KR20220115996A - 핵산 증폭 방법 - Google Patents

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유야 우에하라
다카요시 이노우에
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카오카부시키가이샤
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Abstract

고감도이고 또한 고수량인 RNA 로부터의 핵산 증폭 방법의 제공.
샘플 RNA 로부터 역전사 반응에 의해 cDNA 를 합성하는 것, 및, 그 cDNA 를 멀티플렉스 PCR 에 의해 증폭하는 것을 포함하고, 그 역전사 및 그 멀티플렉스 PCR 이 1 본쇄 핵산 결합 단백질의 존재하에서 실시되고, 그 1 본쇄 핵산 결합 단백질이 T4GP32 또는 그 변이체인, 핵산 증폭 방법.

Description

핵산 증폭 방법
본 발명은 핵산 증폭 방법에 관한 것이다.
멀티플렉스 PCR 은, 복수의 프라이머쌍을 동시에 사용한 PCR 반응에 의해, 1 개의 DNA 샘플로부터 복수의 영역을 동시에 증폭하는 방법이다. RNA 로부터 cDNA 으로의 역전사 (RT) 반응을 멀티플렉스 PCR 과 조합한 멀티플렉스 RT-PCR 은, 유전자 발현 해석이나 지노타이핑 등에 이용되고 있다.
RNA 는, 일반적으로 조직 샘플로부터 추출된다. 또한 최근, 보다 간편하고 비침습적인 RNA 채취 방법으로서, 피부 표면 지질 (skin surface lipids ; SSL) 로부터 RNA 를 채취하는 방법이 개시되었다 (특허문헌 1). SSL 에 포함되는 RNA 는 유전자 발현 해석 등을 위한 RNA 샘플로서 유용하다. 그러나, 1 피험체로부터 회수할 수 있는 SSL 의 양은 많지 않고, 또 그것에 포함되는 RNA 의 양도 많지는 않기 때문에, 1 피험체의 SSL 로부터 조제할 수 있는 RNA 의 양은 미량이다.
비특허문헌 1 에는, BSA 및 T4 gene 32 protein (T4GP32) 이 저해 물질 존재하에서의 PCR 의 반응을 개선하는 것이 기재되어 있다. 비특허문헌 2 에는, DMSO 와 베타인이 PCR 의 특이성과 수량 (收量) 을 향상시킨 것이 기재되어 있다. 비특허문헌 3, 4 에는, RT-PCR 시에, RT 계에 T4GP32 를 첨가해 둠으로써 RT-PCR 산물의 수량이 현저하게 증가했지만, RT 후의 PCR 계에 T4GP32 를 첨가해도 분명한 수량의 증가는 보이지 않았던 것이 기재되어 있다. 특허문헌 2 에는, RNA 를 주형으로 하여 cDNA 를 증폭시키는 증폭 역전사법 (RT-RamDA 법) 에 있어서, 주형 RNA 로부터 박리된 1 본쇄 cDNA 에 T4GP32 를 결합시킴으로써 그 cDNA 를 누크레아제 분해로부터 보호하여, cDNA 의 수량을 증가시키는 것이 기재되어 있다.
국제 공개 공보 제2018/008319호 국제 공개 공보 제2016/052619호
Appl Environ Microbiol, 1996, 62 (3) : 1102-1106 PLOS ONE, 2010, 5 (6) : e11024 Appl Environ Microbiol, 1998, 64 (2) : 669-677 BioTechniques, 2001, 31 (1) : 81-86
본 발명은, 핵산 증폭 방법으로서,
샘플 RNA 로부터 역전사에 의해 cDNA 를 합성하는 것 ; 및,
그 cDNA 를 멀티플렉스 PCR 에 의해 증폭하는 것,
을 포함하고, 그 역전사 및 그 멀티플렉스 PCR 이, 1 본쇄 핵산 결합 단백질의 존재하에서 실시되고, 그 1 본쇄 핵산 결합 단백질이, T4GP32 또는 그 개변체인,
방법을 제공한다.
또 본 발명은, 1 본쇄 핵산 결합 단백질을 유효 성분으로 하는, 멀티플렉스 RT-PCR 의 수량 개선제로서, 그 1 본쇄 핵산 결합 단백질이 T4GP32 또는 그 개변체이고, 또한 역전사 및 멀티플렉스 PCR 의 양쪽의 반응액에 첨가되는, 개선제를 제공한다.
본 명세서 중에서 인용된 모든 특허문헌, 비특허문헌, 및 그 밖의 간행물은, 그 전체가 본 명세서 중에 있어서 참고로서 원용된다.
본 명세서에 있어서, 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열에 관한 「적어도 90 % 의 동일성」 이란, 90 % 이상, 바람직하게는 95 % 이상, 보다 바람직하게는 97 % 이상, 더욱 바람직하게는 98 % 이상, 더욱 바람직하게는 99 % 이상의 동일성을 말한다.
본 명세서에 있어서, 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열의 동일성은, 립만-피어슨법 (Lipman-Pearson 법 ; Science, 1985, 227 : 1435-41) 에 의해 계산된다. 구체적으로는, 유전 정보 처리 소프트웨어 Genetyx-Win (Ver. 5.1.1 ; 소프트웨어 개발) 의 호몰로지 해석 (Search homology) 프로그램을 사용하여, Unit size to compare (ktup) 를 2 로 하여 해석을 실시함으로써 산출된다.
멀티플렉스 RT-PCR 에 있어서의 감도 및 수량의 향상이 요망된다. 본 발명은, 고감도이고 또한 고수량인 RNA 로부터의 핵산 증폭 방법에 관한 것이다.
