KR20130131828A

KR20130131828A - Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡ와 결합하는 신규 화합물, 그 제조방법 및 이용

Info

Publication number: KR20130131828A
Application number: KR1020120055692A
Authority: KR
Inventors: 박현주; 강현진; 채정현; 한수진
Original assignee: 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2012-05-24
Filing date: 2012-05-24
Publication date: 2013-12-04
Also published as: KR101455452B1

Abstract

본 발명은 penoxazone, triazine 및 pyrazolopyrimidine계열의 c-myc의 저해제 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 그 제조방법 및 이를 유효성분으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 phenoxazone, triazine 및 pyrazolopyrimidine계열 화합물들은 c-myc 프로모터의 G-quadruplex 구조를 선택적으로 안정화시킴으로서, c-myc 발현 억제효과를 보인다. 이는 기존의 DNA 결합 항암물질의 한계를 뛰어넘는 새로운 DNA 표적 항암물질의 개발이며, 본 발명 화합물들의 최적화를 통해서 도출된 우수한 항암후보물질들은 c-myc 원암유전자가 이상 발현되어 유발되는 폐암, 결직장암, 유방암, 방광암, 백혈병 등의 다양한 암에 대한 항암제로서 개발이 가능하여 암 치료에 사용될 것으로 기대된다.

Description

Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡ와 결합하는 신규 화합물, 그 제조방법 및 이용{New G-quadruplex DNA Binders, process for preparation thereof and the use of the same}

본 발명은 penoxazone, triazine 및 pyrazolopyrimidine계열의 c-myc의 발현 저해제 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 그 제조방법 및 이를 유효성분으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

Watson-Crick 모델에 기술되어있는 이중나선 DNA는 아데닌(A)는 티민(T)과, 구아닌(G)는 시토신(C)과 수소결합을 통해 쌍을 이룬다. 그러나 Hoogsteen은 구아닌이 풍부한 자리에는 4개의 구아닌이 평면으로 수소 결합하여 하나의 quartet를 이루고, quatet 3개가 수직으로 층을 이루워진 모양을 G-quadruplex으로 제안하였다. 일반적으로 구아닌이 많이 위치한 유전자에서 G-quadruplex모양으로 나타난다고 보고되었다. 이러한 2차 구조는 K⁺나 Na⁺와 같은 1가 금속이온에 의해 안정화된다. 또한 G-quadruplex를 안정화시키는 특정 리간드가 결합하여 안정화시켜준다.

G-quadruplex 구조는 텔로미어나 c-myc, c-kit, bcl-2, k-ras, Rb, RET, VEGF and HIF-1와 같은 암과 관련된 유전자의 프로모터 앞에 존재한다. 구아닌이 풍부한 프로모터부분의 앞에 G-quadruplex 구조를 형성하면 DNA 중합체의 작용이 억제되어 DNA의 복제가 일어나지 않아 최종적으로는 발암 단백질의 발현이 억제되는 역할을 하게 된다. 그러므로 텔로미어와 발암유전자의 G-quadruplex를 타켓으로 한 리간드의 항암제로서 역할을 하게 될 수 있다. 예를 들면 BRACO-19과 같은 비이온성 저분자 화합물이 개발되었으며, c-myc 프로모터의 G-quadruplex에 좋은 선택성이 있는 결과를 보여주어 유전자내 많은 G-quadruplex 구조 중 발암유전자에만 선택적으로 결합하는 화합물의 개발 가능성 제시되었다.

c-Myc는 세포 성장, 분화, 및 세포자살을 조절하는 원암유전자로서, 이의 이상 발현은 폐암, 결직장암, 유방암, 방광암, 백혈병 등을 포함하는 다양한 암에 관련된다. 따라서, c-Myc의 발현을 조절하여 항암제 또는 항-종양제를 개발하려는 많은 노력이 있었다.

현재 많이 사용되고 있는 DNA 타겟 항암제로서 DNA 복제억제를 유도하는 알킬화제, DNA 생합성 억제 및 topoisomerase/DNA 타겟으로 하는 항암제가 있다. 그러나 여전히 정상세포들의 정상적인 증식까지 억제하여 상당히 많은 부작용을 수반하고 있으며, 이러한 한계점들의 극복을 위해 암세포의 특이적인 유전체 구조 및 생화학적 기전을 타겟으로 하는 약물 개발에 대한 관심이 높아지고 있다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 동일한 DNA 타겟이지만 발암유전자의 프로모터에 존재하는 G-quadruplex DNA를 선택적으로 표적하는 기술을 개발하고자 한다.

이를 위하여 본 발명은 penoxazone, triazine 및 pyrazolopyrimidine계열의 c-myc의 발현 저해제 조성물, 그 제조방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하고자 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 c-myc 프로모터의 G-quadruplex 구조를 선택적으로 안정화 시키는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 화합물을 제조하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 화합물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로,

상기 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 c-myc유전자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예로,

상기 암은 폐암, 버키트 림프종, 위암, 자궁경부암, 결직장암, 유방암, 방광암, 백혈병을 포함하는 것을 특징으로 하나, 이에 특별히 제한되지 않는다.

본 발명의 phenoxazone, triazine 및 pyrazolopyrimidine계열 화합물들은 c-myc 프로모터의 G-quadruplex 구조를 선택적으로 안정화시킴으로서, c-myc 발현 억제효과를 보인다. 이는 기존의 DNA 결합 항암물질의 한계를 뛰어넘는 새로운 DNA 표적 항암물질의 개발이며, 본 발명 화합물들의 최적화를 통해서 도출된 우수한 항암후보물질들은 c-myc 원암유전자가 이상 발현되어 유발되는 폐암, 결직장암, 유방암, 방광암, 백혈병 등의 다양한 암에 대한 항암제로서 개발이 가능하여 암 치료에 사용될 것으로 기대된다.

도 1은 PCR-stop assay의 원리 및 방법을 나타낸 것이다.
도 2은 농도에 따른 리간드들의 Pu26WT(왼쪽) 및 Pu26Mut(오른쪽)에 대한 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 리간들이 CA46 세포보다 Ramos 세포에서 mRNA 합성에 더 민감하게 저해하는 것을 나타낸 것이다.
도 4은 프로모터 assay에 사용되어 construct에 삽입된 wild-type c-myc G-quadruplex 시퀀스 (Pu27)와 안정한 G-quadruplex를 형성하지 못하는 single-base mutant (Pu27Mut) 시퀀스를 나타낸 것이다.
도 5은 promoter assay의 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 B5와 유도체의 합성단계를 나타낸 것이다.
도 7은 B5와 유도체들의 PCR-assay결과를 나타낸 것이다(물결선을 함유하는 결합은 부착 지점을 의미한다).
도 8은 C2와 유도체의 합성단계를 나타낸 것이다.
도 9은 triazine "12469"의 구조를 나타낸 것이다.
도 10은 C2 유도체들(9-type)의 PCR-assay결과를 나타낸 것이다(물결선을 함유하는 결합은 부착 지점을 의미한다).
도 11은 C2 유도체들(11-type)의 PCR-assay결과를 나타낸 것이다(물결선을 함유하는 결합은 부착 지점을 의미한다).
도 12은 C2 유도체들(10-type)의 PCR-assay결과를 나타낸 것이다(물결선을 함유하는 결합은 부착 지점을 의미한다).
도 13은 D2와 유도체의 합성단계를 나타낸 것이다.
도 14은 D2와 유도체의 PCR-assay결과를 나타낸 것이다(물결선을 함유하는 결합은 부착 지점을 의미한다).

본 발명자들은 기존의 부작용을 극복한 새로운 개념의 항암제를 개발하기 위하여 본 발명을 완성하게 되었다.

발암유전자 c-myc은 유방암, 결장, 소세포 폐암, 조혈계 종양, 백혈병, 버키트 림프종 등의 다수의 암종에 과잉발현되어 있다.

85 내지 90 %의 c-myc 전사를 조절하는 p1 프로모터 upstream의 NHE Ⅲ₁(nuclease hypersensitivity element Ⅲ₁) 영역에 존재하는 27개의 염기서열은 G-quadruplex를 형성할 수 있으며, 이 G-quadruplex 구조는 유전자 발현을 억제한다. 이 c-myc 프로모터의 G-quadruplex구조를 안정화시키는 리간드는 c-myc이 과발현되는 암종에 선택적인 항암제로 개발 가능하다.

본 발명에서는 기존에 보고된 c-myc G-quadruplex에 결합하는 리간드 구조와는 다르며 선택성이 뛰어난 새로운 리간드를 구조기반 가상검색을 수행하여 단기간내에 발굴하고자 하였다.

상용화된 화합물 라이브러리인 SPECS와 Chemdiv 데이터베이스의 560,000개 화합물을 대상으로 가상검색을 수행하여 c-myc G-quadruplex에 결합력이 우수할 것으로 예측되는 화합물 61개를 구매하고 PCR stop assay를 수행한 결과, c-myc G-quadruplex에 선택적으로 결합하여 안정화 시키는 리간드들은 하기 화학식1(이하 'B5'), 화학식 2(이하 'C2') 및 화학식 3(이하 'D2')을 갖는 화합물임을 밝혔다.

c-myc 프로모터의 NHE Ⅲ₁ 영역에 있는 G-quadruplex를 형성하는 26 뉴클레오티드 올리고머 (Pu26WT)를 template로 사용하는 PCR 반응에서 G-quadruplex 구조를 안정화시키는 리간드를 첨가하면 PCR 반응을 정지시키는 효과를 나타내므로 PCR 반응 생성물을 전기영동으로 분석 후 양을 측정하여 리간드의 활성 값을 구하였다.

리간드들 중에서 상기의 화합물들은 c-myc 프로모터의 G-quadruplex를 선택적으로 안정화시키고, 버키트 림프종 (Burkitt’s lymphoma) 세포 중에서 c-myc의 발현이 프로모터의 G-quadruplex에 의해 영향을 받는 Ramos 세포주에서는 선택적인 세포독성과 c-myc 발현 억제효과를 보였다.

나아가 본 발명자들은 상기 화합물과 아민, 아마이드 부분에 다양한 치환기를 가지는 알리파틱 아민 또는 아마이드를 도입시켜 유도체들을 다양화하였다. 합성된 화합물들은 G-quadruplex에 결합하여 안정화시켜 전사가 일어나지 않는지를 in vitro 실험을 하였고, PCR stop assay의 방법을 이용하여 활성도를 측정하였다. assay 결과 더 좋은 화합물을 도출해 낼 수 있었다.

발명의 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 기존 치료 활성 성분, 기타 보조제, 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 이러한 조성물에 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 비정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 상기 조성물은 약제화하는 경우, 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있으며, 제제화 할 경우에는 약제학적으로 허용 가능한 희석제 또는 부형제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사용액의 형태 등 다양한 형태로 제형화 하여 사용할 수 있으며, 경구투여하거나 정맥내, 복강내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다.

경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제형화 한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크와 같은 윤활제들도 사용된다.

경구용 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 주사제의 기제로는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제 및 방부제와 같은 종래의 첨가제를 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서 투여는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 조성물은 활성물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다.

본 발명에 있어서 용어, 약제학적으로 유효한 양은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 화합물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 당 0.1 내지 100 mg, 바람직하게는 0.5 내지 10 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. ¹ H NMR , ¹³ C NMR 및 MS 측정

¹H NMR과 ¹³C NMR 스펙트럼은 Varian-500 (500 MHz ¹H, 125 MHz ¹³C) 분광계로부터 얻어졌다. NMR 용매로는 CDCl3, DMSO를 사용하였으며, chemical shift는 표준물질인 tetramethylsilane으로부터 ppm단위로 기록하였으며 데이터는 chemical shift multiplicity (s=singlet, d=doublet, t=triplet, q=quartet, bs=broad singlet, m=multiplet, dd=doublet of doublet), coupling constant (Hz), integration의 순으로 기록하였다. High Performers liquid chromatography (HPLC)는 Hewlett Packard Series 1100 모델로, 컬럼은 ZORBAX ECLIPS C₁₈ (3 x 50 mm)을 사용하였다. 질량분석기 (MS)는 Electrospray ionization (ESI) 방식의 Agilent Technologies 6130 모델을 사용하여 수행하였다. Thin layer chromatography (TLC)는 Merck사의 silica gel 60 F₂₅₄이 입혀진 glass plate를 사용하였으며, TLC상에 분리된 물질의 확인을 위하여 UV lamp (254nm)를 사용하거나 PMA 용액 또는 KMnO₄ 용액에 담근 후 가열하여 확인하였다. Flash column chromatography는 Merck 제품의 Silica gel 70-230 mesh을 사용하여 수행하였다. 생성물의 순도는 ¹H NMR과 HPLC 분석을 통해 95%이상 순물질인 것을 확인하였으며 모든 화합물은 ¹H, ¹³C NMR, MS로 확인하였다.

반응에 사용된 대부분의 시약은 Aldrich-Sigma, Junsei, TCI 에서 구입하여 정제 없이 사용하였다. DMF는 사용 직전에 Glass Count 유기용매정제장치를 이용하여 정제한 것을 사용하였다.

실시예 2. phenoxazone 계열 화합물의 합성

1. benzyl 3-( benzyloxy )-2- nitrobenzoate (이하 ' 화합물2 ')

3-hydroxy-2-nitrobenzoic acid(이하 '화합물1')(1.8 g, 10 mmol)를 아세톤에 완전히 녹인 후 K₂CO₃와 benzyl bromide(2.6 mL, 22 mmol)를 차례로 넣은 후 6시간 동안 환류반응을 시켜주었다. 반응이 완결된 후 실온으로 천천히 식혀준다. 반응이 종결되면 실온까지 식히고, 침전물을 필터링 해주고, 용매를 감압 하에 제거한다. 증류수를 첨가하여 H₂O/EtOAc로 추출하였다. 유기층을 증류수와 brine으로 닦고 무수 MgSO₄로 건조시킨 후, 감압 하에서 용매를 제거하였다.

헥산으로 재결정 해주어 화합물 2(흰색고체, 3.6 g, 98 %) 을 얻을 수 있었다.

¹H NMR (CDCl₃, 500 MHz): δ 7.62-7.59 (m, 1H), 7.44-7.30 (m, 11H), 7.24 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 5.40 (s, 2H), 5.20 (s, 2H)

LC-Ms: (M+18)⁺ 381.

2. 3-( benzyloxy )-2- nitrobenzoic acid (이하 ' 화합물3 ')

화합물2(2 g, 5.5 mmol)을 MeOH에 녹인 후 aq. NaOH (10 mL, 5M)를 넣어주고 5시간 동안 반응 시켜주었다. 반응 종결된 뒤 감압 하에 용매를 제거해 주었다. 5N HCl 로 산화 시켜준 다음 Dichloromethane를 첨가하여 H₂O/DMC로 반응물을 추출하였다. 유기층을 증류수와 brine으로 닦고 무수 MgSO₄로 건조시킨 후, 감압 하에서 용매를 제거하였다. 헥산으로 닦아주어 화합물3(흰색 고체, 1.45 g, 96 %)를 얻을 수 있었다.

