WO2020111753A1 - Julgi의 구아닌-사중합체 관련 질환의 진단 및 치료 용도 - Google Patents

Julgi의 구아닌-사중합체 관련 질환의 진단 및 치료 용도 Download PDF

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조현우
이성배
조현섭
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재단법인대구경북과학기술원
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    • G01N33/6845—Methods of identifying protein-protein interactions in protein mixtures

Definitions

  • the present invention relates to the diagnosis and treatment use of JULGI for a disease related to guanine-polymer, more specifically, a guanine-tetrapolymer (G-quadruplex) comprising a JULGI protein or a protein having 80% or more homology to the protein )
  • Detection composition a diagnostic composition comprising the detection composition, and a diagnostic kit comprising the diagnostic composition, a diagnostic method for degenerative neurological disease, cancer or viral infection disease having pathological correlation with guanine-tetrapolymer, JULGI protein
  • it relates to the prevention or treatment of degenerative neurological diseases, cancer, or viral infection diseases of a pharmaceutical composition comprising a protein having 80% or more homology with the protein, or a mutant protein thereof.
  • Degenerative neurological diseases and cancers are caused by the accumulation of functional mutations in key genes due to a wide range of effects from genetic causes to the environment. To date, various genes having pathological correlations with the above diseases have been identified, but the exact mechanism or cause of the onset is still unclear. Especially, in the case of degenerative neurological diseases, there is no way to treat the disease and delay the progression of symptoms. Prescribing treatment is being performed. Therefore, in order to fundamentally treat the above diseases, research and development are required in various aspects, from molecular biological causes to diagnosis and treatment.
  • the guanine-tetrapolymer (G-quadruplex) structure is a secondary structure formed by the formation of four guanine (Guanine) base Hoogsteen-base pairing.
  • Abnormal formation or dissociation of the structure has been reported to cause major diseases such as degenerative neurological diseases and cancer, and is known to have a close pathological correlation with various other diseases. More specifically, an increase in the GGGGCC repeat sequence present in the first intron of the C9orf72 gene in amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and frontotemporal dementia (FTD), which are degenerative neurological diseases, is commonly observed.
  • ALS amyotrophic lateral sclerosis
  • FTD frontotemporal dementia
  • G-quadruplex structure formed from a transcript and a peptide generated by translation therefrom are closely related to the development of the disease.
  • G-quadruplex-forming repeat sequences are also observed in genes and non-coding RNAs related to various degenerative neurological diseases, indicating that the G-quadruplex structure and degenerative neurological diseases are closely related to pathology. It is shown (Reberto Simone et al., 2015, FEBS Letters).
  • proto-oncogenes which are closely related to cancer induction, also have a G-quadruplex-forming base sequence at a major regulatory site that regulates gene expression, which is known to play an important role in gene expression regulation.
  • NRAS Neuroroblastoma RAS viral oncogene homolog
  • it has a G-quadruplex-forming base sequence at 5'UTR, and the gene is expressed by deletion or mutation of the G-quadruplex-forming base sequence. It has been reported that (translation) is significantly increased.
  • G-quadruplex in the promoter region on DNA or 5'UTR region on RNA of many proto-oncogenes means that gene expression regulation through regulation of G-quadruplex structure formation is important in the development of cancer. will be.
  • studies showing that functional mutagenesis of helicase and protein chaperone, which modulate G-quadruplex structure formation, affect cancer development are also closely related to the regulation of cancer and G-quadruplex structure formation. Is to show
  • G-quadruplex guanine-tetrapolymer
  • an object of the present invention is to provide a composition for detecting guanine-tetrapolymer (G-quadruplex), comprising a JULGI protein or a protein having 80% or more homology with the protein.
  • compositions for diagnosing degenerative neurological diseases, cancer or viral infection diseases due to the guanine-tetrapolymer (G-quadruplex) binding activity of the JULGI protein containing the composition, and diagnosis comprising the diagnostic composition
  • Another object is to provide a kit.
  • the present invention comprises the steps of measuring the activity of a protein having 80% or more homology with JULGI protein or the protein in a biological sample derived from a subject, information for diagnosis of degenerative neurological disease, cancer or viral infection disease
  • Another object is to provide a method of providing.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of degenerative neurological diseases, comprising a JULGI mutant protein or a gene encoding the protein as an active ingredient.
  • the present invention is a JULGI protein or a protein having 80% or more homology with the protein; Another object is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer or viral infection disease, which contains the gene encoding the protein as an active ingredient.
  • the present invention provides a composition for detecting guanine-tetrapolymer (G-quadruplex), comprising a JULGI protein or a protein having 80% or more homology with the protein.
  • the JULGI protein may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • the JULGI protein may be one that binds to a guanine-rich sequence or RNA guanine-tetrapolymer.
  • the present invention includes a composition for diagnosing a degenerative neurological disease, cancer or a viral infection disease due to the guanine-tetrapolymer (G-quadruplex) binding activity of the JULGI protein, including the composition for detection, and the diagnostic composition Diagnostic kit.
  • a composition for diagnosing a degenerative neurological disease, cancer or a viral infection disease due to the guanine-tetrapolymer (G-quadruplex) binding activity of the JULGI protein including the composition for detection, and the diagnostic composition Diagnostic kit.
  • the present invention comprises the steps of measuring the activity of a protein having 80% or more homology with JULGI protein or the protein in a biological sample derived from a subject, information for diagnosis of degenerative neurological disease, cancer or viral infection disease Provide a method of providing.
  • the activity measurement may be to determine whether the binding of the JULGI protein and guanine-tetrapolymer.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of degenerative neurological diseases, comprising a JULGI mutant protein or a gene encoding the protein as an active ingredient.
  • the JULGI mutant protein is a 20-, 80-, or 146-th Arginine residue in the RanBP2-type ZnF (Zinc finger) domain of the JULGI protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 alanine (Alanine) may be substituted with a residue, the RNA binding activity may be deleted.
  • the JULGI mutant protein is alanine at the 20th, 79th, or 152th Arginine residues in the RanBP2-type ZnF (Zinc finger) domain of the JULGI protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO:2. (Alanine) may be substituted with a residue, the RNA binding activity may be deleted.
  • the degenerative neurological disease may be caused by a structure of guanine-tetrapolymer (G-quadruplex).
  • the degenerative neurological disease includes amyotrophic lateral sclerosis (ALS), frontotemporal dementia (FTD), type 1 progressive myoclonus epilepsy type 1; EPM1), Fragile X syndrome, Spinocerebellar ataxia (SCA36) and familial Creutzfeldt-Jakob disease (CJD).
  • ALS amyotrophic lateral sclerosis
  • FTD frontotemporal dementia
  • EPM1 type 1 progressive myoclonus epilepsy type 1
  • Fragile X syndrome Fragile X syndrome
  • SCA36 Spinocerebellar ataxia
  • CJD familial Creutzfeldt-Jakob disease
  • the present invention is a JULGI protein or a protein having 80% or more homology with the protein; Or it provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer or viral infection disease, comprising the gene encoding the protein as an active ingredient.
  • the cancer or viral infection disease may be caused by the structure of guanine-tetrapolymer (G-quadruplex).
