DE1642107A1

DE1642107A1 - Verwendung eines Pflanzenextrakts als Fungicid

Info

Publication number: DE1642107A1
Application number: DE19671642107
Authority: DE
Inventors: Meiffren Marcel Georges
Original assignee: RECH SCIENT ET TECH QUTRE MER
Current assignee: RECH SCIENT ET TECH QUTRE MER
Priority date: 1966-03-03
Filing date: 1967-03-02
Publication date: 1971-04-22
Also published as: FR1514942A; US3624211A; LU53097A1; ES337453A1; GR33443B; CH473530A; NL140711B; OA03413A; BE694794A; NL6703486A

Description

PATENTANWÄLTE

DR.-ING. VON KREISLER DR.-ING. SCHDNWALD 1642107 DR.-ING. TH. MEYER DR. FUES DIPL.-CHEM. ALEK VON KREISLER DIPL-CHEM. CAROLA KELLER DR.-ING. KLDPSCH

KÖLN1, DEICHMANNHAUS

5. Mai 1970 Kl/Br.

OFFICE DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE ET TECHNIQUE OUTRE-MER, 24, Rue Bayard, Paris (Frankreich).

Verwendung eines Pflanzenextrakts als Fungieid und Baktericid

Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Extrakts einer rosenartigen Pflanze, insbesondere ihrer Blätter, als bakterieides und fungicides Produkt. Diese Pflanze ist insbesondere unter der Bezeichnung Prunus lusitanica (Linne) oder Cerasus lusitanica (L) (Miller) bekannt.

Für die Zwecke der Erfindung können auch Abarten dieser Pflanzen verwendet werden, die im Index Kewensis Plantarum Phaneroganarum die folgende Bezeichnung trägt: "Prunus lusitanica Gueldenst.· ex Ledeb. Fl. Ross, ii, 9=P. laurocerasus. lusitanica, Linn.Sp. Pl.475 Europe austr.", Band III, Seite 6j56, 1894. Diese Pflanze findet sich vornehmlich in Portugal.

Gemäß der Erfindung wurde gefunden, daß die mit anorganischen oder organischen Lösungsmitteln erhaltenen Extrakte der genannten Pflanze eine fungistatische und bactericide Wirkung haben. Als Lösungsmittel eignen sich beispielsweise Wasser, Trichloräthylen, Benzol, Petroläther, Ä'thyläther, Chloroform oder A'thanol. Durch Extraktion mit diesen Lösungsmitteln geht eine gewlnse Menge der» Wirkstoffs aus der Pflanze in den Lö~ in Lörnjng, und zwar in einer Menge, die in Ab«

Neue Unterlagen ,M. 7 3, as», = η, , ο a, 3 ,,, ^_Λ, _Jnlww ». 4.9. mn ^109817/1"6 BADORIGINAL

hängigkeit von den Extraktionsbedingungen, insbesondere von der Art des Lösungsmittels verschieden ist.

Ein qualitativer Vergleich der Wirkungen, die von verschiedenen Extrakten auf phytopatogene Pilze ausgeübt werden, wurde vorgenommen. Hierbei wurde nach einer Methode gearbeitet, die in der Bakteriologie bei Antagonismus-Versuchen angewendet wird. Papierblätter wurden mit den zu untersuchenden Extrakten befeuchtet und in Petrjsshalen gelegt, die dicht mit den phytopatogenen Pilzen belegt waren. Von den verwendeten Lösungsmitteln ergaben Wasser und Trichloräthylen die wirksamsten Extrakte. Die mit Wasserdampf und Trichloräthylen erhaltenen Extrak-P te erzeugten die größten Hemmungszonen, während gleichzeitig bei der gesamten Petrischale eine fungicide Wirkung festgestellt wurde. Die mit Benzol, Petroläther und A'thyläther erhaltenen Extrakte üben in dieser Reihenfolge eine merkliche Hemmung von unterschiedlicher Intensität aus.

Bei einer vorteilhaften Methode zur Gewinnung der verwendeten Substanz mahlt man die an der Luft getrockneten Blätter zu einem feinen und gleichmäßigen Pulver, mischt dieses Pflanzenpulver mit Wasser, rührt das Gemisch und läßt längere Zeit quellen, worauf man Wasserdampf durchleitet oder destilliert.. Das Gemisch enthält vorzugsweise etwa 8 Teile des Pflanzen-► pulvers und 100 Teile Wasser. Die Einweichdauer beträgt vorteilhaft etwa 48 Stunden.

