WO2021256479A1 - 麦芽発酵液の製造方法 - Google Patents

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WO2021256479A1
WO2021256479A1 PCT/JP2021/022784 JP2021022784W WO2021256479A1 WO 2021256479 A1 WO2021256479 A1 WO 2021256479A1 JP 2021022784 W JP2021022784 W JP 2021022784W WO 2021256479 A1 WO2021256479 A1 WO 2021256479A1
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malt
fermentation
liquid
yeast
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美穂 三好
忠広 砂川
ゆき 大内
智正 神田
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アサヒグループホールディングス株式会社
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    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a fermented liquid having a low ethanol concentration and a fruity aroma using malt saccharified as a raw material, and a method for producing a beverage containing the fermented liquid produced by the production method as a raw material.
  • a rice flour saccharified fermented beverage having excellent digestibility and absorption can be obtained.
  • a specific strain of Kluyveromyces marxianus which is a yeast isolated from kefir, as the yeast used at this time, rice flour that can utilize the sweetness of the rice flour saccharified solution itself in a fruity manner.
  • a saccharified fermented beverage can be obtained (Non-Patent Document 1).
  • Kluiberomyces marxianus has the ability to produce ethyl acetate from lactose only under aeration conditions (Non-Patent Document 2).
  • the present invention is a method for producing a malt fermented liquid having a low ethanol concentration and a fruity aroma, a method for producing a malt fermented beverage using the malt fermented liquid produced by the production method, and a method for producing the malt fermented beverage.
  • the purpose is to provide a fermented malt beverage.
  • the present inventors have used Kluyveromyces marxianus yeast, which has not been used for fermentation of a fermentation raw material solution containing malt saccharified product, for aeration. It was found that by performing fermentation, the production of ethanol is suppressed, and instead the production of aroma components such as esters is promoted, so that a malt fermented liquid having a fruity aroma and a low ethanol concentration can be produced.
  • the present invention has been completed.
  • the method for producing a fermented malt liquid, the method for producing a fermented malt beverage, and the fermented malt beverage according to the present invention are described in the following [1] to [10].
  • [1] A method for producing a malt fermented liquor, which comprises a step of inoculating a yeast of the Kluy veromyces marxianus species into a fermentation raw material liquor containing a saccharified malt and aerating the fermentation.
  • [3] The method for producing a fermented malt solution according to the above [1] or [2], which comprises producing a fermented malt solution having a propyl acetate concentration of 0.1 ppm (mg / L) or more.
  • [4] The method for producing a fermented malt solution according to any one of [1] to [3] above, which comprises producing a fermented malt solution having an ethanol concentration of 0.5% (vol / vol) or less.
  • [5] The method for producing a fermented malt solution according to any one of [1] to [4] above, which comprises producing a fermented malt solution having an ethyl acetate concentration of 50 ppm (mg / L) or more.
  • a method for producing a fermented malt beverage which comprises using the fermented malt solution obtained by the method for producing a fermented malt solution according to any one of [1] to [5] as a raw material to produce a fermented malt beverage.
  • the method for producing a fermented malt beverage according to [6] which comprises a step of diluting the fermented malt liquid.
  • a fermented malt beverage having a propyl acetate concentration of 0.1 ppm (mg / L) or more and an ethanol concentration of 0.5% (vol / vol) or less.
  • the malt fermented beverage according to the above [9] which is a beer-like effervescent beverage.
  • the ethanol-producing ability is low, and esters such as ethyl acetate, isoamyl acetate, ⁇ -phenethyl acetate, and propyl acetate, and alcohols having 3 or more carbon atoms such as isoamyl alcohol and ⁇ -phenethyl alcohol. It is fermented by aeration using yeast of the Kluy veromyces marxianus species, which has a high production capacity. Therefore, according to the method for producing a malt fermented liquid according to the present invention, it is possible to provide a malt fermented liquid having a low ethanol concentration and a fruity aroma. Further, by using the malt fermented liquid, it is possible to provide a malt fermented beverage having a low ethanol concentration and a fruity aroma.
  • the "malt fermented beverage” means a beverage produced by using malt or a processed product thereof as a raw material and undergoing a fermentation step with yeast.
  • the fermented malt beverage may be an alcoholic beverage, or may be a so-called non-alcoholic beverage or a low-alcoholic beverage having an ethanol concentration of less than 1.0% (vol / vol).
  • the ethanol concentration is preferably less than 0.5% (vol / vol), more preferably less than 0.1% (vol / vol), and further less than 0.05% (vol / vol). preferable.
  • malt fermented beverage examples include beer-like sparkling beverages.
  • the "beer-like effervescent beverage” has a flavor, taste and texture equivalent to or similar to that of beer, and has a beer-like taste (a taste pronounced of beer in terms of flavor).
  • Means sex drink Specific examples of the malt-fermented beer-like sparkling beverage include beer and sparkling wine made from malt.
  • liqueurs obtained by mixing malt fermented liquid with ethanol-containing distilled liquid may be used.
  • the ethanol-containing distillation solution is a solution containing ethanol obtained by a distillation operation, and may be, for example, alcohol (ethanol) for raw materials, such as whiskey, brandy, wokca, lamb, tequila, gin, and shochu. Distilled liquor (spirits) or the like can be used.
  • the method for producing a malt fermented liquid according to the present invention includes a step of inoculating a fermentation raw material liquid containing malt saccharified product with yeast of Kluyveromyces marxianus species and aerating fermentation.
  • the yeast of the Kluy veromyces marxianus species has a lower ethanol-producing ability during aeration fermentation than the Saccharomyces yeast, and instead has a higher ability to produce aroma components such as esters and alcohols having 3 or more carbon atoms.
  • a fermented liquid having a low ethanol concentration and rich in esters such as ethyl acetate, isoamyl acetate, ⁇ -phenethyl acetate, and propyl acetate can be obtained.
  • the yeast used in the present invention is not particularly limited as long as it is a yeast of the Kruivelomyces marxianus species. From the viewpoint of safety when the produced malt fermented liquid is applied to foods and drinks, it is preferable to use Kluyveromyces marxianus yeast isolated from foods and drinks, their materials, and edible animals and plants. These Kluy Bello Mrs. Marxianus yeasts are available from strain storage organizations and distributors such as the Biotechnology Center (NBRC), National Collection of Yeast Culture (NCYC), Incorporated Administrative Agency, Product Evaluation Technology Infrastructure Organization. It can be appropriately selected and used from the strains of Mrs. Marxianus.
  • NBRC Biotechnology Center
  • NCYC National Collection of Yeast Culture
  • NCYC National Collection of Yeast Culture
  • Product Evaluation Technology Infrastructure Organization It can be appropriately selected and used from the strains of Mrs. Marxianus.
  • the fermentation raw material liquid infused and fermented with Kluyberomyces marxianus yeast contains malt saccharified product, and a carbon source or nitrogen source that can be assimilated by Kluyberomyces marxianus seed yeast is used.
  • a carbon source or nitrogen source that can be assimilated by Kluyberomyces marxianus seed yeast is used.
  • it is not particularly limited.
  • it may consist only of malt saccharified product, or may contain a carbon source or nitrogen source other than malt saccharified product.
  • malt saccharified product is a saccharified product of saccharides in malt with various enzymes.
  • the enzyme used for the saccharification treatment may be an enzyme originally contained in malt or an enzyme derived from other than malt.
  • a saccharified product is obtained by amylase derived from malt.
  • a saccharifying enzyme derived from other than malt may be further added, or an enzyme other than the saccharifying enzyme such as a proteolytic enzyme may be used in combination.
  • wort or malt extract can be used as the saccharified product of malt.
  • Malt extract is a concentrated wort and contains maltose as a main component.
  • the malt extract is used as it is in carbonated water to make a beverage, or as a raw material for food and drink.
  • Concentration of wort can be performed by a conventional method. Concentration under reduced pressure is preferable because the influence on the components in the wort is suppressed, but it can also be concentrated by heating to remove the solvent.
  • Wort is prepared by preparing a mixture containing malt and raw water, heating it, and saccharifying the starch of the malt.
  • the malt is preferably used as a crushed malt obtained by crushing.
  • the malt crushing treatment can be carried out by a conventional method.
  • the malt crushed product may be a product which has been subjected to a treatment usually performed before and after the crushing treatment.
  • the mixture containing malt and raw water may contain fermented raw materials other than malt.
  • the fermentation raw material may be a grain raw material or a sugar raw material.
  • grain raw materials other than malt include wheat such as barley and wheat, beans such as rice, corn and soybean, and potatoes.
  • the grain raw material can also be used as a grain crushed product, a grain syrup, a grain extract and the like.
  • the grain crushed product may be a product which has been subjected to a treatment usually performed before and after the crushing treatment, such as cornstarch and corn grits.
  • the sugar raw material include sugars such as liquid sugar.
  • Wort may be used as it is as a fermentation raw material liquid, but it is preferable to carry out boiling treatment before inoculating yeast.
  • boiling treatment sterilization can be performed and fermentation can be performed more safely.
  • the filtration treatment is not particularly limited, and can be appropriately selected and used from the solid-liquid separation treatments generally performed in the manufacturing process of foods and drinks such as diatomaceous earth filtration and filter filtration. Further, instead of the filtrate of this sugar solution, a malt extract to which warm water is added may be used and boiled. The boiling method and its conditions can be appropriately determined.
  • a malt fermented liquid having a desired flavor can be produced by appropriately adding herbs or the like before or during the boiling treatment.
  • hops are preferably added before or during the boiling process.
  • the amount of hops added, the mode of addition (for example, addition in several portions) and the boiling conditions can be appropriately determined.
  • the boiled wort removes the dregs such as proteins generated by the precipitation before inoculating the yeast.
  • the residue may be removed by any solid-liquid separation treatment, but generally, the precipitate is removed using a tank called a whirlpool.
  • the temperature of the broth at this time may be 15 ° C. or higher, and is generally about 50 to 80 ° C.
  • the clear wort (filtrate) is cooled to an appropriate fermentation temperature by a plate cooler or the like. The wort after removing the lees becomes the fermentation raw material liquid.
  • Fermentation is performed by inoculating the cooled fermentation raw material liquid with Kluy veromyces marxianus yeast.
  • the cooled fermentation raw material liquid may be subjected to fermentation as it is, or may be subjected to fermentation after adjusting to a desired extract concentration.
