JPH02174676A

JPH02174676A - 新規リパーゼ

Info

Publication number: JPH02174676A
Application number: JP32861988A
Authority: JP
Inventors: Shotaro Yamaguchi; 庄太郎山口; Masaaki Yokoe; 横江　正明; Tamio Mase; 民生間瀬
Original assignee: Amano Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Amano Enzyme Inc
Priority date: 1988-12-26
Filing date: 1988-12-26
Publication date: 1990-07-06
Anticipated expiration: 2013-10-27
Also published as: JP2816470B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、モノグリセライド（以下、ＭＧと言う）、ジ
グリセライド（以下、ＤＧと言う）に作用し、トリグリ
セライド（以下、ＴＧと言う）に全く作用しない新規リ
パーゼ（以下、部分グリセライドリパーゼと言う）に関
し、ＭＧ及び／又はＤＣ（以下、部分グリセライドと言
う）の製造、特にＭＧの製造、油脂の精製、等の油脂工
業分野で利用され、あるいは分析用酵素として利用され
、産業上特に重要である。

〔従来の技術〕

部分グリセライドリパーゼに関連する酵素としては、ラ
ット小腸、ブタ脂肪組織など動物臓器由来のモノグリセ
ライドリパーゼ、ジグリセライドリパーゼがよく知られ
ている。又、微生物由来のものでは、スタフィロコッカ
ス属に属する菌株由来のもの、バチルス属に属する菌株
由来のものが知られている。しかしながら、動物組機由
来の酵素はＭＧばかりではなく、ＤＧ、ＴＧにも作用し
く特開昭６３−２４５６７２）　、微生物由来で前者の
ものは、基質特異性としてＴＧにも作用しく特開昭５５
−４２５３２）、後者のものは、ＭＧにのみ作用し、Ｔ
Ｇ、ＤＣには作用しないものである（特開昭６３−２４
５６７２）。

一方、奥付らはペニシリウム・サイクロピウム（Ｐｅｎ
ｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｃｙｃｌｏｐｉｕｍ）の−菌株が、
ＭＧ、ＤＧによく作用する酵素を生産することを報告し
ている（ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ、
Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、８７巻、　　２０５〜２１１ペー
ジ（１９８０））。しかしながら、この酵素はＭＣ；、
ＤＣのみならずＴＧにも少なからず作用すると述べられ
ている。

［発明が解決しようとする問題点］前述の如く、従来の部分グリセライドリパーゼに関連す
る酵素は、部分グリセライドのみならず、ＴＧにも作用
するため、例えば前述した部分グリセライドの製造法に
利用する場合には、副産物としてＴＧが生成し、さらに
油脂の精製法においては、部分グリセライドばかりでな
く、油脂の本体であるＴＧも分解し、結果として精製収
率が悪くなる。又、分析用の酵素として利用する場合も
、ＴＧの分解という副反応が生ずることとなり、従来の
部分グリセライドリパーゼは、上層目的での利用には問
題があった。

〔問題点を解決するための手段及びその作用〕本発明者
らは、前述の問題点を鑑み、鋭意研究を行い、リパーゼ
を生産する菌株を広く検索した結果−１その中の一菌株
が部分グリセライドリパーゼを生産することを見出した
。さらに、本酵素を単離精製後、諸性質を検討した結果
、ＭＧ及びＤＧにのみ作用し、ＴＧに全く作用しないこ
とを見出し、本発明を完成した。

