KR101837856B1 - 뎅기바이러스 혈청형 2 및 3의 메틸트랜스퍼라제 활성을 억제하는 rna 앱타머 - Google Patents

뎅기바이러스 혈청형 2 및 3의 메틸트랜스퍼라제 활성을 억제하는 rna 앱타머 Download PDF

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Abstract

본 발명은 뎅기바이러스 혈청형 2 및 3의 메틸트랜스퍼라제(Methyltransferase; MTase) 활성을 억제하는 RNA 앱타머 및 그의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 본 발명은 뎅기바이러스 혈청형 2 및 3 MTase에 특이적으로 결합하여 그 활성을 억제하는 RNA 앱타머, 상기 RNA 앱타머를 포함하는 뎅기바이러스 감염 진단용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 뎅기바이러스 진단용 키트에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 RNA 앱타머를 이용하여 뎅기바이러스 감염 진단을 위한 정보의 제공 방법 및 상기 RNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 뎅기바이러스 감염의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

뎅기바이러스 혈청형 2 및 3의 메틸트랜스퍼라제 활성을 억제하는 RNA 앱타머 {RNA aptamers that inhibit methyltransferase activity of Dengue virus serotype 2 and 3}
본 발명은 뎅기바이러스 혈청형 2 및 3의 메틸트랜스퍼라제(Methyltransferase; MTase) 활성을 억제하는 RNA 앱타머 및 그의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 본 발명은 뎅기바이러스 혈청형 2 및 3 MTase에 특이적으로 결합하여 그 활성을 억제하는 RNA 앱타머, 상기 RNA 앱타머를 포함하는 뎅기바이러스 감염 진단용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 뎅기바이러스 진단용 키트에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 RNA 앱타머를 이용하여 뎅기바이러스 감염 진단을 위한 정보의 제공 방법 및 상기 RNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 뎅기바이러스 감염의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 에 관한 것이다.
뎅기바이러스 (Dengue virus, DENV)는 플라비바리데과((Flaviviridae)의 플라비바이러스속(Flavivirus)에 속하는 바이러스로 네 개의 혈청형(DENV1, DENV2, DENV3, DENV4)을 가지고 있다. 열대줄무늬모기나 한줄무늬모기를 통해 감염되며, 사람에게 감염되면 뎅기열, 뎅기 출혈열, 뎅기 쇼크증후군등의 질병이 발생한다. 이러한 질병들은 적절한 치료를 통해 나아질 수 있지만 치료를 받지 못하면 사망률이 20%까지 증가할 수 있다. 하지만 바이러스 감염에 대한 치료는 바이러스 감염 자체를 치료하는 것이 아니라 증상을 완화시키는 대증요법(symptomatic treatment)을 이용해 치료를 하고 있다. DENV는 약 11kb의 단일 가닥 RNA를 게놈으로 가지며 5'말단에 type RNA cap (m7GpppAm) 구조를 가지고 있는 특징이 있다. DENV가 발현하는 비구조단백질 NS5의 N-말단에 위치한 MTase는 RNA의 cap형성에 관여를 하며, 이 단백질의 활성을 억제하게 되면, 바이러스 5'말단의 type I cap의 N-7 부위와 바이러스 RNA 게놈의 첫 번째 뉴클레오티드의 2'에 메틸화가 일어나지 않게 되고, 바이러스 단백질 생산이 억제되며 RNA 게놈 복제가 억제될 것이다.
지금까지 밝혀진 DENV MTase의 3차 구조는 PDB ID 1R6A (J. Biol . Chem ., 279:35638-35643, 2004), PDB ID 3P8Z (J. Biol . Chem ., 286:6233-6240, 2011) 및 PDB ID 5CUQ (Acs Infect Dis . 1:340-349, 2015) 등이 있으며, 이러한 3차 구조로부터 얻는 정보는 DENV MTase 저해제에 대한 수 많은 가설 및 약물 분자 구조 모델 개발의 시도를 할 수 있게 하였다.
앱타머(Aptamer)는 DNA나 RNA와 같은 저분자의 올리고뉴클레오타이드로 보관이나 이동이 자유로운 장점이 있는 최근 단일항체를 대체할 물질로 많은 개발과 연구가 진행 중인 물질이다. 앱타머는 단백질은 물론 작은 유기물질, 무기물질 등의 표적 물질에 대해 매우 강한 선택성과 결합력을 가진다. 또한, 앱타머는 항체와 같은 전형적인 단백질 표적 분자에서 특이성과 친화력으로 비교가 된다. 앱타머는 분자량이 8-15 kDa인데 펩타이드(1-5kDa)(Wu AM, et al. Immunotechnology. 1996;2:21-36; Lister-James J, et al., Q. J. Nucl. Med., 1996;40:221-233)와 항체(150 kDa)의 분자량 면에서 중간 크기이고 단일사슬의 변이절편 항체(scFve, 25 kDa)보다 더 작다. 다가 음이온인 앱타머는 쉽게 구조와 활성을 나타내는 부위 특이 변성을 지지함에 따라 폴리에틸렌글리콜(PEG) 폴리머와 생물결합, 진단 그리고 치료제에 연결하여 사용될 수 있다. 또한, 앱타머는 시험관 내에서 제조되기 때문에 표적물질과 유사한 구조의 물질이 존재하거나, 표적 물질 자체가 독성을 가질 때는, 제조가 불가능한 항체의 단점을 극복할 수 있을 뿐 아니라, 동일한 표적물질에서도 각기 다른 반응 조건하에서 선택적으로 결합하는 앱타머의 제조도 가능하다는 장점을 가지고 있다.
이러한 장점을 가지는 앱타머 중 RNA 앱타머는 생체 외 선별과정의 반복을 통해 임의의 RNA 라이브러리로부터 특이적인 RNA 분자, 즉 앱타머를 선별할 수 있으며, RNA 라이브러리의 사이즈가 크고 생체 외 효소작용에 의하므로 RNA 라이브러리는 고친화도 앱타머를 선별하기 위한 다른 생물학적 라이브러리 또는 합성 라이브러리보다 우수하다. 이와 같은 이유로 치료제로서 RNA 앱타머의 잠재적인 용도에 대한 흥미가 증가하고 있으며 고친화도 RNA 앱타머는 SELEX 과정에 의해 선별될 수 있다.
