WO2020130626A1 - 뎅기 바이러스 ediii에 특이적으로 결합하는 dna 압타머 및 이의 용도 - Google Patents

뎅기 바이러스 ediii에 특이적으로 결합하는 dna 압타머 및 이의 용도 Download PDF

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dengue
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김윤근
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a DNA aptamer specifically binding to dengue virus EDIII (Dengue virus envelope protein domain III; DENV EDIII), a composition for diagnosis of dengue fever comprising the same, and a dengue diagnosis kit.
  • dengue virus EDIII Dengue virus envelope protein domain III
  • DENV EDIII Dengue virus envelope protein domain III
  • Dengue fever is a severe flu-like condition.
  • the dengue virus belongs to a flavivirus, such as the yellow fever virus, and shows structural and pathological similarities. Symptoms include fever, severe headache, muscle and joint pain, and lymph node inflammation. Dengue fever itself has a low mortality rate, but there is a risk of complications such as hypothermia or hemorrhagic vomiting.
  • dengue virus EDIII (Dengue virus envelope protein domain III; DENV EDIII) is a domain III part located on the surface protein of dengue virus, and the flavivirus to which the dengue virus belongs is inside the capsid protein.
  • Genomic RNA genomic RNA
  • E envelope
  • M membrane protein
  • the envelope protein located on the outermost side of the flavivirus antigen is composed of domains I, II, and III, of which domain III is a location where viral receptors bind, and has attracted attention as a major target for diagnosis and immune research using serum. have.
  • Domain III is highly antigenic and has a linear epitope recognized by a virus-neutralizing single antibody. Diseases of the same flavivirus have a strong antigen-cross reaction between viruses, making it difficult for serological diagnosis. For example, there are reports that most infections have been misdiagnosed by a cross reaction between type 3 dengue fever, yellow fever, and St. Louis encephalitis. In order to solve this problem, the sequence of domain III having distinct characteristics even in viruses of the same genus is receiving attention (Registration No. 10-1520084, Republic of Korea).
  • aptamer has a very high affinity for a specific material and is stable, and has been developed a lot in recent years, and its application as a therapeutic and diagnostic sensor using it is actively progressing. Synthesis of aptamers is possible in a relatively simple way, and even cells, proteins, and even small organic substances can be targeted, enabling the development of new detection methods using them, and their specificity and stability are very high compared to antibodies already developed. Therefore, it is possible to develop therapeutic agents, drug delivery systems, and applications as diagnostic biosensors.
  • the present invention was devised to solve the above problems, and the specific binding capacity of the DNA aptamer prepared in the present invention to the dengue virus envelope protein domain III (DENV EDIII) was confirmed and based on this The invention was completed.
  • the object of the present invention is a DNA aptamer that specifically binds to the Dengue virus EDIII (Dengue virus envelope protein domain III; DENV EDIII), wherein the DNA aptamer comprises a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, DNA To provide aptamers.
  • DENV EDIII Dengue virus envelope protein domain III
  • another object of the present invention is to provide a dengue fever diagnostic kit or a composition for dengue fever diagnosis, which includes a DNA aptamer.
  • the present invention is a DNA aptamer specifically binding to dengue virus EDIII (Dengue virus envelope protein domain III; DENV EDIII), wherein the DNA aptamer is the base sequence of SEQ ID NO: 4 It provides a DNA aptamer, characterized in that consisting of.
  • DENV EDIII Dengue virus envelope protein domain III
  • the DENV EDIII may be a domain protein included on the surface of the dengue virus antigen.
  • the present invention provides a composition for diagnosing dengue fever, which includes a DNA aptamer.
  • the present invention provides a dengue fever diagnostic kit comprising a DNA aptamer.
  • the present inventors have conducted extensive research to develop a novel biomarker for the diagnosis of Dengue fever, and DNA aptamer (DNA) with specific binding ability to Dengue virus envelope protein domain III (DENV EDIII) Aptamer) has been confirmed to have strong binding strength and excellent specificity with DENV EDIII, and thus it can be expected to have superior stability than the ELISA method using an existing antibody, and thus can be usefully used in the development of dengue fever diagnostic composition, dengue fever diagnostic kit, etc. It is expected to be.
  • DNA DNA aptamer
  • DENV EDIII Dengue virus envelope protein domain III
  • Figure 1 is a graph showing the results of confirming the binding degree (%) of ssDNA (single strand DNA) and DENV EDIII, and the screening process.
  • Figure 2 shows the result of confirming the Kd value for the DV4 aptamer sequence through fluorescence measurement.
