WO2020101025A1 - 分析方法、分析装置及び分析プログラム - Google Patents

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plasma
time
coagulation
curve
factor
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俊樹 川辺
由紀夫 小田
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Sekisui Medical Co Ltd
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Sekisui Medical Co Ltd
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    • G16H—HEALTHCARE INFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR THE HANDLING OR PROCESSING OF MEDICAL OR HEALTHCARE DATA
    • G16H50/00—ICT specially adapted for medical diagnosis, medical simulation or medical data mining; ICT specially adapted for detecting, monitoring or modelling epidemics or pandemics
    • G16H50/20—ICT specially adapted for medical diagnosis, medical simulation or medical data mining; ICT specially adapted for detecting, monitoring or modelling epidemics or pandemics for computer-aided diagnosis, e.g. based on medical expert systems

Definitions

  • the present invention relates to an analysis method, an analysis device, and an analysis program.
  • a blood coagulation test is performed to diagnose the blood coagulation function of the patient.
  • a predetermined reagent is added to a blood sample of a patient, and the blood coagulation function such as coagulation time is tested.
  • a blood coagulation test can grasp the state of hemostatic ability or fibrinolytic ability of a patient. Factors that cause the prolongation of the blood coagulation time include the influence of anticoagulant drugs, the reduction of components involved in coagulation, the deficiency of congenital blood coagulation factors, and the presence of autoantibodies that inhibit the acquired coagulation reaction.
  • the clinical severity of bleeding symptoms in hemophilia A is 1 for normal coagulation factor VIII activity (hereinafter, coagulation factor VIII etc. is referred to as factor VIII etc.) when the normal person is 100%. It is judged at the boundary of%.
  • factor VIII etc. As a method for measuring factor VIII activity, a measurement method based on a coagulation reaction curve obtained by adding a predetermined reagent to a blood sample of a patient and obtaining the coagulation reaction amount with respect to the reaction time at that time is known.
  • Patent Document 1 The maximum solidification rate is obtained based on the solidification rate curve obtained from the first derivative of the solidification reaction curve showing the solidification reaction amount with respect to the reaction time. Further, the maximum coagulation acceleration and the maximum coagulation deceleration are obtained based on the coagulation acceleration curve obtained from the second derivative of the coagulation reaction curve. Further, the time when each state is reached from the start of the coagulation reaction is obtained as the maximum coagulation rate time, the maximum coagulation acceleration time and the maximum coagulation deceleration time. These values are called coagulation waveform parameters obtained from the coagulation reaction curve, coagulation rate curve or coagulation acceleration curve, and the presence or absence of coagulation factor abnormality is determined based on these values.
  • a congenital coagulation disorder is obtained by performing a test (cross-mixing test) for measuring the coagulation time of a sample obtained by mixing a test plasma showing prolongation of coagulation time with normal plasma.
  • a test cross-mixing test
  • APTT prolongation is observed in the activated partial thromboplastin time (APTT) measurement
  • APTT activated partial thromboplastin time
  • a cross-mixing test is performed to distinguish the factors of APTT prolongation.
  • the cross-mixing test the following two tests are carried out for each of test plasma, normal plasma, and mixed plasma thereof.
  • -Immediate test in which each plasma is measured without heating treatment to examine immediate reaction
  • immediate reaction-Delayed test in which each plasma is measured after incubation (incubation) at 37 ° C for 2 hours to examine delayed reaction
  • a coagulation factor inhibitor inhibitor
  • LA lupus anticoagulant
  • a coagulation factor deficiency such as hemophilia.
  • the results of the cross-mixing test are graphed as the APTT measurement value (second) on the vertical axis and the volume mixing ratio of the test plasma and the normal plasma on the horizontal axis.
  • the created graph shows the following patterns in each of the cases where the factors of coagulation delay are as follows.
  • -Coagulation factor inhibitor hereinafter, inhibitor: In an immediate reaction, it varies from "convex downward", "straight line", or "convex upward".
  • ⁇ Lupus anticoagulant hereinafter, LA: Both immediate response and delayed response are “convex upward” or “straight line”.
  • ⁇ Coagulation factor deficiency hereinafter, factor deficiency
  • hemophilia Both immediate and delayed reactions are "convex downward”.
  • the factor of coagulation delay is determined by the following method based on the result of the cross-mixing test on the plasma to be tested, in which the factor of coagulation delay is unknown.
  • the factor of coagulation delay is an inhibitor or factor deficiency, but it cannot be distinguished.
  • the result of the delayed test is "convex downward”
  • the factor of coagulation delay can be determined to be a factor deficiency
  • if "linear" or "convex upward” the factor of coagulation delay can be determined to be an inhibitor.
  • the factor of coagulation delay is an inhibitor or LA, but it cannot be distinguished.
  • the result of the delayed-type test becomes more "convex upward” than in the case of the immediate-type test, it can be determined that the factor of the delayed coagulation is an inhibitor.
  • the graph pattern may be difficult to judge depending on the test plasma.
  • the test is about 2 and a half hours when the heating time and the measurement time are taken into consideration. It takes time.
  • a method for analyzing coagulation characteristics of a blood sample which comprises: (1) Acquiring data of a coagulation reaction curve showing a coagulation reaction amount with respect to a reaction time of a mixed liquid containing a blood sample and a reagent, (2) calculating data of a differential curve obtained by differentiating the coagulation reaction curve, (3) calculating information related to the center of gravity of the differential curve, (4) evaluating coagulation characteristics of the blood sample using information related to the center of gravity; Including the method.
  • the differential curve is at least one selected from the group consisting of a primary differential curve relating to the coagulation reaction curve and a secondary differential curve relating to the coagulation reaction curve.
  • the center of gravity of the differential curve is the center of gravity of the primary differential curve represented by the coordinates (vT, vH) defined by the center of gravity time vT and the center of gravity height vH, and the vT and the vH are
  • the first-order differential curve is F (t) (t is time)
  • the time when F (t) is a predetermined value x is t1, t2 (t1 ⁇ t2)
  • Information related to the center of gravity is the vT, the vH, the peak width vB, the center of gravity peak width vW, the B flatness ratio vAB, the B time ratio vTB, the W flatness ratio vAW, the W time ratio vTW, and the average time vTa.
  • the peak width vB is a time length from the t1 to the t2 where F (t) ⁇ x
  • the center-of-gravity peak width vW is a time length for which F (t) ⁇ vH from t1 to t2
  • Said vAB represents the ratio of said vH and said vB
  • the vTB represents the ratio of the vT to the vB
  • the vAW represents the ratio of the vH and the vW
  • the vTW represents the ratio of the vT to the vW
  • the vTa, the vHa, and the vTm have the same definitions as F (t), t1 and t2, and when the number of data points from F (t1) to F (t2) is n, Represented Said vABa represents the ratio of said vHa and said
  • the barycentric point of the differential curve is the positive peak barycentric point of the secondary differential curve represented by the coordinates (pT, pH) defined by the barycentric time pT and the barycentric height pH.
  • the pH is expressed by the following formula when the second derivative curve is F ′ (t) (t is time) and the time when F ′ (t) is a predetermined value x is t1 and t2 (t1 ⁇ t2).
  • a group in which the information related to the center of gravity is composed of the pT, the pH, the peak width pB, the center of gravity peak width pW, the B oblateness pAB, the B time ratio pTB, the W oblateness pAW, and the W time ratio pTW.
  • the peak width pB is a time length such that F ′ (t) ⁇ x from t1 to t2,
  • the center-of-gravity peak width pW is the length of time for which F ′ (t) ⁇ pH from t1 to t2,
  • the pAB represents the ratio of the pH and the pB
  • the pTB represents the ratio of the pT and the pB
  • the pAW represents the ratio of the pH and the pW
  • the pTW represents the ratio of the pT and the pW, [5] The analysis method described.
  • the barycentric point of the differential curve is the negative peak barycentric point of the secondary differential curve represented by the coordinates (mT, mH) defined by the barycentric time mT and the barycentric height mH.
  • the mH is expressed by the following formula when the second derivative curve is F ′ (t) (t is time) and the time when F ′ (t) is a predetermined value x is t1 and t2 (t1 ⁇ t2).
  • Information related to the center of gravity is a group consisting of the mT, the mH, the peak width mB, the center of gravity peak width mW, the B oblateness mAB, the B time ratio mTB, the W oblateness mAW, and the W time ratio mTW.
  • the peak width mB is a time length such that F ′ (t) ⁇ x from t1 to t2,
  • the center-of-gravity peak width mW is a time length for which F ′ (t) ⁇ mH from t1 to t2,
  • the mAB represents the ratio of the mH to the mB
  • the mTB represents the ratio of the mT and the mB
  • the mAW represents the ratio of the mH to the mW
  • the mTW represents the ratio of the mT and the mW, [7]
  • the coagulation property is coagulation factor concentration
  • the coagulation factor is composed of coagulation factor V, coagulation factor VIII, coagulation factor IX, coagulation factor X, coagulation factor XI, and coagulation factor XII
  • the analysis method according to [4], [6] or [8] which is at least one selected from the group.
  • the analysis method according to [4], [6] or [8], which comprises: [12] The analysis method according to [4], [6] or [8], wherein the (4) includes an analysis using a ratio (time ratio) of the center of gravity time and the peak width. [13] The analysis method according to [12], wherein the (4) includes determining whether the factor of prolonging the coagulation time is coagulation factor VIII based on the time rate. [14] The above (4) qualifies the analysis target component and quantifies the concentration of the analysis target component based on the relationship between the concentration of the analysis target component and the time rate and the obtained time rate.
  • the above (1) is Preparing mixed plasma in which test plasma and normal plasma are mixed, Performing coagulation time measurement without heating the mixed plasma; Measuring the coagulation time after heating the mixed plasma, Including,
  • the above (3) is Calculating a first parameter related to the coagulation reaction state based on the coagulation time measurement data of the mixed plasma without heating.
  • the (4) is Differentiating a factor of prolongation of coagulation time based on a ratio or a difference between the first parameter and the second parameter.
  • the analytical method according to any one of [1] to [16].
  • the clotting time measurement is at least one of prothrombin time measurement, activated partial thromboplastin time measurement, diluted prothrombin time measurement, diluted partial thromboplastin time measurement, kaolin clotting time measurement, and diluted Russell snake venom time measurement.
  • the analysis method according to [17], which is [19] The analysis method according to [17] or [18], wherein the discrimination includes determining whether the factor of prolongation of coagulation time is an effect of a coagulation factor inhibitor or an effect of lupus anticoagulant.
  • the first parameter and the second parameter are the maximum value of the first-order differential curve, the center of gravity height vH, the center of gravity time vT, the peak width vB, the center of gravity peak width vW, the B flattening rate vAB, and the B time. 21. Any one of claims 17 to 20 comprising at least one selected from the group consisting of rate vTB, W flattening rate vAW, W hour rate vTW, average time vTa, average height vHa, vTm, ABa and vAWa. Analytical method described. [17] The analysis method according to any one of [20].
  • the factor of prolonging the coagulation time is the influence of the coagulation factor inhibitor.
  • the ratio of the first parameter and the second parameter falls within a predetermined range including 1, the factor of prolonging the coagulation time is the influence of lupus anticoagulant.
  • the factor of prolonging the coagulation time is the influence of the coagulation factor inhibitor.
  • FIG. 1 is a flowchart showing an outline of an example of an analysis method for blood coagulation according to an embodiment.
  • FIG. 2 is a flowchart showing an outline of an example of a data analysis method regarding blood coagulation according to one embodiment.
  • FIG. 3 is a diagram showing an example of a coagulation reaction curve.
  • FIG. 4 is a diagram showing an example of the coagulation reaction curve after the baseline adjustment.
  • FIG. 5A is an enlarged view of a part of an example of the coagulation reaction curve.
  • FIG. 5B is an enlarged view of a part of an example of the coagulation reaction curve after the baseline adjustment.
  • FIG. 6 is a diagram illustrating an example of the correction-processed coagulation reaction curve.
  • FIG. 1 is a flowchart showing an outline of an example of an analysis method for blood coagulation according to an embodiment.
  • FIG. 2 is a flowchart showing an outline of an example of a data analysis method regarding blood coagulation according to one embodiment.
  • FIG. 7 is a diagram showing an example of the corrected primary curve.
  • FIG. 8 is a diagram showing an example of the corrected quadratic curve.
  • FIG. 9 is a diagram for explaining the coagulation time, and is a diagram showing an example of the coagulation reaction curve after the baseline adjustment.
  • FIG. 10A is a diagram for explaining the evaluation parameter and is a diagram showing an example of a solidification rate curve.
  • FIG. 10B is a conceptual diagram showing the center of gravity and vTs, vTe, vB, and vW. The dotted line is a diagram showing the 10% calculation target area of the linear curve.
  • FIG. 10C is a diagram showing the center of gravity of the quadratic curve.
  • FIG. 10D is a conceptual diagram showing vTa, vHa, and vTm.
  • the dotted line is a diagram showing the 10% calculation target area of the linear curve.
  • FIG. 11 is a diagram for explaining the calculation target threshold value, the range of the corrected zero-order curve and the corrected primary curve, and the center of gravity that are the analysis targets.
  • FIG. 12A is a diagram for explaining the center of gravity and the like when the calculation target range value is set to 10%.
  • FIG. 12B is a diagram for explaining the center of gravity and the like when the calculation target range value is set to 80%.
  • FIG. 13 is a block diagram showing an outline of a configuration example of the automatic analyzer according to the embodiment.
  • FIG. 14 is a flowchart showing an outline of an operation example of the automatic analyzer according to the embodiment.
  • FIG. 15 is a flowchart showing an outline of an example of the measurement process according to the embodiment.
  • FIG. 16 is a flowchart showing an outline of an example of the analysis processing according to the embodiment.
  • FIG. 17A is a diagram showing an example of an uncorrected zero-order curve of normal plasma and coagulation factor-deficient plasma.
  • FIG. 17B is a diagram showing an example of a corrected zero-order curve of normal plasma and coagulation factor-deficient plasma.
  • FIG. 18A is a diagram showing an example of an uncorrected linear curve of normal plasma and coagulation factor-deficient plasma.
  • FIG. 18B is a diagram showing an example of a corrected linear curve of normal plasma and coagulation factor-deficient plasma.
  • FIG. 19A is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the factor VIII concentration, the time VmaxT indicating the maximum first-order differential value, and the centroid time vT10%.
  • FIG. 19B is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the factor IX concentration, the time VmaxT showing the maximum first-order differential value, and the centroid time vT10%.
  • FIG. 19C is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the factor VIII concentration and the maximum first-order differential value Vmax and the height of the center of gravity vH60%.
  • FIG. 19A is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the factor VIII concentration, the time VmaxT indicating the maximum first-order differential value, and the centroid time vT10%.
  • FIG. 19B is a diagram showing
  • FIG. 19D is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the factor IX concentration, the maximum first-order differential value Vmax, and the height of the center of gravity vH60%.
  • FIG. 20A is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of factor VIII concentration and the peak width vB10%.
  • FIG. 20B is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the factor IX concentration and the peak width vB10%.
  • FIG. 21A is a diagram showing the position of the center of gravity according to the calculation target range value in an example of the corrected primary curve of normal plasma.
  • FIG. 21B is a diagram showing the position of the center of gravity point according to the calculation target threshold value in an example of the corrected primary curve of factor VIII-deficient plasma.
  • FIG. 21C is a diagram showing the position of the center of gravity point according to the calculation target threshold value in an example of the corrected primary curve of factor IX-deficient plasma.
  • FIG. 22A is a diagram showing an example of the center-of-gravity time according to the calculation target threshold value.
  • FIG. 22B is a diagram showing an example of the relative difference in the centroid times according to the calculation target threshold value.
  • FIG. 22C is a diagram showing an example of the height of the center of gravity according to the calculation target threshold value.
  • FIG. 23 is a diagram for explaining an example of the behavior of the center of gravity depending on the calculation target threshold value that differs depending on the sample.
  • FIG. 24A is a diagram showing an example of a corrected primary curve calculated based on the difference method.
  • FIG. 24B is a diagram showing an example of the corrected linear curve calculated based on the average inclination in the section.
  • FIG. 25A is a diagram showing an example of flatness vAB80% obtained by performing a correction process on the logarithm of the factor VIII concentration.
  • FIG. 25B is a diagram showing an example of the flatness RvAB80% obtained without performing the correction process on the logarithm of the factor VIII concentration.
  • 25C is a diagram showing an example of the logarithm of the flattening rate vAB80% obtained by performing the correction process on the logarithm of the factor VIII concentration.
  • FIG. 25D is a diagram showing an example of the logarithm of the flattening rate RvAB80% obtained without performing the correction process on the logarithm of the factor VIII concentration.
  • FIG. 26 is a diagram showing an example of a corrected linear curve for each factor VIII concentration.
  • FIG. 27 is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the factor VIII concentration and the logarithm of the center of gravity height vH60%.
  • FIG. 28A is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the concentrations of various coagulation factors and the logarithm of the time rate vTB5%.
  • FIG. 28B is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the concentrations of various coagulation factors and the logarithm of the time rate vTB10%.
  • FIG. 28C is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the concentrations of various coagulation factors and the logarithm of the time rate vTB20%.
  • FIG. 28D is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the concentrations of various coagulation factors and the logarithm of the time rate vTB30%.
  • FIG. 28E is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the concentrations of various coagulation factors and the logarithm of the time rate vTB40%.
  • FIG. 28F is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the concentrations of various coagulation factors and the logarithm of the time rate vTB50%.
  • FIG. 28G is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the concentrations of various coagulation factors and the logarithm of the time rate vTB60%.
  • FIG. 28H is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the concentrations of various coagulation factors and the logarithm of the time rate vTB70%.
  • FIG. 28I is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the concentrations of various coagulation factors and the logarithm of the time rate vTB80%.
  • FIG. 28J is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the concentrations of various coagulation factors and the logarithm of the time rate vTB90%.
  • FIG. 28K is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the concentrations of various coagulation factors and the logarithm of the time rate vTB95%.
  • FIG. 29 shows an example of the relationship between the factor VIII concentration and the time rate vTB for each calculation target threshold value.
  • FIG. 30 shows an example of the rank order of the time rates obtained for each concentration of factor VIII among the time rates obtained for various concentrations of coagulation factors.
  • FIG. 31 shows an example of the correlation between the logarithm of the factor VIII concentration and the logarithm of the time rate.
  • FIG. 32 is a diagram showing an example of the relationship of the correlation coefficient between the logarithm of the factor VIII concentration and the logarithm of the time rate obtained for each calculation target threshold value.
  • FIG. 33 is a diagram showing an example of the relationship among the calculation target range value, the center-of-gravity height vH, and the maximum first-order differential value Vmax obtained for each factor VIII concentration.
  • FIG. 34 is a diagram showing an example of the relationship between the calculation target threshold value and the peak width vB obtained for each factor VIII concentration.
  • FIG. 35A is a diagram showing an example of the relationship between the calculation target threshold value and the oblateness vAB obtained for each factor VIII concentration.
  • FIG. 35B is a diagram showing an example of the relationship between the calculation target threshold value and the logarithm of the oblateness vAB obtained for each factor VIII concentration.
  • FIG. 36A is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the concentrations of various coagulation factors and the logarithm of the oblateness vAB5%.
  • FIG. 35A is a diagram showing an example of the relationship between the calculation target threshold value and the peak width vB obtained for each factor VIII concentration.
  • FIG. 35A is a diagram showing an example of the relationship between the calculation target threshold value and the oblateness vAB obtained for each factor VIII concentration.
  • FIG. 35B is a diagram showing an
  • FIG. 36B is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the concentrations of various coagulation factors and the logarithm of the oblateness vAB10%.
  • FIG. 36C is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the concentrations of various coagulation factors and the logarithm of the oblateness vAB20%.
  • FIG. 36D is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the concentrations of various coagulation factors and the logarithm of the oblateness vAB30%.
  • FIG. 36E is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the concentrations of various coagulation factors and the logarithm of the oblateness vAB40%.
  • FIG. 36F is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the concentrations of various coagulation factors and the logarithm of the oblateness vAB50%.
  • FIG. 36G is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the concentrations of various coagulation factors and the logarithm of the oblateness vAB60%.
  • FIG. 36H is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the concentrations of various coagulation factors and the logarithm of the oblateness vAB70%.
  • FIG. 36I is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the concentrations of various coagulation factors and the logarithm of the oblateness vAB80%.
  • FIG. 36J is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the concentrations of various coagulation factors and the logarithm of the oblateness vAB90%.
  • FIG. 36K is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the concentrations of various coagulation factors and the logarithm of the oblateness vAB95%.
  • FIG. 37A is a diagram showing an example of the relationship between the logarithms of the concentrations of various coagulation factors and the logarithm of the maximum first derivative Vmax.
  • FIG. 37B is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the concentrations of various coagulation factors and the logarithm of the center of gravity pH 90% of the plus peak of the corrected quadratic curve.
  • FIG. 38 shows an example of the relationship between the factor VIII concentration, the flattening rate vAB and the maximum first-order differential value Vmax for each threshold value to be calculated.
  • FIG. 39 shows an example of the correlation between the logarithm of the factor VIII concentration, the logarithm of the flattening rate, and the logarithm of the maximum first derivative value Vmax.
  • FIG. 40 shows an example of the ratio (recovery rate) between the known concentration of Factor VIII and the calculated concentration obtained from the calibration curve using the values shown in FIG. 39.
  • FIG. 41A is a diagram showing an example of an uncorrected 0th-order curve (the amount of scattered light without correction) and an uncorrected 1st-order curve of normal plasma and various plasmas lacking coagulation factors.
  • FIG. 41B is a diagram showing an example of a corrected 0th-order curve and a corrected 1st-order curve of normal plasma and various clotting factor-deficient plasmas.
  • FIG. 42A is a diagram showing an example of an uncorrected quadratic curve of normal plasma and plasmas lacking various coagulation factors.
  • the right diagram is a diagram in which the scale in the y-axis direction of the left diagram is changed.
  • FIG. 42B is a diagram showing an example of a corrected quadratic curve of normal plasma and various plasmas lacking coagulation factors.
  • the right diagram is a diagram in which the scale in the y-axis direction of the left diagram is changed.
  • the upper diagram of FIG. 43A is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the concentrations of various coagulation factors and the logarithm of APTT.
  • the middle left figure shows a plot of the calculated concentration based on the calibration curve with respect to the actual concentration of the coagulation factor.
  • the middle right figure shows a logarithmic plot of the measured concentration and the calculated concentration.
  • the upper diagram of FIG. 43B is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the concentrations of various coagulation factors and the logarithm of T5.
  • the middle left figure shows a plot of the calculated concentration based on the calibration curve with respect to the actual concentration of the coagulation factor.
  • the middle right figure shows a logarithmic plot of the measured concentration and the calculated concentration.
  • the upper diagram of FIG. 43C is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the concentrations of various coagulation factors and the logarithm of T95-T5.
  • the middle left figure shows a plot of the calculated concentration based on the calibration curve with respect to the actual concentration of the coagulation factor.
  • the middle right figure shows a logarithmic plot of the measured concentration and the calculated concentration.
  • the upper diagram of FIG. 43D is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the concentrations of various coagulation factors and the logarithm of VmaxT.
  • the middle left figure shows a plot of the calculated concentration based on the calibration curve with respect to the actual concentration of the coagulation factor.
  • the middle right figure shows a logarithmic plot of the measured concentration and the calculated concentration.
  • FIG. 43E is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the concentrations of various coagulation factors and the logarithm of Vmax.
  • the middle left figure shows a plot of the calculated concentration based on the calibration curve with respect to the actual concentration of the coagulation factor.
  • the middle right figure shows a logarithmic plot of the measured concentration and the calculated concentration.
  • the upper diagram of FIG. 43F is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the concentrations of various coagulation factors and the logarithm of AmaxT.
  • the middle left figure shows a plot of the calculated concentration based on the calibration curve with respect to the actual concentration of the coagulation factor.
  • the middle right figure shows a logarithmic plot of the measured concentration and the calculated concentration.
  • the upper diagram of FIG. 43G is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the concentrations of various coagulation factors and the logarithm of Amax.
  • the middle left figure shows a plot of the calculated concentration based on the calibration curve with respect to the actual concentration of the coagulation factor.
  • the middle right figure shows a logarithmic plot of the measured concentration and the calculated concentration.
  • the upper diagram of FIG. 43H is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the concentrations of various coagulation factors and the logarithm of vAUC20%.
  • the middle left figure shows a plot of the calculated concentration based on the calibration curve with respect to the actual concentration of the coagulation factor.
  • the middle right figure shows a logarithmic plot of the measured concentration and the calculated concentration.
  • the upper diagram of FIG. 43I is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the concentrations of various coagulation factors and the logarithm of vH5%.
  • the middle left figure shows a plot of the calculated concentration based on the calibration curve with respect to the actual concentration of the coagulation factor.
