KR101666320B1

KR101666320B1 - Hiv 감염성 질환의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101666320B1
Application number: KR1020150134603A
Authority: KR
Inventors: 박현주; 박소정
Original assignee: 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2015-09-23
Filing date: 2015-09-23
Publication date: 2016-10-13

Abstract

본 발명은, 화학식 1의 화합물(6-chloro-N2,N4-bis(2,3-dihydrobenzo[b][1,4]dioxin-6-yl)-1,3,5-triazine-2,4-diamine) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, HIV감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 화합물에 의하면, HIV의 mRNA stem-loop에 직접 결합하여 구조적 안정성을 변화시킴으로써, -1 frameshift를 통하여 생산되는 단백질의 생성을 억제하는 바, 종래 바이러스의 내성을 일으키는 돌연변이의 비율이 높은 단백질을 타겟으로 하는 대신에 RNA를 직접적인 타겟으로 하기 때문에, 내성 문제를 해결할 수 있다.

Description

HIV 감염성 질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for treating disease induced by HIV}

본 발명은, 화학식 1의 화합물(6-chloro-N2,N4-bis(2,3-dihydrobenzo[b][1,4]dioxin-6-yl)-1,3,5-triazine-2,4-diamine) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, HIV 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

인간 면역결핍 바이러스(Human Immunodeficiency Virus, HIV)는 후천성 면역결핍 증후군(AIDS)을 일으키는 원인바이러스로서, CD4+ T 세포를 파괴하여 면역 시스템을 저하시키므로 각종 감염질환, 종양 등을 일으킨다. HIV 게놈은 다른 레트로바이러스와 마찬가지로, gag 및 gag-pol 단백질 전구체를 암호화하며, 최종적으로 단백질분해효소(protease), 역전사효소(RT), 엔도뉴클레아제(endonuclease)/인테그라아제(integrase)를 제공하고, 바이러스 코어의 구조 단백질을 성숙시킨다.

2010년 보고(Datamonitor)에 따르면 전세계 에이즈 치료제 시장규모는 147억 달러로 2009년 대비 약 10%의 성장을 보이고 있고, 주요 7개국(미국, 일본, 영국, 프랑스, 독일, 이탈리아, 스페인)의 시장규모는 118억 달러로서 전체 시장의 대부분을 차지하고 있으며, 2005년에서 2009년 사이 10%의 연평균 성장률(Compound Annual Growth Rate, CAGR)을 나타내고 있다.

한편, 종래 에이즈 치료제 대부분은 HIV 역전사효소의 특정 알로스테릭 (allosteric) 부위에 결합하여 효소의 형태 또는 이동성을 변화시킴으로써 활성을 차단하는 등, 단백질을 타겟으로 하기 때문에 그에 따른 내성 HIV 균주의 출현이라는 문제가 있었다. 또한, 에이즈 치료제를 복용하기 시작하면 평생 복용해야 하므로 구역감과 설사와 같은 약물 부작용, 경제적인 부담이 있을 뿐만 아니라, 일부 항레트로바이러스 약제들은 흔하게 사용되는 다른 약제들과 약물 상호작용을 일으킬 수 있다.

더욱이, 현재 시판중인 항HIV 약제는 환자의 체내에서 HIV 증식을 완전하게 차단하지 못하므로 단독으로 사용하면 약제의 내성을 유발하거나 에이즈가 재발한다는 문제가 있으며, 이를 해소하기 위하여, 두 가지 이상의 약물을 혼합하여 사용하는 칵테일 요법(복합/병용 제제)이 대안으로 제시되고 있으나(한국공개특허 10-2007-0050934호 참조), 지질변화, 지방이상증 같은 부작용 때문에 새로운 치료제의 개발이 요구되는 실정이다. 따라서, 최근에는 약제 순응도 개선 연구 및 내성 바이러스 문제 해결이 신약 개발 분야에서 중요한 화두가 되고 있다.