  • the cancer is pancreatic cancer, stomach cancer, liver cancer, colon cancer, colon cancer, rectal cancer, brain cancer, breast cancer, kidney cancer, thyroid cancer, bladder cancer, esophageal cancer, pharyngeal cancer, oral cancer, snow cancer, uterine cancer, ovarian cancer, leukemia , Prostate cancer, testicular cancer, biliary tract cancer, gallbladder cancer, sarcoma, skin cancer and lung cancer may be any one or more selected from the group consisting of.
  • the virus-infected disease is acquired immunodeficiency syndrome due to human immunodeficiency virus, cervical cancer caused by human papilloma virus. , Epstein-Barr virus caused by Hodgkin's lymphoma, Burkitt's lymphoma, and nasopharyngeal carcinoma.
  • the present invention provides a method for preventing or treating degenerative neurological diseases, comprising administering to a subject a composition comprising a JULGI mutant protein or a gene encoding the protein as an active ingredient.
  • the present invention provides a use for preventing or treating degenerative neurological diseases of a JULGI mutant protein or a gene encoding the protein.
  • the present invention is a JULGI protein or a protein having 80% or more homology with the protein; Or comprising the step of administering to the individual a composition comprising a gene encoding the protein as an active ingredient, provides a method for preventing or treating cancer or viral infection.
  • the present invention is a JULGI protein or a protein having 80% or more homology with the protein; Or it provides a use for preventing or treating cancer or viral infectious diseases of the gene encoding the protein.
  • the plant-derived JULGI protein having the activity of binding to the G-rich nucleotide sequence and the G-quadruplex structure binds to a gene comprising a G-quadruplex-forming nucleotide sequence having a pathological correlation with degenerative neurological disease or cancer. It was confirmed that the effect of the JULGI protein on the pathology of the disease in the Drosophila amyotrophic Drosophila model was confirmed. G-quadruplex due to the activity of JULGI or a protein having homology to the G-quadruplex structure It is expected to be useful for diagnosis or treatment of various diseases that have pathological correlations with abnormal formation and dissociation of structures.
  • Figure 1a is a diagram showing the structure of the JULGI protein to identify the G-quadruplex motif binding target of the JULGI protein.
  • Figure 1b is a result of performing a SELEX analysis to determine whether the JULGI protein specifically binds to the G-rich nucleotide sequence and G-quadruplex structure.
  • FIG. 2A shows SMXL5 having a G-rich nucleotide sequence capable of forming a plant-derived G-quadruplex for JUL1 and its variant JUL1(RA) to confirm that the JULGI protein directly binds to the RNA G-quadruplex motif. This is the result of EMSA analysis.
  • Figure 2b is the result of measuring the dissociation constant (Kd) of the JUL1 and SMXL5 5'UTR binding.
  • Figure 2c is the result of performing a surface interaction analysis to visualize the interaction between SMXL5 5'UTR G-quadruplex and JUL1 protein.
  • Figure 3a shows the G-quadruplex-forming sequence in the C9orf72 gene and the selected four primary carcinogens THRA, NRAS, FLI1 and BCL2, which have a pathological correlation with degenerative neuropathy.
  • Figure 3b is a result showing that the G-quadruplex-forming sequence in each gene and the GST-JUL1 protein binds.
  • Figure 4 is a result of analyzing the effect of JULGI protein on the induction of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) disease, muscle after expressing JUL1 protein or JUL1 variant protein (JUL1 R20/80/145A ) in Drosophila amyotrophic lateral sclerosis model This is a result of comparing the degree of atrophic lateral sclerosis.
  • ALS amyotrophic lateral sclerosis
  • Figure 5 shows that the JULGI protein can be applied to the diagnosis and treatment of degenerative neurological diseases, cancer and viral infection diseases related to it by using the property of directly binding to the RNA G-quadruplex motif.
  • RNA guanine-tetrapolymer (G-quadruplex) structure correlates with the development of major diseases such as degenerative neurological diseases and cancer, G-rich sequencing and G
  • G-quadruplex RNA guanine-tetrapolymer
  • the present invention was completed by confirming that the plant-derived JULGI protein binding to the -quadruplex structure can be used for diagnosis or treatment of the related diseases.
  • the present invention provides a composition for detecting RNA guanine-tetrapolymer (G-quadruplex), comprising a JULGI protein or a protein having 80% or more homology with the protein.
  • the present invention comprises a composition for detection, a diagnostic composition characterized by diagnosing degenerative neurological disease, cancer or viral infection disease due to the guanine-tetrapolymer (G-quadruplex) binding activity of the JULGI protein and the Provided is a diagnostic kit comprising a diagnostic composition.
  • the guanine-tetrapolymer (G-quadruplex) structure is an RNA secondary structure formed by the formation of four guanine bases Hoogsteen-base pairing, abnormal formation or dissociation of the structure from degenerative neurological diseases and cancer It has been reported to cause the same major disease, and is known to have a close pathological relationship with various other diseases.
  • the JULGI protein or a protein having 80% or more homology to the protein has an activity of binding to RNA G-quadruplex
  • the protein may be composed of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 , More preferably, JUL1 protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or JUL2 protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and functional equivalents of the proteins.
  • the term “functional equivalent” refers to at least 70%, preferably 80% or more, more preferably 90% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, More preferably, it has a sequence homology of 95% or more, and refers to a protein having substantially the same physiological activity as the protein represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • “Substantially homogeneous physiological activity” refers to the activity against the formation of phloem in plants.
  • Diagnosis means broadly determining the condition of a patient's illness across all aspects. The content of the judgment is the name of the disease, the etiology, the type of illness, the severity, the detailed aspects of the bed, and the presence or absence of complications. Diagnosis in the present invention is to determine whether the onset and progression level of degenerative neurological diseases, cancer or viral infection diseases due to the guanine-tetrapolymer (G-quadruplex) binding activity of the JULGI protein.
  • G-quadruplex guanine-tetrapolymer
  • the diagnostic kit of the present invention consists of one or more other component compositions, solutions or devices suitable for analytical methods.
  • the diagnostic kit of the present invention may include all of various approaches using specific binding of JULGI and G-quadruplex, and can be prepared by appropriate selection by those skilled in the art.
  • a diagnostic chip coated with JULGI protein may be applied to a subject's blood or tissue itself, an RNA sample extracted therefrom, or a DNA sample amplified through PCR, and trace the G-quadruplex structure present in the sample derived from the subject.
  • a tracer substance such as Thioflavin T or NMM
  • the fluorescence signal can be quantified to diagnose the incidence and progression of the disease, and the bead surface interaction analysis method performed in Example 1-2 above.
  • Bead surface interaction assay may be a basic motif of the diagnostic kit, but is not limited thereto.
  • the present inventors confirmed that the JULGI protein can be used for diagnosis or treatment of various diseases having pathological correlations with abnormal formation or dissociation of RNA G-quadruplex structure through specific examples.
  • the G-quadruplex motif was identified as a binding target of the JULGI protein by performing SELEX analysis using various RNA probes on the JULGI protein (see Example 1-1), and furthermore, G-derived from plants. It was confirmed that direct binding between the RanBP2-type ZnF motif of the JULGI protein and the G-quadruplex was performed through analysis using EMSA and a surface binding system using SMXL5 having a G-rich base sequence capable of forming a quadruplex (Example 1- 2).
  • JULGI is an RNA G-rich base present in the 5'UTR of THRA, NRAS, FLI1 and BCL2, the C9orf72 gene and the selected four primary carcinogens, which have a pathological correlation with degenerative neuropathy.
