KR20220139360A - 피부 표면 지질 유래 rna 의 조제 방법 - Google Patents

Abstract

피부 표면 지질 (SSL) 에 포함되는 RNA 를 회수하는 방법의 제공. SSL 유래 RNA 의 조제 방법. 그 방법에서는, 피험체의 SSL 로부터 조제한 RNA 를 포함하는 수성 용액을 수용성 유기 용매와 혼합하고, 얻어진 혼합액을 고상 재료에 접촉시키고 나서, RNA 를 분리한다. 그 혼합액에 있어서의 수용성 유기 용매의 농도를 조정함으로써, RNA 의 수량을 향상시킨다.

Description

피부 표면 지질 유래 RNA 의 조제 방법

본 발명은, 피부 표면 지질 유래 RNA 의 조제 방법에 관한 것이다.

생체의 여러 가지 조직 중에서도, 피부는, 외계와 접하고 있는 점에서, 침습성 낮게 생체 시료를 채취할 수 있는 조직으로서 주목받고 있다. 특허문헌 1 에는, 피부 표면 지질 (skin surface lipids ; SSL) 에 피험체의 피부 세포에서 유래하는 RNA 가 포함되어 있는 것, SSL 에 포함되는 RNA 는 생체의 해석용 시료로서 유용한 것이 기재되어 있다. 그러나, 피험체로부터 회수할 수 있는 SSL 의 양은 많지 않고, 또 그곳에 포함되는 RNA 의 양도 많지는 않기 때문에, 1 피험체의 SSL 로부터 조제할 수 있는 RNA 의 양은 미량이다.

생체 시료로부터의 RNA 등의 핵산의 추출에는, 일반적으로, 페놀/클로로포름법, AGPC (acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction) 법, 그들의 변법 등이 이용되고 있다. 이들 원리에 근거하는 핵산 추출 시약 (예를 들어 TRIzol (등록상표) 등) 이 시판되고 있다. 특허문헌 2 에는, 생체 재료를 용해하여 그곳에 포함된 핵산을 용출시키는 것, 용출된 핵산을 포함하는 용액에 최종 농도로 10 ∼ 60 체적％ 가 되도록 수용성 유기 용매를 첨가하여 라이세이트 용액을 조제하는 것, 및, 그 라이세이트 용액과 고체 재료를 접촉시켜, 고체 재료에 핵산을 흡착시켜 회수하는 것을 포함하는, 핵산 추출법이 기재되어 있다.

국제 공개 공보 제 2018/008319호 일본 공개특허공보 2007-117084호

본 발명은, 피부 표면 지질 유래 RNA 의 조제 방법으로서,

피험체의 피부 표면 지질로부터 RNA 를 포함하는 수성 용액을 조제하는 것,

그 수성 용액을 수용성 유기 용매와 혼합하여 혼합액을 조제하는 것, 및,

그 혼합액을 고상 재료에 접촉시켜, 그 혼합액 중의 RNA 를 그 고상 재료에 흡착시키는 것

을 포함하고, 그 고상 재료에 접촉시키기 전의 그 혼합액 중의 그 수용성 유기 용매의 최종 농도가 39 체적％ 이상 50 체적％ 이하인, 방법을 제공한다.

본 명세서 중에서 인용된 모든 특허문헌, 비특허문헌, 및 그 밖의 간행물은, 그 전체가 본 명세서 중에 있어서 참고로서 원용된다.

본 명세서에 있어서, 「피부 표면 지질 (skin surface lipids ; SSL)」이란, 피부의 표면에 존재하는 지용성 획분을 말하고, 피지로 불리는 경우도 있다. 일반적으로, SSL 은, 피부에 있는 피지선 등의 외분비선으로부터 분비된 분비물을 주로 포함하고, 피부 표면을 덮는 얇은 층의 형태로 피부 표면에 존재하고 있다.

본 명세서에 있어서, 「피부」란, 특별히 한정하지 않는 한, 체표의 표피, 진피, 모포, 그리고 한선, 피지선 및 그 밖의 선 등의 조직을 포함하는 영역의 총칭이다.

피부 표면 지질 중 (SSL) 으로부터의 RNA 의 수량 (收量) 의 향상이 요망된다. 본 발명은, SSL 에 포함되는 RNA 를 회수하는 방법에 관한 것이다.

