JP2023136356A - 皮膚表上脂質由来ｒｎａの調製方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ＳＳＬに含まれるＲＮＡを効率よく回収するための、ＲＮＡの調製方法を提供する。【解決手段】皮膚表上脂質由来ＲＮＡの調製方法であって、被験体の皮膚表上脂質からＲＮＡを溶出、分離及び回収するＲＮＡ抽出工程において、ｐ－ブロモアニソールを添加する工程を含む、方法。【選択図】なし

Description

本発明は、皮膚表上脂質由来ＲＮＡの調製方法に関する。

生体の様々な組織の中でも、皮膚は、外界と接していることから、侵襲性低く生体試料を採取できる組織として注目されている。最近、皮膚表上脂質（ｓｋｉｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｌｉｐｉｄｓ；ＳＳＬ）に被験体の皮膚細胞に由来するＲＮＡが含まれていること、ＳＳＬに含まれるＲＮＡを生体の解析用の試料として有用であることが見出された（特許文献１）。

生体試料からのＲＮＡ等の核酸の抽出には、一般に、フェノール／クロロホルム法、ＡＧＰＣ（ａｃｉｄ ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ－ｐｈｅｎｏｌ－ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）法、それらの変法などが用いられている。これらの原理に基づく核酸抽出試薬（例えばＴＲＩｚｏｌ（登録商標）など）が市販されている。
また、特許文献２には、４．０未満のｐＨのフェノールを用いてサンプルを処理し、水層から精製ＲＮＡを回収する方法や、少量の有機溶媒を含む酸性化サンプルからＲＮＡを沈殿させる方法が開示されている。また、特許文献３には生体材料を溶解してそこに含まれる核酸を溶出させること、溶出した核酸を含む溶液に最終濃度で１０～６０体積％となるように水溶性有機溶媒を加えてライセート溶液を調製すること、及び、該ライセート溶液と固体材料とを接触させ、固体材料に核酸を吸着させて回収することを含む、核酸抽出法が開示されている。

しかし、ＲＮＡ解析用の試料としてＳＳＬを用いる場合、回収できるＳＳＬの量は多くなく、またそこに含まれるＲＮＡの量も多くはないため、１被験体のＳＳＬから調製できるＲＮＡの量は微量である。また、ＳＳＬ試料には、スキンケア品やメイク品由来の成分が含まれる場合があり、これにより従来の核酸抽出法ではＲＮＡの収量が低下し、解析ができない、或いは解析精度が低下する等の問題が生じ、ＳＳＬからのＲＮＡの収量の向上が望まれていた。

国際公開公報第２０１８／００８３１９号 特表２００７－５３２１４０号公報 特開２００７－１１７０８４号公報

本発明は、ＳＳＬに含まれるＲＮＡを効率よく回収するための、ＲＮＡの調製方法を提供することに関する。

本発明者らは、上記課題に鑑み、検討した結果、ＳＳＬからＲＮＡを抽出する工程において、ｐ－ブロモアニソールを添加することにより、ＳＳＬからのＲＮＡの回収率を向上できることを見出した。

すなわち、本発明は、皮膚表上脂質由来ＲＮＡの調製方法であって、被験体の皮膚表上脂質からＲＮＡを溶出、分離及び回収するＲＮＡ抽出工程において、ｐ－ブロモアニソールを添加する工程を含む、方法を提供する。

本発明の方法によれば、ＳＳＬに含まれるＲＮＡを高収量で回収することができる。本発明は、ＳＳＬを試料として用いたＲＮＡ解析（例えば、遺伝子解析、診断等）の効率や精度を向上させる。

本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、及びその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。

本発明において、「皮膚表上脂質（ｓｋｉｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｌｉｐｉｄｓ；ＳＳＬ）」とは、皮膚の表上に存在する脂溶性画分をいい、皮脂と呼ばれることもある。一般に、ＳＳＬは、皮膚にある皮脂腺等の外分泌腺から分泌された分泌物を主に含み、皮膚表面を覆う薄い層の形で皮膚表上に存在している。