  • Figure 3 shows the results of confirming whether the binding of DV1, DV2, DV3, DV4 aptamer with DENV EDIII protein through EMSA (Electrophoric Mobility Shift Assay) method.
  • the present inventors have conducted extensive research to develop a novel biomarker for the diagnosis of Dengue fever, and DNA aptamer (DNA) with specific binding ability to Dengue virus envelope protein domain III (DENV EDIII) Aptamer) confirmed that it has a strong binding force with DENV EDIII and excellent specificity, and completed the present invention.
  • DNA DNA aptamer
  • DENV EDIII Dengue virus envelope protein domain III
  • the present invention provides a DNA aptamer that specifically binds to DENV EDIII
  • Dengue virus EDIII (Dengue virus envelope protein domain III; DENV EDIII)
  • DENV EDIII domain III portion located on the surface protein of the Dengue virus, the Flavivirus to which the Dengue virus belongs
  • Genomic RNA is located inside the capsid protein, and the outer surface has a structure surrounded by dimers and membrane proteins (M) proteins.
  • M dimers and membrane proteins
  • the envelope protein located on the outermost side of the flavivirus antigen is composed of domains I, II, and III, of which domain III is a location where viral receptors bind, and is receiving attention as a major target for diagnosis and immune research using serum. have.
  • Domain III is highly antigenic and has a linear epitope recognized by a virus-neutralizing single antibody.
  • aptamer is a single-stranded DNA (ssDNA) or RNA having high specificity and affinity for a specific substance.
  • ssDNA single-stranded DNA
  • RNA RNA having high specificity and affinity for a specific substance.
  • Conventional methods using antibodies are relatively time-consuming and expensive because they are made using the immune system of a living body, and their stability may be problematic because they are proteins, whereas aptamers are relatively synthetic in synthesis. Since it is possible by a simple method and can target cells, proteins, and even small organic substances, it is possible to develop new detection methods using this, and the specificity and stability are very high compared to the antibodies already developed.
  • DNA aptamers were used for the specific detection of EDIII. Any DNA (ssDNA) or RNA capable of specific detection of DENV EDIII may correspond to the aptamer of the present invention, and may be preferably composed of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a composition for diagnosing dengue fever, comprising the DNA aptamer.
  • composition of the present invention may further include a pharmacologically or physiologically acceptable carrier, excipient, and diluent in addition to the DNA aptamer.
  • a pharmacologically or physiologically acceptable carrier such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, external preparations, suppositories, and sterile injection solutions according to a conventional method.
  • Carriers, excipients, and diluents that may be included in the composition include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl Cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxy benzoate, propylhydroxy benzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil.
  • diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants, and the like.
  • the present invention provides a dengue fever diagnostic kit comprising the DNA aptamer.
  • the kit includes the aptamer of the present invention that specifically binds to DENV EDIII, and the aptamer may be attached with detection labels widely used in the art, for example, biotin residues.
  • detection labels widely used in the art, for example, biotin residues.
  • the labeling material After introducing the labeling material to the biotin-attached aptamer, it can be used for detection, quantification and diagnosis of DENV EDIII through its analysis.
  • various known analytical labeling materials can be used, for example, fluorescence analysis using streptavidin, avidin, Cy3, Cy5, Alexa, BODIPY, Rhodamine or Q-dot, etc. Can.
  • aptamers for DENV EDIII detection can be labeled with common labeling substances such as other fluorescent substances, magnetic substances, dyes, enzymes, radioactive isotopes, and common detection means, for example, fluorescence. It can be detected through a microscope, Radioimmnodetection (RAID), or the like.
  • common labeling substances such as other fluorescent substances, magnetic substances, dyes, enzymes, radioactive isotopes, and common detection means, for example, fluorescence. It can be detected through a microscope, Radioimmnodetection (RAID), or the like.
  • kit is a variety of tools or reagents that can be used to qualitatively or quantitatively determine whether aptamer is bound to DENV EDIII in a sample, a support (substrate), buffer solution, reaction stopper, solubilizer, detergent or stabilizer It may further include.
  • the aptamer-fixed substrate may be, for example, a solid substrate, selected from the group consisting of polymers, glass, gold, paper, and biomembrane. More specifically, polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyester, polyacrylonitrile, fluororesin, agarose, cellulose, nitrocellulose, dextran, sephadex, sepharose, liposome, carboxymethyl cellulose, polyacrylamide, Polysterene, companion rock, filter paper, ion exchange resin, plastic film, plastic tube, polyamine-methyl vinyl-ether-maleic acid copolymer, amino acid copolymer, ethylene-maleic acid copolymer, nylon, metal, glass, glass beads, or Magnetic particles and the like can be used.
