WO2021182501A1 - 油脂の製造方法 - Google Patents

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達也 篠田
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天野エンザイム株式会社
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    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
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    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12Y301/01003—Triacylglycerol lipase (3.1.1.3)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing fats and oils. More specifically, the present invention relates to a method for producing fats and oils using lipase.
  • Fats and oils such as palm oil are converted into high-quality fats and oils by removing diacylglycerol or converting to triacylglycerol (see, for example, Patent Document 1). Further, the transesterification reaction of lipase is used to modify the fatty acid composition of triacylglycerol to produce fats and oils having high added value (see, for example, Patent Documents 2 and 3). In general, a two-step process is required to both remove diacylglycerol / convert it to triacylglycerol and modify the fatty acid composition of triacylglycerol.
  • Patent Document 1 described above discloses that lipases derived from the genus Pseudomonas or the genus Lysopas are used to reduce the amount of diacylglycerol in diacylglycerol-containing fats and oils and to change the fatty acid composition of triacylglycerol. Further, Patent Document 1 shows that the yield of triacylglycerol decreases when the water content of the fat or oil on which the enzyme acts is 110 ppm or more.
  • Patent Document 4 discloses a lipase derived from penicillium sp. The lipase is said to act on monoglyceride (monoacylglycerol) and diglyceride (diacylglycerol), but not on triglyceride (triacylglycerol) at all.
  • a method for producing a fat or oil which comprises a step of allowing lipase having a ratio of transesterification activity to hydrolysis activity of 0.007 or more to act on the fat or oil containing diacylglycerol.
  • a method for producing a fat or oil which comprises a step of allowing a lipase having a ratio of transesterification activity to hydrolysis activity of 0.001 or more to act on a fat or oil containing diacylglycerol having a water content of less than 110 ppm.
  • the present invention relates to a method for producing fats and oils using lipase.
  • the production method of the present invention is a step of allowing lipase having a ratio of transesterification activity to hydrolysis activity, that is, a "transesterification activity / hydrolysis activity" of 0.007 or more, acting on a diacylglycerol-containing fat or oil, preferably a water content of 110 ppm or more. It is characterized by a step of acting on a diacylglycerol-containing fat or oil, or a step of allowing a lipase having a ratio of 0.001 or more to act on a diacylglycerol-containing fat or oil having a water content of less than 110 ppm.
  • the action of lipase causes the diacylglycerol in the diacylglycerol-containing fat and oil to react with the free fatty acid or the free fatty acid ester to produce triacylglycerol.
  • fats and oils are reformed. In other words, modified fats and oils are obtained.
  • Lipase usually exhibits hydrolysis activity when the reaction system is water-based, and transesterification activity when the reaction system is oil-based. Further, the transesterification activity can be improved by subjecting the lipase to a treatment such as immobilization.
  • a treatment such as immobilization.
  • the substrate oil and fats, etc.
  • the hydrolysis activity also affects the reaction efficiency and the like.
  • the ratio of the hydrolysis activity and the transesterification activity is important for the efficiency of the ester synthesis reaction in the oil system, and the present invention has been completed.
  • the ratio of hydrolysis activity to transesterification activity can be calculated as follows.
  • the hydrolysis activity and transesterification activity can be measured by the methods described below.
  • transesterification activity lipase after immobilization treatment is used. That is, the transesterification activity of the immobilized lipase is measured by the method described later, and the measurement result (the transesterification activity value of the immobilized lipase) is used for calculating the ratio with the hydrolysis activity.
  • the above is the calculation method for immobilized lipase, but each activity can be calculated by the same method for lipase treated by a method other than immobilization. Further, in the case of untreated lipase, the measured values (hydrolysis activity value, transesterification activity value) may be directly used in the calculation of the ratio.
  • the ratio of the transesterification activity to the hydrolysis activity of lipase is not particularly limited as long as the diacylglycerol in the diacylglycerol-containing fat and oil can be reduced by the ester synthesis reaction.
  • An example of the above ratio is preferably 0.007 or more when lipase is allowed to act on a diacylglycerol-containing fat or oil having a water content of 110 ppm or more.