이러한 RNA 앱타머를 이용하여 사스코로나바이러스 진단 소재로 사용 가능함이 제시된 바 있으며(질병관리본부 학술연구용역 보고서, 2008), 포도상구균 테이코산에 특이적으로 결합하여 식품 부패 방지(한국공개특허 10-2012-0068235) 등이 보고된 바 있으나, DENV2 MTase에만 특이적으로 결합하여 이 효소의 활성을 억제하는 RNA 앱타머에 대해서는 공개되어 있지 않은 실정이다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 DENV MTase에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 서열번호 1 또는 2로 구성된 염기서열을 포함하는 앱타머가 DENV2 및 3 MTase에 특이적으로 결합하여 MTase 활성을 억제함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 뎅기바이러스 혈청형 2 및 3의 메틸트랜스퍼라제(Methyltrasnferase)에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 또는 2로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열로 이루어진, RNA 앱타머를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 RNA 앱타머를 포함하는 뎅기바이러스 감염 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 뎅기바이러스 감염 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 RNA 앱타머를 이용하여, 뎅기바이러스 감염이 의심되는 분리된 개체의 시료에서 뎅기바이러스 혈청형 2 및 3의 MTase의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 뎅기바이러스 감염 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 RNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 뎅기바이러스 감염의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 RNA 앱타머 및 뎅기바이러스 혈청형 2및 3의 MTase 간의 결합을 저해하는 제제를 스크리닝하는 단계를 포함하는, 뎅기바이러스 혈청형 2 및 3의 MTase의 활성 억제제 또는 뎅기바이러스 감염 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 뎅기바이러스 혈청형 2 및 3의 메틸트랜스퍼라제(Methyltrasnferase)에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 또는 2로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 RNA 앱타머를 제공한다.
본 발명에서 용어, "뎅기바이러스(Dengue virus, DENV)"는 플라비바이러스속에 속하며 네 개의 혈청형(DENV1, DENV2, DENV3, DENV4)을 가지고 있다. 열대줄무늬모기나 한줄무늬모기를 통해 감염되며, 사람에게 감염되면 뎅기열, 뎅기 출혈열, 뎅기 쇼크증후군등의 질병이 발생하고, 치료를 받지 못하면 사망률이 20%까지 증가할 수 있다.
본 발명에서 용어, "메틸트랜스퍼라제(Methyltransferase; MTase)"는 DENV가 발현하는 NS5(non-structural 5) 단백질의 N-말단에 위치하는 단백질로 DENV 게놈 RNA의 5' 말단에 메틸기를 전달하여 Type I cap 구조를 형성하는데 매우 중요한 단백질이다. MTase 활성을 억제하게 되면 바이러스 5'말단의 type I cap의 N-7 부위와 바이러스 RNA 게놈의 첫번째 뉴클레오티드의 2' 위치에서 메틸화가 일어나지 않게 되고 바이러스 단백질 생산이 억제되며 RNA 게놈 복제가 억제될 것이다. 이전까지 이에 대하여 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머에 대해 보고된 바는 없다. 이에 본 발명자들은 DENV MTase에 특이적으로 결합하여 그 활성을 억제하는 RNA 앱타머를 새롭게 개발하였다
본 발명에서 용어, "RNA 앱타머(RNA aptamer)"는 짧은 단일가닥의 올리고뉴클레오티드로 높은 친화도와 특이성으로 표적 물질에 결합할 수 있는 3차원 구조를 형성할 수 있으며, 대부분의 경우에 표적 단백질에 특이적으로 결합할 수 있을 뿐 아니라 효율적으로 그 기능을 억제할 수 있어 표적 단백질의 기능을 알아내는데 이용될 수 있다. 본 발명에서는 SELEX(Systemic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)를 이용한 반복된 생체 외 선별과정을 통해 임의의 RNA 라이브러리로부터 특이적인 RNA 분자, 즉 앱타머를 선별하였다.
본 발명의 RNA 앱타머는, 서열번호 1 또는 2로 표시되는 염기서열을 가지는 것일 수 있다. 이와 같은 앱타머는 표적 단백질뿐만 아니라 표적 화합물에도 특이적으로 결합할 수 있으며, 본 발명의 목적상 DENV2 및 3 MTase에만 특이적으로 결합하는 것일 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서, 서열번호 1을 최적화한 서열번호 2의 RNA 앱타머가 DENV2 및 3 MTase에 특이적으로 결합하는 것일 수 있으며, 상기 결합에 의해 그 활성을 억제하는 것일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 서열번호 1 또는 2로 이루어진 염기서열을 포함하는 RNA 앱타머가 DENV 2 또는 3의 MTase에 특이적으로 결합하여 그 활성을 억제하는 것을 확인하였다. 먼저, 본 발명자는 무작위의 40개 서열을 가진 pool로 구성된 RNA 라이브러리를 생성하여 DENV2 및 3 MTase에 결합하는 RNA 앱타머를 선별하였다. 총 15차의 과정 후 얻어진 13차 및 15차 RNA pool과 DENV2 MTase가 결합하는 양을 측정하기 위하여 quantitative real time PCR(RT-PCR)을 수행하였다(도 2). 그 결과 13차 RNA pool을 사용하여 RT-PCR을 통해 DNA를 얻어 크게 그룹1(G1, 유사 시퀀스가 가장 많은 그룹), 그룹2(G2, 두 번째로 유사 시퀀스가 많은 그룹) 및 17개의 개별 클론으로 분류하였고(도 3), 이들이 MTase에 특이적으로 결합하는지 알아보기 위해 RNA 앱타머 3' 말단에 비오틴 프로브를 연결하여 이를 확인하고(도 4a), 또한 이들이 MTase의 활성도 억제할 수 있는 능력이 있는지 확인하기 위해 m7G cap에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 SELEX를 통해 얻은 RNA 앱타머를 선별하였다(도 4b). 그 후 선별된 개별 클론 3번(G3, 서열번호 1) 앱타머의 최적화를 위해 전체 길이의 RNA 앱타머를 단계적으로 절단하여 59mer(G3 59mer), 45mer(G3 45mer), 33mer(G3 33mer)를 제작하여(도 5a), 이 중 G3 33mer는 DENV2 MTase에 특이적으로 결합하지 못함을 확인하였다(도 5b). 최적화된 G3 45mer의 루프부분을 변이시킨 변이체를 제작(Mut G3 45mer, 도 6a)하여 네카티브 컨트롤로써 사용하였고, G3 45mer 앱타머의 DENV2 MTase에 대한 결합 친화도를 확인하였다(도 6b 및 6c). 또한, DENV2 MTase에 대한 서열번호 1 및 서열번호 2의 결합이 SELEX를 통해 선별된 염기서열을 통한 특이적 결합이라는 것을 확인하기 위해 경합 분석을 수행하여 이를 확인하였다(도 7). 아울러, G3 45mer 앱타머가 DENV2 MTase뿐만 아니라 다른 혈청형인 DENV1, 3, 4 MTase에도 작용할 수 있는지 확인하기 위한 실험을 수행하였고, 그 결과 G3 45mer 앱타머는 DENV2 및 3에 특이적으로 결합하며 MTase의 활성을 억제하는 능력을 가짐을 보였다(도 8a 및 8b).