본 발명자는, 이전에, SSL 에 피험체의 피부 세포에서 유래하는 RNA 가 포함되어 있고, 이것을 사용하여 생체의 해석이 가능한 것을 알아내어, 특허 출원하였다 (특허문헌 1). 또한 본 발명자는, SSL 로부터 조제한 RNA 를 포함하는 수성 용액에 대해, 소정량의 수용성 유기 용매를 첨가하고, 고상 재료에 접촉시켜, 그 혼합액 중의 RNA 를 효율적으로 그 고상 재료에 흡착시킴으로써, SSL 로부터의 RNA 의 수량이 향상되는 것을 알아냈다. 금회, 본 발명자는, 피험체의 SSL 에 포함되는 RNA 를 보다 효율적으로 회수할 수 있는, SSL 유래 RNA 의 조제 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에 의하면, SSL 에 포함되는 RNA 를 고수량으로 회수할 수 있다. 본 발명은, RNA 시료를 사용한 해석 (예를 들어, 유전자 해석, 진단 등) 에 있어서의 RNA 유전자 검출수를 증가시켜, 해석의 정밀도나 효율을 향상시킨다.

본 발명의 방법에 있어서의 피험체는, 피부 상에 SSL 을 갖는 생물이면 된다. 피험체의 예로는, 인간 및 비인간 포유 동물을 포함하는 포유 동물을 들 수 있고, 바람직하게는 인간이다. 예를 들어, 그 피험체는, 자신의 핵산의 해석을 필요로 하거나 또는 희망하는 인간 또는 비인간 포유 동물일 수 있다. 혹은, 그 피험체는, 피부에 있어서의 유전자 발현 해석, 또는 핵산을 사용한 피부 혹은 피부 이외의 부위의 상태의 해석을 필요로 하거나 또는 희망하는 인간 또는 비인간 포유 동물일 수 있다.

피험체의 SSL 은, 그 피험체의 피부 세포에서 발현한 RNA 를 포함하고, 바람직하게는 그 피험체의 표피, 피지선, 모포, 한선, 및 진피 중 어느 것에서 발현한 RNA 를 포함하고, 보다 바람직하게는 그 피험체의 표피, 피지선, 모포, 및 한선 중 어느 것에서 발현한 RNA 를 포함한다 (특허문헌 1 참조). 따라서, 본 발명의 방법에 의해 조제되는 SSL 유래 RNA 는, 바람직하게는 피험체의 표피, 피지선, 모포, 한선 및 진피에서 선택되는 적어도 1 부위 유래의 RNA 이며, 보다 바람직하게는 표피, 피지선, 모포 및 한선에서 선택되는 적어도 1 부위 유래의 RNA 이다.

본 발명의 방법으로 조제되는 SSL 유래 RNA 는, mRNA, tRNA, rRNA, small RNA (예를 들어, microRNA (miRNA), small interfering RNA (siRNA), Piwi-interacting RNA (piRNA) 등), long intergenic non-coding (linc) RNA 등을 포함할 수 있다. 상기에 예시한 RNA 의 1 종 또는 2 종 이상이 SSL 에 포함될 수 있다.

피험체의 SSL 이 채취되는 피부의 부위로는, 머리, 얼굴, 목, 체간, 수족 등의 신체의 임의의 부위의 피부, 아토피, 여드름, 건조, 염증 (홍조), 종양 등의 질환을 갖는 피부, 창상을 갖는 피부 등을 들 수 있고, 특별히 한정되지 않는다.

피험체의 피부로부터의 SSL 의 채취에는, 피부로부터의 SSL 의 회수 또는 제거에 이용되고 있는 모든 수단을 채용할 수 있다. 바람직하게는, 후술하는 SSL 흡수성 소재, SSL 접착성 소재, 또는 피부로부터 SSL 을 문질러 떨어뜨리는 기구를 사용할 수 있다. SSL 흡수성 소재 또는 SSL 접착성 소재로는, SSL 에 친화성을 갖는 소재이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 폴리프로필렌, 펄프 등을 들 수 있다. 피부로부터의 SSL 의 채취 순서의 보다 상세한 예로는, 기름 제거 종이, 기름 제거 필름 등의 시트상 소재에 SSL 을 흡수시키는 방법, 유리판, 테이프 등에 SSL 을 접착시키는 방법, 스패튤라, 스크레이퍼 등에 의해 SSL 을 문질러 떨어뜨려 회수하는 방법 등을 들 수 있다. SSL 의 흡착성을 향상시키기 위해, 지용성이 높은 용매를 미리 포함시킨 SSL 흡수성 소재를 사용해도 된다. 한편, SSL 흡수성 소재가 수용성이 높은 용매나 수분을 포함하고 있으면, SSL 의 흡착이 저해되기 때문에 바람직하지 않다. SSL 흡수성 소재는, 건조한 상태에서 사용하는 것이 바람직하다.