  • the fermentation raw material liquid inoculated with Kluy veromyces marxianus seed yeast preferably has a Brix of 4 ° to 20 °, more preferably a Brix of 7 ° to 18 °, and 9 ° to 16 °. It is more preferably °, and even more preferably 10 ° to 14 °.
  • the Brix value of the fermentation raw material liquid can be measured by a conventional method using a measuring device such as a refractometer (RX-5000 ⁇ , manufactured by Atago Co., Ltd.).
  • a malt fermented liquor can be obtained by performing aeration fermentation on the fermented raw material liquor inoculated with Kluy veromyces marxianus seed yeast.
  • Kluy veromyces marxianus seed yeast By fermenting Kluiberomyces malxianus yeast under aerobic conditions, ethanol production is further suppressed, and the production of esters and alcohols having 3 or more carbon atoms is higher, and the aroma is superior and low.
  • a fermented malt solution having an ethanol concentration is obtained.
  • Aeration fermentation is fermentation performed under aerobic conditions in which oxygen and air can be supplied into the medium, and can be performed by a conventional method.
  • a shaking culture method, a stirring culture method, and an aeration stirring culture method can be used.
  • the stirring conditions and the aeration amount of air and oxygen gas may be selected as long as they can keep the culture environment aerobic, and may be appropriately selected depending on the culture apparatus, the viscosity of the medium, and the like.
  • Air or oxygen gas can be continuously or intermittently aerated so as to be (for example, 1 ppm (mg / L)) or more.
  • the fermentation conditions in the method for producing a malt fermented liquid according to the present invention are appropriately selected from among general yeast fermentation conditions that can maintain an aerobic culture environment at the time of fermentation, and if necessary. Can be modified.
  • the fermentation temperature is 0 to 35 ° C, preferably 12 to 28 ° C, more preferably 15 to 25 ° C.
  • esters and alcohols having 3 or more carbon atoms can be efficiently produced by Kluyveromyces marxianus yeast.
  • the fermentation time is not particularly limited, but is preferably 7 days or less, more preferably 4 days or less, and even more preferably 3 days or less.
  • the malt fermented liquid produced in this way has a low ethanol concentration and a high content of aroma components.
  • the aroma component include ethyl acetate, isoamyl acetate, isoamyl alcohol, ⁇ -phenethyl acetate (1-phenylethyl acetate), ⁇ -phenethyl alcohol (2-phenylethanol), and propyl acetate. These are the causative components of the fruity aroma, and since the content of these components is high, the malt fermented liquid obtained by aerial fermentation of Kluy veromyces marxianus yeast is excellent in the fruity aroma.
  • the ethanol concentration of the malt fermented liquid obtained by the present invention is not particularly limited.
  • the ethanol concentration of the produced malt fermented liquid is less than 1.0% (vol / vol) and 0.5% (vol). / Vol) or less, more preferably 0.25% (vol / vol) or less, and even more preferably 0.15% (vol / vol) or less.
  • the ethanol concentration of the fermented malt liquid or the beverage is determined by, for example, an enzyme method using a multifunctional biosensor BF-5 (manufactured by Oji Measuring Instruments), a distillation-density (specific gravity) method, or a gas chromatograph. It can be measured by a tograph (GC: Gas Chromatography) analysis method, an oxidation method, or the like.
  • a multifunctional biosensor BF-5 manufactured by Oji Measuring Instruments
  • a distillation-density (specific gravity) method or a gas chromatograph. It can be measured by a tograph (GC: Gas Chromatography) analysis method, an oxidation method, or the like.
  • the malt fermented liquor obtained by the present invention preferably contains propyl acetate equal to or higher than the detection limit.
  • Propyl acetate is an ester produced by aeration fermentation with Kluyberomyces marxianus yeast, which is rarely detected in fermented liquor fermented with Saccharomyces yeast or Pikia yeast used in conventional fermentation. be.
  • the propyl acetate concentration of the fermented malt solution obtained by the present invention is not particularly limited.
  • the propyl acetate concentration of the produced malt fermented liquid is preferably 0.1 ppm (mg / L) or more, preferably 0.4 ppm (mg / L). L) or more is more preferable, and 0.7 ppm or more (mg / L) is further preferable.
  • the propyl acetate concentration of the produced malt fermented liquid is preferably 20.0 ppm (mg / L) or less, preferably 15.0 ppm (mg / L). L) or less is more preferable, and 10.0 ppm or less (mg / L) is further preferable.
  • the ethyl acetate concentration of the fermented malt solution obtained by the present invention is not particularly limited.
  • the ethyl acetate concentration of the produced malt fermented liquid is preferably 50 ppm (mg / L) or more, and 100 ppm (mg / L) or more. More preferably, 150 ppm (mg / L) or more is further preferable.
  • the ethyl acetate concentration of the produced malt fermented liquid is preferably 500.0 ppm (mg / L) or less, preferably 450.0 ppm (mg / L). L) or less is more preferable, and 400.0 ppm (mg / L) or less is further preferable.
  • the malt fermented liquid obtained by the present invention also contains a large amount of isoamyl acetate and isoamyl alcohol.
  • the isoamyl acetate concentration and the isoamyl alcohol concentration of the malt fermented liquid obtained by the present invention are not particularly limited.
  • the total concentration of isoamyl acetate and isoamyl alcohol in the produced malt fermented liquid is preferably 15 ppm (mg / L) or more, preferably 30 ppm (mg). / L) or more is more preferable.
  • the malt fermented liquid obtained by the present invention also contains a large amount of ⁇ -phenethyl acetate and ⁇ -phenethyl alcohol.
  • concentration of ⁇ -phenethyl acetate and the concentration of ⁇ -phenethyl alcohol in the fermented malt solution obtained by the present invention are not particularly limited.
  • the total concentration of ⁇ -phenethyl acetate and ⁇ -phenethyl alcohol in the produced malt fermented liquid is preferably 10 ppm (mg / L) or more, preferably 15 ppm. (Mg / L) or more is more preferable.
  • the amount of esters such as ethyl acetate, isoamyl acetate, ⁇ -phenethyl acetate and propyl acetate and alcohols having 3 or more carbon atoms such as isoamyl alcohol and ⁇ -phenethyl alcohol in the fermented malt liquid and fermented malt beverage can be determined by, for example, GC analysis. It can be obtained from the peak area of the obtained chromatograph.
  • the quantification method from the peak area is not particularly limited, and examples thereof include an area percentage method, an internal standard method, a standard addition method, and an absolute calibration curve method. Specifically, it can be obtained by the method described in the following examples.
  • the malt fermented liquid obtained in the present invention can be used as it is as a raw material for food and drink.
  • the food and drink produced from the malt fermented liquid as a raw material is not particularly limited. Beverages are preferable, malt fermented beverages are more preferable, and malt fermented beer-like effervescent beverages are further preferable as foods and drinks produced from the malt fermented liquid obtained in the present invention.
  • the solid-liquid separation treatment may be any method as long as it can remove yeast and the like, and examples thereof include centrifugal separation treatment, diatomaceous earth filtration treatment, and filter filtration treatment with a filter having an average pore size of about 0.4 to 0.5 ⁇ m. , These processes may be combined. Further, hops, hop extracts, flavors and the like may be added to the obtained fermented malt liquid to adjust the flavor of the fermented malt beverage. The flavor may be adjusted before the solid-liquid separation treatment or after the solid-liquid separation treatment.
  • the malt fermented liquor after the solid-liquid separation treatment may be stored and aged under low temperature conditions of about 0 ° C.
  • pH adjustment treatment, heat treatment and the like may be further carried out according to a conventional method.
  • a fermented malt beverage having an extract concentration and an ethanol concentration within a desired range can also be produced.
  • the solution used for dilution is not particularly limited, and examples thereof include water and carbonated water.
  • the dilution ratio is not particularly limited, and for example, it can be diluted 2 to 10 times, more preferably 2 to 5 times, and even more preferably 2 to 3 times.
  • the step of diluting the malt fermented liquor may be carried out after the completion of the fermentation step, after removing yeast or the like, or for the malt fermented liquor after aging.
  • the concentration of ethanol, various esters, and alcohols having 3 or more carbon atoms in the malt fermented beverage obtained from the malt fermented liquid obtained in the present invention is not particularly limited.
  • a malt fermented beverage having a low ethanol concentration and a fruity aroma can be produced.
  • the malt fermented beverage include malt fermented beer-like effervescent beverages having a propyl acetate concentration of 0.1 ppm (mg / L) or more and an ethanol concentration of 0.5% (vol / vol) or less. ..
  • the malt fermented beer-like effervescent beverage preferably has a propyl acetate concentration of 0.2 ppm (mg / L) or more, more preferably 0.3 ppm (mg / L) or more.
  • the malt fermented beer-like effervescent beverage preferably has a propyl acetate concentration of 20.0 ppm (mg / L) or less, more preferably 15.0 ppm (mg / L) or less, and 10.0 ppm or less (mg / L). Is even more preferable.
  • the ethanol concentration is preferably 0.25% (vol / vol) or less, more preferably 0.1% (vol / vol) or less, and 0.05% (vol / vol) or less. ) The following is more preferable.
  • GC analysis 2 ⁇ L of the recovered solvent layer was injected into a column (DB-FFAP, 30 m ⁇ 0.25 mm ID; 0.25 ⁇ m FT, manufactured by Agilent) by a split injection method, and the solvent layer was held at 40 ° C. for 2 minutes. The temperature was raised to 230 ° C. at 7 ° C./min and held for 10 minutes.
  • the concentration of each component in the analysis sample is the peak area of each component, with ethyl acetate, isoamyl acetate, isoamyl alcohol, and ⁇ -phenethyl alcohol using hexyl alcohol as the internal standard, and ⁇ -phenethyl acetate using hexyl acetate as the internal standard.
  • a calibration curve was created for each component from the ratio of the peak area of the internal standard and calculated.
  • propyl acetate in the malt fermented liquid or the beverage was measured by the SPME-GC / MS (Solid Phase Micro Extraction-Gas Chromatography / Mass Spectrometry) method. Specifically, the adsorbed components were subjected to GC / MS analysis. First, 5 g of a sample was collected in a 20 mL vial, and after mixing, the lid was loosened and degassed. After stirring the vial while heating it at 60 ° C.
  • the gas phase component of the headspace is adsorbed on SPME (DVB / CAR / PDMS (manufactured by SUPELCO), film thickness 50/30 ⁇ m, length 1 cm).
