WO2021151879A1 - Allergenschutz für die haut - Google Patents

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WO2021151879A1
WO2021151879A1 PCT/EP2021/051736 EP2021051736W WO2021151879A1 WO 2021151879 A1 WO2021151879 A1 WO 2021151879A1 EP 2021051736 W EP2021051736 W EP 2021051736W WO 2021151879 A1 WO2021151879 A1 WO 2021151879A1
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peptides
skin
allergens
amino acids
preparation
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PCT/EP2021/051736
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Jörn Hendrik Reuter
Wilfried Siefken
Judith SEIDEL
Anna RINAS
Yvonne WÖHRMANN
Marlis RIEDEL
Mirko Tesch
Christoph Ernst
Tanja BUSSMANN
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Beiersdorf Ag
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Definitions

  • the invention is a preparation comprising specific peptides which can bind allergens, as well as the use of peptides for preventing or reducing the penetration or accumulation of allergens in or on the skin.
  • the skin forms a barrier that protects the human organism from liquid or solid foreign substances. Nevertheless, foreign substances and thus potential allergens can penetrate. This can trigger an immune response, causing the affected skin area to become inflamed.
  • the immune system made up of antibodies, white blood cells, mast cells, complement proteins, and other substances, defends the body against foreign substances (also called antigens).
  • the immune system of susceptible people can react excessively when they come into contact with certain substances (allergens) in the environment or in food or medication that are harmless to most people. The result is an allergic reaction. Some people are allergic to only one substance. Others are allergic to many substances. Around a quarter of all citizens of Germany suffer from allergies.
  • Allergens can cause an allergic reaction if they come into contact with the skin or eyes (or if they are inhaled, eaten, or injected).
  • An allergic reaction can take various forms.
  • Penetrating substances such as small chemical molecules, pollen, allergens, metal ions but also proteases can trigger diseases such as atopic dermatitis or allergic contact dermatitis, which is triggered by the reaction with molecular components of the skin or the immune system.
  • Allergens are substances that are recognized by the body as foreign and trigger an excessive immune reaction, an allergy.
  • plant allergens such as pollen, animal allergens such as cat dander, and chemical allergens such as preservatives.
  • An allergen is a substance that, via the immune system, can trigger hypersensitivity reactions (allergic reactions).
  • An allergen is an antigen. Allergens have no chemical properties in common. It is therefore problematic to develop a chemical that can combat or destroy all allergens at the same time. Most allergens are proteins or protein compounds. The immune system of allergic patients reacts to contact with allergens by forming IgE antibodies. In contrast, “pseudoallergens” are substances in which the immune system is not involved, but mediators, such as B. the histamines.
  • the first three allergy types are mediated via the body fluids and the antibodies contained therein, including factors (humoral), while the fourth allergy type is cell-mediated (via T cells).
  • mixed images also occur.
  • Type I The allergy of the immediate type
  • Type III The formation of immune complexes
  • Type IV The cellular immune response
  • Type I includes, for example, allergic rhinitis, hives (urticaria) or asthma symptoms, but also pollen allergies, insect venom allergies, some drugs or food allergies. Allergic reactions of the immediate type often show a severe course. In the case of a particularly strong reaction to an allergen, a massive release of histamine can also trigger an anaphylactic shock.
  • the body forms suitable antibodies of group Ig E (immunoglobulin E) immediately after contact with a certain allergen; the immune system is now sensitized to these antigens.
  • group Ig E immunoglobulin E
  • the IgE antibodies form a connection with the so-called mast cells, which are found in the skin and mucous membranes. They then bind the antigens to themselves. This bridge bond (between mast cell, antibody and antigen) causes the mast cells to release the inflammation mediator histamine (mast cell degranulation).
  • the histamine and other released substances cause the allergy-typical, unpleasant symptoms.
  • the released histamine ensures that the vessels expand so that they become more permeable. Blood flows more and more in order to be able to transport away foreign and waste materials. This leads to reddening and swelling of the skin or mucous membrane. Itching is also often the result of the inflammatory reaction.
  • Type IV which is also called the late type, predominantly causes allergy symptoms on the skin, such as nickel allergy. Contact allergies are generally responsible for the majority of cases of occupational disability. Allergies of this type can develop unnoticed for years, but then suddenly trigger very violent immune reactions. T-lymphocytes, together with helper cells, directly attack foreign bodies that have entered.
  • the most common contact allergens include nickel, thiomersal, perfume, cobalt, formaldehyde, Peru balsam, rosin, isothiazolinone, chromium or thiuramix.
  • peptide refers to a molecule that is made up of amino acids and which are linked to one another via peptide bonds.
  • the peptides are systematically divided according to the number of amino acids from which they are made up.
  • oligopeptides comprise less than 10 amino acids, for example di- or tripeptides.
  • Polypeptides on the other hand, comprise a larger number of amino acids. Long chains of polypeptides are also known as proteins.
  • the carboxy group of one amino acid reacts formally with elimination of water with the amino group of the other amino acid to form the acid amide group -CO-NH-.
  • the newly made amide bond between the carbon atom of the carbonyl group and the nitrogen atom thus becomes a peptide bond.
  • the table below lists the 20 canonical amino acids.
  • the 20 proteinogenic amino acids there are a number of other amino acids in nature that are known as non-proteinogenic amino acids.
  • Selenocysteine is an exception in some organisms, in which the S atom in the cysteine has been replaced by selenium. Selenocysteine has its own tRNA and a codon, which is otherwise considered a stop codon in the genetic code, meaning that selenocysteine can actually be counted among the proteinogenic amino acids. This amino acid occurs e.g. in the formate dehydrogenase of the bacterium E. coli and the glutathione peroxidase in mammals.
  • Homocysteine L-homocysteine (Hey) is also a naturally occurring but not proteinogenic a-amino acid.
  • peptides are used, among other things, to improve skin properties. They are often used to reduce the depth of wrinkles. But there are also other possible uses, for example peptides, which have a beneficial effect on the water content of the skin by improving the synthesis of the water channels in the skin.
  • WO 2012164488 A2 describes a mixture of a tripeptide and a tetrapeptide for the therapeutic treatment of the papillary dermis and to prevent and / or treat skin aging, in particular photo-induced aging.
  • EP 979829 A2 describes, for example, the use of oligopeptides for cosmetic and topical dermatological skin lightening or for preventing skin tanning. It is known that peptides are susceptible to oxidation and / or degradation reactions which are noticeable through discoloration or off-smells, so that their incorporation and use in cosmetic preparations pose a challenge.
  • Foreign substances such as allergens can, in addition to allergies, cause dermatologically relevant skin changes and chronic diseases such as atopic dermatitis.
  • the barrier structure is easy to use, enables a wide range of applications and is designed to be stable, easy to store and use.
  • One embodiment of the invention are topically applicable preparations comprising one or more peptides for preventing or reducing allergic reactions in or on the skin.
  • the allergic reactions are caused by the penetration and / or the accumulation of foreign substances and / or allergens on the skin and / or in the skin.
  • the peptides according to the invention are characterized in that they comprise 2 to 10 amino acids and at least one of these amino acids has one or more reactive side chains.
  • Another embodiment of the invention is a topically applicable preparation comprising one or more peptides for preventing or reducing the penetration and / or the accumulation of foreign substances and / or allergens on and / or in the skin.
  • the peptides form a skin barrier for foreign substances.
  • the peptides lead in particular to the prevention or reduction of allergic reactions in or on the skin.
  • the prevention or reduction of atopic dermatitis and / or allergic contact dermatitis by the peptides according to the invention or the preparations containing them is therefore also preferred.
  • One embodiment of the invention is therefore also peptides for use in the treatment of atopic dermatitis and / or allergic contact dermatitis.
  • the peptides according to the invention can be used as capture agents for foreign substances.
  • the peptides according to the invention advantageously bind contact allergens.
  • the contact allergy is an allergy to mostly small molecular substances, the so-called contact allergens. These often occur in everyday life or at work. It is based on a T-cell-mediated specific reaction of the immune system (type IV / late-type sensitization) to reactive substances which, as so-called haptens, only become an allergen after binding to proteins in the skin.
  • Known contact allergens include metals (e.g. nickel), preservatives, fragrances and dyes, rubber ingredients, components of resins, adhesives, plastic monomers (e.g. epoxy resin, acrylates), disinfectants and special natural substances (e.g. . vegetable substances).
  • the contact allergy manifests itself clinically as allergic contact eczema.
  • Contact eczema also contact dermatitis
  • the main triggers are allergens and irritant substances.
  • the peptides according to the invention or the preparations contained therein are therefore preferably used to prevent or reduce the penetration and / or accumulation of contact allergens on and / or in the skin.
  • the peptides form a skin barrier for the contact allergens.
  • the peptides thus lead in particular to the prevention or reduction of allergic, in particular contact allergic, reactions in or on the skin.
  • the prevention or reduction of allergic contact dermatitis by the peptides according to the invention or the preparations containing them is therefore also preferred.
  • the peptides according to the invention are preferably used against chemical allergens in order to avoid allergies of type I and in particular type IV in particular.
  • Chemical allergens include, for example, textile fibers, dyes, coating materials or other chemical substances.
  • the peptides according to the invention are particularly preferably used against chemically electronegative allergens.
  • the peptides according to the invention can preferably be used against contact allergens.
  • the preferred contact allergens to be prevented include metals such as nickel, preservatives, fragrances and dyes, rubber ingredients, components of resins,
  • Adhesives plastic monomers such as epoxy resin and acrylates, disinfectants and special natural substances such as in particular vegetable substances, in particular thimerosal, perfume, cobalt, nickel, formaldehyde, urushiole, Peru balsam, rosin, isothiazolinone, chromium or thiuramix.
  • the formation of a contact allergy and / or contact eczema upon contact with the allergens is preferably prevented or reduced in this way.
  • Another preferred embodiment of the invention is also the non-therapeutic, in particular cosmetic, use of one or more peptides or the preparation containing them as a skin barrier against foreign substances and / or allergens, in particular contact allergens, and for skin care.
  • Another embodiment of the invention is a cosmetic method for allergen protection by applying to the skin a preparation which contains one or more peptides according to the invention.
  • the non-therapeutic use and the cosmetic method of the peptides according to the invention serve to prevent the reduction in the penetration and / or accumulation of foreign substances and / or allergens, in particular contact allergens, on and / or in the skin.
  • a contribution to skin care is made.
  • the peptides according to the invention are selected from the group of peptides with 2-10 amino acids and are characterized in that they have one or more amino acids with one or more reactive side chains.
  • the peptides according to the invention preferably contain at least one amino acid selected from the group histidine, cysteine, lysine, tyrosine, serine, selenocysteine, homocysteine, asparagine, aspartic acid, glutamine, glutamic acid, methionine, phenylalanine and / or pyrrolysine.
  • peptides from the group GSH, HHHHHH, Ac-RFAACAA, Ac-RFAALAA, RFAALAA, RFAACAA, Ac-RAACAA, RAACAA, Ac-RFACAA, RFACAA, Ac-RFACA and / or RFACA.
  • the peptides according to the invention are preferably incorporated into cosmetic or dermatological preparations in order to achieve a user-friendly topical application of the allergen barrier.
  • the invention is therefore also a topically applicable preparation, in particular a cosmetic preparation, comprising one or more peptides from the group of peptides with 2-10 amino acids, at least one of these amino acids having one or more reactive side chains.
  • the proportion of peptides according to the invention with 2 to 10 amino acids is advantageously in the range from 0.01 to 10% by weight, in particular in the range from 0.1 to 5% by weight, particularly preferably in the range from 0.2% by weight to 5% % By weight selected, based on the total mass of the preparation.