피험체로부터 채취된 RNA 함유 SSL 은, 후술하는 RNA 조제에 사용할 때까지 보존되어도 된다. 그 RNA 함유 SSL 은, SSL 흡수성 소재 또는 SSL 접착성 소재에 흡수 또는 접착시킨 상태인 채 보존할 수 있다. 그 RNA 함유 SSL 은, 종래 일반적인 RNA 의 보존 조건 (예를 들어 -80 ℃) 에서 보존되어도 되는데, 보다 마일드한 조건에서 보존하는 것이 가능하다 (국제 출원 번호 PCT/JP2019/043040). 예를 들어, 그 RNA 함유 SSL 의 보존의 온도 조건은, 0 ℃ 이하이면 되고, 바람직하게는 -10 ℃ 이하, 보다 바람직하게는 -20 ℃ 이하이면 된다. 그 보존의 기간은, 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 12 개월 이하, 보다 바람직하게는 6 개월 이하, 더욱 바람직하게는 3 개월 이하이다.

본 발명에 의한 SSL 유래 RNA 의 조제 방법은, 피험체의 SSL 로부터 RNA 를 포함하는 수성 용액을 조제하는 것, 그 RNA 를 포함하는 수성 용액을 수용성 유기 용매와 혼합하여 혼합액을 조제하는 것, 및, 그 혼합액을 고상 재료에 접촉시키는 것을 포함한다. 그 고상 재료로부터, 목적의 SSL 유래 RNA 가 회수된다. 본 발명에 있어서, SSL 로부터의 RNA 를 포함하는 수성 용액의 조제에 사용하는 방법으로는, 산성 페놀 (예를 들어, 수포화 (水飽和) 페놀) 과 클로로포름의 혼액을 사용하는 고전적인 RNA 추출을 위한 페놀/클로로포름법, 및 그 변법, 예를 들어 PCI (Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol) 법, AGPC (acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction) 법, 구아니딘티오시아네이트와 페놀을 미리 혼합해 두는 AGPC 변법 등을 들 수 있고, 바람직하게는 AGPC 변법이다.

본 발명의 방법에 있어서, SSL 로부터의 RNA 를 포함하는 수성 용액의 조제의 순서는, 기본적으로 페놀/클로로포름법에 의한 생체 시료로부터의 RNA 추출 순서에 준한다. 구체적인 순서의 예를 이하에 설명한다 : 피험체로부터 채취된 SSL (또는 그것을 포함하는 SSL 흡수성 소재 혹은 SSL 접착성 소재) 에, 산성 페놀을 첨가하여 혼합하고, 이어서 클로로포름을 첨가하여 혼합함으로써, 그 SSL 로부터 RNA 를 추출한다. 이어서, 얻어진 혼합액을 원심 분리하여, RNA 를 포함하는 수층 (상층) 과 페놀-클로로포름층 (하층) 으로 분리시킨다 (추가로 중간층이 분리되는 경우가 있다). 그 수층을 회수함으로써, 그 SSL 로부터 RNA 를 포함하는 수성 용액을 조제한다.

그 RNA 추출에 사용하는 산성 페놀로는, 수포화 페놀을 단독으로 사용해도 되지만, 페놀을 포함하는 시약 혼합액을 사용해도 된다. 예를 들어, 구아니딘티오시아네이트를 포함하는 시판되는 RNA 추출용 시약 (예를 들어 TRIzol (등록상표) Reagent, QIAzol Lysis Reagent, ISOGEN 등) 을 포함하는, 생체 시료로부터의 RNA 추출용의 시약액을, 그 페놀을 포함하는 시약 혼합액으로서 사용할 수 있다. SSL 로부터의 RNA 추출 효율의 관점에서는, 상기 서술한 바와 같은 시판되는 RNA 추출용의 시약액을 사용하는 것이 바람직하다. 즉 AGPC 변법으로 RNA 추출을 실시하는 것이 바람직하다. 그 RNA 추출에 사용하는 클로로포름으로는, 클로로포름을 단독으로 사용하는 것이 바람직하지만, 필요한 양의 RNA 가 수층에 분배되는 한에 있어서, 클로로포름을 포함하는 시약 혼합액을 사용해도 된다.