  • the middle right figure shows a logarithmic plot of the measured concentration and the calculated concentration.
  • the upper diagram of FIG. 43J is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the concentrations of various coagulation factors and the logarithm of vT50%.
  • the middle left figure shows a plot of the calculated concentration based on the calibration curve with respect to the actual concentration of the coagulation factor.
  • the middle right figure shows a logarithmic plot of the measured concentration and the calculated concentration.
  • the upper diagram of FIG. 43K is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the concentrations of various coagulation factors and the logarithm of vTs50%.
  • the middle left figure shows a plot of the calculated concentration based on the calibration curve with respect to the actual concentration of the coagulation factor.
  • the middle right figure shows a logarithmic plot of the measured concentration and the calculated concentration.
  • FIG. 43L is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the concentrations of various coagulation factors and the logarithm of vTe80%.
  • the middle left figure shows a plot of the calculated concentration based on the calibration curve with respect to the actual concentration of the coagulation factor.
  • the middle right figure shows a logarithmic plot of the measured concentration and the calculated concentration.
  • the upper diagram of FIG. 43M is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the concentrations of various coagulation factors and the logarithm of vTr20%.
  • the middle left figure shows a plot of the calculated concentration based on the calibration curve with respect to the actual concentration of the coagulation factor.
  • the middle right figure shows a logarithmic plot of the measured concentration and the calculated concentration.
  • the upper diagram of FIG. 43N is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the concentrations of various coagulation factors and the logarithm of vH95% / vB95%.
  • the middle left figure shows a plot of the calculated concentration based on the calibration curve with respect to the actual concentration of the coagulation factor.
  • the middle right figure shows a logarithmic plot of the measured concentration and the calculated concentration.
  • the upper diagram of FIG. 43O is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the concentrations of various coagulation factors and the logarithm of pH 5%.
  • the middle left figure shows a plot of the calculated concentration based on the calibration curve with respect to the actual concentration of the coagulation factor.
  • the middle right figure shows a logarithmic plot of the measured concentration and the calculated concentration.
  • the upper diagram of FIG. 43P is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the concentrations of various coagulation factors and the logarithm of pT50%.
  • the middle left figure shows a plot of the calculated concentration based on the calibration curve with respect to the actual concentration of the coagulation factor.
  • the middle right figure shows a logarithmic plot of the measured concentration and the calculated concentration.
  • FIG. 43Q is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the concentrations of various coagulation factors and the logarithm of pB70%.
  • the middle left figure shows a plot of the calculated concentration based on the calibration curve with respect to the actual concentration of the coagulation factor.
  • the middle right figure shows a logarithmic plot of the measured concentration and the calculated concentration.
  • the upper diagram of FIG. 43R is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the concentrations of various coagulation factors and the logarithm of pH 5% / pB5%.
  • the middle left figure shows a plot of the calculated concentration based on the calibration curve with respect to the actual concentration of the coagulation factor.
  • the middle right figure shows a logarithmic plot of the measured concentration and the calculated concentration.
  • the upper diagram of FIG. 43S is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the concentrations of various coagulation factors and the logarithm of pAUC90%.
  • the middle left figure shows a plot of the calculated concentration based on the calibration curve with respect to the actual concentration of the coagulation factor.
  • the middle right figure shows a logarithmic plot of the measured concentration and the calculated concentration.
  • the upper diagram of FIG. 43T is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the concentrations of various coagulation factors and the logarithm of mH20%.
  • the middle left figure shows a plot of the calculated concentration based on the calibration curve with respect to the actual concentration of the coagulation factor.
  • the middle right figure shows a logarithmic plot of the measured concentration and the calculated concentration.
  • the upper diagram of FIG. 43U is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the concentrations of various coagulation factors and the logarithm of mH20% / mB20%.
  • the middle left figure shows a plot of the calculated concentration based on the calibration curve with respect to the actual concentration of the coagulation factor.
  • the middle right figure shows a logarithmic plot of the measured concentration and the calculated concentration.
  • 43V is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the concentrations of various coagulation factors and the logarithm of mAUC30%.
  • the middle left figure shows a plot of the calculated concentration based on the calibration curve with respect to the actual concentration of the coagulation factor.
  • the middle right figure shows a logarithmic plot of the measured concentration and the calculated concentration.
  • the upper diagram of FIG. 43W is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the concentrations of various coagulation factors and the logarithm of vHa50%.
  • the middle left figure shows a plot of the calculated concentration based on the calibration curve with respect to the actual concentration of the coagulation factor.
  • the middle right figure shows a logarithmic plot of the measured concentration and the calculated concentration.
  • the upper diagram of FIG. 43X is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the concentrations of various coagulation factors and the logarithm of vTm50%.
  • the middle left figure shows a plot of the calculated concentration based on the calibration curve with respect to the actual concentration of the coagulation factor.
  • the middle right figure shows a logarithmic plot of the measured concentration and the calculated concentration.
  • the upper diagram of FIG. 43Y is a diagram showing an example of the relationship between the logarithm of the concentrations of various coagulation factors and the logarithm of RvH50% / RvB50%.
  • FIG. 44A is a diagram showing corrected linear curves of LA plasma with and without heating.
  • FIG. 44B is a diagram showing a corrected linear curve of Factor VIII inhibitor-positive plasma with and without heating.
  • FIG. 45A is a diagram showing a corrected linear curve of a mixed plasma of LA plasma and normal plasma (LA-NP) in the non-heated state and the warmed state.
  • FIG. 45B is a diagram showing a corrected primary curve of a mixed plasma (IN-NP) of factor VIII inhibitor-positive plasma and normal plasma in the non-heated state and the warmed state.
  • FIG. 46A is a diagram showing a value Pa in unheated plasma, a value Pb in warmed plasma, a ratio Pa / Pb thereof, and a difference Pb-Pa regarding APTT of various plasmas.
  • FIG. 46B is a diagram showing a value Pa in non-heated plasma, a value Pb in warmed plasma, a ratio Pa / Pb thereof, and a difference Pb-Pa regarding Vmax of various plasmas.
  • FIG. 46C is a diagram showing a value Pa in non-heated plasma, a value Pb in warmed plasma, a ratio Pa / Pb thereof, and a difference Pb-Pa regarding Amax of various plasmas.
  • FIG. 46A is a diagram showing a value Pa in unheated plasma, a value Pb in warmed plasma, a ratio Pa / Pb thereof, and a difference Pb-Pa regarding APTT of various plasmas.
  • FIG. 46B is a diagram showing a value Pa in non-heated
  • FIG. 46D is a diagram showing a value Pa in non-heated plasma, a value Pb in warmed plasma, a ratio Pa / Pb thereof, and a difference Pb-Pa for vB10% of various plasmas.
  • FIG. 46E is a diagram showing a value Pa in unheated plasma, a value Pb in warmed plasma, a ratio Pa / Pb thereof, and a difference Pb-Pa regarding vT10% of various plasmas.
  • FIG. 46F is a diagram showing a value Pa in non-heated plasma, a value Pb in warmed plasma, a ratio Pa / Pb thereof, and a difference Pb-Pa regarding vAB10% of various plasmas.
  • FIG. 46G is a diagram showing a value Pa in non-heated plasma, a value Pb in warmed plasma, a ratio Pa / Pb thereof, and a difference Pb-Pa with respect to vTB10% of various plasmas.
  • FIG. 47A is a diagram showing a corrected primary curve of “normal plasma” when the heating time is set to 0 minutes, 10 minutes, 30 minutes, and 120 minutes, respectively.
  • FIG. 47B is a diagram showing a corrected primary curve of “LA positive plasma” when the heating time is 0 minute, 10 minutes, 30 minutes, and 120 minutes, respectively.
  • FIG. 47C is a diagram showing a corrected primary curve of “Factor VIII inhibitor-positive plasma” when the heating time is 0 minute, 10 minutes, 30 minutes, and 120 minutes, respectively.
  • FIG. 47A is a diagram showing a corrected primary curve of “normal plasma” when the heating time is set to 0 minutes, 10 minutes, 30 minutes, and 120 minutes, respectively.
  • FIG. 47B is a diagram showing a
  • FIG. 47D is a diagram showing a corrected primary curve of “equal amount mixed plasma of LA-positive plasma and normal plasma” when the heating time is 0 minute, 10 minutes, 30 minutes, and 120 minutes, respectively.
  • FIG. 47E is a diagram showing a corrected linear curve of “equal volume mixed plasma of factor VIII inhibitor-positive plasma and normal plasma” when the heating time was 0 minute, 10 minutes, 30 minutes, and 120 minutes, respectively.
  • FIG. 48 shows various evaluation parameters obtained from the APTT measurement data of the sample after heating for 10 minutes, various evaluation parameters obtained from the APTT measurement data of the sample without heating treatment, and It is a figure which shows an example of the table which shows the result of having calculated the ratio of both various evaluation parameters.
  • FIG. 48 shows various evaluation parameters obtained from the APTT measurement data of the sample after heating for 10 minutes, various evaluation parameters obtained from the APTT measurement data of the sample without heating treatment, and It is a figure which shows an example of the table which shows the result of having calculated the ratio of both various evaluation parameters.
  • FIG. 49A is a diagram showing the results of a cross-mixing test relating to sample A of LA-positive plasma that has not been heated and has been heated at 37 ° C. for 10 minutes.
  • FIG. 49B is a diagram showing the results of a cross-mixing test relating to LA-positive plasma sample B without heating and after heating at 37 ° C. for 10 minutes.
  • FIG. 49C is a diagram showing the results of a cross-mixing test relating to sample C of LA-positive plasma that has not been heated and has been heated at 37 ° C. for 10 minutes.
  • FIG. 49D is a diagram showing the results of a cross-mixing test relating to sample D of LA-positive plasma that was not heated and was heated at 37 ° C. for 10 minutes.
  • FIG. 49A is a diagram showing the results of a cross-mixing test relating to sample A of LA-positive plasma that has not been heated and has been heated at 37 ° C. for 10 minutes.
  • FIG. 49B is a diagram showing the results
  • FIG. 49E is a diagram showing the results of a cross-mixing test relating to sample H of LA-positive plasma that was not heated and was heated at 37 ° C. for 10 minutes.
  • FIG. 49F is a diagram showing the results of a cross-mixing test relating to sample I of LA-positive plasma that has not been heated and has been heated at 37 ° C. for 10 minutes.
  • FIG. 49G is a diagram showing the results of a cross-mixing test relating to sample J of LA-positive plasma that has not been heated and has been heated at 37 ° C. for 10 minutes.
  • FIG. 49H is a diagram showing the results of a cross-mixing test relating to sample K of LA-positive plasma that has not been heated and that has been heated at 37 ° C. for 10 minutes.
  • FIG. 49I is a diagram showing the results of a cross-mixing test relating to sample O of LA-positive plasma after no heating treatment and after heating at 37 ° C. for 10 minutes.
  • FIG. 49J is a diagram showing a result of a cross-mixing test relating to a sample P of LA-positive plasma without heating and after heating at 37 ° C. for 10 minutes.
  • FIG. 49K is a diagram showing the results of a cross-mixing test involving sample Q of LA-positive plasma that has not been heated and that has been heated at 37 ° C. for 10 minutes.
  • FIG. 49L is a diagram showing the results of a cross-mixing test relating to sample R of LA-positive plasma that has not been heated and has been heated at 37 ° C. for 10 minutes.
  • FIG. 49I is a diagram showing the results of a cross-mixing test relating to sample O of LA-positive plasma after no heating treatment and after heating at 37 ° C. for 10 minutes.
  • FIG. 49J is a diagram showing
  • FIG. 50A is a diagram showing the results of a cross-mixing test involving Sample E of Factor VIII inhibitor-positive plasma that has not been heated and has been heated at 37 ° C. for 10 minutes.
  • FIG. 50B is a diagram showing the results of a cross-mixing test involving Sample F of Factor VIII inhibitor-positive plasma that has not been heated and has been heated at 37 ° C. for 10 minutes.
  • FIG. 50C is a diagram showing the results of a cross-mixing test involving Sample G of Factor VIII inhibitor-positive plasma that was not heated and was heated at 37 ° C. for 10 minutes.
  • FIG. 50D is a diagram showing the results of a cross-mixing test involving Sample L of Factor VIII inhibitor-positive plasma, which was not heated and was heated at 37 ° C.
  • FIG. 50E is a diagram showing the results of a cross-mixing test involving Sample M of Factor VIII inhibitor-positive plasma that has not been heated and has been heated at 37 ° C. for 10 minutes.
  • FIG. 50F is a diagram showing the results of a cross-mixing test involving Sample N of Factor VIII inhibitor-positive plasma that has not been heated and has been heated at 37 ° C. for 10 minutes.
  • FIG. 50G is a diagram showing the results of a cross-mixing test involving Sample S of Factor VIII inhibitor-positive plasma that has not been heated and has been heated at 37 ° C. for 10 minutes.
  • FIG. 50E is a diagram showing the results of a cross-mixing test involving Sample M of Factor VIII inhibitor-positive plasma that has not been heated and has been heated at 37 ° C. for 10 minutes.
  • FIG. 50F is a diagram showing the results of a cross-mixing test involving Sample N of Factor VIII inhibitor-positive plasma that has not been heated and has been heated at 37 ° C.
  • FIG. 50H is a diagram showing the results of a cross-mixing test involving Sample T of Factor VIII inhibitor-positive plasma that was not heated and after being heated at 37 ° C. for 10 minutes.
  • FIG. 50I is a diagram showing the results of a cross-mixing test involving Sample U of factor VIII inhibitor-positive plasma that has not been heated and has been heated at 37 ° C. for 10 minutes.
  • FIG. 51A is a diagram showing an example of APTT without heating treatment of a test plasma (single body) of each sample and after heating treatment at 37 ° C. for 10 minutes.
  • FIG. 51B is a diagram showing an example of APTT without heating treatment of a mixed plasma of test plasma and normal plasma of each sample and after heating treatment at 37 ° C. for 10 minutes.
  • FIG. 52A is a diagram showing an example of a corrected linear curve without heating treatment of an equal amount mixed plasma of LA-positive plasma sample A and normal plasma and after heating treatment at 37 ° C. for 10 minutes.
  • FIG. 52B is a diagram showing an example of a corrected primary curve without heating treatment of an equal amount mixed plasma of LA-positive plasma sample B and normal plasma and after heating treatment at 37 ° C. for 10 minutes.
  • FIG. 52C is a diagram showing an example of a corrected linear curve without heating treatment of an equal amount mixed plasma of LA-positive plasma sample C and normal plasma and after heating treatment at 37 ° C. for 10 minutes.
  • FIG. 52A is a diagram showing an example of a corrected linear curve without heating treatment of an equal amount mixed plasma of LA-positive plasma sample A and normal plasma and after heating treatment at 37 ° C. for 10 minutes.
  • FIG. 52D is a diagram showing an example of a corrected linear curve without heating treatment of an equal amount mixed plasma of LA-positive plasma sample D and normal plasma and after heating treatment at 37 ° C. for 10 minutes.
  • FIG. 52E is a diagram showing an example of a corrected linear curve after heating treatment of equal volume mixed plasma of LA-positive plasma sample H and normal plasma without heating treatment and at 37 ° C. for 10 minutes.
  • FIG. 52F is a diagram showing an example of a corrected linear curve after heating treatment of an equal amount mixed plasma of LA-positive plasma sample I and normal plasma without heating treatment and at 37 ° C. for 10 minutes.
  • FIG. 52G is a diagram showing an example of a corrected linear curve after heating treatment of an equal amount mixed plasma of LA-positive plasma sample J and normal plasma without heating and at 37 ° C.
  • FIG. 52H is a diagram showing an example of a corrected linear curve after heating treatment of equal amount mixed plasma of LA-positive plasma sample K and normal plasma without heating treatment and at 37 ° C. for 10 minutes.
  • FIG. 52I is a diagram showing an example of a corrected linear curve after heating treatment of equal amount mixed plasma of sample O of LA positive plasma and normal plasma and after heating treatment at 37 ° C. for 10 minutes.
  • FIG. 52J is a diagram showing an example of a corrected linear curve without heating treatment of an equal amount mixed plasma of LA-positive plasma sample P and normal plasma and after heating treatment at 37 ° C. for 10 minutes.
  • FIG. 52H is a diagram showing an example of a corrected linear curve after heating treatment of equal amount mixed plasma of LA-positive plasma sample K and normal plasma without heating treatment and at 37 ° C. for 10 minutes.
  • FIG. 52I is a diagram showing an example of a corrected linear curve after heating treatment of equal amount mixed plasma of sample O of LA positive plasma and normal plasma and after heating treatment at 37 ° C. for 10 minutes.
  • 52K is a diagram showing an example of a corrected linear curve after heating treatment of an equal amount mixed plasma of LA-positive plasma sample Q and normal plasma without heating treatment and at 37 ° C. for 10 minutes.
  • FIG. 52L is a diagram showing an example of a corrected linear curve without heating treatment of an equal volume mixed plasma of LA-positive plasma sample R and normal plasma and after heating treatment at 37 ° C. for 10 minutes.
  • FIG. 53A is a diagram showing an example of a corrected linear curve without heating treatment of an equal amount mixed plasma of sample E of factor VIII inhibitor-positive plasma and normal plasma and after heating treatment at 37 ° C. for 10 minutes.
  • FIG. 53B is a diagram showing an example of a corrected linear curve after heating treatment of an equal amount mixed plasma of sample F of factor VIII inhibitor positive plasma and normal plasma after heating treatment at 37 ° C. for 10 minutes.
  • FIG. 53C is a diagram showing an example of a corrected primary curve without heating treatment of an equal amount mixed plasma of sample G of factor VIII inhibitor-positive plasma and normal plasma and after heating treatment at 37 ° C. for 10 minutes.
  • FIG. 53D is a diagram showing an example of a corrected linear curve without heating treatment of an equal volume mixed plasma of Factor L inhibitor positive plasma sample L and normal plasma and after heating treatment at 37 ° C. for 10 minutes.
  • FIG. 53E is a diagram showing an example of a corrected linear curve of a sample M of factor VIII inhibitor-positive plasma, which is not subjected to heating treatment of plasma mixed with an equal amount of normal plasma and after heating for 10 minutes at 37 ° C.
  • FIG. 53F is a diagram showing an example of a corrected linear curve after heating treatment of an equal amount mixed plasma of sample N of factor VIII inhibitor-positive plasma and normal plasma without heating treatment and at 37 ° C. for 10 minutes.
  • FIG. 53G is a diagram showing an example of a corrected linear curve of a sample S of factor VIII inhibitor-positive plasma that has not been heated and is heated at 37 ° C. for 10 minutes without heating the plasma in an equal amount.
  • FIG. 53H is a diagram showing an example of a corrected linear curve after heating treatment of an equal amount mixed plasma of sample T of factor VIII inhibitor-positive plasma and normal plasma and after heating treatment at 37 ° C. for 10 minutes.
  • FIG. 53I is a diagram showing an example of a corrected linear curve of a sample U of factor VIII inhibitor-positive plasma, which is not subjected to heating treatment of plasma mixed with an equal amount of normal plasma and after heating for 10 minutes at 37 ° C.
  • FIG. 54A shows the results of “flattening rate when the calculation target range value S is 10%” related to an equal mixture plasma of individual samples of LA-positive plasma and normal plasma, without heating treatment and after 10 minutes heating treatment.
  • FIG. 54B shows a heating process of “height of center of gravity when the calculation target range value S is 60%” and a heating process for 10 minutes, which relates to an equal amount mixed plasma of individual samples of LA-positive plasma and normal plasma.
  • FIG. 55A shows the "flattening rate when the calculation target threshold value S is 10%" relating to an equal amount mixed plasma of individual samples of LA-positive plasma and normal plasma, without heating treatment and after 10 minutes heating treatment.
  • FIG. 55B is a heating process without heating treatment and a 10-minute heating process for “height of the center of gravity when the calculation target range value S is 60%” relating to an equal amount mixed plasma of individual samples of LA-positive plasma and normal plasma.
  • FIG. 55C is a graph of "centroid time when the calculation target range value S is 60%" relating to an equal amount mixed plasma of individual samples of LA-positive plasma and normal plasma, without heating treatment and after 10 minutes heating treatment.
  • FIG. 56 is a diagram showing the results of a cross-mixing test relating to a sample of LA-positive plasma that has not been heated and that has been heated at 37 ° C. for 2 minutes.
  • FIG. 57 is a diagram showing the results of a cross-mixing test relating to LA-positive plasma samples after heating at 37 ° C. for 2 minutes and after heating for 10 minutes.
  • FIG. 58 is a diagram showing the results of a cross-mixing test involving samples of Factor VIII inhibitor-positive plasma that were not heated and were heated at 37 ° C. for 2 minutes.
  • FIG. 59 is a diagram showing the results of a cross-mixing test involving samples of Factor VIII inhibitor-positive plasma after heating at 37 ° C. for 2 minutes and after heating for 10 minutes.
  • FIG. 60 is a diagram showing an example of a corrected linear curve without heating treatment of an equal amount mixed plasma of LA positive plasma sample and normal plasma and after heating treatment at 37 ° C. for 2 minutes.
  • FIG. 61 is a diagram showing an example of a corrected linear curve after heating treatment of equal volume mixed plasma of a sample of factor VIII inhibitor positive plasma and normal plasma without heating treatment and after heating treatment at 37 ° C.
  • FIG. 62 shows various evaluation parameters obtained from APTT measurement data of a sample after heating for 2 minutes, various evaluation parameters obtained from APTT measurement data of a sample without heating treatment, and It is a figure which shows an example of the table which shows the result of having calculated the ratio of both various evaluation parameters.
  • FIG. 63A is a diagram showing a difference (Pb-Pa) and a ratio (Pb / Pa) between unheated plasma and warmed plasma with respect to APTT time (T50) and Vmax of mixed plasma.
  • LA Mixed plasma of LA positive plasma and normal plasma
  • Inhibitor Mixed plasma of factor VIII inhibitor positive plasma and normal plasma.
  • FIG. 63B is a diagram showing the difference (Pb-Pa) and the ratio (Pb / Pa) between non-warmed plasma and warmed plasma for vAB40% and vABa40% of mixed plasma (LA and Inhibitor).
  • FIG. 63C is a diagram showing a difference (Pb-Pa) and a ratio (Pb / Pa) between unheated plasma and heated plasma for vH40% and vHa40% of mixed plasma (LA and Inhibitor).
  • FIG. 63D is a diagram showing a difference (Pb-Pa) and a ratio (Pb / Pa) between unheated plasma and warmed plasma for vAUC90% and vW10% / vB10% of mixed plasma (LA and Inhibitor).
  • FIG. 63E is a diagram showing a difference (Pb-Pa) and a ratio (Pb / Pa) between unheated plasma and warmed plasma for pAUC80% and mAUC20% of mixed plasma (LA and Inhibitor).
  • the present invention relates to a method for analyzing coagulation characteristics of a blood sample by applying waveform analysis.
  • the present invention also relates to shortening the test time of the blood coagulation test.
  • the present invention excellent analysis of the coagulation characteristics of a blood sample can be realized.
  • the inspection time of the cross mixing test can be shortened.
  • the heating time can be shorter than 2 hours, for example, 10 minutes.
  • the present embodiments relate to analyzing the properties of analytes associated with blood coagulation.
  • the activated partial thromboplastin time (APTT) measurement used for the examination of intrinsic coagulation function is performed and the obtained data is analyzed. It can be similarly applied to analysis of data obtained by measurement of other test items using a coagulation reaction curve including prothrombin time (PT) used for testing extrinsic coagulation function.
  • APTT activated partial thromboplastin time
  • PT prothrombin time
  • Analysis method 1.1 Outline of Analysis Method
  • the outline of the analysis method according to the present embodiment will be described with reference to the flowchart shown in FIG.
  • a sample used for the inspection is prepared (step S101).
  • the coagulation time is measured for the prepared sample (step S102). Examples of measurement of coagulation time include measurement of APTT and PT.
  • a predetermined analysis is performed on the data obtained by measuring the coagulation time (step S103).
  • the blood coagulation function of the sample is evaluated based on the analysis result (step S104).
  • sample Preparation and Coagulation Time Measurement The sample preparation performed in step S101 and the coagulation time measurement performed in step S102 will be described. Here, the measurement of the coagulation time will be described by taking the measurement of APTT as an example.
  • the sample to be tested is, for example, a blood sample derived from a subject who is required to test for abnormalities caused by coagulation factors. More specifically, the blood plasma of a subject is used as the blood sample.
  • a well-known anticoagulant usually used for a coagulation test may be added to the blood sample.
  • blood can be collected using a blood collection tube containing sodium citrate, and plasma can be immediately centrifuged.
  • a contact factor activator and phospholipid are added to the test plasma.
  • the activator ellagic acid, celite, kaolin, silica, polyphenol compound and the like can be used.