  • JUL1 protein or JUL1 (RA) variant protein that eliminates RNA binding activity of the protein in the Drosophila model of amyotrophic lateral sclerosis in order to investigate the effect of JULGI on the pathogenesis of amyotrophic lateral sclerosis
  • the wild-type JUL1 protein was expressed, the atrophic lateral sclerosis symptom was significantly increased, whereas when the JUL1 (RA) was expressed, the atrophic lateral sclerosis symptom was significantly compared to the control group (G4C2) 30 . The decrease was confirmed (see Example 3).
  • the results of the embodiments of the present invention specifically detect the increased G-quadruplex structure for degenerative neurological diseases, cancer, and viral infection diseases, which have a pathological correlation with the G-quadruplex structure using JULGI, and various It can be used for diagnosis of diseases, and proves that it can be usefully used for the treatment of related diseases using JULGI or a variant thereof.
  • the present invention comprises the step of measuring the activity of a protein having 80% or more homology with the JULGI protein in the biological sample derived from the subject, of degenerative neurological disease, cancer or viral infection disease Provides information provision method for diagnosis.
  • method for providing information for diagnosis used in the present invention provides objective basic information necessary for diagnosis or prognosis of degenerative neurological disease, cancer or viral infection disease as a preliminary step for diagnosis. Judgments or comments are excluded.
  • the degenerative neurological disease, cancer or viral infection disease is characterized by having a pathological correlation with the G-quadruplex structure.
  • the degenerative neurological disease is preferably Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Frontotemporal dementia (FTD), Progressive myoclonus epilepsy type 1 (EPM1), Fragile X syndrome (Fragile X syndrome), spinocerebellar ataxia (Spinocerebellar ataxia; SCA36) and familial Creutzfeldt-Jakob disease (Familial Creutzfeldt-Jakob disease; CJD) may be one or more selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the cancer is preferably pancreatic cancer, stomach cancer, liver cancer, colon cancer, colon cancer, rectal cancer, brain cancer, breast cancer, kidney cancer, thyroid cancer, bladder cancer, esophageal cancer, pharyngeal cancer, oral cancer, snow cancer, uterine cancer, ovarian cancer, leukemia, prostate cancer, testicular cancer , Biliary tract cancer, gallbladder cancer, sarcoma, skin cancer and lung cancer, but may be one or more selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the virus-infected disease is preferably acquired immunodeficiency syndrome due to human immunodeficiency virus, cervical cancer due to human papilloma virus, Epstein-Barr virus ( It may be any one or more selected from the group consisting of Hodgkin's lymphoma, Burkitt's lymphoma, and nasopharyngeal carcinoma caused by Epstein-Barr virus, but is not limited thereto.
  • the activity measurement of the JULGI protein and the protein having 80% or more homology to the protein may be to determine whether the binding of the JULGI or its homologous protein and G-quadruplex, and includes protein and RNA or DNA Any method capable of analyzing the interaction between nucleic acids is not limited to the type and can be appropriately selected and carried out by those skilled in the art.
  • the biological sample derived from the subject may include tissue, cells, whole blood, blood, saliva, sputum, cerebrospinal fluid, and urine, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of degenerative neurological diseases, comprising a JULGI mutant protein or a gene encoding the protein as an active ingredient.
  • the JULGI mutant protein is the 20th, 80th, or 146th arginine residue in the RanBP2-type ZnF (Zinc finger) domain of the JULGI protein (JUL1 protein) consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; Or, the amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 JULGI protein (JUL2 protein) RanBP2-type ZnF (Zinc finger) domain 20, 79, or 152th arginine residue is another amino acid, more preferably alanine (Alanine ) May be replaced with a residue to delete RNA binding activity, preferably, the JULGI mutant protein may be composed of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6, respectively.
  • the present invention JULGI protein protein having a homology of 80% or more with the protein; Or it provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer or viral infection disease, comprising the gene encoding the protein as an active ingredient.
  • the degenerative neurological disease, cancer and viral infection disease are characterized by having a pathological correlation with the structure of guanine-tetrapolymer (G-quadruplex).
  • prevention refers to all actions that inhibit or delay the onset of degenerative neurological diseases, cancer, or viral infection diseases by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention.
  • treatment refers to all actions in which symptoms of degenerative neurological diseases, cancer or viral infection diseases are improved or beneficially changed by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention.
  • the gene encoding the JULGI protein or a protein having 80% or more homology to the protein may include both genomic DNA and cDNA encoding the protein.
  • the gene of the present invention may be a JUL1 gene consisting of a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or a JUL2 gene consisting of a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 3 is a sequence encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • the base sequence of SEQ ID NO: 4 is a sequence encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • variants of the nucleotide sequence are included within the scope of the present invention.
  • the gene has a sequence homology of 70% or more, more preferably 80% or more, even more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more with the base sequence of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4, respectively.
  • Branches can include nucleotide sequences.
  • % of sequence homology to a polynucleotide is identified by comparing two optimally aligned sequences with a comparison region, and a portion of the polynucleotide sequence in the comparison region is a reference sequence (addition or deletion) for the optimal alignment of the two sequences. It does not include) may be added or deleted (ie, gap).
  • the JULGI protein has three RanBP2-type ZnF domains, each of which has conserved arginine residues required for RNA binding (R20, R80 and R146 in ZnF1, ZnF2 and ZnF3, respectively). have. Therefore, the present inventors conducted a SELEX analysis to determine whether the JULGI protein having the above structure specifically binds to the G-rich nucleotide sequence and the guanine-tetrapolymer (G-quadruplex) structure. As a result of selectively concentrating the RNA probe bound to the JULGI protein and confirming the nucleotide sequence, as shown in FIG.
  • the RNA bound to JULGI contained a sequence rich in G (guanine), most of which formed G-quadruplex.
  • G-score is high in 57 of 61 RNAs (G-score> 20)), and it was confirmed that the secondary structure forms Hoogsteen-bonded G-quartet stacks.
  • the JULGI protein directly binds to the single-stranded mRNA or RNA G-quadruplex of the SMXL5.
  • EMSA was performed using GST-JUL1 and GST-JUL2 proteins in the presence or absence of potassium necessary for G-quadruplex formation. As a result, it was observed that the movement of the G-quadruplex-forming motif was delayed by binding JUL1 with the SMXL5 5'UTR probe having the G-quadruplex-forming motif used as a positive control, as shown in FIG. 2A.
  • the fluorescence signal emitted by ThT was completely overlapped with the surface of the bead coated with JUL1 in the presence of potassium (+KCl), but it was made of sodium (+NaCl) or lithium (+LiCl).
  • the fluorescence signal decreased in the presence, whereas the Cy5 fluorescence overlapping the bead surface increased in the presence of sodium or lithium.
  • Example 1 Based on the results of Example 1, the present inventors tried to find out whether the JULGI protein binds to the RNA G-rich nucleotide sequence and G-quadruplex structure in the gene related to the development of diseases such as degenerative neurological diseases or cancer.
  • the RNA G-rich sequence present in the 5'UTR of the C9orf72 gene and the selected four proto-oncogenes (THRA, NRAS, FLI1 and BCL2) having a pathological correlation with degenerative neurological disease And JULGI protein binding was verified by bead surface interaction analysis.