필요에 따라, 조제한 그 RNA 를 포함하는 수성 용액을, 재차 페놀 및 클로로포름과 혼합하고, 원심 분리하여 수층을 회수해도 된다. 이 순서를 2 회 이상 반복해도 된다. 또한, 조제한 그 RNA 를 포함하는 수성 용액을, 재차 클로로포름과 혼합하고, 원심 분리하여 수층을 회수해도 된다. 이 순서를 2 회 이상 반복해도 된다.

이어서, 얻어진 그 RNA 를 포함하는 수성 용액을 수용성 유기 용매와 혼합한다. 그 수용성 유기 용매로는, 1 급 알코올, 2 급 알코올, 3 급 알코올 등의 알코올류를 들 수 있고, 이 중 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, n-프로판올 및 부탄올이 바람직하게 사용될 수 있다. 부탄올은 직사슬상 및 분기상 중 어느 것이어도 된다. 이들 알코올류는 단독으로 또는 2 종 이상 조합하여 사용할 수 있다. 환경 부하 및 작업자에 대한 유독성을 저감하는 관점에서는, 에탄올이 보다 바람직하다. 이때, 그 RNA 를 포함하는 수성 용액과 그 수용성 유기 용매의 혼합액 (이하, RNA-용매 혼합액이라고도 한다) 에 있어서의 그 수용성 유기 용매의 최종 농도 (후술하는 고상 재료에 로드하고, 접촉시키기 직전의 농도) 는, 39 체적％ 이상 50 체적％ 이하이면 되고, 바람직하게는 40 체적％ 이상 46 체적％ 이하이며, 보다 바람직하게는 41 체적％ 이상 45.5 체적％ 이하, 더욱 바람직하게는 42 체적％ 이상 45 체적％ 이하이다. 그 혼합액에 있어서의 그 수용성 유기 용매의 농도를 상기의 범위로 조정함으로써, SSL 로부터의 RNA 의 수량이 향상된다. 또한, 본 발명에 있어서 체적％ 란, 25 ℃, 1 기압에 있어서의 체적％ 를 의미한다.

이어서, 그 RNA-용매 혼합액으로부터 RNA 를 회수한다. RNA 의 회수는, 고상 재료를 사용한 핵산 분리법에 따라서 실시될 수 있다. 예를 들어, 수용성 유기 용매의 최종 농도를 상기와 같이 조정한 그 RNA-용매 혼합액을 그 고상 재료에 접촉시켜, 그 혼합액 중의 RNA 를 그 고상 재료에 흡착시킨다. 이어서, 필요에 따라 그 고상 재료로부터 협잡물을 세정한 후, 그 고상 재료로부터 RNA 를 탈리시켜 회수한다.

그 고상 재료로는, 핵산 흡착성의 고상 재료이면 되고, 예를 들어 실리카 베이스의 고상 재료를 들 수 있다. RNA 의 흡착성의 관점에서는, 그 고상 재료는, 다공성의 실리카 멤브레인을 갖는 고상 재료인 것이 바람직하다. 협잡물의 세정이나 RNA 의 용출의 조작을 용이하게 하는 관점에서는, 그 고상 재료는, 스핀 칼럼, 칼럼이 장착된 피펫 튜브, 또는 원심 튜브 혹은 피펫 튜브에 장착 가능한 칼럼 카트리지의 형태인 것이 바람직하고, 또한 오염 방지와 조작 효율의 관점에서는, 스핀 칼럼 또는 원심 튜브에 장착 가능한 칼럼 카트리지의 형태인 것이 보다 바람직하다. 또한, 개개의 피험체로부터 SSL 을 개재하여 채취되는 RNA 의 양이 비교적 적은 것을 고려하면, 그 고상 재료는, 미니 프렙 칼럼 등의 소량의 RNA 를 정제할 수 있는 형태인 것이 바람직하다. 그 고상 재료에는, 시판되는 RNA 정제용 칼럼을 사용할 수 있고, 그 예로는, RNeasy (등록상표) Spin Column (GIAGEN), NucleoSpin (등록상표) RNA Column (다카라 바이오) 등을 들 수 있다.