서열 서열목록
G3 5'-GGGAGAGCGGAAGCGUGCUGGGCAGUGGUUGGGCACAUAUAGACUGUGUAAUUCGUAUAGUGUGCAUAACCCAGAGGUCGAUGGAUCCCCCC-3' 서열번호1
G3 45mer 5'-GGUUGGGCACAUAUAGACUGUGUAAUUCGUAUAGUGUGCAUAACC-3' 서열번호2
상기 목적을 달성하기 위한 다른 양태로서, 본 발명은 상기 RNA 앱타머를 포함하는 뎅기바이러스 감염 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서는, 상기 RNA 앱타머가 뎅기바이러스 혈청형 2 및 3의 메틸트랜스퍼라제에 결합하기 때문에, 이러한 성질을 이용하여 뎅기바이러스가 감염되었는지 여부를 진단하는 데에 활용할 수 있다.
본 발명에서 용어, RNA 앱타머, 뎅기바이러스 및 MTase(메틸트랜스퍼라제)은 상기에서 설명한 바와 동일하다.
본 발명에서 상기 바이러스를 검출하기 위해, 최근에는 면역크로마토그래피시험법 (immunochromatographic assay test, ICA)를 많이 사용하고 있는데, 이 시험법은, 혈청 내 존재하는 항체와 니트로셀룰로스 막에 결합해 있는 항체가 결합하여 발색되는 원리를 이용하지만, 빠른 진단 방법에도 불구하고 민감도 및 특이도가 비교적 낮다. 따라서, 예를 들어 대상 인자에 대해 항체-항원 결합력과 유사한 또는 더 강력한 친화력 및 특이성을 가지는 본 발명의 RNA 앱타머를 포함하는 조성물을 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물에서 상기 RNA 앱타머는 서열번호 1 또는 2의 염기서열을 가질 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 뎅기바이러스 감염 진단용 키트를 제공할 수 있다.
상기 뎅기바이러스 감염 진단용 키트는 DENV MTase에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머를 가지는 DENV MTase 진단용 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하며, 본 발명의 키트를 이용할 경우, 기존에 이용한 방법을 사용하는 데 비해 단시간에 간편하게 높은 특이도로 인해 정확성을 높일 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 진단용 키트는 필요에 따라 완충용액 및 검출의 수행과 분석을 위한 용기들을 추가로 포함할 수 있는데, 병, 통(tub), 작은 봉지(sachet), 봉투(envelope), 튜브, 앰플(ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있으며 이들은 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 용기는, 처음에는 용기의 일부이거나 기계적, 접착성, 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는, 완전히 또는 부분적으로 분리할 수 있는 마개를 장착할 수 있다. 용기는 또한 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는, 스토퍼가 장착될 수 있다. 상기 키트는 외부 패키지를 포함할 수 있으며, 외부 패키지는 구성 요소들의 사용에 관한 사용설명서를 포함할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 뎅기바이러스 감염이 의심되는 분리된 개체의 시료에서 뎅기바이러스 혈청형 2 및 3의 메틸트랜스퍼라제의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 뎅기바이러스 감염 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공할 수 있다.
뎅기바이러스 감염이 의심되는 개체의 시료는 생체 내 및 생체 외, 분리된 시료 등을 이용할 수 있으며, 구체적으로는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특히, 본 발명의 검출하는 방법은 본 발명의 바이러스 진단용 키트를 이용할 수 있다. 그러나, 본 발명의 RNA 앱타머를 이용하는 한 상기에 제한되지 않고 당업계에 공지된 기술에 따라 적절하게 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 뎅기바이러스 감염 진단을 위한 정보제공 방법은 뎅기바이러스 m7G cap을 특이적으로 탐지할 수 있는 항원을 사용할 수 있다. MTase와 RNA 앱타머를 먼저 반응시키고, 기질 RNA를 넣는 방법으로 상기 RNA 앱타머에 의해 MTase 활성이 억제되면 메틸화된 기질 RNA 검출이 감소함으로써, 확인할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 뎅기바이러스 MTase와 결합하여 그 활성을 억제하는 RNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 뎅기바이러스 감염의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
뎅기바이러스에 감염된 경우, 바이러스가 발현시키는 비구조 단백질 중 하나인 NS5 단백질은 뎅기바이러스의 구조적 특징인 type I RNA cap(m7GpppAm)의 cap 형성에 관여하는 것으로 알려져 있다. 이때, NS5의 N-말단 도메인인 MTase 활성을 억제하게 되면 바이러스 5'-말단의 메틸화가 일어나지 않게 되고 바이러스 단백질 생산이 억제되며 바이러스 게놈 복제가 억제됨으로써, 결과적으로 뎅기바이러스 감염 치료 활성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 RNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 뎅기바이러스 감염 치료용 약학 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 유효성분을 10 내지 95 중량%로 본 발명의 RNA 앱타머를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 뎅기바이러스 감염 치료용 약학 조성물은 상기 유효성분 외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 함유할 수 있다.
본 발명의 뎅기바이러스 감염 치료용 약학 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하 여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다.
본 발명의 뎅기바이러스 감염 치료용 약학 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다.
본 발명의 뎅기바이러스 감염 치료용 약학 조성물은 인간을 포함한 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 예를 들면, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피하내 경로를 통해 통상적인 방식이 가능하다. 이때, 투여방법은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 비경구투여가 바람직하다.
