JP2021108664A - 核酸増幅方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】高感度かつ高収量なＲＮＡからの核酸増幅方法の提供。【解決手段】サンプルＲＮＡから逆転写反応によりｃＤＮＡを合成すること、及び、該ｃＤＮＡをマルチプレックスＰＣＲにより増幅することを含み、該逆転写及び該マルチプレックスＰＣＲが一本鎖核酸結合タンパク質の存在下で行われ、該一本鎖核酸結合タンパク質がＴ４ＧＰ３２又はその変異体である、核酸増幅方法。【選択図】なし
Description
本発明は、核酸増幅方法に関する。
マルチプレックスＰＣＲは、複数のプライマー対を同時に使用したＰＣＲ反応により、１つのＤＮＡサンプルから複数の領域を同時に増幅する方法である。ＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写（ＲＴ）反応をマルチプレックスＰＣＲと組み合わせたマルチプレックスＲＴ−ＰＣＲは、遺伝子発現解析やジェノタイピングなどに利用されている。
ＲＮＡは、一般に組織サンプルから抽出される。さらに最近、より簡便かつ非侵襲的なＲＮＡ採取方法として、皮膚表上脂質（ｓｋｉｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｌｉｐｉｄｓ；ＳＳＬ）からＲＮＡを採取する方法が開示された（特許文献１）。ＳＳＬに含まれるＲＮＡは遺伝子発現解析等のためのＲＮＡサンプルとして有用である。しかし、１被験体から回収できるＳＳＬの量は多くなく、またそこに含まれるＲＮＡの量も多くはないため、１被験体のＳＳＬから調製できるＲＮＡの量は微量である。
非特許文献１には、ＢＳＡ及びＴ４ ｇｅｎｅ ３２ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｔ４ＧＰ３２）が阻害物質存在下でのＰＣＲの反応を改善することが記載されている。非特許文献２には、ＤＭＳＯとベタインがＰＣＲの特異性と収量を向上させたことが記載されている。非特許文献３、４には、ＲＴ−ＰＣＲの際に、ＲＴ系にＴ４ＧＰ３２を添加しておくことでＲＴ−ＰＣＲ産物の収量が顕著に増加したが、ＲＴ後のＰＣＲ系にＴ４ＧＰ３２を添加しても明らかな収量の増加はみられなかったことが記載されている。特許文献２には、ＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを増幅させる増幅逆転写法（ＲＴ−ＲａｍＤＡ法）において、鋳型ＲＮＡから剥がされた１本鎖ｃＤＮＡにＴ４ＧＰ３２を結合させることで該ｃＤＮＡをヌクレアーゼ分解から保護して、ｃＤＮＡの収量を増加させることが記載されている。
Appl Environ Microbiol, 1996, 62(3):1102-1106
PLOS ONE, 2010, 5(6):e11024
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BioTechniques, 2001, 31(1):81-86
マルチプレックスＲＴ−ＰＣＲにおける感度及び収量の向上が望まれる。本発明は、高感度かつ高収量なＲＮＡからの核酸増幅方法に関する。
本発明者らは、マルチプレックスＲＴ−ＰＣＲでのＲＴ及びＰＣＲの両方の反応をＴ４ＧＰ３２の存在下で行うことによって、微量のＲＮＡサンプルからでも高収量が達成できることを見出した。
したがって、本発明は、核酸増幅方法であって、
サンプルＲＮＡから逆転写によりｃＤＮＡを合成すること；及び、
該ｃＤＮＡをマルチプレックスＰＣＲにより増幅すること、
を含み、該逆転写及び該マルチプレックスＰＣＲが、一本鎖核酸結合タンパク質の存在下で行われ、該一本鎖核酸結合タンパク質が、Ｔ４ＧＰ３２又はその改変体である、
方法を提供する。
また本発明は、一本鎖核酸結合タンパク質を有効成分とする、マルチプレックスＲＴ−ＰＣＲの収量改善剤であって、該一本鎖核酸結合タンパク質がＴ４ＧＰ３２又はその改変体であり、かつ逆転写及びマルチプレックスＰＣＲの両方の反応液に添加される、改善剤を提供する。
サンプルＲＮＡから逆転写によりｃＤＮＡを合成すること；及び、
該ｃＤＮＡをマルチプレックスＰＣＲにより増幅すること、
を含み、該逆転写及び該マルチプレックスＰＣＲが、一本鎖核酸結合タンパク質の存在下で行われ、該一本鎖核酸結合タンパク質が、Ｔ４ＧＰ３２又はその改変体である、
方法を提供する。
また本発明は、一本鎖核酸結合タンパク質を有効成分とする、マルチプレックスＲＴ−ＰＣＲの収量改善剤であって、該一本鎖核酸結合タンパク質がＴ４ＧＰ３２又はその改変体であり、かつ逆転写及びマルチプレックスＰＣＲの両方の反応液に添加される、改善剤を提供する。
本発明は、マルチプレックスＲＴ−ＰＣＲの感度及び収量を向上させる。本発明の方法は、ＳＳＬ由来ＲＮＡのような微量ＲＮＡサンプルの効率良い増幅と解析を可能にする。本発明は、ＲＮＡ試料を用いた解析（例えば、遺伝子解析、診断等）の感度と精度、及び効率を向上させる。
本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、及びその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。
本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列に関する「少なくとも９０％の同一性」とは、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性をいう。
