WO2021182568A1 - 皮膚表上脂質由来ｒｎａの調製方法 - Google Patents

皮膚表上脂質由来ｒｎａの調製方法 Download PDF

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WO2021182568A1
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ssl
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哲矢 桑野
高良 井上
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花王株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1017—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by filtration, e.g. using filters, frits, membranes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing lipid-derived RNA on the surface of the skin.
  • Patent Document 1 states that skin surface lipids (SSL) contain RNA derived from the skin cells of a subject, and the RNA contained in SSL is useful as a sample for analysis of a living body. It is stated that. However, since the amount of SSL that can be recovered from the subject is not large and the amount of RNA contained therein is not large, the amount of RNA that can be prepared from the SSL of one subject is very small.
  • SSL skin surface lipids
  • nucleic acids such as RNA from biological samples
  • a phenol / chloroform method for extraction of nucleic acids such as RNA from biological samples
  • AGPC acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extension
  • Nucleic acid extraction reagents based on these principles (for example, TRIzol®) are commercially available.
  • Patent Document 2 describes a lysate solution in which a biological material is dissolved and the nucleic acid contained therein is eluted, and a water-soluble organic solvent is added to a solution containing the eluted nucleic acid so as to have a final concentration of 10 to 60% by volume.
  • a nucleic acid extraction method is described, which comprises preparing the lysate solution and contacting the lysate solution with a solid material to adsorb and recover the nucleic acid on the solid material.
  • Patent Document 1 International Publication No. 2018/0083319
  • Patent Document 2 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2007-117084
  • the present invention is a method for preparing RNA derived from lipids on the surface of the skin.
  • Preparing an aqueous solution containing RNA from the subject's skin surface lipids To prepare a mixed solution by mixing the aqueous solution with a water-soluble organic solvent, and Bringing the mixed solution into contact with the solid phase material and adsorbing RNA in the mixed solution to the solid phase material.
  • a method in which the final concentration of the water-soluble organic solvent in the mixed solution before contacting with the solid phase material is 39% by volume or more and 50% by volume or less.
  • SSL skin surface lipids
  • skin is a general term for regions including the epidermis, dermis, hair follicles, and tissues such as sweat glands, sebaceous glands, and other glands on the body surface, unless otherwise specified.
  • the present invention relates to a method for recovering RNA contained in SSL.
  • the present inventor has previously found that SSL contains RNA derived from the skin cells of a subject and can be used to analyze a living body, and has filed a patent application (Patent Document 1). Furthermore, the present inventor added a predetermined amount of a water-soluble organic solvent to an aqueous solution containing RNA prepared from SSL and brought it into contact with a solid phase material to efficiently transfer RNA in the mixed solution to the solid phase. It has been found that the yield of RNA from SSL is improved by adsorbing it on a material. Here, the present inventor provides a method for preparing RNA derived from SSL, which can more efficiently recover RNA contained in the SSL of a subject.
  • RNA contained in SSL can be recovered in high yield.
  • the present invention increases the number of RNA gene detections in analysis using RNA samples (for example, gene analysis, diagnosis, etc.), and improves the accuracy and efficiency of analysis.
  • the subject in the method of the present invention may be an organism having SSL on the skin.
  • subjects include mammals, including humans and non-human mammals, preferably humans.
  • the subject can be a human or non-human mammal that requires or desires analysis of its nucleic acid.
  • the subject may be a human or non-human mammal that requires or desires gene expression analysis in the skin or analysis of the condition of the skin or non-skin sites using nucleic acids.
  • the subject's SSL comprises RNA expressed in the subject's skin cells, preferably RNA expressed in any of the subject's epidermis, sebaceous glands, hair follicles, sweat glands, and dermis, more preferably said. It contains RNA expressed in any of the subject's dermis, sebaceous glands, hair follicles, and sweat glands (see Patent Document 1). Therefore, the SSL-derived RNA prepared by the method of the present invention is preferably an RNA derived from at least one site selected from the epidermis, sebaceous glands, hair follicles, sweat glands and dermis of the subject, and more preferably the epidermis, sebaceous glands, and the like. RNA from at least one site selected from hair follicles and sweat glands.
  • the SSL-derived RNA prepared by the method of the present invention includes mRNA, tRNA, rRNA, small RNA (for example, microRNA (miRNA), small interfering RNA (siRNA), Piwi-interacting RNA (piRNA), etc.), long intergenic non- It may include coding (link) RNA, and the like.
  • mRNA microRNA
  • siRNA small interfering RNA
  • piRNA Piwi-interacting RNA
  • long intergenic non- It may include coding (link) RNA, and the like.
  • One or more of the RNAs listed above may be included in SSL.
  • the skin parts from which the subject's SSL is collected include skin, atopy, acne, dryness, inflammation (redness), tumors, and other diseases on any part of the body such as the head, face, neck, trunk, and limbs.
  • Examples thereof include skin having a skin, skin having a wound, and the like, but the present invention is not particularly limited.
  • any means used to recover or remove SSL from the skin can be adopted.
  • an SSL-absorbing material, an SSL-adhesive material, or an instrument that scrapes the SSL from the skin, which will be described later, can be used.
  • the SSL-absorbing material or the SSL-adhesive material is not particularly limited as long as it is a material having an affinity for SSL, and examples thereof include polypropylene and pulp. More detailed examples of the procedure for collecting SSL from the skin include a method of absorbing SSL into a sheet-like material such as oil blotting paper and oil blotting film, a method of adhering SSL to a glass plate, tape, etc., a spatula, a scraper, etc.
  • an SSL-absorbing material pre-containing a highly lipophilic solvent may be used.
  • the SSL-absorbing material contains a highly water-soluble solvent or water, the adsorption of SSL is hindered, which is not preferable.
  • the SSL-absorbent material is preferably used in a dry state.
  • the RNA-containing SSL collected from the subject may be stored until it is used for RNA preparation described later.
  • the RNA-containing SSL can be stored in a state of being absorbed or adhered to an SSL-absorbing material or an SSL-adhesive material.
  • the RNA-containing SSL may be stored under conventional RNA storage conditions (for example, ⁇ 80 ° C.), but can be stored under milder conditions (International Application No. PCT / JP2019 / 043040). ..