본 발명 뎅기바이러스 감염 치료용 약학 조성물의 투여량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 구체적으로는 본 발명의 치료제의 RNA 앱타머의 유효량은 세포 내 농도가 1 nM 내지 1000 nM, 보다 구체적으로는 100 nM 내지 500 nM이 되도록 한다. 이때, 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회에 나누어 투여할 수도 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 RNA 앱타머 및 뎅기바이러스 혈청형 2의 MTase 간의 결합을 저해하는 제제를 스크리닝하는 단계를 포함하는, 뎅기바이러스 혈청형 2의 MTase의 활성 억제제 또는 뎅기바이러스 감염 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명의 RNA 앱타머 및 뎅기바이러스 혈청형 2의 MTase 간의 결합을 저해하는 염기서열을 DNA/RNA 데이터베이스에 조회하여 상기 서열을 포함하는 리간드 또는 제제를 검색하는 단계; 및, 검색된 리간드 또는 제제의 서열이 뎅기바이러스 혈청형 2를 특이적으로 감지하여 상기 바이러스 복제를 저해할 수 있는 저해제를 검색하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 RNA 앱타머는 뎅기바이러스 혈청형 2 및 3 MTase에 특이적으로 강하게 결합하여 그 활성을 억제할 수 있으므로 뎅기바이러스 혈청형 2 및 3 감염에 대한 치료제로 사용할 수 있으며, 뎅기바이러스 혈청형 2 및 3 복제를 저해할 수 있는 저해제 스크리닝 제제로 활용, 나아가 뎅기바이러스 혈청형 2 및 3을 특이적으로 감지할 수 있는 바이러스 진단제 및 뎅기바이러스 혈청형 2 및 3 치료용 약학 조성물로도 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 MTase에 결합하는 RNA 앱타머를 선별하기 위한 SELEX 방법을 나타내는 모식도이다.
도 2는 13차 및 15차 RNA pool과 DENV2 MTase가 결합하는 양을 정량적 PCR을 수행한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 13차 SELEX pool 앱타머 클론들의 염기서열분석 결과를 나타내는 그림이다.
도 4a는 앱타머 클론 RNA들의 EMSA 수행 결과를 나타내는 그림이다.
도 4b는 MTase와 결합하는 클론 앱타머의 MTase methylation 활성 억제를 나타내는 그림이다.
도 5a는 선별된 G3 앱타머의 절단된 형태의 앱타머들의 예상되는 2차 구조를 나타내는 그림이다.
도 5b는 G3에 대한 절단된 형태의 RNA 앱타머들의 MTase에 대한 결합을 확인한 그림이다.
도 5c는 G3에 대한 절단된 형태의 RNA 앱타머들의 MTase 활성 억제를 확인한 그림이다.
도 6a는 최적화된 G3 45mer 및 변이체(mut G3 45mer)의 2차 구조를 나타내며, 변이 대상인 루프 부분은 노란색으로 표시하였다.
도 6b는 G3 45mer 및 mut G3 45mer의 MTase에 대한 결합능력을 수치상으로 확인한 그래프이다.
도 6c는 G3 45mer의 MTase에 대한 친화도를 나타낸 그래프이다.
도 7은 G3 45mer 앱타머가 MTase에 대하여 특이적으로 결합함을 나타내는 그림이다.
도 8a는 G3 45mer 앱타머의 DENV 혈청형에 따른 MTase 결합능력을 나타내는
도 8b는 G3 45mer 앱타머의 DENV 혈청형에 따른 MTase 활성 억제 능력을 나타내는 그림이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1 : SELEX 앱타머 발굴
SELEX(Systemic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) 과정을 수행하는데 필요한 RNA 라이브러리를 제조하기 위하여, 먼저 40개의 염기가 무작위로 들어간 단일 올리고뉴클레오티드(GCGGAAGCGTGCTGGGCC-N40-CATAACCCAGAGGTCGAT-3', 이때 N40은 A,T,G,C가 동일 mol 수로 존재하는 40개의 뉴클레오티드)를 주형으로 이용하여 sel-5'프라이머(서열번호 3; RNA를 합성하기 위한 T7 RNA 중합효소 프로모터 포함)와 sel-3'프라이머(서열 번호 4; BamHI 제한효소 서열을 포함)를 사용하고 PCR을 통해 DNA 라이브러리를 제조하였다. 100 nM DNA 올리고뉴클레오티드, 10X PCR 버퍼, 10 pmole sel-5'프라이머(서열번호 3), 10 pmole sel-3'프라이머(서열번호 4), 10 uM dNTP, DNA 중합효소(Abm) 1.5 unit를 혼합하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 30초의 조건으로 10 사이클을 반복한 뒤 DNA를 증폭시켜 DNA 라이브러리를 제조하였다.
PCR을 통해 만들어진 DNA 라이브러리를 주형으로 T7 RNA 중합효소(Durascribe, epicentre)를 이용하여, 시험관 내 전사 과정을 거쳐 다양한 염기서열을 가지는 RNA 라이브러리를 제조하였다. 이때 RNA 분해 효소에 저항성이 있는 RNA를 제조하기 위하여, 2' 데옥시 2' 플루오로 CTP와 UTP 그리고 정상적인 GTP와 ATP들과 T7 RNA 중합효소를 이용하여 시험관에서 합성된 주형의 전사에 의해 플루오로기 매 2번 위치가 피리미딘기로 변형된 RNA를 생산하였다.
구체적으로, DNA 라이브러리, 10X 전사 버퍼(transcription buffer), 10 mM DTT, 5 mM ATP, GTP, 2'-F CTP, 2'F-UTP, T7 RNA 중합효소 1 ㎕를 혼합하여 16시간 동안 반응시켰다. DNase를 처리하여 30분간 반응시켜 주형으로 사용된 DNA를 제거하고, 7M 우레아-8% 폴리아크릴아마이드 겔에서 RNA 라이브러리를 추출하고, UV 스펙트로미터(Biomate3/Thermo)로 정량하였다. RNA 라이브러리 염기서열은 A, G, C 및 U 각각 위치에 같은 몰수로 혼입된 40개의 뉴클레오티드를 나타내는 서열을 갖는다.
서열 서열목록
sel-5'-프라이머 5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCGGAAGCGTGCTGGG-3' 서열번호3
sel-3'프라이머 5'-GGGGGGATCCATCGACCTCTGGGTTATG-3' 서열번호4
이하 SELEX 방법을 이용한 MTase에 특이적인 RNA 앱타머 선별 과정을 상세히 설명한다.