  • SPME DVD / CAR / PDMS
  • GC / MS analysis splitless method, column DB-WAX manufactured by Agilent, 60 m ⁇ 0.250 mm ⁇ 0.25 ⁇ m).
  • GC / MS analysis was performed by holding at 38 ° C. for 10 minutes, then raising the temperature to 230 ° C. at 3 ° C./min, and then holding for 23 minutes.
  • the propyl acetate concentration in the sample was calculated by the standard addition method.
  • propyl acetate in the malt fermented liquid or the beverage was measured by the head space gas chromatography mass spectrometry (HS-GC / MS: Head Space-Gas Chromatography / Mass Spectrometry) method. Specifically, 1 ml of the sample and 3 g of sodium chloride were added to 9 ml of ultrapure water, and propyl acetate in the sample was measured by the HS-GC / MS method. The concentration of propyl acetate in the sample was quantified using the absolute calibration curve method. Specifically, first, a calibration curve was prepared from the component amount ( ⁇ g) and the peak area value using a standard substance.
  • the content of propyl acetate ( ⁇ g) is determined from the peak area value of propyl acetate measured by the HS-GC / MS method, and the value is divided by the amount of sample (mL). , The concentration of propyl acetate ( ⁇ g / mL) in the sample was quantified.
  • the propyl acetate in the sample was measured by the SPME-GC / MS method, the concentration of propyl acetate in the sample quantified by the standard addition method, and the propyl acetate in the sample were measured by the HS-GC / MS method. It was confirmed that the concentrations of propyl acetate in the sample quantified by the absolute calibration curve method were almost the same.
  • the ethanol concentration in the malt fermented liquid or the beverage was measured by the following method.
  • a solution obtained by diluting the sample with distilled water so that the ethanol concentration became 0.5 to 2.0% (vol / vol) was measured by a multifunctional biosensor (BF-5, manufactured by Oji Instruments Measurement Co., Ltd.). ..
  • the value obtained by multiplying the obtained measured value by the dilution ratio was taken as the ethanol concentration (% (vol / vol)) in the sample.
  • the multifunctional biosensor is a device that electrochemically detects hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) generated by oxidation by alcohol oxidase, and can measure the total concentration of methanol and ethanol. Since yeast does not biosynthesize methanol, the malt fermented liquor contains only a trace amount of methanol, which can be said to be within the margin of error. Therefore, the measured value by the multifunctional biosensor is the measured value of the ethanol amount of the malt fermented liquid sample.
  • H 2 O 2 hydrogen peroxide
  • a solution obtained by diluting the sample to an alcohol concentration of 0.01-0.04% (vol / vol) using the multifunction biosensor was measured by a high-sensitivity measurement method using a buffer solution containing no sodium azide (SL04-0015, manufactured by Oji Kikai Keisoku Co., Ltd.).
  • the oligosaccharide in the fermentation raw material solution, the malt fermented solution, or the beverage is subjected to HPLC (high performance liquid chromatography) (Prominense® (manufactured by Shimadzu Corporation); RI detector. : RID-20A (manufactured by Shimadzu Corporation); Column for hydrocarbon analysis: Aminex HPX-42A carbohydrate Liquid (manufactured by BIO-RAD)).
  • HPLC analysis was performed at a flow rate of 0.5 mL / min using degassed ultrapure water as the mobile phase at a column temperature of 80 ° C.
  • Example 1 A diluted solution of wort or malt extract was aerated and fermented using 6 kinds of Kluy veromyces marxianus yeast, and the composition of the obtained fermented solution was examined.
  • NBRC260 strain isolated from the atmosphere
  • NBRC272 strain isolated from miso
  • NBRC277 strain NBRC482 strain
  • NBRC483 strain isolated from the mash solution of kaoliangchiu
  • NBRC483 strain isolated from Korea
  • NBRC690 strain both are owned by Biotechnology Center, Product Evaluation Technology Infrastructure Organization
  • wort (a) was produced using a 200 L scale charging facility. 40 kg of crushed malt and starchy auxiliary raw materials as fermentation raw materials and 160 L of raw material water were put into the charging tank, and the mixture in the charging tank was heated and saccharified according to a conventional method. Then, hops were added to the filtrate obtained by filtering the obtained saccharified solution, and then the mixture was boiled. The filtrate after boiling was transferred to a settling tank to separate and remove the precipitate, and then cooled to obtain wort (a).
  • the analytical values of the obtained wort (a) were as follows. The wort (a) diluted with water so as to have a Brix of 11 ° was used as a fermentation raw material liquid (a).
  • the Erlenmeyer flask subjected to rotation speed 160 rpm, 20 24 ⁇ 28 hours under aeration stirring at °C incubator, after which the number of yeast has become 1.3 ⁇ 3.0 ⁇ 10 8 per fermentation solution 1 mL, the fermentation Finished and a fermented liquor was obtained.
  • the fermentation raw material liquids (b) to (d) one strain of Kluy veromyces marxianus seed yeast was used to obtain a fermentation liquid in the same manner as when the fermentation raw material liquid (a) was used.
  • the ethanol concentration of the obtained fermented liquid was 0.68% (vol / vol), whereas in the 100 mL stirring fermentation, the ethanol concentration of the obtained fermented liquid was 0.15. It was less than% (vol / vol).
  • the fermented liquor obtained by 100 mL stirring fermentation has a higher ethyl acetate concentration, a total concentration of isoamyl acetate and isoamyl alcohol, and a total of ⁇ phenethyl acetate and ⁇ phenethyl alcohol than the fermented liquor obtained by 300 mL static fermentation. Both concentrations were clearly high.
  • the fermented liquor obtained by 300 mL static fermentation was 7.3 ppm
  • the fermented liquor obtained by 100 mL stirring fermentation was 100 ppm or more.
  • propyl acetate which was not detected at all in the fermented liquor obtained by 300 mL static fermentation, was detected at 0.72 to 2.64 ppm in the fermented liquor obtained by 100 mL stirring fermentation.
  • the amount of ethanol produced by stirring fermentation is smaller than that of static fermentation, and the amount of aroma components such as ethyl acetate is produced.
  • propyl acetate which is an aroma component of pear, was produced. From these results, a malt fermented liquid having a low ethanol concentration and a strong fruity aroma was obtained by performing aeration fermentation using Kluyveromyces marxianus seed yeast, and by using the malt fermented liquid, the ethanol concentration was obtained. It was shown that a fermented malt beverage with a low and strong fruity aroma can be obtained.
  • Example 2 Fermentation was carried out by various methods using Kluy veromyces marxianus yeast and Pichia kluyberg yeast, and the composition of the obtained fermented liquid was investigated.
  • the Kluy veromyces marxianus yeast the NBRC483 strain used in Example 1 was used.
  • ⁇ Jarfermenter fermentation test> In a 2 L volume jar fermenter (manufactured by Maruhishi Bio-Engine), 600 mL of the fermentation raw material liquid (a) used in Example 1 was put, and the final concentration of the defoaming agent (KM-72GS, manufactured by Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.) was 0. It was added so as to be 165 g / L. Then, in the jar fermenter was fermented by adding to the number of yeast is 2.0 ⁇ 10 5 per fermentation material liquid 1 mL.
  • Fermentation is started at 20 ° C., 240 rpm, 0.5 vvm, and the dissolved oxygen concentration is monitored so that the dissolved oxygen concentration, which decreases with yeast growth, is maintained at 1 ppm (mg / L) or higher. Raised to maintain oxygen supply.
  • the number of yeast is completed fermentation at about 1.8 ⁇ 10 8 per fermentation solution 1 mL, to obtain a fermentation broth.
  • the number of yeast is completed fermentation at about 2.0 ⁇ 10 8 per fermentation solution 1 mL, to obtain a fermentation broth.
  • ⁇ Fermentation tank fermentation test 60 L of the fermentation raw material liquid (a) used in Example 1 was placed in a 100 L fermentation tank, and the defoaming agent KM-72GS was added so as to have a final concentration of 0.165 g / L. Then, to the fermentation tank, the number of yeast is fermented by adding to a 2.0 ⁇ 10 5 per fermentation material liquid 1 mL. During fermentation, the liquid was pumped from the sampling valve port of the fermentation tank to the aeration line, passed through the dissolved oxygen meter from the static mixer, and returned to the bottom of the tank for circulation.
  • Example 3 Stirring fermentation test using Kluy veromyces marxianus yeast and other bacterial species Fermentation raw material solution (a) was prepared at the same number of initial bacteria, container, incubator rotation speed, and temperature as in ⁇ 100 mL stirring fermentation> of Example 1. The test strain was increased and the test was carried out by aeration stirring.
  • yeast NBRC483, which is the Kluyberomyces marxianus yeast used in Example 1, and NBRC10005, which is the type strain of the Kluyveromyces marxianus yeast, were used.
  • control strains 2 strains of Pikia brewer's yeast commonly used in the production of non-alcoholic beer, 1 strain of Torulaspora derbrückii, and 1 strain of Saccharomycodes ludwigii.
  • a strain, one Saccharomyces cerevisiae seed yeast, and one Saccharomyces pastorianus seed yeast were used in the test.
  • the ethanol concentration was less than 0.5% in all the test groups.
  • the type strain NBRC1005 of Kluy veromyces marxianus yeast although it tended to be less than other strains of Kluy veromyces marxianus yeast, the result was that ethyl acetate 50 ppm or more and propyl acetate 0.1 ppm or more were satisfied. rice field.
  • the ethyl acetate concentration was about 3 ppm at the maximum, and no sample in which propyl acetate was detected was detected.
  • Example 4 Fermentation test with Kluy veromyces marxianus yeast in each Brix of fermentation feedstock
  • the NBRC483 strain was pre-cultured at an incubator rotation speed of 160 rpm and 25 ° C., respectively.
  • Malt extract Maltax 10 (Senson) was diluted with water to a Brix 4 °, 7 °, 9 °, 12 °, 16 °, 18 °, 20 ° to prepare a fermentation raw material solution, and 500 mL of these was prepared. 100 mL each was placed in a baffled Erlenmeyer flask.
  • Yeast strains were pre-cultured in this was added to the number of bacteria becomes 2.0 ⁇ 10 5 cells per wort 1 mL.
  • the Erlenmeyer flask subjected to 26-30 hours under aeration-agitation at a rotation speed of 160 rpm, 20 ° C. incubator, the number of yeast is completed fermentation at about 1.8 ⁇ 10 8 per 1 ml, to obtain a fermentation broth.