  • the temperature condition for storing the RNA-containing SSL may be 0 ° C. or lower, preferably ⁇ 10 ° C. or lower, and more preferably ⁇ 20 ° C. or lower.
  • the storage period is not particularly limited, but is preferably 12 months or less, more preferably 6 months or less, and further preferably 3 months or less.
  • the method for preparing SSL-derived RNA according to the present invention is to prepare an aqueous solution containing RNA from the subject's SSL, to prepare an aqueous solution containing the RNA by mixing it with a water-soluble organic solvent, and to prepare a mixed solution. It involves contacting the mixed solution with a solid phase material. The desired SSL-derived RNA is recovered from the solid phase material.
  • the method used for preparing an aqueous solution containing RNA from SSL includes a classical phenol / chloroform method for RNA extraction using a mixed solution of acidic phenol (for example, water-saturated phenol) and chloroform, and a method thereof.
  • Modified methods such as PCI (Phenol / Chloroform / Isoamyl alcohol) method, AGPC (acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction) method, modified guanidine thiocyanate and phenol are preferably mixed with PC, and modified AGPC method is used. It is a law.
  • the procedure for preparing an aqueous solution containing RNA from SSL basically follows the procedure for extracting RNA from a biological sample by the phenol / chloroform method.
  • An example of a specific procedure is described below: To SSL (or an SSL-absorbing material or SSL-adhesive material containing it) collected from a subject, acidic phenol is added and mixed, and then chloroform is added and mixed. By doing so, RNA is extracted from the SSL. Then, the obtained mixed solution is centrifuged to separate it into an aqueous layer (upper layer) containing RNA and a phenol-chloroform layer (lower layer) (the intermediate layer may be further separated). By recovering the aqueous layer, an aqueous solution containing RNA is prepared from the SSL.
  • RNA extraction water-saturated phenol may be used alone, or a reagent mixture containing phenol may be used.
  • a reagent solution for RNA extraction from a biological sample containing a commercially available reagent for RNA extraction containing guanidine thiocyanate for example, TRIzol (registered trademark) Reagent, QIAzol Lysis Reagent, ISOGEN, etc.
  • a commercially available reagent solution for RNA extraction as described above. That is, it is preferable to extract RNA by the modified AGPC method.
  • chloroform used for the RNA extraction it is preferable to use chloroform alone, but a reagent mixture containing chloroform may be used as long as a required amount of RNA is distributed to the aqueous layer.
  • the prepared aqueous solution containing the RNA may be mixed with phenol and chloroform again and centrifuged to recover the aqueous layer. This procedure may be repeated two or more times. Further, the prepared aqueous solution containing the RNA may be mixed with chloroform again and centrifuged to recover the aqueous layer. This procedure may be repeated two or more times.
  • the obtained aqueous solution containing the RNA is mixed with a water-soluble organic solvent.
  • the water-soluble organic solvent include alcohols such as primary alcohols, secondary alcohols and tertiary alcohols, and among them, methanol, ethanol, isopropanol, n-propanol and butanol can be preferably used.
  • Butanol may be linear or branched. These alcohols can be used alone or in combination of two or more. Ethanol is more preferable from the viewpoint of reducing the environmental load and toxicity to workers.
  • the concentration immediately before the above-mentioned concentration may be 39% by volume or more and 50% by volume or less, preferably 40% by volume or more and 46% by volume or less, more preferably 41% by volume or more and 45.5% by volume or less, still more preferably. It is 42% by volume or more and 45% by volume or less. Adjusting the concentration of the water-soluble organic solvent in the mixed solution to the above range improves the yield of RNA from SSL.
  • the volume% means a volume% at 25 ° C. and 1 atm.
  • RNA is recovered from the RNA-solvent mixture.
  • RNA recovery can be performed according to a nucleic acid separation method using a solid phase material.
  • the RNA-solvent mixture prepared by adjusting the final concentration of the water-soluble organic solvent as described above is brought into contact with the solid phase material, and the RNA in the mixed solution is adsorbed on the solid phase material. Then, if necessary, impurities are washed from the solid phase material, and then RNA is desorbed from the solid phase material and recovered.
  • the solid phase material may be any nucleic acid-adsorbing solid phase material, and examples thereof include silica-based solid phase materials.
  • the solid phase material is preferably a solid phase material having a porous silica membrane.
  • the solid phase material may be in the form of a spin column, a pipette tube with a column, or a centrifuge tube or a column cartridge that can be attached to a pipette tube. It is preferable, and from the viewpoint of contamination prevention and operation efficiency, the form of a column cartridge that can be attached to a spin column or a centrifuge tube is more preferable.
  • the solid phase material is preferably in a form capable of purifying a small amount of RNA such as a miniprep column.
  • a commercially available column for RNA purification can be used as the solid phase material, and examples thereof include RNeasy (registered trademark) Spin Colon (GIAGEN) and Nucleo Spin (registered trademark) RNA Colon (Takara Bio). ..
  • a solution containing at least one of a water-soluble organic solvent and a water-soluble salt for example, an aqueous solution
  • Alcohols can be used as the water-soluble organic solvent contained in the cleaning liquid. Examples of alcohols include methanol, ethanol, isopropanol, n-propanol, butanol and the like. Butanol may be linear or branched. A plurality of types of these alcohols can be used in combination. Of these, it is preferable to use ethanol.
  • the amount of the water-soluble organic solvent contained in the washing liquid may be an amount capable of retaining RNA on the solid phase material and washing impurities, and can be appropriately determined by those skilled in the art, but is 30 to 100. It is preferably by volume, more preferably 35 to 50% by volume.
  • the water-soluble salt contained in the cleaning liquid is preferably a halide salt, and a chloride salt is particularly preferable.
  • the water-soluble salt is preferably a monovalent or divalent cationic salt, more preferably an alkali metal salt or an alkaline earth metal salt, and further preferably a sodium salt and a potassium salt, still more preferable. Is a sodium salt.
  • the water-soluble salt When the water-soluble salt is contained in the washing liquid, its concentration is preferably 10 mmol / L or more, more preferably 20 mmol / L or more.