이에, 본 발명자들은 상기와 같은 문제를 해결하고자, 바이러스 내성을 일으키는 돌연변이의 비율이 단백질에 비해 상대적으로 낮은 RNA를 직접적인 타겟으로하여 새로운 AIDS 치료제로 개발 가능성이 있는 리간드를 찾고자 예의 연구한 결과, 구조기반 가상검색 및 합성을 통하여 본 발명의 특정 트리아진계 화합물을 항HIV 약제로서 제공하고자 한다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은, 하기 화학식 1의 화합물(이하, 'YJ16 화합물'이라 함) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, HIV 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

또한, 본 발명은, 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, HIV 감염성 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

또한, 본 발명은, 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 HIV 감염성 질환에 대한 예방 또는 치료용도를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 화학식 1의 화합물은 HIV의 mRNA 스템-루프(stem-loop)에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 화학식 1의 화합물은 HIV의 mRNA에 대하여 리보좀의 -1 틀이동(frameshifting)을 저해하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 화학식 1의 화합물은 HIV의 역전사효소-인테그라제(reverse transcriptase-integrase) 융합 단백질의 생성을 저해하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 HIV 감염성 질환은 후천성 면역결핍 증후군(AIDS) 또는 AIDS 관련증후군(ARC)인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 특정 트리아진계 화합물(YJ16 화합물)에 의하면, HIV의 mRNA stem-loop에 직접 결합하여 구조적 안정성을 변화시킴으로써, -1 frameshift를 통하여 생산되는 단백질(gag-pol)의 생성을 억제하는 바, 종래 바이러스의 내성을 일으키는 돌연변이의 비율이 높은 단백질을 타겟으로 하는 대신에 RNA를 직접적인 타겟으로 하기 때문에, 내성 문제를 해결할 수 있다.

따라서, 본 발명은 기존의 항HIV 약제를 뛰어넘는 새로운 치료제 및 치료법을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명에 의하면 AIDS의 치료를 위한 신규 타깃 RNA를 제공할 수 있다.

도 1a는, 1차 가상검색(virtual screening)을 통하여 선정한 후보물질 35개에 대하여 in vitro TnT assay를 수행한 결과이며, 도 1b는 후보물질 35개중에서 -1 frameshifting 억제활성이 우수한 3종의 hit 리간드들(SC013, YJ16, SC032)에 대하여 농도별로 in vitro TnT assay를 수행한 결과이다.
도 2는, 3종의 hit 리간드들 중에서 효과가 가장 우수한 YJ16 화합물을 선정하여 농도별로 in vitro TnT assay를 수행한 결과이다.
도 3은, YJ16 화합물을 in vitro TnT assay 한 후 얻어진 단백질 산물에 대하여 SDS-PAGE를 실시한 결과이다.
도 4는, YJ16 화합물에 대한 cell based -1 frameshifting 저해활성 시험결과이다.
도 5는, YJ16 화합물에 대하여 in vitro transcription assay를 수행한 결과이다.
도 6은, YJ16 화합물에 대하여 HIV 이외에도 SARS-CoV 및 PEMV에 대하여 -1 frameshifting 저해활성을 분석하여, HIV 특이성을 평가한 결과이다.
도 7은, HIV의 mRNA stem-loop에 결합하는 리간드(YJ16)가 리보좀의 -1 frameshifting을 조절함으로써, Gag-Pol 융합단백질의 생성을 저해함을 나타내는 모식도이다.