  • Such a method for allergen protection is possible by applying a preparation to the skin which contains one or more peptides, the peptides being selected from the group of peptides with 2-10 amino acids and at least one of these amino acids having one or more reactive side chains
  • the term “skin barrier” and “barrier effect” encompasses the interception, blocking, inactivation, prevention, reduction and / or hindering of the penetration or attachment of foreign substances, such as allergens, in particular contact allergens, on or into the skin.
  • foreign substances such as allergens, in particular contact allergens, on or into the skin.
  • the substances exerting an undesired reaction are summarized according to the invention and simply referred to according to the invention as foreign substances and / or allergens.
  • An accumulation or binding of the allergen to the peptide prevents or at least reduces an accumulation or penetration of the allergen on or into the skin.
  • a reduction in the skin deposition of the allergens takes place both in terms of the amount of allergens and in terms of speed.
  • one or more peptides according to the invention are used to intercept, block and / or inactivate allergens and / or to prevent, reduce or hinder the penetration or accumulation of foreign substances or allergens on or in the skin, in particular human skin.
  • Peptides according to the invention capture the foreign substances, individual substances such as metals or metal ions, proteases or allergens. They prevent, reduce or make it more difficult for these substances to accumulate on the skin or penetrate into the skin and there lead to undesirable reactions on or in the skin or the body. The triggering of an immune response is subsequently prevented. In particular, by preventing the penetration of allergens, an allergic reaction is reduced or avoided entirely.
  • the peptides according to the invention are selected from the group of peptides with 2-10 amino acids.
  • the peptides are preferably selected from the group of up to 8 amino acids, in particular less than 8 amino acids.
  • Peptides with a high number of amino acids run the risk of being grouped as foreign substances on contact with the skin and possibly triggering a specific immune defense by means of MHC groups.
  • MHC Major Histocompatibility Complex
  • the peptides according to the invention are further characterized in that they have one or more amino acids, which in turn have one or more reactive side chains.
  • Reactive side chains are characterized by the fact that they contain electron donors and / or acceptors. These properties make it possible for these side chains to be attached to the formation of covalent bonds, coordinative bonds, hydrogen bonds or van der Walls interaction between allergen / irritant / foreign substance and peptide are involved.
  • the peptides according to the invention advantageously have at least one amino acid with a free thiol group.
  • the free thiol group is such a reactive side chain, such as in the amino acid cysteine.
  • the peptide glutathione (GSH) or ⁇ -L-glutamyl-L-cysteinylglycine are also preferred peptides with a reactive side chain.
  • GSH glutathione
  • ⁇ -L-glutamyl-L-cysteinylglycine is also preferred peptides with a reactive side chain.
  • g-L-Glutamyl-L-cysteinylglycine is a tripeptide with the sequence glutamic acid-cysteine-glycine (Glu-Cys-Gly).
  • a side chain is also to be referred to as a group and thus characterizes the reactivity and thus allergen binding of the peptides it contains.
  • peptides are used according to the invention which initially do not contain a reactive group, for example no thiol group, then they are converted to a peptide according to the invention with a reactive group by adding one or more amino acids with reactive groups, for example cysteine.
  • the designation of the peptides according to the invention can then nevertheless comprise the original peptide designation, expanded by the addition of the reactive amino acid (s).
  • oligopeptide-6 e.g. KDIFTRALN
  • the addition of the amino acid cysteine results in an extended peptide according to the invention with the sequence CKDIFTRALN, or Cys-oligopeptide-6.
  • the peptides according to the invention advantageously comprise one or more particularly chemically active amino acids such as histidine, cysteine, lysine, tyrosine, serine, selenocysteine, homocysteine, asparagine, aspartic acid, glutamine, glutamic acid, methionine, phenylalanine, pyrrolysine.
  • one or more particularly chemically active amino acids such as histidine, cysteine, lysine, tyrosine, serine, selenocysteine, homocysteine, asparagine, aspartic acid, glutamine, glutamic acid, methionine, phenylalanine, pyrrolysine.
  • allergens show a high affinity for binding to these reactive amino acids.
  • these specific peptides can thus bind the penetrating substances and be used according to the invention.
  • the bond takes place in the most varied of ways, for example through intermolecular interactions, ionic, hydrogen bridge, van derWaals or covalent bonds. It can also lead to a superimposition of different ways of bonding.
  • the only decisive factor is the effect achieved, the barrier effect that inactivates the allergens and prevents them from penetrating the skin or from accumulating on the skin.
  • the accumulation of foreign substances / allergens on the skin is thus reduced or prevented. Even if the preparation according to the invention and peptides to which the foreign substances are bound are on the skin, this does not mean an accumulation on and on the skin.
  • the use according to the invention opens up the long sought-after way of avoiding or reducing an allergic skin reaction upon contact with allergens.
  • a new antiallergic agent or a new type of antiallergic method has thus been created that does not eliminate or at least alleviate the symptoms of an allergic disease, but rather does not allow an allergic reaction to arise in the first place.
  • cysteine and methionine Both contain a sulfur atom.
  • Cysteine is a polar amino acid and has a free thiol group. This property of cysteine is very important for the structure of proteins, as polypeptide chains are linked to one another or covalent links are created within a polypeptide chain, which considerably stabilize the conformation of a protein.
  • the term cystine is sometimes used for the two cysteines linked by disulphide bridges. In metalloproteins it is often a cysteine residue that binds zinc, copper or iron atoms.
  • Hexahistidine is also relevant in the binding of metalloproteins.
  • This mode of action is also used when coupling nickel and thus a classic nickel allergy is reduced or even avoided entirely by applying a peptide according to the invention.
  • the peptides according to the invention can advantageously contain both naturally occurring and also synthetically produced and modified amino acids, e.g. by acetylation.
  • Glutathione also g-L-glutamyl-L-cysteinylglycine, is a tripeptide with the sequence glutamic acid-cysteine-glycine.
  • one or more peptides according to the invention which contain one or more active amino acids are applied to the skin surface.
  • the invention therefore also comprises topically applicable, in particular cosmetic or dermatological, preparations containing one or more of the peptides according to the invention.
  • Topical application can take place in a wide variety of ways, for example in the form of a cosmetic formulation.
  • a protective mechanism When applied to the skin, a protective mechanism, a barrier effect, is created.
  • Simple aqueous or lipid-containing formulations through to complex preparation forms are possible depending on the area of application.
  • the skin constantly comes into contact with foreign substances from the environment, the allergens. Due to the protective mechanism, the foreign substances from the environment first step on this barrier.
  • the potential allergens hit the peptides contained in the applied formulation and can thus react directly with the active amino acids of these peptides, be bound or at least prevented. The allergens are thus trapped and can no longer cause a biological reaction in the organism.
  • the allergen reaction with the effector (the skin's own peptide or protein) is prevented before an allergy to the allergen can develop.
  • the allergens are also intercepted and thus the triggering of the allergy by the specific allergen (elicitation) is prevented.
  • the barrier effect of the peptides according to the invention and their prevention or reduction of allergic reactions could be shown impressively in the investigations explained below.
  • One mode of operation in the experiments carried out here is primarily based on the interception of allergens through the formation of covalent bonds to the reactive group, e.g. amino acid cysteine, according to the mechanism of nucleophilic addition, also SN1 and SN2.
  • the reactive group e.g. amino acid cysteine
  • Phenion FTS full-skin models (Phenion, Henkel). These were kept for 3 days at 37 ° C. and 7% CO 2 in deep-well plates with 3 pm pore size of the cell culture inserts.
  • the skin models were kept in 1.5 ml air-liquid interface medium without phenol red. The medium was changed daily.
  • the test substances were dissolved in ethanol and incubated for 24 hours at room temperature. After 24 hours of cultivation, 25 ⁇ l of the substance solution were dropped onto a sterile filter paper which had previously been placed on the skin model.
  • the barrier peptide (0.5 mM AcRFAACAA) was previously applied to the model as a solution in 100 mM phosphate buffer (pH 7.5). Alternatively, the barrier peptide was applied at 0.25% by weight in a formulation.
  • the models were harvested and half embedded in OCT mounting medium (VWR Q-Path Chemicals), the other half snap-frozen in liquid nitrogen. The supernatant from each model was collected and stored at -20 ° C.
  • the supernatants of the Phenion FTS models were analyzed with the Bio-Plex Pro Human Cytokine Screening Panel (Bio-Rad) according to the manufacturer's protocol.
  • This multiplex immunoassay is based on capture antibodies that are directed against the respective interleukins and are covalently coupled to magnetic beads.
  • the cytokine concentrations are calculated based on the standard curves of the Bioplex system.
  • interleukin 8 IL8
  • interleukin 6 IL6
  • IL 8 like IL 6, are interleukins and thus messenger substances of the immune system. Typically, these are produced and released by the skin cells when they are irritated and / or damaged by allergens and irritants.
  • the substances applied to the skin model are listed on the x-axis.
  • FIG. 2 shows a peptide according to the invention (0.5 mM AcRFAACAA) alone, 50 mM DNCB and 50 mM DNCB plus peptide (0.5 mM AcRFAACAA).
  • Figure 3 shows the peptide alone, 2.5mM CA (cinnamaldehyde) and 2.5mM cinnamaldehyde plus peptide.
  • the interleukin 6 (IL6) concentration is plotted in pg / mL on the y-axis and the substances applied to the skin model (peptide alone, 2.5mM DNCB and 2.5mM DNCB plus peptide) on the x-axis.
  • DNCB dinitrochlorobenzene
  • CA Ceraldeyhde
  • Benzene is a strong allergen.
  • CA Cosmetic Aldeyhde
  • Eugenol is a phenylpropanoid with an intense clove odor.
  • Eugenol is both an antioxidant and a prooxidant, the latter being the basis for its (mucous) skin-irritating, allergy-promoting effect. All three allergens serve as model allergens to show the barrier effect and avoidance or reduction of allergic reactions of the peptides according to the invention.
  • the secondary antibody (1: 800) and Hoechst Fluorescent Stain (1: 2000) were incubated with the sections for 1-2 h at room temperature in the dark. After washing three times again, the sections were mounted with Fluoromount-G mounting medium (Sothern BioTech) and covered with a cover slip. The fluorescence microscopy was carried out with a Zeiss Axio Observer Z1.
  • the fluorescence images were analyzed with ImageJ.
  • the DNP-colored areas were measured with the Threshold Color tool.
  • FIG. 5 shows the hematoxin and eosin (H&E) staining of the cryosections, here in black and white, in the original in color.
  • H&E hematoxin and eosin
  • Figure 5 shows the cryosections of the Phenion skin models stained with H&E, A) after incubation with PBS (control), B) after incubation with 0.5mM AcRFAACAA peptide (control), C) after incubation with 2.5mM DNCB (strong allergen) and D) after incubation with DNCB and peptide.
  • frozen sections were thawed and incubated for 10 minutes in 3.7% paraformaldehyde at room temperature. After three PBS washing steps and one minute in distilled water. is stained in hematoxylin solution for 3 min. After washing with water and 0.1% HCl, the sections are stained for 3 min in eosin solution and dehydrated in an ethanol series of 70%, 95% and 100%. The sections were mounted and capped in Leica CV Ultra mounting medium. The images were recorded with a Pannoramic Scan II (3DHistech).
  • Figure 6 shows immunohistological analyzes of cryosections from Phenion skin models
  • FIG. 6 D shows the quantification of the red intensity of A, B, C.