本発明において、「皮膚」とは、特に限定しない限り、角層、表皮、真皮、毛包、ならびに汗腺、皮脂腺及びその他の腺などの組織を含む領域の総称である。

本発明の方法における被験体は、皮膚上にＳＳＬを有する生物であればよい。被験体の例としては、ヒト及び非ヒト哺乳動物を含む哺乳動物が挙げられ、好ましくはヒトである。例えば、該被験体は、自身の核酸の解析を必要とするか又は希望するヒト又は非ヒト哺乳動物であり得る。あるいは、該被験体は、皮膚における遺伝子発現解析、又は核酸を用いた皮膚もしくは皮膚以外の部位の状態の解析を必要とするか又は希望するヒト又は非ヒト哺乳動物であり得る。

被験体のＳＳＬは、該被験体の皮膚細胞で発現したＲＮＡを含み、好ましくは該被験体の表皮、皮脂腺、毛包、汗腺、及び真皮のいずれかで発現したＲＮＡを含み、より好ましくは該被験体の表皮、皮脂腺、毛包、及び汗腺のいずれかで発現したＲＮＡを含む（特許文献１参照）。したがって、本発明の方法により調製されるＳＳＬ由来ＲＮＡは、好ましくは被験体の表皮、皮脂腺、毛包、汗腺及び真皮から選択される少なくとも１部位由来のＲＮＡであり、より好ましくは表皮、皮脂腺、毛包及び汗腺から選択される少なくとも１部位由来のＲＮＡである。

本発明の方法で調製されるＳＳＬ由来ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｍａｌｌ ＲＮＡ（例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）等）、ｌｏｎｇ ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ（ｌｉｎｃ）ＲＮＡ、などを含み得る。上記に上げたＲＮＡの１種又は２種以上がＳＳＬに含まれ得る。

被験体のＳＳＬが採取される皮膚の部位としては、頭、顔、首、体幹、手足等の身体の任意の部位の皮膚、アトピー、ニキビ、乾燥、炎症（赤み）、腫瘍等の疾患を有する皮膚、創傷を有する皮膚、などが挙げられるが、特に限定されない。

被験体の皮膚からのＳＳＬの採取には、皮膚からのＳＳＬの回収又は除去に用いられているあらゆる手段を採用することができる。好ましくは、後述するＳＳＬ吸収性素材、ＳＳＬ接着性素材、又は皮膚からＳＳＬをこすり落とす器具を使用することができる。ＳＳＬ吸収性素材又はＳＳＬ接着性素材としては、ＳＳＬに親和性を有する素材であれば特に限定されず、例えばポリプロピレン、パルプ等が挙げられる。皮膚からのＳＳＬの採取手順のより詳細な例としては、あぶら取り紙、あぶら取りフィルム等のシート状素材へＳＳＬを吸収させる方法、ガラス板、テープ等へＳＳＬを接着させる方法、スパーテル、スクレイパー等によりＳＳＬをこすり落として回収する方法、などが挙げられる。ＳＳＬの吸着性を向上させるため、脂溶性の高い溶媒を予め含ませたＳＳＬ吸収性素材を用いてもよい。一方、ＳＳＬ吸収性素材が水溶性の高い溶媒や水分を含んでいると、ＳＳＬの吸着が阻害されるため好ましくない。ＳＳＬ吸収性素材は、乾燥した状態で用いることが好ましい。

被験体から採取されたＲＮＡ含有ＳＳＬは、後述するＲＮＡ調製に用いるまで保存されてもよい。該ＲＮＡ含有ＳＳＬは、ＳＳＬ吸収性素材又はＳＳＬ接着性素材に吸収又は接着させた状態のまま保存することができる。該ＲＮＡ含有ＳＳＬは、従来一般的なＲＮＡの保存条件（例えば－８０℃）で保存されてもよいが、よりもマイルドな条件で保存することが可能である（国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ２０１９／０４３０４０）。例えば、該ＲＮＡ含有ＳＳＬの保存の温度条件は、０℃以下であればよく、好ましくは－１０℃以下、より好ましくは－２０℃以下であればよい。該保存の期間は、特に限定されないが、好ましくは１２ヶ月以下、より好ましくは６ヶ月以下、さらに好ましくは３ヶ月以下である。