¹H NMR (CDCl₃, 500 MHz): δ 7.68 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.46 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.40-7.32 (m, 5H), 7.30 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 5.20 (s, 2H)

LC-Ms: (M+18)⁺ 291, LC-Ms: (M-1)+ 272.

3. 화합물 6의 합성법

화합물3에 0 ℃에서 증류된 CH₂Cl₂ (0.2 M)를 공기를 빼주고 아르곤을 넣어준 다음 oxalylchloride (1. 1 eq)를 넣어준 후 무수 DMF를 4-5방울 떨어 가해준 다음 15분간 교반 해주었다. 감압 하에 oxalylchloride를 제거한 뒤 증류된 CH₂Cl₂ (0.2 M)를 가해주고 0 ℃로 식혀준 다음 triethyl amine (3 eq)와 아민(1 eq)을 차례로 넣어준 뒤 4시간 동안 실온에서 반응시켜준다. 반응이 종결되면 얼음물을 첨가하여 H₂O/EtOAc로 추출하였다. 유기층을 증류수와 brine으로 닦고 무수 MgSO₄로 건조시킨 후, 감압 하에서 용매를 제거하였다. Flach column chromatography (20-40 % Ethyl acetate/n-hexane)방법으로 분리 정제하여 하기 화학식4(이하 '화합물4')를 얻었다.

화합물 4 (1 eq)를 에탄올에 교반 시켰다. Pd/C ( 10 %w/w )를 넣고 공기를 제거하고 H₂을 풍선에 연결하여 6시간 반응시켰다. 반응이 완결된 후 silica에서 필터링 해주어 Pd/C를 제거해 준 후 용액을 감압 하에 제거해주었다. 하기 화학식 5(이하 '화합물5') (노란색 고체, 80 %)을 얻을 수 있었다.

화합물 5를 에탄올에 충분히 녹인 뒤 benzoquinone (5 eq) 를 넣어준 뒤 16시간 동안 실온에서 반응 하였다. 빨간색 계열의 침전물을 EtOAc로 씻어주며 필터링 해주었다. 필터링으로 깨끗한 화합물을 얻어내지 못한 경우 Flach column chromatography (10-20 % EtOAc/CH₂Cl₂)로 얻어 내었다.

하기 화학식 6(이하 '화합물6')을 40-70 % 수득률로 얻을 수 있었다.

4. 2- amino - N ¹ , N ⁹ - dibutyl -3- oxo -3H- phenoxazine -1,9- dicarboxamide (이하 'B5')

2-아미노-N-부틸-3-하이록시싸이클로헥사-1,4-다이엔카복사마이드(105 mg, 0.5 mmol)을 에탄올에 충분히 녹인 뒤 벤조퀴논(270 mg, 2.5 mmol)를 넣어준 뒤 16시간 동안 실온에서 반응하였다. Flach column chromatography( 50 % Ethyl acetate/ n-hexane) 방법으로 분리 정제하여 2-아미노-N¹,N⁹-다이부틸-3-옥소-3에이치-페녹사진-1,9-다이카복사마이드 화합물(빨간색 고체, 123 mg, 60 %)를 얻었다.

¹H NMR (CDCl₃, 500 MHz) δ 10.60 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 10.41 (brs, 1H), 8.59 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 8.03 (brs, 1H), 7.60-7.50 (m, 3H), 6.49 (s, 1H), 3.35- 3.30 (m, 4H), 1.61-1.50 (m, 4H), 1.39-1.31 (m, 4H), 0.92 (t, J= 7.5 Hz, 6H)

¹³C NMR (DMSO, 125 MHz): δ 179.5, 168.5, 166.9, 152.2 150.6, 146.5, 142.1, 134.7, 129.3 125.1, 117.9, 104.6, 97.1 39.6, 39.1 32.1, 31.8, 20.5, 20.4, 14.4, 14.3

LC-Ms:(M+1)⁺411

mp 290-295 ℃.

5. 2- amino - N ¹ , N ⁹ - bis (2- methoxyethyl )-3- oxo -3H- phenoxazine -1,9-dicarboxamide(이하 '6 a' )

화합물 6의 합성법에 따라서 2-amino-3-hydroxy-N-(2-methoxyethyl) cyclohexa-1,4-dienecarboxamide (106 mg, 0.5 mmol)과 benzoquinone (270 mg, 2.5 mmol)사용하여 반응시켰다. Flach column chromatography ( 80 % Ethyl acetate/n-hexane) 방법으로 분리 정제하여 화합물 6a (빨간색 고체, 134 mg, 65 %)를 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz): δ 10.68-10.60 (m, 1H), 10.29 (brs, 1H), 8.73-8.70 (m, 1H), 8.10 (brs, 1H), 7.62-7.50 (m, 3H), 6.50 (s, 1H), 3.53-3.49 (m, 8H), 3.28 (s, 3H), 3.26 (s, 3H)

LC-Ms: (M+1)⁺ 415

mp 248-250 ℃.

6. 2- amino - N ¹ , N ⁹ - bis ( cyclohexylmethyl )-3- oxo -3H- phenoxazine -1,9- dicarboxamide (이하 '6 b' )

화합물 6의 합성법에 따라서 2-amino-N-(cyclohexylmethyl)-3-

hydroxycyclohexa-1,4-dienecarboxamide (125 mg, 0.5 mmol)과 benzoquinone (270 mg, 2.5 mmol)사용하여 반응시켰다. Flach column chromatography ( 80 % Ethyl acetate/n-hexane) 방법으로 분리 정제하여 화합물 6b (빨간색 고체, 270 mg, 63 %)를 얻었다.

¹H NMR (CDCl₃, 500 MHz): δ 10.69 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 10.52 (brs, 1H), 8.67 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 8.10 (brs, 1H), 7.70-7.68 (m, 1H), 7.64-7.59 (m, 2H), 6.58 (s, 1H), 3.29-3.25 (m, 4H), 1.87-1.72 (m, 12H), 1.32-1.25 (m, 6H), 1.06-1.01 (m, 4H)

LC-Ms: (M+1)⁺ 491

mp 290-293 ℃.

7. 2- amino - N ¹ , N ⁹ - dibenzyl -3- oxo -3H- phenoxazine -1,9-dicarboxamide(이하 '6 c' )

화합물 6의 합성법에 따라서 2-amino-N-benzyl-3-hydroxycyclohexa

-1,4-dienecarboxamide (112 mg, 0.5 mmol)과 benzoquinone (270 mg, 2.5 mmol) 사용하여 반응시켰다. 침전물을 EtOAc로 씻어주며 필터링 해주어 화합물 6c (빨간색 고체, 270 mg, 68 %)를 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz): δ 11.33 (t, J= 6.0 Hz, 1H), 10.43 (brs, 1H), 9.25 (t, J= 6.0 Hz), 8.16 (brs, 1H), 7.73-7.63 (m, 3H), 7.45-7.27 (m, 10H), 6.60 (s, 1H), 4.49 (d, J= 6.0 Hz, 2H), 4.43 (d, J= 6.5 Hz, 2H)

LC-Ms: (M+1)⁺ 479

mp 310-313 ℃.

8. 2- amino - N ¹ , N ⁹ - diisopentyl -3- oxo -3H- phenoxazine -1,9-dicarboxamide(이하 '6 d' )

화합물 6의 합성법에 따라서 2-amino-3-hydroxy-N-isopentylcyclohexa-1,4-dienecarboxamide (112 mg, 0.5 mmol)과 benzoquinone (270 mg, 2.5 mmol)사용하여 반응시켰다. Flach column chromatography ( 60 % Ethyl acetate/n-hexane) 방법으로 분리 정제하여 화합물 6d (빨간색 고체, 153 mg, 70 %)를 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz): δ 10.71 (t, J= 5.5 Hz, 1H), 10.52 (brs, 1H), 8.70 (t, J= 6.0 Hz, 1H), 8.14 (brs, 1H), 7.71-7.58 (m, 3H), 6.59 (s, 1H), 3.48-3.45 (m, 4H), 1.76-1.68 (m, 2H), 1.63-1.58 (m, 2H), 1.57-1.52 (m, 2H), 1.01 (d, J= 7.0 Hz, 12H)

LC-Ms: (M+1)⁺ 439

mp 294-296 ℃.

9. 2- amino - N ¹ , N ⁹ - diethyl -3- oxo -3H- phenoxazine -1,9-dicarboxamid(이하 '6 e' )

화합물 6의 합성법에 따라서 2-amino-N-ethyl-3-hydroxycyclohexa

-1,4-dienecarboxamide (91 mg, 0.5 mmol)과 benzoquinone (270 mg, 2.5 mmol)사용하여 반응시켰다. Flach column chromatography (50 % Ethyl acetate/n-hexane) 방법으로 분리 정제하여 화합물 6e (빨간색 고체, 119 mg, 67 %)를 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz): δ 10.59 (t, J= 5.5 Hz, 1H), 10.39 (brs, 1H), 8.60 (t, J= 6.0 Hz, 1H), 8.02 (brs, 1H), 7.60-7.49 (m, 3H), 6.48 (s, 1H), 3.38-3.32 (m, 4H), 1.19 (t, J= 7.5 Hz, 3H), 1.16 (t, J= 7.5 Hz, 3H)

LC-Ms: (M+1)⁺ 355

mp 302-306 ℃.

10. 2- amino -3- oxo - N ¹ , N ⁹ - bis (3,4,5- trimethoxybenzyl )-3H- phenoxazine -1,9-dicarboxamide(이하 '6 f' )

화합물 6의 합성법에 따라서 2-amino-3-hydroxy-N-(3,4,5-trimethoxybenzyl)benzamide (644 mg, 1.94 mmol)과 benzoquinone (1 g, 9.7 mmol)사용하여 반응시켰다. Flach column chromatography (20 % EtOAc/CH₂Cl₂) 방법으로 분리 정제하여 화합물 6f (빨간색 고체, 50 mg, 27 %)를 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz) δ 11.15 (t, J = 6 Hz, 1H), 10.33 (brs, 1H), 9.18 (t, J = 6 Hz, 1H), 8.74 (s, 1H), 8.40 (s, 1H), 8.07 (br s, 1H), 7.55 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.48 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.37 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.75-6.66 (m, 3H), 6.60 (s, 1H), 6.56 (d, J= 2.5 Hz, 1H), 4.30 (t, J = 5.0 Hz, 4H), 3.72 (s, 6H), 3.71 (s, 6H), 3.64 (s, 3H), 3.61 (s, 3H)

LC-Ms: (M+1)⁺ 659

mp 283-286 ℃.

11. 2- amino -3- oxo - N ¹ , N ⁹ - bis (2- phenoxyethyl )-3H- phenoxazine -1,9- dicar boxamide(이하 '6 g' )

화합물 6의 합성법에 따라서 2-amino-3-hydroxy-N-(2-phenoxyethyl)

benzamide (131 mg, 0.48 mmol)과 benzoquinone (260 mg, 2.4 mmol)사용하여 반응시켰다. Flach column chromatography (20 % EtOAc/Hexane - 90% CH₂Cl₂/EtOAc)방법으로 분리 정제하여 화합물 6g (빨간색 고체, 100 mg, 27 %)를 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz): δ 10.87 (t, J= 6.0 Hz, 1H), 10.33 (brs, 1H), 8.92 (t, J= 6.0 Hz, 1H), 8.11 (brs, 1H), 7.64-7.62 (m, 1H), 7.56-7.55 (m, 2H), 7.28-7.23 (m, 3H), 6.98-6.88 (m, 5H), 6.51 (s, 1H),4.19 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 4.13 (t, J= 5.5 Hz, 2H), 3.76-3.69 (m, 4H)

LC-Ms: (M-1)⁺ 539

mp 225-230 ℃.

12. 2- amino - N ¹ , N ⁹ - bis (4- methoxybenzyl )-3- oxo -3H- phenoxazine -1,9-dicarboxamide (이하 '6 h' )

2-아미노-3-하이드록시-N-(4-메톡시페놀) 벤즈아마이드(1.9 g, 2.4 mmol)를 에탄올에 충분히 녹인 뒤, 벤조퀴논(1.3g, 12 mmol)를 넣어주고 16시간 동안 실온에서 반응하였다. 침전물을 EtOAc로 씻어주며 필터링 해주어 화합물 2-아미노-N¹,N⁹-(4-메톡시벤질)-3-옥소-3H-페녹사진-1,9-다이카복사마이드(빨간색 고체, 645 mg, 40 %)를 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz) δ 11.22 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 10.37 (brs, 1H), 9.11 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 8.09 (brs, 1H), 7.63-7.61 (m, 1H), 7.56-7.53 (m, 2H), 7.28 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.21 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.86 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.81 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.50 (s, 1H), 4.35 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 4.33 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 3.72 (s, 3H), 3.69 (s, 3H)

LC-Ms: (M+1)⁺ 539

mp 272-277 ℃.

13. 2- amino - N ¹ , N ⁹ - bis (4- fluorobenzyl )-3- oxo -3H- phenoxazine -1,9-dicarboxamide(이하 '6 i' )

화합물 6의 합성법에 따라서 2-amino-N-(4-fluorobenzyl)-3- hydroxybenzamide (520 mg, 2 mmol)과 benzoquinone (1.12 g, 10.4 mmol)사용하여 반응시켰다. 침전물을 EtOAc로 씻어주며 필터링 해주어 화합물 6i 빨간색 고체, 110 mg, 10 %)를 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz) δ 11.27 (t, J = 6 Hz, 1H), 10.33 (brs, 1H), 9.18 (t, J = 6.5 Hz, 1H), 8.09 (br s, 1H), 7.65-7.60 (m, 3H), 7.39-7.36(m, 2H), 7.34-7.30 (m, 2H), 7.14-7.06 (m, 4H), 6.51 (s, 1H), 4.38-4.36 (m, 4H)

LC-Ms: (M-1)⁺ 513

mp 300-308 ℃.

14. 2- amino - N ¹ , N ⁹ - bis (3,4- difluorobenzyl )-3- oxo -3H- phenoxazine -1,9-dicarboxamide(이하 '6 j' )

화합물 6의 합성법에 따라서 2-amino-N-(3,4-difluorobenzyl)-3- hydroxybenzamide (552 mg, 2 mmol)과 benzoquinone (1.12 g, 10.4 mmol)사용하여 반응시켰다. 침전물을 EtOAc로 씻어주며 필터링 해주어 화합물 6j (빨간색 고체, 70 mg, 1 %)를 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz) δ 11.30 (t, J = 6 Hz, 1H), 10.28 (brs, 1H), 9.24 (t, J = 6.5 Hz, 1H), 8.11 (brs, 1H), 7.66-7.55 (m, 3H), 7.36-7.26 (m, 4H), 7.17-7.11 (m, 2H), 6.51 (s, 1H), 4.39 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 4.36 (d, J = 6.0 Hz, 2H)

LC-Ms: (M-1)⁺ 549

mp 276-279 ℃.