본 발명자들은, 멀티플렉스 RT-PCR 에서의 RT 및 PCR 의 양쪽 반응을 T4GP32 의 존재하에서 실시함으로써, 미량의 RNA 샘플로부터도 고수량을 달성할 수 있는 것을 알아내었다.
본 발명은, 멀티플렉스 RT-PCR 의 감도 및 수량을 향상시킨다. 본 발명의 방법은, SSL 유래 RNA 와 같은 미량 RNA 샘플의 효율 좋은 증폭과 해석을 가능하게 한다. 본 발명은, RNA 시료를 사용한 해석 (예를 들어, 유전자 해석, 진단 등) 의 감도와 정밀도, 및 효율을 향상시킨다.
본 발명은, RNA 로부터의 핵산 증폭 방법을 제공한다. 당해 방법은, 샘플 RNA 로부터 역전사에 의해 cDNA 를 합성하는 것, 및, 그 cDNA 를 멀티플렉스 PCR 에 의해 증폭하는 것을 포함한다.
본 발명의 방법에서 사용되는 샘플 RNA 는, 어떠한 종류의 RNA 여도 되며, 예를 들어, 동물, 식물, 미생물, 바이러스 등에서 유래하는 RNA 를 들 수 있다. 그 샘플 RNA 는, mRNA, tRNA, rRNA, small RNA (예를 들어, microRNA (miRNA), small interfering RNA (siRNA), Piwi-interacting RNA (piRNA) 등), long intergenic non-coding (linc) RNA, 등을 포함할 수 있다. 상기에 올린 RNA 의 1 종 또는 2 종 이상이 그 샘플 RNA 에 포함될 수 있다.
그 샘플 RNA 는, 동물, 식물, 미생물, 바이러스 등으로부터 통상적인 수단으로 추출할 수 있다. 예를 들어, 그 RNA 의 추출에는, 페놀/클로로포름법, AGPC (acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction) 법, 또는 그것들의 변법, 실리카를 코팅한 특수한 자성체 입자를 사용하는 방법, Solid Phase Reversible Immobilization 자성체 입자를 사용하는 방법, 혹은 시판되는 RNA 정제용 시약 (예를 들어 TRIzol (등록상표) Reagent, RNeasy (등록상표), QIAzol (등록상표), ISOGEN 등), 등을 사용할 수 있다.
바람직한 일 실시형태에 있어서, 그 샘플 RNA 는, 피부 표면 지질 유래 RNA 이다. 본 명세서에 있어서, 「피부 표면 지질 (skin surface lipids ; SSL) 」 이란, 피부의 표면에 존재하는 지용성 획분을 말하며, 피지라고 불리기도 한다. 일반적으로, SSL 은, 피부에 있는 피지선 등의 외분비선으로부터 분비된 분비물을 주로 포함하며, 피부 표면을 덮는 얇은 층의 형태로 피부 표면에 존재하고 있다. SSL 에는, 피험체의 피부 세포에서 유래하는 RNA 가 포함되어 있으며, 이것을 사용하여 생체의 해석이 가능하다 (특허문헌 1).
그 SSL 유래 RNA 가 채취되는 피험체는, 피부 상에 SSL 을 갖는 생물이면 된다. 피험체의 예로는, 인간 및 비인간 포유 동물을 포함하는 포유 동물을 들 수 있으며, 바람직하게는 인간이다. 예를 들어, 그 피험체는, 자신의 핵산의 해석을 필요로 하거나 또는 희망하는 인간 또는 비인간 포유 동물일 수 있다. 혹은, 그 피험체는, 피부에 있어서의 유전자 발현 해석, 또는 핵산을 사용한 피부 혹은 피부 이외의 부위의 상태의 해석을 필요로 하거나 또는 희망하는 인간 또는 비인간 포유 동물일 수 있다.
피험체의 SSL 이 채취되는 피부의 부위로는, 머리, 얼굴, 목, 체간, 수족 등의 신체의 임의 부위의 피부, 아토피, 여드름, 건조, 염증 (붉은 기), 종양 등의 질환을 갖는 피부, 창상을 갖는 피부 등을 들 수 있지만, 특별히 한정되지 않는다. 본 명세서에 있어서, 「피부」 란, 특별히 한정되지 않는 한, 체표의 표피, 진피, 모낭, 그리고 땀샘, 피지선 및 그 밖의 선 (腺) 등의 조직을 포함하는 영역의 총칭이다.
피험체의 SSL 은, 그 피험체의 피부 세포에서 발현한 RNA 를 포함하고, 바람직하게는 그 피험체의 표피, 피지선, 모낭, 땀샘, 및 진피 중 어느 것에서 발현한 RNA 를 포함하며, 보다 바람직하게는 그 피험체의 표피, 피지선, 모낭, 및 땀샘 중 어느 것에서 발현한 RNA 를 포함한다 (특허문헌 1 참조). 따라서, 본 발명의 방법에 의해 조제되는 SSL 유래 RNA 는, 바람직하게는 피험체의 표피, 피지선, 모낭, 땀샘 및 진피에서 선택되는 적어도 1 부위 유래의 RNA 이며, 보다 바람직하게는 표피, 피지선, 모낭 및 땀샘에서 선택되는 적어도 1 부위 유래의 RNA 이다.