  • each of the five genes has a G-quadruplex-forming sequence (G-quadruplex-forming sequence), as a result of the experiment as shown in Figure 3b JST1 fused JUL1 protein It was confirmed through fluorescence microscopy that (GST-JUL1) was combined with each of the genes.
  • G-quadruplex-forming sequence As can be seen in Figure 3a, it can be seen that each of the five genes has a G-quadruplex-forming sequence (G-quadruplex-forming sequence), as a result of the experiment as shown in Figure 3b JST1 fused JUL1 protein It was confirmed through fluorescence microscopy that (GST-JUL1) was combined with each of the genes.
  • the above results show that the G-quadruplex structure increased by the onset of degenerative neurological disease or cancer is specifically detected using the JULGI protein, and can be used for diagnosis of various diseases related thereto.
  • Example 2 the present inventors tried to investigate the effect of JULGI protein on the pathogenesis of amyotrophic lateral sclerosis (ALS), one of neurodegenerative diseases.
  • ALS amyotrophic lateral sclerosis
  • the JUL1 protein and the arginine residue present in the Ranbp2 type zinc finger domain of the protein were replaced with an alanine residue to express JUL1 (RA), which eliminates RNA binding activity, in an amyotrophic lateral sclerosis Drosophila model.
  • RA alanine residue
  • the atrophic lateral sclerosis condition was significantly increased, whereas when the JUL1 R20/80/145A was expressed, the atrophic lateral sclerosis condition was the control group (G4C2) 30 It was confirmed that it was significantly reduced compared to.
  • the above results can be used to control the pathology using JULGI, a G-quadruplex binding protein and G-quadruplex folder, and to treat various diseases with pathological correlation with G-quadruplex including amyotrophic lateral sclerosis using JULGI(RA). It shows that you can.
  • JULGI protein or a protein having homology to it as a diagnostic marker and a therapeutic substance for various diseases that have pathological correlations with abnormal formation and dissociation of conventional G-quadruplex structures, such as degenerative neurological diseases, cancer or viral infections It is expected to be useful.

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Abstract

본 발명은 JULGI의 구아닌-사중합체 관련 질환의 진단 및 치료 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 JULGI 단백질 또는 상기 단백질과 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질을 포함하는, 구아닌-사중합체(G-quadruplex) 검출용 조성물, 상기 검출용 조성물을 포함하는 진단용 조성물 및 상기 진단용 조성물을 포함하는 진단 키트, 구아닌-사중합체와 병리적 상관관계를 가지는 퇴행성 신경질환, 암 또는 바이러스 감염 질환의 진단을 위한 정보제공방법, JULGI 단백질 또는 상기 단백질과 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질, 또는 이의 돌연변이 단백질을 포함하는 퇴행성 신경질환, 암, 또는 바이러스 감염질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 JULGI은 G-quadruplex 구조에 결합하는 활성에 기인하여 G-quadruplex 구조의 비정상적인 형성 및 해리와 병리학적인 상관관계를 가지는 다양한 질환의 진단 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

JULGI의 구아닌-사중합체 관련 질환의 진단 및 치료 용도
본 발명은 JULGI의 구아닌-사중합체 관련 질환의 진단 및 치료 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 JULGI 단백질 또는 상기 단백질과 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질을 포함하는, 구아닌-사중합체(G-quadruplex) 검출용 조성물, 상기 검출용 조성물을 포함하는 진단용 조성물 및 상기 진단용 조성물을 포함하는 진단 키트, 구아닌-사중합체와 병리적 상관관계를 가지는 퇴행성 신경질환, 암 또는 바이러스 감염 질환의 진단방법, JULGI 단백질 또는 상기 단백질과 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질, 또는 이의 돌연변이 단백질을 포함하는 약학적 조성물의 퇴행성 신경질환, 암, 또는 바이러스 감염질환의 예방 또는 치료용도에 관한 것이다.
퇴행성 신경질환 및 암은 유전적 원인부터 환경까지 광범위한 영향들에 의한 주요 유전자의 기능적 돌연변이의 축적으로 발병하게 된다. 현재까지 상기 질환들과 병리적 상관관계를 가지는 다양한 유전자들이 규명되었으나 여전히 정확한 발병 기작이나 원인에 대해서는 명확히 밝혀져 있지 않고, 특히 퇴행성 신경질환의 경우 질병을 치료하는 방법이 전무한 실정이며 증상의 진행을 지연시키는 정도의 치료가 시행되고 있다. 따라서 상기 질환들의 근본적인 치료를 위해서는 분자생물학적 원인부터 진단과 치료에 이르기까지 다양한 측면에서 연구 및 개발이 필요하다.
한편, 구아닌-사중합체(G-quadruplex) 구조는 4개의 구아닌(Guanine) 염기가 Hoogsteen-base pairing을 이룸으로써 형성되는 이차구조이다. 상기 구조의 비정상적 형성 또는 해리는 퇴행성 신경질환 및 암과 같은 주요 질병을 유발시키는 것으로 보고되고 있으며, 그 외의 다양한 질병과도 밀접한 병리적 상관관계를 가진다고 알려져 있다. 보다 구체적으로, 퇴행성 신경질환인 근위축성 측색경화증(Amyotrophic lateral sclerosis; ALS) 및 전측두엽 치매(Frontotemporal dementia; FTD)에서 C9orf72 유전자의 첫 번째 인트론에 존재하는 GGGGCC 반복 염기서열의 증가가 공통적으로 관찰되며, 전사체로부터 형성된 G-quadruplex 구조 및 그로부터 번역되어 생성된 펩타이드가 상기 질환의 발병과 밀접한 연관이 있음이 보고된바 있다. 또한, C9orf72 유전자 외에도 다양한 퇴행성 신경질환과 관련된 유전자 및 non-coding RNA들에서도 G-quadruplex 형성 반복 염기서열이 관찰되고 있으며, 이는 G-quadruplex 구조와 퇴행성 신경질환이 병리적으로 밀접한 상관관계가 있음을 보여주는 것이다(Reberto Simone et al., 2015, FEBS Letters).
또한, 암 유발과 밀접한 관련이 있는 원발암유전자(proto-oncogene)들 역시 유전자 발현을 조절하는 주요 조절 부위에 G-quadruplex 형성 염기서열을 가지며, 이는 유전자 발현 조절에 중요한 기능을 한다고 알려져 있다. 원발암유전자인 NRAS(Neuroblastoma RAS viral oncogene homolog)의 경우 5’UTR에 G-quadruplex 형성 염기서열을 가지는데, G-quadruplex 형성 염기서열의 결실(deletion) 또는 돌연변이(mutation)에 의해 상기 유전자의 발현(번역)이 유의미하게 증가됨이 보고되어 있다. 많은 원발암유전자들의 DNA상의 프로모터 영역(promoter region) 또는 RNA 상의 5’UTR 부위에 G-quadruplex가 존재한다는 것은 암의 발생에 있어서 G-quadruplex 구조 형성 조절을 통한 유전자 발현 조절이 중요함을 의미하는 것이다. 또한, G-quadruplex 구조 형성을 조절하는 나선효소(helicase) 및 단백질 샤페론(protein chaperone)의 기능적 돌연변이 발생이 암 발생에 영향을 준다는 연구 결과 또한 암과 G-quadruplex 구조 형성의 조절이 밀접한 관련이 있음을 보여주는 것이다.