  • the upper limit of the concentration is not particularly limited as long as it does not impair the solubility of impurities, but is preferably 1 mol / L or less, and more preferably 0.1 mol / L or less. More preferably, the water-soluble salt is sodium chloride, and the concentration thereof in the washing liquid is preferably 20 mmol / L or more.
  • RNA from the solid phase material can be preferably carried out by flowing an eluate through the solid phase material and eluting RNA.
  • eluate used for elution of the RNA water, Tris-EDTA (TE) buffer, or the like can be used.
  • washing liquid and eluate the washing liquid and eluate attached to a commercially available RNA purification column may be used.
  • the solid phase material can be washed and eluted by a usual procedure. For example, when the solid phase material is mounted on a spin column, an RNA-solvent mixed solution is passed through the column, a washing solution is added to the column on which RNA is adsorbed, and the mixture is centrifuged to wash away impurities together with the washing solution. Subsequently, the eluate is added to the column and centrifuged to elute RNA from the column.
  • the solid phase material on which the RNA is adsorbed may be treated with DNase.
  • DNase treatment the purity of RNA that can be recovered by removing the contaminating DNA can be improved.
  • the DNase treatment is preferably performed between washing of the solid phase material and RNA elution.
  • the RNA eluted from the solid phase material is the subject's SSL-derived RNA and can be used for various analyzes.
  • mRNA contained in the SSL-derived RNA can be converted into cDNA using an Oligo (dT) primer and then used for gene expression analysis, transcriptome analysis and the like.
  • dT Oligo
  • a method for preparing lipid-derived RNA on the surface of the skin Preparing an aqueous solution containing RNA from the subject's skin surface lipids, The aqueous solution is mixed with a water-soluble organic solvent to prepare a mixed solution, and The water-soluble organic solvent in the mixed solution before contacting the solid phase material, which comprises contacting the mixed solution with the solid phase material and adsorbing RNA in the mixed solution to the solid phase material.
  • the method wherein the final concentration of is 39% by volume or more and 50% by volume or less.
  • the water-soluble organic solvent is Alcohols are preferred More preferably, it is at least one selected from the group consisting of methanol, ethanol, isopropanol, n-propanol and butanol.
  • the method described. [3] The method according to [1] or [2], wherein the preparation of the aqueous solution containing the RNA is preferably a phenol / chloroform method or a modified method thereof.
  • the final concentration of the water-soluble organic solvent in the mixed solution is 40% by volume or more and 46% by volume or less, more preferably 41% by volume or more and 45.5% by volume or less, and more preferably 42% by volume or more.
  • the cleaning solution for cleaning the solid phase material is a solution containing at least one selected from the group consisting of a water-soluble organic solvent and a water-soluble salt.
  • the water-soluble organic solvent is preferably alcohols, more preferably at least one selected from the group consisting of methanol, ethanol, isopropanol, n-propanol and butanol.
  • the water-soluble salt is preferably a monovalent or divalent cationic salt, more preferably an alkali metal salt or an alkaline earth metal salt, further preferably a sodium salt and a potassium salt, and preferably a chloride. It is a salt, more preferably sodium chloride, [8] The method according to the above. [10] The method according to [9], wherein the concentration of the water-soluble organic solvent in the cleaning liquid is preferably 30 to 100% by volume, more preferably 35 to 50% by volume.
  • the concentration of the water-soluble salt in the washing liquid is preferably 10 mmol / L or more and 1 mol / L or less, more preferably 10 mmol / L or more and 0.1 mol / L or less, and further preferably 20 mmol / L or more and 1 mol / L or less.
  • the skin surface lipid (SSL) is preferably contained in an SSL-absorbing material or an SSL adhesive material, and more preferably in an oil-removing paper or an oil-removing film, [1] to The method according to any one of [12].
  • RNA Separation from SSL-1 1) Four healthy men were used as subjects. Sebum (SSL) was collected from the entire face of the subject using an oil removal film (5 x 8 cm, made of polypropylene, 3M Japan). Cut the oil-removing film containing SSL into a suitable size, put the whole in a 5 mL tube, add 1.425 mL of QIAzol® Lysis Reagent (QIAGEN), mix well and mix well to RNA from the sebum on the film. Was eluted.
  • SSL Sebum
  • an oil removal film 5 x 8 cm, made of polypropylene, 3M Japan
  • QIAzol® Lysis Reagent QIAGEN
  • RNA quantification in the obtained eluate was carried out at Agilent 4200 TapeStation system (Agility Technologies) with High Sensitivity RNA Science Techniques (Agilent Technologies) and High Technology.
  • Table 1 shows the amount of RNA recovered from the mixed solution of various ethanol concentrations prepared in 2) above.
  • the RNA yield was improved as compared with the mixed solution having the final ethanol concentration (35% by volume) specified in the conventional protocol.
  • the RNA yield was more significantly improved in the mixed solution having a final ethanol concentration of 40 to 45% by volume.
  • Example 2 RNA Separation from SSL-2 1)
  • An aqueous solution containing RNA was recovered from the SSL of the subject in the same procedure as in 1) of Example 1.
  • the aqueous solution was divided into three equal parts, and each was mixed with equal amounts of ethanol solutions of various concentrations to prepare a mixed solution having a final ethanol concentration of 35, 42.5, and 50% by volume.
  • the entire volume of the mixture was passed through a silica base column (NucleoSpin® RNA Colon; Takara Bio). After that, the column was washed with the washing solution attached to the kit according to the protocol attached to NucleoSpin (registered trademark), RNA was eluted with RNase-free water, and the eluate was collected. According to the protocol attached to NucleoSpin (registered trademark), the final ethanol concentration of the sample solution passed through the column is 35% by volume. RNA in the eluate was quantified in the same procedure as in Example 1-3).
  • Table 2 shows the amount of RNA recovered from the mixed solution of various ethanol concentrations prepared in 1) above.
  • the RNA yield of the mixed solution having a final ethanol concentration of 42.5 and 50% by volume was significantly improved as compared with the mixed solution having a final ethanol concentration of 35% by volume.
  • Example 3 Comprehensive gene expression analysis by next-generation sequencer 1) Of the eluents containing RNA obtained in Example 1 and 2), the final ethanol concentration at the time of column application was 35% by volume, 42.5% by volume, and 50% by volume and a 4-fold diluted solution of each eluate were used as samples for gene expression analysis.