  • the red area above a limit value was set in relation to the total area considered (y-axis), the x-axis shows the substances applied to the skin model (peptide alone, 2, 5mM DNCB and 2.5mM DNCB plus peptide).
  • Figures 7 A to E, 8 and 9 show investigations on the reactivity of peptides according to the invention with allergens over time (x-axis) or after 24 h. The absorption is plotted on the y-axis.
  • the peptide allergen reactions were implemented according to a direct peptide reactivity assay. The test is called the in-chemico method - that is, no cells are used, but a chemical reaction is carried out.
  • the Direct Peptide Reaction Assay is an OECD-validated test method.
  • the detection of the native, as yet unbound peptide takes place via the reaction with Ellmans reagent and a corresponding absorption measurement.
  • the Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA) is a chemical method for predicting epidermal protein binding.
  • the DPRA uses HPLC to measure the depletion of peptides in solution after exposure to test chemicals.
  • the DPRA deals with the reactivity of the test chemicals, eugenol and DNCB, with the peptides according to the invention (each at 0.5 mM) and incubation for up to 24 hours.
  • the measurement used in the test is the depletion rate of these peptides and is assessed using a widely used HPLC-UV method.
  • FIGS. 7 A to E The decrease in absorption due to the reaction of the peptide with allergen, eugenol (black) and DNCB (dashed line) can be clearly seen in FIGS. 7 A to E, which proves the inventive allergen trapping function of the peptides according to the invention.
  • the absorption at 415 nm is determined as the measured variable.
  • the allergen concentration is by default at 5mM and thus 10 times the concentration of the peptide used (0.5mM).
  • the SH residue is the reactive binding site of the peptide with the allergens.
  • the color reaction with DTNB (change from colorless to yellow) competes with the allergen reaction. This means that the better the allergen reacts with the peptide, the less peptide is still available for the reaction with the detection reagent, i.e. the lower the resulting yellow coloration. This measurement at 415nm is shown in Figure 9.
  • the decrease in the peptide in the allergen reaction can also be determined using a UV detector after HPLC separation, as shown in Figure 8.
  • FIG. 8 shows the decrease (depletion in%) of the allergen eugenol (5 mM Eu) in the presence of the peptide Ac-RFAACAA (0.5 mM) over time (24 h) compared to the peptide alone.
  • Figure 9 shows the decrease in the peptide against eugenol and against various urushiol derivatives.
  • the control is the peptide in the buffer system without allergen, i.e. instead of allergen only its solvent (ethanol) is added.
  • Urushiols are the strongest naturally occurring allergen, which is also responsible for many sensitizations, as explained above.
  • Urushiole are the essential sensitizing component of the sumac plants, such as the poison sumac Toxicodendron quercifolium, especially in the various Rhus species, such as poison ivy (Toxicodendron radicans / Poison ivy), poison oak (Toxicodendron diversilobum / poison oak) and lacquer tree (Rhus verniciflua ), as well as in Toxicodendron rydbergii, Toxicodendron toxicarium, Toxicodendron vernix.
  • the contact allergy to urushiole is a serious occupational disease, for example among agricultural and forest workers and firefighters, but also all those looking for relaxation who move around in nature. In the United States, they are responsible for 7.1 million doctor visits and 430,000 inpatient hospital stays. For example, this contact allergy accounts for 10% of all US Forest Services injury-related downtime, and approximately one-third of California, Oregon, and Washington forest workers are disabled during the forest fire season as a result of these reactions.
  • the preparations according to the invention comprising the short-chain peptides according to the invention lead to an alleviation of the allergic skin reaction to constituents of poison ivy.
  • the allergens such as DNCB, were in the range of 10; 5; 2.5; 0.5; 0.05; 0.005; 0.0005 mM, cinnamaldehydes in the range of 5; 2.5; 0.5; 0.05; 0.0005 mM and eugenol: 5, 2.5; 0.05; 0.0005 mM tested.
  • the peptide concentrations were in the range of 4, 2, 0.5; 0.25mM varies.
  • the peptides according to the invention can advantageously be incorporated into customary cosmetic and dermatological preparations, which can be in various forms.
  • a solution, an emulsion of the water-in-oil (W / O) type or of the oil-in-water (O / W) type, or multiple emulsions, for example of the water-in-oil-in Water (W / O / W) or oil-in-water-in-oil (O / W / O), a hydrodispersion or lipodispersion, a gel, a solid stick or an aerosol are preferred forms of preparation.
  • the proportion of one or more peptides according to the invention in preparations that can be applied topically is advantageously in the range from 0.01 to 10% by weight, in particular in the range from 0.1 to 5% by weight, particularly preferably in the range from 0.2% by weight. up to 5% by weight, based on the total mass of the preparation.
  • Preferred forms of application of the peptides according to the invention are emulsion preparations, gels and spray formulations.
  • Emulsions produced according to the invention for example in the form of a cream, a lotion, a cosmetic milk are advantageous and contain, for example, fats, oils, waxes and / or other fatty substances, as well as water and one or more emulsifiers, as are usually used for such a type of formulation .
  • the peptide-containing preparations according to the invention advantageously comprise one or more antioxidants.
  • the preparations according to the invention therefore advantageously comprise one or more antioxidants selected from the group a-glycosyl rutin, isoquercitin, tocopherol (vitamin E), citric acid, citrate buffer, BHT (butylhydroxytoluene) and in particular EDTA (ethylenediaminetetraacetate).
  • the proportion of one or more antioxidants or stabilizers in topically applicable preparations is advantageously selected in the range from 0.01 to 2% by weight, in particular in the range from 0.05 to 1.5% by weight, based on the total mass of the Preparation.
  • the preparations according to the invention also advantageously have a pH in the range from 4 to 8, in particular in the range from 4 to 7.
  • a pH of the preparation also contributes to stabilization.
  • a pH of the preparation in the acidic range advantageously less than 7, in particular less than 6, has an advantageous effect on the stability of the peptide.
  • the pH can be adjusted with the usual substances and buffer systems known to the person skilled in the art.
  • the preparations according to the invention advantageously comprise one or more film formers.
  • the peptides can be chemically modified in order to improve the physicochemical properties. For example, derivatization with fatty acid residues (e.g. acetyl, caproyl, undecenoyl or palmitoyl) increases lipophilicity.
  • fatty acid residues e.g. acetyl, caproyl, undecenoyl or palmitoyl
  • chemical modifications can contribute to a better stability of the peptide and thus protect it from degradation by peptidases, for example.
  • the permeability of the skin is increased and the distribution in the skin is further promoted.
  • Substances that trigger allergies, allergens are intercepted by the peptides according to the invention consisting of 2-10 amino acids, at least one amino acid having one or more reactive side chains.
  • This barrier effect of the peptides especially in preparations that can be applied topically, leads to a new type of antiallergic therapy.
  • the figures are percentages by weight based on the total mass of the preparation.

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Abstract

Allergieauslösende Substanzen, Allergene, werden durch Peptide bestehend aus 2-10 Aminosäuren, wobei mindestens eine Aminosäure ein oder mehreren reaktiven Seitenketten aufweist, abgefangen. Diese Barrierewirkung der Peptide, insbesondere in topisch applizierbaren Zubereitungen, führt zu einer neuartigen antiallergischen Therapieform.

Description

Allergenschutz für die Haut
Die Erfindung ist eine Zubereitung umfassend spezifische Peptide, die Allergene binden können, sowie die Verwendung von Peptiden zur Verhinderung oder Verminderung des Eindringens oder Anlagern von Allergenen in oder auf die Haut.
Die Haut bildet eine Barriere, die den menschlichen Organismus vor flüssigen oder festen Fremdsubstanzen schützt. Trotzdem können Fremdsubstanzen und somit potentielle Allergene eindringen. Dies kann eine Immunantwort auslösen, wodurch sich das betroffene Hautareal entzündet.
Normalerweise verteidigt das aus Antikörpern, weißen Blutkörperchen, Mastzellen, Komplementproteinen und anderen Substanzen bestehende Immunsystem den Körper gegen fremde Substanzen (auch Antigene genannt). Das Immunsystem anfälliger Personen kann bei Kontakt mit bestimmten, für die meisten Menschen harmlosen, Substanzen (Allergenen) aus der Umgebung oder in Nahrungsmitteln oder Medikamenten übermäßig reagieren. Die Folge ist eine allergische Reaktion. Einige Personen sind nur gegen eine einzige Substanz allergisch. Andere wiederum reagieren auf viele Substanzen allergisch. Etwa ein Viertel aller Bürger Deutschlands leidet an Allergien.
Allergene können bei Kontakt mit der Haut oder den Augen (oder wenn sie eingeatmet, gegessen oder gespritzt werden), eine allergische Reaktion auslösen. Eine allergische Reaktion kann dabei in verschiedenen Formen auftreten.
Eindringende Substanzen, wie kleine chemische Moleküle, Pollen, Allergene, Metallionen aber auch Proteasen, können Krankheiten auslösen wie z.B. atopische Dermatitis oder allergische Kontaktdermatitis, was durch die Reaktion mit molekularen Bestandteilen der Haut oder des Immunsystems ausgelöst wird.
Aktuell werden lediglich die Symptome, welche durch das Eindringen von Fremdsubstanzen ausgelöst werden, behandelt.
Allergene sind Substanzen, die vom Körper als fremd erkannt werden und eine überschießende Immunreaktion, eine Allergie, auslösen. Es gibt pflanzliche Allergene wie Pollen, tierische wie Katzenhaare und chemische Allergen wie Konservierungsstoffe.
Ein Allergen ist eine Substanz, die über Vermittlung des Immunsystems Überempfindlichkeitsreaktionen (allergische Reaktionen) auslösen kann. Ein Allergen ist ein Antigen. Allergene haben keine chemischen Gemeinsamkeiten. Deswegen ist es problematisch, eine Chemikalie zu entwickeln, die alle Allergene gleichsam bekämpfen oder zerstören kann. Die meisten Allergene sind Eiweiße oder Eiweißverbindungen. Das Immunsystem allergischer Patienten reagiert mit der Bildung von IgE-Antikörpern auf den Kontakt mit Allergenen. „Pseudoallergene“ sind demgegenüber Stoffe, bei denen das Immunsystem nicht beteiligt ist, wohl aber Mediatoren, wie z. B. die Histamine.
Die Medizin unterscheidet vier Allergietypen, je nachdem welche immunologischen Reaktionen das Allergen hervorruft. Die ersten drei Allergietypen werden über die Körperflüssigkeiten und darin enthaltene Antikörper u.a. Faktoren (humoral) vermittelt, der vierte Allergietyp läuft hingegen zellvermittelt (über T-Zellen) ab. Es treten aber auch Mischbilder auf.
• Typ I: Die Allergie vom Soforttyp
• Typ II: Die zytotoxische Reaktion
• Typ III: Die Immunkomplexbildung
• Typ IV: Die zelluläre Immunantwort
Zum Typ I gehören zum Beispiel der allergische Schnupfen, Nesselausschlag (Urtikaria) oder auch Asthma-Symptome, aber auch Pollenallergien, Insektengiftallergien, einige Arzneimittel oder Nahrungsmittelallergien. Allergische Reaktionen vom Soforttyp zeigen häufig einen schweren Verlauf. Bei besonders starker Reaktion auf ein Allergen kann durch eine massive Histaminfreisetzung auch ein anaphylaktischer Schock ausgelöst werden.