본 발명자들은 구아닌-사중합체(G-quadruplex) 구조의 비정상적인 형성 또는 해리가 퇴행성 신경질환 및 암과 같은 주요 질병의 발병과 상관관계가 있다는 종래 연구결과에 근거하여, G-rich 염기서열 및 G-quadruplex 구조와 결합하는 식물체 유래의 JULGI 단백질을 상기 관련 질환들의 진단 또는 치료에 이용할 수 있음을 실험적으로 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 JULGI 단백질 또는 상기 단백질과 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질을 포함하는, 구아닌-사중합체(G-quadruplex) 검출용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, JULGI 단백질의 구아닌-사중합체(G-quadruplex) 결합 활성에 기인하여 퇴행성 신경질환, 암 또는 바이러스 감염질환을 진단하기 위한 조성물 및 상기 진단용 조성물을 포함하는 진단 키트를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 피검체 유래의 생물학적 시료에서 JULGI 단백질 또는 상기 단백질과 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질의 활성을 측정하는 단계를 포함하는, 퇴행성 신경질환, 암 또는 바이러스 감염질환의 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 JULGI 돌연변이 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 JULGI 단백질 또는 상기 단백질과 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질; 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 암 또는 바이러스 감염질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 JULGI 단백질 또는 상기 단백질과 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질을 포함하는, 구아닌-사중합체(G-quadruplex) 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 JULGI 단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, JULGI 단백질은 구아닌-rich 서열 또는 RNA 구아닌-사중합체에 결합하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 검출용 조성물을 포함하는, JULGI 단백질의 구아닌-사중합체(G-quadruplex) 결합 활성에 기인하여 퇴행성 신경질환, 암 또는 바이러스 감염질환을 진단하기 위한 조성물 및 상기 진단용 조성물을 포함하는 진단 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 피검체 유래의 생물학적 시료에서 JULGI 단백질 또는 상기 단백질과 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질의 활성을 측정하는 단계를 포함하는, 퇴행성 신경질환, 암 또는 바이러스 감염질환의 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 활성 측정은 JULGI 단백질과 구아닌-사중합체의 결합 여부를 측정하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 JULGI 돌연변이 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 JULGI 돌연변이 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 JULGI 단백질의 RanBP2-type ZnF(Zinc finger) 도메인 내 20번, 80번, 또는 146번째 아르기닌(Arginine) 잔기가 알라닌(Alanine) 잔기로 치환되어 RNA 결합 활성이 결실된 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 JULGI 돌연변이 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 JULGI 단백질의 RanBP2-type ZnF(Zinc finger) 도메인 내 20번, 79번, 또는 152번째 아르기닌(Arginine) 잔기가 알라닌(Alanine) 잔기로 치환되어 RNA 결합 활성이 결실된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 퇴행성 신경질환은 구아닌-사중합체(G-quadruplex) 구조에 기인하여 발생하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 퇴행성 신경질환은 근위축성 측색경화증(Amyotrophic lateral sclerosis; ALS), 전측두엽 치매(Frontotemporal dementia; FTD), 제1형 진행성 근간대성 간질(Progressive myoclonus epilepsy type 1; EPM1), 취약 X 증후군(Fragile X syndrome), 척수소뇌성 운동실조증(Spinocerebellar ataxia; SCA36) 및 가족성 크로이츠펠트 야콥병(Familial Creutzfeldt-Jakob disease; CJD)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 JULGI 단백질 또는 상기 단백질과 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질; 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 암 또는 바이러스 감염질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 암 또는 바이러스 감염질환은 구아닌-사중합체(G-quadruplex) 구조에 기인하여 발생하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 암은 췌장암, 위암, 간암, 대장암, 결장암, 직장암, 뇌암, 유방암, 신장암, 갑상선암, 방광암, 식도암, 인두암, 구강암, 설암, 자궁암, 난소암, 백혈병, 전립선암, 고환암, 담도암, 담낭암, 육종, 피부암 및 폐암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 바이러스 감염질환은 인간 면역결핍 바이러스(Human immunodeficiency virus)로 인한 후천성 면역결핍 증후군(Acquired immunodeficiency syndrome), 인유두종 바이러스(Human papilloma virus)로 인한 자궁경부암(cervical cancer), 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr virus)로 인한 호지킨 림프종(Hodgkin’s lymphoma), 버킷림프종(Burkitt’s lymphoma) 및 비인두암(nasopharyngeal carcinoma)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 JULGI 돌연변이 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 JULGI 돌연변이 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 JULGI 단백질 또는 상기 단백질과 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질; 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 또는 바이러스 감염질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 JULGI 단백질 또는 상기 단백질과 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질; 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 암 또는 바이러스 감염질환의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
본 발명에서는 G-rich 염기서열 및 G-quadruplex 구조에 결합하는 활성을 가지고 있는 식물체 유래 JULGI 단백질이 퇴행성 신경질환 또는 암과 병리학적인 상관관계를 가지는 G-quadruplex 형성 염기서열을 포함하는 유전자와 결합하는 것을 확인하였고, 실제로 근위축성 측색경화증 초파리 모델에서 JULGI 단백질이 상기 질환의 병증에 미치는 영향을 확인하였는바, JULGI 또는 이와 상동성을 갖는 단백질이 G-quadruplex 구조에 결합하는 활성에 기인하여 G-quadruplex 구조의 비정상적인 형성 및 해리와 병리학적인 상관관계를 가지는 다양한 질환의 진단 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1a는 JULGI 단백질의 결합 표적인 G-quadruplex 모티프를 확인하기 위해 JULGI 단백질의 구조를 그림으로 도시한 것이다.
도 1b는 JULGI 단백질이 G-rich 염기서열 및 G-quadruplex 구조에 특이적으로 결합하는지 여부를 알아보기 위해 SELEX 분석을 실시한 결과이다.
도 2a는 JULGI 단백질이 RNA G-quadruplex 모티프와 직접적으로 결합함을 확인하기 위해, JUL1 및 이의 변이체인 JUL1(RA)에 대하여 식물 유래의 G-quadruplex 형성이 가능한 G-rich 염기서열을 갖는 SMXL5를 이용하여 EMSA 분석을 실시한 결과이다.
도 2b는 JUL1과 SMXL5 5’UTR 결합의 해리 상수(Kd)를 측정한 결과이다.
도 2c는 SMXL5 5’UTR G-quadruplex와 JUL1 단백질 사이의 상호 작용을 시각화하기 위해 표면 상호작용 분석을 실시한 결과이다.
도 3a는 퇴행성 신경질환과 병리학적 상관관계를 갖는 C9orf72 유전자 및 선별된 4개의 원발암유전자인 THRA, NRAS, FLI1 및 BCL2 내 G-quadruplex-형성 서열을 나타낸 것이다.
도 3b는 상기 각 유전자 내 G-quadruplex-형성 서열과 GST-JUL1 단백질이 결합함을 보여주는 결과이다.
도 4는 JULGI 단백질이 근위축성 측색경화증(ALS) 병증 유발에 미치는 영향을 분석한 결과로서, 초파리 근위축성 측색경화증 모델에서 JUL1 단백질 또는 JUL1 변이체 단백질(JUL1R20/80/145A)을 발현시킨 후 근위축성 측색경화증 정도를 비교한 결과이다.