  • the ratio in this example is preferably 0.01 or more, more preferably 0.02 or more, even more preferably 0.03 or more, still more preferably 0.05 or more, even more preferably. Is 0.07 or higher.
  • the upper limit of the ratio is not particularly limited, and examples thereof include 0.5 or less, 0.3 or less, or 0.1 or less.
  • Another example of the above ratio is preferably 0.001 or more when lipase is allowed to act on a diacylglycerol-containing fat or oil having a water content of less than 110 ppm.
  • the ratio in the example is preferably 0.002 or more, more preferably 0.003 or more.
  • the upper limit of the ratio is not particularly limited, and examples thereof include 0.5 or less, 0.3 or less, 0.1 or less, 0.05 or less, 0.01 or less, or 0.005 or less.
  • the origin of lipase is not particularly limited as long as the ratio of transesterification activity to hydrolysis activity satisfies the above conditions.
  • Thermomyces, or Geotrichum can be used.
  • lipases derived from the genus Lysopas, Penicillium or Burkholderia are adopted.
  • a lipase derived from the genus Rhizopus is a lipase produced by Rhizopusoryzae (specific example is Lipase DF (Amano Enzyme)), and an example of a lipase derived from the genus Penicillium is produced by Penicillium camenbertii.
  • Lipase specifically example is Lipase G (Amano Enzyme)
  • example of lipase derived from the genus Burkholderia is lipase produced by Burkholderiacepacia (specific example is Lipase PS (Amano Enzyme)).
  • the above lipase may be used alone or in combination of two or more.
  • lipase is allowed to act on diacylglycerol-containing fats and oils having a water content of 110 ppm or more
  • it is derived from the genus Lysopas (preferably Lysopas oryzae) or the genus Penicillium (preferably Penicillium camemberti).
  • Lipases derived from, more preferably lipases from the genus Lysopas (preferably Lysopas oryzae) can be mentioned.
  • the lipase When the lipase is allowed to act on a diacylglycerol-containing fat or oil having a water content of less than 110 ppm, among the above lipases, preferably, it is derived from the genus Lipase (preferably Lysopas oryzae) or the genus Burkehoridelia (preferably Burkholide). Lipases derived from rear sepacia), more preferably lipases derived from the genus Berkholderia (preferably barkhorideria sepacia).
  • a lipase immobilized on a carrier is used.
  • Immobilized lipase can be prepared according to a conventional method.
  • a commercially available immobilized lipase can be used.
  • a treatment such as immobilization can also be used to change the ratio of the hydrolysis activity and the transesterification activity.
  • fatty acids such as myristic acid, palmitic acid, stearic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid and ⁇ -linolenic acid or esters thereof (hereinafter, "fatty acids and the like" are used as a comprehensive expression for fatty acids and fatty acid esters. ”) May be added alone or in combination of two or more. Moreover, these fatty acids may be those originally contained in fats and oils.
  • the amount or content of fatty acids added is, for example, 1 to 1000 parts by weight, preferably 1.5 to 100 parts by weight, more preferably 2 to 30 parts by weight, still more preferably 2.5 to 10 parts by weight, 3 to 3 to 100 parts by weight per 100 parts by weight of fats and oils. 7.5 parts by weight, or 3.5 to 5 parts by weight.
  • lipase may be added to diacylglycerol-containing fats and oils and reacted.
  • water content moisture concentration; hereinafter simply referred to as "water content”
  • the reaction system including raw material oil (oil or fat or a mixture of fat and fatty acid, etc.) and enzyme
  • 110 ppm for example, 10 ppm or more and less than 110 ppm, preferably 40 to 105 ppm, more preferably 60 to 100 ppm, further preferably 80 to 97 ppm
  • 110 ppm or more for example, 110 to 1000 ppm, preferably 150 to 800 ppm, more.
  • concentration preferably 200 ppm to 500 ppm, more preferably 200 ppm to 400 ppm, and even more preferably 220 to 300 ppm
  • lipase is added and reacted.