本明細書において、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の同一性は、リップマン−パーソン法（Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法；Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５−４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（Ｖｅｒ．５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
本発明は、ＲＮＡからの核酸増幅方法を提供する。当該方法は、サンプルＲＮＡから逆転写によりｃＤＮＡを合成すること、及び、該ｃＤＮＡをマルチプレックスＰＣＲにより増幅することを含む。
本発明の方法で用いられるサンプルＲＮＡは、いかなる種類のＲＮＡであってもよく、例えば、動物、植物、微生物、ウイルス等に由来するＲＮＡが挙げられる。該サンプルＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｍａｌｌ ＲＮＡ（例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）等）、ｌｏｎｇ ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ（ｌｉｎｃ）ＲＮＡ、などを含み得る。上記に上げたＲＮＡの１種又は２種以上が該サンプルＲＮＡに含まれ得る。
該サンプルＲＮＡは、動物、植物、微生物、ウイルス等から通常の手段で抽出することができる。例えば、該ＲＮＡの抽出には、フェノール／クロロホルム法、ＡＧＰＣ（ａｃｉｄ ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−ｐｈｅｎｏｌ−ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）法、又はそれらの変法、シリカをコーティングした特殊な磁性体粒子を用いる方法、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ磁性体粒子を用いる方法、あるいは市販のＲＮＡ精製用試薬（例えばＴＲＩｚｏｌ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）、ＱＩＡｚｏｌ（登録商標）、ＩＳＯＧＥＮ等）、などを用いることができる。
好ましい一実施形態において、該サンプルＲＮＡは、皮膚表上脂質由来ＲＮＡである。本明細書において、「皮膚表上脂質（ｓｋｉｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｌｉｐｉｄｓ；ＳＳＬ）」とは、皮膚の表上に存在する脂溶性画分をいい、皮脂と呼ばれることもある。一般に、ＳＳＬは、皮膚にある皮脂腺等の外分泌腺から分泌された分泌物を主に含み、皮膚表面を覆う薄い層の形で皮膚表上に存在している。ＳＳＬには、被験体の皮膚細胞に由来するＲＮＡが含まれており、これを用いて生体の解析が可能である（特許文献１）。
該ＳＳＬ由来ＲＮＡが採取される被験体は、皮膚上にＳＳＬを有する生物であればよい。被験体の例としては、ヒト及び非ヒト哺乳動物を含む哺乳動物が挙げられ、好ましくはヒトである。例えば、該被験体は、自身の核酸の解析を必要とするか又は希望するヒト又は非ヒト哺乳動物であり得る。あるいは、該被験体は、皮膚における遺伝子発現解析、又は核酸を用いた皮膚もしくは皮膚以外の部位の状態の解析を必要とするか又は希望するヒト又は非ヒト哺乳動物であり得る。
被験体のＳＳＬが採取される皮膚の部位としては、頭、顔、首、体幹、手足等の身体の任意の部位の皮膚、アトピー、ニキビ、乾燥、炎症（赤み）、腫瘍等の疾患を有する皮膚、創傷を有する皮膚、などが挙げられるが、特に限定されない。本明細書において、「皮膚」とは、特に限定しない限り、体表の表皮、真皮、毛包、ならびに汗腺、皮脂腺及びその他の腺などの組織を含む領域の総称である。
被験体のＳＳＬは、該被験体の皮膚細胞で発現したＲＮＡを含み、好ましくは該被験体の表皮、皮脂腺、毛包、汗腺、及び真皮のいずれかで発現したＲＮＡを含み、より好ましくは該被験体の表皮、皮脂腺、毛包、及び汗腺のいずれかで発現したＲＮＡを含む（特許文献１参照）。したがって、本発明の方法により調製されるＳＳＬ由来ＲＮＡは、好ましくは被験体の表皮、皮脂腺、毛包、汗腺及び真皮から選択される少なくとも１部位由来のＲＮＡであり、より好ましくは表皮、皮脂腺、毛包及び汗腺から選択される少なくとも１部位由来のＲＮＡである。
被験体の皮膚からのＳＳＬの採取には、皮膚からのＳＳＬの回収又は除去に用いられているあらゆる手段を採用することができる。好ましくは、後述するＳＳＬ吸収性素材、ＳＳＬ接着性素材、又は皮膚からＳＳＬをこすり落とす器具を使用することができる。ＳＳＬ吸収性素材又はＳＳＬ接着性素材としては、ＳＳＬに親和性を有する素材であれば特に限定されず、例えばポリプロピレン、パルプ等が挙げられる。皮膚からのＳＳＬの採取手順のより詳細な例としては、あぶら取り紙、あぶら取りフィルム等のシート状素材へＳＳＬを吸収させる方法、ガラス板、テープ等へＳＳＬを接着させる方法、スパーテル、スクレイパー等によりＳＳＬをこすり落として回収する方法、などが挙げられる。ＳＳＬの吸着性を向上させるため、脂溶性の高い溶媒を予め含ませたＳＳＬ吸収性素材を用いてもよい。一方、ＳＳＬ吸収性素材が水溶性の高い溶媒や水分を含んでいると、ＳＳＬの吸着が阻害されるため好ましくない。ＳＳＬ吸収性素材は、乾燥した状態で用いることが好ましい。