  • Brix18 ° takes 20 ° of the fermentation material liquid in the case of using the time for growth of the yeast, 30 hours the number of bacteria be cultured was not only reach 1.0 ⁇ 10 8 or so.
  • Table 6 shows the test results for each Brix of the fermentation raw material liquid. In each test group, ethyl acetate of 50 ppm or more and propyl acetate of 0.1 ppm or more were satisfied.
  • Example 5 Sensory evaluation The fermentation broth obtained in ⁇ 100 ml stirring fermentation> of Example 1 and the fermentation broth obtained in Example 3 were diluted with carbonated water so as to have a Brix 5 ° with the fermentation raw material liquid (2.2 times). Diluted), hop flavor was added to prepare each beverage. Each of the obtained beverages was subjected to sensory evaluation by a scoring method by five skilled panelists. The "wort odor intensity" was evaluated with 1 point for water and 7 points for the diluted solution of the fermentation raw material solution (a). However, since the types of fermentation raw material liquids are different in the fermentation liquid beverages using the fermentation raw material liquids (b), (c), and (d), the "wort odor intensity" was not evaluated.
  • the ethanol-producing ability is low, and esters such as ethyl acetate, isoamyl acetate, ⁇ -phenethyl acetate, and propyl acetate, and alcohols having 3 or more carbon atoms such as isoamyl alcohol and ⁇ -phenethyl alcohol. It is fermented by aeration using yeast of the Kluy veromyces marxianus species, which has a high production capacity. Therefore, according to the method for producing a malt fermented liquid according to the present invention, it is possible to provide a malt fermented liquid having a low ethanol concentration and a fruity aroma. Further, by using the malt fermented liquid, it is possible to provide a malt fermented beverage having a low ethanol concentration and a fruity aroma.

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Abstract

麦芽の糖化物を含む発酵原料液に、クルイベロミセス・マルキシアヌス種の酵母を接種して、通気発酵させる工程を有する、麦芽発酵液の製造方法、及び、前記記載の麦芽発酵液の製造方法により得られた麦芽発酵液を原料として、麦芽発酵飲料を製造する、麦芽発酵飲料の製造方法により、エタノール濃度が低く、かつフルーティーな香気を有する麦芽発酵液、及び当該麦芽発酵液から麦芽発酵飲料が提供される。

Description

麦芽発酵液の製造方法
　本発明は、麦芽の糖化物を発酵原料とし、エタノール濃度が低く、かつフルーティーな香気を有する発酵液の製造方法、及び当該製造方法により製造された発酵液を原料として含む飲料の製造方法に関する。
　本願は、２０２０年６月１７日に日本に出願された特願２０２０－１０４６１５号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　近年、アルコール飲料では、消費者の嗜好の多様化にともない、多種多様の商品が上市されている。例えば、より飲み易いことから、アルコール濃度が比較的低いアルコール飲料の需要も高まっている。一方で、発酵アルコール飲料の場合には、発酵によって、エタノールに加えて様々な香気成分が酵母により産生され、飲料の香味に寄与している。
　発酵アルコール飲料において、発酵の際に産生される各種の香気成分は、発酵に使用される酵母の種類に依存する。例えば、ビールやワインの醸造で最も広く利用されている酵母は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）であるが、近年、サッカロミセス属以外の酵母を使用することにより、従来のビール等とは異なる香味のビール等を製造することも行われている。例えば、ピキア・クルイベリ（Ｐｉｃｈｉａ　ｋｌｕｙｖｅｒｉ）等のピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属の酵母を用いて麦汁を好気条件下で発酵させることにより、酢酸イソアミル（ＩＡＡＴ）や酢酸エチルの含有量の多いビールを製造する方法が知られている（特許文献１）。
　一方で、アルコール飲料以外にも、酵母による発酵を利用した飲食品の開発も盛んである。例えば、米粉糖化液を発酵させることにより、消化吸収性に優れた米粉糖化発酵飲料が得られる。この際に使用される酵母として、ケフィアから単離した酵母であるクルイベロミセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｍａｒｘｉａｎｕｓ）の特定の株を用いることにより、フルーティーで米粉糖化液そのものの甘さを活かすことができる米粉糖化発酵飲料が得られる（非特許文献１）。クルイベロミセス・マルキシアヌスは、通気条件でのみ、ラクトースから酢酸エチルを産生する能力を有する（非特許文献２）。
国際公開第２０１４／２０２５６４号
冨永美穂子ら、「ケフィアから単離した酵母,Kluyveromyces marxianus HU-1による米粉糖化液の発酵」、日本農芸化学会誌、１９９８年、第７２巻、第４号、４８１～４８８ページ。 Urit et.al.，Engineering in Life Sciences，2013, vol.13(3) p.247-260.
　発酵アルコール飲料の製造において、エタノール濃度を低く抑えるために発酵度を抑えると、香気成分の含有量も低下したり、発酵不良による不快臭が生じる場合もある。
　本発明は、エタノール濃度が低く、かつフルーティーな香気を有する麦芽発酵液の製造方法、当該製造方法により製造された麦芽発酵液を用いて麦芽発酵飲料を製造する方法、及び当該製造方法により製造された麦芽発酵飲料を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、従来、麦芽の糖化物を含む発酵原料液の発酵には使用されていなかったクルイベロミセス・マルキシアヌス種の酵母を用いて、通気発酵を行うことにより、エタノール産生は抑えられ、かわりにエステル類等の香気成分の産生が促進されることで、フルーティーな香気を有し、かつエタノール濃度の低い麦芽発酵液が製造できることを見出し、本発明を完成させた。
　本発明に係る麦芽発酵液の製造方法、麦芽発酵飲料の製造方法、及び麦芽発酵飲料は、下記［１］～［１０］である。
［１］　麦芽の糖化物を含む発酵原料液に、クルイベロミセス・マルキシアヌス種の酵母を接種して、通気発酵させる工程を有する、麦芽発酵液の製造方法。
［２］　前記発酵原料液のＢｒｉｘが、４°～２０°である、前記［１］の麦芽発酵液の製造方法。
［３］　酢酸プロピル濃度が０．１ｐｐｍ（ｍｇ／Ｌ）以上の麦芽発酵液を製造する、前記［１］又は［２］の麦芽発酵液の製造方法。
［４］　エタノール濃度が０．５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）以下の麦芽発酵液を製造する、前記［１］～［３］のいずれかの麦芽発酵液の製造方法。
［５］　酢酸エチル濃度が５０ｐｐｍ（ｍｇ／Ｌ）以上の麦芽発酵液を製造する、前記［１］～［４］のいずれかの麦芽発酵液の製造方法。
［６］　前記［１］～［５］のいずれかの麦芽発酵液の製造方法により得られた麦芽発酵液を原料として、麦芽発酵飲料を製造する、麦芽発酵飲料の製造方法。
［７］　前記麦芽発酵液を希釈する工程を有する、前記［６］の麦芽発酵飲料の製造方法。
［８］　前記麦芽発酵飲料がビール様発泡性飲料である、前記［６］又は［７］の麦芽発酵飲料の製造方法。
［９］　酢酸プロピル濃度が０．１ｐｐｍ（ｍｇ／Ｌ）以上であり、エタノール濃度が０．５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）以下である、麦芽発酵飲料。
［１０］　ビール様発泡性飲料である、前記［９］の麦芽発酵飲料。
　本発明に係る麦芽発酵液の製造方法では、エタノール産生能が低く、酢酸エチル、酢酸イソアミル、酢酸βフェネチル、酢酸プロピル等のエステル類や、イソアミルアルコール、βフェネチルアルコール等の炭素数３以上のアルコール類の産生能の高いクルイベロミセス・マルキシアヌス種の酵母を用いて通気発酵させる。このため、本発明に係る麦芽発酵液の製造方法により、エタノール濃度が低く、かつフルーティーな香気を有する麦芽発酵液を提供できる。また、当該麦芽発酵液を用いることで、エタノール濃度が低く、かつフルーティーな香気を有する麦芽発酵飲料を提供できる。