300 pmole 2'-F RNA 라이브러리를 1X 결합 버퍼 (30 mM Tris-Cl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 2 mM DTT, 1% BSA)와 혼합하여 20분간 상온에서 반응시킨 뒤, 20 ㎕의 Ni-NTA 아가로스 비드(QAIGEN)와 탭핑(tapping)하면서 상온에서 20분간 반응시켰다. 13000 rpm에서 10초간 원심분리하여 비드를 다운시켜 비드에 비특이적으로 결합한 RNA를 제거하고, 상층액은 150 pmole MTase와 상온에서 20분간 반응시켰다. 반응물인 RNA-MTase 복합체를 20 ㎕의 Ni-NTA 아가로스 비드와 상온에서 20분간 반응시켜 MTase에 결합한 RNA를 얻어내고, 400 ㎕의 결합 버퍼를 넣어서 탭핑하여 MTase에 약하게 결합해 있는 RNA를 제거한 후, 200 ㎕의 DEPC-DW를 넣어 페놀/에탄올 침전하여 농축시켰다.
DEPC-DW를 넣어 RNA를 녹이고, 5X RTase 버퍼, 10 mM dNTP, 10 pmole sel-3'프라이머(서열번호 4), RTase 200 unit (Abm)를 첨가하여 42에서 50분동안 반응시킨 뒤, 95에서 5분동안 RTase를 불활성화시켰다. cDNA, 10X 버퍼 5 ㎕, 25 mM MgCl2 3 ㎕, 10 pmole sel-5'프라이머(서열번호 3), sel-3'프라이머(서열번호 4), 10 ?M dNTP, DNA 중합효소(Abm) 1.5unit를 혼합하여, 95℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 30초 조건으로 PCR을 20 사이클 반복하여 DNA를 증폭시켰다. 시험관 전사 과정을 통해서 DNA를 RNA로 만들어 위와 같은 과정을 15차까지 반복하였다.
1차부터 7차까지는 RNA와 MTase의 비율을 2:1로 하여 SELEX를 하였고, 8차부터 11차까지는 MTase에 비특이적으로 결합하는 RNA pool을 제거하기 위해 tRNA를 SELEX 과정에 사용하였다. 12차와 13차는 MTase의 양을 1/5로 줄여 MTase에 더욱 높은 친화도로 결합할 수 있는 RNA를 선별하였고, 14차와 15차는 MTase 양을 1/5로 줄이면서 tRNA를 사용하는 RNA를 8배 증가시켰다.
실시예 2 : RNA 앱타머와 MTase 결합 테스트
SELEX 과정을 거친 13차, 15차 pool 및 라이브러리 RNA 60 fmole을 MTase 12 pmole과 각각 20분간 상온에서 반응시키고, Ni-NTA 아가로스 비드 20 ㎕가 들어 있는 튜브에 결합 버퍼 200 ㎕를 넣어 부피를 맞춘 후, 상온에서 20분간 반응시키고 탭핑하면서 20분간 반응시켰다. 13000 rpm에서 10초동안 원심분리하여 비드에 비특이적으로 결합한 RNA를 제거하고, 결합 버퍼 400 ㎕를 다시 넣어서 탭핑을 통해 비특이적으로 결합되어 있는 RNA를 제거한 후, DEPC-DW 200 ㎕를 넣고 페놀/에탄올 침전법으로 농축시켰다. 농축시킨 RNA는 DEPC-DW로 녹이고, 5X RTase 버퍼, 10 mM dNTP, 10 pmole sel-3'프라이머 RTase를 첨가하여, 42℃에서 50분 동안 반응시키고, 95℃에서 5분 동안 RTase를 불활성화 시켰다. 이때, 생성된 DNA의 실시간 양을 측정하기 위해 실시간 PCR을 다음과 같은 조건으로 사용하였는데, 구체적으로 cDNA 2 ㎕, 10X PCR 버퍼, 10 pmole sel-5'프라이머(서열번호 3), 10 pmole sel-3'프라이머(서열번호 4), 10 uM dNTP, 10X sybr green, DNA 중합효소 1.5 unit (Abm)를 혼합하여, 95℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 30초의 조건으로 40 사이클 반복하여 MTase에 결합한 RNA양을 측정하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, 정량적 PCR 수행 결과, 13차 RNA pool은 28%, 15차 RNA pool은 25%의 RNA가 MTase에 결합하고, 또한, 13차 RNA pool이 15차 RNA pool 보다 비표적 물질인 비드에 결합하지 않았다. 따라서, 비표적 물질인 비드에는 결합하지 않으면서 표적 단백질인 MTase에 많이 결합하는 13차 RNA pool을 선택하여 RT-PCR을 통해 DNA를 증폭시켰다.
도 3에 나타난 바와 같이, 서열 분석 결과로 두 개의 그룹(유사 서열이 가장 많은 그룹; G1, 두 번째로 유사 서열이 많은 그룹; G2)과 17개의 개별 클론을 얻었다.
실시예 3 : MTase에 대한 친화도 확인
SELEX를 통해 13차 RNA pool로부터 얻은 34개의 클론들 중, MTase에 높은 친화도로 결합하는 앱타머를 선별하기 위하여 G1, G1-1, G2와 개별 클론 1, 2, 3, 7, 14 RNA 앱타머로 EMSA(Electrophoretic mobility shift assay)를 수행하였다.
상기 앱타머들은 RNA 60 fmole과 MTase 12 pmole, tRNA 2 ㎍, 10X 결합 버퍼(300 mM Tris-Cl pH7.5, 1.5 M NaCl, 15 mM MgCl2, 20 mM DTT) 2 ㎕와 DEPC-D.W를 넣어서 20 ㎕를 만들고 상온에서 20분동안 반응시켰다. 6X 로딩 버퍼를 넣고 8% native gel (8% acrylamide, 1X TBE, 10 mM MgCl2, 2% glycerol)에 0.5X TBE 버퍼에서 100V로 2시간 30분동안 전기영동 하였다. 전기영동이 끝나면, RNA를 0.45 ㎛ nylon transfer 멤브레인(Whatman)으로 0.25X TBE에서 200 mA로 4에서 1시간동안 트랜스퍼한 뒤 UV-cross linking시켰다. 멤브레인을 블로킹 버퍼(Norther max, Ambion)에 넣고 하이브리다이저(hybridizer)에서 1시간동안 블로킹하였다. 3’sel-3 biotin probe (5’-biotin GGGGGGATCCATCGACCTCTGGGTTATG-3’) 10 pmole를 넣고 40에서 16시간 동안 반응시킨 후, 워싱 버퍼(Ambion)로 5분씩 2번 워싱하고, 블로킹 버퍼 5 ml에 streptavidin-HRP(novex)를 처리하여 30분동안 반응시켰다. 워싱 버퍼로 5분씩 5번 워싱하여 비특이적으로 결합하는 streptavidin-HRP 제거하고, 멤브레인을 ECL 용액(Western Bright, advansta)에 2분간 반응시킨 후, X-ray 필름에 감광시켜 밴드를 확인하였다.