그 고상 재료로부터의 협잡물의 세정에 사용되는 세정액으로는, 수용성 유기 용매 및 수용성 염 중 적어도 1 종을 포함하는 용액 (예를 들어 수용액) 등을 사용할 수 있다. 그 세정액에 포함되는 수용성 유기 용매로는, 알코올류를 사용할 수 있다. 알코올류로는, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, n-프로판올, 부탄올 등을 들 수 있다. 부탄올은 직사슬상 및 분기상 중 어느 것이어도 된다. 이들 알코올은, 복수 종류를 병용할 수도 있다. 그 중에서도 에탄올을 사용하는 것이 바람직하다. 그 세정액 중에 포함되는 그 수용성 유기 용매의 양은, 그 고상 재료 상의 RNA 를 유지하여 협잡물을 세정할 수 있는 양이면 되고, 당업자가 적절히 결정할 수 있지만, 30 ∼ 100 체적％ 가 바람직하고, 35 ∼ 50 체적％ 가 보다 바람직하다. 한편, 그 세정액에 포함되는 수용성 염은, 할로겐화물의 염인 것이 바람직하고, 그 중에서도 염화물염이 바람직하다. 또, 그 수용성 염은, 1 가 또는 2 가의 카티온염인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염이며, 더욱 바람직하게는 나트륨염 및 칼륨염이며, 또한 바람직하게는 나트륨염이다. 그 수용성 염이 세정액 중에 포함되는 경우, 그 농도는 10 mmol/L 이상이 바람직하고, 20 mmol/L 이상이 보다 바람직하다. 한편, 농도의 상한은, 불순물의 용해성을 저해하지 않는 범위이면 특별히 묻지 않지만, 1 mol/L 이하가 바람직하고, 0.1 mol/L 이하가 보다 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 그 수용성 염은 염화나트륨이며, 그 세정액 중의 농도는 20 mmol/L 이상이면 바람직하다.

그 고상 재료로부터의 RNA 의 탈리는, 바람직하게는, 그 고상 재료에 용출액을 흘려, RNA 를 용출시킴으로써 실시될 수 있다. 그 RNA 의 용출에 사용되는 용출액으로는, 물이나 Tris-EDTA(TE) 버퍼 등을 사용할 수 있다. 그 세정액 및 용출액에는, 시판되는 RNA 정제용 칼럼에 부속의 세정액 및 용출액을 사용해도 된다. 그 고상 재료의 세정이나 용출은, 통상적인 순서로 실시할 수 있다. 예를 들어, 그 고상 재료가 스핀 칼럼에 장착되어 있는 경우, 칼럼에 RNA-용매 혼합액을 통액하고, RNA 가 흡착된 칼럼에 세정액을 첨가하고, 원심하여 세정액과 함께 협잡물을 씻어낸다. 계속해서, 칼럼에 용출액을 첨가하고, 원심하여 RNA 를 칼럼으로부터 용출시킨다.

필요에 따라, 그 RNA 가 흡착된 고상 재료를 DNase 로 처리해도 된다. DNase 처리에 의해, 혼입한 DNA 를 제거하여 회수하는 RNA 의 순도를 향상시킬 수 있다. 그 DNase 처리는, 그 고상 재료의 세정과 RNA 용출 사이에 실시되는 것이 바람직하다.

그 고상 재료로부터 용출된 RNA 는, 피험체의 SSL 유래 RNA 이며, 각종 해석에 사용할 수 있다. 예를 들어, 그 SSL 유래 RNA 에 포함되는 mRNA 를 Oligo(dT) 프라이머를 사용하여 cDNA 로 변환한 후, 유전자 발현 해석, 트랜스크립톰 해석 등에 사용할 수 있다. 혹은, 피험체의 SSL 유래 RNA 에 있어서의 표적 RNA 의 유무를 조사함으로써, 그 피험체의 기능 해석, 질환의 진단, 그 피험체에 투여한 약물의 효능 평가 등을 실시할 수 있다.

본 발명의 예시적 실시형태로서, 이하의 물질, 제조 방법, 용도, 방법 등을 또한 본 명세서에 개시한다. 단, 본 발명은 이들 실시형태로 한정되지 않는다.