被験体から採取されたＲＮＡ含有ＳＳＬは、後述するＲＮＡ調製に用いるまで保存されてもよい。該ＳＳＬは、ＳＳＬ吸収性素材又はＳＳＬ接着性素材に吸収又は接着させた状態のまま保存することができる。該ＳＳＬは、従来一般的なＲＮＡの保存条件（例えば−８０℃）で保存されてもよいが、よりもマイルドな条件で保存することが可能である（国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ２０１９／０４３０４０）。例えば、該ＲＮＡ含有ＳＳＬの保存の温度条件は、０℃以下であればよく、好ましくは−１０℃以下、より好ましくは−２０℃以下であればよい。該保存の期間は、特に限定されないが、好ましくは１２ヶ月以下、より好ましくは６ヶ月以下、さらに好ましくは３ヶ月以下である。
ＳＳＬからのＲＮＡの抽出には、上述した通常のＲＮＡ抽出手段、例えばフェノール/クロロホルム法、ＡＧＰＣ法、及び市販のＲＮＡ精製用の試薬、カラムもしくは磁性粒子を用いることができる。
本発明の方法では、該サンプルＲＮＡから逆転写（ＲＴ）によってｃＤＮＡを合成し、次いで、該ｃＤＮＡをマルチプレックスＰＣＲ（ＭＰＣＲ）により増幅する。これらのＲＴ反応及びＭＰＣＲは、いずれも一本鎖核酸結合タンパク質の存在下で行われる。
該サンプルＲＮＡの逆転写は、反応系に一本鎖核酸結合タンパク質を添加する以外は、通常の手順で行うことができる。例えば、該サンプルＲＮＡ、プライマー、逆転写酵素、及び基質を含有する反応液をインキュベートして、該サンプルＲＮＡに逆転写酵素を作用させてｃＤＮＡを合成すればよい。該プライマーとしては、解析したい特定のＲＮＡを標的としたプライマーを用いてもよいが、より包括的な核酸の保存及び解析のためにはオリゴｄＴプライマー、ランダムプライマー、又はそれらの混合物を用いることが好ましい。該逆転写酵素としては、一般的な逆転写酵素を使用することができるが、逆転写の正確性及び効率性の高い逆転写酵素（例えばＭ−ＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ及びその改変体、あるいは後述する市販の逆転写反応用酵素）を使用することが好ましい。該基質は、該逆転写酵素の基質であり、好ましくはデオキシリボヌクレオチド、例えばｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、ならびにそれらの混合物を使用することができる。該デオキシリボヌクレオチドは修飾されていてもよい。本発明において、ＲＴのための酵素及びその他の試薬としては、市販の逆転写反応用酵素及び逆転写試薬キット、例えばＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅシリーズ（タカラバイオ社）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅシリーズ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）等が挙げられ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）III Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（いずれもライフテクノロジーズジャパン株式会社）を好ましく用いることができる。ＲＴ反応の温度及び時間は、用いる酵素又は試薬の種類、サンプルＲＮＡ、合成すべきｃＤＮＡなどに応じて適宜設定することができる。例えば、市販の逆転写反応用試薬を用いて、そのマニュアルに従って反応液を調製し、該反応液に一本鎖核酸結合タンパク質を添加すればよい。ＲＴの条件も該試薬のマニュアルに従って設定すればよい。
該ＲＴで合成されたｃＤＮＡをＭＰＣＲにより増幅する。ＭＰＣＲは、反応系に一本鎖核酸結合タンパク質を添加する以外は、通常の手順で行うことができる。例えば、ｃＤＮＡ、複数のプライマーペア、ＤＮＡ合成酵素、及び基質を含有する反応液をＰＣＲにかければよい。該プライマーペアは、標的ＤＮＡ配列に応じて適宜設計され得る。該ＤＮＡ合成酵素としては、一般的なＤＮＡ合成酵素を使用することができるが、増幅の正確性及び効率性の高いＤＮＡ合成酵素（例えば後述する市販のマルチプレックスＰＣＲ用酵素）を使用することが好ましい。該基質は、該ＤＮＡ合成酵素の基質であり、好ましくはデオキシリボヌクレオチド、例えばｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、ならびにそれらの混合物を使用することができる。該デオキシリボヌクレオチドは修飾されていてもよい。本発明において、ＭＰＣＲのための酵素及びその他の試薬としては、市販のマルチプレックスＰＣＲ用酵素及び試薬、例えば、Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いることができる。反応の温度及び時間は、用いる酵素又は試薬の種類、鋳型ｃＤＮＡなどに応じて適宜設定することができる。例えば、市販のマルチプレックスＰＣＲ用試薬を用いて、そのマニュアルに従って反応液を調製し、該反応液に一本鎖核酸結合タンパク質を添加すればよい。ＰＣＲの条件も該試薬のマニュアルに従って設定すればよい。