  • animal-derived, plant-derived, or synthetic-derived phospholipid is used. Examples of animal-derived phospholipids include those derived from rabbit brain, chicken, and pig. Examples of plant-derived phospholipids include those derived from soybean. Further, a buffer solution such as Tris-hydrochloric acid may be appropriately added.
  • APTT In order to measure APTT, a commercially available APTT measurement reagent, a reagent kit, or the like can be used.
  • APTT-N manufactured by Sekisui Medical Co., Ltd.
  • Coagpia APTT-N manufactured by Sekisui Medical Co., Ltd.
  • the sample in which the activator and phospholipid are added to the above-mentioned test plasma is heated and the contact factor in the plasma is activated.
  • the temperature condition is, for example, 30 ° C. or higher and 40 ° C. or lower, preferably 35 ° C. or higher and 39 ° C. or lower.
  • the coagulation reaction of the mixed solution after addition of the calcium chloride solution can be measured.
  • an optical method of measuring the scattered light amount of light or the transmittance (or absorbance) may be used, or a mechanical method of measuring the viscosity of plasma may be used.
  • the measured time is, for example, several tens of seconds to 5 minutes, starting from the timing of adding the final reagent. During this period, the measurement is repeatedly performed, for example, periodically. For example, if it is an optical method, photometry may be performed at a cycle of 0.1 second.
  • the time when the calcium chloride solution is added can be set as the reaction start time. Other timings may be defined as the reaction start time.
  • the temperature condition during measurement is, for example, 30 ° C. or higher and 40 ° C. or lower, and preferably 35 ° C. or higher and 39 ° C. or lower.
  • the above measurement may be performed using a device that can automatically perform a series of measurements.
  • An example of such an apparatus is an automatic blood coagulation analyzer CP3000 (manufactured by Sekisui Medical Co., Ltd.).
  • some operations may be performed manually.
  • the sample may be prepared manually and the measurement may be carried out by an optical analyzer.
  • various conditions can be set appropriately depending on the mixing method and the measuring method.
  • FIG. 2 is a flowchart showing an outline of data analysis.
  • step S201 the data to be analyzed is acquired.
  • This data is data obtained by blood coagulation measurement, for example, data reflecting the coagulation reaction process obtained by APTT measurement described above.
  • a calcium chloride solution is added to a sample in which an activator and a phospholipid are added to test plasma, and data showing the time change of the scattered light amount after that is acquired.
  • the data analysis may be performed immediately after the measurement, or may be performed later on the data measured and stored in advance.
  • Fig. 3 shows an example of the acquired data.
  • the horizontal axis represents the elapsed time after the calcium chloride solution was added
  • the vertical axis represents the scattered light amount. Since the coagulation reaction of the mixed solution proceeds with the passage of time, the amount of scattered light increases. In the present embodiment, such a curve indicating the time change of the measured light amount will be referred to as a coagulation reaction curve.
  • the example shown in Fig. 3 is the measurement result of the scattered light amount, and the coagulation reaction curve has a sigmoid shape, but when the transmitted light amount is measured, the coagulation reaction curve has an inverse sigmoid shape.
  • the case where the scattered light amount is measured is shown as an example, but the same process can be performed when the transmitted light amount and the absorbance are measured.
  • Data indicating the amount of coagulation reaction obtained by other methods, including the method of obtaining the coagulation reaction curve by the change in viscosity of the mixed liquid, may be analyzed.
  • the baseline adjustment includes smoothing processing and zero point adjustment.
  • FIG. 4 shows an example of data after performing the baseline adjustment on the data shown in FIG.
  • FIG. 5A shows an enlarged view of the data before the baseline adjustment shown in FIG.
  • FIG. 5B shows an enlarged view of the data after the baseline adjustment shown in FIG.
  • smoothing processing including noise removal is performed in the baseline adjustment.
  • any of various known methods for noise removal can be used.
  • the amount of scattered light at the start of measurement is larger than zero. This is because the mixed solution containing the test plasma originally scatters light. In the baseline adjustment, the amount of scattered light at the start of measurement is adjusted to 0 as shown in FIG.
  • step S203 correction processing is performed on the data after the baseline adjustment.
  • the correction is performed so that the maximum value of the coagulation reaction curve after the baseline adjustment becomes 100.
  • FIG. 6 shows the result of performing the correction process on the data shown in FIG.
  • the coagulation reaction curve after the baseline adjustment will be expressed as D (t).
  • the maximum value of D (t) is Dmax
  • the minimum value of D (t) is Dmin.
  • the change width of D (t), that is, Dmax-Dmin is set as Drange.
  • P (t) [(D (t) -Dmin) / Drange] ⁇ 100 (1)
  • the coagulation reaction curve obtained from the corrected data will be referred to as the corrected coagulation reaction curve.
  • the purpose of this correction processing is as follows.
  • the height of the coagulation reaction curve after the baseline adjustment depends on the fibrinogen concentration of the sample. Fibrinogen levels vary from individual to individual and can vary from sample to sample.
  • the coagulation waveform parameter that does not depend on the fibrinogen concentration can be obtained. That is, with this correction, it becomes possible to quantitatively compare the difference in the shape of the coagulation reaction curve after the baseline adjustment between the samples. It should be noted that although the value after correction is corrected here to be 0 to 100, other values may be used. Further, this correction process does not necessarily have to be performed.
  • step S204 a differential curve obtained by differentiating the coagulation reaction curve is calculated.
  • FIG. 7 shows a first derivative curve obtained by performing a process corresponding to the first derivative on the corrected coagulation reaction curve shown in FIG. 6. The method of calculating the first derivative curve will be described in detail later.
  • the first derivative of the corrected coagulation reaction curve (corrected first derivative) is the change width per time when the total reaction change width is 100, and can be called the coagulation reaction progress rate (coagulation progress rate).
  • the coagulation progress rate is 100 when integrated over the entire area.
  • the first-order derivative of the coagulation reaction curve that has not been subjected to the correction process indicates the value of the actually measured reaction change width per unit time, which indicates the coagulation rate.
  • the second derivative curve as shown in FIG. 8 may be obtained by further differentiating the first derivative curve of the corrected coagulation reaction curve shown in FIG. 7. Further, the second derivative curve indicating the coagulation acceleration may be acquired by further differentiating the first derivative curve of the coagulation reaction curve without the correction process.
  • the correction-processed coagulation reaction curve and the correction-free coagulation reaction curve are also referred to as a corrected 0th-order curve and an uncorrected 0th-order curve, respectively, and are collectively referred to as a “0th-order curve”. Also called.
  • the first-order differential curves of the corrected zero-order curve and the uncorrected zero-order curve are referred to as a corrected first-order curve and an uncorrected first-order curve, respectively, and are collectively referred to as “1. It is also called the "second curve".
  • the second derivative curve of the corrected zero-order curve and the uncorrected zero-order curve, or the corrected first-order curve and the first-order derivative curve of the uncorrected first-order curve are respectively corrected by It is also called a secondary curve and an uncorrected quadratic curve, and these are also collectively referred to as a “quadratic curve”.
  • the coagulation progress rate, the coagulation rate, and other values indicating the progress of coagulation are collectively referred to as the first-order differential value.
  • the matters described by taking the rate of coagulation progress or the rate of coagulation as an example can be similarly applied to the general first derivative.
  • values representing the rate of change of coagulation acceleration and other primary differential values are collectively referred to as secondary differential values.
  • step S205 various evaluation parameters are calculated.
  • the evaluation parameter is a parameter indicating the blood coagulation characteristic of the sample. The evaluation parameters will be described later in detail.
  • the coagulation reaction curve of the abnormal coagulation sample in which the coagulation time is remarkably delayed becomes gentler than that of the normal sample, and the shape of the coagulation reaction curve at the end of the reaction also becomes a gentle plateau.
  • the difference between A (n) and A (n-1) is small, the value of B (n) becomes small even near the maximum value of the linear curve.
  • Such a state is a state in which the S / N ratio is deteriorated and is easily affected by noise in numerical calculation, and the information due to the coagulation reaction is easily buried in the noise.
  • the calculation result of the first derivative using the above equation (2) may be a discrete value.
  • the blood coagulation reaction curve obtained by photometry performed every 0.1 seconds consider obtaining the first-order differential value for the n-th value as the difference value between the n-th value and the (n-1) th value. .
  • the obtained first derivative curve may have discrete values.
  • the fibrinogen concentration is low
  • the height of the coagulation reaction curve is low.
  • One possible solution is to shorten the measurement time interval and increase the measurement sensitivity. However, shortening the measurement time interval may increase the cost of the apparatus and may not be preferable.
  • An average slope value is obtained for each measurement point N in the coagulation reaction curve that has not been subjected to correction processing or has been subjected to correction processing.
  • Measurement data within a certain period of time can be used to calculate the average slope value. That is, a certain number of measurement data before and after each measurement point N, for example, 2K + 1 measurement data from N ⁇ K to N + K can be used. For example, N-2, N-1, N, N + 1, N + 2 5th measurement data can be utilized.
  • the average slope value means a slope value when these plural measurement points are linearly approximated.
  • a well-known method such as the least square method can be used for the calculation method of the linear approximation.
  • the average slope value of these measurement data can be regarded as the first derivative value at the measurement point N.
  • the average slope a within the section is expressed by the following equation (4).
  • the intra-section average slope a can be calculated.
  • evaluation parameters are calculated based on the 0th-order curve, the 1st-order curve, and the 2nd-order curve. The parameters will be described.
  • the coagulation time which is one of the evaluation parameters of the present embodiment, will be described with reference to the coagulation reaction curve after the baseline adjustment shown in FIG.
  • the point at which the amount of change in the scattered light amount in the coagulation reaction curve after the baseline adjustment satisfies a predetermined condition is set as the coagulation end determination point Te.
  • the point at which the amount of change in the scattered light amount per unit time becomes equal to or less than a predetermined value is set as the solidification end determination point Te.
  • the reaction elapsed time corresponding to the amount of scattered light c% is defined as the solidification time Tc.
  • the reaction elapsed time corresponding to a scattered light amount of 50% is set as the coagulation time T50.
  • Tc the coagulation time Tc
  • the method for determining the coagulation time Tc is not limited to this method. Clotting time may be defined by other methods. For example, the time at which the coagulation rate becomes maximum may be set as the coagulation time, or the reaction elapsed time T50 at which the corrected scattered light amount becomes 50% as shown in FIG. 6 may be set as the coagulation time Tc.
  • FIG. 10A shows an example of the corrected linear curve.
  • the maximum value Vmax of the corrected first derivative (coagulation progress rate) can also be an evaluation parameter.
  • the corrected linear curve is taken as an example, but the same applies to an uncorrected linear curve.
  • the maximum value of the solidification rate can also be an evaluation parameter.
  • the value of this S is the calculation target range.
  • the value will be referred to as S (%).
  • the calculation target threshold value S can be set to limit the peak range that reflects the characteristics of the peak shape of the linear curve. In order to limit the peak shape relatively widely, the calculation target threshold value S can be set to 5% to 20%. When the calculation target threshold value S is increased, the influence of the upper shape of the peak is relatively reflected in the analysis result. In order to analyze the shape of the upper part of the peak, the calculation target threshold value S can be set to 20% to 95%.
  • the calculation target threshold value S can be similarly applied to the solidification rate curve.
  • the threshold value S to be calculated can also be applied to a quadratic curve. As shown in FIG. 8, the quadratic curve has peaks in both the plus and minus directions.
  • the calculation target threshold value S can be set for each of the plus peak and the minus peak of the quadratic curve.
  • the time indicating the center of gravity is the center of gravity time vT. That is, the centroid time vT of the primary curve is the time from the reaction start time to the centroid, and is the x coordinate of the centroid in the graph as shown in FIG. 10A.
  • the primary differential value indicating the center of gravity is defined as the center of gravity height vH. That is, the height vH of the center of gravity of the primary curve is the y coordinate of the center of gravity in the graph as shown in FIG. 10A.
  • the center of gravity time vT and the center of gravity height vH are obtained as follows.
  • the integrated value M is represented by the following formula (5).
  • the center of gravity point, the center of gravity time vT, and the center of gravity height vH can be defined in the same manner. .. That is, the barycentric point, the barycentric time vT, and the barycentric height vH can be defined for the primary differential values including the coagulation rate and the corrected primary differential.
  • the center of gravity time vT and the center of gravity height vH can be evaluation parameters.
  • the t2 may be referred to as a region start time vTs and a region end time vTe (vTs ⁇ vTe), respectively (FIG. 10A).
  • FIG. 11 shows the relationship between the calculation target threshold value S, the range of the corrected 0th-order curve and the corrected 1st-order curve to be analyzed at that time, and the obtained center-of-gravity point for certain data.
  • the upper row, the interruption, and the lower row show the cases where the calculation target threshold value S is 10%, 50%, and 80%, respectively.
  • the left column shows the corrected 0th-order curve
  • the right column shows the corrected 1st-order curve and the center of gravity. The position of the center of gravity changes as shown in FIG. 11 along with the change of the calculation target threshold value S.
  • the center of gravity point, the center of gravity time, and the center of gravity height can be defined for the quadratic curve.
  • the time t [t1, ..., t2] (t1 ⁇ t2) is calculated, and the positive peak centroid time pT and the centroid height pH are calculated according to the above equations (5) to (7).
  • the position of the center of gravity changes as the calculation target threshold value S changes.
  • the minimum value and the maximum value of the reaction time at which the second derivative value at the plus peak of the quadratic curve is equal to or more than the threshold value S to be calculated are pTs and pTe, respectively, and F'in the time from pTs to pTe.
  • the peak width pB of the quadratic curve is the time length of (t) ⁇ S (value obtained by subtracting 1 from the number of data points of F ′ (t) ⁇ S multiplied by the photometric time interval).
  • the minimum value and the maximum value of the reaction time at which the secondary differential value at the negative peak of the quadratic curve is less than or equal to the calculation target threshold value S are mTs and mTe, respectively, and F'in the time from mTs to mTe.
  • the peak width mB of the negative peak of the quadratic curve is the time length of (t) ⁇ S (value obtained by subtracting 1 from the number of data points of F ′ (t) ⁇ S multiplied by the photometric time interval).
  • a further example of the parameter used in the present invention is the barycentric peak width vW.
  • vW is the peak width that satisfies the primary curve F (t) ⁇ vH (the time that F (t) ⁇ vH is satisfied from the minimum time to the maximum time that satisfies F (t) ⁇ vH. Long).
  • vTr is the width from vTs to vTe.
  • FIG. 10B shows the calculation target range (dotted line) of the linear curve when the calculation target range value S is 10%.
  • the center of gravity (vT, vH) black circles), vTs, and vTe are shown at the top of FIG.
  • FIG. 10B shows the peak width satisfying F ′ (t) ⁇ pH.
  • the peak width satisfying F ′ (t) ⁇ pH is defined as the barycentric peak width pW.
  • the width of the coagulation reaction time that satisfies F ′ (t) ⁇ mH is defined as the barycentric peak width mW.
  • FIG. 10C shows the positive peak centroid (pT, pH) and the negative peak centroid (mT, mH) of the quadratic curve when the calculation target threshold value S is 10%.
  • parameters used in the present invention include average time vTa, average height vHa, and area central time vTm.
  • FIG. 10D the average point (vTa, vHa) (white diamond), the center of gravity (vT, vH) (black circle), vTs, vTe, and vTm of the linear curve when the target threshold S is 10%. It is shown.
  • vTa, vHa, and vTm are respectively expressed by the following equations when the number of data points from F (vTs) to F (vTe) is n.
  • the area center time vTm for the plus and minus peaks of the quadratic curve can be obtained.
  • the flatnesses vAB, vABa, and the center-of-gravity peak width based on the peak width of the primary curve are used.
  • the flattening ratios vAW and vAWa based on are defined as in the following formulas (8a), (8b), (8c), and (8d).
  • vAB vH / vB (8a)
  • vAW vH / vW (8b)
  • vABa vHa / vB (8c)
  • vAWa vHa / vW (8d)
  • the time ratio vTB based on the peak width of the primary curve and the time ratio vTW based on the barycentric peak width are given below using the barycentric time vT, the peak width vB, and the barycentric peak width vW of the primary curve. It is defined as in equations (9a) and (9b).
  • vTB vT / vB (9a)
  • vTW vT / vW (9b)
  • vAB (vH / vB) K
  • vAB (vB / vH) K
  • vAW (vH / vW) K
  • vAW (vW / vH) K
  • vABa (vHa / vB) K
  • vABa (vB / vHa) K
  • vAWa (vHa / vW) K
  • vAWa (vW / vHa) K
  • vTB (vB / vT) K
  • vTW (vT / vW) K
  • vTW (vW / vT) K.
  • peak width vB, center of gravity peak width vW, average time vTa, average height vHa, region start time vTs, region end time vTe, region center time vTm, peak width vTr, flatness vAB, vAW, vABa, vAWa and time rates vTB and vTW are also parameters related to the center of gravity and can be evaluation parameters in the present invention.
  • the flatness ratio and time ratio as described above can be obtained for a quadratic curve.
  • the flatness pAB based on the peak width or the flatness pAW based on the center of gravity peak width can be obtained as the ratio of pH to pB or pW, while pT and pB or As a ratio with pW, the time rate pTB based on the peak width or the time rate pTW based on the center-of-gravity peak width can be obtained.
  • the flatness mAB based on the peak width or the flatness mAW based on the center-of-gravity peak width can be obtained as the ratio of mH and mB or mW, while mT and mB
  • the time rate mTB based on the peak width or the time rate mTW based on the center-of-gravity peak width can be obtained as a ratio with mW.
  • each parameter may be displayed with the calculation target range value S from which it is derived.
  • the parameters related to the center of gravity of the primary curve when S is x (%) may be referred to as vHx, vTx, vBx, vWx and the like.
  • the parameters vH, vT, vB, vW, vTa, vHa, vTs, vTe, vTm, vTr, vAB, vAW, vABa, vAWa, vTB, vTW related to the center of gravity of the linear curve when S is 10%.
  • 12A and 12B show each parameter when the calculation target range value S is different for the same linear curve.
  • 12A shows the case where the calculation target range value S is 10%
  • FIG. 12B shows the case where the calculation target range value S is 80%.
  • the centroid height vH10% of the primary curve is 0.4
  • the centroid time vT10% is 149 seconds
  • the peak width vB10% is 200 seconds.
  • the center of gravity height vH80% is 0.72
  • the center of gravity time vT80% is 119 seconds
  • the peak width vB80% is 78 seconds. ..
  • AUC area under the curve
  • PAUC AUC
  • mAUC AUC
  • vAUC, pAUC, and mAUC in the calculation target area where S is 5% are vAUC5%, pAUC5%, and mAUC5%, respectively.
  • further parameters other than the parameters related to the center of gravity described above may be included in the parameters used in the present invention.
  • the parameters include the above-mentioned coagulation time Tc, maximum first-order differential value Vmax, maximum second-order differential value Amax, minimum second-order differential value Amin, and VmaxT, AmaxT, AminT representing the time to reach them. Be done. These parameters can also be used as evaluation parameters.
  • the series of parameters described above may include a parameter derived from a corrected coagulation reaction curve (corrected 0th to quadratic curve) and a parameter derived from an uncorrected coagulation reaction curve (uncorrected 0th to 2nd curve).
  • the barycentric time, barycentric height, peak width, average time, average height, flattening ratio, time ratio, and AUC of the primary and quadratic curves are determined by setting the calculation target threshold value S.
  • the reflection result of the characteristics regarding may change.
  • the combination of the above parameters may reflect the characteristics related to blood coagulation.
  • the results of the four arithmetic operations of these parameters and other various operations may more significantly reflect the characteristics relating to blood coagulation.
  • coagulation time Tc center of gravity time vT, center of gravity height vH, peak width vB, center of gravity peak width vW, average time vTa, average height vHa, flatness vAB and vAW, vABa, vAWa, hour rate vTB or vTW, or Based on vAUC, or a combination thereof, coagulation factor deficiency status, presence of antiphospholipid antibodies such as lupus anticoagulant or anticardiolipin antibodies, presence of coagulation factor inhibitors, reduction of von Willebrand factor, etc. Characteristics relating to blood coagulation, such as the presence or absence of abnormality and the concentration of each component, can be determined.
  • a calibration curve can be created by acquiring the evaluation parameters of a sample in which the concentrations of components such as coagulation factors are known. Using this calibration curve, the concentrations of components such as coagulation factors can be calculated based on the measured and analyzed evaluation parameters of the patient sample.
  • the ratio or difference of the above parameters may show a correlation with the concentrations of components such as coagulation factors.
  • the ratio of the evaluation parameters include the flattening ratios vAB, vAW, vABa, vAWa, the time ratios vTB and vTW, and the region central time vTm described above.
  • the difference in the evaluation parameters include the difference between the coagulation time Tc and the center of gravity time vT, the difference between the peak width and the center of gravity peak width, and the difference between vTs at different S.
  • a calibration curve can be created by acquiring the ratio or difference between these parameters. Using this calibration curve, the concentrations of components such as coagulation factors can be calculated based on the measured and analyzed evaluation parameters of the patient sample.
  • the time rate vTB has a high correlation with the concentration of Factor VIII.
  • the calculation target threshold value S is set to 0% or more and 80% or less, preferably 5% or more and 80% or less, the flatness vAB has a high correlation with the concentration of factor VIII.
  • the oblateness vAB when the calculation target threshold value S is set to 70% has a high correlation with the concentration of factor VIII when the concentration is relatively high, and the calculation target threshold value S is 80%.
  • the oblateness vAB when set to% has a high correlation with the concentration of factor VIII when the concentration is relatively low.
  • evaluation parameters such as the maximum first derivative value Vmax, the maximum second derivative value Amax, and the times at which they reached VmaxT and AmaxT may show a correlation with the concentrations of components such as coagulation factors. Therefore, a calibration curve can be created by acquiring the evaluation parameters of a sample in which the concentrations of components such as coagulation factors are known. Using this calibration curve, the concentrations of components such as coagulation factors can be calculated based on the measured and analyzed evaluation parameters of the patient sample.
  • the coagulation time Tc and the center of gravity time vT may behave differently depending on the shape of the primary curve.
  • the shape of the primary curve of an abnormal coagulation sample does not have a single peak with one peak, but has two peaks with two peaks, or one of the two peaks is incomplete. It may take the shape of a shoulder that has a sharp peak. Due to such a shape of the primary curve, the difference d between the coagulation time Tc and the center of gravity time vT shown in FIG. 10A becomes large in the coagulation abnormality sample, for example. Therefore, a characteristic relating to blood coagulation such as the presence or absence of abnormality in blood coagulation can be determined based on this difference d.
  • the relationship between the center of gravity height vH or the center of gravity time vT and the maximum first-order differential value Vmax or the time indicating the maximum value may be variously changed according to the shape of the primary curve. Therefore, based on the relationship between the height of the center of gravity vH or the time of the center of gravity vT and the maximum first-order differential value Vmax or the time VmaxT indicating the maximum differential value Vmax, characteristics relating to blood coagulation such as the presence or absence and the degree of abnormality of blood coagulation can be determined.
  • the center of gravity height vHx or the center of gravity time vTx obtained by changing the target value S ( x (%)) in various ways, or the evaluation parameters such as the flatness rate vABx or the time rate vTBx obtained using these May exhibit properties such as clotting factors and other components involved in clotting function. Therefore, the characteristics related to blood coagulation such as the presence or absence and the degree of abnormality of blood coagulation can be determined based on the behavior of the evaluation parameter obtained by variously changing the calculation target range value x.
  • the various characteristics described above may differ depending on the type of coagulation factor or coagulation function-related component. Therefore, which coagulation factor or the like causes the abnormality can be discriminated based on the above-described evaluation parameters.
  • the time rate vTB 80% obtained when the target threshold value x is set to 80% is significantly reduced compared to when other coagulation factors are deficient. Therefore, the time rate vTB80% obtained when the calculation target threshold value x is set to 80% can be used for the determination of factor VIII deficiency.
  • the discrimination item regarding the coagulation factor and the parameters used for the discrimination include the following (the suffix x of the calculation target range value x added to the end is omitted): -T50, vH, vT, vTe, vTr, vTa, vHa, vTm, vB, vW, vAB, vTB, vAW, pH, pAB, pAW, pAUC, VmaxT, Amax, AmaxT, for factor VIII concentration mAUC, or a combination of two or more thereof.
  • the calculation target area S at this time is preferably 0.5 to 99%, more preferably 1 to 95%, further preferably 5 to 80%, further preferably 30 to 80%, and further preferably 30-70% or 50-80%.
  • the calculation target area S is 0.5 to 99%, more preferably 10 to 95%, and further preferably 10 to 80% when Vmax is 100%.
  • the above evaluation parameters may be obtained from a corrected 0th-order quadratic curve, or may be obtained from an uncorrected 0th-order quadratic curve.
  • the corrected zero-order curve makes the coagulation rate a relative value, but a certain blood coagulation abnormality is reflected in the magnitude of the coagulation rate. Therefore, some evaluation parameters, preferably parameters related to the coagulation rate, such as the height of the center of gravity, the average height, the oblateness, the AUC, etc., are uncorrected 0th to 2nd order rather than the corrected 0th to 2nd order curve.