Beim Allergietyp I bildet der Körper unmittelbar nach Kontakt mit einem bestimmten Allergen passende Antikörper der Gruppe lg E (Immunglobulin E), das Immunsystem ist nun gegen diese Antigene sensibilisiert. Beim nächsten Allergen-Kontakt gehen die IgE-Antikörper eine Verbindung ein mit den so genannten Mastzellen, die in Haut und Schleimhäuten Vorkommen. Anschließend binden sie die Antigene an sich. Diese Brückenbindung (zwischen Mastzelle, Antikörper und Antigen) bewirkt, dass die Mastzellen den Entzündungs- Mediator Histamin ausschütten (Mastzellendegranulation). Das Histamin und weitere freigesetzte Substanzen verursachen die Allergie-typischen, unangenehmen Symptome. In unmittelbarer Umgebung sorgt das freigesetzte Histamin für eine Erweiterung der Gefäße, so dass diese durchlässiger werden. Blut strömt vermehrt heran, um Fremd- und Abfallstoffe abtransportieren zu können. Daher kommt es zu einer Rötung und Schwellung der Haut bzw. Schleimhaut. Folge der Entzündungsreaktion sind auch häufig Juckreiz.
Vom Typ IV, der auch Spättyp genannt wird, werden überwiegend Allergiesymptome auf der Haut ausgelöst, wie zum Beispiel bei der Nickel-Allergie. Kontaktallergien sind allgemein für einen Großteil der Fälle mit Berufsunfähigkeit verantwortlich. Allergien dieses Typs können sich unbemerkt über Jahre entwickeln, dann aber plötzlich sehr heftige Immunreaktionen auslösen. Hierbei greifen T-Lymphozyten gemeinsam mit Helferzellen eingedrungene Fremdkörper direkt an.
Kontaktallergene sind Auslöser von Typ-IV-Allergien. Das typische Krankheitsbild ist das allergische Kontaktekzem, das sich genau an den Körperstellen zeigt, die mit dem betreffenden Allergen in Kontakt kommen. Meist sind das die Hände, das Gesicht, die Unterschenkel oder der Nacken.
Zu den häufigsten Kontaktallergenen gehören Nickel, Thiomersal, Parfüm, Cobalt, Formaldehyd, Perubalsam, Kolophonium, Isothiazolinone, Chrom oder Thiuramix.
Bekannt ist auch die Gruppe der pflanzlichen Kontaktallergene der Urushiole, die insbesondere ein großes Problem im Verbreitungsgebiet, z.B. in Nordamerika, von Poison Ivy, Poison Oak und Sumac, als Vertreter der Familie der Anacardiaceae, darstellen.
Da es kein Allheilmittel gegen Allergene gibt, wäre es wünschenswert, das Eindringen bzw. das Anlagern der Substanzen auf bzw. in die Haut oder den Körper zu verhindern oder zumindest zu vermindern.
Das Abfangen der aktiven Allergene und somit die Verhinderung der Immunantwort wäre somit eine zu präferrierende Behandlung.
Mit dem Begriff Peptid bezeichnet man ein Molekül, das aus Aminosäuren aufgebaut ist und die über Peptidbindungen miteinander verknüpft sind. Systematisch unterteilt man die Peptide nach der Anzahl der Aminosäuren, aus denen sie aufgebaut sind.
So umfassen Oligopeptide weniger als 10 Aminosäuren, beispielsweise Di- oder Tripeptide.
Polypeptide umfassen hingegen eine größere Anzahl an Aminosäuren. Lange Polypeptidketten werden auch als Proteine bezeichnet.
Bei der Kondensation von Aminosäuren reagiert die Carboxygruppe der einen Aminosäure formal unter Wasserabspaltung mit der Aminogruppe der anderen Aminosäure zur Säureamidgruppierung -CO-NH-. Die neu geknüpfte Amidbindung zwischen dem Kohlenstoffatom der Carbonylgruppe und dem Stickstoffatom wird so eine Peptidbindung.
In der nachstehenden Tabelle sind die 20 kanonischen Aminosäuren aufgeführt.
Figure imgf000006_0001
Neben den 20 proteinogenen Aminosäuren finden sich in der Natur eine ganze Reihe weiterer Aminosäuren, die als nicht-proteinogene Aminosäuren bezeichnet werden.
Zudem gibt es noch eine Reihe von Aminosäuren, die erst nach ihrem Einbau in die wachsende Polypeptidkette chemisch verändert werden. Diese modifizierten Aminosäuren entstehen also aus proteinogenen Aminosäuren durch posttranslationale Modifikation. Eine Ausnahme bildet in einigen Organismen das Selenocystein, bei der das S-Atom im Cystein durch Selen ersetzt ist. Für Selenocystein existiert eine eigene tRNA und ein Codon, das ansonsten im genetischen Code als Stopp-Codon gilt und damit kann man Selenocystein eigentlich zu den proteinogenen Aminosäuren zählen. Diese Aminosäure kommt z.B. in der Formiat-Dehydrogenase des Bakteriums E. coli und der Glutathion-Peroxidase der Säugetiere vor.
Auch Homocystein, L-Homocystein (Hey), ist eine natürlich vorkommende, aber nicht proteinogene a-Aminosäure.
Von Natur aus existieren 20 Standardaminosäuren aus denen, abgesehen von wenigen Ausnahmen, jedes Protein besteht. Dies führt somit zu Einschränkungen in den biochemischen-, biophysikalischen und reaktiven Eigenschaften gewünschter funktioneller Proteine und Peptide. Es gibt mittlerweile aber Verfahren, um chemisch modifizierte Aminosäuren mit verschiedensten reaktiven Gruppen an ortsspezifischen Positionen einzuführen. Als Grundlage dafür wird beispielsweise die Methodik der amber-Suppression oder über die Click-Chemie eine Kopplung reaktiver Gruppen erreicht.
In der Kosmetik werden Peptide u.a. eingesetzt, um die Hauteigenschaften zu verbessern. Oft werden sie eingesetzt, um die Faltentiefe zu reduzieren. Es gibt aber auch andere Einsatzmöglichkeiten, beispielsweise Peptide, die den Wassergehalt der Haut günstig beeinflussen, indem sie die Synthese der Wasserkanälchen in der Haut verbessern.
WO 2012164488 A2 beschreibt ein Gemisch aus einem Tripeptid und einem Tetrapeptid zur therapeutischen Behandlung der papillären Dermis und um eine Hautalterung, insbesondere eine photoinduzierte Alterung, zu verhindern und/oder zu behandeln.
EP 979829 A2 beschreibt beispielsweise den Einsatz von Oligopeptiden zur kosmetischen und topischen dermatologischen Hautaufhellung oder zur Verhinderung der Hautbräunung. Bekanntermaßen sind Peptide anfällig für Oxidations- und/oder Abbaureaktionen, die sich durch Verfärbungen oder Fehlgerüche bemerkbar machen, so dass deren Einbau und Verwendung in kosmetischen Zubereitungen eine Herausforderung darstellen.
Zunehmend negative Umwelteinflüsse und vermehrt Fremdsubstanzen gelangen auf die menschliche Haut und können zu Unannehmlichkeiten, Hautreizungen und Krankheiten führen.
Fremdsubstanzen, wie Allergene, können neben Allergien aber auch dermatologisch relevante Hautveränderungen, chronische Krankheiten, wie atopische Dermatitis, herbeiführen.
Weiter wünschenswert ist es daher eine Barriere gegen diese Fremdsubstanzen, insbesondere eine Allergenbarriere, bereit zu stellen.
Wünschenswert ist es dabei auch, dass der Barriereaufbau einfach anwendbar ist, ein breites Anwendungsspektrum ermöglicht und stabil, lager- und anwendungsfreundlich gestaltet ist.
Eine Ausführungsform der Erfindung sind topisch applizierbare Zubereitungen umfassend ein oder mehrere Peptide zur Verhinderung oder Verminderung allergischer Reaktionen in oder auf der Haut. Die allergischen Reaktionen werden dabei hervorgerufen durch das Eindringen und/oder die Anlagerung von Fremdsubstanzen und/oder Allergenen auf der Haut und/oder in die Haut. Die erfindungsgemäßen Peptide sind dadurch charakterisiert, dass sie 2 bis 10 Aminosäuren umfassen und zumindest eine dieser Aminosäuren eine oder mehrere reaktive Seitenketten aufweist.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist eine topisch applizierbare Zubereitung umfassend ein oder mehrere Peptide zur Verhinderung oder Verminderung des Eindringens und/oder der Anlagerung von Fremdsubstanzen und/oder Allergene auf und/oder in die Haut.
Die Peptide bilden eine Hautbarriere für Fremdsubstanzen. Die Peptide führen so insbesondere zur Verhinderung oder Verminderung allergischer Reaktionen in oder auf der Haut. Erfindungsgemäß ist somit auch bevorzugt die Verhinderung oder Verminderung atopischer Dermatitis und/oder allergischer Kontaktdermatitis durch die erfindungsgemäßen Peptide bzw. der sie enthaltenen Zubereitungen.
Eine Ausführungsform der Erfindung sind daher auch Peptide zur Verwendung bei der Behandlung atopischer Dermatitis und/oder allergischer Kontaktdermatitis. Die erfindungsgemäßen Peptide können als Auffangmittel gegenüber Fremdsubstanzen eingesetzt werden.
Vorteilhaft binden die erfindungsgemäßen Peptide Kontaktallergene. Bei der Kontaktallergie handelt es sich um eine Allergie gegenüber zumeist kleinmolekularen Stoffen, den sog. Kontaktallergenen. Diese kommen häufig im Alltag oder am Arbeitsplatz vor. Sie basiert auf einer T -Zell- vermittelten spezifischen Reaktion des Immunsystems (Typ-IV- /Spättyp- Sensibilisierung) gegenüber reaktiven Substanzen, die in der Regel als sog. Haptene erst nach Bindung an Proteine in der Haut zu einem Allergen werden. Bekannte Kontaktallergene sind unter anderem Metalle (z. B. Nickel), Konservierungsmittel, Duft- und Farbstoffe, Gummiinhaltsstoffe, Bestandteile von Harzen, Kleber, Kunststoff-Monomere (z. B. Epoxidharz, Acrylate), Desinfektionsmittel sowie besondere Naturstoffe (z. B. pflanzliche Stoffe). Klinisch manifestiert sich die Kontaktallergie als allergisches Kontaktekzem. Ein Kontaktekzem (auch Kontaktdermatitis) ist eine entzündliche, nicht-infektiöse Intoleranzreaktion der Haut oder Schleimhäute durch äußerlichen Kontakt zu immunologisch, chemisch oder physikalisch wirkenden Noxen. Als Auslöser kommen überwiegend Allergene und irritative Substanzen in Frage.
Bevorzugt werden daher die erfindungsgemäßen Peptide bzw. die sie enthaltenen Zubereitungen zur Verhinderung oder Verminderung des Eindringens und/oder der Anlagerung von Kontaktallergenen auf und/oder in die Haut verwendet.
Die Peptide bilden eine Hautbarriere für die Kontaktallergen. Die Peptide führen so insbesondere zur Verhinderung oder Verminderung allergischer, insbesondere kontaktallergischer, Reaktionen in oder auf der Haut. Erfindungsgemäß ist somit auch bevorzugt die Verhinderung oder Verminderung der allergischer Kontaktdermatitis durch die erfindungsgemäßen Peptide bzw. der sie enthaltenen Zubereitungen.
Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Peptide gegenüber chemischen Allergenen eingesetzt, um insbesondere die Allergien nach Typ I und insbesondere Typ IV, zu vermeiden.
Zu den chemischen Allergenen zählen beispielsweise textile Faserstoffe, Farbstoffe, Beschichtungsstoffe oder andere chemische Substanzen.