[화학식 1]

HIV는 -1 틀이동(frameshift) 기작을 이용하여 Gag와 Gag-Pol 융합 단백질을 발현시키는 것이 필수적인데, HIV 증식이 이 두개의 단백질 비율에 의존하기 때문이다. 즉, HIV를 포함하는 레트로바이러스는 생존에 필요한 단백질 생성을 위해 하나의 mRNA로부터 서로 다른 종류의 단백질을 생성할 수 있는 리보솜 -1 틀이동 (ribosomal -1 frameshifting) 기전을 보인다. 이에 의해, 역전사효소(reverse transcriptase)와 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 삽입효소(integrase)로 스플라이싱되어 사용되어지는 gag-pol fusion protein을 생성하는 것이다. 이러한 -1 frameshifitng에 의해 생성되는 gag-pol fusion protein 생성비율이 정확히 지켜지지 않고 달라지면 HIV의 생존에 치명적인 악영향을 주어 생존을 저해하게 된다.

이때, -1 틀이동 기작은 HIV RNA 스템루프 구조에 의해 발생되고, 그 스템루프의 안정성은 적절한 -1 틀이동을 유지하는데 중요하기 때문에, RNA 스템루프에 결합하여 -1 틀이동을 조절하는 화합물은 항 HIV 약물로 개발할 수 있다. 즉, HIV의 RNA stem-loop의 3차원구조를 타겟으로 하는 새로운 리간드를 발견해 낸다면 -1틀이동을 조절하여 단백질 생산단계 자체를 방해하는 새로운 성격의 항바이러스제로서 응용할 수 있을 것이다.

이에, 본 발명에서는, HIV RNA 스템루프에 결합하는 리간드들을 찾기 위해서, 분자모델링 소프트웨어 패키지와 상업적으로 이용가능한 수십만개의 화합물 데이터 베이스를 이용하여, 기존에 알려진 RNA stem-loop 삼차원구조를 바탕으로 가상검색을 수행함으로써 보다 경제적으로 후보 화합물질군을 확보하였다.

이때, 구조 기반 가상 검색 기술(Structure-Based Ligand Design)이란, 수용체나 효소와 같은 생체거대분자의 3차원 구조가 밝혀지거나, 기존에 유사성을 갖는 알려진 단백질 구조를 바탕으로 상동성 모델링(homology modeling) 연구를 수행하여 구조 모델을 확보한 경우, 이들 단백질에 결합하여 활성을 조절할 수 있는 물질을 탐색하는 방법을 말한다.

이 방법 중 하나는 컴퓨터를 이용하여 대규모 화합물군(chemical library)의 데이터베이스를 표적 수용체에 도킹시켜 스크리닝하는 가상 약효 검색법 (virtual screening)이 있는데, 수십만개의 방대한 화합물을 대상으로 robotics 시설을 이용, assay를 수행하여 약물선도물질을 발굴하는 고효율 약효검색(HTS) 기술에 비해 경비와 시간이 많이 절감되는 장점이 있다. 최근 가상 약효 검색법으로 뛰어난 활성을 가진 선도 화합물을 찾아낼 확률과 도킹된 구조의 예측력을 향상시킨 연구방법들이 축적되면서 빠르게 유의성있는 선도화합물을 발굴한 연구결과들이 많이 보고되고 있다.

본 발명에서는 상기 가상검색으로 신규의 35개 화합물을 선정한 후, 이들에 대해서 생물학적 분석을 시행하였다. -1 틀이동 기작에 대한 화합물들의 효과는 in vitro 와 세포 베이스의 전사/번역 분석(frameshifting assay)에 의해 확인하였고, -1 틀이동 효율은 두 개의 발광효소(renilla luciferase, firefly luciferase) 발현량 분석을 통해 계산하였다. 그 결과, HIV-1의 -1 틀이동 기작에 선택적인 억제제인 신규 화합물 YJ16을 최종적으로 발굴하였다.

따라서, 본 발명에서 발굴된 신규 리간드 YJ16은, 종래 사용되고 있는 항바이러스 치료제의 큰 문제점인 내성균주의 출현과 약제의 순응도를 개선할 수 있다는 점에서 차세대 에이즈 치료제로서 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

본 발명의 상기 YJ16 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다.