15. 2- amino - N ¹ , N ⁹ - bis (3,4- dimethoxyphenyl )-3- oxo -3H- phenoxazine -1,9-dicarboxamide(이하 '6 k' )

화합물 6의 합성법에 따라서 2-amino-N-(3,4-dimethoxyphenyl-3- hydroxybenzamide (576 mg, 2 mmol)과 benzoquinone (1.12 g, 10.4 mmol)사용하여 반응시켰다. 침전물을 EtOAc로 씻어주며 필터링 해주어 화합물 6k (빨간색 고체, 70 mg, 1 %)를 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz) δ 12.04 (s, 1H), 10.30 (brs, 1H), 10.53 (s, 1H), 8.27 (brs, 1H), 7.70-7.60 (m, 3H), 7.43 (s, 1H), 7.32 (s, 1H), 7.16 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.88 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 6.80 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 6.59 (s, 1H), 6.40 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 3.72 (s, 3H),. 3.67 (s, 3H),. 3.66 (s, 3H),. 3.62 (s, 3H)

LC-Ms: (M+1)⁺ 571

mp 268-272 ℃.

16. 2- amino -3- oxo - N ¹ , N ⁹ - bis ( pyridin -2- ylmethyl )-3H- phenoxazine -1,9-dicarboxamide(이하 '6 l' )

2-아미노-3-하이드록시-N-(피리딘-2-일메틸)벤즈아마이드(486 mg, 2 mmol)를 에탄올에 충분히 녹인 뒤, 벤조퀴논 (1.12 g, 10.4 mmol)를 넣어주고 16시간 동안 실온에서 반응하였다. 침전물을 에틸아세테이트로 씻어주며 필터링 해주어 화합물 2-아미노-3-옥소-N¹,N⁹-(페녹사진-2-일메틸)-3에이치-페녹사진-1,9-다이카복사마이드(빨간색 고체, 85 mg, 7 %)를 얻었다.

화합물 6의 합성법에 따라서 2-amino-3-hydroxy-N-pyridin-2- ylmethyl) benzamide (486 mg, 2 mmol)과 benzoquinone (1.12 g, 10.4 mmol)사용하여 반응시켰다. 침전물을 EtOAc로 씻어주며 필터링 해주어 화합물 6l (빨간색 고체, 85 mg, 7 %)를 얻었다..

¹H NMR (DMSO-d₆,500MHz)δ 11.16 (t, J = 6.5 Hz, 1H), 10.25 (brs, 1H), 9.30 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 8.47-8.45 (m, 2H), 8.06 (brs, 1H), 7.67-7.62 (m, 5H), 7.26- 7.23 (m, 4H), 6.55 (s, 1H), 4.45 (d, J = 5.5 Hz, 2H), 4.39 (d, J = 6.5 Hz, 2H)

LC-Ms: (M+1)⁺ 481

mp 260-265 ℃.

17. 2- amino - N ¹ , N ⁹ - bis (3,4- dimethoxybenzyl )-3- oxo -3H- phenoxazine -1,9- dicarboxamide (이하 '6 m' )

화합물 6의 합성법에 따라서 2-amino-N-(3,4-dimethoxybenzyl)-3-

hydroxybenzamide (604 mg, 2 mmol)과 benzoquinone (1.12 g, 10.4 mmol)사용하여 반응시켰다. 침전물을 EtOAc로 씻어주며 필터링 해주어 화합물 6m (빨간색 고체, 50 mg, 0.76 %)를 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz) δ 11.15 (t, J = 6.5 Hz, 1H), 10.36 (brs, 1H), 9.11 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 8.08 (br s, 1H), 7.64-7.62 (m, 1H), 7.58-7.53 (m, 2H), 7.05 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 6.89 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 6.88-6.85 (m, 2H), 6.82-6.80 (m, 2H), 6.51 (s, 1H), 4.33 (d, J = 6.5 Hz, 2H), 4.28 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 3.72 (s, 3H), 3.70 (s, 3H), 3.69 (s, 3H), 3.68 (s, 3H)

LC-Ms: (M+1)⁺ 599

mp 247-250 ℃.

18. 2- amino - N ¹ , N ⁹ - bis (4- methoxyphenyl )-3- oxo -3H- phenoxazine -1,9-dicarboxamide(이하 '6 n' )

화합물 6의 합성법에 따라서 2-amino-3-hydroxy-N-(4- methoxyphenyl)benzamide (516 mg, 2 mmol)과 benzoquinone (1.12 g, 10.4 mmol)사용하여 반응시켰다. 침전물을 EtOAc로 씻어주며 필터링 해주어 화합물 6n (빨간색 고체, 50 mg, 4 %)를 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz) δ 12.11 (s, 1H), 10.61 (s, 1H), 10.34 (brs, 1H), 8.36 (brs, 1H), 7.70 -7.66 (m, 2H), 7.64-7.59 (m, 3H), 7.48 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 6.87 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 6.59(s, 1H), 6.54 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 3.74 (s, 3H), 3.67 (s, 3H)

LC-Ms: (M+1)⁺ 511

mp 338-340.

19. 2- amino -3- oxo - N ¹ , N ⁹ - bis (3,4,5- trimethoxyphenyl )-3H- phenoxazine -1,9-dicarboxamide(이하 '6 o' )

2-아미노-3-하이드록시-N-(3,4,5-트라이메녹시페닐)벤즈아마이드(636 mg, 2 mmol)를 에탄올에 충분히 녹인 뒤 벤조퀴논(1.12 g, 10.4 mmol)을 사용하여 반응시켰다. 침전물을 에틸아세테이트로 씻어주며 필터링 해주어 2-아미노-3-옥소-N¹,N⁹-비스(3,4,5-트라이메녹시페놀)-3에이치-페녹사진-1,9-다이카복사마이드(빨간색 고체, 60 mg, 4 %)를 얻었다.

¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 11.96 (s, 1H), 10.51 (s, 1H), 10.05 (br s, 1H), 8.11 (br s, 1H), 7.73 (m, 2H), 7.65 (m, 1H), 6.88 (s, 2H), 6.85 (s, 2H), 6.64 (s, 1H), 3.67 (s, 6H), 3.59 (s, 6H), 3.57 (s, 3H), 3.54 (s, 3H)

LC-Ms: (M+1)⁺ 631

mp 299-304.

20. 2- amino - N ¹ , N ⁹ - di ( benzo [d][1,3]dioxol-5- yl )-3- oxo -3H- phenoxazine -1,9-dicarboxamide(이하 '6 p' )

2-아미노-N-(벤조[d][1,3]다이옥실-5-일)-3-하이드록시벤즈아마이드(544 mg, 2 mmol)를 에탄올에 충분히 녹인 뒤 벤조퀴논(1.12 g, 10.4 mmol)사용하여 반응시켰다. 침전물을 에틸아세테이트로 씻어주며 필터링 해주어 2-아미노-N¹,N⁹-다이(벤조[d][1,3]다이옥실-5-일)-3-옥소-3에이치-페녹사진-1,9-다이카복사마이드(빨간색 고체, 65 mg, 5 %)를 얻었다.

¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 12.02 (s, 1H), 10.59 (s, 1H), 10.26 (brs, 1H), 8.29 (brs, 1H), 7.65 (m, 3H), 7.34 (s, 1H), 7.23 (s, 1H), 7.07 (dd, J = 1.5, 8.5 Hz, 1H), 6.93 (dd, J = 1.5, 8.5 Hz, 1H), 6.79 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.60 (s, 1H), 6.53 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 5.98 (s, 2H) 5.96 (s, 2H).

LC-Ms: (M+1)⁺ 539

mp 300-305 ℃.

21. 2- amino - N ¹ , N ⁹ - bis (2,3- dihydrobenzo [b][1,4]dioxin-6- yl )-3- oxo -3H- phenoxazine -1,9-dicarboxamide(이하 '6 q' )

화합물 6의 합성법에 따라서 2-amino-N-(2,3-dihydrobenzo[b]

[1,4]dioxin-6-yl)-3-hydroxybenzamide (572 mg, 2 mmol)과 benzoquinone (1.12 g, 10.4 mmol)사용하여 반응시켰다. 침전물을 EtOAc로 씻어주며 필터링 해주어 화합물 6q (빨간색 고체, 68 mg, 5 %)를 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz) δ 12.00 (s, 1H), 10.55 (s, 1H), 10.29 (brs, 1H), 8.28 (brs, 1H), 7.70-7.59 (m, 3H), 7.35 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 7.31 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 7.10 (dd, J = 2.5, 9.0 Hz, 1H), 6.87 (dd, J = 2.5, 9.0 Hz, 1H), 6.72 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 6.60 (s, 1H), 6.41 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 4.20 (m, 8H)

LC-Ms: (M+1)⁺ 567

mp 305-307.

22. 2- amino -3- oxo - N ¹ , N ⁹ - dip - tolyl -3H- phenoxazine -1,9-dicarboxamide(이하 '6 r' )

화합물 6의 합성법에 따라서 2-amino-3-hydroxy-N-p-tolylbenzamide (484 mg, 2 mmol)과 benzoquinone (1.12 g, 10.4 mmol)사용하여 반응시켰다. 침전물을 EtOAc로 씻어주며 필터링 해주어 화합물 6r (빨간색 고체, 100 mg, 8 %)를 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz) δ 12.13 (s, 1H), 10.68 (s, 1H), 10.36 (brs, 1H), 8.36 (brs, 1H), 7.71-7.67 (m, 2H), 7.63 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.58 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.46 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.10 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.77 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.61 (s, 1H), 2.29 (s, 3H), 2.19 (s, 3H)

LC-Ms: (M+1)⁺ 479

mp 345-346.

23. 2- amino - N ¹ , N ⁹ - bis (4- methylbenzyl )-3- oxo -3H- phenoxazine -1,9-dicarboxamide(이하 '6 s' )

화합물 6의 합성법에 따라서 2-amino-3-hydroxy-N-(4-methylbenzyl)

benzamide (512 mg, 2 mmol)과 benzoquinone (1.12 g, 10.4 mmol)사용하여 반응시켰다. 침전물을 EtOAc로 씻어주며 필터링 해주어 화합물 6s (빨간색 고체, 150 mg, 12 %)를 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz,) δ 11.19 (t, J = 6 Hz, 1H), 10.36 (brs , 1H), 9.09 (t, J = 6 Hz, 1H), 8.09 (brs, 1H), 7.64-7.62 (m, 1H), 7.57-7.54 (m, 2H), 7.23 (d, J = 8 Hz, 2H), 7.16 (d, J = 8 Hz, 2H), 7.10 (d, J = 8 Hz, 2H), 7.06 (d, J = 8 Hz, 2H), 6.52 (s, 1H), 4.36 (d, J = 6.5 Hz, 2H), 4.30 (d, J = 5.0 Hz, 2H), 2.27 (s, 3H), 2.24 (s, 3H)

LC-Ms: (M+1)⁺ 507

mp 305-307.

24. 2- amino - N ¹ , N ⁹ - bis (4-( dimethylamino ) phenyl )-3- oxo -3H- phenoxazine -1,9- dicarboxamide 의 합성(이하 '6 t' )

2-아미노-N-(4-(다이메틸아미노)페닐)-3하이드록시벤즈아마이드(542 mg, 2 mmol)를 에탄올에 충분히 녹인 뒤 벤조퀴논(1.12 g, 10.4 mmol)을 사용하여 반응시켰다. 침전물을 에틸아세테이트로 씻어주며 필터링 해주어 2-아미노-N¹,N⁹-비스(4-(다이메닐아미노)페닐)-3-옥소-3에이치-페녹사진-1,9-다이카복사마이드(빨간색 고체, 150 mg, 10 %)를 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz) δ 12.11 (s, 1H), 10.51 (s, 1H), 10.45 (brs, 1H), 8.37 (brs, 1H), 7.69-7.60 (m, 3H), 7.55 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.46 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.20-7.17 (m, 1H), 7.13-7.10 (m, 1H), 6.70 (d, J = 9.0 Hz, 2H)

LC-Ms: (M+1)⁺ 537.

25. 2- amino - N ¹ , N ⁹ - bis (4-( dimethylamino ) benzyl )-3- oxo -3H- phenoxazine -1,9-dicarboxamide(이하 '6 u' )

2-아미노-N-(4-(다이메틸아미노)벤질)-3-하이드록시벤즈아마이드(570 mg, 2 mmol)를 에탄올에 충분히 녹인 뒤 벤조퀴논(1.12 g, 10.4 mmol)을 사용하여 반응시켰다. 침전물을 에틸아세테이트로 씻어주며 필터링 해주어 2-아미노-N¹,N⁹-비스(4-(다이메틸아미노)벤질)-3-옥소-3에이치-페녹사진-1,9-다이카복사마이드(빨간색 고체, 200 mg, 13 %)를 얻었다.

¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 11.17 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 10.43 (brs, 1H), 9.03 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 8.05 (brs, 1H), 7.64-7.61 (m, 1H), 7.55-7.53 (m, 2H), 7.21 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.12 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.66 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 6.62 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.51 (s, 1H), 4.34 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 4.31 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 2.85 (s, 6H), 2.82 (s, 6H)

LC-Ms: (M+1)⁺ 565.

26. 2- amino - N ¹ , N ⁹ - bis (4-( methoxymethoxy ) phenyl )-3- oxo -3H- phenoxazine -1,9-dicarboxamide(이하 '6 v' )

화합물 6의 합성법에 따라서 2-amino-3-hydroxy-N-(4-(methoxymethoxy)phenyl)benzamide (576 mg, 2 mmol)과 benzoquinone (1.12 g, 10.4 mmol)사용하여 반응시켰다. 침전물을 EtOAc로 씻어주며 필터링 해주어 화합물 6v (빨간색 고체, 150 mg, 10 %)를 얻었다.

¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 12.16 (s, 1H), 10.69 (s, 1H), 10.46 (brs, 1H), 8.38 (brs, 1H), 7.69 (m, 2H), 7.63 (m, 3H), 6.51 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.96 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 6.69 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.60 (s, 1H), 5.17 (s, 2H), 5.10 (s, 2H), 3.40 (s, 3H), 3.37 (s, 3H).

LC-Ms: (M+1)⁺ 537

mp 312-315 ℃

실시예 3. triazine 계열 화합물의 합성법

1. 화합물 9 또는 화합물 10의 합성법

하기 화학식7(이하 '화합물'7)에 0 ℃에서 무수 아세톤에 충분히 녹인 후, amine (1 eq)을 차례로 넣어 주고 1시간 동안 반응 시켜주었다. 반응이 종결되면 얼음물을 첨가하여 H₂O/EtOAc로 추출하였다. 유기층을 증류수와 brine으로 닦고 무수 MgSO₄로 건조시킨 후, 감압 하에서 용매를 제거하여 하기 화학식8(이하 '화합물8')을 얻을 수 있었다. 별다른 정제과정 없이 다음 반응에 이용하였다.