  • cDNA was synthesized from each of the above 1) RNA-containing eluate and its diluted solution by reverse transcription at 42 ° C. for 90 minutes using SuperScript VILO cDNA Synthesis kit (Life Technologies Japan Co., Ltd.). The random primer included in the kit was used as the primer for the reverse transcription reaction.
  • a library containing DNA derived from the 20802 gene was prepared by multiplex PCR. Multiplex PCR is performed using Ion AmpliSeqTransscriptome Human Gene Expression Kit (Life Technologies Japan Co., Ltd.) [99 ° C, 2 minutes ⁇ (99 ° C, 15 seconds ⁇ 62 ° C, 16 minutes) ⁇ 20 cycles ⁇ 4 ° C, Hold. ] Condition.
  • the obtained PCR product was purified by Aple XP (Beckman Coulter, Inc.), and then the buffer was reconstituted, the primer sequence was digested, adapter ligation and purification were performed, and amplification was performed to prepare a library.
  • the prepared library was loaded into Ion 540 Chip and sequenced using the Ion S5 / XL system (Life Technologies Japan Co., Ltd.).
  • Table 3 shows the number of genes detected by sequencing.
  • the number of genes detected was 11,463 in the RNA eluate in which the final ethanol concentration at the time of column application was 35% by volume, whereas the final ethanol concentration at the time of column application was 42.5 and 50% by volume. In the eluate that was, it increased to 13,910 and 13,221, respectively. This tendency was more pronounced in the 4-fold diluted solution of the RNA eluate, that is, the number of detected genes in the diluted solution was 8,898 when the final ethanol concentration at the time of column application was 35% by volume.
  • the number of detected genes from the diluted solution in which the final ethanol concentration at the time of column application was 42.5 and 50% by volume increased significantly to 12,226 and 11,199, respectively, and can be collected from this. It was shown that the preparation method of the present invention is more advantageous for the sample having a smaller amount of RNA.

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Abstract

皮膚表上脂質（ＳＳＬ）に含まれるＲＮＡを回収する方法の提供。ＳＳＬ由来ＲＮＡの調製方法。該方法では、被験体のＳＳＬから調製したＲＮＡを含む水性溶液を水溶性有機溶媒と混合し、得られた混合液を固相材料に接触させてから、ＲＮＡを分離する。該混合液における水溶性有機溶媒の濃度を調整することで、ＲＮＡの収量を向上させる。

Description

皮膚表上脂質由来ＲＮＡの調製方法
　本発明は、皮膚表上脂質由来ＲＮＡの調製方法に関する。
　生体の様々な組織の中でも、皮膚は、外界と接していることから、侵襲性低く生体試料を採取できる組織として注目されている。特許文献１には、皮膚表上脂質（ｓｋｉｎ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｌｉｐｉｄｓ；ＳＳＬ）に被験体の皮膚細胞に由来するＲＮＡが含まれていること、ＳＳＬに含まれるＲＮＡは生体の解析用の試料として有用であることが記載されている。しかし、被験体から回収できるＳＳＬの量は多くなく、またそこに含まれるＲＮＡの量も多くはないため、１被験体のＳＳＬから調製できるＲＮＡの量は微量である。
　生体試料からのＲＮＡ等の核酸の抽出には、一般に、フェノール／クロロホルム法、ＡＧＰＣ（ａｃｉｄ　ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ　ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ－ｐｈｅｎｏｌ－ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）法、それらの変法などが用いられている。これらの原理に基づく核酸抽出試薬（例えばＴＲＩｚｏｌ（登録商標）など）が市販されている。特許文献２には、生体材料を溶解してそこに含まれる核酸を溶出させること、溶出した核酸を含む溶液に最終濃度で１０～６０体積％となるように水溶性有機溶媒を加えてライセート溶液を調製すること、及び、該ライセート溶液と固体材料とを接触させ、固体材料に核酸を吸着させて回収することを含む、核酸抽出法が記載されている。
（特許文献１）国際公開公報第２０１８／００８３１９号
（特許文献２）特開２００７－１１７０８４号公報
　本発明は、皮膚表上脂質由来ＲＮＡの調製方法であって、
　被験体の皮膚表上脂質からＲＮＡを含む水性溶液を調製すること、