以下に本発明において使用する微生物の菌学的性質を示
す。

（Ａ）形態 ■分生子柄１００〜７００μ×３．５〜４．５μ、粗面。

■ベニシリ非対称体 ■分岐１３〜３０μ×約４μ ■メトμ ＩＯ〜１５μ×約４μ、３〜５本が群生する。

■フィアライド１０−１３μ×約３μ、３〜８本が輪生する。

■分生子フィアロ型分生子、球形〜亜球形、３．０〜４．０μ、
滑面〜わずかに粗面、分子鎖はもつれた鎖状。

（Ｂ）生育状態 ■ツアペック寒天培地生育はやや速やか、分生子形成は少ない。分生子形成部
はうす青緑色〜明るい緑味灰色、集落裏面は黄味白色〜
黄茶色。

■麦芽エキス寒天培地生育はかなり速やか、分生子をよ（形成する。

分生子形成部はうす青緑色〜明るい緑味灰色、集落裏面
は黄味白色。

（ｃ）生理的性質 ■最適生育条件ｐＨ３〜７でよく生育する。温度は２０〜３０℃でよく
生育する。

■生育の範囲ｐＨ２〜９で生育する。３７℃では生育しない。

以上の諸性質から主にｆｌａｒｒｏｎのＴｈｅ　Ｇｅｎ
ｅｒａｏｆ　Ｈｙｐｈｏｎ＋ｙｃｅｔｅｓ　ｆｒｏｍ　
５ｏｉｌ　（Ｗｉｌｌｉａｍｓ　＆Ｗｉｌｋｉｎｓ。

Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ　　（１９６８）　）に従って検索
すると、■フィアロ型分生子を形成する、■分生子堆・
分生子鹿を形成しない、■分生子柄はよく発達し、多く
のフイアライドを形成し、ベニシリ状となる、■分生子
は隔壁がなく、はぼ球形で連鎖することなどからＰｅｎ
　ｉｃ　ｉ　１１　ｉ　ｕｍ属に分類される。本発明者
らは、本菌株をペニシリウム・エスピーＵ−１５０ト命
名した。尚、本菌株は微工研菌寄第１０４５２号（ＦＥ
ＲＭ　Ｐ−１０４５２）として工業技術院微生物工業技
術研究所に寄託されている。

本発明の部分グリセライドリパーゼを生産する微生物の
培養は、公知の方法が利用でき、目的とする部分グリセ
ライドリパーゼが著量、生産される様にして選定すれば
よい。具体的には固体培地、液体培地のいずれでもよく
、培地成分は炭素源、窒素源等一般培地に使用されるも
のであればいずれでもよい。培養は好気的に４〜３３℃
１好ましくは２０〜３０゛Ｃで１〜４日間行われる。

固体培地で好気的に培養したときは、その培養物に水を
加えて部分グリセライドリパーゼを抽出し、同じように
液体培地で培養したときは、培養物を濾過し、部分グリ
セライドリパーゼを含む培養濾液を得ることができる。

次に、このようにして得た部分グリセライドリパーゼ含
有液にエタノールを多量添加して得た沈澱物を濾別し、
エタノールを揮散させることによって、部分グリセライ
ドリパーゼ粗酵素粉末を得ることができる。

更に、粗酵素粉末を精製するには、既知の方法、例えば
イオン交換やゲルろ過などの各種のクロマトグラフィー
等を適当に組合わして行うことができる。

ペニシリウム・エスピーＵ−１５０を上記のように培養
・精製して得られた部分グリセライドリパーゼの各性質
を以下に詳細に記述する。

尚、本酵素の活性測定は特に記載しない限り、下記の如
く振盪法により行った。

ラウリン酸ビニル　　　　　１．０ｇ５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５，６）　　　５．ＯＩｄ酵
素液　　　　　　　　　　　１．〇−及びガラスピーズ
（φ５ｍｍ）３０個を入れた三角フラスコを３０℃で反
幅振盪（１分間に１４０往復振幅３ｃｍ）を行う。１時
間後、２０成のアセトン：エタノール混液（１：１）を
加え反応を停止し、’ｉａｍしたラウリン酸を、フェノ
ールフタレインを指示薬として、０．ＩＮ　ＫＯＩ＋溶
液で滴定する。

この条件下で１分間に１マイクロ当量の脂肪酸を遊離さ
せる酵素量を１単位とした。

（１）酵素化学的性質」−憂１１月鉄種々のグリセライドに対する基質特異性を第１表に示す
。

尚、ＭＧの基質としては１−ＲＡＳ−モノラウリン（フ
ナコシ社製）　、１−５Ｎ−モノバルミチン（フナコシ
社製）　、３−５Ｎ−モノバルミチン（フナコシ社製）
、２−モノバルミチン（フナコシ社製）　、１−ＲＡＳ
−モノオレイン（シグマ社製）、２−モノオレイン（シ
グマ社製）を使用し、ＤＣとしては１．２−ＲＡＳ−ジ
ラウリン（フナコシ社製）　、１．３−ジラウリン（フ
ナコシ社製）　、１．３−ＲＡＳ−シバルミチン（フナ
コシ社製）　、１．２−５Ｎ−シバルミチン（フナコシ
社ｌ）　、１．３−シバルミチン（フナコシ社製）　、
１．２−ＲＡＳ−ジオレイン（シグマ社製）、１．２−
３Ｎ〜ジオレイン（シグマ社製）、１．３−ジオレイン
（シグマ社製）を使用し、ＴＧとしてはトリラウリン（
フナコシ社製）、トリバルミチン（フナコシ社製）、ト
リオレイン（シグマ社製）を使用した。また、反応時間
はＭＧ及びＤＧに対しては３０分とし、ＴＧに対しては
９０分とした。尚、測定法は以下の如くである。