화합물8 에 무수 아세톤에 넣고, K₂CO₃(2.5eq)과 amine (2 eq)을 차례로 넣어 주고 실온에서 15시간 동안 반응 시켜주었다. 반응이 종결되면 증류수를 첨가하여 H₂O/EtOAc로 추출하였다. 유기층을 증류수와 brine으로 닦고 무수 MgSO₄로 건조시킨 후, 감압 하에서 용매를 제거한 후 MeOH에서 재결정 하거나, Flach column chromatography (20-40 % Ethyl acetate/n-hexane)방법으로 분리 정제하여 하기 화학식 9(이하 '화합물9'), 하기 화학식10(이하 '화합물10')을 얻었다.

2. 6- chloro - N ² , N ⁴ - bis (3,4- dimethoxyphenyl )-1,3,5- triazine -2,4-diamine(이하 '9 a' )

화합물 9 또는 10의 합성법에 따라서 4,6-dichloro-N-(3,4-dimethoxyphenyl)-1,3,5- triazin-2-amine (216 mg, 0.72 mmol) 를 K₂CO₃(99.5g,0.72mmol)과 amine (110 mg, 0.72 mmol)을 차례로 넣는다. 감압 하에서 용매를 제거한 후 Flach column chromatography (40 % EtOAc/Hexane) 방법으로 분리 정제하여 화합물 9a (갈색계열 고체, 70 mg, 23 %)를 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz) δ 10.02 (s, 1H), 7.26-6.84 (m, 6H), 3.72 (s, 9H), 3.50 (s, 3H)

C-Ms: (M+1)⁺ 418.

3. N ² -( benzo [d][1,3]dioxol-5- yl )-6- chloro - N ⁴ -(3,4- dimethoxyphenyl )-1,3,5- triazine -2,4-diamine(이하 '9 b' )

화합물 9 또는 10의 합성법에 따라서 4,6-dichloro-N-(3,4-dimethoxyphenyl)-1,3,5-triazin-2-amine (147 mg, 0.49 mmol) 를 K₂CO₃(68mg,0.49mmol)과 amine (67 mg, 0.49 mmol)을 차례로 넣는다. 감압 하에서 용매를 제거한 후 Flach column chromatography (30 % EtOAc/Hexane) 방법으로 분리 정제하여 화합물 9b (갈색계열 고체, 40 mg, 20 %)를 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz) δ 10.10 (s, 1H), 10.05 (s, 1H), 7.31-7.19 (m, 3H), 7.05-6.83 (m, 3H), 5.99 (s, 2H), 3.34 (s, 6H)

LC-Ms: (M+1)⁺ 402.

4. N ² , N ⁴ - di ( benzo [d][1,3]dioxol-5- yl )-6- chloro -1,3,5- triazine -2,4-diamine(이하 '9 c' )

화합물 9 또는 10의 합성법에 따라서 N-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-4,6-dichloro-1,3,5-triazin-2-amine (568 mg, 2 mmol) 를 K₂CO₃(27.6g,2mmol)과 amine (631 mg, 4.6 mmol)을 차례로 넣는다. 감압 하에서 용매를 제거한 후 E.A로 재결정 하여 화합물 9c (갈색계열 고체, 26.3 mg, 3.4 %)를 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz) δ 10.11 (s, 1H), 10.00 (s, 1H), 7.26-7.24 (m, 2H), 7.06-6.85 (m, 4H), 6.00 (s, 4H)

LC-Ms: (M+1)⁺ 386.

5. N ² -( benzo [d][1,3]dioxol-5- yl )-6- chloro - N ⁴ -( naphthalen -2- yl )-1,3,5-triazine-2,4-diamine(이하 '9 d' )

화합물 9 또는 10의 합성법에 따라서 4,6-dichloro-N-(naphthalen-2-yl)-1,3,5-triazin-2-amine (580 mg, 2 mmol) 를 K₂CO₃(276mg,2mmol)과 amine (631 mg, 4.6 mmol)을 차례로 넣는다. 감압 하에서 용매를 제거한 후 Flach column chromatography (40 % EtOAc/Hexane) 방법으로 분리 정제하여 화합물 9d (갈색계열 고체, 340 mg, 43 %)를 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz) δ 10.32 (s, 1H), 10.06 (s, 1H), 7.97-7.85 (m, 5H), 7.61-7.53 (m, 5H), 5.96 (s, 2H)

LC-Ms: (M+1)⁺ 392.

6. 6- chloro - N ² , N ⁴ - bis (2,3- dihydro -1H- inden -5- yl )-1,3,5- triazine -2,4-diamine(이하 '9 e' )

화합물 9 또는 10의 합성법에 따라서 4,6-dichloro-N-(2,3-dihydro-1H-inden-5-yl)-1,3,5-triazin-2-amine (560 mg, 2 mmol) 를 K₂CO₃(276mg,2mmol)과 amine (293 mg, 2.2 mmol)을 차례로 넣는다. 감압 하에서 용매를 제거한 감압 하에서 용매를 제거한 후 EA를 재결정 하여 화합물 9e (흰색고체, 43.5 mg, 5 %)를 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz) δ 10.13 (s, 2H), 7.51 (d, J= 2.5 Hz, 2H), 7.33 (d, J= 7.0 Hz, 2H),, 7.15 (dd, J= 2.5, 7.0 Hz, 2H), 2.83-2.80 (m, 8H), 2.03-1.98 (m, 4H)

LC-Ms: (M+1)⁺ 378.

7. 6- chloro - N ² -(4-( methoxymethoxy ) phenyl )- N ⁴ -(4- methoxyphenyl )-1,3,5-triazine-2,4-diamine(이하 '9 f' )

6-다이클로로-N-(4-메톡시페놀)-1,3,5-트리아진-2-아민(738 mg, 4 mmol)를 에 무수 아세톤에 넣고, K₂CO₃ (1.1 g, 8 mmol) 및 amine (1 g, 8 mmol)을 차례로 넣은 후, 실온에서 15시간 동안 반응 시켜주었다. 반응이 종결된 후 증류수를 첨가하여 H₂O/EtOAc로 추출하였다. 유기층을 증류수와 brine으로 닦고 무수 MgSO₄로 건조시킨 후, 감압 하에서 용매를 제거한 후 Flach column chromatography (40 % EtOAc/Hexane) 방법으로 분리 정제하여 6-클로로-N²-(4-(메톡시메톡시페닐)-N⁴-(4-메톡시페닐)-1,3,5-트리아진-2,4-다이아민(흰색 고체, 619 mg, 40 %)를 얻었다.

¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 10.09 (s, 1H). 10.06 (s, 1H), 7.49-7.47 (m, 4H), 6.98-6.89 (m, 4H), 5.16 (s, 2H), 3.73 (s, 3H), 3.37 (s, 3H)

LC-Ms: (M+1)+ 388.

8. N ¹ , N ¹ ' -(6- chloro -1,3,5- triazine -2,4- diyl ) bis (4- methoxy - N ³ , N ³ -dimethylbenzene-1,3-diamine)(이하 '9 g' )

화합물 9 또는 10의 합성법에 따라서 N¹-(4,6-dichloro-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methoxy-N³,N³-dimethylbenzene-1,3-diamine (628 mg, 2 mmol) 를 K₂CO₃ (138mg, 1 mmol) 과 amine (166 mg, mmol) 을 차례로 넣는다. 감압 하에서 용매를 제거한 후 MeOH를 재결정 하여 화합물 9g (갈색계열 고체, 265m g, 60%)를 얻었다.

¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 9.91 (s, 1H), 9.83 (s, 1H), 7.13-7.01 (m, 3H), 6.81-6.79 (m, 3H), 3.76 (s, 6H), 2.69 (s, 6H), 2.56 (s, 6H)

LC-Ms: (M+1)⁺ 444.

9. 6- chloro - N ² , N ⁴ - bis (3,4,5- trimethoxyphenyl )-1,3,5- triazine -2,4-diamine (이하 '9 h' )

화합물 9 또는 10의 합성법에 따라서 4,6-dichloro-N-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-1,3,5-triazin-2-amine (500 mg, 1.5 mmol) 를 K₂CO₃ (276mg, 2 mmol) 과 amine (274 mg, 1.5 mmol) 을 차례로 넣는다. 감압 하에서 용매를 제거한 후 MeOH를 재결정 하여 화합물 9h(갈색계열 고체, 300mg, 60%)를 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz) δ 10.13 (s, 1H), 10.02 (s, 1H), 6.89 (s, 4H), 3.62-3.52 (m, 18H)

LC-Ms: (M+1)⁺ 478.

10. 6- chloro - N ² , N ⁴ - bis (5,6,7,8- tetrahydronaphthalen -2- yl )-1,3,5-triazine-2,4-diamine(이하 '9 i' )

화합물 9 또는 10의 합성법에 따라서 4,6-dichloro-N-(5,6,7,8-tetrahydrona phthalen-2-yl)-1,3,5-triazin-2-amine (500 mg, 1.6 mmol)를 K₂CO₃(331mg, 2.4 mmol)과 amine(235 mg, 1.6 mmol)을 차례로 넣는다. 감압 하에서 용매를 제거한 후 MeOH를 재결정하여 화합물 9i(갈색계열 고체, 300mg, 60%)를 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz) δ 10.06 (s, 2H), 7.39-7.28 (m, 3H), 6.98-6.80 (m, 3H), 2.66-2.60 (m, 8H), 1.74-1.71 (m, 8H)

LC-Ms: (M+1)⁺ 406.

11. 6- chloro - N ² , N ⁴ - bis (2,3- dihydrobenzo [b][1,4]dioxin-6- yl )-1,3,5-triazine-2,4-diamine (이하 '9 j' )

화합물 9 또는 10의 합성법에 따라서 4,6-dichloro-N-(2,3-dihydrobenzo[b][1,4] dioxin-6-yl)-1,3,5-triazin-2-amine (700 mg, 2.3 mmol)를 K2CO3 (153mg, 1 mmol) 과 amine (347 g, 2.3 mmol)을 차례로 넣는다. 감압 하에서 용매를 제거한 후 MeOH를 재결정 하여 화합물 9j(흰색 고체, 380mg, 40%)를 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz) δ 10.05 (s, 2H), 7.23-7.17 (m, 2H), 7.05-7.04 (m, 2H), 6.79-6.76 (m, 2H), 4.25-4.22 (m, 8H)

LC-Ms: (M+1)⁺ 414.

12. 6- chloro - N ² , N ⁴ - bis (4-(2- methoxyethoxy ) phenyl )-1,3,5- triazine -2,4-diamine (이하 '9 k' )

화합물 9 또는 10의 합성법에 따라서 4,6-dichloro-N-(4-(2-methoxyethoxy)phenyl)-1,3,5-triazin-2-amine (630 mg, 2 mmol)를 K₂CO₃ (153mg, 1 mmol) 과 amine (167 mg, 1 mmol)을 차례로 넣는다. 감압 하에서 용매를 제거한 후 MeOH를 재결정 하여 화합물 9k(갈색계열 고체, 117mg, 40%)를 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz) δ 10.07 (s, 1H), 10.00 (s, 1H), 7.50-7.47 (m, 4H), 6.92-6.90 (m, 4H), 4.11-4.08 (m, 4H), 3.66 (s, 6H)

LC-Ms: (M+1)⁺ 446.

13. 6- chloro - N ² , N ⁴ - bis (4- methoxyphenyl )-1,3,5- triazine -2,4-diamine(이하 '9 l' )

화합물 9 또는 10의 합성법에 따라서 4,6-dichloro-N-(4-methoxyphenyl)-1,3,5- triazin-2-amine (738 mg, 4 mmol) 를 K₂CO₃ (1.1 g, 8 mmol)과 amine (984 mg, 8 mmol)을 차례로 넣는다. 감압 하에서 용매를 제거한 후 MeOH를 재결정 하여 화합물 9l(흰색고체, 571 mg, 80 %)를 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz) δ 10.07 (s, 1H), 9.89 (s, 1H), 7.67-7.49 (m, 4H), 6.91-6.88 (m, 4H), 3.82 (s, 6H)

LC-Ms: (M+1)⁺ 358.

14. 6- chloro - N ² , N ⁴ - bis (2- methoxyethyl )-1,3,5- triazine -2,4-diamine(이하 '9m')

화합물 9 또는 10의 합성법에 따라서 4,6-dichloro-N-(2-methoxyethyl)-1,3,5- triazin -2 -amine (922 mg, 5 mmol) 를 K₂CO₃(1.3g,10mmol)과 amine (751 mg, 10 mmol)을 차례로 넣는다. 감압 하에서 용매를 제거한 후 MeOH를 재결정 하여 화합물 9m (흰색고체, 652 mg, 50 %)를 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz) δ 7.85-7.84 (m, 1H), 7.76-7.73 (m, 1H), 3.42-3.28 (m, 14H)

LC-Ms: (M+1)⁺ 262.

15. 6- chloro - N ² , N ⁴ - bis ( cyclohexylmethyl )-1,3,5- triazine -2,4-diamine(이하 '9 n' )

화합물 9 또는 10의 합성법에 따라서 4,6-dichloro-N-(cyclohexylmethyl)-1,3,5- triazin-2 -amine (922 mg, 5 mmol) 를 K₂CO₃ (1.3 g, 10 mmol)과 amine (1.1 g, 10 mmol)을 차례로 넣는다. 감압 하에서 용매를 제거한 후 MeOH를 재결정 하여 화합물 9n (흰색고체, 842 mg, 50 %)를 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz) δ 7.88 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 7.69 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 3.07-3.02 (m, 4H), 1.66-1.61 (m, 11H), 1.23-1.13 (m, 7H), 0.91-0.85 (m, 4H)

LC-Ms: (M+1)⁺ 338.

16. 6- chloro - N2 , N4 - diethyl -1,3,5- triazine -2,4-diamine(이하 '9 o' )

화합물 9 또는 10의 합성법에 따라서 4,6-dichloro-N-ethyl-1,3,5-triazin-2-amine (922 mg, 5 mmol) 를 K₂CO₃ (1.3 g, 10 mmol) 과 amine (5 ml, 10 mmol)을 차례로 넣는다. 감압 하에서 용매를 제거한 후 MeOH를 재결정 하여 화합물 9o (흰색고체, 604 mg, 60%)를 얻었다.

¹H NMR (500 MHz, CDCl3-d₃) δ 5.31 (s, 1H), 5.17 (s, 1H), 3.46-3.43 (m, 4H), 1.23-1.18 (m, 6H)

LC-Ms: (M+1)⁺ 202.

17. N ² , N ⁴ - dibenzyl -6- chloro -1,3,5- triazine -2,4-diamine(이하 '9 p' )

화합물 9 또는 10의 합성법에 따라서 N-benzyl-4,6-dichloro-1,3,5-triazin-2-amine (922 mg, 5 mmol) 를 K₂CO₃ (1.3 g, 10 mmol) 과 amine (10 mg, 10 mmol)을 차례로 넣는다. 감압 하에서 용매를 제거한 후 MeOH를 재결정하여 화합물 9p (흰색고체, 997 mg, 60 %)를 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz) δ 8.41 (t, J = 6.5 Hz, 1H), 8.31 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 7.32-7.21 (m, 10H), 4.46-4.41 (m, 4H)

LC-Ms: (M+1)⁺ 226.