一般に、生体試料からのＲＮＡの調製は、試料中のＲＮＡを溶出、分離及び回収するＲＮＡ抽出工程、抽出されたＲＮＡの単離工程からなるが、本発明によるＳＳＬ由来ＲＮＡの調製方法は、被験体の皮膚表上脂質からＲＮＡを溶出、分離及び回収するＲＮＡ抽出工程において、ｐ－ブロモアニソール（別名：４－ブロモ－１－メトキシベンゼン）を添加する工程を含む。
本発明において、皮膚表上脂質からＲＮＡを溶出、分離及び回収する方法としては、限定されないが、酸性フェノール（例えば、水飽和フェノール）とクロロホルムの混液を用いる古典的なＲＮＡ抽出のためのフェノール／クロロホルム法、及びその変法、例えばＰＣＩ（Ｐｈｅｎｏｌ／Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ／Ｉｓｏａｍｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）法、ＡＧＰＣ（ａｃｉｄ ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ－ｐｈｅｎｏｌ－ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）法、グアニジンチオシアネートとフェノールをあらかじめ混合しておくＡＧＰＣ変法等が挙げられ、好ましくはＡＧＰＣ変法である。

フェノール／クロロホルム法を用いた生体試料からのＲＮＡ抽出手順は、基本的には、１）被験体から採取されたＲＮＡを含む試料に、酸性フェノールを加えて混合するＲＮＡの溶出工程、次いで２）クロロホルムを加えて混合し、遠心分離して、ＲＮＡを含む水層とフェノール－クロロホルム層、場合によってはさらに中間層に分離する分離工程、３）分離されたＲＮＡを含む水性溶液（水層）を回収する回収工程からなる。

該ＲＮＡの溶出に用いる酸性フェノールとしては、水飽和フェノールを単独で用いてもよいが、フェノールを含む試薬混合液を用いてもよい。例えば、グアニジンチオシアネートを含む市販のＲＮＡ抽出用試薬（例えばＴＲＩｚｏｌ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ、ＱＩＡｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ、ＩＳＯＧＥＮ等）を含む、生体試料からのＲＮＡ抽出用の試薬液を、該フェノールを含む試薬混合液として用いることができる。ＳＳＬからのＲＮＡ抽出効率の観点からは、上述したような市販のＲＮＡ抽出用の試薬液を用いることが好ましい。すなわちＡＧＰＣ変法でＲＮＡ抽出を行うのが好ましい。
なお、該ＲＮＡ抽出に用いるクロロホルムとしては、クロロホルムを単独で用いることが好ましいが、必要な量のＲＮＡが水層に分配される限りにおいて、クロロホルムを含む試薬混合液を用いてもよい。

また、必要に応じて、回収されたＲＮＡを含む水性溶液を、再度フェノール及びクロロホルムと混合し、遠心分離して水層を回収してもよい。この手順を２回以上繰り返してもよい。さらに、該ＲＮＡを含む水性溶液を、再度クロロホルムと混合し、遠心分離して水層を回収してもよい。この手順を２回以上繰り返してもよい。

本発明において、ｐ－ブロモアニソールの添加は、上記のＲＮＡ抽出過程（溶出工程、分離工程、回収工程）の何れでもよいが、ＲＮＡ収量に影響を与える夾雑物を除去する点から、回収工程において回収されたＲＮＡを含む水性溶液に添加処理するのが好ましい。
該ＲＮＡを含む水性溶液にｐ－ブロモアニソールを添加する場合のｐ－ブロモアニソールの添加量は特に限定されないが、例えば、その最終濃度（ＲＮＡを含む水性溶液とｐ－ブロモアニソールとの混合液におけるｐ－ブロモアニソール濃度）が、０．１体積％以上１体積％以下、好ましくは０．２体積％以上０．８体積％以下、さらに好ましくは０．３体積％以上０．７体積％以下である。該混合液におけるｐ－ブロモアニソールの濃度を上記の範囲に調整することで、ＳＳＬからのＲＮＡの収量が向上する。なお、本発明において体積％とは、２５℃、１気圧における体積％を意味する（以下、同様）。

回収工程においてｐ－ブロモアニソールを、ＲＮＡを含む水性溶液に添加した場合には、添加後よく混合した後、再度遠心分離して水層がＲＮＡを含む水性溶液として回収される。