  • polystyrene polyethylene, polypropylene, polyester, polyacrylonitrile, fluororesin, agarose, cellulose, nitrocellulose, dextran, sephadex, sepharose, liposome, carboxymethyl cellulose, polyacrylamide,
  • Cell culture plates, ELISA plates, tubes, and polymeric membranes may be used as other solid substrates.
  • the substrate may have any possible shape, for example spherical (bead), cylindrical (inside the test tube or well), planar (sheet, test strip), more preferably a multi-well plate (eg, 24 well) , 96 well, 192 well, 384 well, 576 well, etc.).
  • the purified DENV EDIII was coated with cobalt on the surface and fixed to the bead using Dynabeads (Invitrogen, Norway), a magnetic bead that binds to the His-tag of the protein.
  • the ssDNA library (500 pmole) dissolved in 100 uL of binding buffer was incubated at 90°C for 3 minutes, and then incubated at 4°C for 30 minutes. Then, it reacted for 1 hour while gently shaking with DENV EDIII previously immobilized on a magnetic bead. Then, the bead was washed twice with a binding buffer to remove ssDNA not binding to DENV EDIII bound to the bead.
  • the protein and the elution buffer (20 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM MgCl 2 , 0.01% tween 20, 300 mM immidazole, pH 8.0) to separate the protein and ssDNA from the magnetic bead and The bound ssDNA was eluted.
  • the eluted ssDNA was precipitated using ethanol, dissolved in 60 uL of distilled water, and then amplified by PCR using i-pfu polymerase (Intron Biotechnology, Korea) using Forward primer and Biotin-bound Reverse primer.
  • the amount of ssDNA and the concentration of DENV EDIII were carried out while decreasing for strict screening, and the DENV of the remaining ssDNA was measured by measuring the concentration of ssDNA eluted from repeated screening with a UV spectrometer (UV spectrometer, Biochrom Libra S22 spectromether). The screening process was performed while confirming the degree of binding with EDIII. The degree of bonding (%) is as shown in FIG. 1.
  • the 11th repeatedly selected ssDNA was amplified through PCR using unmodified Forward primer and Reverse primer, cloned into pENTR/TOPO vector (TOPO TA Cloning kit, Invitrogen, USA), and E. coli TOP10 cells (Invitrogen, USA). After the clone into which the ssDNA was inserted was purified using a miniprep kit (GeneAll, Korea), the base sequence was analyzed (COSMO Genetech, Korea). As a result, it was possible to analyze the sequence shown in Table 1 below.
  • the amount of 6-FAM-labeled ssDNA aptamer bound to magnetic beads with DENV EDIII fixed was separated by fluorescence measurement by separating only 6-FAM-labeled ssDNA bound to DENV EDIII using a magnet (1420 Victor multilabel counter, PerkinElmer, USA).
  • a magnet (1420 Victor multilabel counter, PerkinElmer, USA.
  • Example 2 In order to measure whether the DV4 aptamer selected through the SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment) technique of Example 1 binds to the actual DENV EDIII, the present inventors confirm the presence or absence of binding through the EMSA (Electrophoric Mobility Shift Assay) method. Did. Recombinant DENV EDIII 5 uM and aptamers DV1, DV2, DV3, and DV4 1 uM were incubated in a binding buffer of 20 uL at room temperature for 1 hour, and then run on 6% acrylamide gel. As a result of sybr green and coomassie blue staining, as shown in FIG. 3, it was confirmed that the developed DV4 aptamer binds to DENV EDIII better than other aptamers.
  • SELEX Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment
  • Sequence list designation order SEQ ID NO: 1 ssDNA library CACCTAATACGACTCACTATAGCGGATCCGA-N40-CTGGCTCGAACAAGCTTGC SEQ ID NO: 2 Forward primer cacctaatac gactcactat agcgga SEQ ID NO: 3 Reverse primer gcaagcttgt tcgagccag SEQ ID NO: 4 DV4 Aptamer CACCTAATACGACTCACTATAGCGGATACGAGGGAGAGTCGGATGGGGTGGTTGTGTTAGGTGTAGTGGGTCTGGCTCGAACAAGCTTGC
  • the DNA aptamer that specifically binds to the dengue virus envelope protein domain III (DENV EDIII) of the present invention has a strong binding force and excellent specificity to the dengue virus surface protein, and is significantly remarkable compared to the diagnosis using existing antibodies. Since dengue virus can be diagnosed with increased accuracy, it is expected that it can be effectively used in various products for diagnosis, such as diagnostic kits and diagnostic compositions.