  • React for a predetermined time for example, 1 hour to 48 hours
  • a predetermined time for example, 1 hour to 48 hours
  • Stirring is recommended during the reaction to accelerate the reaction.
  • a continuous reaction using a column, a flow tank, or the like can be adopted.
  • a batch type stirring tank type reactor, a flow type stirring tank type reactor, a packed bed type reactor, a fluidized bed type reactor and the like can be used.
  • the amount of lipase added is not particularly limited as long as the desired reaction proceeds. For example, 10 to 100 parts by weight may be added per 100 parts by weight of the raw material oil.
  • water is generated along with the production of triacylglycerol, so it is preferable to remove the water from the reaction system.
  • water can be removed by distillation under reduced pressure, the use of a dehydrating agent such as molecular sieve, and the use of a dry inert gas such as nitrogen gas.
  • the diacylglycerol (DG) reducing effect (Test Examples 1 and 2) of various lipases having different ratios of transesterification activity to hydrolysis activity was examined. Hydrolytic activity and transesterification activity were measured by the following methods. (Method for measuring hydrolysis activity) Hydrolytic activity was measured using Lipase Kit S (SB Bioscience Co., Ltd.). To prepare the color-developing stock solution, 2.4 mL of the pH 7.0-adjusted buffer solution and 22 mL of purified water included in the kit were added to the color-developing agent included in the kit.
  • 250 ⁇ L of the pH 7.0-adjusted buffer solution included in the kit and 2000 ⁇ L of purified water were added to 250 ⁇ L of the color-developing stock solution to prepare a color-developing solution.
  • Put 1 mL of the color-developing solution and 50 ⁇ L of the diluted solution obtained by diluting the enzyme solution to an appropriate concentration in a test tube incubate at 37 ° C for 5 minutes, add 100 ⁇ L of the substrate solution included in the kit, react at 37 ° C for 15 minutes, and then acetone. 2 mL was added and the reaction was stopped. The supernatant of the sample after the reaction was stopped was collected, and the absorbance was measured at 412 nm.
  • the hydrolyzing activity (U / g) was calculated from the following formula, using a blank containing the substrate solution after adding acetone.
  • Hydrolytic activity (U / g) (A412sample-A412blank) x 20 x n (However, A412sample is the absorbance of the sample supernatant at 412 nm, A412 blank is the absorbance of the blank at 412 nm, 20 is the coefficient, and n is the dilution multiple of the enzyme solution.) (Transesterification activity measurement method) Add 5 mL of tricapryrin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 6 mL of methyl laurate (6 mL of Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) to a 50 mL disposable centrifuge tube, and preheat at 30 ⁇ 1 ° C.
  • Method (1) Preparation of enzyme sample Each lipase (Rhizopusoryzae-derived lipase, Burkholderiacepacia-derived lipase) was prepared according to a conventional method, and the hydrolysis activity and transesterification activity were measured. Table 1 shows the hydrolysis activity and transesterification activity of each lipase.
  • CPO substrate oils and fats Crude palm oil
  • the DG reduction effect could not be confirmed with lipase (LPS-IM), which has a low ratio of hydrolysis activity and transesterification activity, but in other lipases, which have a high ratio of hydrolysis activity and transesterification activity.
  • LPS-IM lipase
  • the ratio of hydrolysis activity to transesterification activity is more important than the amount of activity for the DG reduction effect.
  • the fatty acid composition after the reaction of each sample is shown in the table below.
  • the "theoretical value” was calculated based on the abundance ratio of free fatty acids and DG in the substrate fats and oils when the transesterification reaction did not occur and only the synthesis reaction of free fatty acids and DG in the substrate fats and oils occurred. It is a thing.
  • the present invention is useful for modifying and improving the physical properties of fats and oils or processed fats and oils (for example, shortening and margarine). For example, improved ductility, improved emulsion stability, optimized solid fat content (SFC), improved solidification, selective concentration of specific fatty acids, production of low trans acid fats and oils or processed low trans acid fats and oils.
  • the present invention can be applied for such purposes.
  • the fats and oils obtained by applying the present invention or processed fats and oils containing the same have improved physical properties and have high industrial utility value.