　該水性溶液を水溶性有機溶媒と混合して混合液を調製すること、及び、
　該混合液を固相材料に接触させ、該混合液中のＲＮＡを該固相材料に吸着させること、
を含み、該固相材料に接触させる前の該混合液中の該水溶性有機溶媒の最終濃度が３９体積％以上５０体積％以下である、方法を提供する。
発明の詳細な説明
　本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、及びその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。
　本明細書において、「皮膚表上脂質（ｓｋｉｎ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｌｉｐｉｄｓ；ＳＳＬ）」とは、皮膚の表上に存在する脂溶性画分をいい、皮脂と呼ばれることもある。一般に、ＳＳＬは、皮膚にある皮脂腺等の外分泌腺から分泌された分泌物を主に含み、皮膚表面を覆う薄い層の形で皮膚表上に存在している。
　本明細書において、「皮膚」とは、特に限定しない限り、体表の表皮、真皮、毛包、ならびに汗腺、皮脂腺及びその他の腺などの組織を含む領域の総称である。
　皮膚表上脂質中（ＳＳＬ）からのＲＮＡの収量の向上が望まれる。本発明は、ＳＳＬに含まれるＲＮＡを回収する方法に関する。
　本発明者は、以前に、ＳＳＬに被験体の皮膚細胞に由来するＲＮＡが含まれており、これを用いて生体の解析が可能であることを見出し、特許出願した（特許文献１）。さらに本発明者は、ＳＳＬから調製したＲＮＡを含む水性溶液に対して、所定量の水溶性有機溶媒を添加し、固相材料に接触させて、該混合液中のＲＮＡを効率よく該固相材料に吸着させることで、ＳＳＬからのＲＮＡの収量が向上することを見出した。今回、本発明者は、被験体のＳＳＬに含まれるＲＮＡをより効率よく回収することができる、ＳＳＬ由来ＲＮＡの調製方法を提供する。
　本発明の方法によれば、ＳＳＬに含まれるＲＮＡを高収量で回収することができる。本発明は、ＲＮＡ試料を用いた解析（例えば、遺伝子解析、診断等）におけるＲＮＡ遺伝子検出数を増加させ、解析の精度や効率を向上させる。
　本発明の方法における被験体は、皮膚上にＳＳＬを有する生物であればよい。被験体の例としては、ヒト及び非ヒト哺乳動物を含む哺乳動物が挙げられ、好ましくはヒトである。例えば、該被験体は、自身の核酸の解析を必要とするか又は希望するヒト又は非ヒト哺乳動物であり得る。あるいは、該被験体は、皮膚における遺伝子発現解析、又は核酸を用いた皮膚もしくは皮膚以外の部位の状態の解析を必要とするか又は希望するヒト又は非ヒト哺乳動物であり得る。
　被験体のＳＳＬは、該被験体の皮膚細胞で発現したＲＮＡを含み、好ましくは該被験体の表皮、皮脂腺、毛包、汗腺、及び真皮のいずれかで発現したＲＮＡを含み、より好ましくは該被験体の表皮、皮脂腺、毛包、及び汗腺のいずれかで発現したＲＮＡを含む（特許文献１参照）。したがって、本発明の方法により調製されるＳＳＬ由来ＲＮＡは、好ましくは被験体の表皮、皮脂腺、毛包、汗腺及び真皮から選択される少なくとも１部位由来のＲＮＡであり、より好ましくは表皮、皮脂腺、毛包及び汗腺から選択される少なくとも１部位由来のＲＮＡである。
　本発明の方法で調製されるＳＳＬ由来ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｍａｌｌ　ＲＮＡ（例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ　ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）等）、ｌｏｎｇ　ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ　ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ（ｌｉｎｃ）ＲＮＡ、などを含み得る。上記に上げたＲＮＡの１種又は２種以上がＳＳＬに含まれ得る。
　被験体のＳＳＬが採取される皮膚の部位としては、頭、顔、首、体幹、手足等の身体の任意の部位の皮膚、アトピー、ニキビ、乾燥、炎症（赤み）、腫瘍等の疾患を有する皮膚、創傷を有する皮膚、などが挙げられるが、特に限定されない。
　被験体の皮膚からのＳＳＬの採取には、皮膚からのＳＳＬの回収又は除去に用いられているあらゆる手段を採用することができる。好ましくは、後述するＳＳＬ吸収性素材、ＳＳＬ接着性素材、又は皮膚からＳＳＬをこすり落とす器具を使用することができる。ＳＳＬ吸収性素材又はＳＳＬ接着性素材としては、ＳＳＬに親和性を有する素材であれば特に限定されず、例えばポリプロピレン、パルプ等が挙げられる。皮膚からのＳＳＬの採取手順のより詳細な例としては、あぶら取り紙、あぶら取りフィルム等のシート状素材へＳＳＬを吸収させる方法、ガラス板、テープ等へＳＳＬを接着させる方法、スパーテル、スクレイパー等によりＳＳＬをこすり落として回収する方法、などが挙げられる。ＳＳＬの吸着性を向上させるため、脂溶性の高い溶媒を予め含ませたＳＳＬ吸収性素材を用いてもよい。一方、ＳＳＬ吸収性素材が水溶性の高い溶媒や水分を含んでいると、ＳＳＬの吸着が阻害されるため好ましくない。ＳＳＬ吸収性素材は、乾燥した状態で用いることが好ましい。
　被験体から採取されたＲＮＡ含有ＳＳＬは、後述するＲＮＡ調製に用いるまで保存されてもよい。該ＲＮＡ含有ＳＳＬは、ＳＳＬ吸収性素材又はＳＳＬ接着性素材に吸収又は接着させた状態のまま保存することができる。該ＲＮＡ含有ＳＳＬは、従来一般的なＲＮＡの保存条件（例えば－８０℃）で保存されてもよいが、よりマイルドな条件で保存することが可能である（国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ２０１９／０４３０４０）。例えば、該ＲＮＡ含有ＳＳＬの保存の温度条件は、０℃以下であればよく、好ましくは－１０℃以下、より好ましくは－２０℃以下であればよい。該保存の期間は、特に限定されないが、好ましくは１２ヶ月以下、より好ましくは６ヶ月以下、さらに好ましくは３ヶ月以下である。
　本発明によるＳＳＬ由来ＲＮＡの調製方法は、被験体のＳＳＬからＲＮＡを含む水性溶液を調製すること、該ＲＮＡを含む水性溶液を水溶性有機溶媒と混合して混合液を調製すること、及び、該混合液を固相材料に接触させることを含む。該固相材料から、目的のＳＳＬ由来ＲＮＡが回収される。本発明において、ＳＳＬからのＲＮＡを含む水性溶液の調製に用いる方法としては、酸性フェノール（例えば、水飽和フェノール）とクロロホルムの混液を用いる古典的なＲＮＡ抽出のためのフェノール／クロロホルム法、及びその変法、例えばＰＣＩ（Ｐｈｅｎｏｌ／Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ／Ｉｓｏａｍｙｌ　ａｌｃｏｈｏｌ）法、ＡＧＰＣ（ａｃｉｄ　ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ　ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ－ｐｈｅｎｏｌ－ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）法、グアニジンチオシアネートとフェノールをあらかじめ混合しておくＡＧＰＣ変法などが挙げられ、好ましくはＡＧＰＣ変法である。