本発明の方法において、上記ＲＴ反応及びＭＰＣＲは、いずれも一本鎖核酸結合タンパク質の存在下で行われる。該一本鎖核酸結合タンパク質としては、Ｔ４ＧＰ３２（Ｔ４ ｇｅｎｅ ３２ ｐｒｏｔｅｉｎ）、及びその改変体が挙げられる。Ｔ４ＧＰ３２は、代表的には配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、一本鎖ＤＮＡに対して結合する。Ｔ４ＧＰ３２の改変体としては、Ｔ４ＧＰ３２のアミノ酸配列上の任意のアミノ酸に対して修飾又は変異を加えて得られるタンパク質が挙げられる。Ｔ４ＧＰ３２の改変体の例としては、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％配列同一なアミノ酸配列からなり、かつ一本鎖核酸、好ましくは一本鎖ＤＮＡに結合するタンパク質が挙げられる。Ｔ４ＧＰ３２は購入することができる（例えばＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈなどより）。該ＲＴとＭＰＣＲの反応液中における該一本鎖核酸結合タンパク質の初期濃度は、好ましくは１μｇ／ｍＬ以上、より好ましくは５μｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは７μｇ／ｍＬ以上であればよく、他方、好ましくは１００μｇ／ｍＬ以下、より好ましくは２０μｇ／ｍＬ以下、さらに好ましくは１５μｇ／ｍＬ以下であればよく、あるいは、好ましくは１〜１００μｇ／ｍＬであればよく、より好ましくは５〜２０μｇ／ｍＬであればよく、さらに好ましくは７〜１５μｇ／ｍＬであればよい。
本発明の方法において、該ＲＴとＭＰＣＲは、別々の反応系（２ステップ）で行われることが好ましいが、簡便さの点では１反応系（１ステップ）で行われてもよい。１ステップ反応の場合、ＲＴに用いた一本鎖核酸結合タンパク質をそのままＭＰＣＲに用いることができる。
該ＭＰＣＲで得られた産物の精製は、反応産物のサイズ分離によって行われることが好ましい。サイズ分離により、目的のＰＣＲ産物を、ＭＰＣＲ反応液中に含まれるプライマーやその他の不純物から分離することができる。ＤＮＡのサイズ分離は、例えば、サイズ分離カラムや、サイズ分離チップ、サイズ分離に利用可能な磁気ビーズなどによって行うことができる。サイズ分離に利用可能な磁気ビーズの好ましい例としては、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰ等のＳｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ（ＳＰＲＩ）磁性ビーズが挙げられる。Ａｍｐｕｒｅ ＸＰとＤＮＡ溶液を混合すると、ＤＮＡは磁性ビーズの表面にコーティングされたカルボキシル基に吸着され、マグネットを用いて磁性ビーズのみを回収することでＤＮＡが精製される。またＡｍｐｕｒｅ ＸＰ溶液とＤＮＡ溶液の混合比を変化させると磁性ビーズに吸着するＤＮＡの分子サイズが変化する。この原理を利用することで、捕捉したい特定の分子サイズのＤＮＡを磁性ビーズ上に回収し、それ以外の分子サイズのＤＮＡや不純物を精製することが可能である。
精製したＰＣＲ産物に対して、その後の解析を行うために必要なさらなる処理を施してもよい。例えば、ＤＮＡのシーケンシングやフラグメント解析のために、精製したＰＣＲ産物を、適切なバッファー溶液へと調製したり、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡに含まれるＰＣＲプライマー領域を切断したり、増幅されたＤＮＡにアダプター配列をさらに付加したりしてもよい。例えば、精製したＰＣＲ産物をバッファー溶液へと調製し、増幅ＤＮＡに対してＰＣＲプライマー配列の除去及びアダプターライゲーションを行い、得られた反応産物を、必要に応じて増幅して、各種解析のためのライブラリーを調製することができる。これらの操作は、例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）に付属している５×ＶＩＬＯ ＲＴ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘ、及びＩｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）に付属している５×Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ ＨｉＦｉ Ｍｉｘ、及びＩｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｏｒｅ Ｐａｎｅｌを用いて、各キット付属のプロトコルに従って行うことができる。
本発明による核酸増幅方法は、ＲＮＡを用いる各種の解析又は診断に応用することができる。好ましくは、本発明の方法は、マルチプレックスＰＣＲを応用することができるあらゆる解析、例えば、遺伝子発現解析、トランスクリプトーム解析、被験体の機能解析、疾患の診断、被験体に投与した薬物の効能評価などの、遺伝子の網羅的解析又は特定の遺伝子を標的とした発現解析に用いることができる。
本発明の例示的実施形態として、以下の物質、製造方法、用途、方法等をさらに本明細書に開示する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
〔１〕核酸増幅方法であって、
サンプルＲＮＡから逆転写によりｃＤＮＡを合成すること；及び、
該ｃＤＮＡをマルチプレックスＰＣＲにより増幅すること、
を含み、該逆転写及び該マルチプレックスＰＣＲが、一本鎖核酸結合タンパク質の存在下で行われ、該一本鎖核酸結合タンパク質が、Ｔ４ＧＰ３２又はその改変体である、
方法。
〔２〕好ましくは、前記Ｔ４ＧＰ３２又はその改変体が、配列番号１のアミノ酸配列又は当該配列と少なくとも９０％配列同一なアミノ酸配列からなり、かつ一本鎖核酸に結合するタンパク質である、〔１〕記載の方法。
〔３〕前記逆転写が、
好ましくは、オリゴｄＴプライマー、ランダムプライマー、又はそれらの混合物を含む反応液中で行われ、
より好ましくは、ランダムプライマーを含む反応液中で行われる、