본 발명에서 '약학적으로 허용가능한 염'이란, 환자에게 비교적 비독성이고 무해한 유효작용을 갖는 농도로서 이 염에 기인한 부작용이 화학식 1의 염기 화합물의 이로운 효능을 떨어뜨리지 않는 화학식 1의 염기 화합물의 어떠한 유기 또는 무기 부가염을 의미한다. 이들 염은 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 질산, 황산, 과염소산, 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 젖산, 말레산, 푸마린산, 글루콘산, 메탄설폰산, 글리콘산, 숙신산, 타타르산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산, 아스파르트산, 옥살산, (D) 또는 (L) 말산, 말레산, 메테인설폰산, 에테인설폰산, 4-톨루엔술폰산, 살리실산, 시트르산, 벤조산 또는 말론산 등을 사용할 수 있다. 또한, 이들 염은 알칼리 금속염 (나트륨염, 칼륨염 등) 및 알칼리 토금속염 (칼슘염, 마그네슘염 등) 등을 포함한다. 예를들면, 산부가염으로는 아세테이트, 아스파테이트, 벤즈에이트, 베실레이트, 바이카보네이트/카보네이트, 바이설페이트/설페이트, 보레이트, 캄실레이트, 시트레이트, 에디실레이트, 에실레이트, 포메이트, 퓨마레이트, 글루셉테이트, 글루코네이트, 글루큐로네이트, 헥사플루오로포스페이트, 하이벤제이트, 하이드로클로라이드/클로라이드, 하이드로브로마이드/브로마이드, 하이드로요오디드/요오디드, 이세티오네이트, 락테이트, 말레이트, 말리에이트, 말로네이트, 메실레이트, 메틸설페이트, 나프틸레이트, 2-나프실레이트, 니코티네이트, 나이트레이트, 오로테이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 포스페이트/수소 포스페이트/이수소 포스페이트, 사카레이트, 스테아레이트, 석시네이트, 타르트레이트, 토실레이트, 트리플루오로아세테이트, 알루미늄, 알기닌, 벤자틴, 칼슘, 콜린, 디에틸아민, 디올아민, 글라이신, 라이신, 마그네슘, 메글루민, 올아민, 칼륨, 나트륨, 트로메타민, 아연염 등이 포함될 수 있으며, 이들 중 하이드로클로라이드 또는 트리플루오로아세테이트가 바람직하다.

또한, 본 발명의 상기 YJ16 화합물은 약학적으로 허용되는 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 이성질체, 수화물 및 용매화물을 모두 포함한다.

본 발명에서 'HIV 감염성 질환'이란 HIV 감염에 의해 발생하는 증상이면 제한이 없으나, 후천성 면역결핍 증후군(AIDS) 또는 AIDS 관련증후군(ARC)인 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물은 기존 치료 활성 성분, 기타 보조제, 약제학적으로 허용가능한 담체 등의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 및 에탄올 등을 포함한다.

본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.

또한 본 발명에서 "약제학적 유효량"은 투여되는 질환 종류 및 중증도, 환자의 연령 및 성별, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정되며 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최대 효과를 얻을 수 있는 양으로, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적 조직에 도달할 수 있는 한 투여방법에는 제한이 없다. 예를 들면, 경구 투여, 동맥 주사, 정맥 주사, 경피 주사, 비강 내 투여, 경기관지 투여 또는 근육 내 투여 등이 포함된다. 일일 투여량은 약 0.0001 내지 100mg/kg이고, 바람직하게는 0.001 내지 10mg/kg이며, 하루 일회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1: 1차 가상검색(virtual screening)을 통한 후보물질 발굴

HIV에서 -1 frameshifting을 유도하는 RNA 구조 중 리간드 RG501(1,4-bis[N-(3-N,N-dimethylpropyl)amidino]benzenetetrahydrochloride)가 결합되어 있는 NMR 구조인 2L94를 타겟으로 선택하여 Protein Data Bank 홈페이지에서 다운로드 받아 가상검색에 사용하였다. 이때, RG501 화합물은, HIV의 RNA stem-loop와 결합하여 -1 frameshifting을 증가시키는 화합물로서, 틀이동 증가에 의해 HIV를 사멸시키는 화합물로 알려져 있기 때문에, 본 실험에서는 양성대조군으로 이용하였다.