도 4a에 나타난 바와 같이, G1, G1-1, G2와 개별 클론 1, 2, 3, 14 RNA 앱타머의 밴드가 시프트되었음을 확인하였다.
실시예 4 : DENV 5' UTR RNA (메틸화 기질 RNA) 제작
5' 말단이 GpppA로 capping 된 DENV 5' UTR RNA를 제작하였다. 구체적으로, DENV2 5'프라이머(서열번호 5), DENV2 3'-1프라이머(서열번호 6), 10X PCR 버퍼, 10?M dNTP, DNA 중합효소 1.5 unit를 혼합하여 PCR을 수행하였다. 다음으로, PCR 주형을 이용하여 DENV2 5'프라이머와 DENV2 3'-2 프라이머(서열번호 7)를 같은 조건으로 PCR하였고, 또한, DENV2 5'프라이머와 DENV2 3'-3 프라이머(서열번호 8)로 PCR을 수행하여 DENV2 5'UTR 전체 DNA를 얻었다. 구체적인 PCR 조건은 95℃에서 5분간 유지하고, 95℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 30초의 조건으로 30 사이클을 반복하여 수행하였다. 상기 DENV2 5'UTR 전체 DNA를 주형으로 하여, 10X 버퍼, 10 mM DTT, 10 mM GTP, CTP, UTP, 2 mM ATP, 8 mM m7GpppA / GpppA (NEB), DNA 1 ㎍, T7 중합효소 100 unit (Takara), RNase 저해제 8 unit (emzynomics)를 혼합하여 37℃에서 3시간 동안 반응시켜 5' 말단에 cap이 있는 RNA를 제작하였다.
DENV1 5'UTR, DENV3 5'UTR, DENV4 5'UTR RNA 모두 위와 같은 방법으로 제작하였다.
DENV1 5'UTR은 DENV1 5'프라이머(서열번호 9), DENV1 3'-1프라이머(서열번호 10), DENV1 3'-2프라이머(서열번호 11), DENV1 3'-3프라이머(서열번호 12)를 이용하였다.
DENV3 5'UTR은 DENV3 5`프라이머(서열번호 13), DENV3 3'-1프라이머(서열번호 14), DENV3 3'-2프라이머(서열번호 15), DENV3 3'-3프라이머(서열번호 16)를 이용하였다.
DENV4 5'UTR은 DENV4 5UTR 5`프라이머(서열번호 17), DENV4 3'-1프라이머(서열번호 18), DENV4 3'-2프라이머(서열번호 19), DENV4 3'-3프라이머(서열번호 20)를 이용하였다.
서열 서열목록
DENV2 5'
프라이머		 5'-TAATACGACTCACTATTAGTTGTTAGTCTACGTGGACCGACAAAGACAGATTCTTTGAGGGAGCT-3' 서열번호5
3'-1
프라이머		 5'-TATTCATCAGAGATCTGCTCTCTAATTAAAAAACTGTTAGAACTACGTTGAGCTTAGCTCCCTCA-3' 서열번호6
3'-2
프라이머		 5'-TTTCTCTCGCGTTTCAGCATATTGAAAGGCGTACTTCTCGCCTTTTTTCGTTGGTTATTCATCAG-3' 서열번호7
3'-3
프라이머		 5'-AGTGAGAATCTCTTTGTCAGCTGTTGCACAGTTGACACGCGGTTTCTCTCGC-3' 서열번호8
DENV1 5'
프라이머		 5'-TAATACGACTCACTATTAGTTGTTAGTCTACGTGGACC GACAAGAACAGTTTCGAATCGGAAGCT-3' 서열번호9
3'-1
프라이머		 5'-GTTGTTCATCAGAGATCTGCTCTCTAATAAAAAACTGTTAGAACTACGTTAAGCAAGCTTCCGAT-3' 서열번호10
3'-2
프라이머		 5'-GGTTTCTCGCGCGTTTCAGCATATTGAAAGACGGTCGACCCGTCTTTTTCCGTTGGTTGTTCATC-3' 서열번호11
3'-3
프라이머		 5'-TGAGAATCTCTTCGCCAACTGTGAAACAGTTGACACGCGGTTTCTCGC-3' 서열번호12
DENV3 5'
프라이머		 5'-TAATACGACTCACTATTAGTTGTTAATCTACGTGGACC GACAAGAACAGTTTCGACTCGGAAGCT-3' 서열번호13
3'-1
프라이머		 5'-GTTGTTCATCAGAGAT CTGCTCTCTAATAAAAAACTGTTAGCACTACGTTAAGCAAGCTTCCGAG-3' 서열번호14
3'-2
프라이머		 5'-GGTTTCTCACGCGTTTCAGCATATTGATAGACGGTTTTCCCGTCTTCTTCCGTTGGTTGTTCATC-3 서열번호15
3'-3
프라이머		 5'-CTTTTGAGAATCTCTTCGCCAACTGTGATCCAGTTGACACACGGTTTCTCAC-3' 서열번호16
DENV4 5'
프라이머		 5'-TAATACGACTCACTATTAGTTGTTAGTCTGTGT GGACCGACAAGGACAGTTCCAAATCGGAAGCT-3' 서열번호17
3'-1
프라이머		 5'-ATTTTTCCAGA GATCTGCTCTCTATTCAAACAAACTGTTAGAACTGTGTTAAGCAAGCTTCCGAT-3' 서열번호18
3'-2
프라이머		 5'-TCTCTCGCGTTTCAGCATATTGAAAGGTGGTCTAACCACCTTTTTTCGTTGGTTCATTTTTCCAG-3' 서열번호19
3'-3
프라이머		 5'-TGAGAATCTCTTCACCAACCCTTGAGGGGTTGATACGCGGTTTCTCTCGCGT-3' 서열번호20
실시예 5 : MTase의 메틸화 활성 억제 앱타머 스크리닝
도 4a에서 확인된 MTase에 결합하는 RNA 앱타머들(G1, G1-1, G2 및 개별 클론 1, 2, 3, 14)이 MTase의 활성도 억제할 수 있는지 확인하기 위해, 시험관 내 메틸화 분석을 실시하였다. 5' 말단이 GpppA로 capping 된 DENV 5' UTR RNA (메틸화 기질 RNA)가 MTase에 의해서 메틸화되는 것을, m7G cap에 특이적으로 결합하는 항체를 사용해서 확인하였다.