（イ）反応液の組成基質０、２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，６）ジメチルホルムアミド酵素液（０，１８単位）精製水（ロ）操作上記反応液を遠心用試験管に入れて、３７℃で各々の反
応時間静置する。反応後、クロロ１１．３ｍＭ０．５− ＯｌＩｄＯｌＩｄ０．３ｒｄホルム：メタノール混液（２：１）２ｍを加え、遠心分
離後、水層中のグリセロールを、グリセロールキナーゼ
、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、パーオキシ
ダーゼを用いた発色法により定量する。

（以下、余白）第 ■ 表この様に、本酵素はＭＧ、ＤＣにのみ作用し、ＴＧには
全く作用しない。またＤＣの位置異性体については、１
．３−ジオレイン、　１．２−ＲＡＳ−ジオレインを同
程度に分解する。ＭＧの位置異性体については、１−Ｒ
ＡＳ−モノオレインの方が分解されやすいものの、２−
モノオレインにも分解する。

又、本酵素は、グリセライドに対する立体特異性は有し
ない。即ち、１．２−５Ｎ−ジオレイン、２．３−５Ｎ
−ジオレインさらに１−５Ｎ−モノバルミチンと３−５
Ｎ−モノバルミチンを同程度に分解する。

さらに、公知の酵素との差異を明確とするために、奥付
らの文献と同様の方法〔ジャーナル・オブ・バイオケミ
ストリー（Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、　８７巻。

２０６ページ（１９８０）　］で基質特異性を調べた結
果を第２表に示す。

尚、奥付らの酵素活性の測定方法は以下に示す通りであ
る。

基質０＝５　ｇ　、　５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５，６
）　５．０　ｍｌ、酵素液１．０ｄを含む反応液を３０
℃で撹拌（１分間に５００回転）を行う。１時間後、２
０ｄのアセトン：エタノール混液（１：　１）を加え反
応を停止し、遊離した脂肪酸をフェノールフタレインを
指示薬として、０．０５Ｎ　ＫＯＨ溶液で滴定する。

第２表において、使用酵素量は奥付らの方法で測定し、
設定した。具体的には前記方法において、基質０．５ｇ
の代わりに１．０ｇのラウリン酸メチルを使用した。

第表（以下、余白）第２表より、奥付らのデータ　（同上、２０８ページＴ
ａｂｌｅＩ［１及び２０９ページＴａｂｌｅｌＶ）と比
較すると明らかな様に、本発明の部分グリセライドリパ
ーゼは、奥付らの酵素と比べて使用した酵素活性を５倍
としてもＴＧに全く作用しないことが分かる。

ｂ、　ｊジ１状振盪法により測定した結果、至適ρ１１は５であり、そ
の結果を第１図に示す。

」−至適１度振盪法により測定した結果、至適温度は３０℃であり、
その結果を第２図に示す。

」工餅女定性本酵素を、各ｐＨの緩衝液中で３５℃９３０分間処理し
た後、その残存活性を振盪法により測定した結果、ｐＨ
５，０〜７，０の範囲で安定であり、その結果を第３図
に示す。

」−贅支定判本酵素を、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５，６）に溶解し
、各温度で１５分間処理し、残存活性を振盪法により測
定した結果、４０℃まで安定であり、その結果を第４図
に示す。

（２）物理化学的性質」−分子量１２．５％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ電気
泳動法により求めた。これにより分子量は約４００００
という値が得られた。この際、分子量マーカーとしてオ
ボトランスフェリン（分子量７６０００〜７８０００）
　、アルブミン（分子１６６２５０）、　　オバルブミ
ン（オボアルブミン：分子量４５０００）　、カルボニ
ックアンヒドラーゼ（分子量３００００）及びミオグロ
ビン（分子量１７２００）を用いた。その結果を第５図
に示す。