18. 6- chloro - N ² , N ⁴ - bis (4-( methoxymethoxy ) phenyl )-1,3,5- triazine -2,4-diamine(이하 '9 q' )

4,6-다이클로로-N-(4-(메톡시메톡시페닐)-1,3,5-트리아진-2-아민(580 mg, 2 mmol)에 무수 아세톤에 넣고, K₂CO₃(276 mg, 2 mmol) 및 4-(메톡시메톡시)아닐린(631 mg, 4.6 mmol)을 차례로 넣은 후, 실온에서 15시간 동안 반응 시켜주었다. 반응이 종결된 후 증류수를 첨가하여 H₂O/EtOAc로 추출하였다. 유기층을 증류수와 brine으로 닦고 무수 MgSO₄로 건조시킨 후, 감압 하에서 용매를 제거한 후 Flach column chromatography(40 % EtOAc/Hexane) 방법으로 분리 정제하여 6-클로로-N²,N⁴-비스(4-(메톡시메톡시)페닐)-1,3,5-트리아진-2,4-다이아민(갈색계열 고체, 80 mg, 10 %)를 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz) δ 10.0 (s, 1H), 7.67 (s, 1H), 7.49 (d, J = 6.5 Hz, 4H), 6.99 (d, J = 6.5 Hz, 4H), 5.17 (s, 4H), 3.39 (s, 3H), 3.37 (s, 3H)

LC-Ms: (M+1)⁺ 418.

19. N ² , N ⁴ - di ( benzo [d][1,3]dioxol-5- yl )- N ⁶ -(2,3- dihydro -1H- inden -5- yl )-1,3,5-triazine-2,4,6-triamine(이하 '10 a' )

화합물 9 또는 10의 합성법에 따라서 N-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-4,6-dichloro -1,3,5-triazin-2-amine (568 mg, 2 mmol)를 (552 mg, 4mmol) 과 amine (552mg, 4 mmol)을 차례로 넣는다. 감압 하에서 용매를 제거한 후 Flach column chromatography (30 % EtOAc/Hexane) 방법으로 분리 정제하여 화합물 10a (흰색 고체, 502 mg, 52%)를 얻었다.

LC-Ms: (M+1)⁺ 483.

20. N ² , N ⁴ - bis (2,3- dihydro -1H- inden -5- yl )- N ⁶ -(3,4,5- trimethoxyphenyl )-1,3,5-triazine-2,4,6-triamine (이하 '10 b' )

화합물 9 또는 10의 합성법에 따라서 4,6-dichloro-N-(3,4,5-trimethoxyphenyl) -1,3,5-triazin-2-amine (400 mg, 1.2 mmol)를 K₂CO₃(248mg, 1.8mmol)과 amine(318 mg, 2.4 mmol)을 차례로 넣는다. 감압 하에서 용매를 제거한 후 Flach column chromatography (30 % EtOAc/Hexane) 방법으로 분리 정제하여 화합물 10b (갈색계열 고체, 100mg, 15%)를 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz) δ 8.98 (s, 2H), 7.64-7.62 (m, 2H), 7.46-7.44 (m, 2H), 7.10 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.07-7.05 (m, 2H), 3.67 (s, 9H), 2.80 (t, J = 6.5 Hz, 8H), 2.04-1.98 (m, 4H)

LC-Ms: (M+1)⁺ 525.

21. N ² , N ⁴ , N ⁶ - tris (2,3- dihydro -1H- inden -5- yl )-1,3,5- triazine -2,4,6-triamine(이하 '10 c' )

화합물 9 또는 10의 합성법에 따라서 4,6-dichloro-N-(2,3-dihydro-1H-inden-5-yl)-1,3,5-triazin-2-amine (560 mg, 2 mmol) 를 K₂CO₃(276mg,2mmol)과 amine (293 mg, 2.2 mmol)을 차례로 넣는다. 감압 하에서 용매를 제거한 감압 하에서 용매를 제거한 후 EA를 재결정하여 화합물 10c (흰색고체, 163.8 mg, 17 %)를 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz) δ 9.97 (s, 3H), 7.52 (d, J = 2.5 Hz, 3H), 7.36 (dd, J= 2.5, 8.0 Hz, 3H), 7.17 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 2.83 (t, J = 7.0 Hz, 12H), 2.06-1.99 (m, 6H)

LC-Ms: (M+1)⁺ 475.

22. N ² , N ⁴ , N ⁶ - tri ( benzo [d][1,3]dioxol-5- yl )-1,3,5- triazine -2,4,6-triamine(이하 '10 d' )

화합물 9 또는 10의 합성법에 따라서 N-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-4,6-dichloro -1,3,5-triazin-2-amine (568 mg, 2 mmol) 를 (27.6 g, 2 mmol) 과 amine (631 mg,4.6 mmol)을 차례로 넣는다. 감압 하에서 용매를 제거한 후 Flach column chromatography (30 % EtOAc/Hexane) 방법으로 분리 정제하여 화합물 10d (흰색 고체, 20mg, 2%)를 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz) δ 9.11 (s, 3H), 7.54-7.52 (m, 3H), 7.11-7.09 (m, 3H), 6.82 (d, J = 8.5 Hz, 3H), 5.98 (s, 6H)

LC-Ms: (M+1)⁺ 487.

23. N ² , N ⁴ , N ⁶ - tris (4-( methoxymethoxy ) phenyl )-1,3,5- triazine -2,4,6-triamine(이하 '10 e' )

화합물 9 또는 10의 합성법에 따라서 4,6-dichloro-N-(2,3-dihydro-1H-inden-5-yl) 1,3,5-triazin-2-amine (560 mg, 2 mmol) 를 K₂CO₃(276mg, 2mmol)과 amine (293 mg, 2.2 mmol)을 차례로 넣는다. 감압 하에서 용매를 제거한 감압 하에서 용매를 제거한 후 EA를 재결정하여 화합물 10e(흰색고체, 163.8 mg, 15 %)를 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz) δ 9.43 (s, 3H), 7.58 (d, J = 7.5 Hz, 6H), 6.98 (d, J = 7.5 Hz, 6H), 5.16 (s, 6H), 3.78- 3.70 (bs, 9H)

LC-Ms: (M+1)⁺ 535.

24. N ² , N ⁴ , N ⁶ - tri ( benzo [d][1,3]dioxol-5- yl )-1,3,5- triazine -2,4,6-triamine(이하 '10 f' )

화합물 9 또는 10의 합성법에 따라서 4,6-dichloro-N-(2-methoxyethyl)-1,3,5 -triazin-2-amine (922 mg, 5 mmol) 를 K₂CO₃(1.3g,10mmol)과 amine (751 mg, 10 mmol)을 차례로 넣는다. 감압 하에서 용매를 제거한 후 E.A를 재결정 하여 화합물 10f (갈색계열 고체, 108 mg, 11 %)를 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz) δ 9.11 (s, 3H), 7.54-7.51 (m, 3H), 7.11-7.09 (m, 3H), 6.82 (d, J = 8.5 Hz, 3H), 5.98 (s, 6H)

LC-Ms: (M+1)⁺ 487.

25. N ² , N ⁴ - di ( benzo [d][1,3]dioxol-5- yl )- N6 -(5,6,7,8- tetrahydronaphthalen -2-yl)-1,3,5-triazine-2,4,6-triamine(이하 '10 g' )

화합물 9 또는 10의 합성법에 따라서 4,6-dichloro-N-(5,6,7,8-tetrahydronaphthalen-2-yl)-1,3,5-triazin-2-amine (590 mg, 2 mmol) 를 K2CO3(552 mg, 4mmol)과 amine (552 mg, 4 mmol)을 차례로 넣는다. 감압 하에서 용매를 제거한 후 E.A를 재결정하여 화합물 10g (갈색계열 고체, 278mg, 56 %)를 얻었다.

LC-Ms: (M+1)⁺ 497.

26. N ² -( benzo [d][1,3]dioxol-5- yl )-6- chloro - N ⁴ -(3,4- dimethoxyphenyl )-1,3,5-triazine-2,4-diamine(이하 '10 h' )

화합물 9 또는 10의 합성법에 따라서 4,6-dichloro-N-(3,4-dimethoxyphenyl)-1,3,5-triazin-2-amine(147 mg, 0.49 mmol)를 K₂CO₃(68mg,0.49mmol)과 amine (67 mg, 0.49 mmol)을 차례로 넣는다. 감압 하에서 용매를 제거한 후 Flach column chromatography (30 % EtOAc/Hexane) 방법으로 분리 정제하여 화합물 10h (갈색계열 고체, 15 mg, 6 %)를 얻었다.

¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 10.06 (s, 1H), 9.98 (s, 1H), 7.31-7.19 (m, 3H), 7.05-6.83 (m, 3H), 5.99 (s, 2H), 3.72 (s, 3H), 3.59 (s, 3H)

LC-Ms: (M+1)⁺402.

27. N ₂ , N ₄ - bis (4-( methoxymethoxy ) phenyl )- N6 -(4- methoxyphenyl )-1,3,5- triazine -2,4,6-triamine (이하 '10 i' )

화합물 9 또는 10의 합성법에 따라서 ,6-dichloro-N-(4-methoxyphenyl)-1,3,5- triazin -2- amine (738 mg , 4 mmol ) 를 K₂CO₃ (1.1g, 8 mmol) 과 amine (1 g, 8 mmol)을 차례로 넣는다. 감압 하에서 용매를 제거한 후 Flach column chromatography (30 % EtOAc/Hexane) 방법으로 분리 정제하여 화합물 10i (갈색 고체, 201mg, 10%)를 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz) 9.25 (s, 3H), 7.59-7.56 (m, 4H), 6.96-6.92 (m, 6H), 6.87-6.84 (m, 2H), 5.15 (s, 4H), 3.74 (s, 3H), 3.38 (s, 6H)

LC-Ms: (M+1)⁺ 505.

28. 화합물 11의 합성법

화합물 9 (1 eq)를 무수 DMF에 넣고 K₂CO₃ (2 eq)과 2-mercaptobenzimidazole (1.2 eq)을 차례로 넣었다. 환류반응으로 16시간 반응 시켰다. 반응이 종결되면 얼음물을 첨가하여 H₂O/EtOAc로 추출하였다. 유기층을 증류수와 brine으로 닦고 무수 MgSO₄로 건조시킨 후, 감압 하에서 용매를 제거한 후 MeOH에서 재결정 하거나, Flach column chromatography (20 % Ethyl acetate/n-hexane)방법으로 분리 정제하거나 CH₂Cl₂로 씻어주며 Filtering 해주어 하기 화학식 11(이하 '화합물11')을 얻었다.Aqueous work up 한 후 20% E.A/Hexane (V/V)의 조건에서 column chromatography를 하거나 CH₂Cl₂로 씻어주며 Filtering 해준다.

29. C2 의 합성법

6-클로로-N²,N⁴-비스(3,4-다이메톡시페닐)-1,3,5-트리아진-2,4-다이아민(500 mg, 1.1 mmol)를 무수 DMF에 넣고 K₂CO₃(2 eq)과 2-mercaptobenzimidazole(1.2 eq)을 차례로 넣었다. 환류반응으로 16시간 반응시켰다. 반응이 종결되면 얼음물을 첨가하여 H₂O/EtOAc로 추출하였다. 유기층을 증류수와 brine으로 닦고 무수 MgSO₄로 건조시킨 후, 감압 하에서 용매를제거한 후 Flach column chromatography (20 %Ethyl acetate/n-hexane) 방법으로 분리 정제하여 5-(1에이치-벤조[디]이미다졸-2-일씨오)-N¹,N³-비스(3,4-디메톡시페닐)벤젠-1,3다이아민(C2) 화합물 (흰색 고체, 182 mg, 30 %)를 얻었다.

IR 3212 3077 2934 2833 1735 1604 1568 1495 1418 1370 1340 1227 1199 1148 1077 997 921 836 798 766 743

LC-Ms : (M+1)⁺ 532

mp 125-135℃

30. 6-(1H- benzo [d]imidazol-2- ylthio )- N ² , N ⁴ -di( benzo [d][1,3]dioxol-5-yl)-1,3,5-triazine-2,4-diamine(이하 '11 a' )

화합물 11의 합성법에 따라서 화합물 9c (430 mg, 1.11 mmol)을 K₂CO₃ (306.36 mg, 2.22 mmol) 과 2-mercaptobenzimidazole (195 mg, 1.3 mmol)을 차례로 넣는다. Flach column chromatography (20 % EtOAc/n-Hexane) 방법으로 분리 정제하여 화합물 11a (갈색계열 고체, 182 mg, 33 %)를 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz) δ 13.12 (s, 1H), 9.80 (s, 1H), 9.64 (s, 1H), 7.78-7.54 (m, 3H), 7.30-7.22 (m, 3H), 7.06-6.63 (m, 4H), 5.95 (s, 2H), 5.71 (s, 2H)

LC-Ms: (M+1)⁺ 500.

31. 6-(1H- benzo [d]imidazol-2- ylthio )- N ² , N ⁴ -bis(2,3-dihydrobenzo[b][1,4]dioxin-6-yl)-1,3,5-triazine-2,4-diamine(이하 '11 b' )

화합물 11의 합성법에 따라서 화합물 9h (378 mg, 0.92 mmol)을 264 mg, 1.84 mmol) 과 2-mercaptobenzimidazole (165 mg, 1.1 mmol)을 차례로 넣는다. CH₂Cl₂로 씻어주며 Filtering 하여 정제하여 화합물 11b (갈색계열 고체, 251 mg, 43 %)를 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz) δ 13.19 (s, 1H), 9.73 (s, 1H), 9.57 (s, 1H), 7.60 (s, 2H), 7.38-7.02 (m, 4H), 6.76-6.61 (m, 4H), 4.19-4.16 (m, 4H), 4.06-4.03 (m, 4H)

LC-Ms: (M+1)⁺ 528.

32. 6-(1H- benzo [d]imidazol-2- ylthio )- N ² , N ⁴ - bis (3,4,5- trimethoxyphenyl )-1,3,5-triazine-2,4-diamine(이하 '11 c' )

화합물 11의 합성법에 따라서 화합물 9h (322 mg, 0.67 mmol)을 K₂CO₃(185mg,1.34mmol)과 2-mercaptobenzimidazole (122 mg, 0.81 mmol)을 차례로 넣는다. Flach column chromatography (25 % EtOAc/Hexane - 40 % EtOAc/Hexane) 방법으로 분리 정제하여 화합물 11c (갈색계열 고체, 28 mg, 7 %)를 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz) δ 12.98 (s, 1H), 9.84 (s, 1H), 9.69 (s, 1H), 7.64-7.60 (m, 3H), 7.28-7.25 (m, 3H), 6.93-6.91 (m, 4H), 3.62-3.53 (m, 18H)

LC-Ms: (M+1)⁺ 592.