도 5는 JULGI 단백질이 RNA G-quadruplex 모티프와 직접적으로 결합하는 특성을 이용해 이와 관련된 퇴행성 신경질환, 암 및 바이러스 감염질환의 진단 및 치료 등에 적용될 수 있음을 그림으로 도시한 것이다.
본 발명자들은 RNA 구아닌-사중합체(G-quadruplex) 구조의 비정상적인 형성 또는 해리가 퇴행성 신경질환 및 암과 같은 주요 질병의 발병과 상관관계가 있다는 종래 연구결과에 근거하여, G-rich 염기서열 및 G-quadruplex 구조와 결합하는 식물체 유래의 JULGI 단백질을 상기 관련 질환들의 진단 또는 치료에 이용할 수 있음을 확인함으로써, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 JULGI 단백질 또는 상기 단백질과 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질을 포함하는, RNA 구아닌-사중합체(G-quadruplex) 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 검출용 조성물을 포함하는, JULGI 단백질의 구아닌-사중합체(G-quadruplex) 결합 활성에 기인하여 퇴행성 신경질환, 암 또는 바이러스 감염질환을 진단하는 것을 특징으로 하는 진단용 조성물 및 상기 진단용 조성물을 포함하는 진단 키트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 구아닌-사중합체(G-quadruplex) 구조는 4개의 구아닌 염기가 Hoogsteen-base pairing을 이룸으로써 형성되는 RNA 이차구조로서, 상기 구조의 비정상적 형성 또는 해리는 퇴행성 신경질환 및 암과 같은 주요 질병을 유발시키는 것으로 보고되고 있으며, 그 외의 다양한 질병과도 밀접한 병리적 상관관계를 가진다고 알려져 있다.
본 발명에 있어서, 상기 JULGI 단백질 또는 상기 단백질과 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질은 RNA G-quadruplex에 결합하는 활성을 가지며, 상기 단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있고, 보다 바람직하게는 서열번호 1 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 JUL1 단백질 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 JUL2 단백질, 및 상기 단백질들의 기능적 동등물을 포함한다. “기능적 동등물”이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체에서 체관 형성에 대한 활성을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “진단(diagnosis)”이란 넓은 의미로는 환자의 병의 실태를 모든 면에 걸쳐서 판단하는 것을 의미한다. 판단의 내용은 병명, 병인, 병형, 경중, 병상의 상세한 양태, 및 합병증의 유무 등이다. 본 발명에서 진단은 JULGI 단백질의 구아닌-사중합체(G-quadruplex) 결합 활성에 기인하여 퇴행성 신경질환, 암 또는 바이러스 감염질환의 발병 여부 및 진행단계 수준 등을 판단하는 것이다.
본 발명의 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성된다.
본 발명의 진단용 키트는 JULGI와 G-quadruplex의 특이적 결합을 이용한 다양한 접근법들을 모두 포함할 수 있으며, 당업자가 적절히 선택하여 제조할 수 있다. 예컨대, JULGI 단백질이 도포된 진단용 칩에 피검자의 혈액 또는 조직 그 자체, 이로부터 추출한 RNA 샘플 또는 PCR을 통해 증폭된 DNA 샘플을 적용하고, 상기 피검자 유래 샘플에 존재하는 G-quadruplex 구조를 추적할 수 있는 티오플라빈 T(Thioflavin T)나 NMM과 같은 추적 물질을 도포, 형광 신호를 정량함으로 해당 질환의 유발 및 진행 정도를 진단할 수 있을 것이며, 상기 실시예 1-2에서 실시한 비드 표면 상호작용 분석법(Bead surface interaction assay)이 상기 진단 키트의 기본 모티브가 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명자들은 구체적인 실시예를 통해 JULGI 단백질을 RNA G-quadruplex 구조의 비정상적인 형성 또는 해리와 병리적 상관관계를 갖는 다양한 질환의 진단 또는 치료에 이용할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 일실시예에서는, JULGI 단백질에 대하여 다양한 RNA 프로브를 이용한 SELEX 분석을 실시함으로써 JULGI 단백질의 결합 표적으로써 G-quadruplex 모티프를 확인하였고(실시예 1-1 참조), 나아가 식물 유래의 G-quadruplex 형성이 가능한 G-rich 염기서열을 갖는 SMXL5를 이용하여 EMSA 및 표면 결합 시스템을 이용한 분석을 통해 JULGI 단백질의 RanBP2-type ZnF 모티프와 G-quadruplex 간의 직접적인 결합을 이루는 것을 확인하였다(실시예 1-2 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, JULGI가 퇴행성 신경질환과 병리적 상관관계를 가지는 C9orf72 유전자 및 선별된 4개의 원발암유전자인 THRA, NRAS, FLI1 및 BCL2의 5’UTR에 존재하는 RNA G-rich 염기서열에 결합하는지 여부를 검증하기 위해 비드 표면 상호작용 분석을 실시한 결과, JULGI 단백질이 상기 각 유전자들과 결합한 것을 확인하였다(실시예 2 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, JULGI가 근위축성 측색경화증의 병증 유발에 미치는 영향을 알아보기 위해 근위축성 측색경화증의 초파리 모델에서 JUL1 단백질 또는 상기 단백질의 RNA 결합 활성을 없앤 JUL1(RA) 변이체 단백질을 각각 발현시킨 결과, 야생형 JUL1 단백질을 발현시킨 경우 근위축성 측색경화증 병증이 유의하게 증가한 반면, JUL1(RA)을 발현시킨 경우에는 근위축성 측색경화증의 병증이 대조군(G4C2)30과 비교하여 유의하게 감소한 것을 확인하였다(실시예 3 참조).
상기 본 발명의 실시예 결과들은 JULGI를 이용하여 G-quadruplex 구조와 병리학적 상관관계를 가지는 퇴행성 신경질환, 암, 바이러스 감염질환 등에 대하여 증가된 G-quadruplex 구조를 특이적으로 검출하고, 이와 관련된 다양한 질환의 진단에 이용할 수 있으며, JULGI 또는 이의 변이체를 이용해 관련된 상기 질환들의 치료에도 유용하게 이용할 수 있음을 입증하는 것이다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 피검체 유래의 생물학적 시료에서 JULGI 단백질 상기 단백질과 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질의 활성을 측정하는 단계를 포함하는, 퇴행성 신경질환, 암 또는 바이러스 감염질환의 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 “진단을 위한 정보제공방법”은 진단을 위한 예비적 단계로써 퇴행성 신경질환, 암 또는 바이러스 감염질환의 진단 또는 예후 예측을 위하여 필요한 객관적인 기초정보를 제공하는 것이며 의사의 임상학적 판단 또는 소견은 제외된다.
상기 퇴행성 신경질환, 암 또는 바이러스 감염질환은 G-quadruplex 구조와 병리적 상관관계를 가지는 것을 특징으로 한다.
