JP2009511011A

JP2009511011A - Ｄｎａ採取用ステッカー及びこれからｄｎａを分離する方法

Info

Publication number: JP2009511011A
Application number: JP2008534427A
Authority: JP
Inventors: ジャ−ソンリュ; ヨン−ギルユ
Original assignee: ジャンヨン−ズー
Priority date: 2005-10-05
Filing date: 2005-10-05
Publication date: 2009-03-19
Also published as: CN101065500A; US20090269743A1; WO2007040287A1; US7932038B2

Abstract

【課題】ＤＮＡの収率を向上することができる改善されたＤＮＡ採取用ステッカーを提供する。また、前記ＤＮＡ採取用ステッカーを用いてヒトの皮膚から剥がれて付着された角質のみを簡単に分離して、ヒト遺伝子を容易に採取し、これから効率的にＤＮＡを分離する方法を提供する。
【解決手段】本発明は、ＤＮＡ採取用ステッカー及びこれから効率的にＤＮＡを採取する方法に関し、ＥＤＴＡ、Ｔｒｉｓ、ＳＤＳ及びピオニン成分が含まれた塗布液を含有した本発明によるステッカーを角質が剥がれる皮膚に貼った後、はがして、ステッカーから角質成分のみを分離することによってヒト遺伝子を簡便に採取し、それを本発明による方法でＤＮＡを分離し、ＰＣＲなどを利用して増幅させる。このように増幅させた遺伝子を親子鑑定、犯罪捜査などに利用される遺伝指紋（ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ）または遺伝的疾病の検出に活用できる方法を提供する。
【選択図】図１

Description

本発明は、ＤＮＡ採取用ステッカー及びこれから効率的にＤＮＡを採取する方法に関し、詳細には、血液や毛髪を用いることなくヒトの皮膚から剥がれて付着された角質のみを簡単に分離して、ヒト遺伝子を簡便に採取し、それをＰＣＲ技術を用いて増幅させることによって、親子鑑定、犯罪捜査などに利用できるＤＮＡ採取用ステッカー及びこれから効率的にＤＮＡを分離する方法に関する。

一般に、ＤＮＡ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ）は、人体内の遺伝情報を有している分子であって、ヒトの２３対の染色体内に保存されており、遺伝情報においては、タンパク質をコードしているエクソン（ｅｘｏｎ）と、タンパク質の非コード領域であるイントロン（ｉｎｔｒｏｎ）から構成されている。特に、前記イントロンのうち、Ａｌｕ配列は、その遺伝的系統の影響を受けて個人個人が特異な反復パターンを有しており、その部位を、例えば、ゲノム上に分散している類似、あるいは同一の短い配列（例えば、マイクロセテライト（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ）またはＶＮＴＲ（ＶａｒｉａｂｌｅＮｕｍｂｅｒｏｆＴａｎｄｅｍＡｒｒａｙ））などを検出する方法で調査して、遺伝指紋（ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ）として活用している。

ヒトのＤＮＡを採取する技術としては、血液や毛髪を用いる方法が知られている。しかしながら、この方法は一般的に拒否感を与えるばかりでなく、手続きが複雑であるという問題点があった。

一方、ヒトの角質が常に剥がれる特徴を利用して、ステッカーを用いてＤＮＡを採取する方法において、従来のステッカーは、その接着成分からヒトの角質、つまりヒトＤＮＡのみを分離することができないという問題点があった。一般の接着成分は重合体であり、ＤＮＡもまた重合体であるので、ＤＮＡを分離する条件下では接着成分がＤＮＡと共に凝固してしまい、分離することができないためである。

本発明の出願人は、前記の問題点に鑑みて、ＥＤＴＡ（ＥｔｈｙｌｅｎｅＤｉａｍｉｎｅＴｅｔｒａＡｃｅｔａｔｅ）、Ｔｒｉｓ及びＳＤＳ（ＳｏｄｉｕｍＤｏｄｅｃｙｌＳｕｌｐｈａｔｅ）からなる塗布液を塗布して製造したステッカーを用いて、ヒトの皮膚の角質からＤＮＡ成分のみを採取し、フェノール抽出法を用いてステッカーからＤＮＡを分離することに関する発明を韓国特許出願第２０００−７４８５３号として出願した（以下、従来発明という。）。しかし、従来の技術に比べて、前記ステッカー及びフェノール抽出法を用いることによってＤＮＡの収率は良好に改善されたが、十分満足できるものではなかった。