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Abstract

油脂中のジアシルグリセロールの低減（トリアシルグリセロールへの変換による）を効率的に行うために有効な新たな手段を提供することを課題とする。加水分解活性に対するエステル交換活性の比率が0.007以上であるリパーゼを、ジアシルグリセロール含有油脂に作用させる工程を含む、油脂の製造方法が開示される。

Description

油脂の製造方法
　本発明は油脂の製造方法に関する。詳しくは、リパーゼを利用した油脂の製造方法に関する。
　パーム油等の油脂について、ジアシルグリセロールの除去又はトリアシルグリセロールへの変換によって良質な油脂へと変換することが行われている（例えば特許文献１を参照）。また、リパーゼのエステル交換反応を利用してトリアシルグリセロールの脂肪酸組成を変えることによって改質し、付加価値の高い油脂を製造することが行われている（例えば特許文献２、３を参照）。一般に、ジアシルグリセロールの除去／トリアシルグリセロールへの変換と、トリアシルグリセロールの脂肪酸組成の改変の両者を行う場合には、２段階の工程が必要になる。
　上掲の特許文献１には、シュードモナス属由来又はリゾパス属由来のリパーゼを用いてジアシルグリセロール含有油脂のジアシルグリセロール量を低減させること及びトリアシルグリセロールの脂肪酸組成を変化させることが開示されている。また、特許文献１には、酵素を作用させる油脂の含水量が110ppm以上ではトリアシルグリセロールの収率が低下することが示されている。
　一方、油脂の製造や改質に利用可能なリパーゼとして、特許文献４に、ペニシリウムsp.由来のリパーゼが開示されている。当該リパーゼはモノグリセリド（モノアシルグリセロール）とジグリセリド（ジアシルグリセロール）に作用する一方で、トリグリセリド（トリアシルグリセロール）には全く作用しないとされている。
特開昭６４－２５８８号公報 国際公開第２０１２／０７７６１４号パンフレット 国際公開第２０１９／１５５７８９号パンフレット 特開平２－１７４６７６号公報
　以上の背景の下で本発明は、油脂中のジアシルグリセロールの低減（トリアシルグリセロールへの変換による）を効率的に行うために有効な新たな手段を提供することを課題とする。
　上記課題を解決すべく、使用する酵素の「加水分解活性とエステル交換活性の比率」に注目して検討を重ねた結果、効率的且つ効果的に油脂を改質する方法（換言すれば、改質した油脂の製造方法）が見出された。当該成果に基づき以下の発明が提供される。
　［１］加水分解活性に対するエステル交換活性の比率が0.007以上であるリパーゼをジアシルグリセロール含有油脂に作用させる工程を含む、油脂の製造方法。
　［２］前記ジアシルグリセロール含有油脂の含水量が110ppm以上である、［１］に記載の油脂の製造方法。
　［３］前記比率が0.01以上である、［１］又は［２］に記載の製造方法。
　［４］前記リパーゼが固定化リパーゼである、［１］～［３］のいずれかに記載の製造方法。
　［５］前記含水量が1000ppm以下である、［２］～［４］のいずれか一項に記載の製造方法。
　［６］加水分解活性に対するエステル交換活性の比率が0.001以上であるリパーゼを、含水量が110ppm未満のジアシルグリセロール含有油脂に作用させる工程を含む、油脂の製造方法。
　本発明はリパーゼを利用した油脂の製造方法に関する。本発明の製造方法は、加水分解活性に対するエステル交換活性の比率、即ち、「エステル交換活性／加水分解活性」が0.007以上であるリパーゼをジアシルグリセロール含有油脂に作用させる工程、好ましくは含水量110ppm以上のジアシルグリセロール含有油脂に作用させる工程、又は、当該比率が0.001以上であるリパーゼを含水量が110ppm未満のジアシルグリセロール含有油脂に作用させる工程によって特徴付けられる。当該工程ではリパーゼの作用によってジアシルグリセロール含有油脂中のジアシルグリセロールと遊離脂肪酸又は遊離脂肪酸エステルが反応し、トリアシルグリセロールが生成する。その結果、油脂が改質される。換言すれば、改質した油脂が得られる。