피험체의 피부로부터의 SSL 의 채취에는, 피부로부터의 SSL 의 회수 또는 제거에 사용되고 있는 모든 수단을 채용할 수 있다. 바람직하게는, 후술하는 SSL 흡수성 소재, SSL 접착성 소재, 또는 피부로부터 SSL 을 문질러 떨어뜨리는 기구를 사용할 수 있다. SSL 흡수성 소재 또는 SSL 접착성 소재로는, SSL 에 친화성을 갖는 소재이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 폴리프로필렌, 펄프 등을 들 수 있다. 피부로부터의 SSL 의 채취 순서의 보다 상세한 예로는, 기름 제거지, 기름 제거 필름 등의 시트상 소재에 SSL 을 흡수시키는 방법, 유리판, 테이프 등에 SSL 을 접착시키는 방법, 스페츌러, 스크레이퍼 등에 의해 SSL 을 문질러 떨어뜨려 회수하는 방법, 등을 들 수 있다. SSL 의 흡착성을 향상시키기 위해서, 지용성이 높은 용매를 미리 포함시킨 SSL 흡수성 소재를 사용해도 된다. 한편, SSL 흡수성 소재가 수용성이 높은 용매나 수분을 포함하고 있으면, SSL 의 흡착이 저해되기 때문에 바람직하지 않다. SSL 흡수성 소재는, 건조한 상태로 사용하는 것이 바람직하다.
피험체로부터 채취된 RNA 함유 SSL 은, 후술하는 RNA 조제에 사용될 때까지 보존되어도 된다. 그 SSL 은, SSL 흡수성 소재 또는 SSL 접착성 소재에 흡수 또는 접착시킨 상태인 채로 보존할 수 있다. 그 SSL 은, 종래 일반적인 RNA 의 보존 조건 (예를 들어 -80 ℃) 으로 보존되어도 되지만, 보다 마일드인 조건으로 보존하는 것이 가능하다 (국제 출원 번호 PCT/JP2019/043040). 예를 들어, 그 RNA 함유 SSL 의 보존의 온도 조건은, 0 ℃ 이하이면 되고, 바람직하게는 -10 ℃ 이하, 보다 바람직하게는 -20 ℃ 이하이면 된다. 그 보존 기간은, 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 12 개월 이하, 보다 바람직하게는 6 개월 이하, 더욱 바람직하게는 3 개월 이하이다.
SSL 로부터의 RNA 의 추출에는, 상기 서술한 통상적인 RNA 추출 수단, 예를 들어 페놀/클로로포름법, AGPC 법, 및 시판되는 RNA 정제용 시약, 칼럼 혹은 자성 입자를 사용할 수 있다.
본 발명의 방법에서는, 그 샘플 RNA 로부터 역전사 (RT) 에 의해 cDNA 를 합성하고, 이어서, 그 cDNA 를 멀티플렉스 PCR (MPCR) 에 의해 증폭한다. 이들 RT 반응 및 MPCR 은, 모두 1 본쇄 핵산 결합 단백질의 존재하에서 실시된다.
그 샘플 RNA 의 역전사는, 반응계에 1 본쇄 핵산 결합 단백질을 첨가하는 것 이외에는, 통상적인 순서로 실시할 수 있다. 예를 들어, 그 샘플 RNA, 프라이머, 역전사 효소, 및 기질을 함유하는 반응액을 인큐베이트 하여, 그 샘플 RNA 에 역전사 효소를 작용시켜 cDNA 를 합성하면 된다. 그 프라이머로는, 해석하고자 하는 특정한 RNA 를 표적으로 한 프라이머를 사용해도 되지만, 보다 포괄적인 핵산의 보존 및 해석을 위해서는 올리고 dT 프라이머, 랜덤 프라이머, 또는 그들의 혼합물을 사용하는 것이 바람직하다. 그 역전사 효소로는, 일반적인 역전사 효소를 사용할 수 있지만, 역전사의 정확성 및 효율성이 높은 역전사 효소 (예를 들어 M-MLV Reverse Transcriptase 및 그 개변체, 혹은 후술하는 시판되는 역전사 반응용 효소) 를 사용하는 것이 바람직하다. 그 기질은, 그 역전사 효소의 기질이며, 바람직하게는 데옥시리보뉴클레오티드, 예를 들어 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP, 그리고 그들의 혼합물을 사용할 수 있다. 그 데옥시리보뉴클레오티드는 수식되어 있어도 된다. 본 발명에 있어서, RT 를 위한 효소 및 그 밖의 시약으로는, 시판되는 역전사 반응용 효소 및 역전사 시약 키트, 예를 들어 PrimeScript (등록상표) Reverse Transcriptase 시리즈 (다카라 바이오사), SuperScript (등록상표) Reverse Transcriptase 시리즈 (라이프 테크놀로지스 재팬 주식회사) 등을 들 수 있으며, SuperScript (등록상표) III Reverse Transcriptase, SuperScript (등록상표) VILO cDNA Synthesis kit (모두 라이프 테크놀로지스 재팬 주식회사) 를 바람직하게 사용할 수 있다. RT 반응의 온도 및 시간은, 사용하는 효소 또는 시약의 종류, 샘플 RNA, 합성해야 할 cDNA 등에 따라 적절히 설정할 수 있다. 예를 들어, 시판되는 역전사 반응용 시약을 사용하여, 그 매뉴얼에 따라서 반응액을 조제하고, 그 반응액에 1 본쇄 핵산 결합 단백질을 첨가하면 된다. RT 의 조건도 그 시약의 매뉴얼에 따라서 설정하면 된다.