  • the value obtained from the curve may better reflect the blood coagulation property.
  • the peak shape of the primary curve is often monomodal in normal samples, but it may be bimodal due to differences in the types of reagents and the effects of components involved in the coagulation function contained in the samples, or shoulders. It may become a curved line.
  • the maximum value of the coagulation rate is used as the evaluation parameter as in the techniques disclosed in Patent Documents 1 to 3, even if the coagulation rate curve does not actually have a monomodal shape, it is strong.
  • the maximum value of the solidification rate may be specified by obtaining a single-peaked solidification rate curve by smoothing treatment. However, such smoothing processing may cause loss of useful information included in the measurement data.
  • the analysis method according to the present embodiment does not need to perform excessive smoothing processing to the extent that necessary information is lost by using the evaluation parameter related to the center of gravity. Therefore, according to the analysis method of the present embodiment, it is possible to obtain the analysis result in which the states of various factors are reflected in detail.
  • Calculating the center of gravity includes calculation regarding the average. Therefore, the influence of random noise included in the measurement data can be reduced by calculation. Therefore, it is not necessary to excessively perform smoothing processing for noise removal, and a large amount of information is maintained. Further, this method is an analysis method having a good S / N ratio. In particular, the data relating to the linear curve or the quadratic curve is likely to be noisy, but the method using the center of gravity of the present method can also provide useful information from the data of the linear curve or the quadratic curve.
  • the calculation target range value S may be set variously, and a different center of gravity point may be calculated for each setting of the calculation target range value S. For example, if the calculation target range value S is changed from 0% to 99% for each 1%, 100 centroid points are obtained, and various evaluation parameters such as the centroid height vH are obtained for each centroid point. Further, as described above, the combination of these evaluation parameters can also be useful information. Therefore, much information can be obtained by using the center of gravity.
  • the coagulation reaction curve which is the data from which the center of gravity is obtained in this embodiment, is routinely measured in clinical settings, such as APTT measurement. Therefore, the analysis according to the present embodiment can be easily used in the clinical field simply by introducing the data analysis method.
  • a parameter such as the maximum value (Vmax) of the primary curve is a parameter that represents a certain point in the primary differential value
  • the center of gravity is a parameter that reflects data with a wide range with respect to the time axis. Is. Therefore, for example, even data asymmetric with respect to the time axis can be a parameter indicating the asymmetry.
  • step S203 the correction process shown as step S203 is performed.
  • this correction processing it becomes possible to cancel the difference in the magnitude of the fibrinogen concentration for each sample, and to quantitatively compare the difference in the shape of the coagulation reaction curve between the samples.
  • the average slope in the section shown by the above formula (4) is used. According to this method, more detailed information can be obtained than in the case of using the difference method shown in the above equation (2). In particular, a good S / N ratio can be obtained even when the amount of change in the value on the coagulation reaction curve is small.
  • a further aspect of the present invention is, Preparing mixed plasma in which test plasma and normal plasma are mixed, Performing coagulation time measurement without heating the mixed plasma, Performing coagulation time measurement after the heating treatment of the mixed plasma, Calculating a first parameter related to the coagulation reaction state based on the coagulation time measurement data of the mixed plasma without heating. Calculating a second parameter related to the coagulation reaction state based on the coagulation time measurement data after the heating treatment of the mixed plasma; Differentiating a factor of prolongation of the coagulation time based on a ratio or a difference between the first parameter and the second parameter; And a method for analyzing coagulation characteristics of a blood sample.
  • the present embodiments relate to analyzing the properties of analytes associated with blood coagulation.
  • the APTT measurement used for the examination of the intrinsic coagulation function is performed, the obtained data is analyzed, and the factor of APTT prolongation is identified.
  • a sample used for inspection is prepared (step S101).
  • plasma of the sample test plasma
  • normal plasma normal plasma
  • the APTT measurement without heating treatment of the mixed plasma and the APTT measurement after the heating treatment of the mixed plasma are performed on the prepared sample (step S102).
  • step S103 a predetermined analysis is performed on the data obtained by the APTT measurement.
  • the first parameter is calculated from the result of the APTT measurement of the mixed plasma without heating
  • the second parameter is calculated from the result of the APTT measurement of the mixed plasma after the heating.
  • the blood coagulation function of the sample is evaluated based on the analysis result (step S104).
  • the factor of APTT prolongation is discriminated based on the ratio or difference between the calculated first parameter and the calculated second parameter, for example, the presence or absence of an inhibitor is discriminated. For example, if the ratio of the first parameter to the second parameter does not fall within a predetermined range including 1, it is determined that the factor of APTT prolongation is due to the effect of the inhibitor, such as the presence of the inhibitor. , If the ratio of the first parameter and the second parameter falls within a predetermined range including 1, the factor of APTT prolongation is not the effect of the inhibitor but the presence of LA, etc. Determined to be due to influence.
  • the difference between the first parameter and the second parameter does not fall within a predetermined range including 0, it is determined that the factor of APTT prolongation is due to the influence of the inhibitor, and the first parameter and the second parameter
  • the difference from the parameter is within a predetermined range including 0
  • it is determined that the factor of APTT prolongation is not the effect of the inhibitor but the effect of LA or the like.
  • the influence of the inhibitor or LA can be changed not only by the presence or absence of the inhibitor or LA, but also by the amount of these inhibitors.
  • sample preparation performed in step S101 and the APTT measurement performed in step S102 will be described.
  • the sample to be tested is 1.2.
  • the test plasma and the separately prepared normal plasma are mixed at a predetermined volume ratio.
  • part of the APTT measurement is carried out immediately and part of the APTT measurement is carried out after heating for a predetermined time.
  • the temperature for heating is, for example, 30 ° C. or higher and 40 ° C. or lower, preferably 35 ° C. or higher and 39 ° C. or lower, and more preferably 37 ° C.
  • the heating time may be, for example, in the range of 2 to 30 minutes, preferably 5 to 30 minutes. In one example, it is about 2 to 10 minutes.
  • the heating time may be longer such as 30 minutes and 1 hour, but is preferably 1 hour or less, and 2 hours or less at the maximum.
  • the basic procedure for APTT measurement of unheated or warmed mixed plasma is described in 1.2.
  • the mixed plasma obtained by the above heating treatment is also referred to as “warmed plasma”.
  • the mixed plasma that has not been subjected to the heating treatment is also referred to as “non-heated plasma”.
  • the “non-heated plasma” may be subjected to a heating treatment of the sample in the usual coagulation reaction measurement, for example, heating at 30 ° C. or higher and 40 ° C. or lower for 1 minute or less.
  • the coagulation time is about 1 in the mixed plasma of LA-positive plasma and normal plasma, whereas the ratio (Pb / Pa) is about 1 in the mixed plasma of factor VIII inhibitor-positive plasma and normal plasma. (Pb / Pa) is obviously larger than 1.
  • the maximum value Vmax of the corrected first derivative is such that the ratio (Pb / Pa) is approximately 1 in the mixed plasma of LA-positive plasma and normal plasma, whereas the maximum value Vmax of the factor-VIII inhibitor-positive plasma and normal plasma is In the mixed plasma of, the ratio (Pb / Pa) is clearly smaller than 1.
  • the peak width vB has a ratio (Pb / Pa) of about 1 in the mixed plasma of LA-positive plasma and normal plasma, whereas in the mixed plasma of Factor VIII inhibitor-positive plasma and normal plasma, The ratio (Pb / Pa) is clearly greater than 1.
  • the flattening ratio vAW of the mixed plasma of LA-positive plasma and normal plasma has a ratio (Pb / Pa) of about 1, while that of the mixed plasma of factor VIII inhibitor-positive plasma and normal plasma is The ratio (Pb / Pa) is clearly smaller than 1.
  • the center of gravity time vT is about 1 in the mixed plasma of LA-positive plasma and normal plasma, whereas in the mixed plasma of Factor VIII inhibitor-positive plasma and normal plasma, the ratio (Pb / Pa) is about 1.
  • the ratio (Pb / Pa) is clearly greater than 1.
  • the center-of-gravity height vH is about 1 in the mixed plasma of LA-positive plasma and normal plasma, whereas in the mixed plasma of Factor VIII inhibitor-positive plasma and normal plasma, the ratio (Pb / Pa) is about 1. , The ratio (Pb / Pa) is clearly smaller than 1.
  • the time rate vTW is about 1 in the mixed plasma of LA-positive plasma and normal plasma
  • the ratio (Pb / Pa) is about 1 in the mixed plasma of Factor VIII inhibitor-positive plasma and normal plasma.
  • the ratio (Pb / Pa) becomes smaller than 1.
  • any of the above-described evaluation parameters may be used, any combination of these may be used, or any combination of these and other evaluation parameters may be used.
  • the results of the above four arithmetic operations between the evaluation parameters and other various operations may reflect whether the sample of the subject is LA-positive or factor VIII inhibitor-positive.
  • this method can be said to be a method for determining whether the prolonger factor of APTT is an inhibitor, LA, or a factor deficiency.
  • the calculation target threshold value S set in the analysis can be set to various values.
  • the heating treatment time can be variously set.
  • the heating time is preferably 2 minutes or more and 30 minutes or less within 2 hours, more preferably about 10 minutes.
  • the mixing ratio of the mixed plasma is not limited to 1: 1 and may be another ratio.
  • the heating time of the sample can be shortened.
  • an index such as a ratio or difference of evaluation parameters.
  • FIG. 13 is a block diagram showing an outline of a configuration example of the automatic analyzer 1 according to the present embodiment.
  • the automatic analyzer 1 includes a control unit 10, a measurement unit 30, and a touch screen 90.
  • the control unit 10 controls the entire operation of the automatic analyzer 1.
  • the control unit 10 is composed of, for example, a personal computer (PC).
  • the control unit 10 includes a CenTral Processing Unit (CPU) 12, a Random Access Memory (RAM) 14, a Read Only Memory (ROM) 16, a storage 18, and a communication interface (I) that are connected to each other via a bus line 22. / F) 20.
  • the CPU 12 performs various signal processing and the like.
  • the RAM 14 functions as the main storage device of the CPU 12.
  • the ROM 16 stores various startup programs and the like.
  • a Hard Disk Drive (HDD), Solid StaTe Drive (SSD), or the like can be used for the storage 18.
  • Various information such as programs and parameters used by the CPU 12 is recorded in the storage 18.
  • the data acquired by the measurement unit 30 is recorded in the storage 18.
  • the RAM 14 and the storage 18 are not limited to this, and may be replaced with various storage devices.
  • the control unit 10 communicates with external devices such as the measurement unit 30 and the touch screen 90 via the communication I / F 20.
  • the touch screen 90 includes a display device 92 and a touch panel 94.
  • the display device 92 may include, for example, a liquid crystal display (LCD) or an organic EL display.
  • the display device 92 displays various screens under the control of the control unit 10. This screen may include various screens such as an operation screen of the automatic analyzer 1, a screen showing measurement results, and a screen showing analysis results.
  • the touch panel 94 is provided on the display device 92. The touch panel 94 acquires an input from the user and transmits the obtained input information to the control unit 10.
  • the control unit 10 may be connected to other devices such as a printer, a handy code reader, and a host computer via the communication I / F 20.
  • the measurement unit 30 includes a control circuit 42, a data processing circuit 44, a constant temperature bath 52, a reaction container 54, a light source 62, a scattered light detector 64, a transmitted light detector 66, a sample container 72, and a reagent.
  • a container 74, a sample probe 76, and a reagent probe 78 are provided.
  • the control circuit 42 controls the operation of each part of the measurement unit 30 based on a command from the control unit 10. Although not shown, the control circuit 42 is connected to the data processing circuit 44, the constant temperature bath 52, the light source 62, the scattered light detector 64, the transmitted light detector 66, the sample probe 76, the reagent probe 78, etc. Control the behavior of.
  • the data processing circuit 44 is connected to the scattered light detector 64 and the transmitted light detector 66, and acquires detection results from the scattered light detector 64 and the transmitted light detector 66.
  • the data processing circuit 44 performs various types of processing on the acquired detection result and outputs the processing result.
  • the processing performed by the data processing circuit 44 includes, for example, A / D conversion processing for changing the format of data output from the scattered light detector 64 and the transmitted light detector 66 into a format that can be processed by the control unit 10. Can be
  • the control circuit 42 and the data processing circuit 44 may include, for example, a CPU, an application-specific integrated circuit (ASIC), a field programmable gate array (FPGA), or the like.
  • the control circuit 42 and the data processing circuit 44 may each be configured by one integrated circuit or the like, or may be configured by combining a plurality of integrated circuits or the like. Further, the control circuit 42 and the data processing circuit 44 may be configured by one integrated circuit or the like.
  • the operations of the control circuit 42 and the data processing circuit 44 can be performed, for example, according to a program recorded in a storage device or a recording area in the circuit.
  • the sample container 72 stores a sample such as blood of a patient.
  • the reagent container 74 accommodates various reagents used for measurement. Any number of sample containers 72 and reagent containers 74 may be provided. Since there are usually a plurality of types of reagents used for the test, there are generally a plurality of reagent containers 74.
  • the sample probe 76 dispenses the sample contained in the sample container 72 into the reaction container 54 under the control of the control circuit 42.
  • the reagent probe 78 dispenses the reagent contained in the reagent container 74 into the reaction container 54 under the control of the control circuit 42.
  • the number of specimen probes 76 and reagent probes 78 may be any number.
  • the constant temperature bath 52 maintains the temperature of the reaction container 54 at a predetermined temperature under the control of the control circuit 42.
  • the mixed liquid in which the sample dispensed by the sample probe 76 and the reagent dispensed by the reagent probe 78 are mixed reacts.
  • the number of reaction vessels 54 may be any number.
  • the light source 62 emits light of a predetermined wavelength under the control of the control circuit 42.
  • the light source 62 may be configured to emit light having different wavelengths depending on the measurement conditions. Therefore, the light source 62 may have a plurality of light source elements.
  • the light emitted from the light source 62 is guided by, for example, an optical fiber and is applied to the reaction container 54.
  • the light with which the reaction container 54 is irradiated is partially scattered and partially transmitted depending on the components of the mixed liquid in the reaction container 54 and the distribution state of the components.
  • the scattered light detector 64 detects the light scattered by the reaction container 54, and detects the amount of light, for example.
  • the transmitted light detector 66 detects the light transmitted through the reaction container 54, and detects the amount of light, for example.
  • the data processing circuit 44 processes information on the amount of scattered light detected by the scattered light detector 64 and information on the amount of transmitted light detected by the transmitted light detector 66. Either of the scattered light detector 64 and the transmitted light detector 66 may operate depending on the measurement conditions. Therefore, the data processing circuit 44 processes either the information on the scattered light amount detected by the scattered light detector 64 or the information on the transmitted light amount detected by the transmitted light detector 66 according to the measurement condition. Good. The data processing circuit 44 sends the processed data to the control unit 10. Note that the measurement unit 30 shown in FIG. 13 includes the scattered light detector 64 and the transmitted light detector 66, but may include only one of them.
  • the control unit 10 performs various analyzes based on the data acquired from the measurement unit 30. This analysis includes calculation of the above-described evaluation parameters, evaluation of the subject based on the evaluation parameters, and the like.
  • the data processing circuit 44 may perform part or all of these analyzes.
  • the PC that controls the operation of the measurement unit 30 and the PC that performs data analysis and evaluation are the same control unit 10 is shown, but these may be separate entities.
  • the PC that receives the measurement results and analyzes and evaluates the data may exist as a single unit.
  • FIG. 14 is a diagram showing an outline of the operation of the control unit 10.
  • step S301 the control unit 10 determines whether the user has selected the setting mode.
  • the control unit 10 uses the touch panel 94 to detect that the setting mode is selected on the menu screen displayed on the display device 92 of the touch screen 90 as the selection by the user. If the setting mode is not selected, the process proceeds to step S303. When the setting mode is selected, the process proceeds to step S302.
  • step S302 the control unit 10 performs a setting process.
  • the control unit 10 executes various settings based on user input. For example, measurement conditions, subject information, reagent information, measurement parameters, analysis parameters, etc. are set.
  • the process proceeds to step S303.
  • step S303 the control unit 10 determines whether or not a measurement start instruction has been input. When the measurement start instruction has not been input, the process proceeds to step S306. When the instruction to start the measurement is input, the process proceeds to step S304.
  • step S304 the control unit 10 outputs a measurement start instruction to the measurement unit 30. Based on this instruction, the measurement unit 30 executes the operation related to the measurement processing described later. By this operation, the measurement using the measurement unit 30 is performed. Then, a process progresses to step S305.
  • step S305 the control unit 10 executes an analysis process described later. In the analysis process, the control unit 10 analyzes the data obtained by the measurement based on the setting. Then, a process progresses to step S306.
  • step S306 the control unit 10 determines whether another process has been selected. If no other process is selected, the process proceeds to step S308. If another process is selected, the process proceeds to step S307. In step S307, the control unit 10 performs the selected process. For example, the control unit 10 may perform another analysis based on the data stored in the storage 18. The control unit 10 may also output an instruction for maintenance of the measurement unit 30. Then, a process progresses to step S308.
  • step S308 the control unit 10 determines whether to end the process. For example, when the end of processing is input, it is determined to end the processing. When the process is not finished, the process returns to step S301. As a result, the above processing is repeated. When it is determined that the processing is to be ended, this processing is ended.
  • FIG. 15 is a flowchart showing an outline of the operation regarding the measurement performed by the measurement unit 30.
  • step S401 the control circuit 42 causes the sample probe 76 to suck the sample in the sample container 72 by a predetermined amount and then discharge it to the reaction container 54.
  • the temperature of the reaction container 54 is adjusted by the constant temperature bath 52 to a temperature according to the measurement conditions.
  • step S402 the control circuit 42 causes the reagent probe 78 to suck a predetermined amount of the reagent in the reagent container 74 and then discharge the reagent into the reaction container 54 to prepare a mixed liquid with the subject.
  • a plurality of reagents may be ejected, and various types may be ejected, depending on the type of test and the like.
  • the coagulation reaction of the mixed solution is started by discharging the reagent for starting the reaction.
  • step S403 the control circuit 42 causes each unit to start detection (photometry) of the reaction amount. That is, the control circuit 42 starts to irradiate the light source 62 with light having an appropriate wavelength according to the measurement conditions.
  • the control circuit 42 causes one or both of the scattered light detector 64 and the transmitted light detector 66 to start light detection according to the measurement conditions.
  • the scattered light detector 64 starts detecting scattered light in the reaction container 54.
  • the transmitted light detector 66 starts detecting transmitted light in the reaction container 54.
  • step S404 the control circuit 42 acquires detection data from the scattered light detector 64 or the transmitted light detector 66, whichever is necessary.
  • step S405 the control circuit 42 determines whether to end the measurement. For example, it is determined to end the measurement when a predetermined end condition is satisfied.
  • the termination condition may be, for example, that the elapsed time from the addition of the reagent reaches a predetermined time.
  • the process returns to step S404. In this way, data is continuously acquired at predetermined intervals, for example.
  • step S405 When it is determined in step S405 that the measurement should be ended, the process proceeds to step S406.
  • step S406 the control circuit 42 ends the measurement.
  • the control circuit 42 causes the light source 62 to stop emitting light.
  • the control circuit 42 causes the scattered light detector 64 and the transmitted light detector 66 to stop light detection.
  • step S407 the control circuit 42 causes the data processing circuit 44 to perform data processing on the acquired data.
  • step S408 the control circuit 42 transmits the processed data to the control unit 10. With that, the measurement process ends.
  • the analysis process shown here is to analyze the measurement data of the coagulation time such as APTT described above for the analysis target, calculate various evaluation parameters, and based on the obtained evaluation parameters, the presence or absence of blood coagulation abnormality. This is a process of analyzing characteristics related to blood coagulation.
  • the analysis target is 1.2. It may be a plasma to be tested as described above, or above 2.2. It may be a mixed plasma (warmed plasma and non-warmed plasma) as described above.
  • step S501 the control unit 10 acquires the measurement data of the coagulation time to be analyzed.
  • the data may be obtained from the measurement unit 30, for example.
  • the control unit 10 may obtain the measurement data from another device or the data stored in the storage device via, for example, a network or a medium.
  • step S502 the control unit 10 adjusts the baseline. In this baseline adjustment, the control unit 10 performs the process of step S202 described above.
  • step S503 the control unit 10 performs a data correction process. In this data correction process, the control unit 10 performs the process of step S203 described above.
  • step S504 the control unit 10 performs a calculation process of a differential curve such as a primary or quadratic curve. In this differential curve calculation process, the control unit 10 performs the process of step S204 described above.
  • step S505 the control unit 10 performs an evaluation parameter calculation process.
  • the control unit 10 performs the process of step S205 described above.
  • the control unit 10 calculates the non-heated plasma based on the calculated various evaluation parameters of the warmed plasma and the non-heated plasma. Calculate the ratio or difference between the first parameter of the and the second parameter from the warmed plasma.
  • the control unit 10 performs an evaluation process. In this evaluation process, the control unit 10 performs the process of step S104 described above to derive an evaluation result.
  • step S507 the control unit 10 records the evaluation result in the storage 18, causes the display device 92 to output the evaluation result, and transmits the evaluation result to the host computer.
  • the analysis according to this embodiment can be automatically performed by the automatic analyzer 1.
  • the parameters used in the following examples represent parameters derived from the corrected 0th-order quadratic curve unless otherwise specified.
  • the parameters derived from the uncorrected 0th to quadratic curves are represented by prefixing the name of each parameter with R.
  • R the height of the center of gravity of the corrected primary curve
  • RvH the height of the center of gravity of the uncorrected primary curve
  • RvT the time of the center of gravity of the corrected primary curve
  • RvT The time of center of gravity is represented by RvT.
  • Table 1 A list of parameters is shown in Table 1 below.
  • the B flattening rate, the W flattening rate, the B time rate, and the W time rate of the combined waveform parameter may be represented so that the content of the parameter calculation without the coefficient k can be understood.
  • Method 4.1.1 Method for measuring coagulation reaction of blood sample
  • a plurality of mixed samples in which a blood sample derived from a subject having an abnormality due to a blood coagulation factor and a normal blood sample (normal plasma) are mixed at a specific ratio
  • the analysis was performed. That is, a sample to be measured was prepared by mixing each of the plurality of mixed samples with the coagulation time measuring reagent.
  • the photometric data of the amount of scattered light was acquired as the coagulation reaction data of the sample to be measured.
  • the analysis according to the present embodiment was performed on the acquired photometric data.
  • Factor VIII Deficient Plasma manufactured by George King Bio-Medical, Inc.
  • Factor IX Deficient Plasma manufactured by George King Bio-Medical, Inc.
  • factor VIII concentration and IX factor concentration are 100%.
  • a mixture of normal pool plasma (hereinafter referred to as normal plasma) that can be regarded as Factor VIII concentration ⁇ 0.1% Factor VIII deficient plasma or Factor IX concentration ⁇ 0.1% Factor IX ⁇ Definient plasma by varying the mixing ratio of normal plasma and factor VIII and IX concentrations of 50% and 25%, respectively. , 10%, 5%, 2.5%, 1%, 0.75%, 0.5%, 0.25%, 0.1% or less mixed plasma was prepared.
  • Coagpia APTT-N manufactured by Sekisui Medical Co., Ltd.
  • Coagpia APTT-N calcium chloride solution 50 ⁇ L manufactured by Sekisui Medical Co., Ltd.
  • the blood coagulation reaction was measured using an automatic blood coagulation analyzer CP3000 (manufactured by Sekisui Medical Co., Ltd.).
  • 50 ⁇ L of the sample discharged into a cuvette (reaction vessel) and heated at 37 ° C. for 45 seconds was added (discharged) with 50 ⁇ L of APTT reagent heated to about 37 ° C., and 25 mM mM chloride was added after 171 seconds had elapsed.
  • 50 ⁇ L of calcium liquid was added (discharged) to start the coagulation reaction.
  • the reaction was carried out at 37 ° C.
  • the coagulation reaction was detected (photometry) by irradiating light from an LED light with a wavelength of 660nm as a light source and detecting the amount of 90 degree side scattered light at 0.1 second intervals. The detection time was 360 seconds.
  • the maximum value Vmax of the primary differential value and the time VmaxT at which the maximum value is obtained were obtained. Further, the above-mentioned peak width vB was specified based on the corrected linear curve. Further, the center-of-gravity time vT and the center-of-gravity height vH were calculated using the corrected linear curve and the above equations (5), (6) and (7).
  • FIG. 17A shows an example of the obtained coagulation reaction curve (uncorrected zero-order curve).
  • the solid line shows the uncorrected 0th-order curve of normal plasma
  • the broken line shows the uncorrected 0th-order curve with a factor VIII concentration of 0.1% or less
  • the dashed-dotted line shows the uncorrected 0th-order curve with a factor IX concentration of 0.1% or less.