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Abstract

본 발명은 뎅기 바이러스 EDIII(Dengue virus envelope protein domain III; DENV EDIII)에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머, 이를 포함하는 뎅기열 진단용 조성물, 뎅기열 진단 키트에 관한 것으로서, 본 발명자들은 뎅기열(Dengue fever)의 진단을 위한 신규 바이오 마커를 개발하기 위해 예의 연구한 결과, 뎅기 바이러스 EDIII(Dengue virus envelope protein domain III; DENV EDIII)에 대하여 특이적인 결합능을 갖는 DNA 압타머(DNA Aptamer)가 DENV EDIII와의 강한 결합력과 우수한 특이성이 있다는 것을 확인하였는 바, 기존의 항체를 이용한 ELISA 방법보다 뛰어난 안정성을 기대할 수 있으므로, 뎅기열 진단용 조성물, 뎅기열 진단 키트 등의 개발 시에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

뎅기 바이러스 EDIII에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머 및 이의 용도
본 발명은 뎅기 바이러스 EDIII (Dengue virus envelope protein domain III; DENV EDIII)에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머, 이를 포함하는 뎅기열 진단용 조성물, 뎅기열 진단 키트에 관한 것이다.
뎅기열은 극심한 독감과 같은 증상을 보이는 질병이다. 뎅기 바이러스는 황열 바이러스와 같은 플라비바이러스(flavivirus)에 속하며 구조적, 병리학적 유사성을 보인다. 발열, 심각한 두통, 근육 및 관절의 통증, 임파선 염증 등의 증상이 나타난다. 뎅기열은 그 자체로는 사망율이 낮으나, 저체온증이나 출혈성 구토 등의 합병증을 동반할 위험성이 있다 뎅기 바이러스에는 네 가지의 항원형이 있으며 다른 종류의 항원에 의한 연속적인 감염은 위독한 상태로 진행될 수 있다. 세계 인구의 약 40%가 뎅기 바이러스 감염 위험에 노출되어 있으며, 매년마다 100만 건 이상의 뎅기 바이러스 감염이 발생한다. 약 50만 명의 위독성 환자들 중 상당수는 아이들이며, 발병한 환자들 중 2.5%가 사망한다. 주로 흰줄숲모기에 의해 전파된다.
한편, 뎅기 바이러스 EDIII(Dengue virus envelope protein domain III; DENV EDIII)은 뎅기 바이러스의 표면 단백질에 위치하는 도메인 III(domain III) 부분으로, 뎅기 바이러스가 속하는 플라비바이러스는 캡시드 단백질(capsid protein) 내부에 게놈 RNA(genomic RNA)가 위치하며, 바깥쪽을 표면(envelope; E) 단백질의 다이머(dimer)와 막 단백질(membrane(M) protein)이 둘러싸고 있는 구조를 가지고 있다. 플라비바이러스 항원의 가장 바깥쪽에 위치하는 envelope protein은 domain I, II, III으로 구성되어 있으며, 이 중 domain III는 바이러스 수용체가 결합하는 위치로, 혈청을 이용한 진단과 면역 연구의 주요한 타겟으로 주목받고 있다. Domain III는 매우 항원적 특성이 강하며 바이러스-중화(virus-neutralizing) 단일 항체에 의해 인식되는 선형의 에피톱을 가지고 있다. 같은 플라비바이러스 속의 질병들은 바이러스 사이의 항원-교차반응이 강하므로 혈청학적 진단에 어려움이 있다. 그 일례로, 3 유형 뎅기열, 황열, 그리고 세인트루이스 뇌염 사이의 교차 반응에 의해 대부분의 감염이 오진단 되었다는 보고도 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 같은 속의 바이러스에서도 뚜렷하게 구분되는 특성을 가지는 domain III의 서열이 주목 받고 있다(대한민국 등록특허공보 10-1520084).
현재 뎅기열과 같은 열대 풍토성 질환은 증상에 기반한 진단, 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 이용한 감염체 검출, 항원-항체 반응을 이용한 면역진단법 등에 의해 진단되고 있다. 그러나 현존하는 방법들은 의료 시설이 열악한 빈곤 국가에서는 비용 상의 문제로 널리 쓰이지 못하거나, 또는 민감도·선별도 등의 척도에서 적합한 수준에 미달되어 있다. 기존의 진단법이 갖는 한계를 극복하고 빈곤 국가에서 실제로 활용될 수 있는 소외질환 검출 플랫폼을 개발하는 것이 요구된다.