그 RT 로 합성된 cDNA 를 MPCR 에 의해 증폭한다. MPCR 은, 반응계에 1 본쇄 핵산 결합 단백질을 첨가하는 것 이외에는, 통상적인 순서로 실시할 수 있다. 예를 들어, cDNA, 복수의 프라이머 페어, DNA 합성 효소, 및 기질을 함유하는 반응액을 PCR 에 걸면 된다. 그 프라이머 페어는, 표적 DNA 서열에 따라 적절히 설계될 수 있다. 그 DNA 합성 효소로는, 일반적인 DNA 합성 효소를 사용할 수 있지만, 증폭의 정확성 및 효율성이 높은 DNA 합성 효소 (예를 들어 후술하는 시판되는 멀티플렉스 PCR 용 효소) 를 사용하는 것이 바람직하다. 그 기질은, 그 DNA 합성 효소의 기질이며, 바람직하게는 데옥시리보뉴클레오티드, 예를 들어 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP, 그리고 그들의 혼합물을 사용할 수 있다. 그 데옥시리보뉴클레오티드는 수식되어 있어도 된다. 본 발명에 있어서, MPCR 을 위한 효소 및 그 밖의 시약으로는, 시판되는 멀티플렉스 PCR 용 효소 및 시약, 예를 들어, Ion AmpliSeq Transcriptome Human Gene Expression Kit (라이프 테크놀로지스 재팬 주식회사) 를 사용할 수 있다. 반응의 온도 및 시간은, 사용하는 효소 또는 시약의 종류, 주형 cDNA 등에 따라 적절히 설정할 수 있다. 예를 들어, 시판되는 멀티플렉스 PCR 용 시약을 사용하여, 그 매뉴얼에 따라서 반응액을 조제하고, 그 반응액에 1 본쇄 핵산 결합 단백질을 첨가하면 된다. PCR 의 조건도 그 시약의 매뉴얼에 따라서 설정하면 된다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 RT 반응 및 MPCR 은, 모두 1 본쇄 핵산 결합 단백질의 존재하에서 실시된다. 그 1 본쇄 핵산 결합 단백질로는, T4GP32 (T4 gene 32 protein), 및 그 개변체를 들 수 있다. T4GP32 는, 대표적으로는 서열 번호 1 의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질이며, 1 본쇄 DNA 에 대하여 결합한다. T4GP32 의 개변체로는, T4GP32 의 아미노산 서열 상의 임의의 아미노산에 대하여 수식 또는 변이를 가하여 얻어지는 단백질을 들 수 있다. T4GP32 의 개변체의 예로는, 서열 번호 1 의 아미노산 서열과 적어도 90 % 서열 동일한 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 1 본쇄 핵산, 바람직하게는 1 본쇄 DNA 에 결합하는 단백질을 들 수 있다. T4GP32 는 구입할 수 있다 (예를 들어 NEW ENGLAND BioLabs Inc., Sigma-Aldrich 등으로부터). 그 RT 와 MPCR 의 반응액 중에 있어서의 그 1 본쇄 핵산 결합 단백질의 초기 농도는, 바람직하게는 1 μg/mL 이상, 보다 바람직하게는 5 μg/mL 이상, 더욱 바람직하게는 7 μg/mL 이상이면 되고, 한편, 바람직하게는 100 μg/mL 이하, 보다 바람직하게는 20 μg/mL 이하, 더욱 바람직하게는 15 μg/mL 이하이면 되고, 혹은, 바람직하게는 1 ∼ 100 μg/mL 이면 되고, 보다 바람직하게는 5 ∼ 20 μg/mL 이면 되고, 더욱 바람직하게는 7 ∼ 15 μg/mL 이면 된다.
본 발명의 방법에 있어서, 그 RT 와 MPCR 은, 별도의 반응계 (2 스텝) 로 실시되는 것이 바람직하지만, 간편함의 점에서는 1 반응계 (1 스텝) 로 실시되어도 된다. 1 스텝 반응의 경우, RT 에 사용한 1 본쇄 핵산 결합 단백질을 그대로 MPCR 에 사용할 수 있다.
그 MPCR 로 얻어진 산물의 정제는, 반응 산물의 사이즈 분리에 의해 실시되는 것이 바람직하다. 사이즈 분리에 의해, 목적으로 하는 PCR 산물을, MPCR 반응액 중에 포함되는 프라이머나 그 밖의 불순물로부터 분리할 수 있다. DNA 의 사이즈 분리는, 예를 들어, 사이즈 분리 칼럼이나, 사이즈 분리 칩, 사이즈 분리에 이용 가능한 자기 비즈 등에 의해 실시할 수 있다. 사이즈 분리에 이용 가능한 자기 비즈의 바람직한 예로는, Ampure XP 등의 Solid Phase Reversible Immobilization (SPRI) 자성 비즈를 들 수 있다. Ampure XP 와 DNA 용액을 혼합하면, DNA 는 자성 비즈의 표면에 코팅된 카르복실기에 흡착되고, 마그넷을 사용하여 자성 비즈만을 회수함으로써 DNA 가 정제된다. 또 Ampure XP 용액과 DNA 용액의 혼합비를 변화시키면 자성 비즈에 흡착하는 DNA 의 분자 사이즈가 변화한다. 이 원리를 이용함으로써, 포착하고자 하는 특정한 분자 사이즈의 DNA 를 자성 비즈 상에 회수하고, 그 이외의 분자 사이즈의 DNA 나 불순물을 정제하는 것이 가능하다.