우선, 2L94는 안정된 구조를 위해 야생형의 RNA에서 일부 뉴틀레오타이드가 치환되어 있기 때문에, sybyl의 build up 모듈을 이용하여 2L94 구조를 야생형에 맞게 교정하였다. 교정된 HIV RNA stem-loop 구조를 이용하여 가상검색을 하기 위해 생물학적 활성 정보를 통해 활성부위(active site)를 결정하였다.

이후, 종래 HIV의 RNA stem-loop와 결합하여 -1 frameshifting의 효율에 영향을 주는 것으로 알려진 화합물(RG501)의 도킹 구조를 분석하여 약리단(pharmacophore)를 찾은 후, Unity 모듈을 사용하여 약리단별로 상업적으로 이용가능한 화합물군(ZINC)과 in-house 데이터베이스를 검색하여 1차로 후보 화합물들을 확보하고 이들을 데이터 베이스화하였다. 약리단 검색을 통해 선택된 데이터베이스에 대하여 RNA stem-loop의 리간드 결합부위를 타겟으로 도킹 방법을 통해 가상 검색 작업을 수행하였다. 도킹 작업은 Autodock_vina를 통해 실시되었고 리간드(RG501)를 중심으로 grid를 결정하였다.

가상검색 결과, 리간드 RG501과 유사하게 활성부위에 잘 피팅되고, 결합력(binding affinity)을 예측하는 스코어값이 RG501 보다 더 우수한 35개의 화합물을 후보 화합물군으로 선정하였다.

실시예 2: 후보 화합물의 in vitro -1 frameshifting 저해활성 시험

상기 실시예 1에서 선정된 35개의 후보화합물에 대하여, 하기와 같이 in vitro -1 frameshifting assay(in vitro transcription/translation coupled assay system; TnT assay)를 이용하여 - frameshifting 저해활성을 측정하였다.

2-1. Template Construct 제조

우선, -1 frameshifting assay를 위한 template Construct를 제조하기 위하여, 2개의 luciferase 유전자(renilla luciferase와 firefly luciferase)가 포함되어 있어 -1 frameshifting으로 인해 생성되는 단백질을 비교 측정가능하게 하는, p2luc-HIV reporter construct를 제작하였다.

구체적으로, 이 p2luc-HIV는, -1 frameshifting을 유도하는 slippery 서열(UUUUUUA)와 HIV RNA stem-loop sequence를 p2luc dual-luciferase 벡터내 두 luciferase 리포터 유전자 사이에 삽입함으로써 제조하였으며, p2luc-HIV의 염기서열은 다음과 같다.

이 construct에 의하면, -1 frameshifting이 일어나지 않을 경우 오직 renilla luciferase 단백질만 생성되는 반면, -1 frameshifting이 일어난 후에는 renilla luciferase-firefly luciferase 융합단백질이 생성된다.

2-2. TnT assay

in vitro에서 전사와 번역이 동시에 일어나게 하는 TnT assay는 제조사(Promega)의 프로토콜에 따라 수행하였다. 즉, 1μg의 DNA 주형, 16㎕의 reticulocyte lysate mixture, 10μCi/㎕ [³⁵S]으로 표지된 메티오닌 0.8㎕을 포함하는 반응액에, DMSO에 녹인 2.5mM의 후보화합물을 0.5㎕ 넣어 약 2시간 동안 30℃에서 반응시켰다. 이때, 음성대조군으로는 DMSO를 이용하였다.