回収されたＲＮＡを含む水性溶液（水層）からＲＮＡを単離する方法は、特に限定されないが、例えばＲＮＡを含む水性溶液に水溶性有機溶媒を添加してＲＮＡを単離させた後、ろ過や固相材料に吸着させ、回収することが挙げられる。
ここで、用いられる水溶性有機溶媒としては、１級アルコール、２級アルコール、３級アルコールなどのアルコール類が挙げられ、このうちメタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ－プロパノール及びブタノールが好ましく使用され得る。ブタノールは直鎖状及び分岐状のいずれでもよい。これらのアルコール類は単独で又は２種以上組み合わせて使用することができる。環境負荷及び作業者への有毒性を低減する観点からは、エタノールがより好ましい。このとき、該ＲＮＡを含む水性溶液と該水溶性有機溶媒との混合液（以下、ＲＮＡ－溶媒混合液ともいう）における該水溶性有機溶媒の最終濃度（後述する固相材料にロードし、接触させる直前の濃度）は、３９体積％以上５０体積％以下であればよく、好ましくは４０体積％以上４６体積％以下であり、より好ましくは４１体積％以上４５．５体積％以下、さらに好ましくは４２体積％以上４５体積％以下である。

固相材料を用いたＲＮＡの単離は、例えば、ＲＮＡ－溶媒混合液を該固相材料に接触させて、該混合液中のＲＮＡを該固相材料に吸着させる。次いで、必要に応じて該固相材料から夾雑物を洗浄した後、該固相材料からＲＮＡを脱離させ回収する。

該固相材料としては、核酸吸着性の固相材料であればよく、例えばシリカベースの固相材料が挙げられる。ＲＮＡの吸着性の観点からは、該固相材料は、多孔性のシリカメンブレンを有する固相材料であることが好ましい。夾雑物の洗浄やＲＮＡの溶出の操作を容易にする観点からは、該固相材料は、スピンカラム、カラム付きピペットチューブ、又は遠心チューブもしくはピペットチューブに装着可能なカラムカートリッジの形態であることが好ましく、さらに汚染防止と操作効率の観点からは、スピンカラム又は遠心チューブに装着可能なカラムカートリッジの形態であることがより好ましい。さらに、個々の被験体からＳＳＬを介して採取されるＲＮＡの量が比較的少ないことを考慮すると、該固相材料は、ミニプレップカラムなどの少量のＲＮＡを精製できる形態であることが好ましい。該固相材料には、市販のＲＮＡ精製用カラムを用いることができ、その例としては、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ（ＧＩＡＧＥＮ）、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標） ＲＮＡ Ｃｏｌｕｍｎ（タカラバイオ）等が挙げられる。

該固相材料からの夾雑物の洗浄に用いられる洗浄液としては、水溶性有機溶媒及び水溶性塩の少なくとも１種を含む溶液（例えば水溶液）などを用いることができる。該洗浄液に含まれる水溶性有機溶媒としては、アルコール類を用いることができる。アルコール類としては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ－プロパノール及びブタノールなどが挙げられる。ブタノールは直鎖状及び分岐状のいずれでもよい。これらアルコールは、複数種類を併用することもできる。中でもエタノールを用いることが好ましい。該洗浄液中に含まれる該水溶性有機溶媒の量は、該固相材料上のＲＮＡを保持し夾雑物を洗浄できる量であればよく、当業者が適宜決定することができるが、３０～１００体積％が好ましく、３５～５０体積％がより好ましい。一方、該洗浄液に含まれる水溶性塩は、ハロゲン化物の塩であることが好ましく、中でも塩化物塩が好ましい。また、該水溶性塩は、一価又は二価のカチオン塩であることが好ましく、より好ましくはアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩であり、さらに好ましくはナトリウム塩及びカリウム塩であり、なお好ましくはナトリウム塩である。該水溶性塩が洗浄液中に含まれる場合、その濃度は１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上が好ましく、２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上がより好ましい。一方、濃度の上限は、不純物の溶解性を損なわない範囲であれば特に問わないが、１ｍｏｌ／Ｌ以下が好ましく、０．１ｍｏｌ／Ｌ以下がより好ましい。さらに好ましくは、該水溶性塩は塩化ナトリウムであり、その洗浄液中の濃度は２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上且つ０．１ｍｏｌ／Ｌ以下であると好ましい。