実施例５において実施された「麦汁臭の強さ」の官能検査の結果を示す図である。 実施例５において実施された「洋梨らしい香り」の官能検査の結果を示す図である。 実施例５において実施された「フルーティーな香り」の官能検査の結果を示す図である。 実施例６において実施された「洋梨らしい香り」と「おいしさ」の相関関係を示す図である。
　本発明及び本願明細書において、「麦芽発酵飲料」とは、麦芽又はその加工品を原料として用い、酵母による発酵工程を経て製造される飲料を意味する。麦芽発酵飲料としては、アルコール飲料であってもよく、エタノール濃度が１．０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）未満であるいわゆるノンアルコール飲料又はローアルコール飲料であってもよい。また、麦芽発酵飲料としては、エタノール濃度は０．５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）未満が好ましく、０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）未満がより好ましく、０．０５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）未満がさらに好ましい。
　麦芽発酵飲料としては、例えば、ビール様発泡性飲料が挙げられる。本発明及び本願明細書において、「ビール様発泡性飲料」とは、ビールと同等の又はそれと似た風味・味覚及びテクスチャーを有し、ビールらしさ（香味上ビールを想起させる呈味）を有する発泡性飲料を意味する。麦芽発酵ビール様発泡性飲料としては、具体的には、ビール、麦芽を原料とする発泡酒等が挙げられる。その他、麦芽発酵液を、エタノール含有蒸留液と混和して得られたリキュール類であってもよい。エタノール含有蒸留液とは、蒸留操作により得られたエタノールを含有する溶液であり、例えば、原料用アルコール（エタノール）であってもよく、ウィスキー、ブランデー、ウオッカ、ラム、テキーラ、ジン、焼酎等の蒸留酒（スピリッツ）等を用いることができる。
　本発明に係る麦芽発酵液の製造方法は、麦芽の糖化物を含む発酵原料液に、クルイベロミセス・マルキシアヌス種の酵母を接種して、通気発酵させる工程を有する。クルイベロミセス・マルキシアヌス種の酵母は、サッカロミセス属酵母よりも通気発酵時のエタノール産生能が低く、代わりにエステル類や炭素数３以上のアルコール類等の香気成分の産生能が高い。このため、クルイベロミセス・マルキシアヌス種の酵母を用いることにより、エタノール濃度が低く、酢酸エチル、酢酸イソアミル、酢酸βフェネチル、酢酸プロピル等のエステル類を豊富に含む発酵液が得られる。
　本発明において用いられる酵母は、クルイベロミセス・マルキシアヌス種の酵母であれば特に限定されるものではない。製造される麦芽発酵液を飲食品へ適用する際の安全性の点から、飲食品やその素材、可食性の動植物から分離されたクルイベロミセス・マルキシアヌス種酵母であることが好ましい。これらのクルイベロミセス・マルキシアヌス種酵母は、例えば、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター（ＮＢＲＣ）、National Collection of Yeast Culture（ＮＣＹＣ）等の菌株保存機関や販売元から入手可能なクルイベロミセス・マルキシアヌス種の株の中から、適宜選択して用いることができる。
　本発明において、クルイベロミセス・マルキシアヌス種酵母を接種して発酵させる発酵原料液は、麦芽の糖化物を含むものであり、クルイベロミセス・マルキシアヌス種酵母が資化可能な炭素源又は窒素源を含むものであれば、特に限定されるものではない。例えば、麦芽の糖化物のみからなるものであってもよく、麦芽の糖化物以外の炭素源又は窒素源を含むものであってもよい。
　本発明及び本願明細書において、「麦芽の糖化物」とは、麦芽中の糖類を、各種酵素で糖化処理したものである。糖化処理に使用する酵素は、麦芽に本来含まれている酵素であってもよく、麦芽以外に由来する酵素であってもよい。例えば、麦芽又はその粉砕物に水を加えて、５０～６０℃で保持することにより、麦芽由来のアミラーゼによって糖化物が得られる。この際に、麦芽以外に由来する糖化酵素をさらに添加してもよく、タンパク質分解酵素等の糖化酵素以外の酵素を併用してもよい。
　本発明において、麦芽の糖化物としては、例えば、麦汁や麦芽エキスを用いることができる。麦芽エキスは、麦汁を濃縮したものであり、麦芽糖を主成分とする。麦芽エキスは、そのまま炭酸水でわって飲料としたり、飲食品の原材料として使用されている。麦汁の濃縮は、常法により行うことができる。麦汁中の成分への影響が抑えられるため、減圧濃縮が好ましいが、加熱して溶媒を除去して濃縮することもできる。
　麦汁は、麦芽と原料水とを含む混合物を調製して加温し、麦芽の澱粉質を糖化させて調製する。麦芽は、粉砕処理して得られる麦芽粉砕物として用いることが好ましい。麦芽の粉砕処理は、常法により行うことができる。麦芽粉砕物は、粉砕処理の前後において通常なされる処理を施したものであってもよい。
　麦芽と原料水を含む混合物には、麦芽以外の発酵原料を含んでいてもよい。当該発酵原料は、穀物原料であってもよく、糖質原料であってもよい。麦芽以外の穀物原料としては、例えば、大麦や小麦等の麦類、米、トウモロコシ、大豆等の豆類、イモ類等が挙げられる。穀物原料は、穀物粉砕物、穀物シロップ、穀物エキス等として用いることもできる。穀物粉砕物としては、コーンスターチ、コーングリッツ等のように、粉砕処理の前後において通常なされる処理を施したものであってもよい。糖質原料としては、例えば、液糖等の糖類が挙げられる。
　麦汁は、このまま発酵原料液として用いてもよいが、酵母を接種させる前に、煮沸処理を行うことが好ましい。当該煮沸処理により、殺菌でき、より安全に発酵を行うことができる。煮沸処理を行う場合、煮沸処理前に、濾過等により不溶性の固形分を除去しておくことが好ましい。当該濾過処理は、特に限定されるものではなく、珪藻土濾過、フィルター濾過等の飲食品の製造工程で一般的に行われている固液分離処理の中から適宜選択して用いることができる。また、この糖液の濾液に替わりに、麦芽エキスに温水を加えたものを用い、これを煮沸してもよい。煮沸方法及びその条件は、適宜決定することができる。
　煮沸処理前又は煮沸処理中に、香草等を適宜添加することにより、所望の香味を有する麦芽発酵液を製造することができる。特にホップは、煮沸処理前又は煮沸処理中に添加することが好ましい。ホップの存在下で煮沸処理することにより、ホップの風味・香気成分を効率よく煮出することができる。ホップの添加量、添加態様（例えば数回に分けて添加するなど）及び煮沸条件は、適宜決定することができる。
　煮沸された麦汁は、酵母を接種させる前に、沈殿により生じたタンパク質等の粕を除去することが好ましい。粕の除去は、いずれの固液分離処理で行ってもよいが、一般的には、ワールプールと呼ばれる槽を用いて沈殿物を除去する。この際の煮汁の温度は、１５℃以上であればよく、一般的には５０～８０℃程度で行われる。粕を除去した後の清澄な麦汁（濾液）は、プレートクーラー等により適切な発酵温度まで冷却する。この粕を除去した後の麦汁が、発酵原料液となる。
　冷却した発酵原料液にクルイベロミセス・マルキシアヌス種酵母を接種して、発酵を行う。冷却した発酵原料液は、そのまま発酵に供してもよく、所望のエキス濃度に調整した後に発酵に供してもよい。本発明において、クルイベロミセス・マルキシアヌス種酵母を接種する発酵原料液は、Ｂｒｉｘが４°～２０°であるものが好ましく、Ｂｒｉｘが７°～１８°であるものがより好ましく、９°～１６°であるものがさらに好ましく、１０°～１４°がよりさらに好ましい。
　なお、本発明及び本願明細書において、発酵原料液のＢｒｉｘ値は、屈折計（ＲＸ－５０００α、アタゴ社製）等の測定装置を用いて、常法により測定することができる。
　クルイベロミセス・マルキシアヌス種酵母を接種した発酵原料液に対して通気発酵を行うことにより、麦芽発酵液が得られる。クルイベロミセス・マルキシアヌス種酵母は、好気条件で発酵させることにより、エタノール産生がより抑えられ、エステル類や炭素数３以上のアルコール類の産生量がより多くなり、より香気に優れ、かつ低エタノール濃度の麦芽発酵液が得られる。
　通気発酵は、酸素や空気を培地中に供給できる好気的条件下で行う発酵であり、常法により行うことができる。例えば、振とう培養法、攪拌培養法、通気攪拌培養法が利用できる。また、撹拌条件や、空気や酸素ガスの通気量については、培養環境を好気的に保つことができる条件であればよく、培養装置、培地の粘度等により適宜選択すればよい。例えば、ジャーファーメンターを用いる培養のように大量培養を行う場合、発酵液中の溶存酸素量をモニタリングしながら培養して発酵させることができ、この際、発酵液中の溶存酸素量が所定量（例えば、１ｐｐｍ（ｍｇ／Ｌ））以上となるように、連続して又は間欠的に空気や酸素ガスを通気させることができる。
　本発明に係る麦芽発酵液の製造方法における発酵条件は、一般的な酵母の発酵条件のうち、発酵時の培養環境を好気的に保つことができる条件の中から適宜選択し、必要に応じて改変することができる。例えば、発酵温度は、０～３５℃とし、１２～２８℃が好ましく、１５～２５℃がより好ましい。前記温度範囲内で発酵を行うことにより、クルイベロミセス・マルキシアヌス種酵母によるエステル類や炭素数３以上のアルコール類の産生が効率よく行われる。発酵時間は特に限定されるものではないが、７日間以内であることが好ましく、４日間以内であることがより好ましく、３日間以内であることがさらに好ましい。
　こうして製造された麦芽発酵液は、エタノール濃度が低く、香気成分の含有量が多い。当該香気成分としては、酢酸エチル、酢酸イソアミル、イソアミルアルコール、酢酸βフェネチル（酢酸１－フェニルエチル）、βフェネチルアルコール（２－フェニルエタノール）、酢酸プロピルが挙げられる。これらはフルーティーな香気の原因成分であり、これらの成分の含有量が高いことから、クルイベロミセス・マルキシアヌス種酵母を通気発酵させて得られた麦芽発酵液は、フルーティーな香気に優れている。