本発明は、前記のような従来の問題点を解決するためになされたものであって、その目的は、ＤＮＡの収率を向上するように改善したＤＮＡ採取用ステッカーを提供することである。

本発明の他の目的は、前記ＤＮＡ採取用ステッカーを用いてヒトの皮膚から剥がれて付着された角質のみを簡単に分離して、ヒト遺伝子を容易に採取し、これから効率的にＤＮＡを分離する方法を提供することである。

本発明は、ステッカー製作段階；ヒトの角質からＤＮＡを採取する段階；ＤＮＡ成分のみを採取する段階；ＰＣＲを用いたＤＮＡ増幅段階；及び各種遺伝子及び個人の遺伝的構成の確認段階で構成されている。

前述した目的を達成するために、ヒト成分から遺伝子を採取及び分析を行なう前に、ＥＤＴＡ（ＥｔｈｙｌｅｎｅＤｉａｍｉｎｅＴｅｔｒａＡｃｅｔａｔｅ）、Ｔｒｉｓ及びＳＤＳ（ＳｏｄｉｕｍＤｏｄｅｃｙｌＳｕｌｐｈａｔｅ）及びピオニン（ｐｅｙｏｎｉｎｅ）からなる塗布液が塗布されたステッカーをヒトの皮膚に貼った後、はがして、前記塗布液で３０〜４５℃で４０〜８０分間培養する。その後、プロテイナーゼＫ（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ）を添加して４０〜６８℃で３０〜１００分間反応させた。

本発明のＤＮＡ採取用ステッカーを用いたＤＮＡ分離方法は、次の段階を有することを特徴とする。

１）一般に知られているヒト用ステッカーの一面にＥＤＴＡ０．０５〜１ｍｏｌ（ｐＨ８．０）、Ｔｒｉｓ０．００２〜０．０１５（ｐＨ８．０）、ＳＤＳを３０〜４０重量％（約１〜１．４ｍｏｌ）、及び３％ピオニン（ｐｅｙｏｎｉｎｅ）からなる塗布液を塗布して、ＤＮＡ採取用ステッカーを製造する段階；
２）前記ステッカーをヒトの皮膚に貼った後、はがして角質を取る段階；
３）前記採取したヒトの角質からタンパク質沈殿溶液を利用してＤＮＡ成分のみを採取する段階；
４）ＰＣＲ法を用いて前記採取したＤＮＡを増幅させる段階；
５）ＰＣＲ産物を利用してＤＮＡ試料の各種遺伝子及び個人の遺伝的構成を確認する段階。

次に、段階ごとに分けて本発明を詳細に説明する。

第１段階；ＤＮＡ採取用ステッカーの製造段階
本発明に用いられるステッカーは、ヒトに無害な接着成分が含まれたヒト用ステッカとして一般に知られているステッカーを使用する。前記一般のヒト用ステッカーの接着成分がついている一面上にＥＤＴＡ（ＥｔｈｙｌｅｎｅＤｉａｍｉｎｅＴｅｔｒａＡｃｅｔａｔｅ）、Ｔｒｉｓ、ＳＤＳ（ＳｏｄｉｕｍＤｏｄｅｃｙｌＳｕｌｐｈａｔｅ）及びピオニン（ｐｅｙｏｎｉｎｅ）からなる液を塗布して、本発明のＤＮＡ採取用ステッカーを製造する。

塗布量は、前記ＤＮＡ採取用ステッカーがヒトに接着できないほど過剰でもなく、接着成分とヒトの角質成分とが互いに分離できないほど不足でもないようにする。すなわち、接着表面の７０％〜８５％の範囲を塗布液で塗布すればよく、好ましくは７５％である。塗布厚さは、接着成分と皮膚とが互いに接しないほどに厚く塗布してはならず、３ｍｍ以下の厚さが望ましい。

前記塗布液において、ＥＤＴＡは、細胞膜の全体構造を維持するのに必須であるマグネシウムイオンを除去して細胞膜を弱化させ、ＤＮＡを分解する細胞内の酵素を阻害することによって、ＤＮＡを確実に採取できるようにする役割を果たす。また、Ｔｒｉｓは非毒性であり、安価で、多く使用される緩衝システムであり、ＳＤＳは一種の洗剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）であり、脂質分子を除去して細胞の溶解（ｌｙｓｉｓ）過程を助け、これによって細胞膜の解体を誘発する作用をする。前記塗布液のそれぞれの組成物が自分の役割を果たすために、ステッカーに塗布される前記塗布液の組成は、ＥＤＴＡ０．０５〜０．１ｍｏｌ（ｐＨ８．０）、Ｔｒｉｓ５〜１５ｍｍｏｌ（ｐＨ８．０）、ＳＤＳ３０〜４０重量％になるようにＳＤＳと３％のピオニン（ｐｅｙｏｎｉｎｅ）を添加し、蒸留水を加えて全体量を７，０００〜８，０００ｍｌにし、好ましくは、ＥＤＴＡ０．１ｍｏｌ、Ｔｒｉｓ１０ｍｏｌ、ＳＤＳ３７．５重量％になるようにＳＤＳと３％のピオニン（ｐｅｙｏｎｉｎｅ）を添加し、蒸留水を加えて全体量を７，５００ｍｌにするのが好適である。