33. 6-(1H- benzo [d]imidazol-2- ylthio )- N ² , N ⁴ - bis (4- methoxyphenyl )-1,3,5-triazine-2,4-diamine(이하 '11 d' )

화합물 11의 합성법에 따라서 화합물 9l (357.8 mg, 0.97 mmol)을 K₂CO₃(268mg,1.94mmol)과 2-mercaptobenzimidazole (175 mg, 1.17 mmol)을 차례로 넣는다. Flach column chromatography (40 % EtOAc/Hexane) 방법으로 분리 정제하여 화합물 11d (갈색계열 고체, 78 mg, 17 %)를 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz) δ 13.19 (s, 1H), 9.77 (s, 1H), 9.57 (s, 1H), 7.74-7.35 (m, 3H), 7.34-7.32 (m, 3H), 7.00-6.98 (m, 2H), 6.88-6.87 (m, 2H), 5.98-5.97 (m, 2H), 3.73 (s, 3H), 3.52 (s, 3H)

LC-Ms (M+1)⁺ 472.

34. 6-(1H- benzo [d]imidazol-2- ylthio )- N ² , N ⁴ - bis (2- methoxyethyl )-1,3,5-triazine-2,4-diamine(이하 '11 e' )

화합물 11의 합성법에 따라서 화합물 9m (594 mg, 2.27 mmol)을 K₂CO₃(622mg,4.5mmol)과 2-mercaptobenzimidazole (408.5 mg, 2.72 mmol)을 차례로 넣는다. CH₂Cl₂로 씻어주며 Filtering 하여 정제하여 화합물 11e (갈색계열 고체, 127 mg, 15 %)를 얻었다.

LC-Ms: (M+1)⁺376.

35. 6-(1H- benzo [d]imidazol-2- ylthio )- N2 , N4 - diethyl -1,3,5- triazine -2,4-diamine (이하 '11 f' )

화합물 11의 합성법에 따라서 화합물 6-chloro-N2,N4-diethyl-1,3,5-triazine-2,4-diamine (322 mg, 0.67 mmol) 을 K₂CO₃(185 mg, 1.34 mmol) 과 2-mercaptobenzimidazole(122 mg, 0.81 mmol)을 차례로 넣는다. CH₂Cl₂로 씻어주며 Filtering 하여 정제하여 화합물 11e(갈색계열 고체, 28 mg, 7 %)를 얻었다.

¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 7.93 (t, J = 5.0 Hz, 1H), 7.73 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 7.67-7.65 (m, 1H), 7.57-7.56 (m, 1H), 7.23-7.21 (m, 1H), 7.14-7.11 (m, 1H), 3.28-3.18 (m, 4H), 1.10-1.04 (m, 6H)

LC-Ms: (M+1)⁺ 316.

실시예 4. triazine 계 화합물의 합성

1. 4- chloro -2,6- dimethoxypyrimidine (이하 ' 화합물12 -1')

하기 화학식 12(이하 '화합물12') (1g, 5.4 mmol )를 0℃에서 메탄올에 완전히 녹인다. NaOMe (25% in MeOH, 2.3 ml, 54.02 mmol)를 천천히 가하여 준다. 0℃에서 두 시간 동안 반응시켜준 뒤 실온에서 1시간 반응시켜준다. 반응이 종결되면 증류수를 첨가하여 H₂O/EtOAc로 추출하였다. 유기층을 증류수와 brine으로 닦고 무수 MgSO₄로 건조시킨 후, 감압 하에서 용매를 제거하였다. Flach column chromatography (0-10 % dichloromethane/n-hexane) 방법으로 분리 정제하여 화합물 12-1 (흰색 고체, 700 mg, 70%)를 얻었다.

¹H NMR (CD₃OH, 500MHz) : δ 7.76 (s, 1H), 4.91 (s, 6H)

LC-Ms: (M+1)⁺175.

2. 4- chloro -2,6- dimethoxypyrimidine -5- carbaldehyde (이하 ' 화합물13 ')

증류한 THF에 0℃, 아르곤하에 butyllithium용액(1.6 M in hexane, 3 ml, 4.8 mmol)을 천천히 가한다. 5ml의 THF에 녹인 화합물 12-1 (4.0 mmoles, 650 mg)를 가하여주고, 한 시간 반 동안 at -70℃ 교반하였다. ethyl formate(0.31 ml, 3.8 mmol)를 가하여 주고, -70℃에서 1시간 동안 더 반응하였다. -70℃에서 35%의 HCl(2 ml), ethanol(2 ml) tetrahydrofuran (8 ml)를 사용하여 가수분해 시켜준다. 반응이 종결되면 온도를 실온까지 올려준 뒤, hydrogenocarbonate용액 10ml를 이용해 약한 염기를 만들어준다. 거의 건조될 때까지 감압 하에 용매를 제거해준다. Dichloromethane를 첨가하여 H₂O/DMC로 반응물을 추출하였다. 유기층을 증류수와 brine으로 닦고 무수 MgSO₄로 건조시킨 후, 감압 하에서 용매를 제거하였다. Flach column chromatography (20-30 % dichloromethane/n-hexane)방법으로 분리 정제하여 화합물 13 (흰색 고체, 665 mg, 86 %)를 얻었다.

¹H NMR (DMSO, 500MHz): δ 10.51 (s, 1H), 4.05 (s, 3H), 4.01 (s, 3H)

LC-Ms: (M+1)⁺203.

3. 4,6- dimethoxy -1H-pyrazolo[3,4-d] pyrimidine (이하 ' 화합물13 -1')

화합물 13 (1.5 mmol, 300 mg )를 에탄올에 녹인 뒤 10분간 교반하였다. hydrazine monohydrate (4.5 mmol, 225mg)를 천천히 넣어주고 30분 동안 환류반응 시켜주었다. 반응이 종결되면 실온까지 식히고, 침전물을 필터링해주고, 에탄올에서 재결정 해준다. 고체는 증류수로 닦아준 다음 필터링 해주었다. 화합물 13-1 (흰색 고체, 210mg, 77%)를 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 500MHz) δ 8.0 (s, 1H), 4.04 (s, 3H), 3.93 (s, 3H)

LC-Ms: (M+1)⁺181.

4. 4,6- dimethoxy -1- methyl -1H-pyrazolo[3,4-d] pyrimidine (이하 ' 화합물14 ')

화합물 13-1 (55 mmoles, 10 g)를 30ml DMF에 녹여준 뒤 0℃ 건조한 DMF에 NaH(60% dispersion in mineral oil, 3.3 g, 82.5 mmol)를 넣어주고 30분 동안 교반한 용기에 천천히 가해준다. 1시간 반 동안 실온에서 반응시켜준다. methyl iodoide (4.1 ml, 9.3 mmol)를 가한 뒤 4시간 동안 더 반응시켜준다. 반응이 종결되면 얼음물을 첨가하여 H₂O/EtOAc로 추출하였다. 유기층을 증류수와 brine으로 닦고 무수 MgSO₄로 건조시킨 후, 감압 하에서 용매를 제거하였다. Flach column chromatography (0-10 % Ethyl acetate/n-hexane)방법으로 분리 정제하여 화합물 14 (흰색 고체, 8 g, 75 %)를 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 500MHz) δ 8.1 (s, 1H), 4.05 (s, 3H), 3.97 (s, 3H), 3.90 (s, 3H)

LC-Ms: (M+1)⁺195.

5. 1- methyl -1H- pyrazolo [3,4-d]pyrimidine-4,6(5H,7H)-dione(이하 ' 화합물14 -1')

화합물 14 (500 mg, 2.5 mmol)를 c.HCl (30 ml)에 한시간동안 환류반응 시켜준다. 반응이 종결된 후 감압 하에서 용매를 제거하였다. 1M NaOH 용액을 이용하여 약한 염기를 만들어주고 감압 하에 건조시킨 뒤 화합물 14-1 (흰색 고체, 400 mg, 96 %)를 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 500MHz) δ 8.99 (s, 1H), 7.41 (s, 1H), 3.51 (s, 3H), 1.61 (s, 1H)

LC-Ms: (M+1)⁺167.

6. 4,6- dichloro -1- methyl -1H-pyrazolo[3,4-d] pyrimidine (이하 ' 화합물15 ')

화합물 14-1 (300 mg, 1.8 mmol)를 phosphorus oxychloride (826 mg, 5.4 mmoles) 녹인 뒤 phosphorus pentachloride (680 mg, 3.3 mmol)를 반응용기에 넣고 18시간 동안 가열하여 환류반응 하였다. 감압 하에서 phosphorus oxychloride를 제거하고, 얼음을 넣어주었다. Dichloromethane를 첨가하여 H₂O/DMC로 반응물을 추출하였다. 유기층을 증류수와 brine으로 닦고 무수 MgSO₄로 건조시킨 후, 감압 하에서 용매를 제거하였다. Flach column chromatography (20-30 % Ethyl acetate/n-hexane)방법으로 분리 정제하여 화합물 15 (흰색 고체, 200 mg, 55 %)를 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 500MHz) δ 8.55 (s, 1H), 4.04 (s, 3H)

LC-Ms: (M)⁺ 203.

7. 6- chloro -N-(4- chlorophenyl )-1- methyl -1H- pyrazolo [3,4-d]pyrimidin-4-amine(이하 ' 화합물16 ')

화합물 15 (1.5 g, 7.3 mmol)을 에탄올에 완전히 녹인 뒤 triethylamine (1.5 g, 11 mmol)를 천천히 가한 뒤 4-Chloroaniline (926 mg, 8.1 mmol)를 넣어주어 실온에서 2시간 동안 반응시켜주었다. 반응 종결한 뒤, 용매를 감압 하에서 제거해준다. Ethyl acetate 를 첨가하여 H₂O/EtOAc 로 반응물을 추출하였다. 유기층을 증류수와 brine으로 닦고 무수 MgSO₄로 건조시킨 후, 감압 하에서 용매를 제거하였다. Flach column chromatography (20-30 % dichloromethane/n-hexane)방법으로 분리 정제하여 화합물 16 (흰색 고체, 665mg, 86 %)를 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 500MHz) δ 10.57 (s, 1H), 8.26 (s, 1H), 7.80 (d, J = 8 Hz, 2H), 7.50 (d, J = 8.0 Hz, 2H ), 3.91 (s, 3H)

¹³C NMR (DMSO, 125 MHz) δ 157.2, 155.4, 154.5, 137.9, 132.7, 129.5, 128.6, 123.3, 100.7, 55.0, 34.5, 34.0

LC-Ms: (M)⁺ 294

mp 223-225 ℃.

8. 화합물 17의 합성법

화합물 16 (100 mg, 0.3 mmoles) THF완전히 녹인 용기에 아닐린(0.45 mmol)를 넣고 교반 시켜주었다. 환류반응으로 18시간 동안 반응 하였다. 반응이 종결되면 증류수를 첨가하여 H₂O/EtOAc로 추출하였다. 유기층을 증류수와 brine으로 닦고 무수 MgSO₄로 건조시킨 후, 감압 하에서 용매를 제거하였다. Flach column chromatography (30-60 % Ethyl acetate /n-hexane)방법으로 분리 정제하여 하기 화학식 13(이하 '화합물17')을 60-70 % 의 수득률로 얻었다.

9. N ⁴ -(4- chlorophenyl )- N ⁶ -(2- methoxyethyl )-1- methyl -1H- pyrazolo [3,4-d]pyrimidine-4,6-diamine(이하 '17 a' )

화합물 17의 합성법에 따라서 17a (흰색 고체, 75 mg, 75%)를 얻었다.

¹H NMR (DMSO, 500 MHz) δ 9.67 (s, 1H), 8.00 (s, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.37 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 6.99 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 3.74 (s, 3H), 3.50 (s, 3H), 3.35 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 3.27 (t, J = 7.0 Hz, 2H)

LC-Ms: (M+1)⁺ 333

mp 145-148 ℃.

10. N ⁶ - butyl - N ⁴ -(4- chlorophenyl )-1- methyl -1H- pyrazolo [3,4-d]pyrimidine-4,6-diamine(이하 '17 b' )

6-클로로-N-(4-클로로페닐)-1-메틸-4,5,6,7-테트라하이드로-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4-아민(100mg,0.3mmoles)를 THF에 완전히 녹인 후 부틸아민(0.45 mmoles)을 넣고 교반 시켜주었다. 환류반응으로 18시간 동안 반응시켰다. 반응 종결 후 증류수를 첨가하여 H₂O/EtOAc로 추출하였다. 유기층을 증류수와 brine으로 닦고 무수 MgSO₄로 건조시킨 후, 감압 하에서 용매를 제거하였다. Flash column chromatography (30-60 % Ethyl acetate/hexane)방법으로 분리 정제하여 N⁶-부틸-N⁴-(4-클로로페닐)-1-메틸-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4,6-다이아민(흰색고체, 75 mg, 75%)를 얻었다.

¹H NMR (DMSO, 500 MHz): δ 9.64 (s, 1H), 7.99 (s, 2H), 7.37 (d, J = 8.0 Hz , 2H), 7.00 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 3.73 (s, 3H), 3.30 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 1.54 (m, 2H), 1.16 (m, 2H), 0.90 (t, J = 7.0 Hz, 3H)

LC-Ms: (M+1)⁺ 303

mp 110-113 ℃.

11. N ⁴ -(4- chlorophenyl )- N ⁶ - ethyl -1- methyl -1H- pyrazolo [3,4-d]pyrimidine-4,6-diamine(이하 '17 c' )

화합물 17의 합성법에 따라서 17c (흰색 고체, 50 mg, 66 %)를 얻었다.

¹H NMR (DMSO, 500 MHz) δ 9.64 (s, 1H), 7.99 (s, 2H), 7.37 (d, J = 8 Hz, 2H), 7.00 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 3.74 (s, 3H), 3.35 (m, 2H), 1.16 (t, J = 7 Hz, 3H)

LC-Ms: (M+1)⁺ 303

mp 148-153 ℃.

12. 화합물 18의 합성법

화합물 16 (100 mg, 0.3 mmol)를 dioxane 녹인 후 아닐린 (0.45 mmol), K₃PO₄ (96 mg, 0.45 mmol), BINAP (10 mg, 10 %w/w), Pd₂(dba)₃ (10 mg, 10 %w/w)를 넣어준다. 환류반응을 18시간 동안 반응시켰다. 반응이 종결되면 증류수를 첨가하여 H₂O/EtOAc로 추출하였다. 유기층을 증류수와 brine으로 닦고 무수 MgSO₄로 건조시킨 후, 감압 하에서 용매를 제거하였다. Flach column chromatography (30-60 % Ethyl acetate/n-hexane)방법으로 분리 정제하여 하기 화학식 14(이하 '화합물18')을 40-50 % 의 수득률로 얻었다.