又、ＴＳＫ　Ｇ２００Ｏ５−カラム（東ソー社製）を用
いてゲルろ過性により求めた。これにｉり分子量は約３
８０００という値が得られた。この際、分子量マーカー
としてアデニレートキナーゼ（分子量３２０００）　、
　　エノラーゼ（分子量　６７０００）　、　　ラクテ
ートデヒドロゲナーゼ（分子量１４００００）及びグル
タメートデヒドロゲナーゼ（分子量２９００００）を用
いた。その結果を第６図に示す。

］−等１点キャリアアンフオラインを用いる等電点分画法により４
“Ｃ，４００Ｖの定電圧で４５時間通電した後、各両分
の酵素活性を測定し、ｐ＋　４．４±０．４の値を得た
。

次に本発明を実施例により説明する。

米糠２％及びコーンステイープリカー１．５％よす成る
培地（ｐＨ６，０）にペニシリウム・エスピーＵ−１５
０を接種し、２６℃において２日間通気撹拌培養した。

得られた培養液（２０ｆｆｉ）より菌体をろ別した後：
ろ液を限外ろ過により濃縮した。

酊索Ω雁里上記の濃縮液（２５０ｄ）に、硫安を０．７５飽和にな
る様に添加し、生じた沈澱物を遠心により集めた。

得られた沈澱分を１１０１１Ｉのリン酸緩衝液（ｐ＋＋
　６．０）（以下ＰＢと言う）に溶解させ、１０ｍＭの
ＰＢに対して充分透析を行った。

この透析液を１１０１１ＩのＰＲで平衡化させたＤＥＡ
Ｅ−セファ０−スＣＬ−６Ｂカラムに負荷し、０〜５０
０ｍＭＮａＣｌの直線濃度勾配により吸着したタンパク
質を溶出させた。次に、部分グリセライドリパーゼ画分
を集め、限外ろ過膜により脱塩、濃縮を行った。

次に、上記濃縮液を１０ｍＭのＰＢで平衡化させたセフ
ァディックスＧ−７５ゲルの入ったカラムに負荷し、同
緩衝液でタンパク質を溶出させた。

溶出された部分グリセライドリパーゼ画分を集め、１０
ｍＭのＰＢに対して充分透析を行った。

この透析液を、１０ｍＭのＰＢで平衡化したハイドロキ
シアパタイトゲルの入ったカラムに負荷し、１０〜５０
０　ｍＨのＰＢの直線濃度勾配により吸着したタンパク
質を溶出させた。次に部分グリセライドリパーゼ画分を
集め、限外ろ過膜により脱塩、ｅ４縮を行った。

次に、Ｆ記濃縮液を、ｐＨ３〜１０のキャリアアンホラ
インを用いた等電点分画クロマトグラフィーに供し、ρ
■４．３〜４．５の範囲に濃縮された部分グリセライト
リパーゼ画分を得、１０ａ＋ＭのＰＢに対して充分透析
し、精製した部分グリセライドリパーゼ溶液（６２５０
単位１０Ｄｚｅｏ、７■含有）を得た。この時の分画パ
ターンを第７図に示す。

〔発明の効果〕

以上の様に、本発明の酵素はＭＧ、ＤＣに作用し、ＴＧ
に全く作用しない、従来にない全く新しい酵素である。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第４図は、各々本発明の部分トリグリセライド
リパーゼの至適ｐＨ１至適温度、ｐ＋＋安定性及び温度
安定性を示す。第５図及び第６図はそれぞれ５ＤＳ−電気泳動法、ゲル
ろ適法による本酵素の分子量測定図である。第７図は本酵素の精製操作で得たクロマトグラム及び本
酵素の等電点を示すものである。

Claims

【特許請求の範囲】１）モノグリセライド、ジグリセライドに作用し、トリ
グリセライドに全く作用しない新規リパーゼ。２）下記の理化学的性質を有する特許請求の範囲第１項
記載の新規リパーゼ（ａ）分子量：４００００±４０００（ｂ）至適ｐＨ：ｐＨ５付近（ｃ）至適温度：３０℃ （ｄ）ｐＨ安定性：ｐＨ５．０〜７．０（ｅ）熱安定性：４０℃まで（ｆ）等電点：４．４±０．４