  • FIG. 17B shows a corrected zero-order curve obtained by correcting the uncorrected zero-order curve of each sample shown in FIG. 17A so that the maximum value of the scattered light amount becomes 100.
  • Extending coagulation time is observed in factor VIII-deficient plasma and factor IX-deficient plasma, because each coagulation factor is deficient. That is, in these clotting factor-deficient plasmas, the time when the scattered light amount starts to increase and the time when the increase in the scattered light amount ends are slower than in the case of normal plasma. In addition, the slope when the scattered light amount rises is smaller than that in the case of normal plasma.
  • FIG. 18A shows an uncorrected first-order curve obtained by differentiating the zero-order curve of the normal plasma and the coagulation factor-deficient plasma shown in FIG. 17A.
  • FIG. 18B shows a corrected first-order curve obtained by differentiating the corrected zero-order curve of the normal plasma and the coagulation factor-deficient plasma shown in FIG. 17B.
  • the maximum value of the first derivative is smaller than in the case of normal plasma, and the time when the first derivative becomes the maximum is delayed.
  • FIG. 19A shows the relationship between coagulation time and the logarithm of factor VIII concentration. When logarithmic conversion was performed for a concentration of 0.1% or less, the concentration was calculated as 0.1%. The same applies to the other figures.
  • a triangle mark ( ⁇ ) indicates the time (VmaxT) at which the first-order differential value reaches its maximum value
  • a circle mark ( ⁇ ) indicates the center-of-gravity time vT.
  • the calculation target threshold value S was set to 10%.
  • FIG. 19B shows the relationship of clotting time to the logarithm of factor IX concentration.
  • a triangle mark ( ⁇ ) indicates the time (VmaxT) at which the first-order differential value reaches its maximum value
  • a circle mark ( ⁇ ) indicates the center-of-gravity time vT.
  • FIG. 19C shows the relationship of the first derivative with the logarithm of the factor VIII concentration.
  • FIG. 19D shows the relationship of the first derivative value with respect to the logarithm of the factor IX concentration.
  • a triangle mark ( ⁇ ) indicates the maximum value Vmax of the first derivative
  • a circle mark ( ⁇ ) indicates the center of gravity height vH.
  • the threshold value S for calculation was set to 60%.
  • the center-of-gravity time vT showed a high correlation with the factor VIII concentration and the factor IX concentration.
  • the center of gravity height vH also showed a high correlation with the factor VIII concentration and the factor IX concentration.
  • the center of gravity is calculated from the calculation related to the average, so the random noise effect included in the measurement data is reduced by the calculation. Therefore, the present method using the center of gravity is unlikely to be affected by noise, and it is expected that the present method can acquire the coagulation factor concentration with high accuracy.
  • the example shown in FIGS. 19A and 19B is the case where the calculation target range value S is set to 10%
  • the example shown in FIGS. 19C and 19D is the case where the calculation target range value S is set to 60%. is there.
  • the present invention is not limited to this, and since the calculation target range value S can be set to various values, various parameters can be obtained and various information can be obtained.
  • FIG. 20A shows the relationship between the peak width vB and the logarithm of the Factor VIII concentration.
  • the calculation target threshold value S was set to 10%.
  • FIG. 20B shows the relationship of peak width vB to the logarithm of factor IX concentration.
  • the calculation target threshold value S was set to 10%.
  • the concentration of Factor VIII or Factor IX contained in the patient sample can be calculated by measuring the peak width vB of the patient sample based on the calibration curve obtained from these. It was shown that the deficiency status of coagulation factors can be determined based on these calculated concentrations.
  • FIG. 21A shows a corrected primary curve of normal plasma.
  • FIG. 21B shows a corrected first-order curve of Factor VIII-deficient plasma (Factor FIII Deficient Plasma).
  • FIG. 21C shows a corrected linear curve of Factor IX Deficient Plasma.
  • the black circles indicate, in order from the bottom, when the calculation target threshold value S is set to 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, respectively. The obtained center of gravity is shown.
  • the corrected linear curve in FIG. 21A shows a unimodal shape with one peak.
  • the center-of-gravity time vT monotonically slightly decreases as the calculation target threshold value S increases.
  • the corrected linear curves of FIGS. 21B and 21C show a bimodal shape having two peaks. Therefore, under the influence of the first small peak, the center-of-gravity time vT shows a relatively large reduction in the halfway along with the increase of the calculation target range value S.
  • the center-of-gravity time vT shows a relatively large extension.
  • the values, the contents of change, the ratio, the difference, and the like which are obtained by obtaining a plurality of center-of-gravity points having different calculation target range values S, can also be evaluation parameters.
  • the corrected linear curve may show two local maximum values.
  • a relatively wide maximum value on the right side as observed at about 80 seconds in the example shown in FIG. 21B and at about 60 seconds in the example shown in FIG. 21C is called a main peak, and in the example shown in FIG. 21B.
  • the relatively narrow local maxima on the left as observed at about 50 seconds and about 50 seconds in the example shown in FIG. 21C will be referred to as side peaks.
  • FIG. 22A shows the relationship between the set value (10% to 90%) of the calculation target range value S and the center of gravity time vT.
  • FIG. 22B shows the center of gravity time vT obtained when the calculation target range value S is 10% and the center of gravity time vT obtained when the set value of the calculation target range value S is 20% to 90%. Show the difference.
  • FIG. 22C shows the relationship between the set value (10% to 90%) of the calculation target range value S and the center-of-gravity height vH.
  • FIG. 22C it was revealed that the center-of-gravity height vH of normal plasma and the center-of-gravity height vH of coagulation factor-deficient plasma were significantly different. That is, for example, it was revealed that the deficiency status of coagulation factors can be detected by comparing the height of center of gravity vH of normal plasma with the height of center of gravity vH of a patient sample.
  • the left column of FIG. 23 shows the corrected linear curve obtained for the test plasma containing only the factor VIII-deficient plasma.
  • the right column of FIG. 23 shows the corrected primary curve obtained for the test plasma having a factor VIII concentration of 0.25%.
  • the maximum first-order differential value Vmax is indicated by a triangle mark ( ⁇ ).
  • the maximum first-order derivative value Vmax is located at the narrow side peak on the left side.
  • the calculation target range value S is set to 70% or 80%
  • the center of gravity point is located toward the wide main peak on the right side
  • the calculation target range value S is 90%.
  • the center of gravity is located at the side peak showing the maximum first-order differential value Vmax.
  • the maximum first-order derivative value Vmax is located at the main peak on the right side.
  • the center of gravity point is located toward the wide main peak on the right side, and the maximum first derivative value Vmax Is close to the time.
  • the method of the present embodiment it is possible to discriminate even plasma such as when 0.25% Factor VIII is present.
  • FIG. 24A shows an example of the corrected linear curve of the factor IX-deficient plasma calculated using the above equation (2).
  • FIG. 24B shows an example of a corrected linear curve of Factor IX-deficient plasma calculated using the above formula (4).
  • the first-order differential value can be grasped in more detail based on the above equation (4) in FIG. 24B.
  • the side peak information around time 45 seconds can be grasped in detail.
  • the corrected linear curve based on the average slope within the section can be calculated from a series of measurement data.
  • the calculation of the average inclination value within the section is suitable for analysis in an analyzer using an optical detector that reduces the change in photometric amount, for example, a blood coagulation analyzer.
  • Factor VIII Deficient Plasma manufactured by George King Bio-Medical, Inc.
  • normal plasma normal pool plasma whose factor VIII concentration and factor IX concentration were considered to be 100% was used.
  • factor VIII deficient plasma George King Bio-Medical, Inc.
  • test plasma factor VIII deficient plasma (George King Bio-Medical, Inc.) and normal plasma were mixed, and the factor VIII concentration was 50%, 25%, 10%, 5%, 2.5%, 1 %, 0.75%, 0.5% and 0.25% prepared samples, and factor VIII-deficient plasma (factor VIII concentration of 0.1% or less) was used.
  • the plasma of other coagulation factors deficient (concentration 0.1% or less) and normal plasma are mixed, and the concentration of each factor is 50%, 25%, 10%, 5%, 2.5%, 1%, 0.75%, Samples prepared to have 0.5% and 0.25% were also prepared as test plasma.
  • Other coagulation factor deficient plasmas used were factor V deficient plasma, factor IX deficient plasma, factor X deficient plasma, factor XI deficient plasma, factor XII deficient plasma, and prekallikrein deficient plasma. When logarithmic conversion of only deficient plasma was performed, the concentration was calculated as 0.1%.
  • Factor V deficient Plasma Factor V Deficient Plasma (manufactured by George King Bio-Medical, Inc.) was used.
  • Factor IX Deficient Plasma (manufactured by George King Bio-Medical, Inc.) was used for factor IX-deficient plasma.
  • Factor X Deficient Plasma (George King Bio-Medical, Inc.) was used for factor X deficient plasma.
  • Factor XI Deficient Plasma (manufactured by George King Bio-Medical, Inc.) was used for factor XI deficient plasma.
  • Factor XII Deficient Plasma Factor XII deficient Plasma (manufactured by George King Bio-Medical, Inc.) was used for factor XII deficient plasma.
  • Prekallikrein Deficient Plasma (manufactured by George King Bio-Medical, Inc.) was used for prekallikrein deficient plasma.
  • the measurement of Factor V, Factor XI, and Factor XII has the following clinical significance and is expected to be measurable using waveform analysis technology.
  • Congenital coagulation factor V deficiency is a hemorrhagic disease due to quantitative deficiency or dysfunction of coagulation factor V caused by mutation of coagulation factor V gene, and the measurement of coagulation factor V is necessary for its diagnosis. If factor XI deficiency is suspected, measurement of coagulation factor XI is necessary.
  • congenital defects in factor XII which have recently been reported to be associated with infertility, are tested by coagulation factor XII assay.
  • Coagpia APTT-N manufactured by Sekisui Medical Co., Ltd.
  • Coagpia APTT-N calcium chloride solution manufactured by Sekisui Medical Co., Ltd.
  • APTT measurement of each of the above-described test plasmas was performed using an automatic blood coagulation analyzer CP3000 (manufactured by Sekisui Medical Co., Ltd.).
  • the measurement procedure of APTT with CP3000 was the same as that of the first example.
  • the gravity center time vT and the center of gravity height vH were calculated based on the above equations (5), (6) and (7) using the data satisfying ⁇ S ⁇ 0.01.
  • the peak width vB was also calculated. Using these parameters, the flatness vAB and the time rate vTB were calculated based on the above equations (8) and (9).
  • step S203 The effect of the correction processing in step S203 was examined. APTT measurement was performed on test plasmas having different factor VIII concentrations, and the flatness ratio vAB80% when the calculation target range value was 80% was calculated based on the corrected linear curve obtained from the corrected zero-order curve. The flattening rate vAB at this time is calculated by multiplying a constant 100 so that the value becomes 1 or more. Further, based on the uncorrected linear curve obtained from the uncorrected zero-order curve, the flatness RvAB80% when the calculation target range value is 80% was calculated.
  • FIG. 25A shows the relationship between Factor VIII concentration and vAB80% based on the corrected linear curve.
  • FIG. 25B shows the relationship between Factor VIII concentration and RvAB80% based on an uncorrected linear curve.
  • the horizontal axis of each graph shows the logarithm of the factor VIII concentration.
  • the corrected linear curve shown in FIG. 25A was slightly better in agreement with the regression curve than the uncorrected linear curve shown in FIG. 25B.
  • 25C and 25D show examples of logarithmic transformation of the vertical axis in FIGS. 25A and 25B, respectively. It was found that the corrected linear curve shown in FIG. 25C has a larger slope of the linear regression equation and the intercept is closer to 0 than the uncorrected linear curve shown in FIG. 25D. Generally, in a linear calibration curve with the concentration on the horizontal axis, the reproducibility is better when the slope is larger, and the constraint of the measurement concentration range is smaller when the intercept is closer to zero. From these results, considering that the concentration of factor VIII is calculated from the calibration curve based on vAB80%, it is preferable that the slope is large and the intercept is close to 0 as shown in FIG. 25C.
  • Factor VIII concentration is 50%, 25%, 10%, 5%, 2.5%, 1%, 0.75%, 0.5%, 0.25% and 0%, respectively.
  • Factor-deficient plasma hereinafter, FVIII (50%), FVIII (25%), FVIII (10%), FVIII (5%), FVIII (2.5%), FVIII (1%), FVIII (0.75%), FVIII (0.5%), FVIII (0.25%), and FVIII (0%)
  • FIG. 27 is a graph showing the relationship between the logarithmic conversion value of factor VIII concentration (%) and the logarithmic conversion value of centroid height vH60%. It became clear that both show a good linear relationship. From this, it became clear that the factor VIII concentration can be calculated, that is, the factor VIII deficiency level can be determined by using the evaluation parameter related to the center of gravity such as the height of the center of gravity vH.
  • the threshold value S for each factor is 0%, 0.25%, 0.5%, 0.75%, 1%, 2.5%, 5%, 10%, 25%, 50%.
  • Concentration of various deficiency factors and time rate vTB when 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% were set respectively.
  • the vertical axis represents the logarithm of the time rate vTB.
  • Factor V deficient plasma FV
  • Factor VIII deficient plasma FVIII
  • Factor IX deficient plasma FIX
  • Factor X deficient plasma FX
  • Factor XI deficient plasma FXI
  • Data are shown for each of Factor XII deficient plasma (FXII) and Prekallikrein deficient plasma (PK). These data are not plotted because the coagulation reaction did not end within the measurement time in the APTT measurement of the factor XII-deficient plasma at factor XII concentrations of 0% and 0.25%.
  • Fig. 29 shows the value of the time rate vTBx% when the calculation target threshold value S is set to each value for each factor VIII concentration.
  • the value of each time rate vTBx% is counted from the lowest time rate vTBx% for all coagulation factor deficient plasmas shown in the corresponding figures in FIGS. 28A to 28K.
  • FIG. 30 shows the ranking indicating the order of the value. For example, in the results shown in FIG.
  • the threshold S for calculation was set to 5% to 30%
  • the data of factor VIII deficient plasma was distinguished from the data of other clotting factor deficient plasma when the factor VIII concentration was 2.5% or less.
  • the threshold S for calculation was set to 5% to 30%
  • the data of factor VIII deficient plasma was distinguished from the data of other clotting factor deficient plasma when the factor VIII concentration was 2.5% or less.
  • the threshold S for calculation was set to 5% to 30%
  • the data of factor VIII deficient plasma was distinguished from the data of other clotting factor deficient plasma when the factor VIII concentration was 2.5% or less.
  • the threshold S for calculation was set to 5% to 30%
  • the data of factor VIII deficient plasma was distinguished from the data of other clotting factor deficient plasma when the factor VIII concentration was 2.5% or less.
  • the time rate vTB obtained in the case of factor VIII-deficient plasma is clearly lower than the time rate vTB obtained in the case of other clotting factor-deficient plasma.
  • the regression line obtained by the least square method is used as the calibration
  • the factor VIII deficient plasma data was distinguished from the other clotting factor deficient plasma data when the factor VIII concentration was 1% or less. obtain. That is, it can be distinguished that the factor of prolonging the coagulation time is the deficiency of factor VIII.
  • the time rate vTB obtained in the case of factor VIII-deficient plasma is the time rate obtained in the case of other clotting factor-deficient plasma.
  • the regression line obtained by the least square method is used as the calibration curve. It can be seen that the concentration of Factor VIII can be calculated by using. As shown in FIGS. 31 and 32, the correlation coefficient was maximum when the calculation target range value S was 70%.
  • the factor VIII deficient plasma data can be distinguished from the other coagulation factor deficient plasma data when the factor VIII concentration is 10% or less. That is, it can be distinguished that the factor of prolonging the coagulation time is the deficiency of factor VIII.
  • the correlation coefficient is relatively low, which is not suitable for calculating the concentration of factor VIII.
  • the calculation target threshold value S is set to 90% or more, the data of factor VIII-deficient plasma cannot be distinguished from the data of other clotting factor-deficient plasmas. That is, the cause of the extension of the coagulation time cannot be distinguished.
  • the factor VIII concentration can be calculated based on the time rate vTB obtained by setting the calculation target threshold value S to 70% or less.
  • the threshold value S it is possible to determine whether or not the factor of APTT prolongation is a deficiency of factor VIII, by which the concentration of factor VIII is relatively high, below 10%. It has become clear that it is possible to discriminate up to. It was also found that the factor VIII concentration can be calculated with high accuracy by performing the analysis with the calculation target threshold value S set to 70%.
  • the concentration dependency of the time rate vTB is recognized for Factor IX. Therefore, it was found that the concentration of Factor IX can be calculated based on the time rate vTB even when it can be distinguished by some method that there is a deficiency of Factor IX.
  • each factor VIII concentration 0%, 0.25%, 0.5%, 0.75%, 1%, 2.5%, 5%, 10%, 25%, 50% Concentrations and centroids of various deficiency factors when the value S is set to 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, and 95%, respectively.
  • the relationship with the height vH is shown in FIG. 33, the maximum first derivative value Vmax of each factor VIII concentration is also displayed.
  • FIG. 34 shows the relationship between the concentrations of various deficiency factors and the peak width vB when the calculation target range value S is set to the same conditions.
  • FIG. 35A shows the oblateness vAB obtained based on the center of gravity height vH and the peak width vB. Also, the logarithm of the flatness vAB is shown in FIG. 35B.
  • FIG. 36A, FIG. 36B, FIG. 36C, FIG. 36D, FIG. 36E, FIG. 36F, FIG. 36G shows the relationship between the concentration of various deficiency factors and the flattening rate vAB when the calculation target threshold value S is set to the same conditions.
  • 36H, 36I, 36J, and 36K respectively.
  • the horizontal axis represents the logarithm of the concentration (%) of the coagulation factor
  • the vertical axis represents the logarithm of the flatness vAB.
  • Factor V deficient plasma FV
  • Factor VIII deficient plasma FVIII
  • Factor IX deficient plasma FIX
  • Factor X deficient plasma FX
  • Factor XI deficient plasma FXI
  • Data are shown for each of Factor XII deficient plasma (FXII) and Prekallikrein deficient plasma (PK). These data are not plotted because the coagulation reaction did not end within the measurement time in the APTT measurement of the factor XII-deficient plasma at factor XII concentrations of 0% and 0.25%.
  • FIG. 37A also shows the maximum first derivative value Vmax. Note that Vmax corresponds to the centroid height vH100% when the calculation target range value S is set to 100%. Furthermore, regarding the corrected quadratic curve obtained by the primary differentiation of the corrected linear curve, the same is true for the positive peak centroid height pH 90% obtained when the calculation target range value S is set to 90%. 37B.
  • Fig. 38 shows the value of the flatness vABx% and the maximum first derivative value Vmax (vH100%) when the calculation threshold value S is set to each value.
  • a high correlation coefficient was obtained between Log (Factor VIII concentration) and Log (vAB) especially when the calculation target range value S was set to 80% or less. That is, it was revealed that the factor VIII concentration can be quantified by using the oblateness vAB.
  • the calibration curve using the flattening rate vAB has a larger slope than the calibration curve using the maximum first derivative Vmax shown in FIG.
  • the calibration curve using the oblateness vAB has a larger slope than the center of gravity pH 90% of the plus peak of the corrected quadratic curve shown in FIG.
  • FIG. 40 shows the ratio (recovery rate) between the factor VIII concentration and the calculated concentration obtained from the calibration curve using the values shown in FIG. 39.
  • the shaded values indicate values where the calculated concentration is within ⁇ 10% of the factor VIII concentration.
  • the maximum first derivative value Vmax has a poor recovery rate when the factor VIII concentration is 0.25% or less.
  • vAB80% has a good recovery rate when the factor VIII concentration is 0.25% or less, but the recovery rate decreases at 0.5%, 2.5% and 50% when the factor VIII concentration is 0.5% or more.
  • vAB 70% has a good recovery rate when the factor VIII concentration is 0.5% or more excluding 0.75%. That is, if vAB70% and vAB80% are used, the factor VIII concentration can be quantified with high recovery in the factor VIII concentration range of 0% to 50%.
  • the distribution range of flatness vAB for factor VIII-deficient plasma was indistinguishable from the distribution range of flatness vAB for other factor-deficient plasmas. That is, it was revealed that it is difficult to distinguish the factor of prolongation of the coagulation time from the deficiency of factor VIII based on the oblateness vAB.
  • concentration dependency of flattening rate vAB is recognized for many coagulation factors. Therefore, it was found that the concentrations of these coagulation factors can be calculated based on the oblateness vAB.
  • the flatness vAB was found to have a good correlation with the factor concentration, regardless of the threshold S for calculation.
  • factor IX the flatness vAB was found to have a good correlation with the factor concentration when the threshold S for calculation was set to a value other than 95%.
  • Factor XI the flatness vAB showed a good correlation with the factor concentration when the threshold value x for calculation was set to be 50% or more and 80% or less.
  • the center of gravity height pH (after logarithmic conversion) of the corrected quadratic curve with respect to the coagulation factor concentration (after logarithmic conversion) shows a very high correlation with Factor VIII, and in other factors, Also, good correlation was observed in the order of factor V, factor X, factor IX, and factor XI. Therefore, it was revealed that the concentrations of these factors can be calculated even by using the center-of-height pH of the corrected quadratic curve.
  • Method 6.1.1 Method for measuring coagulation reaction of blood sample
  • a mixed plasma of coagulation factor-deficient plasma and normal plasma was prepared in the same manner as in the second example.
  • the factor V deficient plasma (V), the factor VIII deficient plasma (VIII), the factor IX deficient plasma (IX), and the factor X deficient plasma (X) used in the second example are used.
  • Factor XI deficient plasma (XI) and Factor XII deficient plasma (XII) were used.
  • Normal plasma (PNP) was used as a control.
  • FIG. 41A an uncorrected 0th-order curve and an uncorrected 1st-order curve obtained as a test plasma with a coagulation factor deficiency (factor concentration was treated as 0.1% in the examples).
  • FIG. 41B shows an example of a corrected 0th-order curve and a corrected 1st-order curve obtained from the same test plasma.
  • FIG. 42A shows an example of an uncorrected quadratic curve obtained from the same test plasma.
  • the right diagram of FIG. 42A is a diagram in which the scale in the y-axis direction of the left diagram of FIG. 42A is changed.
  • FIG. 41A an uncorrected 0th-order curve and an uncorrected 1st-order curve obtained as a test plasma with a coagulation factor deficiency (factor concentration was treated as 0.1% in the examples).
  • FIG. 41B shows an example of a corrected 0th-order curve and a corrected 1st-order curve obtained from the same test plasma.
  • FIG. 42B shows an example of the corrected quadratic curve obtained from the same test plasma.
  • the right diagram of FIG. 42B is a diagram in which the scale in the y-axis direction of the left diagram of FIG. 42B is changed.
  • the coagulation time and the height and time of the maximum peak in the primary curve and the quadratic curve were different depending on the type of the deficient coagulation factor.
  • Table 2 shows the parameters calculated from the corrected 0th to quadratic curves.
  • the calculation target range value x was set to 0% to 99% when the maximum peak value (Vmax, Amax, Amin) was set to 100%.
  • APTT represents T50 (time until the 0th-order curve reaches 50% of the maximum height).
  • 43A to 43V show the relationship between the logarithm of various coagulation factor concentrations and the logarithm of parameter values in the upper figures. A calibration curve was created from this relationship. The calculated concentration was calculated from the parameter values based on the calibration curve.
  • the correlation of various coagulation factors is plotted such that the X-axis is the measured concentration and the Y-axis is the calculated concentration.
  • both axes are plotted in logarithmic display so that the correlation at low concentrations can be confirmed.
  • the equations shown below the middle chart are the linear regression equation of the calculated concentration and the correlation coefficient for each coagulation factor concentration.
  • the linear regression equation of the calculated concentration (Y axis) with respect to the coagulation factor concentration (X axis) has a slope of 1 ⁇ 0.
  • Parameters having values of 1, y intercept ⁇ 1, and correlation coefficient (R) of 0.9 or more are indicated by “+” in Tables 3 to 8.
  • Table 9 shows, for each parameter, the number of S values for which a linear regression equation of “+” condition was obtained for each coagulation factor.
  • the parameter for which the linear regression equation of the “+” condition is obtained can be used for measuring the concentration of the coagulation factor or determining the deficiency.
  • the APTT prolongation factor is determined by using the above-mentioned parameters relating to the 0th-order curve and the quadratic curve. Or when the APTT prolongation factor is a coagulation factor inhibitor (anticoagulation factor antibody), the type of the coagulation factor inhibitor is discriminated.
  • mixed plasma of test plasma having abnormal coagulation and normal plasma is used.
  • the test plasma and the separately prepared normal plasma are mixed at a predetermined ratio.