　本発明によって得られた麦芽発酵液のエタノール濃度は、特に限定されるものではない。例えば、Ｂｒｉｘ４°～２０°の発酵原料液を通気発酵させた場合には、製造される麦芽発酵液のエタノール濃度は、１．０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）未満であり、０．５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）以下であることが好ましく、０．２５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）以下であることがより好ましく、０．１５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）以下であることがさらに好ましい。
　なお、本発明及び本願明細書において、麦芽発酵液や飲料のエタノール濃度は、例えば、多機能バイオセンサＢＦ－５（王子計測機器製）を用いた酵素法、蒸留－密度（比重）法、ガスクロマトグラフ（GC:Gas Chromatography）分析法、酸化法等により測定することができる。
　本発明によって得られた麦芽発酵液は、検出限界値以上の酢酸プロピルを含有していることが好ましい。酢酸プロピルは、従来の発酵に使用されているサッカロミセス属酵母やピキア属酵母を用いて発酵させた発酵液中ではほとんど検出されず、クルイベロミセス・マルキシアヌス種酵母による通気発酵により産生されるエステルである。本発明によって得られた麦芽発酵液の酢酸プロピル濃度は、特に限定されるものではない。例えば、Ｂｒｉｘ４°～２０°の発酵原料液を通気発酵させた場合には、製造される麦芽発酵液の酢酸プロピル濃度は、０．１ｐｐｍ（ｍｇ／Ｌ）以上が好ましく、０．４ｐｐｍ（ｍｇ／Ｌ）以上がより好ましく、０．７ｐｐｍ以上（ｍｇ／Ｌ）がさらに好ましい。また、Ｂｒｉｘ４°～２０°の発酵原料液を通気発酵させた場合には、製造される麦芽発酵液の酢酸プロピル濃度は、２０．０ｐｐｍ（ｍｇ／Ｌ）以下が好ましく、１５．０ｐｐｍ（ｍｇ／Ｌ）以下がより好ましく、１０．０ｐｐｍ以下（ｍｇ／Ｌ）がさらに好ましい。
　クルイベロミセス・マルキシアヌス種酵母は、酢酸エチルの産生能にも優れている。本発明によって得られた麦芽発酵液の酢酸エチル濃度は、特に限定されるものではない。例えば、Ｂｒｉｘ４°～２０°の発酵原料液を通気発酵させた場合には、製造される麦芽発酵液の酢酸エチル濃度は、５０ｐｐｍ（ｍｇ／Ｌ）以上が好ましく、１００ｐｐｍ（ｍｇ／Ｌ）以上がより好ましく、１５０ｐｐｍ（ｍｇ／Ｌ）以上がさらに好ましい。また、Ｂｒｉｘ４°～２０°の発酵原料液を通気発酵させた場合には、製造される麦芽発酵液の酢酸エチル濃度は、５００．０ｐｐｍ（ｍｇ／Ｌ）以下が好ましく、４５０．０ｐｐｍ（ｍｇ／Ｌ）以下がより好ましく、４００．０ｐｐｍ（ｍｇ／Ｌ）以下がさらに好ましい。
　本発明によって得られた麦芽発酵液は、酢酸イソアミルとイソアミルアルコールも多く含まれている。本発明によって得られた麦芽発酵液の酢酸イソアミル濃度とイソアミルアルコール濃度は、特に限定されるものではない。例えば、Ｂｒｉｘ４°～２０°の発酵原料液を通気発酵させた場合には、製造される麦芽発酵液の酢酸イソアミルとイソアミルアルコールの合計濃度は、１５ｐｐｍ（ｍｇ／Ｌ）以上が好ましく、３０ｐｐｍ（ｍｇ／Ｌ）以上がより好ましい。
　本発明によって得られた麦芽発酵液は、酢酸βフェネチルとβフェネチルアルコールも多く含まれている。本発明によって得られた麦芽発酵液の酢酸βフェネチル濃度とβフェネチルアルコールの濃度は、特に限定されるものではない。例えば、Ｂｒｉｘ４°～２０°の発酵原料液を通気発酵させた場合には、製造される麦芽発酵液の酢酸βフェネチルとβフェネチルアルコールの合計濃度は、１０ｐｐｍ（ｍｇ／Ｌ）以上が好ましく、１５ｐｐｍ（ｍｇ／Ｌ）以上がより好ましい。
　麦芽発酵液や麦芽発酵飲料中の酢酸エチル、酢酸イソアミル、酢酸βフェネチル、酢酸プロピル等のエステル類やイソアミルアルコール、βフェネチルアルコール等の炭素数３以上のアルコール類の量は、例えば、ＧＣ分析により得られたクロマトグラフのピーク面積から求めることができる。ピーク面積からの定量方法は、特に限定されるものではないが、例えば、面積百分率法、内部標準法、標準添加法、及び絶対検量線法が挙げられる。具体的には、下記実施例に記載の方法により求めることができる。
　本発明において得られた麦芽発酵液は、そのまま飲食品の原料とすることができる。当該麦芽発酵液を原料として製造される飲食品は、特に限定されるものではない。本発明において得られた麦芽発酵液を原料として製造される飲食品としては、飲料が好ましく、麦芽発酵飲料がより好ましく、麦芽発酵ビール様発泡性飲料がさらに好ましい。
　例えば、得られた麦芽発酵液を固液分離処理することにより、酵母等を除去して、麦芽発酵飲料を得ることができる。当該固液分離処理は、酵母等を除去可能な方法であればよく、例えば、遠心分離処理、珪藻土濾過処理、平均孔径が０．４～０．５μｍ程度のフィルターによるフィルター濾過処理等が挙げられ、これらの処理を組み合わせてもよい。また、得られた麦芽発酵液にホップ、ホップエキス、香料等を添加し、発酵麦芽飲料の香味を調整してもよい。香味の調整は、固液分離処理前に行ってもよく、固液分離処理後に行ってもよい。また、固液分離処理後の麦芽発酵液を、０℃程度の低温条件下で貯蔵して熟成させてもよい。麦芽発酵飲料を製造するために、さらに、例えば、ｐＨ調整処理や加熱処理等を常法に従って行ってもよい。
　得られた麦芽発酵液を、適宜希釈することにより、エキス濃度やエタノール濃度が所望の範囲内である麦芽発酵飲料を製造することもできる。希釈に用いられる溶液は、特に限定されるものではないが、例えば、水又は炭酸水等が挙げられる。希釈倍率は特に限定されるものではなく、例えば、２～１０倍に希釈することができ、２～５倍希釈がより好ましく、２～３倍希釈がさらに好ましい。麦芽発酵液を希釈する工程は、発酵工程終了後に行ってもよく、酵母等を除去した後に行ってもよく、熟成後の麦芽発酵液に対して行ってもよい。
　本発明において得られた麦芽発酵液を原料として得られる麦芽発酵飲料のエタノールや各種のエステル類や炭素数３以上のアルコール類の濃度は、特に限定されるものではない。本発明において得られた麦芽発酵液を原料とすることにより、エタノール濃度が低く、フルーティーな香気を有する麦芽発酵飲料を製造できる。当該麦芽発酵飲料としては、例えば、酢酸プロピル濃度が０．１ｐｐｍ（ｍｇ／Ｌ）以上であり、エタノール濃度が０．５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）以下である麦芽発酵ビール様発泡性飲料が挙げられる。当該麦芽発酵ビール様発泡性飲料としては、酢酸プロピル濃度は０．２ｐｐｍ（ｍｇ／Ｌ）以上が好ましく、０．３ｐｐｍ（ｍｇ／Ｌ）以上がより好ましい。当該麦芽発酵ビール様発泡性飲料としては、酢酸プロピル濃度は、２０．０ｐｐｍ（ｍｇ／Ｌ）以下が好ましく、１５．０ｐｐｍ（ｍｇ／Ｌ）以下がより好ましく、１０．０ｐｐｍ以下（ｍｇ／Ｌ）がさらに好ましい。当該麦芽発酵ビール様発泡性飲料としては、エタノール濃度は、０．２５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）以下が好ましく、０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）以下がより好ましく、０．０５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）以下がさらに好ましい。
　次に実施例及び参考例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例等に限定されるものではない。
＜酢酸エチル等の香気成分の分析＞
　以降の実験において、特に記載のない限り、発酵原料液、麦芽発酵液、又は飲料中の酢酸エチル、酢酸イソアミル、イソアミルアルコール、酢酸βフェネチル、βフェネチルアルコールの濃度は、二硫化炭素で抽出後、ヘキシルアルコール及び酢酸ヘキシルを内部標準に用いてＧＣ分析で測定した。
　具体的にはまず、容器にサンプルを３０g採取し、硫酸アンモニウム６ｇ、及び二硫化炭素３ｍＬを加えて、内部標準物質として５００ｐｐｍのヘキシルアルコールと２０ｐｐｍの酢酸ヘキシルの混合液を１５０μＬ添加した後、１０分間振とう抽出した。その後、３，０００ｒｐｍで遠心分離処理を１０分間行い、溶媒層を回収し、ＧＣ分析に供した。ＧＣ分析は、回収した溶媒層をスプリット注入法でカラム（ＤＢ－ＦＦＡＰ、３０ｍ×０．２５ｍｍＩＤ；０．２５μｍＦ．Ｔ.、Ａｇｉｌｅｎｔ社製））に２μＬ注入し、４０℃で２分間保持した後、７℃／分で２３０℃まで昇温させて１０分間保持して行った。分析サンプル中の各成分の濃度は、酢酸エチル、酢酸イソアミル、イソアミルアルコール、βフェネチルアルコールはヘキシルアルコールを内部標準として、また、酢酸βフェネチルについては酢酸ヘキシルを内部標準として、各成分のピーク面積と内部標準のピーク面積の比から、成分ごとに検量線を作成して、算出した。
＜酢酸プロピルの分析＞
　実施例１及び２において、麦芽発酵液又は飲料中の酢酸プロピルは、ＳＰＭＥ－ＧＣ／ＭＳ（Solid Phase Micro Extraction - Gas Chromatography / Mass Spectrometry）法で測定した。具体的には、吸着された成分をＧＣ／ＭＳ分析に供した。まず、２０ｍＬ容のバイアルにサンプルを５ｇ採取し、混和後に、蓋を緩めてガス抜きをした。当該バイアルを６０℃で３０分間加温しながら撹拌した後、ヘッドスペースの気相成分をＳＰＭＥ（ＤＶＢ/ＣＡＲ/ＰＤＭＳ（ＳＵＰＥＬＣＯ社製）、膜厚５０／３０μｍ、長さ１ｃｍ）に吸着させて、ＧＣ／ＭＳ分析に供した（スプリットレス法、Ａｇｉｌｅｎｔ社製カラムＤＢ－ＷＡＸ、６０ｍ×０．２５０ｍｍ×０．２５μｍ）。ＧＣ／ＭＳ分析は、３８℃で１０分間保持した後、３℃／分で２３０℃まで昇温させ、次いで２３分間保持して行った。サンプル中の酢酸プロピル濃度は、標準添加法により算出した。
　実施例３及び４において、麦芽発酵液又は飲料中の酢酸プロピルは、ヘッドスペースガスクロマトグラフィー質量分析（ＨＳ－ＧＣ／ＭＳ：Head Space - Gas Chromatography / Mass Spectrometry）法で測定した。具体的には、サンプル１ｍｌと塩化ナトリウム３ｇを超純水９ｍｌに添加し、ＨＳ－ＧＣ／ＭＳ法でサンプル中の酢酸プロピルを測定した。サンプル中の酢酸プロピルの濃度は、絶対検量線法を用いて定量した。具体的には、まず、標準物質を用いて、成分量（μg）とピーク面積値から検量線を作成した。この検量線を使用して、ＨＳ－ＧＣ／ＭＳ法で測定された酢酸プロピルのピーク面積値から酢酸プロピルの含有量（μg）を求め、その値をサンプルの量（ｍL）で除することにより、サンプル中の酢酸プロピルの濃度（μg/mL）を定量した。