생성된 단백질의 양을 정량적으로 측정하기 위하여, Dual luciferase assay(DLA)를 실시하였다. 즉, in vitro TnT assay에서 얻은 lysate sample을 약 3㎕를 취하여 firefly luciferase 발현을 측정하기 위해 약 50㎕의 Luciferase Assay Reagent II(Promega)를 첨가하여 firefly luminescent signal을 안정화시킨 후 그 양을 측정하였다. 이후 firefly luciferase의 시그널을 소멸시키는 동시에 renilla luciferase의 시그널을 안정화시킬 수 있는 Stop & Glo Reagent를 첨가하여 두번째로 renilla luciferase를 정량하였다. 이때, luciferase의 양은 Glomax^® 20/20 luminometer로 측정하였다. 이때, -1 RF efficiency는 하기 공식에 따라 계산하였다.

그 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이, 3개의 화합물(SC103, YJ16, SC032)이 대조군(DMS0)에 비하여 -1 RF efficiency가 50-80%로 현저히 저하됨을 확인하였는 바, 이들 3개의 화합물(SC103, YJ16, SC032)을 hit 리간드로 선정하였다.

2-3. 농도의존 시험

상기 선정된 3개의 hit 리간드(SC103, YJ16, SC032)에 대하여, RG501 화합물과의 활성비교를 위하여 실시예 2-2와 같은 방법으로 in vitro TnT assay를 수행하되, 농도를 0 내지 250uM로 다양하게 하였다.

그 결과, 도 1b에 나타낸 바와 같이, YJ16 화합물이 RG501을 포함한 다른 화합물보다 -1 frameshifting에 의해 생성되는 단백질의 합성을 현저히 저해함을 알 수 있었다. 특히, YJ16 화합물은 -1 frameshifting efficiency를 감소시키는 비율이 RG501에 의한 증가 변화율보다 현저하고, 활성 농도 또한 현저히 낮기 때문에, 기존에 알려진 RG501 화합물보다 틀이동 조절효과가 우수함을 확인하였다.

상기 결과를 바탕으로, YJ16 화합물의 -1 frameshifting 저해 활성을, 농도 0.25, 0.5, 2.5, 25μM 별로 더욱 검증한 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 농도-의존적으로 저해 활성이 증가함을 알 수 있었다.

2-4. SDS-PAGE

in vitro TnT assay 이후, Dual luciferase assay(DLA) 대신 SDS-PAGE의 밴드강도를 측정함으로써 - RF efficiency를 확인하였다.

즉, SDS-PAGE에 의해 Non-frameshifting 단백질(renilla luciferase)과 frameshifting 단백질(renilla luciferase-firefly luciferase 융합단백질)을 분리한 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, YJ16 화합물 처리군에서는 미처리군에 비하여 frameshifting 단백질의 발현양이 감소함을 알 수 있었으며, 이러한 결과는 DLA 결과와도 일치하는 것이다.

실시예 3: YJ16 화합물의 cell-based -1 frameshifting 저해활성 시험

상기 실시예 2의 in vitro 실험에 더하여, YJ16 화합물이 동물세포에서도 동일한 저해활성을 나타내는지 더욱 확인하기 위하여, 인간신장세포(HEK 293T)를 대상으로 Dual luciferase assay를 실시하였다.

구체적으로, 96-well 플레이트에 1∼1.5×10⁴의 HEK 293T 세포를 각각 씨딩하고 24시간 동안 37℃ DMEM에서 배양한 후, 실시예 2-1의 주형 construct(p2luc-HIV)를 PureFection^TM을 이용하여 트랜스펙션하고 3시간 배양하였다. 그 다음, YJ16 화합물을 첨가하여 18-24시간 배양한 후, GloMax^®-Multi⁺을 이용하여 DLA(dual luciferase assay)를 실시하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, YJ16 화합물의 경우 음성대조군(DMSO)에 비하여, 세포에서도 in vitro 결과와 마찬가지로 -1 frameshifting을 현저히 억제함을 알 수 있었다.