該固相材料からのＲＮＡの脱離は、好ましくは、該固相材料に溶出液を流し、ＲＮＡを溶出させることで行われ得る。該ＲＮＡの溶出に用いられる溶出液としては、水やＴｒｉｓ－ＥＤＴＡ（ＴＥ）バッファーなどを用いることができる。該洗浄液及び溶出液には、市販のＲＮＡ精製用カラムに付属の洗浄液及び溶出液を用いてもよい。該固相材料の洗浄や溶出は、通常の手順で行うことができる。例えば、該固相材料がスピンカラムに装着されている場合、カラムにＲＮＡ－溶媒混合液を通液し、ＲＮＡが吸着したカラムに洗浄液を添加し、遠心して洗浄液とともに夾雑物を洗い流す。続いて、カラムに溶出液を添加し、遠心してＲＮＡをカラムから溶出、単離する。

必要に応じて、該ＲＮＡが吸着した固相材料をＤＮａｓｅで処理してもよい。ＤＮａｓｅ処理により、混入したＤＮＡを除去して回収するＲＮＡの純度を向上させることができる。該ＤＮａｓｅ処理は、該固相材料の洗浄とＲＮＡ溶出との間に行われることが好ましい。

斯くして単離されたＲＮＡは、被験体のＳＳＬ由来ＲＮＡであり、各種解析に使用することができる。例えば、該ＳＳＬ由来ＲＮＡに含まれるｍＲＮＡをＯｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマーを用いてｃＤＮＡに変換した後、遺伝子発現解析、トランスクリプトーム解析などに用いることができる。あるいは、被験体のＳＳＬ由来ＲＮＡにおける標的ＲＮＡの有無を調べることで、該被験体の機能解析、疾患の診断、該被験体に投与した薬物の効能評価などを行うことができる。

本発明はまた、例示的実施形態として以下を包含する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
＜１＞皮膚表上脂質由来ＲＮＡの調製方法であって、被験体の皮膚表上脂質からＲＮＡを溶出、分離及び回収するＲＮＡ抽出工程において、ｐ－ブロモアニソールを添加する工程を含む、方法。
＜２＞ｐ－ブロモアニソールの添加が、ＲＮＡ抽出過程で回収されたＲＮＡを含む水性溶液に対して行われる、＜１＞の方法。
＜３＞ｐ－ブロモアニソールが、最終濃度０．１体積％以上１体積％以下、好ましくは０．２体積％以上０．８体積％以下、さらに好ましくは０．３体積％以上０．７体積％以下で、前記水性溶液に添加される、＜２＞の方法。
＜４＞ＲＮＡ抽出工程におけるＲＮＡの溶出、分離及び回収が、フェノール／クロロホルム法又はその変法により行われる、＜１＞～＜３＞のいずれかの方法。
＜５＞さらに、ＲＮＡ抽出後、回収されたＲＮＡを含む水性溶液に水溶性有機溶媒を混合し、該混合液を固相材料に接触させ、該混合液中のＲＮＡを該固相材料に吸着させてＲＮＡを単離する工程を含む、＜１＞～＜４＞のいずれかの方法。
＜６＞前記水溶性有機溶媒がメタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ－プロパノール及びブタノールからなる群より選択される少なくとも１種である、＜５＞の方法。
＜７＞前記固相材料がシリカベースの固相材料である、＜５＞又は＜６＞の方法。

以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

実施例１ ＳＳＬからのＲＮＡ分離
１）健常女性５名を被験者とした。１枚のあぶら取りフィルム（５×８ｃｍ、ポリプロピレン製、３Ｍジャパン）を用いて、洗顔を行い、化粧を施してから２～３時間経過した被験者の全顔から皮脂（ＳＳＬ）を回収した。なお、ＳＳＬは２日連続で採取した。２枚のＳＳＬを含むあぶら取りフィルムをそれぞれ適当な大きさに切断し、１枚分ずつ別々の５ｍＬチューブに入れ、ＱＩＡｚｏｌ（登録商標） Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を１．４２５ｍＬずつ添加し、よく混合してフィルム上の皮脂からＲＮＡを溶出させた。得られた溶出溶液１．３ｍＬを回収し、それぞれにクロロホルム２６０μＬを添加し、よく混合した後、遠心（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分間）し、水層（上層）０．７１５ｍＬずつを、ＲＮＡを含む水性溶液として１本のチューブに回収して混合した。