13. N ⁴ -(4- chlorophenyl )- N ⁶ -(2,5- dimethoxyphenyl )-1- methyl -1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidine-4,6-diamine(이하 ' D2' )

2,5-다이메톡시벤젠아민(70 mg, 0.45 mmoles), K₃PO₄(96 mg, 0.45 mmoles), BINAP(10 mg, 10 w/w%), Pd₂(dba)₃(10 mg, 10 w/w%)를 다이옥세인에 녹인 6- 클로로-N-(4-클로로페닐)-1-메틸-4,5,6,7-테트라하이드로-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4-아민(100mg, 0.3mmoles)에 첨가하였다. 환류반응을 18시간 동안 반응시킨 후, 반응이 종결 후 증류수를 첨가하여 H₂O/EtOAc로 추출하였다. 유기층을 증류수와 brine으로 닦고 무수 MgSO₄로 건조시킨 후, 감압 하에서 용매를 제거하였다. Flash column chromatography (30-60 % Ethyl acetate/hexane) 방법으로 분리 정제하여 N⁴-(4-클로로페놀)-N⁶-(2,5-다이메톡시페닐)-1-메틸-4,5,6,7-테트라하이드로-1H-피라졸[3,4-d]피리미딘-4,6-다이아민(흰색고체, 50mg, 40%)를 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 500MHz): δ 9.85 (s, 1H), 8.08 (s, 1H), 7.84 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.82 (s, 1H), 7.39 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.94 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 6.55 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 3.85 (s, 3H), 3.82 (s, 3H), 3.67 (s, 3H)

¹³C NMR (DMSO, 125 MHz) δ 158.5, 155.4, 154.8, 153.9, 143.5, 138.9, 132.3, 130.3, 129.2, 127.4, 123.3, 111.8, 107.5, 106.7, 97.7, 56.9, 55.9, 33.9

LC-Ms: (M+1)⁺411

mp 180-184 ℃.

14. N ⁴ -(4- chlorophenyl )- N ⁶ -(3,5- dimethoxyphenyl )-1- methyl -1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidine-4,6-diamine(이하 '18 a' )

화합물 18의 합성법에 따라서 18a (흰색 고체, 50 mg, 40%)를 얻었다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 500MHz) δ 9.81 (s, 1H), 8.04 (s, 1H), 7.95 (s, 1H), 7.81 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 729 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 6.67 (s, 1H), 6.55 (s, 2H), 3.79 (s, 6H)

LC-Ms: (M+1)⁺411

mp 128-131 ℃.

실시예 5. PCR - stop assay / Native PAGE( 폴리아크릴아미드겔전기영동 )

PCR-stop assay를 위한 올리고뉴클레오티드는 Bionics 또는 Bioneer(Seoul, Korea)로부터 합성되었으며, 20% 변성된(denature)된 PAGE(6M Urea)로 정제하였다. 실험에 사용되는 올리고뉴클레오티드의 염기서열은 하기의 표1에 나타내었다.

SPECS 및 Chemdiv로 부터 얻어진 리간드들을 DMSO에 용해시켰다. Taq polymerase 및 dNTP 혼합물은 Koma Biotech(Korea)으로부터 구입하였다.

promoter		Sequences of forward strand	서열번호	Sequences of reverse strand	서열번호
c-Myc	Pu26WT	5′-TGGGGAGGGTGGGGAGG GTGGGGAAG-3	서열번호 1	5′-ATCGCTTCTCGTCTTCCC CA-3′	서열번호 6
c-Myc	Pu26-1245	5′-TGGGGAGGGTGAGGAGGG TGGGGAAG-3′	서열번호 2	5′-ATCGCTTCTCGTCTTCCC CA-3′	서열번호 6
Bcl2		5′-AGGGGCGGGCGCGGGAGG AAGGGGGCGGGAGCGGGGCTG-3′	서열번호 3	5′-ATCGCTTCTCGTCAGCCC CG-3′	서열번호 7
HIF-1		5′-GCGGGGAGGGGAGAGGGG GCGGGAGC-3′	서열번호 4	5′-ATCGCTTCTCGTGCTCCC GC-3′	서열번호 8
VEGF		5′-TAGGGGCGGGCCGGGGGC GGGGAGC-3′	서열번호 5	5′-ATCGCTTCTCGTGCTCCCCG-3′	서열번호 9

실험적 원리 및 방법은 도 1에 나타내었다. PCR은 0.2μM의 올리고뉴클레오티드에 각각 10 mM Tris-HCl (pH 7.6), 50 mM KCl, 1.5 mM Mg(OAc)₂를 포함하는 반응버퍼가 사용되었다. PCR 사이클의 첫번째 변성은 94℃에서 2분간, 후에 30사이클은 94 ℃에서 30초, 58 ℃에서 30초, 72 ℃에서 30초간 이루어졌다. PCR 결과물은 15 % native-PAGE (1X TBE)로 정제하고 SYBR Green I (Roche)으로 염색하였다. PCR 결과물의 형광강도는 FLA-2000을 사용하여 알았고, Multigauge software (Fujifilm)을 이용하여 분석하였다.

c-myc 프로모터의 G-quadruplex와는 다른 형태의 G-quadruplex를 형성하는 Bcl2, HIF-1α, VEGF 유전자의 프로모터에 존재하는 시퀀스를 포함하는 올리고머를 template로 사용하여 PCR 수행한 후 PAGE 분석으로 (도 2) 각 리간드 존재하에 PCR 생산량을 정량함으로써 PCR 억제효과에 대한 IC₅₀값을 비교한 결과 세 화합물들은 모두 c-myc 프로모터의 G-quadruplex에 선택적으로 결합하여 안정화시킴으로써 DNA 중합을 억제하는 효과를 보였다(표2).

화합물명	Pu26WT (μM)	Pu26-1245 (μM)	Selectivity (Pu26-1245/Pu26WT)	Bcl-2	VEGF	HIF-1α
B5	14.0 ±2.01	63.18 ± 3.18	4.51	>90	>90	>100
C2	12.3 ±1.56	> 200	> 16.26	>100	>100	>100
D2	53.0 ±1.0	> 200	> 3.77	>100	>100	>100

실시예 6. Cytotoxicity Assay

리간드들의 세포독성실험을 위하여, Ramos 및 CA46 세포들을 각각 다른 농도의 리간드들을 처리하였다. Ramos 세포는 Korean Cell line bank (KCLB, #21596)에서 얻었으며, CA46세포는 ATCC (#CRL 1648)에서 얻었다. 두 세포 모두 10% FBS 및 1% penicillin/streptomycin를 함유한 RPMI-1640에서 배양하였다. 48시간 리간드로 처리 후, 세포증식은 MTS reagent(Promega, #G3580)을 이용하여 측정하였다. 대조군으로 DMSO를 같은 양으로 처리하였다.

MTS assay를 수행하여 각 화합물의 Ramos 세포주에 대한 독성과 CA46 세포주에 대한 독성 비교시 세포증식에 영향을 주는 c-myc에 발현이 프로모터의 G-quadruplex 형성에 영향을 받는 Ramos 세포에 상대적으로 독성이 강함을 확인하였다 (표3). Real-time PCR을 수행하여 각 화합물 존재하에 c-myc mRNA 발현량 비교에서는 상기 화합물들은 모두 Ramos 세포주에서 선택적으로 c-myc mRNA 발현을 억제함을 확인하였다 (도 3). 이 결과는 세 화합물들의 Ramos 세포증식 억제효과는 c-myc 프로모터의 G-quadruplex와의 결합에 의한 c-myc 발현억제와 연관되어 있음을 보여준다.

화합물명	Ramos IC ₅₀ (μM)	CA46 IC ₅₀ (M)(uM)	Selectivity ( CA46 / Ramos )
B5	11.3±0.3	21.8±1.75	1.92
C2	1.35±0.15	>100	>74
D2	11.7±0.33	17.8±0.89	1.52

실시예 7. Real - Time PCR

Easy-Blue RNA extraction kits (Intron Biotechnology)를 사용하여 48시간 또는 72시간 리간드들로 처리와 함께 12-well plate에서 배양한 Ramos 및 CA46으로부터 총 RNA를 분리하였다. 총 RNA의 농도는 260 nm의 분광광도법으로 결정하였고 , cDNA 합성은 Maxime RT PreMix kits (Intron Biotechnology)을 이용하여 수행하였다.

Real-time PCR은 SYBR Green I (Kapa SYBR FAST qPCR Kit)를 포함한 Master Mixture 및 Line - gene K Real-Time PCR detection system (Bioer Technology)을 이용하여 수행하였다. PCR은 첫 변성온도는 95℃에서 3분간, 후에 40사이클은 95 ℃ 에서 15초 및 60 ℃에서 45초로 수행되었다. 녹는 곡선은 0.5℃ 단위 및 30초의 배양시간으로 얻었다.

실험에서는 하기 표 4의 프라이머가 사용되었다.

c-myc	forward	5′-TCAAGAGGCGAACACACAAC-3′	서열번호10
c-myc	reverse	5′-GGCCTTTTCATTGTTTTCCA-3′	서열번호11
β-actin	forward	5′-GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3′	서열번호12
β-actin	reverse	5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′	서열번호13

실시예 8. Promoter assay

pGL3의 3가지 구조체가 사용되었다. pGL3-Pu27은 반딧불 루시퍼라아제 유전자의 c-myc 상류의 야생형 NHEⅢ₁을 가지고 있으며. pGL3-Pu27Mut은 이 부분에 점돌연변이 된 것이다. HeLa 세포(4 ⅹ 10⁴)는 24시간동안 10 % FBS(fetal bovine serum) 및 1% penicillin/streptomycin (Hyclone)을 포함하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)에서 예비배양하였다. 제조자의 설명에 따라 WelFect transfection kits (Welgene)을 사용하여, 세포들을 pGL3 구조체 0.5μg을 사용하여 감염시켰다. 감염효율의 정규화를 위해, pRL-TK 25 ng을 같이 감염시켰다. 리간드들을 48시간 처리하였고, PBS 버퍼하에 긁어서 세포를 얻었다. passive lysis buffer(Promega)에 의해 분해 한 후, 세포용해물의 상청액은 FB12 luminometer (Berthold detection system)을 이용하는 dual-luciferase assays (Promega) 수행에 사용되었다.

pGL3 벡터에 c-myc NHE Ⅲ₁ 프로모터내에 wild-type c-myc G-quadruplex 시퀀스(Pu27) 및 single-base mutant (Pu27Mut)를 포함하는 시퀀스를(도 4) 각각 끼워 넣은 firefly루시퍼라제 리포터 construct를 transfection시킨 HeLa 세포주에 화합물들을 처리 후 루시퍼라제 발현량을 측정하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, 모든 화합물들이 선택적으로 wild-type Pu27를 포함하는 construct에서 루시퍼라제 발현을 저해함을 확인하였다(Promoter assay).

실시예 9. B5와 유도체들의 합성 및 PCR assay 결과

B5계열 화합물6의 합성경로는 도 6에 나타내었다. 주요 중간체가 되는 화합물 3은 시중에서 구입할 수 있는 출발물질을 사용하여 합성하였다. 출발 물질인 화합물 1을 사용하여 페놀릭 OH기를 선택적으로 보호 시켜주어 화합물 3을 만들어주었다. 대량 합성한 화합물 3을 다양한 치환기를 가지는 알리파틱 화합물이나 아닐린 화합물을 아미데이션 반응시켜주어 화합물 4를 합성하였다. 그런 다음 환원반응과 benzoquinone를 이용한 산화적 고리화 반응을 차례로 반응시켜 최종 화합물 6을 얻을 수 있었다.

화합물 데이터베이스에 대해 가상검색을 통해 선별한 B5를 토대로 제일 처음 6a-6e 화합물을 디자인과 합성하였다. core 부분인 Phenoxazone의 형태를 유지하고, 아마이드 부분을 다양항 알리파틱을 도입하였다.

도 7은 B5와 유도체들의 PCR-assay결과를 나타낸 것이다

도 7에 나타난 바와 같이, 처음 합성한 화합물들의 bio assay의 결과를 토대로 아마이드에 벤질 아민기를 도입한 화합물 6c을 토대로 6f-6j 화합물과 같은 벤질 부분의 para나 ortho에 eletron withdrawing 그룹가지는 벤질 아민기를 도입하여 bio assay를 결과 B5 보다 8배 이상 좋은 화합물 6h를 찾을 수 있었다. 두 번째 결과를 토대로 벤질기에 같은 eletron withdrawing 그룹 가지는 아닐린를 도입하여 비교해 보기로 했다. 그 결과 벤질 아민기를 도입한 6f, 아닐린의 6m과 같은 경우 비교하였을 때 아닐린이 더 좋은 assay를 결과를 얻을 수 있었고, 화합물 6h, 화합물 6o를 비교하였을 때 벤질 아민기에 eletron withdrawing 그룹 가지는 화합물 6o에서 더 좋을 결과 값을 얻을 수 있어 이후에 합성을 할땐 같은 치환기 그룹을 가지는 벤질 아민과 아닐린 그룹을 각각 도입하였다. 6r, 6s와 같은 eletron donating 그룹를 가지는 벤질 아민과 아닐린 그룹도 도입해 보았으나 좋은 결과 값을 얻지 못하였다.

실시예 10. C2 와 유도체들의 합성 및 PCR assay 결과

Cyanuric chloride(화합물7)를 출발물질을 사용하여 합성하였다 (도 8). 화합물 9, 10은 하나의 클로라이드가 다른 치환기를 가지는 화합물 8 형태에서 반응 하여 얻을 수 있었는데 화합물 8은 0 ℃에서 한 시간 반응 시킨 다음 다른 정제 과정 없이 다음 반응을 시켜주었다. 실온에서 K₂CO₃를 염기로 사용하여 반응 시켜주어두, 세 개가 치환된 형태의 화합물 9, 10은 Flach column chromatography를 이용하여 얻을 수 있었다. 화합물 8 을 이용하여 K₂CO₃를 염기로, DMF를 용매로 사용하여 C2화합물과 같은 benzothiolimdazole이 첨가된 화합물 11을 얻을 수 있었다.

화합물 데이터베이스에 대해 가상검색을 통해 선별한 C2를 토대로 core 부분인 triazine부분의 형태는 유지하고 클로라이드 2개가 아민으로 치환된 화합물 9의 형태를 제일 처음 합성하였다. C2는 클로라이드 3개가 아민과 thio그룹의 형태로 이루워져 있지만, triazine "12469"(도 9)와 비슷한 형태로써 2개의 아민그룹을 가지는 형태의 화합물을 합성하였다. 앞선 B5계열의 유도체와 비슷한 형태의 eletron withdraqing 그룹을 가지는 아닐린 계열의 화합물을 도입하여 보았고(9a-9c), 화합물 9e 같은 eletron donating 그룹을 각각 도입해 보았다.

도 10은 C2 유도체들(9-type)의 PCR-assay결과를 나타낸 것이다(물결선을 함유하는 결합은 부착 지점을 의미한다).

도 11은 C2 유도체들(11-type)의 PCR-assay결과를 나타낸 것이다(물결선을 함유하는 결합은 부착 지점을 의미한다).

도 12은 C2 유도체들(10-type)의 PCR-assay결과를 나타낸 것이다(물결선을 함유하는 결합은 부착 지점을 의미한다).