실시예 4: YJ16 화합물의 in vitro transcription assay

YJ16 화합물이 틀이동 저해에 의한 단백질 발현억제 이외에, 전사 자체 즉 RNA 생성에도 영향을 미치는지 확인하기 위하여, Riboprobe RNA system-T7(promega)을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 in vitro transcription assay를 실시하였다.

구체적으로, 우선 실시예 2의 in vitro TnT assay에서 사용한 HIV의 RNA stem-loop 구조가 삽입되어 있는 DNA construct를 제한효소(Xho I)를 이용하여 선형형태로 준비하였다. 이후, 1㎍의 선형 DNA, 4㎕의 transcription optimized 5X buffer, 2㎕의 100mM dithiothreitol, 40unit의 recombinant RNasin ribonuclease inhibitor, 각각 1㎕의 rATP, rGTP, rUTP(2.5mM), 2.4㎕의 100uM rCTP, 20unit의 T7 polymerase, 0.5㎕의 2.5mM 후보 화합물을 포함하는 총 20㎕의 반응물을, 약 1시간 동안 37℃에서 전사 반응시켰다.

이후, 생성된 RNA 전사체를 확인하기 위하여, 7M urea가 포함된 10% 폴리아크릴아미드겔에 100V로 2시간 동안 전기영동한 후 건조하고, SYBR^®Gold Nucleic Acid Gel Stain으로 RNA 생성을 확인하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, YJ16 화합물은 대조군(DMSO)과 비교하여 RNA 생성에 큰 영향을 주지 않음을 확인하였다. 이러한 결과는, YJ16 화합물이 DNA 주형에는 결합하지 않기 때문에 전사 자체에는 영향을 미치지 않으면서, mRNA에는 결합하여 틀이동 조절에 의해 번역(단백질 생성)만을 저해한다는 것을 의미하는 것이다.

실시예 5: YJ16 화합물의 HIV stem-loop에 대한 특이성 분석

YJ16 화합물이 HIV에만 특이적으로 -1 frameshifting을 억제하는지 확인하기 위하여, 다른 RNA 바이러스인 SARS-CoV(Severe acute respiratory syndrome coronavirus) 및 PEMV(Pea enation mosaic virus)를 대상으로 억제활성을 확인하였다.

구체적으로, SARS-CoV와 PEMV의 RNA 특이구조인 pseudoknot을 포함하는 새로운 construct(p2luc-SARS, p2luc-PEMV)를 제작하여, 실시예 2와 동일한 방법으로 in vitro TnT assay를 실시한 후, Dual luciferase 분석하였다. 이때, p2luc-SARS, p2luc-PEMV의 염기서열은 다음과 같다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, YJ16 화합물은 SARS와 PEMV에 대하여는 저해효과가 미미한 반면, HIV에 대하여는 저해효과가 현저하였는 바, YJ16 화합물이 HIV stem-loop 구조에 더 특이적으로 작용함을 알 수 있다.

이상, 도 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 화합물(YJ16)은 HIV의 mRNA stem-loop의 삼차원구조를 타겟으로 하는 새로운 리간드로서, -1 frameshifting을 조절하여 단백질 생산단계 자체를 방해하는 새로운 성격의 항바이러스제이기 때문에, AIDS 등의 질환 예방/치료에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

Claims

하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, HIV(Human Immunodeficiency Virus) 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
[화학식 1]
제 1 항에 있어서, 상기 화합물은 HIV의 mRNA 스템-루프(stem-loop)에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 화합물은 HIV의 mRNA에 대하여 리보좀의 -1 틀이동(frameshifting)을 저해하는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 화합물은 HIV의 역전사효소-인테그라제(reverse transcriptase-integrase) 융합 단백질의 생성을 저해하는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 HIV 감염성 질환은 후천성 면역결핍 증후군(AIDS) 또는 AIDS 관련증후군(ARC)인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.