  • the heating temperature may be, for example, 30 ° C. or higher and 40 ° C. or lower, preferably 35 ° C. or higher and 39 ° C. or lower, and more preferably 37 ° C.
  • the heating time may be, for example, in the range of 2 to 30 minutes, preferably 5 to 30 minutes. The heating time may be longer, but is preferably within 1 hour, and within 2 hours at the maximum.
  • APTT measurement is performed on the heated plasma and non-heated plasma, and photometric data is acquired. Therefore, in the present embodiment, a part of the prepared mixed plasma may be subjected to APTT measurement after the above heating treatment, and a part thereof may be subjected to APTT measurement without the heating treatment.
  • the correction processing and the differentiation of the data can be carried out in the same procedure as in the first embodiment.
  • the parameters shown in Table 1 can be calculated from the uncorrected and corrected 0th-order curves to quadratic curves of the obtained warm plasma and non-warm plasma, respectively.
  • the parameter obtained from the non-warmed plasma is called a first parameter
  • the parameter obtained from the warmed plasma is called a second parameter.
  • the APTT prolongation factor is determined, or when the APTT prolongation factor is a coagulation factor inhibitor, the type of the coagulation factor inhibitor is distinguished. be able to.
  • Test Plasma The test plasma used in this example is shown below. As normal plasma (NP), citrated plasma obtained from a healthy person was used. As the LA plasma (LA), Positive Lupus Anticoagulant Plasma from George King Biomedical, Inc. was used. For Factor VIII deficient plasma (HA) and Factor IX deficient plasma (HB), Factor VIII Deficient and Factor IX Deficient of George King Biomedical were used. For Factor VIII inhibitor plasma (InL, InM and InH), Factor VIII Deficient with Inhibitor from George King Biomedical, Inc. was used. Group No.
  • “low”, “medium”, and “high” of the inhibitor titer mean the following: Medium: 2-40 (BU / mL) (BU / mL: Bethesda unit) Low: lower than medium titer High: higher than medium titer
  • APTT Measurement Coagpia APTT-N (manufactured by Sekisui Medical Co., Ltd.) was used as the APTT reagent, and Coagpia APTT-N calcium chloride solution (manufactured by Sekisui Medical Co., Ltd.) was used as the calcium chloride solution.
  • An automatic blood coagulation analyzer CP3000 (manufactured by Sekisui Medical Co., Ltd.) was used for APTT measurement. 50 ⁇ L of the mixed plasma was discharged into the cuvette (reaction vessel) of the apparatus, and processed in the normal (non-heating) mode or the heating mode according to the following procedure.
  • FIG. 44A shows corrected linear curves of LA plasma (LA) with and without heating. In LA, there was almost no change in the curve shape due to heating.
  • FIG. 44B shows a corrected first derivative curve of Factor VIII inhibitor plasma (IN) with and without heating.
  • IN Factor VIII inhibitor plasma
  • FIG. 45A shows a corrected first derivative curve of a 1: 1 mixed plasma of LA plasma (LA) and normal plasma (LA-NP) with and without heating.
  • LA LA plasma
  • LA-NP normal plasma
  • FIG. 45B shows a corrected first derivative curve of Factor VIII inhibitor plasma (IN) and normal plasma at 1: 1 (IN-NP) with and without heating.
  • the peak appears earlier and the shape becomes sharper as in the case of LA-NP by mixing with normal plasma, as compared with FIG. 44B.
  • the peak appeared later, the peak height became lower, and the peak width became wider.
  • This shape change is due to the fact that the inhibitor (anti-factor VIII antibody) contained in IN during the heating treatment progressed the factor-VIII and antigen-antibody reaction contained in normal plasma, so that the coagulation reaction of the mixed plasma was It was judged that it was due to the inhibition. It was confirmed that IN can be distinguished from LA by indexing the shape change between non-heating and heating as a parameter change.
  • Table 10 shows various parameter values obtained from unheated plasma and warmed plasma (heated for 10 minutes) and their ratio (Pb / Pa).
  • the Pb / Pa of Factor VIII inhibitor plasma mixed plasma (IN-NP) deviates greatly from 1 and is clearly different from normal plasma (NP), LA plasma (LA) and LA mixed plasma (LA-NP). did. Therefore, it was shown that Factor VIII inhibitor-positive plasma can be discriminated based on Pb / Pa of various parameters.
  • Figures 46A-G show normal (NP), LA, HA, HB, low titer (InL), medium titer (InL) and high titer (InH) plasma levels of factor VIII inhibitor and normal plasma.
  • NP normal
  • HA low titer
  • InL medium titer
  • InH high titer
  • Using the mixed plasma mixed at a ratio of 1: 1 shows the parameter Pa of various parameters without heating, the parameter Pb with heating, and their ratio Pa / Pb and difference Pb-Pa.
  • Factor VIII inhibitor mid-titer plasma (InM) tended to have Pa / Pb greater than or less than 1.
  • In the low titer plasma of factor VIII inhibitor (InL) both Pa / Pb and Pb-Pa tended to have the same distribution as that of HA, but depending on the parameter, the spread was larger than that of HA.
  • Pa / Pb tended to be larger or smaller than 1 as a whole, or Pb-Pa tended to deviate from 0, but some parameters ( In some cases, Pa / Pb of APTT, vT) was close to 1.
  • the InH APTT was not 0 for Pb-Pa even when Pa / Pb was about 1, but extended for at least 5 seconds. Therefore, it was shown that InH can be discriminated using APTT by using the ratio and difference of Pa and Pb in combination.
  • APTT shortening
  • -The mixed plasma containing LA extends both Pa and Pb
  • Pb / Pa is about 1.
  • -The mixed plasma containing HA and HB shortens both Pa and Pb
  • Pb / Pa is about 1.
  • -The mixed plasma containing InL shortens both Pa and Pb, and Pb / Pa is about 1.
  • -InM-containing mixed plasma is slightly elongated in Pa, further elongated in Pb than Pa, and Pb / Pa is greater than 1.
  • -InH-containing mixed plasmas have an extended Pa, Pb comparable or even longer than Pa, and Pb / Pa of about 1 or greater.
  • test plasma contained in the mixed plasma can be discriminated as follows based on the warmed and unheated APTT. (1) If both Pa and Pb are extended and Pb / Pa is about 1, the test plasma is LA or InH. (2) If both Pa and Pb are shortened and Pb / Pa is about 1, the test plasma is HAB (HA or HB) or InL. (3) If both Pa and Pb are extended and Pb / Pa is greater than 1, the test plasma is InM or InH.
  • Pb / Pa at Vmax was about 1 for LA, HA, HB, InL, and some InH, similar to APTT, while it was less than 1 for InM and some InH. ..
  • the APTT is extended and the coagulation rate is decreased according to the inhibitor titer, and as a result, their parameter ratio Pb / Pa deviates from 1. Therefore, in InM and InH excluding a part thereof, Pb / Pa of APTT is larger than 1 and Pb / Pa of Vmax is smaller than 1.
  • Some InH is a sample with a high titer (ultra-high titer) in the high titer group, and Vmax decreases to around 1 in the non-heated state (Pa) as shown in FIG. 44B.
  • the parameter ratio Pb / Pa is around 1 because there is almost no change in the heating (Pb).
  • it may be defined as a sample having Vmax of 2 or less at non-heating (Pa) as an example.
  • Amax showed the same tendency as Vmax
  • vB and vT showed the same tendency as APTT
  • vAB and vTB showed the same tendency as Vmax and Amax.
  • Method 8.1.1. Blood Specimens The following five types of measurement target samples were prepared using blood specimens derived from subjects with abnormal blood coagulation factors and normal blood specimens (normal plasma).
  • LA Positive Plasma Positive LAPS Anticoagulant Plasma (George King Biomedical, Inc.) was used for LA positive plasma.
  • each APTT measurement was performed using an automatic blood coagulation analyzer CP3000 (manufactured by Sekisui Medical Co., Ltd.).
  • CP3000 automatic blood coagulation analyzer
  • 50 ⁇ L of a sample discharged to a cuvette (reaction vessel) and heated at 37 ° C. for 45 seconds was added (discharged) with 50 ⁇ L of APTT reagent heated to about 37 ° C., and 25 mM calcium chloride was further added after 171 seconds had elapsed.
  • 50 ⁇ L of the liquid was added (discharged) to start the coagulation reaction. The reaction was carried out while maintaining the temperature at 37 ° C.
  • the coagulation reaction was detected (photometry) by irradiating light with an LED light having a wavelength of 660 nm as a light source and detecting the scattered light amount of 90 ° side scattered light at 0.1 second intervals.
  • the detection time was 360 seconds.
  • Baseline adjustment was performed on the coagulation reaction curve. That is, a smoothing process including noise removal was performed on the coagulation reaction curve, and the amount of scattered light at the start of measurement was adjusted to 0. Subsequently, the maximum height of the coagulation reaction curve was corrected to 100 to obtain a corrected zero-order curve.
  • the corrected first-order curve was obtained by first-order differentiating the corrected zero-order curve.
  • the average slope in the section according to the above-mentioned formula (4) was used.
  • the coagulation time was calculated based on the coagulation reaction curve after the baseline adjustment.
  • the peak width vB10% when the calculation target range value S was set to 10% was calculated.
  • the center-of-gravity time vT60% and the center-of-gravity height vH60% when the calculation target range value S is set to 60% were calculated.
  • the flatness ratio vAB10% when the calculation target threshold value S was set to 10% was calculated.
  • the time rate vTB5% was calculated when the calculation target threshold value S was set to 5%.
  • FIGS. 47A to 47E Representative corrected linear curves of the above-mentioned five types of samples are shown in FIGS. 47A to 47E, respectively.
  • the four curves M0, M10, M30, and M120 in each figure are the correction values 1 without heating of mixed plasma, 10 minutes after heating, 30 minutes after heating, and 120 minutes after heating. The next curve is shown.
  • FIG. 47A shows a corrected primary curve of “(1) Normal plasma”. This curve has a higher peak height and a narrower peak width than the other samples. It also showed a unimodal shape. Looking at the effect of the difference in the heating time, there was almost no change in the shape of the curve among the curves M0, M10, M30 and M120.
  • FIG. 47B shows a corrected primary curve of “(2) LA positive plasma”. This curve has an extension, a low peak height and a wide peak width when compared to normal plasma. In addition, one of the bimodal peaks was a shoulder-like peak, or a bimodal shape. Looking at the effect of the difference in heating time, there is a slight change in the shape of the curve between the curves M0, M10, M30, and M120, but no significant change.
  • FIG. 47C shows a corrected primary curve of “(3) Factor VIII inhibitor-positive plasma”. This curve showed a prolongation as compared with normal plasma, a low peak height, a wide peak width, and a remarkable bimodal shape. Further, the peak height is lower and the peak width is wider than that of LA-positive plasma. Looking at the effect of the difference in heating time, there is a small change in the top of the curves M0, M10, M30, and M120, but no significant change.
  • FIG. 47D shows the corrected primary curve of “(4) LA-positive plasma and normal plasma equivalent volume mixed plasma”.
  • the peak height is higher and the peak width is narrower than that of “(2) LA positive plasma” shown in FIG. 47B.
  • a slight change in the waveform shape can be seen between the curves M0, M10, M30, and M120, but no significant change is seen.
  • FIG. 47E shows a corrected primary curve of “(5) Mixed plasma of factor VIII inhibitor-positive plasma and normal plasma”. Compared with “(3) Factor VIII inhibitor-positive plasma” shown in FIG. 47C, this curve markedly increased the peak height and narrowed the peak width particularly in M0 without heating treatment. .. On the other hand, as the heating treatment time became longer, the peak height became lower and the peak width became wider. In particular, a large shape change was observed between the curves M0 and M10. For example, after no heating treatment (M0), after 10 minutes heating treatment (M10), the peak height became half or less, and the peak was bimodal. The curve after heating for 10 minutes (M10) is flattened, and a large shape change is observed. A shape change could be confirmed until after heating treatment for 30 minutes (M30), but no subsequent shape change was observed.
  • FIG. 48 shows various evaluation parameters obtained from APTT measurement of mixed plasma after heating treatment for 10 minutes, and various evaluation parameters obtained from APTT measurement of mixed plasma without heating treatment, for each of the above-mentioned 5 types of samples. , And an example of a table showing the results of calculating the ratio of various evaluation parameters of both.
  • NP represents “normal plasma”
  • LA represents “LA positive plasma”
  • LAM represents “equal mixture of LA positive plasma and normal plasma.
  • Plasma represents “Factor VIII inhibitor-positive plasma”
  • I M represents “equal mixture plasma of Factor VIII inhibitor-positive plasma and normal plasma” .
  • 10 min represents “10 minutes of heating at 37 ° C.” and “0 min” represents “no heating”.
  • the various evaluation parameters shown in FIG. 48 are as follows.
  • the coagulation time indicates the reaction elapsed time at which the scattered light amount of the coagulation reaction curve after the baseline adjustment becomes 50%.
  • Vmax indicates the maximum value of the corrected linear curve.
  • VmaxT indicates the time from the start of photometry to the time when Vmax is reached.
  • Amax indicates the maximum value of the corrected quadratic curve.
  • AmaxT indicates the time from the start of photometry to the point when Amax is reached.
  • vB10% indicates the peak width when the calculation target threshold value S is set to 10%.
  • vAB10% indicates the flatness when the calculation target range value S is 10%, and the value of the center of gravity height vH10% when the calculation target range value S is 10% is divided by the peak width vB10% (vH10% / vB10%).
  • vTB5% indicates the time rate when the calculation target range value S is set to 5%, and is the value obtained by dividing the centroid time vT5% when the calculation target range value S is set to 5% by the peak width vB5% (vT5 % / vB5%).
  • vT60% indicates the centroid time when the calculation target threshold value S is set to 60%.
  • vH60% indicates the height of the center of gravity when the calculation target range value S is set to 60%.
  • the ratio (Pb / Pa) is equal to that in the equal mixed plasma (LA M) of LA-positive plasma and normal plasma. It was expected to be close to 1. As a result of the analysis, as shown in FIG. 48, the ratio (Pb / Pa) was a value close to 1 except for Amax. It is speculated that the reason why Amax deviates greatly from 1.0 is that it is affected by the deterioration of the S / N ratio due to the smaller values of Pb and Pa due to the second derivative.
  • the ratio (Pb / Pa) for LAM is 0.988, whereas the coagulation time for INM is 1.596, which is clearly large.
  • the INM ratio (Pb / Pa) of 1.596 indicates that the effect of the factor VIII inhibitor on the coagulation-inhibiting reaction is enhanced in this sample by heating for 10 minutes.
  • the LAM ratio (Pb / Pa) of 0.988 indicates that the heating treatment of LA for 10 minutes does not affect the coagulation reaction.
  • Vmax is considered to be one preferable example as an evaluation parameter for determining the influence of a factor VIII inhibitor such as the presence of a factor VIII inhibitor.
  • VmaxT is not preferable as an evaluation parameter for determining the influence of a factor VIII inhibitor such as the presence of a factor VIII inhibitor.
  • Center of gravity height vH is a parameter that represents the rate of progress of the coagulation reaction.
  • the ratio of center of gravity height vH60% (Pb / Pa) is 1.052 for LAM, but is 0.427 for INM, and INM is clearly small.
  • the center of gravity height vH is considered to be one preferable example as an evaluation parameter for determining the influence of a factor VIII inhibitor such as the presence of a factor VIII inhibitor.
  • Center of gravity time vT is a parameter that reflects the temporal change in the progress of the coagulation reaction.
  • the ratio of the center of gravity time vT60% (Pb / Pa) is 0.988 for LAM, but 1.592 for INM, and INM is clearly large.
  • the center-of-gravity time vT is considered to be one preferable example as an evaluation parameter for determining the influence of the factor VIII inhibitor such as the presence of the factor VIII inhibitor.
  • VmaxT is easily affected by the bimodal peak, while the center-of-gravity time vT can be a better evaluation parameter than VmaxT in that it is a parameter that reflects the averaged shape of the entire corrected linear curve. ..
  • the peak width vB10% (Pb / Pa) is 0.958 for LAM, but 2.270 for INM, and INM is clearly large.
  • the peak width vB is considered to be one preferable example as an evaluation parameter for determining the influence of the factor VIII inhibitor such as the presence of the factor VIII inhibitor.
  • the ratio of flatness vAB10% (Pb / Pa) is 1.087 in LAM, while it is 0.191 in INM, and INM is clearly small.
  • the flattening rate vAB is considered to be one preferable example as an evaluation parameter for determining the influence of the factor VIII inhibitor such as the presence of the factor VIII inhibitor.
  • the ratio of hourly rate vTB5% (Pb / Pa) is 1.019 for LAM, but 0.718 for INM, and INM is small.
  • INM the center of gravity time vTx is prolonged and the peak width vB is increased due to the heating process, so these changes cancel each other out, and the value is far from 1.0 compared to other parameters. Absent.
  • the difference (Pb-Pa) between the parameters is close to 0 if Pb and Pa are close to each other, and the value is far from 0 if Pb and Pa are not close to each other. It can be seen that is also a judgment index.
  • parameters related to the coagulation reaction state in particular, for example, the maximum first derivative value Vmax, peak width vB, flatness vAB, center of gravity time vT, center of gravity height vH, based on the time rate vTB, etc., the sample of the subject, It has been found that it can be distinguished whether it is factor VIII inhibitor positive or LA positive.
  • 49A to 49L show the results of cross-mixing tests of different LA-positive samples.
  • 49A to 49L show the results of samples A, B, C, D, H, I, J, K, O, P, Q, and R, respectively.
  • the horizontal axis of each graph shows the mixing ratio of LA-positive plasma and normal plasma, showing that the proportion of LA-positive plasma is 0%, 50%, and 100%.
  • the vertical axis represents the measured coagulation time of APTT.
  • m0 shown by the solid line shows the APTT measurement result without heating treatment
  • m10 shown by the broken line shows the APTT measurement result when the heating treatment time of the mixed plasma was 10 minutes.
  • Figures 50A to 50I show the results of cross-mixing tests of different Factor VIII inhibitor positive specimens.
  • 50A to 50I show the results of Samples E, F, G, LM, N, S, T, and U, respectively.
  • the horizontal axis of each graph shows the mixing ratio of Factor VIII inhibitor-positive plasma and normal plasma, and shows that the ratio of Factor VIII inhibitor-positive plasma is 0%, 50%, and 100%.
  • the vertical axis represents the measured coagulation time of APTT.
  • m0 shown by a solid line shows the measurement result of APTT without heating treatment
  • m10 shown by the broken line shows the measurement result when the heating treatment time of the mixed plasma was 10 minutes.
  • FIG. 51A shows the APTT measurement results for each sample when the test plasma was not heated at 100% and when it was heated at 37 ° C. for 10 minutes.
  • FIG. 51B shows the APTT measurement results for each sample, when no heating treatment was performed with an equal amount of mixed plasma of test plasma and normal plasma and when heating treatment was performed at 37 ° C. for 10 minutes.
  • 52A to 52L are mixed plasmas obtained by mixing the above-mentioned 12 cases of LA-positive plasma and normal plasma in a volume ratio of 1: 1; that is, samples A, B, C, D, H, I, J, K, O. , P, Q, and R are not heat-treated, and the corrected linear curves when heat-treated at 37 ° C. for 10 minutes are shown.
  • the solid line M0 shows the case without heating treatment
  • the broken line M10 shows the case of heating treatment at 37 ° C. for 10 minutes.
  • 53A to 53I are mixed plasmas obtained by mixing the above-described nine examples of factor VIII inhibitor-positive plasma and normal plasma at a volume ratio of 1: 1; that is, samples E, F, G, L, M, N, S, The corrected linear curves when T and U are not heated and when they are heated at 37 ° C. for 10 minutes are shown.
  • the solid line M0 shows the case without heating treatment
  • the broken line M10 shows the case of heating treatment at 37 ° C. for 10 minutes.
  • the “calculation target” relating to the “equal amount mixed plasma of LA-positive plasma and normal plasma” The flatness ratio vAB10% when the threshold S was 10% was calculated. Then, the ratio (vAB10% 10/0 ratio) of the flattening ratio vAB10% without heating treatment and the flattening ratio vAB10% without heating treatment was calculated. Similarly, based on each of the data without heating treatment and the data with 10-minute heating treatment shown in FIGS. 53A to 53I, “equal amount mixed plasma of factor VIII inhibitor-positive plasma and normal plasma” was obtained.
  • the ratio of the flattening ratio vAB obtained from the data obtained by APTT measurement without heating to the flattening ratio vAB obtained from the data obtained by APTT measurement after 10 minutes heating treatment (vAB 10 It was confirmed that the (/ 0 ratio) can be an effective index for distinguishing whether the sample of the subject is LA positive or Factor VIII inhibitor positive.
  • the “calculation target” relating to the “equal amount mixed plasma of LA-positive plasma and normal plasma” The height of the center of gravity when the threshold S was 60% vH 60% "was calculated. Then, the ratio (vH60% 10/0 ratio) of the height of center of gravity vH60% without heating treatment and the height of center of gravity vH60% without heating treatment was calculated. Similarly, based on each of the data without heating treatment and the data with heating treatment for 10 minutes shown in FIGS. 53A to 53I, “equal amount mixed plasma of factor VIII inhibitor-positive plasma and normal plasma” was obtained.
  • the ratio of the center of gravity height vH obtained from the data obtained by the APTT measurement without heating treatment to the height of the center of gravity vH obtained from the data obtained by the APTT measurement without heating treatment for 10 minutes can be an effective index for distinguishing whether the subject sample is LA-positive or Factor VIII inhibitor-positive.
  • the “calculation target” relating to the “equal amount mixed plasma of LA-positive plasma and normal plasma” The height of the center of gravity when the threshold S was 60% vH 60% "was calculated. Then, the difference (vH60% 10/0 difference) between the height of center of gravity vH60% without heating treatment and the height of center of gravity vH60% without heating treatment for 10 minutes was calculated. Similarly, based on each of the data without heating treatment and the data with heating treatment for 10 minutes shown in FIGS. 53A to 53I, “equal amount mixed plasma of factor VIII inhibitor-positive plasma and normal plasma” was obtained.
  • the “calculation target” relating to the “equal amount mixed plasma of LA-positive plasma and normal plasma” The center-of-gravity time vT 60% when the threshold S was 60% was calculated. Then, the difference (vT60% 10/0 difference) between the centroid time vT60% without heating treatment and the centroid time vT60% without heating treatment was calculated. Similarly, based on each of the data without heating treatment and the data with 10-minute heating treatment shown in FIGS. 53A to 53I, “equal amount mixed plasma of factor VIII inhibitor-positive plasma and normal plasma” was obtained.
  • the center-of-gravity time vT60% when the calculation target threshold value S is 60% was calculated. Then, the difference between the center of gravity time vT60% without heating and the center of gravity time vT60% without heating (vT60% 10/0 difference) was calculated. The calculated results are shown in FIG. 55C.
  • the difference between the center-of-gravity time vT obtained from the data obtained by APTT measurement without heating treatment and the center-of-gravity time vT obtained from the data obtained by APTT measurement without heating treatment (vT10 It was confirmed that the (/ 0 difference) can be an effective index for distinguishing whether the sample of the subject is LA positive or Factor VIII inhibitor positive.
  • FIG. 56 shows the results of the cross-mixing test of LA-positive samples.
  • m0 shown by the solid line shows the APTT measurement result without heating treatment
  • m2 shown by the broken line shows the APTT measurement result when the heating treatment time of the mixed plasma was 2 minutes.
  • FIG. 56 there was almost no difference in the measurement results between the mixed plasma heating treatment times of 0 minutes (unheated) and 2 minutes, and the graph showed a “convex upward” pattern.
  • FIG. 57 also shows the result of the cross-mixing test of the LA-positive sample.
  • m10 indicated by the solid line indicates the APTT measurement result when the heating treatment time of the mixed plasma was 10 minutes
  • m2 indicated by the broken line indicates the heating treatment time of the mixed plasma of 2 minutes.
  • the APTT measurement result of is shown.
  • FIG. 57 there was almost no difference in the measurement results when the mixed plasma heating treatment time was 10 minutes and 2 minutes. That is, there was almost no difference in the measurement results when the mixed plasma heating treatment time was 0 minutes (unheated), 2 minutes, and 10 minutes.
  • FIG. 58 shows the result of the cross-mixing test of the Factor VIII inhibitor-positive sample.
  • m0 shown by a solid line shows the APTT measurement result without heating treatment
  • m2 shown by the broken line shows the APTT measurement result when the heating treatment time of the mixed plasma was 2 minutes.
  • the heating time of the mixed plasma shows a pattern of "convex upward” in both 0 minutes (unheated) and 2 minutes, and the coagulation time after 2 minutes heating treatment is compared with that in unheated The pattern of “convex upwards” became stronger.
  • FIG. 59 also shows the result of the cross-mixing test of the Factor VIII inhibitor-positive sample.