Nähere Einzelheiten über die Bedingungen der Extraktion mit Trichloräthylen sowie durch Destillation oder Wasserdampfdestillation werden in den folgenden Beispielen beschrieben.

Beispiel 1; Extraktion mit Trichloräthylen

'Die Blätter von "Prunus lusitanicus" wurden mit Wasser gut gewaschen und dann getrocknet. Sie wurden dann zu kleinen StUkken geschnitten und in Trichloräthylen gemahlen, bis sich ein homogener Brei gebildet hatte, der auf Papier in einen Ver-

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dampferkolben filtriert und mit Trichlorathylen gespült wurde, bis die Flüssigkeit farblos war. Dann wurde Cellulosepulver zum Piltrat gegeben, das in einem rotierenden Verdampfer unter vermindertem Druck eingeengt wurde, wobei das Wasserbad bei einer Temperatur von etwa 35°C gehalten wurde. Die •Verdampfung wurde abgebrochen, wenn der Extrakt trocken geworden war. Das auf diese Weise erhaltene Pulver wurde mit Petroläther (4o bis 65 C) an einer Säule aus Cellulosepulver eluiert. Die erste Fraktion, die durch das Lösungsmittel eluiert wurde, enthielt den Wirkstoff und war gelb gefärbt. Die Eluti-n wurde abgebrochen, wenn das Eluat farblos wurde. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels konnte diese Fraktion mit Vaselinöl oder Wasser aufgenommen werden. Sie wurde in diesen beiden Formen in den später beschriebenen biologischen Versuchen verwendet.

Beispiel 2: Herstellung des Wirkstoffs durch Destillation

oder Wasserdampfdestillation

An der Luft getrocknete Blätter von Prunus lusitanica in einer Menge von 4o g wurden gemahlen. Das erhaltene Pulver wurde in einem Mischer mit 450 ml Wasser etwa 10 Minuten gerührt. Der erhaltene Brei wurde für die Destillation bzvi. V/asserdampf destillation in einen Kolben gegossen. Man ließ etwa 48 Stunden einweichen. Das Destillat wurde anschließend in einer Vorlage aufgefangen, die vorzugsweise mit einem Eisbad gekühlt wurde.

Für die Destillation wurde auf den in eine elektrische Heizvorrichtung gestellten Kolben eine mit Einstülpungen versehene Vigreux-Kolonne aufgesetzt, die ihrerseits mit Hilfe eines schrägen Verbindungsstücks mit einem geraden Kühler verbunden war. Die kondensierten Dämpfe flössen nach der Destillation durch ein gekrümmtes Rohr, das in die Vorlage tauchte.

Bei der Wasserdampfdestillation wird der Wanserdampferzeuger (Behälter, der dan zum Sieden gebrachte Wasser enthält) mit

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dem Kolben, der den Brei enthält, mit einem Schlauch verbunden, der durch ein gebogenes Glasrohr, das bis zum Boden des Kolbens geführt ist, verlängert ist. Am gleichen Behälter ist mit einem gekrümmten Verbindungsstück ein gerader Kühler befestigt, wo die Dämpfe, die den Wirkstoff mitnehmen, kondensiert werden. Der Wirkstoff wird wie vorher in einem vorzugsweise gekühlten Behälter aufgefangen.

Die eigentliche Identifizierung der fungiciden und bactericiden Substanz erfolgt durch DünnschichtChromatographie. Die Platten für die Chromatographie werden aus einem Gemisch von 100 ml einer 0,02-molaren Natriumacetatlösung und 50 g Kieselgel erhalten, das im Handel unter der Bezeichnung "Kieselgel G" erhältlich ist. Die.se Platten werden 1 Stunde bei 110⁰C aktiviert.