〔1〕피부 표면 지질 유래 RNA 의 조제 방법으로서,

피험체의 피부 표면 지질로부터 RNA 를 포함하는 수성 용액을 조제하는 것,

그 수성 용액을 수용성 유기 용매와 혼합하여, 혼합액을 조제하는 것, 및,

그 혼합액을 고상 재료에 접촉시켜, 그 혼합액 중의 RNA 를 그 고상 재료에 흡착시키는 것을 포함하고, 그 고상 재료에 접촉시키기 전의 그 혼합액 중의 그 수용성 유기 용매의 최종 농도가 39 체적％ 이상 50 체적％ 이하인, 방법.

〔2〕상기 수용성 유기 용매가,

바람직하게는 알코올류이며,

보다 바람직하게는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, n-프로판올 및 부탄올로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인,

〔1〕에 기재된 방법.

〔3〕바람직하게는, 상기 RNA 를 포함하는 수성 용액의 조제가, 페놀/클로로포름법 또는 그 변법에 의한 조제인,〔1〕또는〔2〕에 기재된 방법.

〔4〕바람직하게는, 상기 혼합액 중의 상기 수용성 유기 용매의 최종 농도가 40 체적％ 이상 46 체적％ 이하, 보다 바람직하게는 41 체적％ 이상 45.5 체적％ 이하, 보다 바람직하게는 42 체적％ 이상 45 체적％ 이하인,〔1〕 ∼ 〔3〕중 어느 한 항에 기재된 방법.

〔5〕상기 고상 재료가, 바람직하게는 실리카 베이스의 고상 재료이며, 보다 바람직하게는 다공성의 실리카 멤브레인을 갖는 고상 재료인,〔1〕 ∼ 〔4〕중 어느 한 항에 기재된 방법.

〔6〕상기 고상 재료가, 바람직하게는, 스핀 칼럼, 칼럼이 장착된 피펫 튜브, 또는 원심 튜브 혹은 피펫 튜브에 장착 가능한 칼럼 카트리지의 형태인,〔5〕에 기재된 방법.

〔7〕바람직하게는, 상기 고상 재료로부터 RNA 를 회수하는 것을 추가로 포함하는,〔1〕 ∼ 〔6〕중 어느 한 항에 기재된 방법.

〔8〕바람직하게는, 상기 RNA 가 흡착된 상기 고상 재료를 세정하고, 이어서 그 고상 재료로부터 그 RNA 를 용출시키는 것을 추가로 포함하는,〔1〕 ∼ 〔7〕중 어느 한 항에 기재된 방법.

〔9〕바람직하게는, 상기 고상 재료의 세정을 위한 세정액이, 수용성 유기 용매 및 수용성 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는 용액이며,

여기서,

그 수용성 유기 용매가, 바람직하게는 알코올류이며, 보다 바람직하게는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, n-프로판올 및 부탄올로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종이며,

그 수용성 염이, 바람직하게는 1 가 또는 2 가의 카티온 염이며, 보다 바람직하게는 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염이며, 더욱 바람직하게는 나트륨염 및 칼륨염이며, 또한 바람직하게는 염화물염이며, 또한 바람직하게는 염화나트륨인,

〔8〕에 기재된 방법.

〔10〕상기 세정액에 있어서의 상기 수용성 유기 용매의 농도가, 바람직하게는 30 ∼ 100 체적％, 보다 바람직하게는 35 ∼ 50 체적％ 인,〔9〕에 기재된 방법.

〔11〕상기 세정액에 있어서의 상기 수용성 염의 농도가, 바람직하게는 10 mmol/L 이상 1 mol/L 이하, 보다 바람직하게는 10 mmol/L 이상 0.1 mol/L 이하, 더욱 바람직하게는 20 mmol/L 이상 1 mol/L 이하, 더욱 바람직하게는 20 mmol/L 이상 0.1 mol/L 이하인,〔9〕또는〔10〕에 기재된 방법.

〔12〕상기 고상 재료로부터의 RNA 의 용출을 위한 용출액이 물 또는 버퍼인,〔8〕 ∼ 〔11〕중 어느 한 항에 기재된 방법.

〔13〕상기 피부 표면 지질 (SSL) 이, 바람직하게는 SSL 흡수성 소재 또는 SSL 접착성 소재에 포함되어 있고, 보다 바람직하게는 기름 제거 종이 또는 기름 제거 필름에 포함되어 있는,〔1〕 ∼ 〔12〕중 어느 한 항에 기재된 방법.