　本発明の方法において、ＳＳＬからのＲＮＡを含む水性溶液の調製の手順は、基本的にフェノール／クロロホルム法での生体試料からのＲＮＡ抽出手順に準ずる。具体的な手順の例を以下に説明する：被験体から採取されたＳＳＬ（又はそれを含むＳＳＬ吸収性素材もしくはＳＳＬ接着性素材）に、酸性フェノールを加えて混合し、次いでクロロホルムを加えて混合することで、該ＳＳＬからＲＮＡを抽出する。次いで、得られた混合液を遠心分離して、ＲＮＡを含む水層（上層）とフェノール－クロロホルム層（下層）に分離させる（さらに中間層が分離されることがある）。該水層を回収することで、該ＳＳＬからＲＮＡを含む水性溶液を調製する。
　該ＲＮＡ抽出に用いる酸性フェノールとしては、水飽和フェノールを単独で用いてもよいが、フェノールを含む試薬混合液を用いてもよい。例えば、グアニジンチオシアネートを含む市販のＲＮＡ抽出用試薬（例えばＴＲＩｚｏｌ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ、ＱＩＡｚｏｌ　Ｌｙｓｉｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ、ＩＳＯＧＥＮ等）を含む、生体試料からのＲＮＡ抽出用の試薬液を、該フェノールを含む試薬混合液として用いることができる。ＳＳＬからのＲＮＡ抽出効率の観点からは、上述したような市販のＲＮＡ抽出用の試薬液を用いることが好ましい。すなわちＡＧＰＣ変法でＲＮＡ抽出を行うのが好ましい。該ＲＮＡ抽出に用いるクロロホルムとしては、クロロホルムを単独で用いることが好ましいが、必要な量のＲＮＡが水層に分配される限りにおいて、クロロホルムを含む試薬混合液を用いてもよい。
　必要に応じて、調製した該ＲＮＡを含む水性溶液を、再度フェノール及びクロロホルムと混合し、遠心分離して水層を回収してもよい。この手順を２回以上繰り返してもよい。さらに、調製した該ＲＮＡを含む水性溶液を、再度クロロホルムと混合し、遠心分離して水層を回収してもよい。この手順を２回以上繰り返してもよい。
　次いで、得られた該ＲＮＡを含む水性溶液を水溶性有機溶媒と混合する。該水溶性有機溶媒としては、１級アルコール、２級アルコール、３級アルコールなどのアルコール類が挙げられ、このうちメタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ－プロパノール及びブタノールが好ましく使用され得る。ブタノールは直鎖状及び分岐状のいずれでもよい。これらのアルコール類は単独で又は２種以上組み合わせて使用することができる。環境負荷及び作業者への有毒性を低減する観点からは、エタノールがより好ましい。このとき、該ＲＮＡを含む水性溶液と該水溶性有機溶媒との混合液（以下、ＲＮＡ－溶媒混合液ともいう）における該水溶性有機溶媒の最終濃度（後述する固相材料にロードし、接触させる直前の濃度）は、３９体積％以上５０体積％以下であればよく、好ましくは４０体積％以上４６体積％以下であり、より好ましくは４１体積％以上４５．５体積％以下、さらに好ましくは４２体積％以上４５体積％以下である。該混合液における該水溶性有機溶媒の濃度を上記の範囲に調整することで、ＳＳＬからのＲＮＡの収量が向上する。なお、本発明において体積％とは、２５℃、１気圧における体積％を意味する。
　次いで、該ＲＮＡ－溶媒混合液からＲＮＡを回収する。ＲＮＡの回収は、固相材料を用いた核酸分離法に従って行われ得る。例えば、水溶性有機溶媒の最終濃度を上記のとおりに調整した該ＲＮＡ－溶媒混合液を該固相材料に接触させて、該混合液中のＲＮＡを該固相材料に吸着させる。次いで、必要に応じて該固相材料から夾雑物を洗浄した後、該固相材料からＲＮＡを脱離させ回収する。
　該固相材料としては、核酸吸着性の固相材料であればよく、例えばシリカベースの固相材料が挙げられる。ＲＮＡの吸着性の観点からは、該固相材料は、多孔性のシリカメンブレンを有する固相材料であることが好ましい。夾雑物の洗浄やＲＮＡの溶出の操作を容易にする観点からは、該固相材料は、スピンカラム、カラム付きピペットチューブ、又は遠心チューブもしくはピペットチューブに装着可能なカラムカートリッジの形態であることが好ましく、さらに汚染防止と操作効率の観点からは、スピンカラム又は遠心チューブに装着可能なカラムカートリッジの形態であることがより好ましい。さらに、個々の被験体からＳＳＬを介して採取されるＲＮＡの量が比較的少ないことを考慮すると、該固相材料は、ミニプレップカラムなどの少量のＲＮＡを精製できる形態であることが好ましい。該固相材料には、市販のＲＮＡ精製用カラムを用いることができ、その例としては、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｓｐｉｎ　Ｃｏｌｕｍｎ（ＧＩＡＧＥＮ）、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）　ＲＮＡ　Ｃｏｌｕｍｎ（タカラバイオ）等が挙げられる。
　該固相材料からの夾雑物の洗浄に用いられる洗浄液としては、水溶性有機溶媒及び水溶性塩の少なくとも１種を含む溶液（例えば水溶液）などを用いることができる。該洗浄液に含まれる水溶性有機溶媒としては、アルコール類を用いることができる。アルコール類としては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ－プロパノール、ブタノールなどが挙げられる。ブタノールは直鎖状及び分岐状のいずれでもよい。これらアルコールは、複数種類を併用することもできる。中でもエタノールを用いることが好ましい。該洗浄液中に含まれる該水溶性有機溶媒の量は、該固相材料上のＲＮＡを保持し夾雑物を洗浄できる量であればよく、当業者が適宜決定することができるが、３０～１００体積％が好ましく、３５～５０体積％がより好ましい。一方、該洗浄液に含まれる水溶性塩は、ハロゲン化物の塩であることが好ましく、中でも塩化物塩が好ましい。また、該水溶性塩は、一価又は二価のカチオン塩であることが好ましく、より好ましくはアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩であり、さらに好ましくはナトリウム塩及びカリウム塩であり、なお好ましくはナトリウム塩である。該水溶性塩が洗浄液中に含まれる場合、その濃度は１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上が好ましく、２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上がより好ましい。一方、濃度の上限は、不純物の溶解性を損なわない範囲であれば特に問わないが、１ｍｏｌ／Ｌ以下が好ましく、０．１ｍｏｌ／Ｌ以下がより好ましい。さらに好ましくは、該水溶性塩は塩化ナトリウムであり、その洗浄液中の濃度は２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上であると好ましい。