Für den Nachweis des Wirkstoffs wurden stark konzentrierte Trichloräthylenextrakte (Beispiel 1) oder durch Destillation oder Wasserdampfdestillation (Beispiel 2) erhaltene wäßrige Lösungen verwendet. Ein Fleck der Substanz wird in der Nähe des unteren Randes der Platte aufgebracht, worauf der untere Rand der Platte in das für die.Chromatographie gewählte Lösungsmittel getaucht wird. Durch Verdampfen einer 0,2 $igen Lösung von Dichlorfluoreszein in 95 $igem Äthanol erscheint auf der Platte nach etwa 30 Minuten im Ultraviolettlicht ein gelbbraunvioletter Flecken auf leicht fluoreszierendem gelbem Untergrund.

Die Rf-Werte der so entwickelten Substanz, gerechnet für vier Lösungsmittel, sind nachstehend angegeben:

Rf-Wert

1) Äthyläther 0,96

2) Äthyläther/Trichloräthylen 1:2 0,56

3) Chloroform-Essigsäure 95:0,5 0,22

4) Benzol-0,In-Ammoniak 100:10 0,22

Es ist festzustellen, daß die-Eigenschaften der Flecken, die 109817/1936

aus dem Trichloräthylenextrakt und aus dem Destillat erhalten wurden, vollständig identisch waren.

Es ist zu bemerken, daß dem Wirkstoff meistens ein Fleck vorausgeht, der im sichtbaren Licht gelb und im Ultraviolettlicht fluoreszierend gelb und blau umrandet ist und nach Entwicklung mit Dichlorfluoreszein lebhaft gelb erscheint und hierbei stark fluoresziert. Die Rf-Werte dieses letztgenannten Flecks sind nachstehend für die vier genannten Lösungsmittel aufgeführt :

Rf-Wert

1) Ä'thy lather 0,96

2) Kthyläther/Trichloräthylen 1:2 0,92

3) Chloroform-Essigsäure 95:0,5 0,91

4) Benzol-0,ln-Ammoniak 100:10 0,86

Für die nachstehend beschriebenen Anwendungen wurden entweder die eigentliche gereinigte Substanz oder ihre Lösung, d.h. die rohen Extrakte, die durch Behandlung der Blätter von Prunus lusitanica mit verschiedenen Lösungsmitteln, z.B. Wasser und insbesondere Trichloräthylen hergestellt wurden, oder durch Destillation oder Wasserdampfdestillation erhaltene wäßrige Lösungen verwendet. Die fungicide Wirkung der erfindungsgemäß verwendeten Substanz wurde in der folgenden Weise ermittelt: Verwendet wurde sowohl ein flüssiges Medium, nämlich die Czapek-Dox-Nährlösung der folgenden Zusammensetzung:

Destilliertes Wasser Natriumnitrat Kaliumchlorid Monokaliumphosphat Magnesiumsulfat Ei.r;en (II) -sulfat Glucose

air; auch ejrui fe.stoc Medium, der sog. üabouraud-Nährboden. Dor J'--tzt^eä-ainto Nährboden int ein maltosehaltiger Nährboden

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1000	5	ml
2		g
0,	5	g
1	01	S
o,		g
o,	g
50	g

für Versuchszwecke. Zu seiner Herstellung geht man von 1000 ml destilliertem Wasser und 10 g Pepton aus, die man einige Minuten kocht. Man gibt anschließend 20 g Agaragar zu und läßt etwa 45 Minuten in einem Autoklaven bei 115 bis 120⁰C. Außerdem stellt man eine Lösung von 40 g roher Maltose in einer geringen Menge heißem destilliertem Wasser her und gibt sie zu der aus dem Autoklaven genommenen peptonhaltlgen Agar-Agar-Nährlösung. Man rührt den Nährboden, sterilisiert ihn etwa 20 Minuten bei 110°C und la;
festen Nährboden erhält.

Minuten bei 110°C und läßt abkühlen, wobei man den gewünschten

Bei Verwendung des vorstehend genannten flüssigen Czapek-Box-Nährbodens mischt man den Wirkstoff in Form einer Lösung diesem Nährboden zu, ohne ein anderes antibakterielles Antibio-

erfindungsgemäß hergestellte. tikum zuzusetzen, da der/aktive Extrakt bactericide und bakteriostatische Wirkung hat. Bei Verwendung des_ beschriebenen festen Sabouraud-Nährbodens schmilzt man vorher das Agar-Agar · dieses Nährbodens bei einer Temperatur von etwa 50 C und gibt dann den Wirkstoff in Form einer Lösung zu. In bekannter Weise bringt man in beiden Fällen Reagenzgläser In eine schräge Lage und beimpft dann die Nährböden mit den zu untersuchenden. Pilzen und vergleicht mit Vergleichslcultüren der gleichen Pilze. Die Versuche können auch in Petrischalen durchgeführt werden.