상기 퇴행성 신경질환은 바람직하게는 근위축성 측색경화증(Amyotrophic lateral sclerosis; ALS), 전측두엽 치매(Frontotemporal dementia; FTD), 제1형 진행성 근간대성 간질(Progressive myoclonus epilepsy type 1; EPM1), 취약 X 증후군(Fragile X syndrome), 척수소뇌성 운동실조증(Spinocerebellar ataxia; SCA36) 및 가족성 크로이츠펠트 야콥병(Familial Creutzfeldt-Jakob disease; CJD)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 암은 바람직하게는 췌장암, 위암, 간암, 대장암, 결장암, 직장암, 뇌암, 유방암, 신장암, 갑상선암, 방광암, 식도암, 인두암, 구강암, 설암, 자궁암, 난소암, 백혈병, 전립선암, 고환암, 담도암, 담낭암, 육종, 피부암 및 폐암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 바이러스 감염질환은 바람직하게는 인간 면역결핍 바이러스(Human immunodeficiency virus)로 인한 후천성 면역결핍 증후군(Acquired immunodeficiency syndrome), 인유두종 바이러스(Human papilloma virus)로 인한 자궁경부암(cervical cancer), 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr virus)로 인한 호지킨 림프종(Hodgkin’s lymphoma), 버킷림프종(Burkitt’s lymphoma) 및 비인두암(nasopharyngeal carcinoma)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 JULGI 단백질 상기 단백질과 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질의 활성 측정은 JULGI 또는 이의 상동단백질과 G-quadruplex의 결합 여부를 측정하는 것일 수 있으며, 단백질과 RNA 또는 DNA를 포함하는 핵산 간의 상호작용을 분석할 수 있는 방법이라면 그 종류에 제한되지 않고 당업자가 적절히 선택하여 실시할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 피검체 유래의 생물학적 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈액, 타액, 객담, 뇌척수액 및 뇨 등을 포함할 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 JULGI 돌연변이 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 JULGI 돌연변이 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 JULGI 단백질(JUL1 단백질)의 RanBP2-type ZnF(Zinc finger) 도메인 내 20번, 80번, 또는 146번째 아르기닌(Arginine) 잔기; 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 JULGI 단백질(JUL2 단백질)의 RanBP2-type ZnF(Zinc finger) 도메인 내 20번, 79번, 또는 152번째 아르기닌 잔기가 다른 아미노산, 보다 바람직하게는 알라닌(Alanine) 잔기로 치환되어 RNA 결합 활성이 결실된 것일 수 있으며, 바람직하게 JULGI 돌연변이 단백질은 각각 서열번호 5 또는 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 JULGI 단백질 상기 단백질과 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질; 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 암 또는 바이러스 감염질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 퇴행성 신경질환, 암 및 바이러스 감염질환은 구아닌-사중합체(G-quadruplex) 구조와 병리적 상관관계를 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “예방”이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 퇴행성 신경질환, 암, 또는 바이러스 감염질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 퇴행성 신경질환, 암 또는 바이러스 감염질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 있어서 상기 JULGI 단백질 또는 상기 단백질과 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자는 상기 단백질을 코딩하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 JUL1 유전자 또는 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 JUL2 유전자일 수 있다. 서열번호 3의 염기서열은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 암호화하는 서열이며, 서열번호 4의 염기서열은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 암호화하는 서열이다. 또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다.
폴리뉴클레오티드에 대한 “서열 상동성의 %”는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. JULGI 단백질과 G-rich 염기서열 및 G-quadruplex 구조와의 결합 확인
1-1. JULGI의 결합 표적으로 G-quadruplex 모티프 확인
도 1a에 도시된 바와 같이 JULGI 단백질은 3개의 RanBP2-type ZnF 도메인을 가지고 있으며, 상기 도메인 각각은 RNA 결합에 필요한 보존된 아르기닌 잔기(ZnF1, ZnF2 및 ZnF3에 각각 R20, R80 및 R146 존재)를 가지고 있다. 따라서 본 발명자들은 상기와 같은 구조를 갖는 JULGI 단백질이 G-rich 염기서열 및 구아닌-사중합체(G-quadruplex) 구조에 특이적으로 결합하는지 여부를 알아보기 위해, SELEX 분석을 실시하였다. JULGI 단백질에 결합된 RNA 프로브를 선택적으로 농축하고 염기서열을 확인한 결과, 도 1b에 나타낸 바와 같이 JULGI에 결합된 RNA는 G(구아닌)이 풍부한 서열을 포함하고 있었으며, 대부분이 G-quadruplex를 형성하였고(61개 RNA 중에서 57개에서 G-score가 높음(G-score > 20)), 2차 구조는 Hoogsteen-bonded G-quartet stacks을 형성하는 것을 확인하였다.
1-2. JULGI 단백질과 RNA G-quadruplex 모티프 간의 직접적 결합을 통한 G-quadruplex 형성 확인
상기 결과를 바탕으로, 식물 유래의 G-quadruplex 형성이 가능한 G-rich 염기서열을 갖는 SMXL5를 이용하여 JULGI 단백질이 상기 SMXL5의 단일가닥 mRNA 또는 RNA G-quadruplex에 직접적으로 결합하는지 여부를 알아보기 위해, G-quadruplex 형성에 필요한 칼륨이 존재하거나 또는 존재하지 않는 조건에서 GST-JUL1 및 GST-JUL2 단백질을 이용하여 EMSA를 수행하였다. 그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이 JUL1이 양성 대조군으로 사용된 G-quadruplex 형성 모티프를 갖는 SMXL5 5’UTR 프로브와 결합함으로써 G-quadruplex 형성 모티프의 이동이 지연된 것을 관찰하였다. 그러나 G-quadruplex 형성 모티프가 없는 mSMXL5 5'UTR (1), mSMXL5 5’UTR (3)의 경우에는 상기와 같은 결과가 나타나지 않았다. 이에 반해, G-quartet의 두 개 층을 생성하는 변이체인 mSMXL5 5’UTR (2)의 경우에는 SMXL5 5’UTR 보다는 덜 효율적지만 JUL1 단백질과 결합하는 것을 확인하였다. 또한, 상기 JUL1과 SMXL5 5’UTR 결합의 해리 상수(Kd)를 측정한 결과, 도 2b에서 볼 수 있는 바와 같이 칼륨의 존재하지 않을 때에는 130 nM, 칼륨의 존재 시에는 230 nM로 추정되었으며, 이는 JUL1이 우선적으로 1차 SMXL5 5’UTR 서열에 결합한다는 것을 의미하는 것이다.
다음으로, SMXL5 5’UTR G-quadruplex와 JUL1 단백질 사이의 상호 작용을 시각화하기 위해 단백질이 코팅된 비드 표면의 액체-고체 계면에서 RNA 프로브에 대해 G-quadruplex를 강하게 안정화시키는 칼륨, 약하게 안정화시키는 나트륨, 또는 G-quadruplex를 안정화시키지 않는 리튬과 응축시킨 표면 결합 시스템을 이용하여 실험하였다. 이를 위해, 구체적으로 도 2c에 도시된 바와 같이 Cy5로 표지된 RNA 프로브인 SMXL5 5’UTR을 GST-JUL1으로 코팅된 글루타티온-세파로오스(glutathione-sepharose) 비드에 처리하고, 결과적으로 비드 표면상에 형성된 G-quadruplex를 Cy5 및 G-quadruplex 센서인 Thioflavin T(ThT)를 사용하여 동시에 시각화하였다. 그 결과, 도 2c에 나타낸 바와 같이 ThT에 의해 방출된 형광 신호는 칼륨 존재(+KCl) 하에 JUL1이 코팅된 비드 표면과 완전히 중첩되어 나타났으나, 나트륨(+NaCl) 또는 리튬(+LiCl)의 존재 시에는 형광 신호가 감소하였고, 반면에 비드 표면과 중첩되는 Cy5 형광은 나트륨 또는 리튬 존재 시 증가하였다. 이러한 결과는 SMXL5 5’UTR의 G-quadruplex에서 JUL1의 RanBP2-type ZnF와 직접적인 결합이 일어난다는 것을 의미한다.