정제한 PCR 산물에 대하여, 그 후의 해석을 실시하기 위해서 필요한 추가적인 처리를 실시해도 된다. 예를 들어, DNA 의 시퀀싱이나 프래그먼트 해석을 위해서, 정제한 PCR 산물을, 적절한 버퍼 용액으로 조제하거나, PCR 증폭된 DNA 에 포함되는 PCR 프라이머 영역을 절단하거나, 증폭된 DNA 에 어댑터 서열을 추가로 부가하거나 해도 된다. 예를 들어, 정제한 PCR 산물을 버퍼 용액으로 조제하고, 증폭 DNA 에 대하여 PCR 프라이머 서열의 제거 및 어댑터 라이게이션을 실시하고, 얻어진 반응 산물을, 필요에 따라 증폭하여, 각종 해석을 위한 라이브러리를 조제할 수 있다. 이들 조작은, 예를 들어, SuperScript (등록상표) VILO cDNA Synthesis kit (라이프 테크놀로지스 재팬 주식회사) 에 부속되어 있는 5×VILO RT Reaction Mix, 및 Ion AmpliSeq Transcriptome Human Gene Expression Kit (라이프 테크놀로지스 재팬 주식회사) 에 부속되어 있는 5×Ion AmpliSeq HiFi Mix, 및 Ion AmpliSeq Transcriptome Human Gene Expression Core Panel 을 사용하여, 각 키트 부속의 프로토콜에 따라서 실시할 수 있다.
본 발명에 의한 핵산 증폭 방법은, RNA 를 사용하는 각종 해석 또는 진단에 응용할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 방법은, 멀티플렉스 PCR 을 응용할 수 있는 모든 해석, 예를 들어, 유전자 발현 해석, 트랜스크립톰 해석, 피험체의 기능 해석, 질환의 진단, 피험체에 투여한 약물의 효능 평가 등의, 유전자의 망라적 해석 또는 특정한 유전자를 표적으로 한 발현 해석에 사용할 수 있다.
본 발명의 예시적 실시형태로서, 이하의 물질, 제조 방법, 용도, 방법 등을 추가로 본 명세서에 개시한다. 단, 본 발명은 이들 실시형태에 한정되지 않는다.
〔1〕 핵산 증폭 방법으로서,
샘플 RNA 로부터 역전사에 의해 cDNA 를 합성하는 것 ; 및,
그 cDNA 를 멀티플렉스 PCR 에 의해 증폭하는 것,
을 포함하고, 그 역전사 및 그 멀티플렉스 PCR 이, 1 본쇄 핵산 결합 단백질의 존재하에서 실시되고, 그 1 본쇄 핵산 결합 단백질이, T4GP32 또는 그 개변체인,
방법.
〔2〕 바람직하게는, 상기 T4GP32 또는 그 개변체가, 서열 번호 1 의 아미노산 서열 또는 당해 서열과 적어도 90 % 서열 동일한 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 1 본쇄 핵산에 결합하는 단백질인, 〔1〕 에 기재된 방법.
〔3〕 상기 역전사가,
바람직하게는, 올리고 dT 프라이머, 랜덤 프라이머, 또는 그들의 혼합물을 포함하는 반응액 중에서 실시되고,
보다 바람직하게는, 랜덤 프라이머를 포함하는 반응액 중에서 실시되는,
〔1〕 또는〔2〕 에 기재된 방법.
〔4〕 바람직하게는, 상기 샘플 RNA 가 피부 표면 지질 유래 RNA 인, 〔1〕 ∼ 〔3〕 중 어느 한 항에 기재된 방법.
〔5〕 상기 역전사와 상기 멀티플렉스 PCR 의 반응액 중에 있어서의 상기 1 본쇄 핵산 결합 단백질의 초기 농도가, 바람직하게는 1 μg/mL 이상, 보다 바람직하게는 5 μg/mL 이상, 더욱 바람직하게는 7 μg/mL 이상이며, 한편, 바람직하게는 100 μg/mL 이하, 보다 바람직하게는 20 μg/mL 이하, 더욱 바람직하게는 15 μg/mL 이하이거나, 혹은, 바람직하게는 1 ∼ 100 μg/mL, 보다 바람직하게는 5 ∼ 20 μg/mL, 더욱 바람직하게는 7 ∼ 15 μg/mL 인, 〔1〕 ∼ 〔4〕 중 어느 한 항에 기재된 방법.
〔6〕 1 본쇄 핵산 결합 단백질을 유효 성분으로 하는, 멀티플렉스 RT-PCR 의 수량 개선제로서, 그 1 본쇄 핵산 결합 단백질이 T4GP32 또는 그 개변체이고, 또한 역전사 및 멀티플렉스 PCR 의 양쪽의 반응액에 첨가되는, 개선제.
〔7〕 바람직하게는, 상기 T4GP32 또는 그 개변체가, 서열 번호 1 의 아미노산 서열 또는 당해 서열과 적어도 90 % 서열 동일한 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 1 본쇄 핵산에 결합하는 단백질인, 〔6〕 에 기재된 개선제.
〔8〕 상기 역전사가
바람직하게는, 올리고 dT 프라이머, 랜덤 프라이머, 또는 그들의 혼합물을 포함하는 반응액 중에서 실시되고,
보다 바람직하게는, 랜덤 프라이머를 포함하는 반응액 중에서 실시되는,
〔6〕 또는〔7〕 에 기재된 개선제.
〔9〕 바람직하게는, 피부 표면 지질 유래 RNA 를 사용한 멀티플렉스 RT-PCR 의 수량을 개선하는, 〔6〕 ∼ 〔8〕 중 어느 한 항에 기재된 개선제.
〔10〕 상기 역전사 및 멀티플렉스 PCR 의 반응액 중에 있어서의 상기 1 본쇄 핵산 결합 단백질의 초기 농도가, 바람직하게는 1 μg/mL 이상, 보다 바람직하게는 5 μg/mL 이상, 더욱 바람직하게는 7 μg/mL 이상이며, 한편, 바람직하게는 100 μg/mL 이하, 보다 바람직하게는 20 μg/mL 이하, 더욱 바람직하게는 15 μg/mL 이하이거나, 혹은, 바람직하게는 1 ∼ 100 μg/mL, 보다 바람직하게는 5 ∼ 20 μg/mL, 더욱 바람직하게는 7 ∼ 15 μg/mL 인, 〔6〕 ∼ 〔9〕 중 어느 한 항에 기재된 개선제.