도 10, 도 11, 도 12에 나타난 바와 같이, bio assay 결과 화합물 9f, 9q para에 eletron withdrawing 그룹를 가지는 화합물이 C2 화합물보다 좋을 결과를 나타내었고, 알리파틱 아민을 도입하였을 땐 좋은 결과 값을 얻지 못하였다. C2의 가장 유사한 형태인 화합물 11 계열에서도 주로 벤질에 eletron withdrawing 그룹을 도입하였고, 벤질에 eletron donating 그룹를 가지는 화합물과 알리파틱 아민도 비교 도입하여 보았다. eletron withdrawing 그룹를 가지는 화합물(11-c)이 hit 화합물보다 좋을 결과를 나타었고, 알리파틱 아민을 도입하였을 땐 좋은 결과 값을 얻지 못하였다. 화합물 10 계열에서도 화합물 9계열과 비슷한 아민계열을 도입 하였으나 앞선 화합물 9, 11보다 더 좋은 bio-assay 결과는 얻지 못하였다.

화합물 11 계열에서도 화합물 9계열의 화합물에 thiol 그룹을 도입하였을 때 앞선 결과 보다 더 좋은 결과 값을 기대했지만 11c와 9h, 11d와 9f결과 값이 상이하여 더 좋은 화합물을 얻을 수 있었다고 생각하지 못하였고, 오히려 치환되지 않은 클로라이드가 G-quadruplexd와 수소결합에 참여하여 도움을 준다는 사실을 알 수 있었다.

실시예11 . D2 와 유도체들의 합성 및 PCR assay 결과

화합물 D2는 코어부분의 purine의 형태를 유지하며, 유도체를 디자인, 합성하였다(도13). 화합물 11을 이용하여 두 개의 Cl에 메톡시 그룹을 도입하고 -78 ℃에서 포밀레이션을 해주어 화합물 12를 생성시켰다. 화합물 13을 만들기 위해 화합물 12에 Hydrazine을 이용하여 환류 시킨 다음, 물로 씻어주어 Hydrazine을 제거한 다음 필터링을 통해 고리화합물을 만들고, 염기 NaH, 메틸아이오다이드를 이용하여 메틸레이션을 하여 컬럼크로파토그래피를 이용해 화합물 13을 정제하였다. c.HCl를 이용하여 metyl를 떼어주는 반응을 시켰다. 이때 화합물이 물층에 녹아있어 물의 증발을 통해 얻을 수 있었다. 그런 다음 POCl₃ 3당량, PCl₅ 5당량을 넣어준 다음 환류시켜 주어 주요중간체인 화합물 14를 얻었다. 각각의 아민이나 아닐린을 도입하였다. R₁기를 도입할 땐 r.t에서 반응 시켜 주고, R₂를 도입할 땐 아민을 첨가 반응 시킬 때엔 염기 K₂CO₃, 용매 THF를 이용하여 얻을수 있었다. 반면 아닐린을 첨가 시킬 때엔 Pd₂(dba)₃를 촉매로 사용하여 Buchwald-Hartwig 반응을 시켜주어 얻을 수 있었다.

처음 화합물을 합성하였을 때 화합물인 D2를 타겟으로 합성을 진행하였으나 아닐린 계열을 치환하는 화합물에서 염기 K₂CO₃, 용매 THF를 이용하여 진행이 되질 않아 Buchwald-Hartwig 반응을 하여 D2 및 17d를 얻을 수 있었다.

도 14은 D2와 유도체의 PCR-assay결과를 나타낸 것이다(물결선을 함유하는 결합은 부착 지점을 의미한다).

도 14에 나타난 바와 같이, 화합물에서는 D2화합물과 비슷한 결과를 얻었고, 이전 화합물들과는 달리 알리파틱 화합물에서 좋은 화합물을 얻을 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예는 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

<110> SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY Foundation for Corporate Collaboration <120> New G-quadruplex DNA Binders, process for preparation thereof and the use of the same <130> PB12-10495 <160> 13 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> c-Myc(Pu26WT) promoter Sequences of forward strand <400> 1 tggggagggt ggggagggtg gggaag 26 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> c-Myc(Pu26-1245) promoter Sequences of forward strand <400> 2 tggggagggt gaggagggtg gggaag 26 <210> 3 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bcl2 promoter Sequences of forward strand <400> 3 aggggcgggc gcgggaggaa gggggcggga gcggggctg 39 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HIF-1 promoter Sequences of forward strand <400> 4 gcggggaggg gagagggggc gggagc 26 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGF promoter Sequences of forward strand <400> 5 taggggcggg ccgggggcgg ggagc 25 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> c-Myc(Pu26WT) promoter Sequences of reverse strand <400> 6 atcgcttctc gtcttcccca 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bcl2 promoter Sequences of reverse strand <400> 7 atcgcttctc gtcagccccg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HIF-1 promoter Sequences of reverse strand <400> 8 atcgcttctc gtgctcccgc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGF promoter Sequences of reverse strand <400> 9 atcgcttctc gtgctccccg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> c-myc promoter Sequences of forward strand <400> 10 tcaagaggcg aacacacaac 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> c-myc promoter Sequences of reverse strand <400> 11 ggccttttca ttgttttcca 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B-actin promoter Sequences of forward strand <400> 12 ggacttcgag caagagatgg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B-actin promoter Sequences of reverse strand <400> 13 agcactgtgt tggcgtacag 20

Claims

하기 화학식 6의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
[화학식 6]

상기 식에서, R은
,
,
,
,
,
또는
를 나타내고; 물결선에 의해 양분되는 결합은 부착 지점을 의미함.
하기 단계를 포함하는 2-아미노-N¹,N⁹-다이부틸-3-옥소-3에이치-페녹사진-1,9-다이카복사마이드(B5)의 제조방법:
1) 2-아미노-N-부틸-3-하이드록시사이클로헥사-1,4-다이엔카복사마이드를 알코올에 녹인 후 벤조퀴논과 반응시키는 단계; 및
2) 상기 1)단계 후, 반응 결과물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(flash column chromatography)방법으로 분리 정제하는 단계.
하기 단계를 포함하는 2-아미노-N¹,N⁹-비스(4-메톡시벤질)-3-옥소-3에이치-페녹사진-1,9-다이카복사마이드(6h)의 제조방법:
1) 2-아미노-3-하이드록시-N-(4-메톡시페닐) 벤즈아마이드를 알코올에 녹인 후 벤조퀴논과 반응시키는 단계; 및
2) 상기 1)단계 후, 반응 침전물을 에틸아세테이트로 씻어주어 필터링 하는 단계.
하기 단계를 포함하는 2-아미노-N¹,N⁹-비스(피리딘-2-일메틸)-3에이치-페녹사진-1,9-다이카복사마이드(6l)의 제조방법:
1) 2-아미노-3-N-피리딘-2-일메틸 벤즈아미이드를 알코올에 녹인 후 벤조퀴논과 반응시키는 단계; 및
2) 상기 1)단계 후, 반응 침전물을 에틸아세테이트로 씻어주어 필터링 하는 단계.
하기 단계를 포함하는 2-아미노-N¹,N⁹-다이(벤조[d][1,3]다이옥솔-5-일)-3-옥소-3에이치-페녹사진-1,9-다이카복사마이드(6p)의 제조방법:
1) 2-아미노-N-(벤조[d][1,3]다이옥솔-5-일)-3-하이드록시벤즈아마이드를 알코올에 녹인 후 벤조퀴논과 반응시키는 단계; 및
2) 상기 1)단계 후, 반응 침전물을 에틸아세테이트로 씻어주어 필터링 하는 단계.
하기 단계를 포함하는 2-아미노-N¹,N⁹-비스(4-(다이메틸아미노)페닐)-3-옥소-3에이치-페녹사진-1,9-다이카복사마이드(6t)의 제조방법:
1) 2-아미노-N-(4-(다이메틸아미노)페닐)-3-하이드록시벤즈아마이드를 알코올에 녹인 후 벤조퀴논과 반응시키는 단계; 및
2) 상기 1)단계 후, 반응 침전물을 에틸아세테이트로 씻어주어 필터링 하는 단계.
하기 단계를 포함하는 2-아미노-3-옥소-N¹,N⁹-비스(3,4,5-트리메톡시페닐)-3에이치-페녹사진-1,9-다이카복사마이드(6o)의 제조방법:
1) 2-아미노-3-하이드록시-N-(3,4,5-트리메톡시페닐) 벤즈아마이드를 알코올에 녹인 후 벤조퀴논과 반응시키는 단계; 및
2) 상기 1)단계 후, 반응 침전물을 에틸아세테이트로 씻어주어 필터링 하는 단계.
하기 단계를 포함하는 2-아미노-N¹,N⁹-비스(4-(다이메틸아미노)벤질)-3-옥소-3에이치-페녹사진-1,9-다이카복사마이드(6u)의 제조방법:
1) 2-아미노-N-(4-(다이메틸아미노)벤질)-3-하이드록시벤즈아마이드를 알코올에 녹인 후 벤조퀴논과 반응시키는 단계; 및
2) 상기 1)단계 후, 반응 침전물을 에틸아세테이트로 씻어주어 필터링 하는 단계.
하기 화학식 11을 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
[화학식 11]

상기 식에서, R은
또는
를 나타내고; 물결선에 의해 양분되는 결합은 부착 지점을 의미함.
하기 단계를 포함하는 6-(1에이치-벤조[d]이미다졸-2-일씨오)-N²,N⁴-비스(2,3-다이하이드로벤조[b][1,4]다이옥신-6-일)-1,3,5-트리아진-2,4-다이아민(11c)의 제조방법:
1) 6-클로로-N²,N⁴-비스(3,4,5-트리메톡시페닐)-1,3,5-트리아진-2,4-다이아민과 2-머갑토벤즈이미다졸을 반응시키는 단계; 및
2) 상기 1)단계 후, 반응 결과물을 다이클로로메탄에 씻어주어 필터링 하는 단계.
하기 단계를 포함하는 5-(1에이치-벤조[디]이미다졸-2-일씨오)-N¹,N³-비스(3,4-디메톡시페닐)벤젠-1,3다이아민(C2)의 제조방법:
1) 6-클로로-N², N⁴-비스(3,4-다이메톡시페닐)-1,3,5-트리아진-2,4-다이아민을 무수 DMF(dimethylformamide)에 넣은 후, 탄산칼륨를 넣고, 2-머갑토벤즈이미다졸을 넣어 반응시키는 단계; 및
2) 상기 1)단계 반응 후, 반응 결과물에 증류수를 첨가하여 물 및 에틸아세테이트로 추출하는 단계; 및
3) 상기 2)단계의 에틸아세테이트을 증류수 및 브라인(brine)으로 닦은 후, 황산마그네슘으로 건조 후, 감압하에 용매를 제거하여 플래시 컬럼 크로마토그래피(flash column chromatography)로 분리 정제하는 단계.
하기 화학식 9의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
[화학식 9]

상기 식에서, R1은
및 R2은
, 또는 R1은
및 R2은
인 것을 나타내고; 물결선에 의해 양분되는 결합은 부착 지점을 의미함.
하기 단계를 포함하는 6-클로로-N²-(4-(메톡시메톡시페닐)-N⁴-(4-메톡시페닐)-1,3,5-트리아진-2,4-다이아민(9f)의 제조방법:
1) 6-다이클로로-N-(4-메톡시페놀)-1,3,5-트리아진-2-아민을 무수 아세톤에 넣은 후, 탄산칼륨을 넣고, 아민을 넣어 반응시키는 단계;
2) 상기 1)단계 반응 후, 반응 결과물에 증류수를 첨가하여 물 및 에틸아세테이트로 추출하는 단계; 및
3) 상기 2)단계의 에틸아세테이트을 증류수 및 브라인(brine)으로 닦은 후, 황산마그네슘으로 건조 후, 감압하에 용매를 제거하여 플래시 컬럼 크로마토그래피(flash column chromatography)로 분리 정제하는 단계.
하기 단계를 포함하는 6-클로로-N²,N⁴-비스(4-(메톡시메톡시)페닐)-1,3,5-트리아진-2,4-다이아민(9q)의 제조방법:
1) 4,6-다이클로로-N-(4-(메톡시메톡시페닐)-1,3,5-트리아진-2-아민을 무수 아세톤에 넣은 후, 탄산칼륨을 넣고, 4-(메톡시메톡시) 아닐린을 넣어 반응시키는 단계;
2) 상기 1)단계 반응 후, 반응 결과물에 증류수를 첨가하여 물 및 에틸아세테이트로 추출하는 단계; 및
3) 상기 2)단계의 에틸아세테이트을 증류수 및 브라인(brine)으로 닦은 후, 황산마그네슘으로 건조 후, 감압하에 용매를 제거하여 플래시 컬럼 크로마토그래피(flash column chromatography)로 분리 정제하는 단계.
하기 화학식 13의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
[화학식 13]

상기 식에서, R은
또는
를 나타내고; 물결선에 의해 양분되는 결합은 부착 지점을 의미함.
하기 단계를 포함하는 N⁴-(4-클로로페놀)-N⁶-(2,5-다이메톡시페닐)-1-메틸-4,5,6,7-테트라하이드로-1에이치-피라졸[3,4-d]피리미딘-4,6-다이아민(D2)의 제조방법:
1) 2,5-다이메톡시벤젠아민, K₃PO₄, BINAP(2,2'-bis-diphenylphosphino-1,1'-binaphtyl) 및 Pd₂(dba)₃를 다이옥세인에 녹인 6- 클로로-N-(4-클로로페닐)-1-메틸-4,5,6,7-테트라하이드로-1에치치-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4-아민에 첨가하여 반응시키는 단계;
2) 상기 1)단계 반응 후, 반응 결과물에 증류수를 첨가하여 물 및 에틸아세테이트로 추출하는 단계; 및
3) 상기 2)단계의 에틸아세테이트을 증류수 및 브라인(brine)으로 닦은 후, 황산마그네슘으로 건조 후, 감압하에 용매를 제거하여 플래시 컬럼 크로마토그래피(flash column chromatography)로 분리 정제하는 단계.
하기 단계를 포함하는 N⁶-부틸-N⁴-(4-클로로페닐)-1-메틸-1에이치-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4,6-다이아민(17b)의 제조방법:
1) 6-클로로-N-(4-클로로페닐)-1-메틸-4,5,6,7-테트라하이드로-1에이치-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4-아민을 THF(Tetrahydrofuran)에 녹인 후, 부틸아민을 넣고 교반 시키는 단계;
2) 상기 1)단계 반응 후, 반응 결과물에 증류수를 첨가하여 물 및 에틸아세테이트로 추출하는 단계; 및
3) 상기 2)단계의 에틸아세테이트을 증류수 및 브라인(brine)으로 닦은 후, 황산마그네슘으로 건조 후, 감압하에 용매를 제거하여 플래시 컬럼 크로마토그래피(flash column chromatography)로 분리 정제하는 단계.
제 1항, 제 9항, 제 12항 또는 제 15항 중 어느 한 항의 화합물을 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 18항에 있어서,
상기 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 c-myc유전자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 18항에 있어서,
상기 암은 폐암, 결직장암, 유방암, 방광암, 자궁경부암, 위암, 버키트 림프종 및 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 암예방 또는 치료용 약학적 조성물.