류자 세트는 이식 우수 신장과 아급성 임상 거부 신장 사이를 구별하는 능력에 관한 p-값에 의해 프로브 세트들의 랭크를 결정함으로써 획득되는, 비일시적 컴퓨터 판독가능 저장 매체.
  101. 개선된 샘플 분류 애플리케이션을 생성하기 위해 적어도 하나의 프로세서에 의해 실행가능한 인스트럭션들을 포함하는 컴퓨터 프로그램으로 인코딩된 비일시적 컴퓨터 판독가능 저장 매체에 있어서,
    (a) 안정한 크레아티닌 값을 갖는 신장 이식 수여자로부터의 혈액 샘플로부터 도출된 샘플 데이터를 수신하기 위한 소프트웨어 모듈;
    (b) 상기 매체 상에 저장된 적어도 2-웨이 분류자 세트로서, 상기 2-웨이 분류자 세트는 이식 우수 신장과 비-이식 우수 신장 사이를 구별할 수 있고, 상기 분류자 세트는,
    (i) 표 3 또는 표 4로부터 적어도 5 개의 유전자들; 또는
    (ii) 표 3 또는 표 4의 적어도 10 개의 유전자들, 적어도 20 개의 유전자들, 적어도 30 개의 유전자들, 적어도 40 개의 유전자들, 적어도 50 개의 유전자들, 또는 모든 유전자들을 포함하는, 상기 적어도 2-웨이 분류자 세트;
    (c) 분류 규칙 또는 확률 유사 방정식을 사용하여 상기 샘플 데이터에 상기 적어도 2-웨이 분류자 세트를 적용하기 위한 소프트웨어 모듈; 및
    (d) 상기 샘플에 대한 분류를 출력하기 위해 상기 분류 규칙 또는 확률 유사 방정식을 사용하기 위한 소프트웨어 모듈을 포함하고, 상기 분류는 비-이식 우수 신장으로부터 이식 우수 신장을 구별하고, 비-이식 우수 신장은 급성 거부, 아급성 거부, 거부 없이 급성 기능 부전, 및 신장 손상을 가진 신장을 포함하는, 비일시적 컴퓨터 판독가능 저장 매체.
  102. 제 88 항에 있어서,
    상기 적어도 2-웨이 분류자 세트는 이식 우수 신장과 아급성 임상 거부 신장 사이를 구별하는 능력에 관한 p-값에 의해 프로브 세트들의 랭크를 결정함으로써 획득되는, 비일시적 컴퓨터 판독가능 저장 매체.
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