Gegenüber diesen Substanzklassen ist die erfindungsgemäße Verwendung und Verfahren bevorzugt anzuwenden.
Besonders bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Peptide gegen chemisch elektronegative Allergene eingesetzt. Bevorzugt lassen sich die erfindungsgemäßen Peptide gegen Kontaktallergene einsetzen.
Zu den bevorzugt zu verhindernden Kontaktallergenen gehören u.a. Metalle, wie Nickel, Konservierungsmittel, Duft- und Farbstoffe, Gummiinhaltsstoffe, Bestandteile von Harzen,
Kleber, Kunststoff-Monomere, wie Epoxidharz und Acrylate, Desinfektionsmittel sowie besondere Naturstoffe, wie insbesondere pflanzliche Stoffe, insbesondere Thiomersal, Parfüm, Cobalt, Nickel, Formaldehyd, Urushiole, Perubalsam, Kolophonium, Isothiazolinone, Chrom oder Thiuramix.
Bevorzugt wird erfindungsgemäß so die Ausbildung einer Kontaktallergie und/oder Kontaktekzem bei Kontakt mit den Allergenen verhindert bzw. vermindert.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist zudem die nicht-therapeutische, insbesondere kosmetische Verwendung von ein oder mehreren Peptiden bzw. der sie enthaltenen Zubereitung als Hautbarriere gegenüber Fremdsubstanzen und/oder Allergenen, insbesondere Kontaktallergenen, sowie zur Hautpflege.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein kosmetisches Verfahren zum Allergenschutz indem eine Zubereitung auf die Haut aufgetragen wird, die ein oder mehrere erfindungsgemäße Peptide enthält.
Die nicht-therapeutische Verwendung sowie das kosmetische Verfahren der erfindungsgemäßen Peptide dienen zur Verhinderung der Verminderung des Eindringens und/oder der Anlagerung von Fremdsubstanzen und/oder Allergene, insbesondere Kontaktallergene, auf und/oder in die Haut. Somit wird u.a. auch ein Beitrag zur Hautpflege geleistet.
Die erfindungsgemäßen Peptide werden aus der Gruppe der Peptide mit 2-10 Aminosäuren gewählt und sind dadurch charakterisiert, dass sie ein oder mehrere Aminosäuren mit ein oder mehreren reaktiven Seitenketten aufweisen.
Bevorzugt enthalten die erfindungsgemäßen Peptide mindestens eine Aminosäure gewählt aus der Gruppe Histidin, Cystein, Lysin, Tyrosin, Serin, Selenocystein, Homocystein, Asparagin, Asparaginsäure, Glutamin, Glutaminsäure, Methionin, Phenylalanin und/oder Pyrrolysin.
Bevorzugt ist wiederum die Peptide aus der Gruppe GSH, HHHHHH, Ac-RFAACAA, Ac- RFAALAA, RFAALAA, RFAACAA, Ac-RAACAA, RAACAA, Ac-RFACAA, RFACAA, Ac-RFACA und/oder RFACA zu wählen.
Das Sequenzprotokoll der erfindungsgemäß bevorzugten Peptide lautet: Seq 1 : HHHHHH = His His His His His His Seq 2: RFAACAA = Arg Phe Ala Ala Cys Ala Ala Seq 3: RFAALAA = Arg Phe Ala Ala Leu Ala Ala Seq 4: RAACAA = Arg Ala Ala Cys Ala Ala Seq 5: RFACAA = Arg Phe Ala Cys Ala Ala Seq 6: RFACA = Arg Phe Ala Cys Ala sowie jeweils deren acetylierten Säuren (Ac-).
Zur topischen Applikation werden die erfindungsgemäßen Peptide bevorzugt in kosmetische oder dermatologische Zubereitungen eingebracht, um so eine anwendungsfreundliche topische Applikation der Allergenbarriere zu erzielen.
Die Erfindung ist daher auch eine topisch applizierbare Zubereitung, insbesondere kosmetische Zubereitung, umfassend ein oder mehrere Peptide aus der Gruppe der Peptide mit 2-10 Aminosäuren, wobei zumindest eine dieser Aminosäuren eine oder mehrere reaktive Seitenketten aufweist.
Der Anteil an erfindungsgemäßen Peptiden mit 2 bis 10 Aminosäuren wird vorteilhaft im Bereich von 0,01 bis 10 Gew.%, insbesondere im Bereich von 0,1 bis 5 Gew.%, besonders bevorzugt im Bereich von 0,2 Gew.% bis 5 Gew.% gewählt, bezogen auf die Gesamtmasse der Zubereitung.
Es ist so ein Verfahren zum Allergenschutz möglich indem eine Zubereitung auf die Haut aufgetragen wird, die ein oder mehrere Peptide enthält, wobei die Peptide aus der Gruppe der Peptide mit 2-10 Aminosäuren gewählt werden und zumindest eine dieser Aminosäuren eine oder mehrere reaktive Seitenketten aufweist
Erfindungsgemäß umfasst der Begriff „Hautbarriere“ und „Barrierewirkung“ das Abfangen, Blockieren, Inaktivieren, Verhindern, Vermindern und/oder Erschweren des Eindringens bzw. des Anlagerns von Fremdsubstanzen, wie etwa Allergenen, insbesondere Kontaktallergene, auf oder in die Haut. Die eine unerwünschte Reaktion ausübenden Substanzen werden erfindungsgemäß zusammenfassend erfindungsgemäß vereinfacht als Fremdsubstanz und/oder Allergene bezeichnet.
Durch eine Anlagerung, Bindung des Allergens an das Peptids wird eine Anlagerung bzw. das Eindringen des Allergens auf bzw. in die Haut verhindert bzw. zumindest vermindert. Eine Verminderung der Hautanlagerung der Allergene findet dabei sowohl bezüglich der Menge an Allergenen als auch bezüglich der Geschwindigkeit statt.
D.h. ein oder mehrere erfindungsgemäße Peptide werden zum Abfangen, Blockieren und/oder Inaktivieren von Allergenen und/oder zum Verhindern, Vermindern oder Erschweren des Eindringens bzw. der Anlagerung von Fremdsubstanz bzw. Allergenen auf oder in die Haut verwendet, insbesondere der menschlichen Haut.
Erfindungsgemäße Peptide fangen die Fremdsubstanzen, Einzelsubstanzen wie Metalle oder Metallionen, Proteasen oder Allergene, ab. Sie verhindern, vermindern oder erschweren somit, dass diese Substanzen sich auf der Haut anlagern oder in die Haut eindringen und dort zu unerwünschten Reaktionen auf oder in der Haut oder dem Körper führen können. Die Auslösung einer Immunantwort wird in der Folge verhindert. Insbesondere durch die Verhinderung des Eindringens von Allergenen wird somit eine allergische Reaktion vermindert oder ganz vermieden.
Insbesondere wird so eine atopische Dermatitis und/oder allergische Kontaktdermatitis verhindert.
Die erfindungsgemäßen Peptide werden aus der Gruppe der Peptide mit 2-10 Aminosäuren gewählt. Bevorzugt werden die Peptide gewählt aus der Gruppe bis zu 8 Aminosäuren, insbesondere weniger als 8 Aminosäuren.
Peptide mit hoher Aminosäureanzahl laufen Gefahr bei Kontakt mit der Haut als Fremdsubstanz eingruppiert zu werden und ggf. eine spezifische Immunabwehr mittels MHC-Gruppen auszulösen.
Das Kürzel MHC steht für „Major Histocompatibility Complex“, eine Gruppe von sehr variantenreichen Genen, die bei der Immunantwort von Wirbeltieren eine Rolle spielen. Die Gene liefern die Bauanleitung für Transportermoleküle. Deren Aufgabe ist es, Eiweiß- Bruchstücke (Peptide) von Viren und Bakterien festzuhalten und sie spezialisierten Zellen des Immunsystems zu präsentieren: Diese können so die Feinde erkennen und bekämpfen.
Die erfindungsgemäßen Peptide sind weiterhin dadurch charakterisiert, dass sie ein oder mehrere Aminosäuren aufweisen, die wiederum ein oder mehrere reaktive Seitenketten aufweisen.
Reaktive Seitenketten sind dadurch charakterisiert, dass sie Elektronendonoren und/ oder - akzeptoren beinhalten. Durch diese Eigenschaften ist es möglich, dass diese Seitenketten an der Ausbildung kovalenter Bindungen, koordinativer Bindungen, Wasserstoffbrücken-Bindungen oder van der Walls-Wechselwirkung zwischen Allergen / Irritans / Fremdsubstanz und Peptid, beteiligt sind.
Die erfindungsgemäßen Peptide weisen vorteilhaft mindestens eine Aminosäure mit einer freien Thiolgruppe auf. Die freie Thiolgruppe ist eine solche reaktive Seitenkette, wie beispielsweise in der Aminosäure Cystein.
So sind auch zum Beispiel das Peptid Gluthation (GSH) oder y-L-Glutamyl-L-cysteinylglycin bevorzugte Peptide mit reaktiver Seitenkette. g-L-Glutamyl-L-cysteinylglycin ist ein Tripeptid mit der Sequenz Glutaminsäure- Cystein - Glycin (Glu-Cys-Gly).
Erfindungsgemäß ist eine Seitenkette auch als Gruppe zu bezeichnen und so die Reaktivität und damit Allergenbindung sie enthaltener Peptide charakterisiert.
Werden Peptide erfindungsgemäß eingesetzt, die zunächst keine reaktive Gruppe, beispielsweise keine Thiolgruppe, enthalten, so werden diese durch den Zusatz von einer oder mehrerer Aminosäuren mit reaktiven Gruppen, beispielsweise Cystein, zu einem erfindungsgemäßen Peptid mit reaktiver Gruppe umgewandelt. Die Bezeichnung der erfindungsgemäßen Peptide kann dann dennoch die ursprüngliche Peptidbezeichnung umfassen, erweitert durch den Zusatz der reaktiven Aminosäure(n).
Da es gängige Bezeichnung von Peptiden ohne Thiolgruppe gibt, wie beispielsweise Oligopeptid-6, z.B. KDIFTRALN, ergibt sich mit dem Zusatz der Aminosäure Cystein ein erfindungsgemäßes erweitertes Peptid mit der Sequenz CKDIFTRALN, oder Cys-Oligopeptid-6.
Die erfindungsgemäßen Peptide umfassen vorteilhaft ein oder mehrere besonders chemisch aktive Aminosäuren wie Histidin, Cystein, Lysin, Tyrosin, Serin, Selenocystein, Homocystein, Asparagin, Asparaginsäure, Glutamin, Glutaminsäure, Methionin, Phenylalanin, Pyrrolysin.
Es zeigte sich, dass Allergene eine hohe Affinität für die Bindung an diese reaktiven Aminosäuren zeigen. Überraschenderweise können so diese spezifischen Peptide die eindringenden Substanzen binden und erfindungsgemäß verwendet werden.
Die Bindung erfolgt dabei auf verschiedenste Art und Weise, beispielsweise durch intermolekulare Wechselwirkungen, ionische-, Wasserstoffbrücken-, van derWaals- oder aber kovalente Bindung. Es kann dabei auch zu einer Überlagerung verschiedener Bindungsweisen kommen. Entscheidend ist allein der dadurch erzielte Effekt, die Barrierewirkung, dass die Allergene dadurch inaktiviert und am Eindringen in die Haut bzw. an der Anlagerung auf der Haut gehindert werden.