　ここで、ＳＰＭＥ－ＧＣ／ＭＳ法でサンプル中の酢酸プロピルを測定し、標準添加法により定量したサンプル中の酢酸プロピルの濃度と、ＨＳ－ＧＣ／ＭＳ法でサンプル中の酢酸プロピルを測定し、絶対検量線法により定量したサンプル中の酢酸プロピルの濃度は、おおむね一致していることを確認した。
＜エタノール濃度測定＞
　以降の実験において、特に記載のない限り、麦芽発酵液又は飲料中のエタノール濃度は、下記の方法により測定した。
　蒸留水を用いてエタノール濃度が０．５～２．０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）になるようにサンプルを希釈した溶液を、多機能バイオセンサ（ＢＦ－５、王子機器計測社製）により測定した。得られた測定値に希釈倍率を乗じた値を、サンプル中のエタノール濃度（％（ｖｏｌ／ｖｏｌ））とした。
　なお、当該多機能バイオセンサは、アルコールオキシダーゼによる酸化によって生じた過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を電気化学的に検出する装置であり、メタノールとエタノールの合計濃度が測定できる。酵母はメタノールを生合成しないことなどから、麦芽発酵液には、メタノールは、誤差範囲といえる程度の微量しか含まれていない。このため、当該多機能バイオセンサによる測定値は、麦芽発酵液サンプルのエタノール量の測定値である。
　エタノール濃度が０．５%未満のサンプルの場合には、前記多機能バイオセンサを使用して、アルコール濃度が０．０１～０．０４％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）となるようにサンプルを希釈した溶液に対して、アジ化ナトリウム非含有の緩衝液（ＳＬ０４－００１５、王子機器計測社製）を用いた高感度測定法により、エタノール濃度の測定を行った。
＜Ｂｒｉｘ測定＞
　以降の実験において、特に記載のない限り、発酵原料液、麦芽発酵液、又は飲料のＢｒｉｘは、デジタル屈折計（ＲＸ－５０００α、アタゴ社製）を用いて測定した。
＜ｐＨ測定＞
　以降の実験において、特に記載のない限り、発酵原料液、麦芽発酵液、又は飲料のｐＨは、ｐＨ計測機（ＬＡＱＵＡｔｗｉｎ－ｐＨ－３３、Ｈｏｒｉｂａ社製）により測定した。
＜オリゴ糖測定＞
　以降の実験において、特に記載のない限り、発酵原料液、麦芽発酵液、又は飲料中のオリゴ糖は、ＨＰＬＣ（high performance liquid chromatography）（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃe（登録商標）（島津製作所社製）；ＲＩ検出器：ＲＩＤ－２０Ａ（島津製作所社製）；炭化水素分析用カラム：Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ－４２Ａ ｃａｒｂｏｈｙｄｏｒａｔｅ Ｃｏｌｕｍｎ（ＢＩＯ－ＲＡＤ社製））により分析した。ＨＰＬＣ分析は、カラム温度を８０℃とし、移動相として脱気した超純水を使用して、流量０．５ｍＬ／分で行った。
［実施例１］
　６種のクルイベロミセス・マルキシアヌス種酵母を用いて麦汁又は麦芽エキスの希釈液を通気発酵させ、得られた発酵液の組成を調べた。クルイベロミセス・マルキシアヌス種酵母としては、ＮＢＲＣ２６０株（大気から分離）、ＮＢＲＣ２７２株（味噌から分離）、ＮＢＲＣ２７７株、ＮＢＲＣ４８２株（中国酒（kaoliangchiu）のマッシュ液から分離）、ＮＢＲＣ４８３株（韓国の圧搾酵母（Korean yeast cake）から分離）、及びＮＢＲＣ６９０株（いずれも、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンターの保有株）を用いた。
＜発酵原料液（ａ）の調製＞
　２００Ｌスケールの仕込設備を用いて、麦汁（ａ）の製造を行った。仕込槽に、発酵原料となる粉砕麦芽及びデンプン質副原料を４０ｋｇと原料水１６０Ｌとを投入して、仕込槽内の混合物を、常法に従って加温して糖化させた。次いで、得られた糖化液を濾過して得られた濾液に、ホップを添加した後、煮沸した。煮沸後の濾液を沈降槽に移して沈殿物を分離除去した後、冷却して麦汁（ａ）を得た。得られた麦汁（ａ）の分析値は次の通りであった。この麦汁（ａ）を、Ｂｒｉｘ１１°となるよう水で希釈したものを、発酵原料液（ａ）とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
＜発酵原料液（ｂ）～（ｄ）の調製＞
　表２に記載の３種類の麦芽エキスを、Ｂｒｉｘ１１°となるように水で希釈して混合した後、オートクレーブ滅菌したものを、それぞれ、発酵原料液（ｂ）～（ｄ）とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
＜１００ｍＬ撹拌発酵＞
　発酵原料液（ａ）で、クルイベロミセス・マルキシアヌス種酵母６株を、インキュベーターの回転数１６０ｒｐｍ、２５℃にて、それぞれ前培養した。次いで、５００ｍＬ容のバッフル付き三角フラスコに、１００ｍＬの表３に記載の発酵原料液を入れ、これに、前培養した酵母菌株を、菌数が麦汁１ｍＬあたり２．０×１０５個となるよう添加した。この三角フラスコを、インキュベーターの回転数１６０ｒｐｍ、２０℃にて２４～２８時間通気撹拌を行い、酵母菌数が発酵液１ｍＬあたり１．３～３．０×１０８個となった後、発酵を終了し、発酵液を得た。発酵原料液（ｂ）～（ｄ）では、クルイベロミセス・マルキシアヌス種酵母１株を用いて、発酵原料液（ａ）を使用したときと同様に発酵液を得た。
＜３００ｍＬ静置発酵＞
　５００ｍＬ容滅菌ディスポーザル容器（コーニング社製）に、３００ｍＬのＢｒｉｘ１１°の発酵原料液（ａ）を入れ、酵母菌数が麦汁１ｍＬあたり２．０×１０７個となるように添加し、２０℃にて３日間、静置発酵させ、発酵液を得た。
＜各種成分の分析＞
　発酵終了後に得られた発酵液は、遠心分離処理して上清を回収した後、０．２μｍのフィルター処理をして酵母菌を取り除いた。酵母菌除去後の各発酵液について、エタノール濃度、各香気成分濃度を上述の方法により定量した。その結果を表３に示す。
＜麦芽発酵飲料の官能評価＞
　酵母菌除去後の発酵液を、炭酸水で３倍希釈した後、ホップ香料を添加することにより、麦芽発酵飲料を調製した。得られた麦芽発酵飲料について、パネリスト５名で官能評価を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　３００ｍＬ静置発酵では、得られた発酵液のエタノール濃度が０．６８％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）だったのに対して、１００ｍＬ撹拌発酵では、得られた発酵液のエタノール濃度はいずれも０．１５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）未満であった。また、１００ｍＬ撹拌発酵で得られた発酵液はいずれも、３００ｍＬ静置発酵で得られた発酵液よりも、酢酸エチル濃度、酢酸イソアミルとイソアミルアルコールの合計濃度、酢酸βフェネチルとβフェネチルアルコールの合計濃度のいずれも明らかに高かった。特に、酢酸エチルは、３００ｍＬ静置発酵で得られた発酵液は７．３ｐｐｍであったのに対して、１００ｍＬ撹拌発酵で得られた発酵液はいずれも、１００ｐｐｍ以上だった。さらに、３００ｍＬ静置発酵で得られた発酵液では全く検出されなかった酢酸プロピルが、１００ｍＬ撹拌発酵で得られた発酵液では０．７２～２．６４ｐｐｍ検出された。
　官能評価では、５名のパネリスト全員が、１００ｍＬ撹拌発酵で得られた全ての発酵液に、洋梨のようなフルーティーな香気を感じたが、３００ｍＬ静置発酵で得られた発酵液ではそのような香気が感じられなかった。なお、酢酸プロピルは、洋梨の香気の代表的な成分の一つである。
　すなわち、使用したクルイベロミセス・マルキシアヌス種酵母の株や発酵原料液にかかわらず、撹拌発酵させることにより、静置発酵させるよりも、エタノール産生量が少なく、酢酸エチル等の香気成分の産生量が多く、特に、洋梨の香気成分である酢酸プロピルが産生されていた。これらの結果から、クルイベロミセス・マルキシアヌス種酵母を用いて通気発酵を行うことにより、エタノール濃度が低く、フルーティーな香気が強い麦芽発酵液が得られ、当該麦芽発酵液を用いることにより、エタノール濃度が低く、フルーティーな香気が強い麦芽発酵飲料が得られることが示された。
［実施例２］
　クルイベロミセス・マルキシアヌス種酵母とピキア・クルイベリ種酵母とを用いて、各種の方法で発酵させ、得られた発酵液の組成を調べた。クルイベロミセス・マルキシアヌス種酵母としては、実施例１でも用いたＮＢＲＣ４８３株を用いた。
＜ジャーファーメンター発酵試験＞
　２Ｌ容ジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ社製）に、実施例１でも用いた発酵原料液（ａ）６００ｍＬを入れ、消泡剤（ＫＭ－７２ＧＳ、信越化学工業社製）を終濃度０．１６５ｇ／Ｌとなるように添加した。次いで、当該ジャーファーメンターで、酵母菌数が発酵原料液１ｍＬあたり２．０×１０５個となるよう添加して発酵させた。発酵は、２０℃、２４０ｒｐｍ、０．５ｖｖｍで開始し、溶存酸素濃度をモニタリングして、酵母増殖に伴って減少する溶存酸素濃度が１ｐｐｍ（ｍｇ／Ｌ）以上で保持されるよう、撹拌数を上げて酸素供給量を維持した。ＮＢＲＣ４８３株の場合は、酵母菌数が発酵液１ｍＬあたり約１．８×１０８個で発酵を終了し、発酵液を得た。ピキア・クルイベリ種酵母の場合は、酵母菌数が発酵液１ｍＬあたり約２．０×１０８個で発酵を終了し、発酵液を得た。
＜発酵タンク発酵試験＞
　１００Ｌ容の発酵タンクに、実施例１でも用いた発酵原料液（ａ）６０Ｌを入れ、消泡剤ＫＭ－７２ＧＳを終濃度０．１６５ｇ／Ｌとなるように添加した。次いで、当該発酵タンクに、酵母菌数が発酵原料液１ｍＬあたり２．０×１０５個となるよう添加して発酵させた。発酵中は、当該発酵タンクのサンプリングバルブ口からポンプでエアレーションラインへ通液し、スタティックミキサーから溶存酸素計を通過し、タンク底へ戻して循環させた。酵母増殖時に酸素不足とならないように、溶存酸素量をモニタリングしながら、溶存酸素濃度が１ｐｐｍ（ｍｇ／Ｌ）以上となるように間欠で通気を行った。ＮＢＲＣ４８３株の場合は、酵母菌数が発酵液１ｍＬあたり約１．８×１０８個で発酵を終了し、発酵液を得た。ピキア・クルイベリ種酵母の場合は、酵母菌数が発酵液１ｍＬあたり３．０×１０７個で発酵を終了し、発酵液を得た。