〔１〕又は〔２〕記載の方法。
〔４〕好ましくは、前記サンプルＲＮＡが皮膚表上脂質由来ＲＮＡである、〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載の方法。
〔５〕前記逆転写と前記マルチプレックスＰＣＲの反応液中における前記一本鎖核酸結合タンパク質の初期濃度が、好ましくは１μｇ／ｍＬ以上、より好ましくは５μｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは７μｇ／ｍＬ以上であり、他方、好ましくは１００μｇ／ｍＬ以下、より好ましくは２０μｇ／ｍＬ以下、さらに好ましくは１５μｇ／ｍＬ以下であるか、あるいは、好ましくは１〜１００μｇ／ｍＬ、より好ましくは５〜２０μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは７〜１５μｇ／ｍＬである、〔１〕〜〔４〕のいずれか１項記載の方法。
サンプルＲＮＡから逆転写によりｃＤＮＡを合成すること；及び、
該ｃＤＮＡをマルチプレックスＰＣＲにより増幅すること、
を含み、該逆転写及び該マルチプレックスＰＣＲが、一本鎖核酸結合タンパク質の存在下で行われ、該一本鎖核酸結合タンパク質が、Ｔ４ＧＰ３２又はその改変体である、
方法。
〔２〕好ましくは、前記Ｔ４ＧＰ３２又はその改変体が、配列番号１のアミノ酸配列又は当該配列と少なくとも９０％配列同一なアミノ酸配列からなり、かつ一本鎖核酸に結合するタンパク質である、〔１〕記載の方法。
〔３〕前記逆転写が、
好ましくは、オリゴｄＴプライマー、ランダムプライマー、又はそれらの混合物を含む反応液中で行われ、
より好ましくは、ランダムプライマーを含む反応液中で行われる、
〔１〕又は〔２〕記載の方法。
〔４〕好ましくは、前記サンプルＲＮＡが皮膚表上脂質由来ＲＮＡである、〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載の方法。
〔５〕前記逆転写と前記マルチプレックスＰＣＲの反応液中における前記一本鎖核酸結合タンパク質の初期濃度が、好ましくは１μｇ／ｍＬ以上、より好ましくは５μｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは７μｇ／ｍＬ以上であり、他方、好ましくは１００μｇ／ｍＬ以下、より好ましくは２０μｇ／ｍＬ以下、さらに好ましくは１５μｇ／ｍＬ以下であるか、あるいは、好ましくは１〜１００μｇ／ｍＬ、より好ましくは５〜２０μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは７〜１５μｇ／ｍＬである、〔１〕〜〔４〕のいずれか１項記載の方法。
〔６〕一本鎖核酸結合タンパク質を有効成分とする、マルチプレックスＲＴ−ＰＣＲの収量改善剤であって、該一本鎖核酸結合タンパク質がＴ４ＧＰ３２又はその改変体であり、かつ逆転写及びマルチプレックスＰＣＲの両方の反応液に添加される、改善剤。
〔７〕好ましくは、前記Ｔ４ＧＰ３２又はその改変体が、配列番号１のアミノ酸配列又は当該配列と少なくとも９０％配列同一なアミノ酸配列からなり、かつ一本鎖核酸に結合するタンパク質である、〔６〕記載の改善剤。
〔８〕前記逆転写が
好ましくは、オリゴｄＴプライマー、ランダムプライマー、又はそれらの混合物を含む反応液中で行われ、
より好ましくは、ランダムプライマーを含む反応液中で行われる、
〔６〕又は〔７〕記載の改善剤。
〔９〕好ましくは、皮膚表上脂質由来ＲＮＡを用いたマルチプレックスＲＴ−ＰＣＲの収量を改善する、〔６〕〜〔８〕のいずれか１項記載の改善剤。
〔１０〕前記逆転写及びマルチプレックスＰＣＲの反応液中における前記一本鎖核酸結合タンパク質の初期濃度が、好ましくは１μｇ／ｍＬ以上、より好ましくは５μｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは７μｇ／ｍＬ以上であり、他方、好ましくは１００μｇ／ｍＬ以下、より好ましくは２０μｇ／ｍＬ以下、さらに好ましくは１５μｇ／ｍＬ以下であるか、あるいは、好ましくは１〜１００μｇ／ｍＬ、より好ましくは５〜２０μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは７〜１５μｇ／ｍＬである、〔６〕〜〔９〕のいずれか１項記載の改善剤。
〔１１〕好ましくは、マルチプレックスＲＴ−ＰＣＲの感度及び収量を改善する、〔６〕〜〔１０〕のいずれか１項記載の改善剤。
〔７〕好ましくは、前記Ｔ４ＧＰ３２又はその改変体が、配列番号１のアミノ酸配列又は当該配列と少なくとも９０％配列同一なアミノ酸配列からなり、かつ一本鎖核酸に結合するタンパク質である、〔６〕記載の改善剤。
〔８〕前記逆転写が
好ましくは、オリゴｄＴプライマー、ランダムプライマー、又はそれらの混合物を含む反応液中で行われ、
より好ましくは、ランダムプライマーを含む反応液中で行われる、
〔６〕又は〔７〕記載の改善剤。
〔９〕好ましくは、皮膚表上脂質由来ＲＮＡを用いたマルチプレックスＲＴ−ＰＣＲの収量を改善する、〔６〕〜〔８〕のいずれか１項記載の改善剤。
〔１０〕前記逆転写及びマルチプレックスＰＣＲの反応液中における前記一本鎖核酸結合タンパク質の初期濃度が、好ましくは１μｇ／ｍＬ以上、より好ましくは５μｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは７μｇ／ｍＬ以上であり、他方、好ましくは１００μｇ／ｍＬ以下、より好ましくは２０μｇ／ｍＬ以下、さらに好ましくは１５μｇ／ｍＬ以下であるか、あるいは、好ましくは１〜１００μｇ／ｍＬ、より好ましくは５〜２０μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは７〜１５μｇ／ｍＬである、〔６〕〜〔９〕のいずれか１項記載の改善剤。