  • m10 indicated by the solid line indicates the APTT measurement result when the heating treatment time of the mixed plasma was 10 minutes
  • m2 indicated by the broken line indicates the heating treatment time of the mixed plasma of 2 minutes.
  • the APTT measurement result of is shown.
  • FIG. 59 there was almost no difference in the measurement results between the mixed plasma heating treatment times of 10 minutes and 2 minutes.
  • FIG. 60 shows a corrected linear curve of a mixed plasma prepared by mixing LA-positive plasma and normal plasma at a volume ratio of 1: 1 without heating and at 37 ° C. for 2 minutes.
  • the solid line LA_0 shows the case without heating treatment
  • the broken line LA_2 shows the case with heating treatment at 37 ° C. for 2 minutes. It was confirmed that there was almost no change in the shape between the curves LA_0 and LA_2, and that the effect of heating treatment on the curve shape was not observed.
  • FIG. 61 shows a corrected linear curve of the mixed plasma in which the factor VIII inhibitor positive plasma and the normal plasma were mixed at a volume ratio of 1: 1 without heating and when heated at 37 ° C. for 2 minutes.
  • the meaning of each curve is the same as in FIG.
  • a large shape change was observed between the curves 8M_0 and 8M_2, and it was confirmed that the heating treatment had a significant effect on the curve shape.
  • the heating treatment for 2 minutes the peak height was lowered and the peak width was widened as in the heating treatment for 10 minutes in the fifth embodiment.
  • FIG. 62 shows various evaluation parameters obtained from the APTT measurement of the mixed plasma after the 2-minute heating treatment and the APTT measurement of the unheated mixed plasma for each of the five types of samples as in the fifth example.
  • An example of a table showing the obtained various evaluation parameters and the result of calculating the ratio of the various evaluation parameters is shown.
  • the ratio (Pb / Pa) was 1.045 for LAM, whereas the ratio (Pb / Pa) was 1.082 for INM, showing no difference.
  • This result shows that the LA-positive sample does not affect the coagulation reaction by the heating treatment for 2 minutes, and shows that the coagulation-inhibiting reaction of the factor VIII inhibitor-positive sample does not affect the coagulation reaction very strongly.
  • the difference between the 2-minute heating process and the unheated VmaxT is almost unchanged in LAM, but is extended in INM. Reflecting this, the VmaxT ratio (Pb / Pa) is 1.020 for LAM, but 1.182 for INM. As shown in FIG. 61, even with the heating treatment for 2 minutes, the bimodality of the corrected first-order rate curve becomes remarkable after the heating treatment as in the heating treatment for 10 minutes in the fifth embodiment. ..
  • the ratio of center of gravity height vH60% (Pb / Pa) is 0.947 for LAM, but 0.737 for INM, and INM is clearly small.
  • the ratio of centroid time vT60% (Pb / Pa) is 1.044 for LAM, but 1.146 for INM, and INM is large.
  • the ratio of flatness vAB10% (Pb / Pa) is 0.864 for LAM, but 0.490 for INM, and INM is clearly small.
  • the ratio of time rate vTB (Pb / Pa) is 0.975 in LAM, while it is 0.840 in INM, and INM is small.
  • the parameters related to the coagulation reaction state particularly, for example, the maximum first-order differential value Vmax, the peak width vB, and It has been found that it is possible to distinguish whether the sample of the subject is Factor VIII inhibitor-positive or LA-positive based on the flatness ratio vAB, the center-of-gravity time vT, the center-of-gravity height vH, the time ratio vTB, and the like.
  • vAB10% 10/0 ratio “vH60% 10/0 ratio”, and “vT60% 10/0 difference” are listed as evaluation parameters that can be effective indicators, but they are not limited to these. Evaluation parameters other than the above can also be an effective index for distinguishing whether the subject sample is LA-positive or Factor VIII inhibitor-positive.
  • the calculation target range value S that is set when obtaining the oblateness vABx is not limited to 10%, and may be another value.
  • the calculation target range value S set in obtaining the center of gravity height vHx is not limited to 60% and may be another value.
  • the calculation target range value S set in obtaining the center-of-gravity time vTx is not limited to 60% and may be another value.
  • the sample of the subject is also LA positive. Or positive for factor VIII inhibitors can be distinguished.
  • the heating time is not limited to 10 minutes. According to the corrected linear curve of FIG. 47E, it is considered that the heating treatment time need not be longer than 30 minutes. On the other hand, since it is necessary for the inhibitor to react, it is preferable to heat for 2 minutes or more. Therefore, the heating time may be appropriately changed from 2 minutes to 30 minutes. In any case, the inspection time can be shortened sufficiently compared with the conventional 2 hours.
  • Method Mixed plasma (12 samples for LA-positive plasma and 9 samples for Factor VIII inhibitor-positive plasma) was prepared by the same procedure as in Example 5, and was not heated at 37 ° C. and was heated for 10 minutes. APTT measurement was carried out later. Various evaluation parameters were calculated from the obtained photometric data, and the ratio (Pb / Pa) and the difference (Pb-Pa) between the parameter (Pa) of non-warmed plasma and the parameter (Pb) of warmed plasma were obtained.
  • the ratio (Pb / Pa) and the difference (Pb / Pa) and the difference between the equal mixed plasma (LA) of LA-positive plasma and normal plasma and the equivalent mixed plasma (Inhibitor) of factor VIII inhibitor-positive plasma and normal plasma Pb ⁇ Pa) distribution mean value was evaluated. Equal variance and unequal variance were judged for each distribution by the F test (significance level 1%), and then the P value of the difference between the mean values of the LA distribution and the inhibitor distribution was calculated by the T test (two-sided).
  • FIGS. 63A to 63E show examples of the difference (Pb-Pa) and ratio (Pb / Pa) in various evaluation parameters between non-heated plasma and warmed plasma for LA and Inhibitor.
  • 63A shows APTT time (T50) and Vmax
  • FIG. 63B shows vAB40% and vABa40%
  • FIG. 63C shows vH40% and vHa40%
  • FIG. 63D shows vAUC90% and vW10% / vB10%
  • FIG. 63E shows pAUC80% and mAUC20%. The result of is shown.
  • Tables 12 to 15 show the difference (P value) in the distribution of Pb / Pa and Pb-Pa of various parameters between LA and Inhibitor.
  • the values in the table are-: P value ⁇ 1%, 1: 0.1% ⁇ P value ⁇ 1%, 2: 0.01% ⁇ P value ⁇ 0.1%, 3: 0.001% ⁇ P Values ⁇ 0.01%, 4: 0.0001% ⁇ P value ⁇ 0.001%, 5: P value ⁇ 0.0001%.
  • the ratio (Pb / Pa) had a large difference in distribution between LA and Inhibitor compared to the difference (Pb-Pa).
  • the APTT measurement is described as an example, but the present invention is not limited to this.
  • the techniques described above may be similarly applied to other clotting time measurements, such as prothrombin time measurements, diluted prothrombin time measurements, diluted partial thromboplastin time measurements, kaolin clotting time measurements, diluted Russell snake venom time measurements, and the like.
  • the factor VIII inhibitor was described as an example of the coagulation factor inhibitor, but the above-described technique is similarly applied to inhibitors of factors other than factor VIII. Can be done.
  • SYMBOLS 1 Automatic analyzer, 10 ... Control unit, 12 ... Central Processing Unit (CPU), 14 ... Random Access Memory (RAM), 16 ... Read Only Memory (ROM), 18 ... Storage, 20 ... Communication interface (I / F) ), 22 ... Bus line, 30 ... Measuring unit, 42 ... Control circuit, 44 ... Data processing circuit, 52 ... Constant temperature bath, 54 ... Reaction vessel, 62 ... Light source, 64 ... Scattered light detector, 66 ... Transmitted light detector , 72 ... Specimen container, 74 ... Reagent container, 76 ... Specimen probe, 78 ... Reagent probe, 90 ... Touch screen, 92 ... Display device, 94 ... Touch panel.

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Abstract

血液試料の凝固特性の優れた分析を実現する。本発明に係る血液検体の凝固特性の分析方法は、血液試料と試薬とを含む混合液の、反応時間に対する凝固反応量を示す凝固反応曲線のデータを取得することと、前記凝固反応曲線に関する微分によって得られる微分曲線のデータを算出することと、前記微分曲線の重心点に関係する情報を算出することと、前記重心点に関係する情報を用いて前記血液試料の凝固特性を評価することとを含む。

Description

分析方法、分析装置及び分析プログラム
　本発明は、分析方法、分析装置及び分析プログラムに関する。
　患者の血液凝固機能を診断するために血液凝固検査が行われている。血液凝固検査では、患者の血液検体に所定の試薬が添加され、凝固時間等の血液凝固機能が検査される。血液凝固検査によって、患者の止血能力又は線溶能力の状態が把握され得る。血液凝固時間の延長が生じる要因としては、凝固阻害薬剤の影響、凝固関与成分の減少、先天的な血液凝固因子の欠乏、又は後天的な凝固反応を阻害する自己抗体の存在などが挙げられる。
　例えば、血友病Ａにおける出血症状の臨床的な重症度は、凝固第VIII因子活性（以下、凝固第VIII因子などを第VIII因子などとする。）について通常人を100%としたときに1%を境として判定される。第VIII因子活性を測定する方法として、患者の血液検体に所定の試薬が添加され、この際の反応時間に対する凝固反応量から得られる凝固反応曲線に基づく測定方法が知られている。
　特許文献１、特許文献２及び特許文献３には、次の技術が開示されている。反応時間に対する凝固反応量を示す凝固反応曲線の１次微分から得られる凝固速度曲線に基づいて、最大凝固速度が求められる。また、凝固反応曲線の２次微分から得られる凝固加速度曲線に基づいて、最大凝固加速度及び最大凝固減速度が求められる。また、凝固反応開始時からのそれぞれの状態に達した時間が、最大凝固速度時間、最大凝固加速度時間及び最大凝固減速度時間として求められている。これらの値は、凝固反応曲線、凝固速度曲線又は凝固加速度曲線から得られる凝固波形パラメータと呼ばれており、これらの値に基づいて凝固因子異常の有無などが判定される。
　また特許文献２には、凝固時間の延長を示した被検血漿と、正常血漿とを混合して得た試料の凝固時間を測定する試験（クロスミキシング試験）を行うことにより、先天性凝固障害と後天性凝固障害とを鑑別する方法が開示されている。一般に、活性化部分トロンボプラスチン時間（APTT）測定においてAPTTの延長が見られた場合、クロスミキシング試験が行われ、APTTの延長の要因が鑑別される。クロスミキシング試験では、被検血漿と、正常血漿と、これらの混合血漿とを対象として、各々について次の２つの試験が行われる。
・前記各血漿を加温処理なしに測定して即時反応を検査する即時型試験
・前記各血漿を37℃で２時間加温処理（インキュベーション）後に測定して遅延反応を検査する遅延型試験
　クロスミキシング試験の結果に基づいて、APTTの延長が、凝固因子インヒビター（インヒビター）、ループスアンチコアグラント（LA）又は血友病などの凝固因子欠乏のうち何れに起因するかが判定される。クロスミキシング試験の結果は、縦軸にAPTT測定値（秒）、横軸を被検血漿と正常血漿の容量混合比としてグラフ化される。作成されるグラフは、凝固遅延の要因が下記の各場合において、次のようなパターンを示す。
・凝固因子インヒビター（以下、インヒビター）：即時反応では、「下に凸」、「直線」、又は「上に凸」と様々になる。遅延反応では「直線」又は明確な「上に凸」になる。
・ループスアンチコアグラント（以下、LA）：即時反応及び遅延反応とも、「上に凸」又は「直線」になる。
・血友病などの凝固因子欠乏（以下、因子欠乏）：即時反応及び遅延反応とも、「下に凸」になる。
　したがって、凝固遅延の要因が未知である被検血漿に関するクロスミキシング試験の結果に基づいて、凝固遅延の要因が以下の方法で判定される。即時型試験で「下に凸」の結果が得られたときは、凝固遅延の要因は、インヒビター又は因子欠乏であるが、そのいずれであるかの区別はできない。この場合、遅延型試験の結果が「下に凸」であれば凝固遅延の要因は因子欠乏、「直線」又は「上に凸」であれば凝固遅延の要因はインヒビターと判定できる。即時型試験で「上に凸」の結果が得られたときは、凝固遅延の要因は、インヒビター又はLAであるが、そのいずれであるかの区別はできない。この場合、遅延型試験の結果が即時型試験のときよりさらに明確な「上に凸」になれば凝固遅延の要因はインヒビターと判定できる。
　このように従来のクロスミキシング試験は定性的なグラフパターンで判定しているため、被検血漿によっては判定が難しいグラフパターンとなる場合がある。また、混合血漿を37℃で２時間、加温処理（インキュベーション）した後に、APTTの測定を行うことが求められるため、当該試験は、加温時間と測定時間を加味すると、約２時間半もの時間を要する。
特開２０１６－１９４４２６号公報 特開２０１６－１１８４４２号公報 特開２０１７－１０６９２５号公報
　本発明は以下を提供する。
〔１〕血液検体の凝固特性の分析方法であって、
（１）血液試料と試薬とを含む混合液の、反応時間に対する凝固反応量を示す凝固反応曲線のデータを取得することと、
（２）前記凝固反応曲線に関する微分によって得られる微分曲線のデータを算出することと、
（３）前記微分曲線の重心点に関係する情報を算出することと、
（４）前記重心点に関係する情報を用いて前記血液試料の凝固特性を評価することと、
を含む、方法。
〔２〕前記微分曲線が、前記凝固反応曲線に関する１次微分曲線及び該凝固反応曲線に関する２次微分曲線からなる群より選択される少なくとも１つである、〔１〕記載の方法。
〔３〕前記微分曲線の重心点が、重心時間vT及び重心高さvHで規定される座標（vT, vH）で表される前記１次微分曲線の重心点であり、該vT及び該vHは、該１次微分曲線をF(t)（tは時間）、F(t)が所定値xである時間をt1、t2（t1<t2）とするとき、下記式で表される、
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000005
  
〔２〕記載の分析方法。
〔４〕前記重心点に関係する情報が、前記vT、前記vH、ピーク幅vB、重心ピーク幅vW、B扁平率vAB、B時間率vTB、W扁平率vAW、W時間率vTW、平均時間vTa、平均高さvHa、vTm、vABa及びvAWaからなる群より選択される１つ以上のパラメータを含み、
　該ピーク幅vBが、前記t1からt2までのF(t)≧xとなる時間長であり、
　該重心ピーク幅vWが、前記t1からt2までのF(t)≧vHとなる時間長であり、
　該vABが、該vHと該vBとの比を表し、
　該vTBが、該vTと該vBとの比を表し、
　該vAWが、該vHと該vWとの比を表し、
　該vTWが、該vTと該vWとの比を表し、
　該vTa、該vHa、及び該vTmは、F(t)、t1及びt2が前記と同じ定義であり、F(t1)からF(t2)までのデータ点数をｎとするとき、それぞれ下記式で表され、
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000006
  
　該vABaが、該vHaと該vBとの比を表し、
　該vAWaが、該vHaと該vWとの比を表す、
〔３〕記載の分析方法。
〔５〕前記微分曲線の重心点が、重心時間pT及び重心高さpHで規定される座標（pT, pH）で表される前記２次微分曲線のプラスピークの重心点であり、該pT及び該pHは、該２次微分曲線をF'(t)（tは時間）、F'(t)が所定値xである時間をt1、t2（t1<t2）とするとき、下記式で表される、
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000007
  
〔２〕記載の分析方法。
〔６〕前記重心点に関係する情報が、前記pT、前記pH、ピーク幅pB、重心ピーク幅pW、B扁平率pAB、B時間率pTB、W扁平率pAW、及びW時間率pTWからなる群より選択される１つ以上のパラメータを含み、
　該ピーク幅pBが、前記t1からt2までのF'(t)≧xとなる時間長であり、
　該重心ピーク幅pWが、前記t1からt2までのF'(t)≧pHとなる時間長であり、
　該pABが、該pHと該pBとの比を表し、
　該pTBが、該pTと該pBとの比を表し、
　該pAWが、該pHと該pWとの比を表し、
　該pTWが、該pTと該pWとの比を表す、
〔５〕記載の分析方法。
〔７〕前記微分曲線の重心点が、重心時間mT及び重心高さmHで規定される座標（mT, mH）で表される前記２次微分曲線のマイナスピークの重心点であり、該mT及び該mHは、該２次微分曲線をF'(t)（tは時間）、F'(t)が所定値xである時間をt1、t2（t1<t2）とするとき、下記式で表される、
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000008
  
〔２〕記載の分析方法。
〔８〕前記重心点に関係する情報が、前記mT、前記mH、ピーク幅mB、重心ピーク幅mW、B扁平率mAB、B時間率mTB、W扁平率mAW、及びW時間率mTWからなる群より選択される１つ以上のパラメータを含み、
　該ピーク幅mBが、前記t1からt2までのF'(t)≦xとなる時間長であり、
　該重心ピーク幅mWが、前記t1からt2までのF'(t)≦mHとなる時間長であり、
　該mABが、該mHと該mBとの比を表し、
　該mTBが、該mTと該mBとの比を表し、
　該mAWが、該mHと該mWとの比を表し、
　該mTWが、該mTと該mWとの比を表す、
〔７〕記載の分析方法。
〔９〕前記所定値xが、前記１次微分曲線F(t)の最大値の0.5～99％である値である、〔３〕～〔８〕のいずれか１項記載の分析方法。