Erfindungsgemäß ist die Anlagerung der Fremdsubstanzen/Allergene an der Haut damit vermindert oder verhindert. Auch wenn sich die erfindungsgemäße Zubereitung und Peptide auf der Haut befinden, an die die Fremdsubtanzen gebunden sind, ist damit nicht eine Anlagerung an und auf der Haut zu verstehen.
Durch das Ausnutzen der Affinität der Allergene zu den reaktiven Aminosäureseitenketten bzw. - gruppen eröffnet die erfindungsgemäße Verwendung den lange gesuchten Weg zur Vermeidung oder Verminderung einer allergischen Hautreaktion bei Kontakt mit Allergenen.
Erfindungsgemäß ist damit ein neues Antiallergikum bzw. ein neuartiges antiallergisches Verfahren geschaffen worden, dass nicht die Symptome einer allergischen Erkrankung beseitigt oder zumindest lindert, sondern eine allergische Reaktion erst gar nicht entstehen lässt.
Reaktive Aminosäuren sind exemplarisch Cystein und Methionin. Beide enthalten ein Schwefel- Atom. Cystein ist eine polare Aminosäure und hat eine freie Thiol-Gruppe. Für die Struktur von Proteinen ist diese Eigenschaft von Cystein sehr wichtig, da so Polypeptidketten miteinander verbunden werden oder auch kovalente Verknüpfungen innerhalb einer Polypeptidkette entstehen, die die Konformation eines Proteins erheblich stabilisieren. Für die beiden über Disulfid-Brücken verbundenen Cysteine findet man manchmal auch den Begriff Cystin. In Metalloproteinen ist es häufig ein Cystein-Rest, der Zink-, Kupfer- oder Eisen-Atome bindet.
Ebenso ist das Hexahistidin in der Bindung von Metalloproteinen relevant.
Diese Wirkweise wird auch bei der Kopplung von Nickel ausgenutzt und so eine klassische Nickelallergie durch Aufträgen eines erfindungsgemäßen Peptids vermindert oder gar ganz vermieden.
Die erfindungsgemäßen Peptide können vorteilhaft sowohl natürlich vorkommende aber auch synthetisch hergestellte sowie modifizierte Aminosäuren beinhalten wie z.B. durch Acetylierung.
Beispielhaft bevorzugte Peptide sind
Gluthation (GSH), auch g-L-Glutamyl-L-cysteinylglycin, ist ein Tripeptid mit der Sequenz Glutaminsäure- Cystein - Glycin.
- Hexa-Histidin (HHHHHH)
- Ac-RFAACAA - ein Peptid mit der Sequenz Acetyl-Arginin - Phenylalanin - Alanin - Alanin - Cystein -Alanin - Alanin Das Peptid ist exemplarisch in Abbildung 1 dargestellt und die aktive Aminosäureseitenkette ist dort mit einem Pfeil gekennzeichnet.
- Ac-RFAALAA - ein Peptid mit der Sequenz Acetyl-Arginin - Phenylalanin - Alanin - Alanin - Lysin -Alanin - Alanin
- Ac-RAACAA
- Ac-RFACAA
- Ac-RFACA
- RFAALAA
- RFAACAA
- RAACAA
- RFACAA
- RFACA
Das Peptidsequenzenprotokoll dieser Peptide ist im Anhang aufgeführt.
Zur Anwendung werden ein oder mehrere erfindungsgemäße Peptide, die ein oder mehrere aktive Aminosäuren enthalten, auf die Hautoberfläche aufgetragen.
Die Erfindung umfasst daher auch topisch applizierbare, insbesondere kosmetische oder dermatologische, Zubereitungen enthaltend ein oder mehrere der erfindungsgemäßen Peptide.
Die topische Applikation kann dabei auf verschiedensten Wegen erfolgen, beispielsweise wie in Form einer kosmetischen Formulierung. Aufgetragen auf der Haut bildet sich so ein Schutzmechanismus, eine Barrierewirkung.
Einfache wässrige oder lipidhaltige Formulierungen bis hin zu komplex aufgebauten Zubereitungsformen sind dabei je nach Anwendungsgebiet möglich.
Die Haut kommt ständig mit Fremdsubstanzen aus der Umwelt, den Allergenen, in Kontakt. Durch den Schutzmechanismus treten die Fremdsubtanzen aus der Umwelt nun zunächst auf diese Barriere. Die potentiellen Allergene treffen auf die in der aufgetragenen Formulierung enthaltenen Peptide und können so direkt mit den aktiven Aminosäuren dieser Peptide reagieren, gebunden oder zumindest gehindert werden. Die Allergene sind somit abgefangen und können keine biologische Reaktion im Organismus mehr hervorrufen.
Es wird die Allergenreaktion mit Effektor (hauteigenes Peptid bzw. Protein) verhindert, bevor eine Allergie gegen das Allergen ausgeprägt werden kann.
Ebenso werden die Allergene abgefangen und damit die Auslösung der Allergie durch das spezifische Allergen (Elizitation) verhindert. Die Barriere Wirkung der erfindungsgemäßen Peptide sowie deren Verhinderung oder Verminderung allergischer Reaktionen konnte eindrucksvoll in den nachstehend erläuterten Untersuchungen gezeigt werden.
Eine Funktionsweise in den hier durchgeführten Experimenten beruht vordringlich auf dem Abfangen von Allergenen durch die Ausbildung von kovalenten Bindungen zu der reaktiven Gruppe, z.B. Aminosäure Cystein, nach dem Mechanismus einer nukleophilen Addition, auch SN1 und SN2.
Zum Nachweis der Barrierewirkung wurden nachstehende Untersuchungen durchgeführt.
Es konnte gezeigt werden, dass sowohl die biologische Modifikation durch Allergene in der Haut als auch biologische Signalkaskaden verhindert werden.
Gearbeitet wurde mit Phenion FTS Vollhautmodellen (Phenion, Henkel). Diese wurden 3 Tage bei 37°C und 7% C02 in deep-well Platten mit 3pM Porengröße der Zellkultureinsätze gehalten. Die Hautmodelle wurden in 1 ,5ml Air-Liquid-Interface Medium ohne Phenolrot gehalten. Das Medium wurde täglich gewechselt. Die Testsubstanzen wurden in Ethanol gelöst und für 24h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 24h Kultivierung wurden 25pl der Substanzlösung auf ein steriles Filterpapier getropft, welches zuvor auf das Hautmodell gelegt wurde. Zuvor wurde das Barrierepeptid (0,5mM AcRFAACAA) als Lösung in 100mM Phosphatpuffer (pH 7.5) auf das Modell aufgebracht. Alternativ wurde das Barrierepeptid zu 0,25 Gew.% in einer Formulierung aufgebracht.
Nach weiteren 24h Kultur wurden die Modelle geerntet und eine Hälfte in OCT mounting medium (VWR Q-Path Chemicals) eingebettet, die andere in Flüssigstickstoff schockgefroren. Der Überstand jedes Modells wurde gesammelt und bei -20°C gelagert.
Danach erfolgte die Analyse der Überstände (Abbildungen 2, 3 und 4).
Die Überstände der Phenion FTS Modelle wurden mit dem Bio-Plex Pro Human Cytokine Screening Panel (Bio-Rad) nach dem Herstellerprotokoll analysiert. Dieser Multiplex Immunoassay basiert auf Capture-Antikörpern, die gegen die jeweiligen Interleukine gerichtet und kovalent an Magnetkügelchen gekoppelt sind. Die Zytokinkonzentrationen werden basierend auf den Standardkurven vom Bioplex-System errechnet.
In den Abbildungen 2 bis 4 ist auf dery-Achse die Interleukin 8 (IL8) - bzw. Interleukin 6 (IL6) - Konzentration in pg/mL aufgetragen. IL 8, wie auch IL 6, sind Interleukine und damit Botenstoffe des Immunsystems. Typischerweise werden diese von den Hautzellen produziert und freigesetzt, wenn diese durch Allergene und Irritantien gereizt und/oder beschädigt werden.
Auf der x-Achse sind die auf das Hautmodel aufgebrachten Substanzen aufgeführt.
In Abbildung 2 ist ein erfindungsgemäßes Peptid (0,5 mM AcRFAACAA ) allein, 50mM DNCB und 50 mM DNCB plus Peptid (0,5 mM AcRFAACAA) aufgeführt.
Abbildung 3 zeigt das Peptid allein, 2,5mM CA (Cinnamaldehyde) und 2,5mM Cinnamaldehyde plus Peptid.
In Abbildung 4 ist auf dery-Achse die Interleukin 6 (IL6) Konzentration in pg/mL aufgetragen und auf der x-Achse, die auf das Hautmodel aufgebrachten Substanzen (Peptid allein, 2,5mM DNCB und 2,5mM DNCB plus Peptid).
DNCB (Dinitrochlorobenzol) ist ein starkes Allergen. CA (Cinnamic Aldeyhde) ist ein mittelstarkes Allergen. Eugenol ist ein Phenylpropanoid mit einem intensiven Geruch nach Gewürznelken. Eugenol ist sowohl ein Antioxidans als auch ein Prooxidans, auf Letzterem beruht seine (schleim)hautreizende, allergiefördernde Wirkung. Alle drei Allergene dienen als Modellallergene um die Barriere-Wirkung und Vermeidung bzw. Verminderung allergischer Reaktionen der erfindungsgemäßen Peptide zu zeigen.
In den Abbildungen 2 bis 4 ist deutlich das unveränderte Hautmodell zu erkennen (jeweils linker Balken). Durch Auftragung der Allergene ist eine starke korrosive Wirkung durch die Allergene DNCB und CA (mittlerer Balken) offenkundig. IL 8, wie auch IL 6, sind von den Hautzellen produziert und freigesetzt worden, was eine allergische Hautreaktion darstellt. Durch die Auftragung des Peptids in Kombination mit dem Allergen (rechter Balken) zeigt sich die Situation aber überraschend wie unverändert. Die Allergenwirkung wurde durch das Peptid vollständig aufgehoben.
Weitere Untersuchungsergebnisse (Immunohistochemie) zeigen Abbildungen 5 und 6.
Dazu wurden Hautbiopsien oder Hautmodelle in OCT medium eingebettet und in der Gasphase von Flüssigstickstoff eingefroren. Die gefrorenen Modelle wurden am Kryostat in 7pm Schichtdicke geschnitten und auf Objektträger aufgebracht. Nach Lufttrocknung für 1 bis 24h wurde 20min in 3,7% Paraformaldehyd bei RT fixiert. Nach 3 Waschschritten in PBS für je 5min, wurden die Schnitte in einer Lösung mit 0,2% T riton X-100 für 90min bei RT geblockt. Primärantikörper (e.g. DNP, Rabbit von Sigma (1 :200)), wurden entsprechend verdünnt und für mindestens 4h bei RT mit den Schnitten inkubiert. Hiernach wurde wieder dreimalig mit PBS für je 5min gewaschen. Der Sekundärantikörper (1 :800) und Hoechst Fluorescent Stain (1 :2000) wurden für 1-2 h bei RT im Dunkeln mit den Schnitten inkubiert. Nach erneutem dreimaligem Waschen wurden die Schnitte mit Fluoromount-G mounting medium (Sothern BioTech) gemounted und mit einem Deckglas gedeckelt. Die Fluoreszenzmikroskopie wurde mit einem Zeiss Axio Observer Z1 durchgeführt.
Die Fluoreszenzaufnahmen wurden mit ImageJ analysiert. Die DNP-gefärbten Gebiete wurden mit dem Threshold Colour tool gemessen.
Abbildung 5 zeigt die Hämatoxilin and Eosin (H&E) Färbung der Kryoschnitte, hier in schwarz weiß, im Original in Farbe.