실험조건은 MTase와 앱타머를 먼저 반응시킨 후, 기질 RNA를 넣는 방법으로 수행하였다. 구체적으로, 10X 버퍼 (50 mM Tris-Cl pH7, 50 mM NaCl, 2 mM DTT), 앱타머 48 pmole, MTase 6 pmole, DEPC-D.W를 혼합하여 총 부피 10 ㎕로 만들고 상온에서 20분간 반응시켰다. 10X buffer, 80 uM SAM, GpppA 기질 RNA 1 pmole과 DEPC-D.W를 혼합하여 총 부피 20 ㎕로 만들어 22℃에서 30분간 반응시킨 후, 2X RNA dye를 넣고 95℃에서 5분간 heating하여 6% 우레아 겔로 전기영동한 후 밴드를 확인하였다. 다음으로, 겔을 0.45 ㎛ nylon transfer 멤브레인(Whatman)으로 0.25X TBE에서 200 mA로 4℃에서 1시간 동안 트랜스퍼한 뒤 UV-cross linking시켰다. 멤브레인을 블로킹 버퍼(Norther max, Ambion)에 넣고 4℃에서 1시간 동안 블로킹하고, m7G-cap 항체(SYSY)를 처리하여 1시간 동안 반응시켰다. 워싱 버퍼(0.2% Tween20, 1X PBS)로 5분 간격으로 30분 동안 워싱하고, 2차 항체(anti-mouse HRP antibody)를 4℃에서 1시간 동안 처리하였다. 이후, 워싱 버퍼로 5분 간격으로 30분 동안 워싱하여 비특이적으로 결합하는 항체를 제거하고, ECL 용액을 멤브레인에 2분간 반응시켜 X-ray 필름에 감광시켜 밴드를 확인하였다.
도 4b에 나타난 바와 같이, G2와 클론 1, 2, 3, 14 앱타머들에 의해서 MTase 활성이 억제되어, 메틸화된 기질 RNA 감지가 감소하는 것을 확인하였다. 이를 통해 MTase에 결합하는 능력을 지닌 RNA 앱타머들은 MTase의 활성 또한 방해 할 수 있다는 것을 확인 할 수 있었다. 반면, MTase에 결합하지 못하는 클론 7 RNA는 MTase의 활성 또한 방해하지 못하는 것을 확인함으로써 선별된 앱타머들의 MTase 활성 방해가 단지 RNA에 의한 비특이적인 작용이 아님을 확인할 수 있었다. 또한, 가장 많은 서열이 확인된 G1 앱타머는 MTase에 잘 결합하지만 메틸화 활성은 약 50% 정도밖에는 억제하지 못하는 것을 확인하였다.
실시예 6 : 절단된 형태의 RNA(truncated RNA) 앱타머 제작
선택된 클론 3의 RNA 앱타머 최적화를 위해 전체길이의 RNA 앱타머를 단계적으로 잘라내어 59mer, 45mer, 33mer의 앱타머로 절단하였다(도 5a). G3 59mer RNA 앱타머를 5' 프라이머 (서열번호 21) 및 3'-1 프라이머 (서열번호 22) 로 PCR을 수행한 뒤에, PCR 주형을 이용하여 G3 59mer 5'프라이머, G3 59mer 3'-2프라이머 (서열번호 23) 로 PCR하여 DNA를 얻었다. G3 45mer RNA 앱타머를 5' 프라이머 (서열번호 24) 및 3' 프라이머 (서열번호 25) 로, G3 33mer RNA 앱타머를 5' 프라이머 (서열번호 26) 및 3' 프라이머 (서열번호 27)로 각각 PCR을 통해 DNA를 증폭시켰다. PCR 조건은 10X PCR 버퍼 5 ul, 25 mM MgCl2 3 ul, 10 pmole 5'프라이머(서열번호 3), 10 pmole 3'프라이머(서열번호 4), 10 uM dNTP, DNA 중합효소 1.5 unit (Abm)를 혼합하여, 95℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 30초의 조건으로 25 사이클을 반복, 수행하였다. 증폭시킨 이중나선 DNA 주형을 T7 RNA 중합효소를 이용하여 시험관 내 전사를 수행하여 RNA를 제작하였고, 이때 피리미딘 뉴클레오티드들은 2'-플루오로기로 치환된 것을 이용하였다. 제작된 각각의 RNA 앱타머들은 우레아 폴리아크릴아미드 겔로 전기영동한 후 정제하였다.
상기 제작된 RNA 앱타머들 중 G3 33mer RNA 앱타머를 제외한 G3 전체길이, G3 59mer 및 G3 45mer RNA 앱타머들은 DENV2 MTase에 결합하였으며, 또한 DENV2 MTase의 메틸화 활성을 억제하는 것을 확인하였다(도 5b 및 도 5c). 따라서, 이후 실험에 사용할 앱타머는 가장 길이가 작은 G3 45mer RNA 앱타머를 사용하였다.
서열 서열목록
G3 59mer 5'-프라이머 5'-TAATACGACTCACTATAGGCAGTGGTTGGGC-3' 서열번호21
G3 59mer 3'-1 프라이머 5'-ACGAATTACACAGTCTATATGTGCCCAACC-3' 서열번호22
G3 59mer 3'-2 프라이머 5'-GACCTCTGGGTTATGCACACTATACGAATTA-3' 서열번호23
G3 45mer 5'-프라이머 5'-TAATACGACTCACTATAGGTTGGGCACATATAGAC-3 서열번호24
G3 45mer 3'-프라이머 5'-GGTTATGCACACTATACGAATTACACAGTCTATAT-3' 서열번호25
G3 33mer 5'-프라이머 5'-TAATACGACTCACTATAGGCACATATAGAC-3' 서열번호26
G3 33mer 3'-프라이머 5'-GCACACTATACGAATTACACAGTCTATATG-3' 서열번호27
실시예 7 : G3 45mer RNA 앱타머 변이체 제작
G3 45mer RNA 앱타머의 변이체를 만들기 위해서 앱타머의 루프 부분을 변이시킨 형태를 제작하였다(도 6a). 상기 실시예 2와 같은 방법으로 정량적 PCR을 통해서 G3 45mer는 MTase에 대한 결합 능력을 확인한 결과, G3 45mer RNA 앱타머와 MTase는 61% 결합하는 것을 확인하였고, 변이체인 Mut G3 45mer는 0.07% 결합하였다(도 6b).