　該固相材料からのＲＮＡの脱離は、好ましくは、該固相材料に溶出液を流し、ＲＮＡを溶出させることで行われ得る。該ＲＮＡの溶出に用いられる溶出液としては、水やＴｒｉｓ－ＥＤＴＡ（ＴＥ）バッファーなどを用いることができる。該洗浄液及び溶出液には、市販のＲＮＡ精製用カラムに付属の洗浄液及び溶出液を用いてもよい。該固相材料の洗浄や溶出は、通常の手順で行うことができる。例えば、該固相材料がスピンカラムに装着されている場合、カラムにＲＮＡ－溶媒混合液を通液し、ＲＮＡが吸着したカラムに洗浄液を添加し、遠心して洗浄液とともに夾雑物を洗い流す。続いて、カラムに溶出液を添加し、遠心してＲＮＡをカラムから溶出させる。
　必要に応じて、該ＲＮＡが吸着した固相材料をＤＮａｓｅで処理してもよい。ＤＮａｓｅ処理により、混入したＤＮＡを除去して回収するＲＮＡの純度を向上させることができる。該ＤＮａｓｅ処理は、該固相材料の洗浄とＲＮＡ溶出との間に行われることが好ましい。
　該固相材料から溶出されたＲＮＡは、被験体のＳＳＬ由来ＲＮＡであり、各種解析に使用することができる。例えば、該ＳＳＬ由来ＲＮＡに含まれるｍＲＮＡをＯｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマーを用いてｃＤＮＡに変換した後、遺伝子発現解析、トランスクリプトーム解析などに用いることができる。あるいは、被験体のＳＳＬ由来ＲＮＡにおける標的ＲＮＡの有無を調べることで、該被験体の機能解析、疾患の診断、該被験体に投与した薬物の効能評価などを行うことができる。
　本発明の例示的実施形態として、以下の物質、製造方法、用途、方法等をさらに本明細書に開示する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
〔１〕皮膚表上脂質由来ＲＮＡの調製方法であって、
　被験体の皮膚表上脂質からＲＮＡを含む水性溶液を調製すること、
　該水性溶液を水溶性有機溶媒と混合して、混合液を調製すること、及び、
　該混合液を固相材料に接触させ、該混合液中のＲＮＡを該固相材料に吸着させること、を含み、該記固相材料に接触させる前の該混合液中の該水溶性有機溶媒の最終濃度が３９体積％以上５０体積％以下である、方法。
〔２〕前記水溶性有機溶媒が、
　好ましくはアルコール類であり、
　より好ましくはメタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ－プロパノール及びブタノールからなる群より選択される少なくとも１種である、
〔１〕記載の方法。
〔３〕好ましくは、前記ＲＮＡを含む水性溶液の調製が、フェノール／クロロホルム法又はその変法による調製である、〔１〕又は〔２〕記載の方法。
〔４〕好ましくは、前記混合液中の前記水溶性有機溶媒の最終濃度が４０体積％以上４６体積％以下、より好ましくは４１体積％以上４５．５体積％以下、より好ましくは４２体積％以上４５体積％以下である、〔１〕～〔３〕のいずれか１項記載の方法。
〔５〕前記固相材料が、好ましくはシリカベースの固相材料であり、より好ましくは多孔性のシリカメンブレンを有する固相材料である、〔１〕～〔４〕のいずれか１項記載の方法。
〔６〕前記固相材料が、好ましくは、スピンカラム、カラム付きピペットチューブ、又は遠心チューブもしくはピペットチューブに装着可能なカラムカートリッジの形態である、〔５〕記載の方法。
〔７〕好ましくは、前記固相材料からＲＮＡを回収することをさらに含む、〔１〕～〔６〕のいずれか１項記載の方法。
〔８〕好ましくは、前記ＲＮＡが吸着した前記固相材料を洗浄し、次いで該固相材料から該ＲＮＡを溶出させることをさらに含む、〔１〕～〔７〕のいずれか１項記載の方法。
〔９〕好ましくは、前記固相材料の洗浄のための洗浄液が、水溶性有機溶媒及び水溶性塩からなる群より選択される少なくとも１種を含む溶液であり、
ここで、
　該水溶性有機溶媒が、好ましくはアルコール類であり、より好ましくはメタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ－プロパノール及びブタノールからなる群より選択される少なくとも１種であり、
　該水溶性塩が、好ましくは一価又は二価のカチオン塩であり、より好ましくはアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩であり、さらに好ましくはナトリウム塩及びカリウム塩であり、かつ好ましくは塩化物塩であり、なお好ましくは塩化ナトリウムである、
〔８〕記載の方法。
〔１０〕前記洗浄液における前記水溶性有機溶媒の濃度が、好ましくは３０～１００体積％、より好ましくは３５～５０体積％である、〔９〕記載の方法。
〔１１〕前記洗浄液における前記水溶性塩の濃度が、好ましくは１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上１ｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上０．１ｍｏｌ／Ｌ以下、さらに好ましくは２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上１ｍｏｌ／Ｌ以下、さらに好ましくは２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上０．１ｍｏｌ／Ｌ以下である、〔９〕又は〔１０〕記載の方法。
〔１２〕前記固相材料からのＲＮＡの溶出のための溶出液が水又はバッファーである、〔８〕～〔１１〕のいずれか１項記載の方法。
〔１３〕前記皮膚表上脂質（ＳＳＬ）が、好ましくはＳＳＬ吸収性素材又はＳＳＬ接着性素材に含まれており、より好ましくはあぶら取り紙又はあぶら取りフィルムに含まれている、〔１〕～〔１２〕のいずれか１項記載の方法。
　以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例１　ＳＳＬからのＲＮＡ分離－１
１）健常男性４名を被験者とした。あぶら取りフィルム（５×８ｃｍ、ポリプロピレン製、３Ｍジャパン）を用いて、被験者の全顔から皮脂（ＳＳＬ）を回収した。ＳＳＬを含むあぶら取りフィルムを適当な大きさに切断し、その全部を５ｍＬチューブに入れ、ＱＩＡｚｏｌ（登録商標）　Ｌｙｓｉｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ）１．４２５ｍＬを添加し、よく混合してフィルム上の皮脂からＲＮＡを溶出させた。得られた溶液１．３ｍＬにクロロホルム２６０μＬを添加し、よく混合した後、遠心（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分間）し、水層（上層）０．７ｍＬを、ＲＮＡを含む水性溶液として回収した。
２）上記１）で得た４名分のＲＮＡを含む水性溶液を混合後、７つに等分し、各々を等量の各種濃度のエタノール溶液と混合して、最終エタノール濃度が３５～５０体積％の範囲内にある各種混合液を調製した。該混合液の全量をシリカベースカラム（ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ｓｐｉｎ　ｃｏｌｕｍｎ；ＱＩＡＧＥＮ）に通した。その後はＲＮｅａｓｙ（登録商標）に付属のプロトコルに準じて、キット付属洗浄液でカラムを洗浄し、次いでＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒにてＲＮＡを溶出させ、溶出液を回収した。なお、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）付属のプロトコルでは、カラムに通すサンプル溶液の最終エタノール濃度は３５体積％である。