〔１１〕好ましくは、マルチプレックスＲＴ−ＰＣＲの感度及び収量を改善する、〔６〕〜〔１０〕のいずれか１項記載の改善剤。
〔１２〕マルチプレックスＲＴ−ＰＣＲの収量改善のための一本鎖核酸結合タンパク質の使用であって、該一本鎖核酸結合タンパク質がＴ４ＧＰ３２又はその改変体であり、かつ逆転写及びマルチプレックスＰＣＲの両方の反応液に添加される、使用。
〔１３〕好ましくは、前記Ｔ４ＧＰ３２又はその改変体が、配列番号１のアミノ酸配列又は当該配列と少なくとも９０％配列同一なアミノ酸配列からなり、かつ一本鎖核酸に結合するタンパク質である、〔１２〕記載の使用。
〔１４〕前記逆転写が
好ましくは、オリゴｄＴプライマー、ランダムプライマー、又はそれらの混合物を含む反応液中で行われ、
より好ましくは、ランダムプライマーを含む反応液中で行われる、
〔１２〕又は〔１３〕記載の使用。
〔１５〕好ましくは、前記一本鎖核酸結合タンパク質が皮膚表上脂質由来ＲＮＡを用いたマルチプレックスＲＴ−ＰＣＲの収量改善のために使用される、〔１２〕〜〔１４〕のいずれか１項記載の使用。
〔１６〕前記逆転写及びマルチプレックスＰＣＲの反応液中における前記一本鎖核酸結合タンパク質の初期濃度が、好ましくは１μｇ／ｍＬ以上、より好ましくは５μｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは７μｇ／ｍＬ以上であり、他方、好ましくは１００μｇ／ｍＬ以下、より好ましくは２０μｇ／ｍＬ以下、さらに好ましくは１５μｇ／ｍＬ以下であるか、あるいは、好ましくは１〜１００μｇ／ｍＬ、より好ましくは５〜２０μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは７〜１５μｇ／ｍＬである、〔１２〕〜〔１５〕のいずれか１項記載の使用。
〔１７〕好ましくは、前記一本鎖核酸結合タンパク質がマルチプレックスＲＴ−ＰＣＲの感度及び収量改善のために使用される、〔１２〕〜〔１６〕のいずれか１項記載の使用。
〔１３〕好ましくは、前記Ｔ４ＧＰ３２又はその改変体が、配列番号１のアミノ酸配列又は当該配列と少なくとも９０％配列同一なアミノ酸配列からなり、かつ一本鎖核酸に結合するタンパク質である、〔１２〕記載の使用。
〔１４〕前記逆転写が
好ましくは、オリゴｄＴプライマー、ランダムプライマー、又はそれらの混合物を含む反応液中で行われ、
より好ましくは、ランダムプライマーを含む反応液中で行われる、
〔１２〕又は〔１３〕記載の使用。
〔１５〕好ましくは、前記一本鎖核酸結合タンパク質が皮膚表上脂質由来ＲＮＡを用いたマルチプレックスＲＴ−ＰＣＲの収量改善のために使用される、〔１２〕〜〔１４〕のいずれか１項記載の使用。
〔１６〕前記逆転写及びマルチプレックスＰＣＲの反応液中における前記一本鎖核酸結合タンパク質の初期濃度が、好ましくは１μｇ／ｍＬ以上、より好ましくは５μｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは７μｇ／ｍＬ以上であり、他方、好ましくは１００μｇ／ｍＬ以下、より好ましくは２０μｇ／ｍＬ以下、さらに好ましくは１５μｇ／ｍＬ以下であるか、あるいは、好ましくは１〜１００μｇ／ｍＬ、より好ましくは５〜２０μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは７〜１５μｇ／ｍＬである、〔１２〕〜〔１５〕のいずれか１項記載の使用。
〔１７〕好ましくは、前記一本鎖核酸結合タンパク質がマルチプレックスＲＴ−ＰＣＲの感度及び収量改善のために使用される、〔１２〕〜〔１６〕のいずれか１項記載の使用。
以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例１ マルチプレックスＰＣＲに対するＴ４ＧＰ３２の効果
１）ＳＳＬからのＲＮＡ抽出
健常な成人女性又は男性それぞれ１名を被験者とした。あぶら取りフィルム（５×８ｃｍ、ポリプロピレン製、３Ｍジャパン）を用いて、被験者の顔全体から皮脂を回収した。皮脂を含む該あぶら取りフィルムは、まとめてガラスバイアルに移し、ＲＮＡ精製まで−８０℃で保存した。該あぶら取りフィルムに含まれるＳＳＬ中ＲＮＡを精製した。該あぶら取りフィルムを適当な大きさに切断し、ＱＩＡｚｏｌ（登録商標）Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて該フィルムからＲＮＡを含む水相を回収した。回収した水相から、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）（ＱＩＡＧＥＮ）に付属のプロトコルに準じてＲＮＡを抽出した。
１）ＳＳＬからのＲＮＡ抽出
健常な成人女性又は男性それぞれ１名を被験者とした。あぶら取りフィルム（５×８ｃｍ、ポリプロピレン製、３Ｍジャパン）を用いて、被験者の顔全体から皮脂を回収した。皮脂を含む該あぶら取りフィルムは、まとめてガラスバイアルに移し、ＲＮＡ精製まで−８０℃で保存した。該あぶら取りフィルムに含まれるＳＳＬ中ＲＮＡを精製した。該あぶら取りフィルムを適当な大きさに切断し、ＱＩＡｚｏｌ（登録商標）Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて該フィルムからＲＮＡを含む水相を回収した。回収した水相から、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）（ＱＩＡＧＥＮ）に付属のプロトコルに準じてＲＮＡを抽出した。