〔11〕 바람직하게는, 멀티플렉스 RT-PCR 의 감도 및 수량을 개선하는, 〔6〕 ∼ 〔10〕 중 어느 한 항에 기재된 개선제.
〔12〕 멀티플렉스 RT-PCR 의 수량 개선을 위한 1 본쇄 핵산 결합 단백질의 사용으로서, 그 1 본쇄 핵산 결합 단백질이 T4GP32 또는 그 개변체이고, 또한 역전사 및 멀티플렉스 PCR 의 양쪽의 반응액에 첨가되는, 사용.
〔13〕 바람직하게는, 상기 T4GP32 또는 그 개변체가, 서열 번호 1 의 아미노산 서열 또는 당해 서열과 적어도 90 % 서열 동일한 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 1 본쇄 핵산에 결합하는 단백질인, 〔12〕 에 기재된 사용.
〔14〕 상기 역전사가
바람직하게는, 올리고 dT 프라이머, 랜덤 프라이머, 또는 그들의 혼합물을 포함하는 반응액 중에서 실시되고,
보다 바람직하게는, 랜덤 프라이머를 포함하는 반응액 중에서 실시되는,
〔12〕 또는〔13〕 에 기재된 사용.
〔15〕 바람직하게는, 상기 1 본쇄 핵산 결합 단백질이 피부 표면 지질 유래 RNA 를 사용한 멀티플렉스 RT-PCR 의 수량 개선을 위해서 사용되는, 〔12〕 ∼ 〔14〕 중 어느 한 항에 기재된 사용.
〔16〕 상기 역전사 및 멀티플렉스 PCR 의 반응액 중에 있어서의 상기 1 본쇄 핵산 결합 단백질의 초기 농도가, 바람직하게는 1 μg/mL 이상, 보다 바람직하게는 5 μg/mL 이상, 더욱 바람직하게는 7 μg/mL 이상이며, 한편, 바람직하게는 100 μg/mL 이하, 보다 바람직하게는 20 μg/mL 이하, 더욱 바람직하게는 15 μg/mL 이하이거나, 혹은, 바람직하게는 1 ∼ 100 μg/mL, 보다 바람직하게는 5 ∼ 20 μg/mL, 더욱 바람직하게는 7 ∼ 15 μg/mL 인, 〔12〕 ∼ 〔15〕 중 어느 한 항에 기재된 사용.
〔17〕 바람직하게는, 상기 1 본쇄 핵산 결합 단백질이 멀티플렉스 RT-PCR 의 감도 및 수량 개선을 위해서 사용되는, 〔12〕 ∼ 〔16〕 중 어느 한 항에 기재된 사용.
〔18〕 멀티플렉스 RT-PCR 의 수량 개선제의 제조에 있어서의 1 본쇄 핵산 결합 단백질의 사용으로서, 그 1 본쇄 핵산 결합 단백질이 T4GP32 또는 그 개변체이며, 그 개선제가 역전사 및 멀티플렉스 PCR 의 양쪽의 반응액에 첨가되는, 사용.
〔19〕 바람직하게는, 상기 T4GP32 또는 그 개변체가, 서열 번호 1 의 아미노산 서열 또는 당해 서열과 적어도 90 % 서열 동일한 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 1 본쇄 핵산에 결합하는 단백질인, 〔18〕 에 기재된 사용.
〔20〕 상기 역전사가
바람직하게는, 올리고 dT 프라이머, 랜덤 프라이머, 또는 그들의 혼합물을 포함하는 반응액 중에서 실시되고,
보다 바람직하게는, 랜덤 프라이머를 포함하는 반응액 중에서 실시되는,
〔18〕 또는〔19〕 에 기재된 사용.
〔21〕 바람직하게는, 상기 1 본쇄 핵산 결합 단백질이 피부 표면 지질 유래 RNA 를 사용한 멀티플렉스 RT-PCR 의 수량 개선을 위해서 사용되는, 〔18〕 ∼ 〔20〕 중 어느 한 항에 기재된 사용.
〔22〕 상기 역전사 및 멀티플렉스 PCR 의 반응액 중에 있어서의 상기 1 본쇄 핵산 결합 단백질의 초기 농도가, 바람직하게는 1 μg/mL 이상, 보다 바람직하게는 5 μg/mL 이상, 더욱 바람직하게는 7 μg/mL 이상이며, 한편, 바람직하게는 100 μg/mL 이하, 보다 바람직하게는 20 μg/mL 이하, 더욱 바람직하게는 15 μg/mL 이하이거나, 혹은, 바람직하게는 1 ∼ 100 μg/mL, 보다 바람직하게는 5 ∼ 20 μg/mL, 더욱 바람직하게는 7 ∼ 15 μg/mL 인, 〔18〕 ∼ 〔21〕 중 어느 한 항에 기재된 사용.
〔23〕 바람직하게는, 상기 1 본쇄 핵산 결합 단백질이 멀티플렉스 RT-PCR 의 감도 및 수량 개선을 위해서 사용되는, 〔18〕 ∼ 〔22〕 중 어느 한 항에 기재된 사용.