Eine in der beschriebenen Weise durchgeführte Reihe von Versuchen hat ergeben, daß bei einer Wirkstoffdosis, die 16 mg Trockengewicht des pflanzlichen Materials pro Milliliter des Reaktionsmediums entspricht, die erfindungsgemäß verwendete Substanz in reiner Form oder in Form von Extrakten des Wachstums von Fadenpilzen, insbesondere der folgerndem Schädlinge vollständig hemmt:
Phytopato.qene Pilze

Colletotrichum coffeanum Fusariuma xylarloides Pestalozzia coffeicola Helminthosf-arium oryzae

Marasmius perniciosus Botrytis ciierea

Phytophttaora. palaiivora

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Die systematische Untersuchung der fungiciden Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Wirkstoffs wurde in Versuchen vorgenommen, bei denen wäßrige Lösungen des aktiven Extraktes.zerstäubt wurden. Bei diesen Versuchen konnte Wirksamkeit gegen Oidium von Getreide,verursacht durch Erisyphe graminis, und gegen Brand von Bohnen, verursacht durch Uromyces appendiculatus, "nachgewiesen -'werden.

Die erfindungsgemäß verwendete Substanz hemmt ferner vollständig bei einer Dosis von 9 mg/ml, gerechnet als Trockengewicht des pflanzlichen Ausgangsmaterials, das Wachstum von pathogenen Pilzen bei Mykosen des Menschen, insbesondere bei

Epicoccum flocosum

Microsporum canis '

Trichophyton agrophytes

Aspergillus fumigatus

Absidia corymbifera

Histoplasma capsulatum.

Außerdem wird bei einer höheren Dosis, die 28 mg/ml trockenem pflanzlichem Ausgangsmaterxal entspricht, Hemmung des Wachstums von Hefeformen, insbesondere von Candida albicans, festgestellt.

Bei Tierversuchen hat sich gezeigt, daß der erfindungsgemäß verwendete Wirkstoff eine sehr schnelle Wirkung auf den Schorf bei Meerschweinchen und auf die Candidose der Vorhaut des Meerschweinchens ausübt.

Außerdem hat die erfindungsgemäß verwendete Substanz eine weitgehende antibacterielle Wirkung. Beispielsweise wurden Versuche an vier Bakterien vorgenommen, die zur Zeit für die Erprobung von Antibiotika und bei der Erprobung von Wirkstoffen gegen pathogene Bakterien, nämlich zwei grampositive und zv/ei gramnegative Bakterien, verwendet werden.

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Vollständige Hemmung des Wachstums auf festem Sabouraud-Nährboden und auf flüssigem Panassay-Nährboden tritt ein bei Klebsiella sp., hinterlegt beim Pasteur-Institut unter Nr. 53 153 bei einer Dosis von 23 mg/ml, bei Bacillus subtilis, hinterlegt beim Pasteur-Institut unter Nr. 5 262, bei Sarcina lutea, beim Pasteur-Institut unter Nr. 5 3^5 hinterlegter Stamm, und Escherichia coli, beim Pasteur-Institut unter Nr. 54 127 hinterlegter Stamm, bei einer Dosis von 36 mg/ml des pflanzlichen Ausgangsmaterials (Trockengewicht).

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Versuche über die in vivo-Wirksamkeit der Extrakte von Prunus Lusitanica