Abbildung 5 zeigt die mit H&E gefärbte Kryoschnitte der Phenion Hautmodelle, A) nach Inkubation mit PBS (Kontrolle), B) nach Inkubation mit 0,5mM AcRFAACAA-Peptid (Kontrolle), C) nach Inkubation mit 2,5mM DNCB (starkes Allergen) und D) nach Inkubation mit DNCB und Peptid.
Deutlich zu erkennen ist das unveränderte Hautmodell in A) und B) sowie eine starke korrosive Wirkung des DNCBs in C). Neben einem sich auflösenden Stratum Corneum ist ein starker Zellkernverlust in der Epidermis in Folge der Allergenwirkung zu erkennen (Pfeile). In D) zeigt sich die Situation wie in A) und B). Die Allergenwirkung wurde durch das Peptid vollständig aufgehoben.
In weiteren Untersuchungen wurden gefrorene Schnitte aufgetaut und 10min in 3,7% Paraformaldehyd bei RT inkubiert. Nach drei PBS Waschschritten und einer Minute in Aqua dest. wird für 3 min in Hämatoxilinlösung gefärbt. Nach Waschen mit Wasser und 0,1% HCl werden die Schnitte für 3 min in Eosinlösung gefärbt und dehydriert in einer Ethanolserie von 70%, 95% und 100%. Die Schnitte wurden in Leica CV Ultra mounting medium gemounted und eingedeckelt. Die Bilder wurden mit einer Pannoramic Scan II (3DHistech) aufgenommen.
Abbildung 6 zeigt immunhistologische Analysen der Kryoschnitte von Phenion Hautmodellen,
A) nach Inkubation mit PBS (Kontrolle),
B) nach Inkubation mit 2,5mM DNCB (starkes Allergen) und
C) nach Inkubation mit DNCB und Peptid (0,5mM AcRFAACAA-Peptid).
Die Zellkernfärbung mit DAPI (4,6-Diamin-2-phenylindol) in blau (hier graue Punkte) und durch DNCB haptenisierte Proteine in rot (hier weiße Fläche). Abbildung 6 D zeigt die Quantifizierung der Rotintensität von A, B, C. Die Rotfläche über einem Grenzwert wurde ins Verhältnis der betrachteten Gesamtfläche gesetzt (y-Achse), die x-Achse zeigt die auf das Hautmodel aufgebrachten Substanzen (Peptid allein, 2,5mM DNCB und 2,5mM DNCB plus Peptid).
Deutlich zu erkennen ist das Fehlen der Rotfärbung in A) (kein Allergen eingesetzt), eine intensive Rotfärbung sowohl der Epidermis als auch in Teilen der Dermis in B), welche auf eine sehr starke Reaktion von DNCB mit den Proteinen der Haut und somit auf eine starke Haptenisierung hinweist. In C) ist die extrem reduzierte Rotfärbung zu erkennen, die zeigt, dass die Allergenwirkung durch Einsatz des Peptides nahezu vollständig aufgehoben wurde. Dies ist in D) quantifiziert. (Rot - in schwarz/weiß Kopie - weiß).
Abbildungen 7 A bis E, 8 und 9 zeigen Untersuchungen zur Reaktivität erfindungsgemäßer Peptide mit Allergenen über die Zeit (x-Achse) bzw. nach 24 h. Auf der y-Achse ist die Absorption aufgetragen. Die Peptid-Allergenreaktionen wurden gemäß eines Direct Peptide Reactivity Assays umgesetzt. Der Test wird als in-chemico-Methode bezeichnet - das heißt, es werden keine Zellen verwendet, sondern es wird eine chemische Reaktion durchgeführt.
Der Direct Peptide Reaction Assay (DPRA) ist eine OECD-validierte Testmethode.
Der Nachweis des nativen, noch ungebunden Peptides erfolgt über die Umsetzung mit Ellmans- Reagenz und entsprechender Absorptionsmessung. Der Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA) ist eine chemische Methode zur Vorhersage der epidermalen Proteinbindung. Der DPRA verwendet beispielsweise HPLC, um die Abreicherung von Peptiden in Lösung nach Exposition gegenüber Testchemikalien zu messen.
In den durchgeführten Untersuchungen (Abbildungen 7) befasst sich der DPRA mit der Reaktivität der Testchemikalien, Eugenol und DNCB, mit den erfindungsgemäßen Peptiden (je zu 0,5mM) und bis zu 24-stündiger Inkubation. Die im Test verwendete Messung ist die Abreicherungsrate dieser Peptide und wird über ein weit verbreitetes HPLC-UV-Verfahren bewertet.
Als erfindungsgemäße Peptide wurden beispielhafte Vertreter, RFAACAA, RAACAA, RFACAA, RFACA, GSH, ausgewählt, die die erfinderische Anwendung über die gesamte Breite der erfindungsgemäßen Peptide darstellt
Deutlich zu erkennen sind in den Abbildungen 7 A bis E die Absorptionsabnahmen durch die Reaktion des Peptides mit Allergen, Eugenol (schwarz) und DNCB (gestrichelt), was die erfinderische Allergenabfangfunktion der erfindungsgemäßen Peptide belegt.
Bei der DPRA Methode wird als Messgröße die Absorption bei 415 nm ermittelt. Standardmäßig ist bei den durchgeführten Untersuchungen die Allergen-Konzentration auf 5mM und somit 10-mal der Konzentration des eingesetzten Peptids (0,5mM).
Die in der Abbildung 8 und 9 dargestellten Reaktionsverläufe wurden colorimetrisch durch die Umsetzung des Peptids mit Ellmann’s Reagenz im Photometer ermittelt. Dabei wird DTNB ((5,5'-Dithiobis-2-nitrobenzoesäure, Ellmanns Reagenz) gespalten und an den SH-Rest der Aminosäure Cystein der erfindungsgemäßen Peptide (Ac-RFAACAA, RFAACAA) gebunden.
Zugleich ist der SH-Rest die reaktive Bindestelle des Peptids mit den Allergenen. Die Farbreaktion mit DTNB (Umschlag von farblos zu gelb) steht dabei in Konkurrenz zur Allergenreaktion. D.h. je besser das Allergen mit dem Peptid reagiert, desto weniger Peptid steht noch für die Reaktion mit dem Nachweisreagenz zur Verfügung, also desto geringer ist die resultierende Gelbfärbung. Diese Messung bei 415nm ist in der Abbildung 9 dargestellt.
Alternativ kann die Abnahme des Peptids in der Allergenreaktion auch per UV-Detektor nach einer HPLC-Auftrennung ermittelt werden, wie es in Abbildung 8 dargestellt ist.
Abbildung 8 zeigt den Abfall (Depletion in %) des Allergens Eugenol (5 mM Eu) in Anwesenheit des Peptids Ac-RFAACAA (0,5mM) über die Zeit (24h) im Vergleich zum Peptid allein.
Abbildung 9 zeigt die Allergenreduktion (Eugenol, Urushiole) im DirectPeptideReactionAssay (DPRA) nach 24h Reaktion, n=3.
In Abbildung 9 ist der Abfall des Peptids gegen Eugenol und gegen verschiedene Urushiol- Derivate dargestellt. Die Kontrolle ist das Peptid im Puffersystem ohne Allergen, d.h. es wird statt Allergen nur dessen Lösemittel (Ethanol) zugesetzt.
Es wurden Urushiole der nachstehenden Struktur eingesetzt.
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Die untersuchten Urushiole unterscheiden sich in der Seitenkette=R in der Sättigung.
Es wurden Urushiol mit R = C15 einfach (C15:1), zweifach (C15:2) bzw. dreifach (C15:3) ungesättigt untersucht. Die Ergebnisse zeigen eine sehr hohe Reaktivität und damit Protektivität der erfindungsgemäßen Peptide auch gegen Urushiole. Die Peptide, insbesondere Ac-RFAACAA, RFAACAA, zeigen eine sehr hohe Reaktivität und damit Protektivität insbesondere gegen die Urushiol Strukturen l-V.
Bei Urushiolen handelt es sich um das stärkste natürlich vorkommende Allergen, welches darüber hinaus sich für viele Sensibilisierungen verantwortlich zeigt, wie zuvor ausgeführt. Urushiole sind der wesentliche sensibilisierende Bestandteil der Sumach Gewächse, wie dem Giftsumach Toxicodendron quercifolium, darunter vor allem in den verschiedenen Rhus-Arten, wie Gift Efeu (Toxicodendron radicans / Poison ivy), Gifteichen (Toxicodendron diversilobum / poison oak) und Lackbaum (Rhus verniciflua), sowie in Toxicodendron rydbergii, Toxicodendron toxicarium, Toxicodendron vernix.
Bei ca. 50-75% aller US-Amerikaner lässt sich die Allergie gegen Urushiole auslösen, was eine vorhergehende Sensibilisierung voraussetzt. Diese Kontaktdermatitis betrifft 10-50 Millionen Amerikaner pro Jahr.
Die Kontaktallergie gegen Urushiole ist eine ernstzunehmende Berufskrankheit beispielsweise bei Landwirtschaft- und Forstarbeitern und Feuerwehrleuten, aber auch aller Erholungssuchender, die sich in der Natur bewegen. In den USA sind sie für 7,1 Millionen Arztbesuche und 430000 stationärer Krankenhausaufenthalte verantwortlich. Beispielsweise verursacht diese Kontaktallergie 10% aller verletzungsbedingten Ausfallzeiten der US Forest Services, und ungefähr ein Drittel der Waldarbeiter von Kalifornien, Oregon und Washington sind arbeitsunfähig während der Waldbrandsaison aufgrund dieser Reaktionen.
Erfindungsgemäß ist hier nun eine mögliche Abhilfe gegeben.
Die erfindungsgemäßen Zubereitungen umfassend die erfindungsgemäßen kurzkettigen Peptide führen zu einer Linderung der allergischen Hautreaktion auf Bestandteile von Poison Ivy.
Alle Untersuchung zeigen eindrucksvoll die Allergen-Barrierewirkung der erfindungsgemäßen Peptide, eine Verhinderung oder Verminderung des Eindringens und/oder der Anlagerung von Fremdsubstanzen und/oder Allergene auf und/oder in die Haut.
Die zahlreichen Untersuchungen der unterschiedlichen Peptide zeigen exemplarisch die Barriere Wirkung sowie Verhinderung bzw. Verminderung allergischer Reaktionen für alle erfindungsgemäßen Peptide mit einer Aminosäurezahl von 2 bis 10, wobei mindestens eine Aminosäure ein oder mehrere reaktive Seitenketten aufweist. Neben der reinen Wirkungsnachweise wurden auch Tests mit unterschiedlichen Konzentrationen der Allergene und Peptide vorgenommen.
Die Allergene, wie beispielsweise DNCB, wurden im Bereich von 10; 5; 2,5; 0,5; 0,05; 0,005; 0,0005 mM, Cinnamaldeyde im Bereich von 5; 2,5; 0,5; 0,05; 0,0005 mM und Eugenol: 5, 2,5; 0,05; 0,0005 mM getestet. Die Peptidkonzentrationen wurden im Bereich von 4, 2, 0,5; 0,25 mM variiert.
In allen Anteilsbereichen und Verhältnissen wurden signifikante Barrierewirkungen erzielt.
So erzielte das Peptid der Sequenz HHHHHH = His His His His His His eine Barrierewirkung gegenüber Metallen, insbesondere gegenüber Nickel.