한편, 압타머는 특정물질에 대한 친화도가 매우 높고 안정하기 때문에 최근 많이 개발되고 있고 이를 이용한 치료제 및 진단용 센서로의 응용이 활발히 진행되고 있다. 압타머의 합성은 비교적 단순한 방법으로 가능하고 세포, 단백질 그리고 작은 유기물질까지도 표적물질이 될 수 있기 때문에 이를 이용한 새로운 검출방법들의 개발이 가능하며 그 특이성 및 안정성이 이미 개발되어 있는 항체에 비해 매우 높기 때문에 치료제 개발 및 약물전달 시스템, 진단용 바이오센서로의 응용이 가능하다.
따라서, 소외 질환 검출 플랫폼을 개발하기 위해, 신규 바이오 마커를 이용한 뎅기열의 진단이 주요한 과제의 대상이 되고 있고, 이에 대한 연구가 이루어지고 있으나, 아직 미비한 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명에서 제조된 DNA 압타머의 뎅기 바이러스 EDIII(Dengue virus envelope protein domain III; DENV EDIII)에 대한 특이적인 결합능을 확인하고 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이에, 본 발명의 목적은 뎅기 바이러스 EDIII(Dengue virus envelope protein domain III; DENV EDIII)에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머로서, 상기 DNA 압타머는 서열번호 4의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, DNA 압타머를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 DNA 압타머를 포함하는, 뎅기열 진단용 조성물 또는 뎅기열 진단키트를 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 뎅기 바이러스 EDIII(Dengue virus envelope protein domain III; DENV EDIII)에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머로서, 상기 DNA 압타머는 서열번호 4의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, DNA 압타머를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예로서, 상기 DENV EDIII는 뎅기 바이러스 항원(antigen)의 표면에 포함되는 도메인 단백질일 수 있다.
또한, 본 발명은 DNA 압타머를 포함하는, 뎅기열 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 DNA 압타머를 포함하는, 뎅기열 진단 키트를 제공한다.
본 발명자들은 뎅기열(Dengue fever)의 진단을 위한 신규 바이오 마커를 개발하기 위해 예의 연구한 결과, 뎅기 바이러스 EDIII(Dengue virus envelope protein domain III; DENV EDIII)에 대하여 특이적인 결합능을 갖는 DNA 압타머(DNA Aptamer)가 DENV EDIII와의 강한 결합력과 우수한 특이성이 있다는 것을 확인하였는 바, 기존의 항체를 이용한 ELISA 방법보다 뛰어난 안정성을 기대할 수 있으므로, 뎅기열 진단용 조성물, 뎅기열 진단 키트 등의 개발 시에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 ssDNA(single strand DNA)와 DENV EDIII의 결합 정도(%)를 확인하고, 선별 과정을 진행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 DV4 압타머 서열에 대한 Kd 값을 형광측정을 통하여 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 DV1, DV2, DV3, DV4 압타머의 DENV EDIII 단백질과의 결합여부를 EMSA(Electrophoric Mobility Shift Assay) 방법을 통하여 확인한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명자들은 뎅기열(Dengue fever)의 진단을 위한 신규 바이오 마커를 개발하기 위해 예의 연구한 결과, 뎅기 바이러스 EDIII(Dengue virus envelope protein domain III; DENV EDIII)에 대하여 특이적인 결합능을 갖는 DNA 압타머(DNA Aptamer)가 DENV EDIII와의 강한 결합력과 우수한 특이성이 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명의 일 실시예에서는 SELEX를 이용하여 DENV EDIII에 대한 압타머를 탐색한 결과, DV4 압타머의 서열 및 구조를 분석 및 확인하였고(실시예 1 참조), 형광 측정을 이용하여 DENV EDIII와 압타머 간의 결합력을 측정하였다(실시예 2 참조).
따라서, 본 발명은 DENV EDIII에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머를 제공한
다.