　リパーゼは通常、反応系が水系の場合は加水分解活性を示し、反応系が油系の場合はエステル交換活性を示す。また、リパーゼに対して固定化などの処理を施すことでエステル交換活性の向上が図られる。従来、油系においてエステル交換反応又はエステル合成反応を行う場合、エステル交換活性のみを指標に使用する酵素を決めることが一般的であった。しかしながら、基質（油脂等）には微量ながらも水分が含まれていることから、反応効率等に加水分解活性も影響している可能性が考えられる。この着想の下で検討した結果、油系におけるエステル合成反応の効率等に、加水分解活性とエステル交換活性の比率が重要であることが判明し、本発明を完成するに至った。加水分解活性とエステル交換活性の比率は以下のように算出することができる。尚、加水分解活性とエステル交換活性は後述の方法で測定することができる。
　加水分解活性については、まず、固定化処理前のリパーゼの加水分解活性を測定する。そして、固定化処理に使用したリパーゼ量から固定化リパーゼ1g当たりの加水分解活性値を算出する。例えば、固定化処理前のリパーゼの加水分解活性が10000u/gであり、このリパーゼを固定化に1g（活性換算で1g相当量）使用した結果、4gの固定化リパーゼが得られたのであれば、エステル交換活性との比率の計算に用いる加水分解活性値は、10000u/g×1g÷4g＝2500u/gとなる。一方、エステル交換活性については固定化処理後のリパーゼを用いる。即ち、固定化リパーゼのエステル交換活性を後述の方法で測定し、測定結果（固定化リパーゼのエステル交換活性値）を加水分解活性との比率の計算に用いる。尚、以上は固定化リパーゼの場合の算出方法であるが、固定化以外の方法で処理したリパーゼについても同様の方法で各活性の算出が可能である。また、未処理のリパーゼであれば、その測定値（加水分解活性値、エステル交換活性値）を直接、比率の計算に用いれば良い。
　リパーゼの加水分解活性に対するエステル交換活性の比率は、エステル合成反応によりジアシルグリセロール含有油脂中のジアシルグリセロールを低減できる限り特に限定されない。上記比率の例は、含水量110ppm以上のジアシルグリセロール含有油脂にリパーゼを作用させる場合において、好ましくは0.007以上である。ジアシルグリセロール含有油脂中のジアシルグリセロールをより一層低減させる観点から、当該例における当該比率は、好ましくは0.01以上、より好ましくは0.02以上、より一層好ましくは0.03以上、更に好ましくは0.05以上、更に一層好ましくは0.07以上である。当該比率の上限としては特に限定されないが、例えば0.5以下、0.3以下又は0.1以下が挙げられる。
　上記比率の別の例は、含水量が110ppm未満のジアシルグリセロール含有油脂にリパーゼを作用させる場合において、好ましくは0.001以上である。ジアシルグリセロール含有油脂中のジアシルグリセロールをより一層低減させる観点から、当該例における当該比率は、好ましくは0.002以上、より好ましくは0.003以上が挙げられる。当該比率の上限としては特に限定されないが、例えば0.5以下、0.3以下、0.1以下、0.05以下、0.01以下又は0.005以下が挙げられる。
　加水分解活性に対するエステル交換活性の比率が上記の条件を満たす限り、リパーゼの由来は特に限定されない。例えば、リゾパス属（Rhizopus）由来、ペニシリウム属（Penicillium）由来、バークホルデリア属（Burkholderia）由来、アスペルギルス属（Aspergillus）由来、カンジダ属（Candida）由来、シュードモナス属（Pseudomonas）由来、ムコール属（Mucor）由来、サーモマイセス属（Thermomyces）由来又はゲオトリクム属（Geotrichum）由来のリパーゼを用いることができる。好ましくは、リゾパス属由来、ペニシリウム属由来又はバークホルデリア属由来のリパーゼを採用する。リゾパス属由来リパーゼの例は、リゾパス・オリゼ（Rhizopusoryzae）が産生するリパーゼ（具体例はリパーゼDF（天野エンザイム社））であり、ペニシリウム属由来リパーゼの例はペニシリウム・カマンベルティ（Penicilliumcamenbertii）が産生するリパーゼ（具体例はリパーゼG（天野エンザイム社））であり、バークホリデリア属由来リパーゼの例は、バークホリデリア・セパシア（Burkholderiacepacia）が産生するリパーゼ（具体例はリパーゼPS（天野エンザイム社））である。