실시예

이하, 실시예에 근거하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이것으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 SSL 로부터의 RNA 분리-1

1) 정상 남성 4 명을 피험자로 하였다. 기름 제거 필름 (5 × 8 ㎝, 폴리프로필렌제, 3M 재팬) 을 사용하여, 피험자의 전체 얼굴으로부터 피지 (SSL) 를 회수하였다. SSL 을 포함하는 기름 제거 필름을 적당한 크기로 절단하고, 그 전부를 5 mL 튜브에 넣고, QIAzol (등록상표) Lysis Reagent (QIAGEN) 1.425 mL 를 첨가하고, 잘 혼합하여 필름 상의 피지로부터 RNA 를 용출시켰다. 얻어진 용액 1.3 mL 에 클로로포름 260 μL 를 첨가하고, 잘 혼합한 후, 원심 (15,000 rpm, 4 ℃, 15 분간) 하고, 수층 (상층) 0.7 mL 를, RNA 를 포함하는 수성 용액으로서 회수하였다.

2) 상기 1) 에서 얻은 4 명분의 RNA 를 포함하는 수성 용액을 혼합 후, 7 개로 등분하고, 각각을 등량의 각종 농도의 에탄올 용액과 혼합하여, 최종 에탄올 농도가 35 ∼ 50 체적％ 의 범위 내에 있는 각종 혼합액을 조제하였다. 그 혼합액의 전체량을 실리카 베이스 칼럼 (RNeasy (등록상표) spin column ; QIAGEN) 에 통과시켰다. 그 다음은 RNeasy (등록상표) 에 부속의 프로토콜에 준하여, 키트 부속 세정액으로 칼럼을 세정하고, 이어서 RNase-free water 로 RNA 를 용출시키고, 용출액을 회수하였다. 또한, RNeasy (등록상표) 부속의 프로토콜로는, 칼럼에 통과시키는 샘플 용액의 최종 에탄올 농도는 35 체적％ 이다.

3) 얻어진 용출액 중의 RNA 정량은, Agilent 4200 TapeStation system (Agilent technologies) 으로, High Sensitivity RNA Screen Tape (Agilent technologies) 및 High Sensitivity RNA ScreenTape Sample buffer (Agilent technologies) 를 사용하여 실시하였다.

4) 상기 2) 에서 조제한 각종 에탄올 농도의 혼합액으로부터 회수된 RNA 의 양을 표 1 에 나타낸다. 최종 에탄올 농도가 40 체적％ 이상인 혼합액에서는, 종래 프로토콜에 지시된 최종 에탄올 농도 (35 체적％) 의 혼합액에 비해, RNA 수량이 향상되었다. 최종 에탄올 농도 40 ∼ 45 체적％ 의 혼합액에서, 보다 현저하게 RNA 수량이 향상되었다.

실시예 2 SSL 로부터의 RNA 분리-2

1) 정상 남성 1 명을 피험자로 하였다. 실시예 1 의 1) 과 동일한 순서로 피험자의 SSL 로부터 RNA 를 포함하는 수성 용액을 회수하였다. 그 수성 용액을 3 개로 등분하고, 각각을 등량의 각종 농도의 에탄올 용액과 혼합하여, 최종 에탄올 농도 35, 42.5, 및 50 체적％ 의 혼합액을 조제하였다. 그 혼합액의 전체량을 실리카 베이스 칼럼 (NucleoSpin (등록상표) RNA Column ; 다카라 바이오) 에 통과시켰다. 그 다음은 NucleoSpin (등록상표) 에 부속의 프로토콜에 준하여, 키트 부속 세정액으로 칼럼을 세정하고, RNase-free water 로 RNA 를 용출시키고, 용출액을 회수하였다. 또한 NucleoSpin (등록상표) 부속의 프로토콜로는, 칼럼에 통과시키는 샘플 용액의 최종 에탄올 농도는 35 체적％ 이다. 실시예 1 의 3) 과 동일한 순서로 용출액 중의 RNA 를 정량하였다.

2) 상기 1) 에서 조제한 각종 에탄올 농도의 혼합액으로부터 회수된 RNA 의 양을 표 2 에 나타낸다. 최종 에탄올 농도 42.5 및 50 체적％ 의 혼합액에서는, 최종 에탄올 농도 35 체적％ 의 혼합액에 비해 RNA 수량이 현저하게 향상되었다.