２）上記１）で得た５名分のＲＮＡを含む水性溶液のそれぞれを、２つに分け、片方に終濃度が０．５体積％となる量のｐ－ブロモアニソールを添加し、よく混合した。室温（１５～２４℃）で５分静置後、遠心（１２，０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）し、水層（上層）０．７ｍＬをＲＮＡを含む水性溶液として回収した（ｐ－ブロモアニソール処理）。もう一方はｐ－ブロモアニソールを添加せず、そのまま以降の処理に用いた（従来法）。ｐ－ブロモアニソール処理及び従来法により回収した水性溶液それぞれに、最終エタノール濃度が４２．５体積％となる量のエタノールを添加し、混合液を調製した。該混合液の全量をシリカベースカラム（ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎ；ＱＩＡＧＥＮ）に通した。その後はＲＮｅａｓｙ（登録商標）に付属のプロトコルに準じて、キット付属洗浄液でカラムを洗浄し、次いでＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒにてＲＮＡを溶出させ、単離したＲＮＡを含む溶出液を回収した。

３）得られた溶出液中のＲＮＡ定量は、Ａｇｉｌｅｎｔ ４２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（アジレント・テクノロジー株式会社）にて、Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ＲＮＡ Ｓｃｒｅｅｎ Ｔａｐｅ（アジレント・テクノロジー株式会社）及びＨｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ＲＮＡ ＳｃｒｅｅｎＴａｐｅ Ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（アジレント・テクノロジー株式会社）を用いて実施した。

４）上記２）で調製した従来法とｐ－ブロモアニソール処理それぞれの混合液から回収した溶出液中のＲＮＡの濃度、及び従来法に対するｐ－ブロモアニソール処理のＲＮＡの相対収量を表１に示す。ｐ－ブロモアニソール処理では、従来法に比べて、ＲＮＡ収量が向上した。

５）上記２）で調製した従来法とｐ－ブロモアニソール処理の混合液から回収された溶出液中のＲＮＡをテンプレートとし、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて４２℃、３０分間逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成した。逆転写反応のプライマーには、キットに付属しているランダムプライマーを使用した。得られたｃＤＮＡからマルチプレックスＰＣＲにより、２０８０２遺伝子に由来するＤＮＡを含むライブラリーを調製した。マルチプレックスＰＣＲは、Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて、［９９℃、２分→（９９℃、１５秒→６０℃、１６分）×２０サイクル→４℃、Ｈｏｌｄ］の条件で行った。調製したライブラリーのＰＣＲ産物濃度をＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ（アジレント・テクノロジー株式会社）とＨｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｄ１０００ ＳｃｒｅｅｎＴａｐｅ（アジレント・テクノロジー株式会社）を用いて測定した。

６）上記２）で調製した従来法とｐ－ブロモアニソール処理それぞれの混合液から調製したライブラリーのＰＣＲ産物の濃度、及び従来法に対するｐ－ブロモアニソール処理のＰＣＲ産物の相対収量を表２に示す。ｐ－ブロモアニソール処理では、従来法に比べて、ＰＣＲ産物収量が向上した。

Claims (7)

1. 皮膚表上脂質由来ＲＮＡの調製方法であって、被験体の皮膚表上脂質からＲＮＡを溶出、分離及び回収するＲＮＡ抽出工程において、ｐ－ブロモアニソールを添加する工程を含む、方法。
2. ｐ－ブロモアニソールの添加が、ＲＮＡ抽出過程で回収されたＲＮＡを含む水性溶液に対して行われる、請求項１記載の方法。
3. ｐ－ブロモアニソールが、最終濃度０．１体積％以上１体積％以下で、前記水性溶液に添加される、請求項２記載の方法。
4. ＲＮＡ抽出工程におけるＲＮＡの溶出、分離及び回収が、フェノール／クロロホルム法又はその変法により行われる、請求項１～３のいずれか１項記載の方法。
5. さらに、ＲＮＡ抽出後、回収されたＲＮＡを含む水性溶液に水溶性有機溶媒を混合し、該混合液を固相材料に接触させ、該混合液中のＲＮＡを該固相材料に吸着させてＲＮＡを単離する工程を含む、請求項１～４のいずれか１項記載の方法。
6. 前記水溶性有機溶媒がメタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ－プロパノール及びブタノールからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項５記載の方法。
7. 前記固相材料がシリカベースの固相材料である、請求項５又は６記載の方法。