실시예 2. JULGI 단백질의 퇴행성 신경질환 및 암 등의 발병 유전자 내 G-rich 염기서열 및 G-quadruplex 구조와의 결합 확인
상기 실시예 1의 결과를 바탕으로, 본 발명자들은 JULGI 단백질이 퇴행성 신경질환 또는 암과 같은 질환의 발병과 관련된 유전자 내 RNA G-rich 염기서열 및 G-quadruplex 구조와 결합하는지 여부를 알아보고자 하였다. 이를 위해, 퇴행성 신경 질환과 병리적 상관관계를 가지는 C9orf72 유전자 및 선별된 4개의 원발암유전자(proto-oncogene)(THRA, NRAS, FLI1 및 BCL2)의 5’UTR에 존재하는 RNA G-rich 염기서열과 JULGI 단백질의 결합여부를 비드 표면 상호작용 분석을 통해 검증하였다.
도 3a에서 볼 수 있는 바와 같이 상기 5종의 유전자 각각이 G-quadruplex-형성 서열(G-quadruplex-forming sequence)을 가짐을 알 수 있고, 실험 결과 도 3b에 나타낸 바와 같이 GST가 융합된 JUL1 단백질(GST-JUL1)이 상기 각 유전자들과 결합한 것을 형광현미경 관찰을 통해 확인하였다. 상기 결과는 JULGI 단백질을 이용하여 퇴행성 신경질환 또는 암 등의 발병에 의해 증가된 G-quadruplex 구조를 특이적으로 검출하고, 이와 관련된 다양한 질환의 진단에 이용할 수 있음을 보여주는 것이다.
실시예 3. JULGI 단백질이 근위축성 측색경화증의 병증 유발에 미치는 영향 확인
상기 실시예 2의 결과에 더하여, 본 발명자들은 JULGI 단백질이 신경 퇴행성 질환의 하나인 근위축성 측색경화증(amyotrophic lateral sclerosis; ALS)의 병증 유발에 미치는 영향을 알아보고자 하였다. 이를 위해, JUL1 단백질 및 상기 단백질의 Ranbp2 type zinc finger 도메인에 존재하는 아르기닌 잔기를 알라닌 잔기로 치환하여 RNA 결합 활성을 없앤 JUL1(RA)를 근위축성 측색경화증 초파리 모델에서 발현시켰다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 야생형 JUL1 단백질을 발현시킨 경우 근위축성 측색경화증 병증이 유의하게 증가한 반면, JUL1R20/80/145A을 발현시킨 경우에는 근위축성 측색경화증의 병증이 대조군(G4C2)30과 비교하여 유의하게 감소한 것을 확인하였다. 상기 결과는 G-quadruplex 결합 단백질이자 G-quadruplex folder인 JULGI를 이용하여 병증을 조절할 수 있으며 JULGI(RA)를 이용해 근위축성 측색경화증을 포함하는 G-quadruplex와 병리적 상관관계를 가지는 다양한 질환을 치료할 수 있음을 보여주는 것이다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
종래 G-quadruplex 구조의 비정상적인 형성 및 해리와 병리학적인 상관관계를 가지는 다양한 질환 예컨대, 퇴행성 신경질환, 암 또는 바이러스 감염질환에 대하여, JULGI 단백질 또는 이와 상동성을 갖는 단백질을 진단 마커로 및 치료 물질로 유용하게 활용할 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (22)

  1. JULGI 단백질 또는 상기 단백질과 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질을 포함하는, 구아닌-사중합체(G-quadruplex) 검출용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 JULGI 단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 검출용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    JULGI 단백질은 구아닌-rich 서열 또는 RNA 구아닌-사중합체에 결합하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  4. 제1항의 조성물을 포함하는, 진단용 조성물로서,
    JULGI 단백질의 구아닌-사중합체(G-quadruplex) 결합 활성에 기인하여 퇴행성 신경질환, 암 또는 바이러스 감염질환을 진단하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  5. 제4항의 조성물을 포함하는, 진단용 키트.
  6. 피검체 유래의 생물학적 시료에서 JULGI 단백질 또는 상기 단백질과 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질의 활성을 측정하는 단계를 포함하는, 퇴행성 신경질환, 암 또는 바이러스 감염질환의 진단을 위한 정보제공방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 JULGI 단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 활성 측정은 JULGI 단백질과 구아닌-사중합체의 결합 여부를 측정하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  9. JULGI 돌연변이 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 JULGI 돌연변이 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 JULGI 단백질의 RanBP2-type ZnF(Zinc finger) 도메인 내 20번, 80번, 또는 146번째 아르기닌(Arginine) 잔기가 알라닌(Alanine) 잔기로 치환되어 RNA 결합 활성이 결실된 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 JULGI 돌연변이 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 JULGI 단백질의 RanBP2-type ZnF(Zinc finger) 도메인 내 20번, 79번, 또는 152번째 아르기닌(Arginine) 잔기가 알라닌(Alanine) 잔기로 치환되어 RNA 결합 활성이 결실된 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 퇴행성 신경질환은 구아닌-사중합체(G-quadruplex) 구조에 기인하여 발생하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 퇴행성 신경질환은 근위축성 측색경화증(Amyotrophic lateral sclerosis; ALS), 전측두엽 치매(Frontotemporal dementia; FTD), 제1형 진행성 근간대성 간질(Progressive myoclonus epilepsy type 1; EPM1), 취약 X 증후군(Fragile X syndrome), 척수소뇌성 운동실조증(Spinocerebellar ataxia; SCA36) 및 가족성 크로이츠펠트 야콥병(Familial Creutzfeldt-Jakob disease; CJD)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  14. JULGI 단백질 또는 상기 단백질과 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질; 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 암 또는 바이러스 감염질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 JULGI 단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 암 또는 바이러스 감염질환은 구아닌-사중합체(G-quadruplex) 구조에 기인하여 발생하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  17. 제14항에 있어서,
    상기 암은 췌장암, 위암, 간암, 대장암, 결장암, 직장암, 뇌암, 유방암, 신장암, 갑상선암, 방광암, 식도암, 인두암, 구강암, 설암, 자궁암, 난소암, 백혈병, 전립선암, 고환암, 담도암, 담낭암, 육종, 피부암 및 폐암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  18. 제14항에 있어서,
    상기 바이러스 감염질환은 인간 면역결핍 바이러스(Human immunodeficiency virus)로 인한 후천성 면역결핍 증후군(Acquired immunodeficiency syndrome), 인유두종 바이러스(Human papilloma virus)로 인한 자궁경부암(cervical cancer), 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr virus)로 인한 호지킨 림프종(Hodgkin’s lymphoma), 버킷림프종(Burkitt’s lymphoma) 및 비인두암(nasopharyngeal carcinoma)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  19. JULGI 돌연변이 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료방법.
  20. JULGI 단백질 또는 상기 단백질과 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질; 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 또는 바이러스 감염질환의 예방 또는 치료방법.
  21. JULGI 돌연변이 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의, 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용도.
  22. JULGI 단백질 또는 상기 단백질과 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질; 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의, 암 또는 바이러스 감염질환의 예방 또는 치료용도.
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