　上記のリパーゼは、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。リパーゼを含水量110ppm以上のジアシルグリセロール含有油脂に作用させる場合にあっては、上記のリパーゼの中でも、好ましくは、リゾパス属（好ましくはリゾパス・オリゼ）由来又はペニシリウム属（好ましくはペニシリウム・カマンベルティ）由来のリパーゼ、より好ましくはリゾパス属（好ましくはリゾパス・オリゼ）由来のリパーゼが挙げられる。
リパーゼを含水量が110ppm未満のジアシルグリセロール含有油脂に作用させる場合にあっては、上記のリパーゼの中でも、好ましくは、リゾパス属（好ましくはリゾパス・オリゼ）由来又はバークホリデリア属（好ましくはバークホリデリア・セパシア）由来のリパーゼ、より好ましくバークホリデリア属（好ましくはバークホリデリア・セパシア）由来のリパーゼが挙げられる。
　本発明の一態様では、担体に固定化したリパーゼ（固定化リパーゼ）を用いる。固定化リパーゼは常法に従い作製することができる。また、市販の固定化リパーゼを用いることもできる。尚、加水分解活性とエステル交換活性の比率を変えることに固定化等の処理を利用することもできる。
　リパーゼを作用させる油脂として、大豆油、ナタネ油、米油、コーン油、ひまわり油、綿実油、落花生油、サフラワー油、オリーブ油、パーム油、パーム軟質油、パーム分別油、パーム核油、ヤシ油、カカオバター等の植物油脂、魚油、ラード、牛脂、乳脂等の動物油脂及びこれらの分別油、硬化油、トリラウリン、トリオレイン、トリパルミチン等の合成油脂を例示することができる。
　必要に応じて、油脂にミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸及びγ－リノレン酸等の脂肪酸又はそのエステル（以下、脂肪酸と脂肪酸エステルを包括する表現として「脂肪酸等」を使用する）を単独又は２種類以上組み合せて添加してもよい。また、これらの脂肪酸は、油脂中にもともと含まれているものであってもよい。脂肪酸等の添加量又は含有量は、油脂100重量部あたり例えば１～1000重量部、好ましくは1.5～100重量部、より好ましくは2～30重量部、さらに好ましくは2.5～10重量部、3～7.5重量部、又は3.5～5重量部である。
　リパーゼを用いてエステル合成反応を行なうには、例えば、リパーゼをジアシルグリセロール含有油脂に添加し、反応させればよい。具体的には、反応開始時の反応系（原料油（油脂、又は油脂と脂肪酸等の混合物）及び酵素含む）の含水量（水分濃度；以下において、単に「含水量」と記載する。）は特に限定されず、110ppm未満（例えば10ppm以上110ppm未満、好ましくは40～105ppm、より好ましくは60～100ppm、さらに好ましくは80～97ppm）又は110ppm以上（例えば110～1000ppm、好ましくは150～800ppm、より好ましくは200ppm～500ppm、更に好ましくは200ppm～400ppm、一層好ましくは220～300ppm）に調整した後、リパーゼを添加し反応させる。反応系の含水量が多いほどエステル合成反応より加水分解反応が起きやすくなる。従って、反応系の含水量が多い場合には、リパーゼの加水分解活性とエステル交換活性の比率は高いことが好ましい。
　例えば30～100℃、好ましくは35～80℃の条件下、所定時間（例えば1時間～48時間）反応させる。反応を促進させるために、反応中は攪拌するとよい。バッチ式の反応の他、カラム、流動槽等を用いる連続反応を採用できる。固定化リパーゼを用いた反応には、回分式攪拌槽型反応器、流通式攪拌槽型反応器、充填層型反応器、流動層型反応器等を利用できる。