２）逆転写及びマルチプレックスＰＣＲ
抽出されたＲＮＡから、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて４２℃、３０分間逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成した。逆転写反応のプライマーには、キットに付属しているランダムプライマーを使用した。得られたｃＤＮＡからマルチプレックスＰＣＲにより、２０８０２遺伝子に由来するＤＮＡを含むライブラリーを調製した。マルチプレックスＰＣＲは、Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて、ＰＣＲ改善剤と共に［９９℃、２分→（９９℃、１５秒→６０℃、１６分）×２０サイクル→４℃、Ｈｏｌｄ］の条件で行った。ＰＣＲ改善剤としては、既報（非特許文献１、２）に従い、ＢＳＡ（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ ｐｏｗｄｅｒ，ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ＩｇＧ−ｆｒｅｅ，ｌｏｗ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ，ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔ，ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｗｏｒ ｓｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ）（Ｓｉｇｍａ ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号：Ａ２０５８）、ベタイン塩酸塩（富士フィルム和光純薬株式会社）、及びＴ４ＧＰ３２（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．）を表１記載の濃度で用いた。調製したライブラリーのＰＣＲ産物濃度をＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ（アジレント・テクノロジー株式会社）とＨｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｄ１０００ ＳｃｒｅｅｎＴａｐｅ（アジレント・テクノロジー株式会社）を用いて測定した。対照（ＰＣＲ改善剤未添加）に対するＰＣＲ産物の相対収量を求めた。
抽出されたＲＮＡから、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて４２℃、３０分間逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成した。逆転写反応のプライマーには、キットに付属しているランダムプライマーを使用した。得られたｃＤＮＡからマルチプレックスＰＣＲにより、２０８０２遺伝子に由来するＤＮＡを含むライブラリーを調製した。マルチプレックスＰＣＲは、Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて、ＰＣＲ改善剤と共に［９９℃、２分→（９９℃、１５秒→６０℃、１６分）×２０サイクル→４℃、Ｈｏｌｄ］の条件で行った。ＰＣＲ改善剤としては、既報（非特許文献１、２）に従い、ＢＳＡ（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ ｐｏｗｄｅｒ，ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ＩｇＧ−ｆｒｅｅ，ｌｏｗ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ，ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔ，ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｗｏｒ ｓｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ）（Ｓｉｇｍａ ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号：Ａ２０５８）、ベタイン塩酸塩（富士フィルム和光純薬株式会社）、及びＴ４ＧＰ３２（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．）を表１記載の濃度で用いた。調製したライブラリーのＰＣＲ産物濃度をＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ（アジレント・テクノロジー株式会社）とＨｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｄ１０００ ＳｃｒｅｅｎＴａｐｅ（アジレント・テクノロジー株式会社）を用いて測定した。対照（ＰＣＲ改善剤未添加）に対するＰＣＲ産物の相対収量を求めた。
３）結果
ＰＣＲ改善剤存在下でのＰＣＲ産物の相対収量を表１に示す。なお、表１中、ＢＳＡとベタインの結果は女性被験者由来のＳＳＬ中ＲＮＡ、Ｔ４ＧＰ３２の結果は男性被験者由来のＳＳＬ中ＲＮＡを用いた場合の結果である。Ｔ４ＧＰ３２を添加した場合、対照に対するＰＣＲ産物の相対収量は１．４１に増加した。一方、ＢＳＡ又はベタインを添加した場合、対照ではＰＣＲ産物が検出されたのに対して、ＰＣＲ産物は検出限界以下に減少した。既報（非特許文献３、４）では、ＲＴ後のＰＣＲ系にＴ４ＧＰ３２を添加しても明らかな収量の増加はみられないことが報告されているが、本発明のような複数領域を対象とするマルチプレックスＰＣＲの場合には、Ｔ４ＧＰ３２の添加が反応の感度及び収量に顕著な効果を奏すると推測された。