I. Gesamtextrakt

10 Meerschweinchen wurden an den Planken rasiert, dort 10 mal geritzt und mit einer Paste behandelt, die aus einem Gemisch aus Bienenhonig und einer Suspension von Tricophyton mentagrophytes var. asteroides bestand. 5 Meerschweinchen wurden dann ohne weitere Behandlung gelassen und 5 wurden vom Morgen nach der Impfung an täglich an der einen Seite mit dem konzentrierten und an der anderen Seite mit dem verdünnten Produkt behandelt. Vom fünften Tage an zeigten die nicht behandelten Meerschweinchen erythematöse Flecken, die immer dichter wurden und Juckreiz auslösten. Die dicken Krusten lösten sich und die Kratzstellen hinterließen näßende Wunden. Im Gegensatz hierzu zeigten die behandelten Meerschweinchen nach dem fünften Tag der Behandlung viel kleinere Wunden als die Vergleichstiere, jedoch war die Entzündungsreaktion auf der mit dem verdünnten Produkt behandelten Seite viel stärk^er als auf der mit dem konzentrierten Produkt behandelten Seite. Am 10. Behandlungstag war bei den meisten der behandelten Meerschweinchen die Heilung vollkommen im Gegensatz zu den Vergleichstieren, deren Wunden sich verschlimmert hatten.

II. Gereinigtes Produkt, das als Destillat die phenolische

Substanz allein enthielt.

Es wurde anschließend unter den oben genannten Bedingungen ein Vergleichsversuch durchgeführt, bei dem anstelle des Gesarntextraktes nur die phenolische Substanz verwendet wurde und bei dem bei 5 Meerschweinchen einmal sofort und bei ^lj anderen Meerschweinchen erst nach dem fünften Tage nach der Impfung diese Substanz aufgebracht wurde. Hierbei wurden völlig anö^re Er^cbnifine erhalten, die die Unwirksamkeit d\.(:::(.:r Substanz a 11 ο in belepjcn. Die sofort behandelten Meeri;r:hv,". inch'jn h?.-ti,orj wr.-ni^or inter.:":!.ve Wunden als die Ver-F₁ 1 '■ i r.'ii.':1. J (.:!■'■ un'J di c- rpütor brhfnvie] ton Ti ore .

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Die erfindungsgemaßen wäßrigen oder mit Trichloräthylen erhaltenen Extrakte von Prunus lusitanica zeigen somit eine außerordentlich überraschende in vivo-Wirksamkeit.

Klinische Untersuchungen zur Bestimmung der Wirksamkeit

des Extraktes bei der Behandlung von Mykosen

Zur Anwendung kam ein aus einem Pulver luftgetrockneter Blätter von Prunus lusitanica durch Wasserdampfdestillation gewonnener Extrakt.

1.) Intertrigo des 4. Interdigitalraumes Der Grund der Falte war schuppig, rissig, schmerzhaft und die Epidermis mazeriert und abgenutzt. Auf der Außenfläche der dritten Zehe und an der Innenseite der vierten Zehe befand sich ein sehr juckendes Ekzem. Dies xvurde durch Züchten einer Probe auf Sabouraud-Milieu als Trichophyton ru-brum identifiziert.

Man behandelte-dieses Ekzem während 8 Tagen jeden Abend mit dem erfindungsgemäßen Extrakt. Die klinische Heilung erfolgte am sechsten Tag und blieb innerhalb von 5 Monaten bestehen.

2.) Pytiriasis versicolor der Brust und der Schultern Der nicht juckende, leicht schuppige, seit mehr als 6 Monaten andauernde Befall wurde durch Anfärbung einer Schuppenprobe identifiziert als Microsporum furfur.

Man behandelte die Stelle 30 Tage lang jeden Morgen und Abend mit dem erfindungsgemaßen Extrakt und beobachtete ein schnelles Abheilen der Wunden; schon am fünfzehnten Tag war die Nachuntersuchung negativ.

Bei beiden Untersuchungen erwies sich der Extrakt als gut verträglich.

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Claims

Patentansprüche

1.) Verwendung der mit anorganischen und/oder organischen Lösungsmitteln aus der rosenartigen Pflanze "Prunus lusitanica", insbesondere aus ihren Blättern gewonnenen Extrakte als fungicide und baktericide Wirkstoffe.

2.) Verwendung der Trichloräthylenextrakte für den im Anspruch 1 genannten Zweck.

3.) Verwendung der durch Destillation oder Wasserdampfdestillation gewonnenen Extrakte für den im Anspruch 1 genannten Zweck.

4.) Mittel zur Hemmung des Wachstums von pathogenen Pilzen bei Mykosen, enthaltend den Gesamtextrakt der mit Trichloräthylen oder durch Destillation oder Wasserdampfdestillation extrahierten rosenartigen Pflanze "Prunus lusitanica", insbesondere ihre Blätter. *

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