　リパーゼの添加量は所望の反応が進行する限り特に限定されない。例えば原料油100重量部あたり10～100重量部添加すればよい。
　エステル合成反応が進行すると、トリアシルグリセロールの生成とともに水分が生じることから、当該水分を反応系より除去することが好ましい。例えば、減圧留去、モレキュラーシーブ等の脱水剤の使用、窒素ガス等の乾燥不活性ガスの使用によって水分を除去することができる。
　加水分解活性に対するエステル交換活性の比率が異なる各種リパーゼのジアシルグリセロール（DG）低減効果（試験例１、２）を検討した。加水分解活性とエステル交換活性は以下の方法で測定した。
（加水分解活性測定方法）
　加水分解活性はリパーゼキットS（SBバイオサイエンス株式会社）を用いて測定した。キット付属の発色剤にキット付属のpH7.0調整緩衝液2.4mLと精製水22mLを加えて発色原液を調製した。発色原液250μLにキット付属のpH7.0調整緩衝液250μLと精製水2000μLを加えて発色液とした。発色液1mL、酵素液を適当な濃度に希釈した希釈液50μLを試験管に入れ、37℃で5分間保温後、キット付属の基質液100μLを添加し、さらに37℃で15分反応後、アセトン2mLを加え反応を停止した。反応停止後のサンプルの上清を回収し、412nmで吸光度を測定した。アセトン添加後に基質液を入れたものをブランクとして、以下の計算式から加水分解活性（U/g）を算出した。
　加水分解活性（U/g）＝（A412sample－A412blank）×20×n
　（但し、A412sampleはサンプルの上清の412nmの吸光度、A412blankはブランクの412nmの吸光度、20は係数、nは酵素液の希釈倍数）
（エステル交換活性測定方法）
　50ｍL容ディスポーサブル遠沈管にトリカプリリン（和光純薬工業（株）製）5ｍLとラウリン酸メチル（和光純薬工業（株）6ｍLを加え、30±1℃で10分間予熱する。酵素サンプル0.1ｇを加え、蓋をして転倒混合した後、ローテーターにセットし30℃、50rpmで30分酵素反応を行った。反応後の溶液30μLを1mLのヘキサンに溶解させガスクロマトグラフィーのサンプルとした。
　ガスクロマトグラフィー分析（カラム：DB-1HT(AgilentJ&W社,5m×0.25mm,df0.1μm)、温度条件：50℃、1分間保持後、40℃/分の速度で370℃まで昇温、検出器：FID、キャリアーガス：ヘリウム）により、酵素反応（エステル交換）の結果として生成したカプリリン酸メチルのエリア値を求め、次式よりエステル交換活性を算出した。
　エステル交換活性(u/g)＝A/a×34×1/30×1/0.1×11
　A：試料のカプリリン酸メチルのエリア値
　a：1mmol/L～7.5mmol/Lのオクタン酸メチルを上記条件でガスクロマトグラフィーに欠けたときのエリア値とオクタン酸メチル濃度(mmol/L)から作成した検量線(オクタン酸メチルのエリア値＝a×オクタン酸メチル濃度)から算出した傾き
　34：反応液をヘキサンに希釈した時の希釈倍率　＊（1mL+30μL）／30μL≒34
　1/30：反応時間1分間当たりへの換算係数
　1/0.1：試料1g当たりへの換算係数
　11：反応液量（mL）※トリカプリリン5mL+ラウリン酸メチル6mL
＜試験例１＞
１．方法
（１）酵素サンプルの調製
　各リパーゼ（Rhizopusoryzae由来リパーゼ、Burkholderiacepacia由来リパーゼ）を常法に従い調製し、加水分解活性とエステル交換活性を測定した。各リパーゼの加水分解活性とエステル交換活性を表１に示す。
（２）基質油脂の調製
　精製パーム油にジオレイン酸グリセロール、パルミチン酸及びオレイン酸を混合した油脂（TG含量89.4重量%、DG含量6.7重量%、残分は主に脂肪酸）を水分が95ppmになるまで80℃で12時間以上減圧乾燥した。
（３）反応
　酵素サンプル0.2g、180℃で12時間以上減圧乾燥したモレキュラーシーブ3A10g及び基質油脂20gを三角フラスコに加え、60℃、160rpmで振とうし、反応させた。22時間後の反応液についてGC分析を行い、基質油脂の組成変化を確認した。反応前と反応後のDG比率からDG残存率を算出した。