第２段階；ヒトの角質を取る段階
このように製造したステッカーは、皮膚のどの部位に貼ってもよいが、好ましくは、肘、脇、腕、踝、顔など角質の多い部分に適用することが好ましい。本発明のステッカーは、接着時間にあまり影響されないので、貼った後に、すぐにはがしても適量の試料を得ることができる。

第３段階；ＤＮＡ成分のみを採取する段階
前記ステッカーを利用してヒトの角質を取り、これからＤＮＡ成分のみを分離する方法について説明する。

ｉ）まず、ステッカーの接着部位を適切なサイズ（約４ｃｍ×６ｃｍ）に切断し、前記塗布液と同一の組成及び成分比のＤＮＡ抽出溶液に浸す。ここで、組成及び成分比を同一にする理由は、ステッカーの接着成分と採取されたヒトの角質との間の塗布液がＤＮＡ抽出溶液に溶解して、ステッカーの接着成分と採取されたヒトの角質との間を分離しやすくするためである。

前記塗布液に浸した状態で３０℃〜４５℃、好ましくは３７℃で４０分〜８０分、さらに好ましくは６０分間培養する。ここで、３０℃未満の温度で培養すると、前記塗布液、ＤＮＡ抽出溶液の活性（ａｃｔｉｖｉｔｙ）が低下し、その分前記ステッカーの接着成分とヒトの角質との間の塗布液がＤＮＡ抽出溶液に溶解する割合が低くなるので、結果的にヒトの角質からのＤＮＡ回収率が６０％以下に低下し、ＤＮＡの分析が難しくなる。また、４５℃を超過すると、重合体であるステッカーの接着成分までステッカーからＤＮＡ抽出溶液に溶出してしまい、塗布液、ＤＮＡ抽出溶液の活性（ａｃｔｉｖｉｔｙ）も低下し、結果的にヒトの角質のＤＮＡ回収量に比して接着成分の回収量が大きく増加し、後述するＰＣＲ増幅はもちろんのこと、ＤＮＡの分析も不可能になる。

一方、前記培養時間を４０分未満にすると、溶解時間が短いためにステッカーの接着成分と角質の分離が、最終的にＰＣＲ増幅及びＤＮＡ分析ができる程度まで行われない。８０分を超過すると、ＤＮＡ抽出過程において最終段階であるアルコール処理で接着成分が抽出されてしまい、ＰＣＲを行なうことができなくなる。よって、培養条件を満たすことが重要である。

ｉｉ）培養後、タンパク質分解酵素であるプロテイナーゼＫ（ｐｏｒｔｅｉｎａｓｅＫ）を添加してタンパク質を除去する。この時、４０℃〜６８℃で３０分〜１００分間プロテイナーゼＫを反応させる。好ましくは、５℃で９０分間である。ここで、反応時間が１００分を超過すると、皮膚から共に分離されたＤｎａｓｅの作用で採取しようとするＤＮＡ量が減少する。また、３０分未満にすると、十分にタンパク質除去を行なうことができない。一方、４０分未満、あるいは６８℃を超過する場合には、温度に敏感なタンパク質除去酵素である前記プロテイナーゼＫの活動が減少し、ヒトの角質などが塊状態になり、結果的にＤＮＡ回収率が低下する。特に６８℃を超過すると、分析しようとするＤＮＡが変性する。

ｉｉｉ）前記溶液に１／２重量のタンパク質沈殿溶液（ｐｒｏｔｅｉｎｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎｓｏｌｕｔｉｏｎ）を添加した後、遠心分離するとタンパク質が沈殿する。上層に位置する水層をピペットだけで分離し、次にこの分離液と同量のイソプロパノールを添加し、再び遠心分離する。このようにして得られた試料にナトリウムイオンのような塩存在下で、７０％エタノールを試料と同一重量で添加して−２０℃で遠心分離すると、ＤＮＡが沈殿を形成する（ＤＮＡ濃縮）。