본 발명에서 사용되는 용어, "뎅기 바이러스 EDIII(Dengue virus envelope protein domain III; DENV EDIII)"란, 뎅기 바이러스의 표면 단백질에 위치하는 도메인 III(domain III)부분으로, 뎅기 바이러스가 속하는 플라비바이러스는 캡시드 단백질(capsid protein) 내부에 게놈 RNA(genomic RNA)가 위치하며, 바깥쪽을 표면(envelope; E) 단백질의 다이머(dimer)와 막 단백질(membrane(M) protein)이 둘러싸고 있는 구조를 가지고 있다. 플라비바이러스 항원의 가장 바깥쪽에 위치하는 envelope protein은 domain I, II, III으로 구성되어 있으며, 이 중 domain III는 바이러스 수용체가 결합하는 위치로, 혈청을 이용한 진단과 면역 연구의 주요한 타겟으로 주목받고 있다. Domain III는 매우 항원적 특성이 강하며 바이러스-중화(virus-neutralizing) 단일 항체에 의해 인식되는 선형의 에피톱을 가지고 있다. 같은 플라비바이러스 속의 질병들은 바이러스 사이의 항원-교차반응이 강하므로 혈청학적 진단에 어려움이 있다. 그 일례로, 3 유형 뎅기열, 황열, 그리고 세인트루이스 뇌염 사이의 교차 반응에 의해 대부분의 감염이 오진단 되었다는 보고도 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 같은 속의 바이러스에서도 뚜렷하게 구분되는 특성을 가지는 domain III의 서열이 주목 받고 있는 바, DENV EDIII의 검출을 통해 효과적으로 뎅기열을 진단할 수 있고, 뎅기 바이러스 EDIII는 뎅기 바이러스 항원(antigen)의 표면에 포함되는 도메인 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어, "압타머"란 특정 물질에 대해 높은 특이성과 친화도를 가지는 단일가닥 DNA(ssDNA) 또는 RNA이다. 기존에 개발되어 있는 항체를 이용한 방법은 생체의 면역시스템을 이용하여 만들어지기 때문에 비교적 많은 시간이 들고 고비용이라는 점, 단백질이기 때문에 그 안정성이 문제가 되는 경우가 있는 반면, 압타머는 합성에 있어서, 비교적 단순한 방법으로 가능하고 세포, 단백질 그리고 작은 유기물질까지도 표적물질이 될 수 있기 때문에 이를 이용한 새로운 검출방법들의 개발이 가능하며 그 특이성 및 안정성이 이미 개발되어 있는 항체에 비해 매우 높은 점에 착안하여, DENV EDIII의 특이적 검출을 위하여 DNA 압타머를 사용하였다. DENV EDIII의 특이적 검출이 가능한 DNA(ssDNA) 또는 RNA라면 모두 본 발명의 압타머에 해당할 수 있고, 바람직하게는 서열번호 4의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 DNA 압타머를 포함하는, 뎅기열 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 상기 DNA 압타머 외에 약리학적으로나 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제, 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제, 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
또한, 본 발명은 상기 DNA 압타머를 포함하는, 뎅기열 진단 키트를 제공한다.
상기 키트는 DENV EDIII에 특이적으로 결합하는 본 발명의 압타머를 포함하고 있으며, 압타머에는 당업계에 널리 사용되는 검출 표지들, 예를 들어 바이오틴 잔기가 부착될 수 있다. 바이오틴이 부착된 압타머에 표지물질을 도입한 다음, 이의 분석을 통해 DENV EDIII의 검출, 정량 및 진단에 이용할 수 있다. 바이오틴에 사용되는 표지물질로서 다양한 공지된 분석용 표지물질이 사용될 수 있으며, 예를 들면, 스트렙타비딘, 아비딘, Cy3, Cy5, Alexa, BODIPY, Rhodamine 또는 Q-dot 등을 사용하여 형광분석을 할 수 있다. 또한, DENV EDIII 검출을 위한 압타머에는 바이오틴 잔기 외에도, 기타 형광물질, 자성체, 염색물질, 효소, 방사성동위원소 등과 같은 통상의 표지 물질로 표지할 수 있으며, 통상의 검출 수단, 예를 들어, 형광 현미경, Radioimmnodetection(RAID) 등을 통하여 검출할 수 있다.
또한, 상기 키트는 압타머와 시료 내 DENV EDIII의 결합 여부를 정성 또는 정량적으로 측정하는데 사용할 수 있는 각종 도구 또는 시약으로서, 지지체(기재), 완충용액, 반응 정지제, 용해제, 세척제 또는 안정화제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 압타머가 고정된 기재는, 예컨대 고체 기재로서 고분자, 유리, 금, 종이 및 생체막(membrane)으로 이루어진 군에서 선택된 것을 사용할 수 있다. 보다 구체적으로는, 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 아가로스, 셀룰로즈, 니트로셀룰로즈, 덱스트란, 세파덱스, 세파로즈, 리포솜, 카복시메틸 셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 폴리스테린, 반려암, 여과지, 이온교환수지, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 금속, 유리, 글래스 비드, 또는 자성 입자 등을 사용할 수 있다. 그 외의 다른 고체 기질로는 세포배양 플레이트, ELISA 플레이트, 튜브 및 폴리머성 막 등을 사용할 수 있다. 상기 기재는 임의의 가능한 형태, 예를 들어 구형(비드), 원통형(시험관 또는 웰 내면), 평면형(시트, 시험 스트립)을 가질 수 있으며, 보다 바람직하게는 멀티 웰 플레이트(예를 들어, 24웰, 96웰, 192웰, 384웰, 576웰 등)를 사용할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. SELEX을 이용한 DENV EDIII에 대한 압타머 탐색
1-1. ssDNA(single strand DNA)라이브러리의 제조
양 말단에 PCR 증폭 및 클로닝을 위한 프라이머의 결합서열을 갖고 가운데 40개의 무작위 DNA염기서열을 포함하는 90개의 서열을 가지는 합성된 라이브러리(5'-CACCTAATACGACTCACTATAGCGGATCCGA-N40-CTGGCTCGAACAAGCTTGC-3'; 서열번호 1)를 설계하였다. 또한, PCR 증폭 및 ssDNA 생성을 위하여 Forward 프라이머 (5'-CACCTAATACGACTCACTATAGCGGA-3; 서열번호 2)와 Reverse 프라이머(5'-GCAAGCTTGTTCGAGCCAG-3'; 서열번호 3) 및 비오틴이 결합된 Reverse 프라이머(5'-Biotin-GCAAGCTTGTTCGAGCCAG-3')을 사용하였다. 여기서 사용된 모든 올리고 뉴클레오티드는 바이오닉스 사(한국)에서 합성 및 PAGE 정제하였다.