２．結果
　各サンプルのDG低減効果（反応開始時の反応系の含水量95ppm）を以下の表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　含水率が95ppmの場合、加水分解活性とエステル交換活性の比率が低いリパーゼを用いてもDG低減効果が確認できた。
＜試験例２＞
１．方法
（１）酵素サンプル
　市販の固定化酵素（LDF-IM、LGS-IM、LPS-IM、いずれも天野エンザイム製）を酵素サンプルとして用いた。
（２）基質油脂の調製
　クルードパームオイル（以下CPO）（TG含量92.5重量%、DG含量4.8重量%、残分は主に脂肪酸）を80℃で2時間以上減圧乾燥して水分量が228ppmになるよう調整した。
（３）反応
　酵素サンプル1g、180℃で12時間以上減圧乾燥したモレキュラーシーブ3A10g及び基質油脂20gを三角フラスコに加え、60℃、160rpmで振とうし、反応させた。24時間後の反応液についてGC分析を行い、基質油脂の組成変化を確認した。
２．結果
　各サンプルのDG低減効果（反応開始時の反応系の含水量228ppm）を以下の表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　含水量が228ppmの場合、加水分解活性とエステル交換活性の比率が低いリパーゼ（LPS-IM）ではDG低減効果を確認できなかったが、加水分解活性とエステル交換活性の比率が高い他のリパーゼにおいてはDG低減効果が確認できた。また、DG低減効果には、活性量よりも加水分解活性とエステル交換活性の比率が重要であることが示唆された。
　各サンプルの反応後の脂肪酸組成を以下の表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 　「理論値」は、エステル交換反応が生じず、基質油脂中の遊離脂肪酸とDGの合成反応のみが起きた場合の組成比率を、基質油脂中の遊離脂肪酸とDGの存在比率を基に算出したものである。
　サンプル３ではエステル合成反応と共にエステル交換反応が起きることが確認できた（表２、表３）。一方、サンプル４においては、エステル合成反応は起きているものの（表２）、エステル交換反応が起きていない（表３）ことが確認できた。また、サンプル５ではエステル合成反応は起きずに（表２）、エステル交換反応が起きる（表３）ことが確認できた。これらの結果より、エステル交換反応能の有無に関わらず、加水分解活性とエステル交換活性の比率が高い場合にエステル合成反応が起きることが判明した。
　本発明は油脂又は油脂加工品（例えばショートニング、マーガリン）の物性の改質・改良に有用である。例えば、展延性の向上、エマルジョン安定性の向上、固体脂含有値（SFC）の最適化、固化性の向上、特定の脂肪酸の選択的濃縮、低トランス酸油脂又は低トランス酸油脂加工品の製造等を目的として、本発明を適用することができる。本発明を適用して得られる油脂又はそれを含む油脂加工品は物性に改善を認め、産業上の利用価値が高い。
　この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。

Claims (6)

  1. 　加水分解活性に対するエステル交換活性の比率が0.007以上であるリパーゼをジアシルグリセロール含有油脂に作用させる工程を含む、油脂の製造方法。
  2. 　前記ジアシルグリセロール含有油脂の含水量が110ppm以上である、請求項１に記載の油脂の製造方法。
  3. 　前記比率が0.01以上である、請求項１又は２に記載の製造方法。
  4. 　前記リパーゼが固定化リパーゼである、請求項１～３のいずれかに記載の製造方法。
  5. 　前記含水量が1000ppm以下である、請求項２～４のいずれか一項に記載の製造方法。
  6. 　加水分解活性に対するエステル交換活性の比率が0.001以上であるリパーゼを、含水量が110ppm未満のジアシルグリセロール含有油脂に作用させる工程を含む、油脂の製造方法。
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