Vorteilhaft können die erfindungsgemäßen Peptide eingearbeitet werden in übliche kosmetische und dermatologische Zubereitungen, welche in verschiedenen Formen vorliegen können. So sind z.B. eine Lösung, eine Emulsion vom Typ Wasser-in-ÖI (W/O) oder vom Typ Öl-in-Wasser (O/W), oder eine multiple Emulsionen, beispielsweise vom Typ Wasser-in-ÖI-in-Wasser (W/O/W) oder Öl-in-Wasser-in-ÖI (O/W/O), eine Hydrodispersion oder Lipodispersion, ein Gel, einen festen Stift oder auch ein Aerosol bevorzugte Zubereitungsformen.
Der Anteil an ein oder mehreren erfindungsgemäßen Peptiden in topisch applizierbaren Zubereitungen wird vorteilhaft im Bereich von 0,01 bis 10 Gew.%, insbesondere im Bereich von 0,1 bis 5 Gew.%, besonders bevorzugt im Bereich von 0,2 Gew.% bis 5 Gew.% zu gewählt, bezogen auf die Gesamtmasse der Zubereitung.
Bevorzugte Applikationsformen der erfindungsgemäßen Peptide sind Emulsionszubereitungen, Gele sowie Sprayformulierungen.
Erfindungsgemäß hergestellte Emulsionen z.B. in Form einer Creme, einer Lotion, einer kosmetischen Milch sind vorteilhaft und enthalten z.B. Fette, Öle, Wachse und/oder andere Fettkörper, sowie Wasser und einen oder mehrere Emulgatoren, wie sie üblicherweise für einen solchen Typ der Formulierung verwendet werden.
Bekanntermaßen sind Peptide anfällig für Oxidations- und/oder Abbaureaktionen, die sich durch Verfärbungen oder Fehlgerüche bemerkbar machen.
Um die Reaktivität, d.h. die Bindung der Allergene an die reaktiven Gruppen der Peptide, zu verbessern, ist es vorteilhaft zusätzlich Antioxidantien und/oder Stabilisatoren zum Schutz des Peptids den Zubereitungen hinzuzufügen. Vorteilhaft umfassen die erfindungsgemäßen peptidhaltigen Zubereitungen ein oder mehrere Antioxidantien. Vorteilhaft umfassen die erfindungsgemäßen Zubereitungen daher ein oder mehrere Antioxidationen gewählt aus der Gruppe a-Glycosylrutin, Isoquercitin, Tocopherol (Vitamin E), Citronensäure, Citratpuffer, BHT (Butylhydroxytoluol) und insbesondere EDTA (Ethylendiamintetraacetat).
Der Anteil an ein oder mehreren Antioxidantien bzw. Stabilisatoren in topisch applizierbaren Zubereitungen wird vorteilhaft im Bereich von 0,01 bis 2 Gew.%, insbesondere im Bereich von 0,05 bis 1 ,5 Gew.%, gewählt, bezogen auf die Gesamtmasse der Zubereitung.
Weiter vorteilhaft weisen die erfindungsgemäßen Zubereitungen einen pH-Wert im Bereich von 4 bis 8, insbesondere im Bereich von 4 bis 7, auf.
Zur Stabilisierung trägt erstaunlicherweise auch der pH-Wert der Zubereitung bei. Ein pH-Wert der Zubereitung im sauren Bereich, vorteilhaft kleiner 7, insbesondere kleiner 6, beeinflusst die Stabilität des Peptids vorteilhaft.
Die Anpassung des pH-Wertes gelingt mit üblichen dem Fachmann bekannten Stoffen und Puffersystemen.
Die Vorteile des Zusatzes an Antioxidationen und die Wahl des pH-Wertes liegt somit einerseits in der Stabilitätsverbesserung und andererseits in einer breiteren hautfreundlicheren Anwendungsweise.
Vorteilhaft umfassen die erfindungsgemäßen Zubereitungen ein oder mehrere Filmbildner.
Weiterhin können die Peptide chemisch modifiziert werden, um die physikochemischen Eigenschaften zu verbessern. So erhöht beispielsweise die Derivatisierung mit Fettsäureresten (z. B. Acetyl-, Caproyl-, Undecenoyl- oder Palmitoyl-) die Lipophilie. Andererseits können chemische Modifizierungen zu einer besseren Stabilität des Peptids beitragen und es so beispielsweise vor dem Abbau durch Peptidasen schützen.
Mittels sogenannter Penetrationsenhancer, Lösevermittler und physikalischer Methoden wird die Permeabilität der Haut erhöht und außerdem die Verteilung in der Haut weiter begünstigt.
Ein Zusatz an Lösevermittlern ist somit vorteilhaft.
Es ist dem Fachmanne natürlich bekannt, dass anspruchsvolle kosmetische Zusammensetzungen zumeist nicht ohne die üblichen Hilfs- und Zusatzstoffe denkbar sind. Darunter zählen beispielsweise Konsistenzgeber, Füllstoffe, Farbstoffe, Emulgatoren, zusätzliche Wirkstoffe wie Vitamine oder Proteine, Lichtschutzmittel, Stabilisatoren, Insektenrepellentien, Alkohol, Wasser, Salze, EDTA, antimikrobiell, proteolytisch oder keratolytisch wirksame Substanzen usw., wobei auf den Zusatz potentiell möglicher Allergene natürlich bevorzugt verzichtet wird.
Mutatis mutandis gelten entsprechende Anforderungen an die Formulierung medizinischer Zubereitungen.
Allergieauslösenden Substanzen, Allergene, werden durch die erfindungsgemäßen Peptide bestehend aus 2-10 Aminosäuren, wobei mindestens eine Aminosäure ein oder mehreren reaktiven Seitenketten aufweist, abgefangen. Diese Barrierewirkung der Peptide, insbesondere in topisch applizierbaren Zubereitungen, führt zu einer neuartigen antiallergischen Therapieform.
Beispielzubereitungen
Die Zahlenangaben sind Gewichtsanteile bezogen auf die Gesamtmasse der Zubereitung.
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Claims

Patentansprüche
1 . Peptide zur Verwendung bei der Behandlung atopischer Dermatitis und/oder allergischer Kontaktdermatitis dadurch gekennzeichnet, dass das oder die Peptide aus der Gruppe der Peptide mit 2 bis 10 Aminosäuren gewählt werden und zumindest eine dieser Aminosäuren eine oder mehrere reaktive Seitenketten aufweist.
2. Peptide nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass zumindest eine dieser Aminosäuren eine oder mehrere freie Thiolgruppen aufweist.
3. Peptide nach einem der vorstehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass die Peptide mindestens eine Aminosäure gewählt aus der Gruppe Histidin, Cystein, Lysin, Tyrosin, Serin, Selenocystein, Homocystein, Asparagin, Asparaginsäure, Glutamin, Glutaminsäure, Methionin, Phenylalanin und/oder Pyrrolysin enthalten.
4. Peptide nach einem der vorstehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass die Peptide gewählt werden aus der Gruppe GSH, HHHHHH, Ac-RFAACAA, Ac-RFAALAA, RFAALAA, RFAACAA, Ac-RAACAA, RAACAA, Ac-RFACAA, RFACAA, Ac-RFACA und/oder RFACA.
5. Topisch applizierbare Zubereitung umfassend ein oder mehrere Peptide dadurch gekennzeichnet, dass die Peptide aus der Gruppe der Peptide mit 2-10 Aminosäuren gewählt werden und zumindest eine dieser Aminosäuren eine oder mehrere reaktive Seitenketten aufweist.
6. Zubereitung nach Anspruch 5 dadurch gekennzeichnet, dass zumindest eine dieser Aminosäuren eine oder mehrere freie Thiolgruppen aufweist.
7. Zubereitung nach Anspruch 5 oder 6 dadurch gekennzeichnet, dass die Peptide mindestens eine Aminosäure gewählt aus der Gruppe Histidin, Cystein, Lysin, Tyrosin, Serin, Selenocystein, Asparagin, Asparaginsäure, Glutamin, Glutaminsäure, Methionin, Phenylalanin und/oder Pyrrolysin enthalten.
8. Zubereitung nach Anspruch 5, 6 oder 7 dadurch gekennzeichnet, dass die Peptide gewählt werden aus der Gruppe GSH, HHHHHH, Ac-RFAACAA, Ac-RFAALAA, RFAALAA, RFAACAA, Ac-RAACAA, RAACAA, Ac-RFACAA, RFACAA, Ac-RFACA und/oder RFACA.
9. Zubereitung nach einem der Ansprüche 5 bis 8 dadurch gekennzeichnet, dass der Anteil an Peptiden mit 2-10 Aminosäuren im Bereich von 0,01 bis 10 Gew.%, insbesondere im Bereich von 0,1 bis 5 Gew.%, besonders bevorzugt im Bereich von 0,2 Gew.% bis 5 Gew.% gewählt wird, bezogen auf die Gesamtmasse der Zubereitung.
10. Zubereitung nach einem der Ansprüche 5 bis 9 dadurch gekennzeichnet, dass die Zubereitung in Form einer Emulsion, eines Geles oder Sprays formuliert ist.
11. Zubereitung nach einem der Ansprüche 5 bis 10 dadurch gekennzeichnet, dass die Zubereitung ein oder mehrere Antioxidantien und/oder Stabilisatoren enthalten.
12. Zubereitung nach Anspruch 11 dadurch gekennzeichnet, dass der oder die Antioxidationen oder Stabilisatoren gewählt werden aus der Gruppe a-Glycosylrutin, Isoquercitin,
Tocopherol (Vitamin E), Citronensäure, Citratpuffer, BHT (Butylhydroxytoluol) und EDTA (Ethylendiamintetraacetat).
13. Zubereitung nach einem der Ansprüche 5 bis 12 dadurch gekennzeichnet, dass die Zubereitung einen pH-Wert kleiner 7, insbesondere kleiner 6, vorteilhaft im Bereich von 4 bis 7, aufweist.
14. Topisch applizierbare Zubereitung nach einem der Ansprüche 5 bis 13 zur Verhinderung der Verminderung des Eindringens und/oder der Anlagerung von Fremdsubstanzen und/oder Allergene auf der Haut und/oder in die Haut.
15. Zubereitung nach Anspruch 14 zur Verhinderung der Verminderung des Eindringens und/oder der Anlagerung von Kontaktallergenen auf der Haut und/oder in die Haut.
16. Zubereitung nach einem der Ansprüche 5 bis 15 zur Verhinderung oder Verminderung allergischer, insbesondere Kontaktallergischer, Reaktionen in oder auf der Haut.
17. Nicht-therapeutische Verwendung von topisch applizierbaren Zubereitungen nach einem der Ansprüche 5 bis 16 als Hautbarriere gegenüber Fremdsubstanzen und/oder Allergenen, insbesondere Kontaktallergenen.
18. Nicht-therapeutische Verwendung von topisch applizierbaren Zubereitungen nach einem der Ansprüche 5 bis 16 zur Verhinderung der Verminderung des Eindringens und/oder der Anlagerung von Fremdsubstanzen und/oder Allergene, insbesondere Kontaktallergenen, auf der Haut und/oder in die Haut.
19. Kosmetisches Verfahren zum Allergenschutz, insbesondere Kontaktallergenschutz, indem eine Zubereitung nach einem der Ansprüche 5 bis 16 auf die Haut aufgetragen wird
20. Verfahren nach Anspruch 19 zur Verhinderung oder Verminderung allergischer Reaktionen in oder auf der Haut.
21. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20 zur Verhinderung oder Verminderung atopischer Dermatitis und/oder allergische Kontaktdermatitis.
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