第４段階；ＰＣＲ（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）を用いたＤＮＡ増幅段階
前記段階で得られたＤＮＡを７０％エタノールで洗浄して乾燥し、ＴＥ緩衝液に溶解させた後、ＰＣＲ（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）を用いて短時間で前記ＤＮＡを増幅させることができる。前記ステッカーで採取したＤＮＡも前記ＰＣＲ技術を用いて増幅させることができる。本発明により適用する際、ＰＣＲの２乃至３サイクルでも有効なＤＮＡ量を得ることができる。

第５段階；様々な遺伝子及び個人の遺伝的構成の確認段階
前記段階で得られたＤＮＡを試料として、様々な遺伝子及び個人の遺伝的構成の確認方法（ｇｅｎｅｔｉｃｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）を適用することができる。このような遺伝的構成の特性を応用して、親子鑑定や犯罪現場で容疑者を探すことにも活用できる。本発明により採取したＤＮＡは、遺伝指紋検索以外にも遺伝疾患の検出にも利用することができる。様々な遺伝子及び個人の遺伝的構成の確認方法としては、ＤＮＡ混成化（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）原理を利用したサザンブロッティング（ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ）やＤＮＡチップなどを挙げられる。

以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明する。但し、本発明は実施例に限定されるものではなく、該当技術分野における通常の知識を有する者であれば、本発明の思想範囲内で通常の様々の変更が可能である。

本発明によれば、ＤＮＡ採取用ステッカー及びこれから効率的にＤＮＡを採取する方法は、血液や毛髪を用いることなく、ヒトから剥がれて付着された角質のみを簡単に分離することによって遺伝子を容易に採取し、それをＰＣＲ技術により増幅させて親子鑑定や犯罪捜査などに活用することができる効果を有する。

すなわち、本発明による特殊なステッカーを皮膚に貼った後、はがして、これから効率的にＤＮＡを抽出することで、個人の遺伝子を簡単に検出することができる。

ステッカーの製造例及びヒトの角質取り
ＥＤＴＡ０．１ｍｏｌ（ｐＨ８．０）、Ｔｒｉｓ１０ｍｍｏｌ（ｐＨ８．０）、ＳＤＳ３７．５重量％となるように、ＳＤＳと３％のピオニン（ｐｅｙｏｎｉｎｅ）を添加し、蒸留水を加えて全体量を７，５００にし、塗布液をヒトに無害な接着成分が含有されたヒト用ステッカーの一面の７５％の面積に２ｍｍの厚さに塗布した。

前記塗布したステッカーを手のひらに貼り、１０分後にはずした。

ステッカーに付着されたヒトの角質からＤＮＡを分離する過程
前記実施例１のステッカーを４ｃｍ×６ｃｍの四角形に切断し、前記実施例１の塗布液と同一の組成及び成分比の塗布溶液に浸し、３７℃で６０分間培養した。培養後、タンパク質の分解酵素であるプロテイナーゼＫ（ｐｏｒｔｅｉｎａｓｅＫ）を添加し、６５℃で９０分間プロテイナーゼＫを反応させた。次に、前記溶液に１／２重量のタンパク質沈殿溶液（ｐｒｏｔｅｉｎｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎｓｏｌｕｔｉｏｎ）を添加した後、遠心分離するとタンパク質が沈殿する。上層に位置する水層をピペットだけで分離し、この分離液に同量のイソプロパノール（Ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ）を加え、再び遠心分離する。このようにして得られた試料にナトリウムイオンのような塩存在下で、７０％エタノールを試料と同一重量で添加して−２０℃で遠心分離すると、ＤＮＡが沈殿を形成する（ＤＮＡの濃縮）。

（実験例１）
種々の条件によるＤＮＡ採取量
前記実施例１及び２のステッカーの接着成分の組成及び培養温度、時間、プロテイナーゼＫ（ｐｏｒｔｅｉｎａｓｅＫ）の作用時間、温度を異にして実験した結果を表１に示す。

（実験例２）
従来発明のステッカーと本発明のステッカーを利用したヒトＤＮＡの収率比較
従来発明のステッカーと前記実施例で製造したステッカーを利用したヒトＤＮＡの収率を比較するため、ＡｐｏＥ遺伝子とＩＬ４遺伝子に対するＰＣＲを行なった。