또한, 이러한 결합력을 수치화하기 위해서, G3 45mer 앱타머의 MTase에 대한 친화도를 알아보았다. G3 45mer 앱타머의 양을 고정하고, MTase 단백질을 농도별로(0.3nM~218.7nM) 증가시켜 MTase에 결합한 앱타머의 양을 정량적 PCR을 통해 확인하였다. 그 결과, G3 45mer 앱타머는 DENV2 MTase에 대하여 28.04±2.12nM의 친화도를 가지며 결합하는 것을 확인 할 수 있었다. 반면, negative control인 Mut G3 45mer 앱타머는 단백질 농도의 증가에 따라 MTase에 대한 결합이 증가하지 않음을 확인 하였다(도 6c).
실시예 8 : DENV2 MTase에 특이적 결합 확인
DENV2 MTase에 대한 G3 및 G3 45mer의 결합이 단순히 RNA에 의한 비특이적인 결합이 아니라 SELEX를 통해 선별된 염기서열을 통한 특이적 결합이라는 것을 확인하기 위해서 경합 분석(competition assay)을 실시하였다.
PCR을 통해 얻은 DNA 1 ㎍ 10X 버퍼, 10 mM DTT, 10 mM ATP, CTP, UTP, 5 mM GTP, 20 mM 5’biotin 표지 GMP, T7 RNA 중합효소 1 ㎕ (DuraScribe, epicentre)을 이용하여 5'말단에 biotin이 표지된 RNA를 얻었다. 5'biotin 표지된 G3 앱타머에 비표지 G3, G3 45mer, Mut G3 45mer 앱타머를 10, 100, 1000배의 비율로 처리하여 상온에서 20분간 결합시키고, Ni-NTA 아가로스 비드 20 ㎕와 탭핑하면서 20분 반응시켰다. 13000 rpm에서 10초 동안 원심분리하여 MTase에 결합하지 않은 RNA를 제거하고, 결합 버퍼 400 ㎕를 넣고 탭핑하여 비특이적으로 결합하는 RNA를 제거하였다. DEPC-DW 20 ㎕와 페놀 용액 16 ㎕를 넣고 10분간 원심분리(13000 rpm)한 뒤, 상층액 10 ㎕를 얻어서 8% 우레아 겔에 180V로 1시간동안 전기영동하였다. 이후 실험은 상기 실시예 4와 같은 방법으로 수행하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, Mut G3 45mer는 MTase와 G3의 결합을 방해하지 못하였으며, 비표지 G3 앱타머를 100배 넣었을 때부터, Mut G3 45mer는 1000배를 넣었을 때 경합이되는 것을 확인하였다. 또한, 5'biotin 표지 G3 45mer 앱타머에 비표지 G3 45mer 앱타머, G3 앱타머, Mut G3 45mer 앱타머를 10, 100, 1000배 비율로 처리한 결과, 비표지 G3 45mer 앱타머, G3 앱타머를 100배 처리했을 때, 경합이 되는 것을 확인할 수 있었고, Mut G3 45mer 앱타머는 경합이 되지 않는 것을 확인하였다.
이를 통해서 G3 앱타머, G3 45mer 앱타머와 MTase의 결합이 선별된 특정 염기서열과 그 염기서열이 이루는 구조를 통한 특이적인 결합이라는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 9 : 선별 앱타머와 DENV 혈청형 MTase의 결합 및 메틸화 활성 억제 확인
G3 45mer 앱타머가 DENV2 MTase뿐만 아니라 다른 혈청형인 DENV1, 3, 4 MTase에도 작용할 수 있는지 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
상기 실시예 2와 같은 방법으로 정량적 PCR을 통해서 수행한 결과, G3 45mer 앱타머는 DENV2 MTase뿐만 아니라 DENV3 MTase에도 결합함을 확인하였다(도 8a). 또한, DENV 혈청별로 5'UTR RNA에 대하여, G3 45mer 앱타머에 의한 MTase 활성을 확인한 결과, 도 8a와 마찬가지로 DENV2 MTase, DENV3 MTase 활성을 억제하는 것을 확인 할 수 있었다(도 8b). Mut G3 45mer는 모든 타입의 MTase에 결합능력이 없으며, MTase의 활성 또한 방해하지 못하는 것을 알 수 있었다.
상기 실시예들을 통해, G3 및 G3 45mer 앱타머는 DENV2 및 DENV3 MTase에 특이적으로 결합하며, MTase 활성을 억제 할 수 있음을 확인하였다.
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Claims (10)

  1. 뎅기바이러스 혈청형 2 및 3의 메틸트랜스퍼라제(Methyltrasnferase)에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 또는 2로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열로 이루어진, RNA 앱타머.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 RNA 앱타머는, U(우라실)와 C(시토신)의 2' 히드록실기가 플루오르기로 치환되어 있는 RNA 앱타머.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 RNA 앱타머는 뎅기바이러스 혈청형 2 및 3의 메틸트랜스퍼라제에 결합하여 그 활성을 억제하는 것인, RNA 앱타머.
  4. 제1항의 RNA 앱타머를 포함하는 뎅기바이러스 감염 진단용 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 조성물은 뎅기바이러스 혈청형 2 및 3의 감염을 진단하는 것인, 조성물.
  6. 제4항의 조성물을 포함하는 뎅기바이러스 감염 진단용 키트.
  7. 제1항의 RNA 앱타머를 이용하여, 뎅기바이러스 감염이 의심되는 분리된 개체의 시료에서 뎅기바이러스 혈청형 2 및 3의 메틸트랜스퍼라제의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 뎅기바이러스 감염 진단을 위한 정보의 제공 방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제1항의 RNA 앱타머 및 뎅기바이러스 혈청형 2 및 3의 메틸트랜스퍼라제 간의 결합을 저해하는 제제를 스크리닝하는 단계를 포함하는, 뎅기바이러스 혈청형 2 및 3의 메틸트랜스퍼라제의 활성 억제제 또는 뎅기바이러스 감염 치료제를 스크리닝하는 방법.


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