실시예
이하, 실시예에 기초하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하는데, 본 발명은 이것에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 멀티플렉스 PCR 에 대한 T4GP32 의 효과
1) SSL 로부터의 RNA 추출
건강한 성인 여성 또는 남성 각각 1 명을 피험자로 하였다. 기름 제거 필름 (5 × 8 ㎝, 폴리프로필렌제, 3M 재팬) 을 사용하여, 피험자의 얼굴 전체에서 피지를 회수하였다. 피지를 포함하는 그 기름 제거 필름은, 정리하여 유리 바이알로 옮기고, RNA 정제까지 -80 ℃ 에서 보존하였다. 그 기름 제거 필름에 포함되는 SSL 중 RNA 를 정제하였다. 그 기름 제거 필름을 적당한 크기로 절단하고, QIAzol (등록상표) Lysis Reagent (QIAGEN) 를 사용하여 그 필름으로부터 RNA 를 포함하는 수상 (水相) 을 회수하였다. 회수한 수상으로부터, RNeasy (등록상표) (QIAGEN) 에 부속된 프로토콜에 준하여 RNA 를 추출하였다.
2) 역전사 및 멀티플렉스 PCR
추출된 RNA 로부터, SuperScript (등록상표) VILO cDNA Synthesis kit (라이프 테크놀로지스 재팬 주식회사) 를 사용하여 42 ℃, 30 분간 역전사를 실시하고, cDNA 를 합성하였다. 역전사 반응의 프라이머에는, 키트에 부속되어 있는 랜덤 프라이머를 사용하였다. 얻어진 cDNA 로부터 멀티플렉스 PCR 에 의해, 20802 유전자에서 유래하는 DNA 를 포함하는 라이브러리를 조제하였다. 멀티플렉스 PCR 은, Ion AmpliSeq Transcriptome Human Gene Expression Kit (라이프 테크놀로지스 재팬 주식회사) 를 사용하여, PCR 개선제와 함께 [99 ℃, 2 분 → (99 ℃, 15 초 → 60 ℃, 16 분) × 20 사이클 → 4 ℃, Hold] 의 조건으로 실시하였다. PCR 개선제로는, 기보 (旣報) (비특허문헌 1, 2) 에 따라서, BSA (lyophilized powder, essentially IgG-free, low endotoxin, BioReagent, suitable fwor sell culture) (Sigma aldrich, 카탈로그 번호 : A2058), 베타인 염산염 (후지 필름 와코 순약 주식회사), 및 T4GP32 (NEW ENGLAND BioLabs Inc.) 를 표 1 에 기재된 농도로 사용하였다. 조제한 라이브러리의 PCR 산물 농도를 TapeStation (애질런트·테크놀로지 주식회사) 과 High Sensitivity D1000 ScreenTape (애질런트·테크놀로지 주식회사) 를 사용하여 측정하였다. 대조 (PCR 개선제 미첨가) 에 대한 PCR 산물의 상대 수량을 구하였다.
3) 결과
PCR 개선제 존재하에서의 PCR 산물의 상대 수량을 표 1 에 나타낸다. 또한, 표 1 중, BSA 와 베타인의 결과는 여성 피험자 유래의 SSL 중 RNA, T4GP32 의 결과는 남성 피험자 유래의 SSL 중 RNA 를 사용한 경우의 결과이다. T4GP32 를 첨가한 경우, 대조에 대한 PCR 산물의 상대 수량은 1.41 로 증가하였다. 한편, BSA 또는 베타인을 첨가한 경우, 대조에서는 PCR 산물이 검출된 것에 반해, PCR 산물은 검출 한계 이하로 감소하였다. 기보 (비특허문헌 3, 4) 에서는, RT 후의 PCR 계에 T4GP32 를 첨가해도 분명한 수량의 증가는 보이지 않는 것이 보고되어 있지만, 본 발명과 같은 복수 영역을 대상으로 하는 멀티플렉스 PCR 의 경우에는, T4GP32 의 첨가가 반응의 감도 및 수량에 현저한 효과를 발휘하는 것으로 추측되었다.
Figure pct00001
실시예 2 역전사 및 멀티플렉스 PCR 에 대한 T4GP32 의 효과
1) 역전사 및 멀티플렉스 PCR
건강한 성인 남성 1 명을 피험자로 하였다. 기름 제거 필름 (5 × 8 ㎝, 폴리프로필렌제, 3M재팬) 을 사용하여, 피험자의 얼굴 전체에서 피지를 회수하였다. 그 기름 제거 필름으로부터 실시예 1 과 동일한 순서로 RNA 를 추출하였다. 역전사는, T4GP32 를 첨가 (0.0010 w/v%) 또는 미첨가의 조건하에서 실시예 1 과 동일하게 실시하였다. 멀티플렉스 PCR 에 대해서도, T4GP32 (0.0010 w/v%) 를 첨가 또는 미첨가의 조건하에서 실시예 1 과 동일하게 실시하고, PCR 산물 농도를 측정하였다. 대조 (역전사 및 PCR 로 T4GP32 미첨가) 에 대한 PCR 산물의 상대 수량을 구하였다.
2) 결과
결과를 표 2 에 나타낸다. 역전사에만 T4GP32 를 첨가한 경우, 및 멀티플렉스 PCR 에만 T4GP32 를 첨가한 경우에는, 대조에 대한 상대 수량은, 각각 1.06 과 1.41 이었다. 이에 반해, 역전사와 멀티플렉스 PCR 쌍방의 행정에 T4GP32 를 첨가한 경우, 상대 수량은 2.19 로 현저하게 증가하였다.