＜静置発酵試験＞
　滅菌容器（１０Ｌ容ステリテナー、積水成型工業社製）に、実施例１でも用いた発酵原料液（ａ）７Ｌを入れた。次いで、当該容器に、酵母菌数が発酵原料液１ｍＬあたり１．０×１０７個程度となるよう添加し、２０℃、６日間、静置発酵を行ない、発酵液を得た。発酵終了時の菌数は、発酵液１ｍＬあたり、ＮＢＲＣ４８３株では１．４×１０８個、ピキア・クルイベリ種酵母では６×１０７個であった。
＜各種成分の分析＞
　実施例１と同様にして、発酵終了後に得られた麦芽発酵液のエタノール濃度、各香気成分濃度を上述の方法により定量した。その結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　ＮＢＲＣ４８３株を用いたジャーファーメンター発酵試験及び発酵タンク発酵試験では、エタノール濃度及び含有香気成分について、実施例１の１００ｍＬ撹拌発酵とよく似た傾向がみられた。すなわち、いずれの試験サンプルでも、エタノール濃度は０．１５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）以下であり、酢酸エチル濃度は６０ｐｐｍ（ｍｇ／Ｌ）以上、酢酸プロピル濃度は０．１５ｐｐｍ（ｍｇ／Ｌ）以上であった。また、その他の香気成分も、高い傾向にあった。一方で、ＮＢＲＣ４８３株を用いた静置発酵試験及びピキア・クルイベリ種酵母を用いた静置発酵試験及び通気発酵試験では、酢酸プロピルは最大でも０．０２ｐｐｍ（ｍｇ／Ｌ）しか検出されず、酢酸エチルは最大でも３５．４ｐｐｍ（ｍｇ／Ｌ）（ピキア・クルイベリ種酵母の静置試験）であった。また、静置発酵試験では、得られた発酵液のエタノール濃度は、０．８１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）（ＮＢＲＣ４８３株）、０．５２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）（ピキア・クルイベリ種酵母）であり、通気発酵試験に比べて高かった。
［実施例３］
　クルイベロミセス・マルキシアヌス種酵母およびその他の菌種を用いた攪拌発酵試験
　実施例１の＜１００ｍＬ撹拌発酵＞と同じ初発菌数、容器、インキュベーター回転数、温度にて、発酵原料液（ａ）を使用し、試験株を増やして通気攪拌で試験を行った。酵母は、実施例１で使用したクルイベロミセス・マルキシアヌス種酵母であるＮＢＲＣ４８３及びクルイベロミセス・マルキシアヌス種酵母のタイプストレインであるＮＢＲＣ１０００５を使用した。また、対照菌株として、ノンアルコールビール製造に一般的に使用されるピキア・クルイベリ種酵母２株、トルラスポラ・デルブリュッキ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）種酵母1株、サッカロマイコーデス・ルドウィギイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ　ｌｕｄｗｉｇｉｉ）種酵母1株、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）種酵母1株、及びサッカロミセス・パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）種酵母1株を試験に用いた。表５中、各菌種のタイプストレインは、菌種の横にＴＳと記載した。発酵時間は２０～２８時間とし、各酵母の菌数濃度が濁度でＯＤ６６０＝４．０～７．０となるまで発酵させた後、発酵を終了し、各発酵液を得た。サッカロマイコーデス・ルドウィギイは、菌体が凝集し、濁度（ＯＤ６６０）の測定が難しかったため、すべての菌株の中で一番長い培養時間に合わせて培養を終了した。各発酵液のエタノール濃度及び各香気成分濃度を表５に示す。


Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　試験の結果、いずれの試験区でもエタノール濃度は０．５％未満であった。クルイベロミセス・マルキシアヌス種酵母のタイプストレインＮＢＲＣ１０００５では、そのほかのクルイベロミセス・マルキシアヌス種酵母の菌株よりは少ない傾向にあったものの、酢酸エチル５０ｐｐｍ以上、酢酸プロピル０．１ｐｐｍ以上を満たす結果となっていた。一方で、対照株では酢酸エチル濃度は最大でも３ｐｐｍ程度であり、酢酸プロピルが検出されたサンプルはなかった。
［実施例４］
　発酵原料液の各Ｂｒｉｘでのクルイベロミセス・マルキシアヌス種酵母による発酵試験
　ＮＢＲＣ４８３株をインキュベーターの回転数１６０ｒｐｍ、２５℃にてそれぞれ前培養した。麦芽エキスＭａｌｔａｘ １０（Ｓｅｎｓｏｎ社）を、Ｂｒｉｘ４°、7°、９°、１２°、１６°、１８°、２０°となるように水で希釈して発酵原料液を作成し、これらを５００ｍL容バッフル付き三角フラスコに１００ｍLずつ入れた。これに前培養した酵母菌株を、菌数が麦汁１ｍLあたり２．０×１０５個となるように添加した。この三角フラスコを、インキュベーターの回転数１６０ｒｐｍ、２０℃にて２６～３０時間通気攪拌を行い、酵母菌数が１ｍｌあたり約１．８×１０８個で発酵を終了し、発酵液を得た。Ｂｒｉｘ１８°、２０°の発酵原料液を用いた場合は酵母の増殖に時間がかかり、３０時間培養しても菌数が１．０×１０８個程度にしか達しなかった。発酵原料液のＢｒｉｘ毎の試験結果を表６に示す。いずれの試験区でも酢酸エチル５０ｐｐｍ以上、酢酸プロピル０．１ｐｐｍ以上を満たしていた。


Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
［実施例５］
　官能評価
　実施例１の＜１００ｍｌ攪拌発酵＞で得られた発酵液、及び実施例３で得られた発酵液を、発酵原料液でＢｒｉｘ５°となるように炭酸水で希釈し（２．２倍希釈）、ホップ香料を添加し、各飲料を調製した。得られた各飲料について、熟練したパネリスト５名により評点法による官能評価を行った。「麦汁臭の強さ」については、水を１点、発酵原料液（ａ）の希釈液を７点として評価した。ただし、発酵原料液（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）を使用した発酵液の飲料では、発酵原料液の種類が異なるため、「麦汁臭の強さ」を評価しなかった。「洋梨らしい香り」、「フルーティーな香り」、及び「おいしさ」については、代表的なビール酵母であるサッカロミセス・パストリアヌス（ＮＢＲＣ１１０２４）による麦汁通気発酵液を４点として、各飲料を評価した。官能評価は、各飲料の名称等の詳細を伏せ、評価の順序がパネリストにより異なるようにランダムに行なった。「麦汁臭の強さ」、「洋梨らしい香り」、「フルーティーな香り」については香りを、「おいしさ」については味を評価した。各評価結果を表７～８および図１～３に示す。すべての飲料で麦汁臭の強さは同程度に低かったことから、各発酵液は官能的にも同程度に発酵が進んだとみなすことができる。また、クルイベロミセス・マルキシアヌス種酵母の通気発酵液を使用した飲料では、対照にくらべて有意に「洋梨らしい香り」および「フルーティーな香り」が強いという結果が得られた。検定には、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用いた（＊：ｐ＜０．０５，＊＊：ｐ＜０．０１）。この特徴は異なる種類の麦汁を用いた場合でも同様に確認された。一方で他の菌種の株を用いた飲料、あるいはクルイベロミセス・マルキシアヌス種酵母の静置発酵液を使用した飲料では、これらの項目が対照より優位に高い値となることはなかった。以上から、クルイベロミセス・マルキシアヌス種酵母の通気発酵液は、官能的に「洋梨らしい香り」「フルーティーな香り」が強い特徴があるといえる。


Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
［実施例６］
　「洋梨らしい香り」と「おいしさ」の関係を調べるため、両者の相関関係を調べた。有意差検定はスピアマンの順位相関係数を用いた。その結果、おいしさと洋梨らしい香りには有意な正の相関（ρ＝０．５７４，ｐ＝０．０００）があることが示された（図４）。発酵液の洋梨らしい香りが、発酵液全体としてのおいしさにつながっていることがわかった。
　本発明に係る麦芽発酵液の製造方法では、エタノール産生能が低く、酢酸エチル、酢酸イソアミル、酢酸βフェネチル、酢酸プロピル等のエステル類や、イソアミルアルコール、βフェネチルアルコール等の炭素数３以上のアルコール類の産生能の高いクルイベロミセス・マルキシアヌス種の酵母を用いて通気発酵させる。このため、本発明に係る麦芽発酵液の製造方法により、エタノール濃度が低く、かつフルーティーな香気を有する麦芽発酵液を提供できる。また、当該麦芽発酵液を用いることで、エタノール濃度が低く、かつフルーティーな香気を有する麦芽発酵飲料を提供できる。

Claims (10)

  1. 　麦芽の糖化物を含む発酵原料液に、クルイベロミセス・マルキシアヌス種の酵母を接種して、通気発酵させる工程を有する、麦芽発酵液の製造方法。
  2. 　前記発酵原料液のＢｒｉｘが、４°～２０°である、請求項１に記載の麦芽発酵液の製造方法。
  3. 　酢酸プロピル濃度が０．１ｐｐｍ（ｍｇ／Ｌ）以上の麦芽発酵液を製造する、請求項１又は２に記載の麦芽発酵液の製造方法。
  4. 　エタノール濃度が０．５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）以下の麦芽発酵液を製造する、請求項１～３のいずれか一項に記載の麦芽発酵液の製造方法。
  5. 　酢酸エチル濃度が５０ｐｐｍ（ｍｇ／Ｌ）以上の麦芽発酵液を製造する、請求項１～４のいずれか一項に記載の麦芽発酵液の製造方法。
  6. 　請求項１～５のいずれか一項に記載の麦芽発酵液の製造方法により得られた麦芽発酵液を原料として、麦芽発酵飲料を製造する、麦芽発酵飲料の製造方法。
  7. 　前記麦芽発酵液を希釈する工程を有する、請求項６に記載の麦芽発酵飲料の製造方法。
  8. 　前記麦芽発酵飲料がビール様発泡性飲料である、請求項６又は７に記載の麦芽発酵飲料の製造方法。
  9. 　酢酸プロピル濃度が０．１ｐｐｍ（ｍｇ／Ｌ）以上であり、エタノール濃度が０．５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）以下である、麦芽発酵飲料。
  10. 　ビール様発泡性飲料である、請求項９に記載の麦芽発酵飲料。
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