３）得られた溶出液中のＲＮＡ定量は、Ａｇｉｌｅｎｔ　４２００　ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にて、Ｈｉｇｈ　Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ＲＮＡ　Ｓｃｒｅｅｎ　Ｔａｐｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＨｉｇｈ　Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ＲＮＡ　ＳｃｒｅｅｎＴａｐｅ　Ｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて実施した。
４）上記２）で調製した各種エタノール濃度の混合液から回収されたＲＮＡの量を表１に示す。最終エタノール濃度が４０体積％以上の混合液では、従来プロトコルに指示された最終エタノール濃度（３５体積％）の混合液に比べて、ＲＮＡ収量が向上した。最終エタノール濃度４０～４５体積％の混合液で、より顕著にＲＮＡ収量が向上した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
実施例２　ＳＳＬからのＲＮＡ分離－２
１）健常男性１名を被験者とした。実施例１の１）と同様の手順で被験者のＳＳＬからＲＮＡを含む水性溶液を回収した。該水性溶液を３つに等分し、各々を等量の各種濃度のエタノール溶液と混合して、最終エタノール濃度３５、４２．５、及び５０体積％の混合液を調製した。該混合液の全量をシリカベースカラム（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）　ＲＮＡ　Ｃｏｌｕｍｎ；タカラバイオ）に通した。その後はＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）に付属のプロトコルに準じて、キット付属洗浄液でカラムを洗浄し、ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒにてＲＮＡを溶出させ、溶出液を回収した。なおＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）付属のプロトコルでは、カラムに通すサンプル溶液の最終エタノール濃度は３５体積％である。実施例１の３）と同様の手順で溶出液中のＲＮＡを定量した。
２）上記１）で調製した各種エタノール濃度の混合液から回収されたＲＮＡの量を表２に示す。最終エタノール濃度４２．５及び５０体積％の混合液では、最終エタノール濃度３５体積％の混合液に比べてＲＮＡ収量が顕著に向上した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
実施例３　次世代シーケンサーによる網羅的遺伝子発現解析
１）実施例１の２）で得られたＲＮＡを含む溶出液のうち、カラムアプライ時の最終エタノール濃度が３５体積％、４２．５体積％及び５０体積％のもの、ならびに各々の溶出液の４倍希釈溶液を、遺伝子発現解析用のサンプルとして使用した。
２）上記１）のＲＮＡを含む溶出液及びその希釈溶液のそれぞれから、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＶＩＬＯ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて４２℃、９０分間逆転写を行うことでｃＤＮＡを合成した。逆転写反応のプライマーには、キットに付属しているランダムプライマーを使用した。得られたｃＤＮＡから、マルチプレックスＰＣＲにより２０８０２遺伝子に由来するＤＮＡを含むライブラリーを調製した。マルチプレックスＰＣＲは、Ｉｏｎ　ＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて、［９９℃、２分→（９９℃、１５秒→６２℃、１６分）×２０サイクル→４℃、Ｈｏｌｄ］の条件で行った。得られたＰＣＲ産物は、Ａｍｐｕｒｅ　ＸＰ（ベックマン・コールター株式会社）で精製した後に、バッファーの再構成、プライマー配列の消化、アダプターライゲーションと精製、増幅を行い、ライブラリーを調製した。調製したライブラリーをＩｏｎ　５４０　Ｃｈｉｐにローディングし、Ｉｏｎ　Ｓ５／ＸＬシステム（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いてシーケンシングした。
　シーケンシングにより検出された遺伝子数を表３に示す。検出された遺伝子数は、カラムアプライ時の最終エタノール濃度が３５体積％であったＲＮＡ溶出液では１１，４６３であったのに対し、カラムアプライ時の最終エタノール濃度が４２．５及び５０体積％であった溶出液では、１３，９１０及び１３，２２１にそれぞれ増加した。この傾向は、ＲＮＡ溶出液の４倍希釈溶液においてより顕著であった、すなわち、カラムアプライ時の最終エタノール濃度が３５体積％であった希釈溶液からの検出遺伝子数が８，８９８であったのに対し、カラムアプライ時の最終エタノール濃度が４２．５及び５０体積％であった希釈溶液からの検出遺伝子数は、それぞれ１２，２２６及び１１，１９９と大幅に増加し、このことから、採取できるＲＮＡ量が少ないサンプルほど本発明の調製方法が有利であることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003

Claims (6)

  1. 　皮膚表上脂質由来ＲＮＡの調製方法であって、
    　被験体の皮膚表上脂質からＲＮＡを含む水性溶液を調製すること、
    　該水性溶液を水溶性有機溶媒と混合して、混合液を調製すること、及び、
    　該混合液を固相材料に接触させ、該混合液中のＲＮＡを該固相材料に吸着させること、
    を含み、該固相材料に接触させる前の該混合液中の該水溶性有機溶媒の最終濃度が３９体積％以上５０体積％以下である、方法。
  2. 　前記水溶性有機溶媒がメタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ－プロパノール及びブタノールからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１記載の方法。
  3. 　前記ＲＮＡを含む水性溶液の調製が、フェノール／クロロホルム法又はその変法による調製である、請求項１又は２記載の方法。
  4. 　前記水溶性有機溶媒の最終濃度が４０体積％以上４６体積％以下である、請求項１～３のいずれか１項記載の方法。
  5. 　前記固相材料がシリカベースの固相材料である、請求項１～４のいずれか１項記載の方法。
  6. 　前記固相材料からＲＮＡを回収することをさらに含む、請求項１～５のいずれか１項記載の方法。 
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