Figure pct00002
SEQUENCE LISTING <110> Kao Corporation <120> Method of amplifying nucleic acids <130> KS1720 <150> JP 2020-002506 <151> 2020/01/10 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 301 <212> PRT <213> Bacteriophage T4 <400> 1 Met Phe Lys Arg Lys Ser Thr Ala Glu Leu Ala Ala Gln Met Ala Lys 1 5 10 15 Leu Asn Gly Asn Lys Gly Phe Ser Ser Glu Asp Lys Gly Glu Trp Lys 20 25 30 Leu Lys Leu Asp Asn Ala Gly Asn Gly Gln Ala Val Ile Arg Phe Leu 35 40 45 Pro Ser Lys Asn Asp Glu Gln Ala Pro Phe Ala Ile Leu Val Asn His 50 55 60 Gly Phe Lys Lys Asn Gly Lys Trp Tyr Ile Glu Thr Cys Ser Ser Thr 65 70 75 80 His Gly Asp Tyr Asp Ser Cys Pro Val Cys Gln Tyr Ile Ser Lys Asn 85 90 95 Asp Leu Tyr Asn Thr Asp Asn Lys Glu Tyr Ser Leu Val Lys Arg Lys 100 105 110 Thr Ser Tyr Trp Ala Asn Ile Leu Val Val Lys Asp Pro Ala Ala Pro 115 120 125 Glu Asn Glu Gly Lys Val Phe Lys Tyr Arg Phe Gly Lys Lys Ile Trp 130 135 140 Asp Lys Ile Asn Ala Met Ile Ala Val Asp Val Glu Met Gly Glu Thr 145 150 155 160 Pro Val Asp Val Thr Cys Pro Trp Glu Gly Ala Asn Phe Val Leu Lys 165 170 175 Val Lys Gln Val Ser Gly Phe Ser Asn Tyr Asp Glu Ser Lys Phe Leu 180 185 190 Asn Gln Ser Ala Ile Pro Asn Ile Asp Asp Glu Ser Phe Gln Lys Glu 195 200 205 Leu Phe Glu Gln Met Val Asp Leu Ser Glu Met Thr Ser Lys Asp Lys 210 215 220 Phe Lys Ser Phe Glu Glu Leu Asn Thr Lys Phe Gly Gln Val Met Gly 225 230 235 240 Thr Ala Val Met Gly Gly Ala Ala Ala Thr Ala Ala Lys Lys Ala Asp 245 250 255 Lys Val Ala Asp Asp Leu Asp Ala Phe Asn Val Asp Asp Phe Asn Thr 260 265 270 Lys Thr Glu Asp Asp Phe Met Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser 275 280 285 Ala Asp Asp Thr Asp Leu Asp Asp Leu Leu Asn Asp Leu 290 295 300

Claims (14)

  1. 핵산 증폭 방법으로서,
    샘플 RNA 로부터 역전사에 의해 cDNA 를 합성하는 것 ; 및,
    그 cDNA 를 멀티플렉스 PCR 에 의해 증폭하는 것,
    을 포함하고, 그 역전사 및 그 멀티플렉스 PCR 이, 1 본쇄 핵산 결합 단백질의 존재하에서 실시되고 그 1 본쇄 핵산 결합 단백질이, T4GP32 또는 그 개변체인, 핵산 증폭 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 T4GP32 또는 그 개변체가, 서열 번호 1 의 아미노산 서열 또는 당해 서열과 적어도 90 % 서열 동일한 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 1 본쇄 핵산에 결합하는 단백질인, 핵산 증폭 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 역전사 반응이, 랜덤 프라이머를 포함하는 반응액 중에서 실시되는, 핵산 증폭 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 샘플 RNA 가, 피부 표면 지질 유래 RNA 인, 핵산 증폭 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 역전사와 상기 멀티플렉스 PCR 의 반응액 중에 있어서의 상기 1 본쇄 핵산 결합 단백질의 초기 농도가 1 ∼ 100 μg/mL 인, 핵산 증폭 방법.
  6. 1 본쇄 핵산 결합 단백질을 유효 성분으로 하는, 멀티플렉스 RT-PCR 의 수량 (收量) 개선제로서, 그 1 본쇄 핵산 결합 단백질이 T4GP32 또는 그 개변체이고, 또한 역전사 및 멀티플렉스 PCR 의 양쪽의 반응액에 첨가되는, 개선제.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 T4GP32 또는 그 개변체가, 서열 번호 1 의 아미노산 서열 또는 당해 서열과 적어도 90 % 서열 동일한 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 1 본쇄 핵산에 결합하는 단백질인, 개선제.
  8. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서,
    멀티플렉스 RT-PCR 의 감도 및 수량을 개선하는, 개선제.
  9. 멀티플렉스 RT-PCR 의 수량 개선을 위한 1 본쇄 핵산 결합 단백질의 사용으로서, 그 1 본쇄 핵산 결합 단백질이 T4GP32 또는 그 개변체이고, 또한 역전사 및 멀티플렉스 PCR 의 양쪽의 반응액에 첨가되는, 사용.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 T4GP32 또는 그 개변체가, 서열 번호 1 의 아미노산 서열 또는 당해 서열과 적어도 90 % 서열 동일한 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 1 본쇄 핵산에 결합하는 단백질인, 사용.
  11. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서,
    상기 1 본쇄 핵산 결합 단백질이, 멀티플렉스 RT-PCR 의 감도 및 수량 개선을 위해서 사용되는, 사용.
  12. 멀티플렉스 RT-PCR 의 수량 개선제의 제조에 있어서의 1 본쇄 핵산 결합 단백질의 사용으로서, 그 1 본쇄 핵산 결합 단백질이 T4GP32 또는 그 개변체이며, 그 개선제가 역전사 및 멀티플렉스 PCR 의 양쪽의 반응액에 첨가되는, 사용.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 T4GP32 또는 그 개변체가, 서열 번호 1 의 아미노산 서열 또는 당해 서열과 적어도 90 % 서열 동일한 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 1 본쇄 핵산에 결합하는 단백질인, 사용.
  14. 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서,
    상기 1 본쇄 핵산 결합 단백질이, 멀티플렉스 RT-PCR 의 감도 및 수량 개선을 위해서 사용되는, 사용.
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