ＰＣＲ改善剤存在下でのＰＣＲ産物の相対収量を表１に示す。なお、表１中、ＢＳＡとベタインの結果は女性被験者由来のＳＳＬ中ＲＮＡ、Ｔ４ＧＰ３２の結果は男性被験者由来のＳＳＬ中ＲＮＡを用いた場合の結果である。Ｔ４ＧＰ３２を添加した場合、対照に対するＰＣＲ産物の相対収量は１．４１に増加した。一方、ＢＳＡ又はベタインを添加した場合、対照ではＰＣＲ産物が検出されたのに対して、ＰＣＲ産物は検出限界以下に減少した。既報（非特許文献３、４）では、ＲＴ後のＰＣＲ系にＴ４ＧＰ３２を添加しても明らかな収量の増加はみられないことが報告されているが、本発明のような複数領域を対象とするマルチプレックスＰＣＲの場合には、Ｔ４ＧＰ３２の添加が反応の感度及び収量に顕著な効果を奏すると推測された。
実施例２ 逆転写及びマルチプレックスＰＣＲに対するＴ４ＧＰ３２の効果
１）逆転写及びマルチプレックスＰＣＲ
健常な成人男性１名を被験者とした。あぶら取りフィルム（５×８ｃｍ、ポリプロピレン製、３Ｍジャパン）を用いて、被験者の顔全体から皮脂を回収した。該あぶら取りフィルムから実施例１と同様の手順でＲＮＡを抽出した。逆転写は、Ｔ４ＧＰ３２を添加（０．００１０ｗ／ｖ％）又は未添加の条件下で実施例１と同様に実施した。マルチプレックスＰＣＲについても、Ｔ４ＧＰ３２（０．００１０ｗ／ｖ％）を添加又は未添加の条件下で実施例１と同様に実施し、ＰＣＲ産物濃度を測定した。対照（逆転写及びＰＣＲでＴ４ＧＰ３２未添加）に対するＰＣＲ産物の相対収量を求めた。
１）逆転写及びマルチプレックスＰＣＲ
健常な成人男性１名を被験者とした。あぶら取りフィルム（５×８ｃｍ、ポリプロピレン製、３Ｍジャパン）を用いて、被験者の顔全体から皮脂を回収した。該あぶら取りフィルムから実施例１と同様の手順でＲＮＡを抽出した。逆転写は、Ｔ４ＧＰ３２を添加（０．００１０ｗ／ｖ％）又は未添加の条件下で実施例１と同様に実施した。マルチプレックスＰＣＲについても、Ｔ４ＧＰ３２（０．００１０ｗ／ｖ％）を添加又は未添加の条件下で実施例１と同様に実施し、ＰＣＲ産物濃度を測定した。対照（逆転写及びＰＣＲでＴ４ＧＰ３２未添加）に対するＰＣＲ産物の相対収量を求めた。
２）結果
結果を表２に示す。逆転写のみにＴ４ＧＰ３２を添加した場合、及びマルチプレックスＰＣＲのみにＴ４ＧＰ３２を添加した場合には、対照に対する相対収量は、それぞれ１．０６と１．４１であった。これに対し、逆転写とマルチプレックスＰＣＲ双方の行程にＴ４ＧＰ３２を添加した場合、相対収量は２．１９へと顕著に増加した。
結果を表２に示す。逆転写のみにＴ４ＧＰ３２を添加した場合、及びマルチプレックスＰＣＲのみにＴ４ＧＰ３２を添加した場合には、対照に対する相対収量は、それぞれ１．０６と１．４１であった。これに対し、逆転写とマルチプレックスＰＣＲ双方の行程にＴ４ＧＰ３２を添加した場合、相対収量は２．１９へと顕著に増加した。
Claims (8)
- 核酸増幅方法であって、
サンプルＲＮＡから逆転写によりｃＤＮＡを合成すること；及び、
該ｃＤＮＡをマルチプレックスＰＣＲにより増幅すること、
を含み、該逆転写及び該マルチプレックスＰＣＲが、一本鎖核酸結合タンパク質の存在下で行われ、該一本鎖核酸結合タンパク質が、Ｔ４ＧＰ３２又はその改変体である、
方法。 - 前記Ｔ４ＧＰ３２又はその改変体が、配列番号１のアミノ酸配列又は当該配列と少なくとも９０％配列同一なアミノ酸配列からなり、かつ一本鎖核酸に結合するタンパク質である、請求項１記載の方法。
- 前記逆転写反応が、ランダムプライマーを含む反応液中で行われる、請求項１又は２記載の方法。
- 前記サンプルＲＮＡが、皮膚表上脂質由来ＲＮＡである、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
- 前記逆転写と前記マルチプレックスＰＣＲの反応液中における前記一本鎖核酸結合タンパク質の初期濃度が１〜１００μｇ／ｍＬである、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
- 一本鎖核酸結合タンパク質を有効成分とする、マルチプレックスＲＴ−ＰＣＲの収量改善剤であって、該一本鎖核酸結合タンパク質がＴ４ＧＰ３２又はその改変体であり、かつ逆転写及びマルチプレックスＰＣＲの両方の反応液に添加される、改善剤。
- 前記Ｔ４ＧＰ３２又はその改変体が、配列番号１のアミノ酸配列又は当該配列と少なくとも９０％配列同一なアミノ酸配列からなり、かつ一本鎖核酸に結合するタンパク質である、請求項６記載の改善剤。
- マルチプレックスＲＴ−ＰＣＲの感度及び収量を改善する、請求項６又は７記載の改善剤。
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|---|---|---|---|
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| JP2020002506 | 2020-01-10 |
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|---|---|
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-
2021
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