1-2. DENV EDIII의 Ni-NTA 자성 비드에 고정화
정제된 DENV EDIII는 표면에 코발트로 코팅되어 있어 단백질의 His-tag과 결합하는 자성 비드 (magnetic bead)인 Dynabeads (Invitrogen, 노르웨이)를 이용하여 bead에 고정하였다.
구체적으로 단백질 결합 버퍼 (20 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM MgCl 2, pH 8.0) 100 uL에 녹아 있는 단백질 1000 pmole과 15 ul의 bead를 외부 자석을 이용하여 결합버퍼로 세척 후, 한 시간 동안 실온에서 반응하여 bead에 고정하였다.
1-3. DENV EDIII에 특이적인 압타머 선별
DENV EDIII에 특이적인 압타머를 선별하기 위해 자성을 이용한 특이적 분리방법을 수행하였다.
구체적으로, 먼저 ssDNA의 가장 안정한 구조형성을 위해, 100 uL의 결합 버퍼에 녹아 있는 ssDNA 라이브러리 (500 pmole)를 90℃에서 3분 동안 배양 후, 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 그 후, 앞서 magnetic bead에 고정화된 DENV EDIII와 함께 약하게 흔들어주면서 1시간 동안 반응하였다. 그 다음, bead에 결합된 DENV EDIII과 결합하지 않는 ssDNA를 제거하기 위해 결합 버퍼로 bead를 두 번 세척하였다.
그 후, magnetic bead에서 단백질과 결합한 ssDNA를 분리하기 위해 용출 버퍼(20 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 0.01% tween 20, 300 mM immidazole, pH 8.0)를 이용해 단백질 및 결합 ssDNA를 용출하였다. 용출된 ssDNA는 에탄올을 이용해 침전시킨 후, 60 uL의 증류수에 용해한 다음 Forward 프라이머 및 비오틴이 결합된 Reverse 프라이머를 이용하여 i-pfu polymerase(인트론 바이오 테크놀로지, 한국)를 이용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 다음 선별 과정을 위한 ssDNA를 생성하기 위해, 비오틴이 결합된 PCR 산물을 비오틴과 결합하는 스트렙타아비딘(streptavidin)이 코팅된 자성 비드와 함께 커플링 버퍼(5 mM Tris-HCl, 0.5 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.005% tween 20, pH 7.5)조건에서 1시간 배양하였다. 배양 후 ssDNA만을 분리하기 위해 100 ul의 100 mM NaOH와 10분 동안 배양하였고, 외부 자석을 이용해 선별된 ssDNA만을 얻을 수 있었다. 또한, 첫 번째 선별된 ssDNA를 다음 선별에 사용하여 선별을 반복하였다. 이때 ssDNA의 양 및 DENV EDIII의 농도는 엄격한 선별을 위해 보다 감소시키면서 진행하였으며, 반복되는 선별에서 용출된 ssDNA를 UV 분광광도계(UV spectrometer, Biochrom Libra S22 spectromether)로 농도를 측정하여 남아 있는 ssDNA의 DENV EDIII와의 결합 정도를 확인하며 선별 과정을 진행하였다. 상기 결합 정도(%)는 도 1에 나타난 바와 같다.