ｉ）ＡｐｏＥ遺伝子増幅のためのプライマー配列は次のとおりである
Ｆｏｒｗａｒｄ：５´-tcggccgcagggcgctgatggac-３´
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５´-cccaggcgctcgcggatggcgc-３´。

ＲＣＲ条件は次のとおりである
９５℃、５ｍｉｎ；９５℃、２０ｓｅｃ、７０℃、１ｍｉｎ、４０サイクル、７２℃、１ｍｉｎ；７２℃、５ｍｉｎ。

ｉｉ）ＩＬ−４遺伝子増幅のためのプライマー配列は次のとおりである
Ｆｏｒｗａｒｄ：５´-gacccaaactaggcct-３´
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５´-cagtcctcctggggaaagat-３´。

ＲＣＲ条件は次のとおりである
９５℃、５ｍｉｎ；９５℃、３０ｓｅｃ、６２℃、３０ｓｅｃ、４０サイクル、７２℃、１ｍｉｎ；７２℃、５ｍｉｎ。

図２に示したように、８人を対象にして従来のステッカーと、成分が変化したステッカーを利用してＤＮＡを抽出した後、ＰＤＲでＡｐｏＥ、ＩＬ４遺伝子を増幅させた結果、２つの遺伝子共、成分が変化したステッカーにおいてより向上した結果が得られた。

（実験例３）
ステッカーからＤＮＡを分離する方法によるＤＮＡ収率の比較
前記実施例で製造したステッカーを利用してＤＮＡを分離する方法によるヒトＤＮＡの収率を比較するために、ＳＴ遺伝子とＤＲＤ２遺伝子に対するＰＣＲを行なった。

ｉ）ＳＴ遺伝子増幅のためのプライマー配列は次のとおりである
Ｆｏｒｗａｒｄ：５´-ggcgttgccgctctgaatgc-３´
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５´-gagggactgagctggacaaccac-３´。

ＲＣＲ条件は次のとおりである
９５℃、５ｍｉｎ；９５℃、２０ｓｅｃ、６０℃、４０ｓｅｃ、４０サイクル、７２℃、１ｍｉｎ；７２℃、５ｍｉｎ。

ｉｉ）ＤＲＤ２遺伝子増幅のためのプライマー配列は次のとおりである
Ｆｏｒｗａｒｄ：５´-gatgatacccacttcaggaag-３´
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５´-gatgtgtaggaattagccagg-３´。

図３に示したように、５人を対象にして従来のフェノール抽出法とタンパク質沈殿溶液を添加して抽出した本発明の方法によって分離されたＤＮＡの収率を比較するためにＳＴ及びＤＲＤ２遺伝子を増幅させた結果、２つの遺伝子共、改善された抽出方法においてより向上した結果が得られた。

本発明のＤＮＡ採取用ステッカー及びこれから効率的にＤＮＡを採取する方法は、血液や毛髪を用いることなく、ヒトの皮膚からはがれて付着された角質のみを簡単に分離することで、ヒトの遺伝子を簡便に採取し、それをＰＣＲ技術を用いて増幅させることによって、親子鑑定、犯罪捜査などに利用できる効果を有する。このように本発明は、遺伝工学産業上極めて有用な発明である。

ステッカーからＤＮＡを分離する過程を概略的に示した図である。本発明のステッカーと従来のステッカーから分離したＤＮＡのＰＣＲ産物の収得率を比較したゲル写真である。本発明のステッカーからタンパク質沈殿溶液を利用して分離したＤＮＡのＰＣＲ産物とフェノール抽出法を用いて分離したＤＮＡのＰＣＲ産物を比較したゲル写真である。

Claims

ＤＮＡ採取用ステッカーにおいて、
ＥＤＴＡ０．０５〜１ｍｏｌ（ｐＨ８．０）、Ｔｒｉｓ０．００２〜０．０１５ｍｏｌ（ｐＨ８．０）、ＳＤＳ３０〜４０重量％（約１〜１．４ｍｏｌ）、及び３％のピオニンからなる塗布液をステッカーの一面に塗布することを特徴とするＤＮＡ採取用ステッカー。
ＤＮＡ採取用ステッカーからＤＮＡを分離する方法において、
請求項１に記載されたＤＮＡ採取用ステッカーを利用してヒトの皮膚の角質を取り、
前記ステッカーからＤＮＡを分離するために、プロテイナーゼＫ処理を施して得た溶液の１／２重量のタンパク質沈殿溶液を添加する段階を有することを特徴とするＤＮＡ採取用ステッカーからＤＮＡを分離する方法。