실시예 3 차세대 시퀸서에 의한 망라적 유전자 발현 해석

1) 실시예 1 의 2) 에서 얻어진 RNA 를 포함하는 용출액 중, 칼럼 어플라이 시의 최종 에탄올 농도가 35 체적％, 42.5 체적％ 및 50 체적％ 인 것, 그리고 각각의 용출액의 4 배 희석 용액을, 유전자 발현 해석용의 샘플로서 사용하였다.

2) 상기 1) 의 RNA 를 포함하는 용출액 및 그 희석 용액의 각각으로부터, SuperScript VILO cDNA Synthesis kit (라이프 테크놀로지스 재팬 주식회사) 를 사용하여 42 ℃, 90 분간 역전사를 실시함으로써 cDNA 를 합성하였다. 역전사 반응의 프라이머에는, 키트에 부속되어 있는 랜덤 프라이머를 사용하였다. 얻어진 cDNA 로부터, 멀티플렉스 PCR 에 의해 20802 유전자에서 유래하는 DNA 를 포함하는 라이브러리를 조제하였다. 멀티플렉스 PCR 은, Ion AmpliSeq Transcriptome Human Gene Expression Kit (라이프 테크놀로지스 재팬 주식회사) 를 사용하여, [99 ℃, 2 분 → (99 ℃, 15 초 → 62 ℃, 16 분) × 20 사이클 → 4 ℃, Hold] 의 조건으로 실시하였다. 얻어진 PCR 산물은, Ampure XP (벡크만 쿨터 주식회사) 로 정제한 후에, 버퍼의 재구성, 프라이머 배열의 소화, 어댑터 라이게이션과 정제, 증폭을 실시하여, 라이브러리를 조제하였다. 조제한 라이브러리를 Ion 540 Chip 에 로딩하고, Ion S5/XL 시스템 (라이프 테크놀로지스 재팬 주식회사) 을 사용하여 시퀀싱하였다.

시퀀싱에 의해 검출된 유전자수를 표 3 에 나타낸다. 검출된 유전자수는, 칼럼 어플라이 시의 최종 에탄올 농도가 35 체적％ 이었던 RNA 용출액에서는 11,463 이었던 것에 대해, 칼럼 어플라이 시의 최종 에탄올 농도가 42.5 및 50 체적％ 이었던 용출액에서는, 13,910 및 13,221 로 각각 증가하였다. 이 경향은, RNA 용출액의 4 배 희석 용액에 있어서 보다 현저하였고, 즉, 칼럼 어플라이 시의 최종 에탄올 농도가 35 체적％ 이었던 희석 용액으로부터의 검출 유전자수가 8,898 이었던 것에 대해, 칼럼 어플라이 시의 최종 에탄올 농도가 42.5 및 50 체적％ 이었던 희석 용액으로부터의 검출 유전자수는, 각각 12,226 및 11,199 로 대폭 증가하고, 이 점에서, 채취할 수 있는 RNA 량이 적은 샘플일수록 본 발명의 조제 방법이 유리한 것이 나타났다.

Claims (6)

1. 피부 표면 지질 유래 RNA 의 조제 방법으로서,
   피험체의 피부 표면 지질로부터 RNA 를 포함하는 수성 용액을 조제하는 것,
   그 수성 용액을 수용성 유기 용매와 혼합하여, 혼합액을 조제하는 것, 및,
   그 혼합액을 고상 재료에 접촉시켜, 그 혼합액 중의 RNA 를 그 고상 재료에 흡착시키는 것
   을 포함하고, 그 고상 재료에 접촉시키기 전의 그 혼합액 중의 그 수용성 유기 용매의 최종 농도가 39 체적％ 이상 50 체적％ 이하인, 방법.
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 수용성 유기 용매가 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, n-프로판올 및 부탄올로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종인, 방법.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   상기 RNA 를 포함하는 수성 용액의 조제가, 페놀/클로로포름법 또는 그 변법에 의한 조제인, 방법.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 수용성 유기 용매의 최종 농도가 40 체적％ 이상 46 체적％ 이하인, 방법.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 고상 재료가 실리카 베이스의 고상 재료인, 방법.
6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 고상 재료로부터 RNA 를 회수하는 것을 추가로 포함하는, 방법.