1-4. 압타머 서열분석 및 구조분석
11 번째의 반복 선별된 ssDNA는 변형되지 않은 Forward 프라이머와 Reverse 프라이머를 이용하여 PCR 과정을 통해 증폭하였고, pENTR/TOPO 벡터(TOPO TA Cloning kit, Invitrogen, 미국)에 클로닝한 후, E. coli TOP10 세포(Invitrogen, 미국)에 형질전환하였다. ssDNA가 삽입된 클론을 miniprep 키트(GeneAll, 한국)를 이용하여 정제한 후, 염기서열을 분석(COSMO Genetech, 한국)하였다. 그 결과, 하기 표1 과 같은 서열을 분석할 수 있었다.
Aptamer Sequences (5' to 3') Length (bases)
DV4 CACCTAATACGACTCACTATAGCGGATACGAGGGAGAGTCGGATGGGGTGGTTGTGTTAGGTGTAGTGGGTCTGGCTCGAACAAGCTTGC 90
실시예 2. 형광 측정을 이용한 단백질과 압타머 간의 결합력 측정
400pmole의 DENV EDIII를 10 uL 자성 비드(megnetic bead)와 혼합한 후, 100 uL의 결합 버퍼(20 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM MgCl 2, pH 8.0)에서 1시간 동안 배양하였다. 결합하지 않은 DENV EDIII를 분리하기 위해 결합 버퍼로 2번 세척하였다. 그 후 다양한 농도의 6-FAM으로 표지된 압타머와 1시간 동안 배양하고, 결합하지 않은 압타머는 세척을 통해 제거하였다. DENV EDIII가 고정된 자성 비드에 결합된 6-FAM이 표지된 ssDNA 압타머의 양은 자석을 이용하여 DENV EDIII에 결합된 6-FAM가 표지된 ssDNA만을 분리하여 형광측정(1420 Victor multilabel counter, PerkinElmer, USA)을 통해 측정하였다. 그 결과, 도 2 및 하기 표 2에 나타낸 바와 같이, DV4 염기서열이 갖는 DNA 압타머의 kd값을 측정할 수 있었다.
Aptamer Kd (nM)
DV4 44.0 ± 10.1 nM
실시예 3. EMSA를 이용한 DENV EDIII에 대한 결합 유무 측정
상기 실시예 1의 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment) 기법을 통해 선별된 DV4 압타머가 실제 DENV EDIII에 결합하는지 측정하기 위하여 본 발명자들은 EMSA(Electrophoric Mobility Shift Assay) 방법을 통해 결합의 유무를 확인하였다. 재조합 DENV EDIII 5 uM과 압타머 DV1, DV2, DV3, DV4 1 uM 을 1시간 동안 상온에서 20 uL 의 결합버퍼에서 배양한 후, 6% acrylamide gel에 running하였다. sybr green과 coomassie blue 염색 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 개발된 DV4 압타머는 다른 압타머에 비해 DENV EDIII에 더 잘 결합하는 것을 확인할 수 있었다.
참고로, 본 발명의 서열목록 리스트는 하기 표 3과 같다.
서열목록 명칭 서열
서열번호 1 ssDNA library CACCTAATACGACTCACTATAGCGGATCCGA-N40-CTGGCTCGAACAAGCTTGC
서열번호 2 Forward primer cacctaatac gactcactat agcgga
서열번호 3 Reverse primer gcaagcttgt tcgagccag
서열번호 4 DV4 Aptamer CACCTAATACGACTCACTATAGCGGATACGAGGGAGAGTCGGATGGGGTGGTTGTGTTAGGTGTAGTGGGTCTGGCTCGAACAAGCTTGC
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다름 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 아닌 것으로 이해해야 한다.
본 발명의 뎅기 바이러스 EDIII(Dengue virus envelope protein domain III; DENV EDIII)에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머는 뎅기 바이러스 표면 단백질에 강한 결합력과 우수한 특이성을 가지고 있어, 기존의 항체를 이용한 진단과 비교하여 현저히 증가된 정확성을 가지고 뎅기 바이러스를 진단할 수 있으므로, 진단 키트, 진단용 조성물 등 진단을 위한 다양한 제품에 효율적으로 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (4)

  1. 뎅기 바이러스 EDIII(Dengue virus envelope protein domain III; DENV EDIII)에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머로서,
    상기 DNA 압타머는 서열번호 4의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, DNA 압타머.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 뎅기 바이러스 EDIII는 뎅기 바이러스 항원(antigen)의 표면에 포함되는 도메인 단백질을 포함하는 단백질인 것을 특징으로 하는, DNA 압타머.
  3. 제1항의 DNA 압타머를 포함하는, 뎅기열 진단용 조성물.
  4. 제1항의 DNA 압타머를 포함하는, 뎅기열 진단 키트.
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