〔１０〕前記凝固特性が凝固因子濃度であり、該凝固因子が、凝固第V因子、凝固第VIII因子、凝固第IX因子、凝固第X因子、凝固第XI因子、及び凝固第XII因子からなる群より選択される少なくとも１種である、〔４〕、〔６〕又は〔８〕記載の分析方法。
〔１１〕前記（４）が、分析対象成分の濃度と前記扁平率との関係と、得られた前記扁平率とに基づいて、分析対象成分を定性すること及び分析対象成分の濃度を定量することを含む、〔４〕、〔６〕又は〔８〕記載の分析方法。
〔１２〕前記（４）が、前記重心時間と前記ピーク幅との比（時間率）を用いた解析を含む、〔４〕、〔６〕又は〔８〕記載の分析方法。
〔１３〕前記（４）が、前記時間率に基づいて、凝固時間延長の要因が凝固第VIII因子であるか否かを判定することを含む、〔１２〕記載の分析方法。
〔１４〕前記（４）が、分析対象成分の濃度と前記時間率との関係と、得られた前記時間率とに基づいて、分析対象成分を定性すること及び分析対象成分の濃度を定量することを含む、〔１２〕又は〔１３〕記載の分析方法。
〔１５〕前記凝固反応曲線のデータは、活性化部分トロンボプラスチン時間の測定によって得られたデータである、〔１〕～〔１４〕のいずれか１項記載の分析方法。
〔１６〕前記（２）が、取得した前記凝固反応曲線のデータの最大値に基づいて補正処理を行って補正処理済み凝固反応曲線のデータを算出することを更に含み、かつ
　該（２）において、前記微分曲線のデータの算出には該補正処理済み凝固反応曲線のデータを用いる、
〔１〕～〔１５〕のいずれか１項記載の分析方法。
〔１７〕前記（１）が、
　　被検血漿と正常血漿とを混合した混合血漿を調製することと、
　　該混合血漿の加温処理なしでの凝固時間測定を行うことと、
　　該混合血漿の加温処理後の凝固時間測定を行うことと、
を含み、
　前記（３）が、
　　該混合血漿の加温処理なしでの凝固時間測定データに基づいて凝固反応状態と関係する第１のパラメータを算出することと、
　　該混合血漿の加温処理後の凝固時間測定データに基づいて凝固反応状態と関係する第２のパラメータを算出することと、
を含み、
　前記（４）が、
　　該第１のパラメータと該第２のパラメータとの比又は差に基づいて、凝固時間の延長の要因を鑑別することと
を含む、
〔１〕～〔１６〕のいずれか１項記載の分析方法。
〔１８〕前記凝固時間測定は、プロトロンビン時間測定、活性化部分トロンボプラスチン時間測定、希釈プロトロンビン時間測定、希釈部分トロンボプラスチン時間測定、カオリン凝固時間測定、及び希釈ラッセル蛇毒時間測定のうち、少なくとも何れか１つである、〔１７〕記載の分析方法。
〔１９〕前記鑑別は、凝固時間の延長の要因が凝固因子インヒビターの影響であるかループスアンチコアグラントの影響であるかを判定することを含む、〔１７〕又は〔１８〕記載の分析方法。
〔２０〕前記混合血漿の加温時間は２分以上３０分以下である、〔１７〕～〔１９〕のいずれか１項記載の分析方法。
〔２１〕前記第１のパラメータ及び前記第２のパラメータが、前記１次微分曲線の最大値、重心高さvH、重心時間vT、ピーク幅vB、重心ピーク幅vW、B扁平率vAB、B時間率vTB、W扁平率vAW、W時間率vTW、平均時間vTa、平均高さvHa、vTm、ABa及びvAWaからなる群より選択される少なくとも１つを含む、請求項１７～２０のいずれか１項記載の分析方法。
〔１７〕～〔２０〕のいずれか１項記載の分析方法。
〔２２〕前記鑑別は、前記第１のパラメータと前記第２のパラメータとの比が１を含む所定の範囲内に収まらない場合に、凝固時間の延長の要因が凝固因子インヒビターの影響にあると判定することを含む、〔１７〕～〔２１〕のいずれか１項記載の分析方法。
〔２３〕前記鑑別は、前記第１のパラメータと前記第２のパラメータとの比が１を含む所定の範囲内に収まる場合に、凝固時間の延長の要因はループスアンチコアグラントの影響にあると判定することを含む、〔１７〕～〔２１〕のいずれか１項記載の分析方法。
〔２４〕前記鑑別は、前記第１のパラメータと前記第２のパラメータとの差が０を含む所定の範囲内に収まらない場合に、凝固時間の延長の要因が凝固因子インヒビターの影響にあると判定することを含む、〔１７〕～〔２１〕のいずれか１項記載の分析方法。
〔２５〕前記鑑別は、前記第１のパラメータと前記第２のパラメータとの差が０を含む所定の範囲内に収まる場合に、凝固時間の延長の要因はループスアンチコアグラントの影響にあると判定することを含む、〔１７〕～〔２１〕のいずれか１項記載の分析方法。
〔２６〕前記被検血漿と前記正常血漿との混合比は１対１である、〔１７〕～〔２５〕のいずれか１項記載の分析方法。
〔２７〕前記混合血漿の加温処理温度は３５℃以上３９℃以下である、〔１７〕～〔２６〕のいずれか１項記載の分析方法。
〔２８〕〔１〕～〔２７〕のいずれか１項記載の分析方法を実行するための分析装置。
図１は、一実施形態に係る血液凝固に関する分析方法の一例の概略を示すフローチャートである。 図２は、一実施形態に係る血液凝固に関するデータ解析方法の一例の概略を示すフローチャートである。 図３は、凝固反応曲線の一例を示す図である。 図４は、ベースライン調整後の凝固反応曲線の一例を示す図である。 図５Ａは、凝固反応曲線の一例の一部を拡大した図である。 図５Ｂは、ベースライン調整後の凝固反応曲線の一例の一部を拡大した図である。 図６は、補正処理済み凝固反応曲線の一例を示す図である。 図７は、補正１次曲線の一例を示す図である。 図８は、補正２次曲線の一例を示す図である。 図９は、凝固時間について説明するための図であり、ベースライン調整後の凝固反応曲線の一例を示す図である。 図１０Ａは、評価パラメータについて説明するための図であり、凝固速度曲線の一例を示す図である。 図１０Ｂは、重心点と、vTs、vTe、vB、vWを示す概念図である。点線は、１次曲線の10％演算対象域を示す図である。 図１０Ｃは、２次曲線の重心点を示す図である。 図１０Ｄは、vTa、vHa、vTmを示す概念図である。点線は、１次曲線の10％演算対象域を示す図である。 図１１は、演算対象域値、解析対象となる補正０次曲線及び補正１次曲線の範囲、重心点について説明するための図である。 図１２Ａは、演算対象域値を10%に設定した場合の重心点などについて説明するための図である。 図１２Ｂは、演算対象域値を80%に設定した場合の重心点などについて説明するための図である。 図１３は、一実施形態に係る自動分析装置の構成例の概略を示すブロック図である。 図１４は、一実施形態に係る自動分析装置の動作例の概略を示すフローチャートである。 図１５は、一実施形態に係る測定処理の一例の概略を示すフローチャートである。 図１６は、一実施形態に係る分析処理の一例の概略を示すフローチャートである。 図１７Ａは、正常血漿と凝固因子欠乏血漿との未補正０次曲線の一例を示す図である。 図１７Ｂは、正常血漿と凝固因子欠乏血漿との補正０次曲線の一例を示す図である。 図１８Ａは、正常血漿と凝固因子欠乏血漿との未補正１次曲線の一例を示す図である。 図１８Ｂは、正常血漿と凝固因子欠乏血漿との補正１次曲線の一例を示す図である。 図１９Ａは、第VIII因子濃度の対数と最大１次微分値を示す時間VmaxT及び重心時間vT10%との関係の一例を示す図である。 図１９Ｂは、第IX因子濃度の対数と最大１次微分値を示す時間VmaxT及び重心時間vT10%との関係の一例を示す図である。 図１９Ｃは、第VIII因子濃度の対数と最大１次微分値Vmax及び重心高さvH60%との関係の一例を示す図である。 図１９Ｄは、第IX因子濃度の対数と最大１次微分値Vmax及び重心高さvH60%との関係の一例を示す図である。 図２０Ａは、第VIII因子濃度の対数とピーク幅vB10%との関係の一例を示す図である。 図２０Ｂは、第IX因子濃度の対数とピーク幅vB10%との関係の一例を示す図である。 図２１Ａは、正常血漿の補正１次曲線の一例における演算対象域値に応じた重心点の位置を示す図である。 図２１Ｂは、第VIII因子欠乏血漿の補正１次曲線の一例における演算対象域値に応じた重心点の位置を示す図である。 図２１Ｃは、第IX因子欠乏血漿の補正１次曲線の一例における演算対象域値に応じた重心点の位置を示す図である。 図２２Ａは、演算対象域値に応じた重心時間の一例を示す図である。 図２２Ｂは、演算対象域値に応じた重心時間の相対差の一例を示す図である。 図２２Ｃは、演算対象域値に応じた重心高さの一例を示す図である。 図２３は、試料に応じて異なる演算対象域値に応じた重心点の挙動の一例を説明するための図である。 図２４Ａは、差分法に基づいて算出された補正１次曲線の一例を示す図である。 図２４Ｂは、区間内平均傾きに基づいて算出された補正１次曲線の一例を示す図である。 図２５Ａは、第VIII因子濃度の対数に対する補正処理を行い得られた扁平率vAB80%の一例を示す図である。 図２５Ｂは、第VIII因子濃度の対数に対する補正処理を行わずに得られた扁平率RvAB80%の一例を示す図である。 図２５Ｃは、第VIII因子濃度の対数に対する補正処理を行い得られた扁平率vAB80%の対数の一例を示す図である。 図２５Ｄは、第VIII因子濃度の対数に対する補正処理を行わずに得られた扁平率RvAB80%の対数の一例を示す図である。 図２６は、第VIII因子濃度毎の補正１次曲線の一例を示す図である。 図２７は、第VIII因子濃度の対数と重心高さvH60%の対数との関係の一例を示す図である。 図２８Ａは、種々の凝固因子の濃度の対数と時間率vTB5%の対数との関係の一例を示す図である。 図２８Ｂは、種々の凝固因子の濃度の対数と時間率vTB10%の対数との関係の一例を示す図である。 図２８Ｃは、種々の凝固因子の濃度の対数と時間率vTB20%の対数との関係の一例を示す図である。 図２８Ｄは、種々の凝固因子の濃度の対数と時間率vTB30%の対数との関係の一例を示す図である。 図２８Ｅは、種々の凝固因子の濃度の対数と時間率vTB40%の対数との関係の一例を示す図である。 図２８Ｆは、種々の凝固因子の濃度の対数と時間率vTB50%の対数との関係の一例を示す図である。 図２８Ｇは、種々の凝固因子の濃度の対数と時間率vTB60%の対数との関係の一例を示す図である。 図２８Ｈは、種々の凝固因子の濃度の対数と時間率vTB70%の対数との関係の一例を示す図である。 図２８Ｉは、種々の凝固因子の濃度の対数と時間率vTB80%の対数との関係の一例を示す図である。 図２８Ｊは、種々の凝固因子の濃度の対数と時間率vTB90%の対数との関係の一例を示す図である。 図２８Ｋは、種々の凝固因子の濃度の対数と時間率vTB95%の対数との関係の一例を示す図である。 図２９は、演算対象域値毎の第VIII因子濃度と時間率vTBとの関係の一例を示す。 図３０は、種々の凝固因子の濃度について得られた時間率の中で、各濃度の第VIII因子について得られた時間率の順位の一例を示す。 図３１は、第VIII因子濃度の対数と時間率の対数との相関関係の一例を示す。 図３２は、演算対象域値ごとに得られた第VIII因子濃度の対数と時間率の対数との相関係数の関係の一例を示す図である。 図３３は、第VIII因子濃度ごとに得られた演算対象域値と重心高さvH及び最大１次微分値Vmaxとの関係の一例を示す図である。 図３４は、第VIII因子濃度ごとに得られた演算対象域値とピーク幅vBとの関係の一例を示す図である。 図３５Ａは、第VIII因子濃度ごとに得られた演算対象域値と扁平率vABとの関係の一例を示す図である。 図３５Ｂは、第VIII因子濃度ごとに得られた演算対象域値と扁平率vABの対数との関係の一例を示す図である。 図３６Ａは、種々の凝固因子の濃度の対数と扁平率vAB5%の対数との関係の一例を示す図である。 図３６Ｂは、種々の凝固因子の濃度の対数と扁平率vAB10%の対数との関係の一例を示す図である。 図３６Ｃは、種々の凝固因子の濃度の対数と扁平率vAB20%の対数との関係の一例を示す図である。 図３６Ｄは、種々の凝固因子の濃度の対数と扁平率vAB30%の対数との関係の一例を示す図である。 図３６Ｅは、種々の凝固因子の濃度の対数と扁平率vAB40%の対数との関係の一例を示す図である。 図３６Ｆは、種々の凝固因子の濃度の対数と扁平率vAB50%の対数との関係の一例を示す図である。 図３６Ｇは、種々の凝固因子の濃度の対数と扁平率vAB60%の対数との関係の一例を示す図である。 図３６Ｈは、種々の凝固因子の濃度の対数と扁平率vAB70%の対数との関係の一例を示す図である。 図３６Ｉは、種々の凝固因子の濃度の対数と扁平率vAB80%の対数との関係の一例を示す図である。 図３６Ｊは、種々の凝固因子の濃度の対数と扁平率vAB90%の対数との関係の一例を示す図である。 図３６Ｋは、種々の凝固因子の濃度の対数と扁平率vAB95%の対数との関係の一例を示す図である。 図３７Ａは、種々の凝固因子の濃度の対数と最大１次微分値Vmaxの対数との関係の一例を示す図である。 図３７Ｂは、種々の凝固因子の濃度の対数と補正２次曲線のプラスピークの重心高さpH90%の対数との関係の一例を示す図である。 図３８は、第VIII因子濃度と演算対象域値毎の扁平率vAB及び最大１次微分値Vmaxとの関係の一例を示す。 図３９は、第VIII因子濃度の対数と扁平率の対数及び最大１次微分値Vmaxの対数との相関関係の一例を示す。 図４０は、第VIII因子の既知濃度と、図３９に示した値を用いた検量線から求めた演算濃度との比（回収率）の一例を示す。 図４１Ａは、正常血漿と各種凝固因子欠乏血漿の未補正０次曲線（補正なしの散乱光量）及び未補正１次曲線の一例を示す図である。 図４１Ｂは、正常血漿と各種凝固因子欠乏血漿の補正０次曲線及び補正１次曲線の一例を示す図である。 図４２Ａは、正常血漿と各種凝固因子欠乏血漿の未補正２次曲線の一例を示す図である。右図は、左図のｙ軸方向の縮尺を変えた図である。 図４２Ｂは、正常血漿と各種凝固因子欠乏血漿の補正２次曲線の一例を示す図である。右図は、左図のｙ軸方向の縮尺を変えた図である。 図４３Ａの上図は、各種凝固因子の濃度の対数とAPTTの対数との関係の一例を示す図である。中左図は、凝固因子の実測濃度に対する検量線に基づく演算濃度のプロットを示す。中右図は、実測濃度と演算濃度の対数プロットを示す。 図４３Ｂの上図は、各種凝固因子の濃度の対数とT5の対数との関係の一例を示す図である。中左図は、凝固因子の実測濃度に対する検量線に基づく演算濃度のプロットを示す。中右図は、実測濃度と演算濃度の対数プロットを示す。 図４３Ｃの上図は、各種凝固因子の濃度の対数とT95-T5の対数との関係の一例を示す図である。中左図は、凝固因子の実測濃度に対する検量線に基づく演算濃度のプロットを示す。中右図は、実測濃度と演算濃度の対数プロットを示す。 図４３Ｄの上図は、各種凝固因子の濃度の対数とVmaxTの対数との関係の一例を示す図である。中左図は、凝固因子の実測濃度に対する検量線に基づく演算濃度のプロットを示す。中右図は、実測濃度と演算濃度の対数プロットを示す。 図４３Ｅの上図は、各種凝固因子の濃度の対数とVmaxの対数との関係の一例を示す図である。中左図は、凝固因子の実測濃度に対する検量線に基づく演算濃度のプロットを示す。中右図は、実測濃度と演算濃度の対数プロットを示す。 図４３Ｆの上図は、各種凝固因子の濃度の対数とAmaxTの対数との関係の一例を示す図である。中左図は、凝固因子の実測濃度に対する検量線に基づく演算濃度のプロットを示す。中右図は、実測濃度と演算濃度の対数プロットを示す。 図４３Ｇの上図は、各種凝固因子の濃度の対数とAmaxの対数との関係の一例を示す図である。中左図は、凝固因子の実測濃度に対する検量線に基づく演算濃度のプロットを示す。中右図は、実測濃度と演算濃度の対数プロットを示す。 図４３Ｈの上図は、各種凝固因子の濃度の対数とvAUC20%の対数との関係の一例を示す図である。中左図は、凝固因子の実測濃度に対する検量線に基づく演算濃度のプロットを示す。中右図は、実測濃度と演算濃度の対数プロットを示す。 図４３Ｉの上図は、各種凝固因子の濃度の対数とvH5%の対数との関係の一例を示す図である。中左図は、凝固因子の実測濃度に対する検量線に基づく演算濃度のプロットを示す。中右図は、実測濃度と演算濃度の対数プロットを示す。 図４３Ｊの上図は、各種凝固因子の濃度の対数とvT50%の対数との関係の一例を示す図である。中左図は、凝固因子の実測濃度に対する検量線に基づく演算濃度のプロットを示す。中右図は、実測濃度と演算濃度の対数プロットを示す。 図４３Ｋの上図は、各種凝固因子の濃度の対数とvTs50%の対数との関係の一例を示す図である。中左図は、凝固因子の実測濃度に対する検量線に基づく演算濃度のプロットを示す。中右図は、実測濃度と演算濃度の対数プロットを示す。 図４３Ｌの上図は、各種凝固因子の濃度の対数とvTe80%の対数との関係の一例を示す図である。中左図は、凝固因子の実測濃度に対する検量線に基づく演算濃度のプロットを示す。中右図は、実測濃度と演算濃度の対数プロットを示す。 図４３Ｍの上図は、各種凝固因子の濃度の対数とvTr20%の対数との関係の一例を示す図である。中左図は、凝固因子の実測濃度に対する検量線に基づく演算濃度のプロットを示す。中右図は、実測濃度と演算濃度の対数プロットを示す。 図４３Ｎの上図は、各種凝固因子の濃度の対数とvH95%/vB95%の対数との関係の一例を示す図である。中左図は、凝固因子の実測濃度に対する検量線に基づく演算濃度のプロットを示す。中右図は、実測濃度と演算濃度の対数プロットを示す。 図４３Ｏの上図は、各種凝固因子の濃度の対数とpH5%の対数との関係の一例を示す図である。中左図は、凝固因子の実測濃度に対する検量線に基づく演算濃度のプロットを示す。中右図は、実測濃度と演算濃度の対数プロットを示す。 図４３Ｐの上図は、各種凝固因子の濃度の対数とpT50%の対数との関係の一例を示す図である。中左図は、凝固因子の実測濃度に対する検量線に基づく演算濃度のプロットを示す。中右図は、実測濃度と演算濃度の対数プロットを示す。 図４３Ｑの上図は、各種凝固因子の濃度の対数とpB70%の対数との関係の一例を示す図である。中左図は、凝固因子の実測濃度に対する検量線に基づく演算濃度のプロットを示す。中右図は、実測濃度と演算濃度の対数プロットを示す。 図４３Ｒの上図は、各種凝固因子の濃度の対数とpH5%/pB5%の対数との関係の一例を示す図である。中左図は、凝固因子の実測濃度に対する検量線に基づく演算濃度のプロットを示す。中右図は、実測濃度と演算濃度の対数プロットを示す。 図４３Ｓの上図は、各種凝固因子の濃度の対数とpAUC90%の対数との関係の一例を示す図である。中左図は、凝固因子の実測濃度に対する検量線に基づく演算濃度のプロットを示す。中右図は、実測濃度と演算濃度の対数プロットを示す。 図４３Ｔの上図は、各種凝固因子の濃度の対数とmH20%の対数との関係の一例を示す図である。中左図は、凝固因子の実測濃度に対する検量線に基づく演算濃度のプロットを示す。中右図は、実測濃度と演算濃度の対数プロットを示す。 図４３Ｕの上図は、各種凝固因子の濃度の対数とmH20%/mB20%の対数との関係の一例を示す図である。中左図は、凝固因子の実測濃度に対する検量線に基づく演算濃度のプロットを示す。中右図は、実測濃度と演算濃度の対数プロットを示す。 図４３Ｖの上図は、各種凝固因子の濃度の対数とmAUC30%の対数との関係の一例を示す図である。中左図は、凝固因子の実測濃度に対する検量線に基づく演算濃度のプロットを示す。中右図は、実測濃度と演算濃度の対数プロットを示す。 図４３Ｗの上図は、各種凝固因子の濃度の対数とvHa50%の対数との関係の一例を示す図である。中左図は、凝固因子の実測濃度に対する検量線に基づく演算濃度のプロットを示す。中右図は、実測濃度と演算濃度の対数プロットを示す。 図４３Ｘの上図は、各種凝固因子の濃度の対数とvTm50%の対数との関係の一例を示す図である。中左図は、凝固因子の実測濃度に対する検量線に基づく演算濃度のプロットを示す。中右図は、実測濃度と演算濃度の対数プロットを示す。 図４３Ｙの上図は、各種凝固因子の濃度の対数とRvH50%/RvB50%の対数との関係の一例を示す図である。中左図は、凝固因子の実測濃度に対する検量線に基づく演算濃度のプロットを示す。中右図は、実測濃度と演算濃度の対数プロットを示す。 図４４Ａは、加温及び非加温でのＬＡ血漿の補正１次曲線を示す図である。 図４４Ｂは、加温及び非加温での第VIII因子インヒビター陽性血漿の補正１次曲線を示す図である。 図４５Ａは、ＬＡ血漿と正常血漿との混合血漿（ＬＡ－ＮＰ）の非加温及び加温での補正１次曲線を示す図である。 図４５Ｂは、第VIII因子インヒビター陽性血漿と正常血漿との混合血漿（ＩＮ－ＮＰ）の非加温及び加温での補正１次曲線を示す図である。 図４６Ａは、各種血漿のAPTTについての、非加温血漿での値Ｐａ、加温血漿での値Ｐｂ、それらの比Ｐａ／Ｐｂ、及び差Ｐｂ－Ｐａを示す図である。 図４６Ｂは、各種血漿のVmaxについての、非加温血漿での値Ｐａ、加温血漿での値Ｐｂ、それらの比Ｐａ／Ｐｂ、及び差Ｐｂ－Ｐａを示す図である。 図４６Ｃは、各種血漿のAmaxについての、非加温血漿での値Ｐａ、加温血漿での値Ｐｂ、それらの比Ｐａ／Ｐｂ、及び差Ｐｂ－Ｐａを示す図である。 図４６Ｄは、各種血漿のvB10％についての、非加温血漿での値Ｐａ、加温血漿での値Ｐｂ、それらの比Ｐａ／Ｐｂ、及び差Ｐｂ－Ｐａを示す図である。 図４６Ｅは、各種血漿のvT10％についての、非加温血漿での値Ｐａ、加温血漿での値Ｐｂ、それらの比Ｐａ／Ｐｂ、及び差Ｐｂ－Ｐａを示す図である。 図４６Ｆは、各種血漿のvAB10％についての、非加温血漿での値Ｐａ、加温血漿での値Ｐｂ、それらの比Ｐａ／Ｐｂ、及び差Ｐｂ－Ｐａを示す図である。 図４６Ｇは、各種血漿のvTB10％についての、非加温血漿での値Ｐａ、加温血漿での値Ｐｂ、それらの比Ｐａ／Ｐｂ、及び差Ｐｂ－Ｐａを示す図である。 図４７Ａは、加温時間を０分、１０分、３０分、１２０分のそれぞれとした場合の「正常血漿」の補正１次曲線を示す図である。 図４７Ｂは、加温時間を０分、１０分、３０分、１２０分のそれぞれとした場合の「ＬＡ陽性血漿」の補正１次曲線を示す図である。 図４７Ｃは、加温時間を０分、１０分、３０分、１２０分のそれぞれとした場合の「第VIII因子インヒビター陽性血漿」の補正１次曲線を示す図である。 図４７Ｄは、加温時間を０分、１０分、３０分、１２０分のそれぞれとした場合の「ＬＡ陽性血漿と正常血漿との等量混合血漿」の補正１次曲線を示す図である。 図４７Ｅは、加温時間を０分、１０分、３０分、１２０分のそれぞれとした場合の「第VIII因子インヒビター陽性血漿と正常血漿との等量混合血漿」の補正１次曲線を示す図である。 図４８は、５種類の試料のそれぞれについて、１０分加温処理後の試料のAPTT測定データから得られる各種評価パラメータ、加温処理なしの試料のAPTT測定データから得られる各種評価パラメータ、及び、双方の各種評価パラメータの比を算出した結果を示す表の一例を示す図である。 図４９Ａは、加温処理なし及び３７℃で１０分加温処理後のＬＡ陽性血漿のサンプルＡに関わるクロスミキシング試験の結果を示す図である。 図４９Ｂは、加温処理なし及び３７℃で１０分加温処理後のＬＡ陽性血漿のサンプルＢに関わるクロスミキシング試験の結果を示す図である。 図４９Ｃは、加温処理なし及び３７℃で１０分加温処理後のＬＡ陽性血漿のサンプルＣに関わるクロスミキシング試験の結果を示す図である。 図４９Ｄは、加温処理なし及び３７℃で１０分加温処理後のＬＡ陽性血漿のサンプルＤに関わるクロスミキシング試験の結果を示す図である。 図４９Ｅは、加温処理なし及び３７℃で１０分加温処理後のＬＡ陽性血漿のサンプルＨに関わるクロスミキシング試験の結果を示す図である。 図４９Ｆは、加温処理なし及び３７℃で１０分加温処理後のＬＡ陽性血漿のサンプルＩに関わるクロスミキシング試験の結果を示す図である。 図４９Ｇは、加温処理なし及び３７℃で１０分加温処理後のＬＡ陽性血漿のサンプルＪに関わるクロスミキシング試験の結果を示す図である。 図４９Ｈは、加温処理なし及び３７℃で１０分加温処理後のＬＡ陽性血漿のサンプルＫに関わるクロスミキシング試験の結果を示す図である。 図４９Ｉは、加温処理なし及び３７℃で１０分加温処理後のＬＡ陽性血漿のサンプルＯに関わるクロスミキシング試験の結果を示す図である。 図４９Ｊは、加温処理なし及び３７℃で１０分加温処理後のＬＡ陽性血漿のサンプルＰに関わるクロスミキシング試験の結果を示す図である。 図４９Ｋは、加温処理なし及び３７℃で１０分加温処理後のＬＡ陽性血漿のサンプルＱに関わるクロスミキシング試験の結果を示す図である。 図４９Ｌは、加温処理なし及び３７℃で１０分加温処理後のＬＡ陽性血漿のサンプルＲに関わるクロスミキシング試験の結果を示す図である。 図５０Ａは、加温処理なし及び３７℃で１０分加温処理後の第VIII因子インヒビター陽性血漿のサンプルＥに関わるクロスミキシング試験の結果を示す図である。 図５０Ｂは、加温処理なし及び３７℃で１０分加温処理後の第VIII因子インヒビター陽性血漿のサンプルＦに関わるクロスミキシング試験の結果を示す図である。 図５０Ｃは、加温処理なし及び３７℃で１０分加温処理後の第VIII因子インヒビター陽性血漿のサンプルＧに関わるクロスミキシング試験の結果を示す図である。 図５０Ｄは、加温処理なし及び３７℃で１０分加温処理後の第VIII因子インヒビター陽性血漿のサンプルＬに関わるクロスミキシング試験の結果を示す図である。 図５０Ｅは、加温処理なし及び３７℃で１０分加温処理後の第VIII因子インヒビター陽性血漿のサンプルＭに関わるクロスミキシング試験の結果を示す図である。 図５０Ｆは、加温処理なし及び３７℃で１０分加温処理後の第VIII因子インヒビター陽性血漿のサンプルＮに関わるクロスミキシング試験の結果を示す図である。 図５０Ｇは、加温処理なし及び３７℃で１０分加温処理後の第VIII因子インヒビター陽性血漿のサンプルＳに関わるクロスミキシング試験の結果を示す図である。 図５０Ｈは、加温処理なし及び３７℃で１０分加温処理後の第VIII因子インヒビター陽性血漿のサンプルＴに関わるクロスミキシング試験の結果を示す図である。 図５０Ｉは、加温処理なし及び３７℃で１０分加温処理後の第VIII因子インヒビター陽性血漿のサンプルＵに関わるクロスミキシング試験の結果を示す図である。 図５１Ａは、各サンプルの被検血漿（単体）の加温処理なし及び３７℃で１０分加温処理後のAPTTの例を示す図である。 図５１Ｂは、各サンプルの被検血漿と正常血漿との混合血漿の加温処理なし及び３７℃で１０分加温処理後のAPTTの例を示す図である。 図５２Ａは、ＬＡ陽性血漿のサンプルＡと正常血漿との等量混合血漿の加温処理なし及び３７℃で１０分加温処理後の補正１次曲線の例を示す図である。 図５２Ｂは、ＬＡ陽性血漿のサンプルＢと正常血漿との等量混合血漿の加温処理なし及び３７℃で１０分加温処理後の補正１次曲線の例を示す図である。 図５２Ｃは、ＬＡ陽性血漿のサンプルＣと正常血漿との等量混合血漿の加温処理なし及び３７℃で１０分加温処理後の補正１次曲線の例を示す図である。 図５２Ｄは、ＬＡ陽性血漿のサンプルＤと正常血漿との等量混合血漿の加温処理なし及び３７℃で１０分加温処理後の補正１次曲線の例を示す図である。 図５２Ｅは、ＬＡ陽性血漿のサンプルＨと正常血漿との等量混合血漿の加温処理なし及び３７℃で１０分加温処理後の補正１次曲線の例を示す図である。 図５２Ｆは、ＬＡ陽性血漿のサンプルＩと正常血漿との等量混合血漿の加温処理なし及び３７℃で１０分加温処理後の補正１次曲線の例を示す図である。 図５２Ｇは、ＬＡ陽性血漿のサンプルＪと正常血漿との等量混合血漿の加温処理なし及び３７℃で１０分加温処理後の補正１次曲線の例を示す図である。 図５２Ｈは、ＬＡ陽性血漿のサンプルＫと正常血漿との等量混合血漿の加温処理なし及び３７℃で１０分加温処理後の補正１次曲線の例を示す図である。 図５２Ｉは、ＬＡ陽性血漿のサンプルＯと正常血漿との等量混合血漿の加温処理なし及び３７℃で１０分加温処理後の補正１次曲線の例を示す図である。 図５２Ｊは、ＬＡ陽性血漿のサンプルＰと正常血漿との等量混合血漿の加温処理なし及び３７℃で１０分加温処理後の補正１次曲線の例を示す図である。 図５２Ｋは、ＬＡ陽性血漿のサンプルＱと正常血漿との等量混合血漿の加温処理なし及び３７℃で１０分加温処理後の補正１次曲線の例を示す図である。 図５２Ｌは、ＬＡ陽性血漿のサンプルＲと正常血漿との等量混合血漿の加温処理なし及び３７℃で１０分加温処理後の補正１次曲線の例を示す図である。 図５３Ａは、第VIII因子インヒビター陽性血漿のサンプルＥと正常血漿との等量混合血漿の加温処理なし及び３７℃で１０分加温処理後の補正１次曲線の例を示す図である。 図５３Ｂは、第VIII因子インヒビター陽性血漿のサンプルＦと正常血漿との等量混合血漿の加温処理なし及び３７℃で１０分加温処理後の補正１次曲線の例を示す図である。 図５３Ｃは、第VIII因子インヒビター陽性血漿のサンプルＧと正常血漿との等量混合血漿の加温処理なし及び３７℃で１０分加温処理後の補正１次曲線の例を示す図である。 図５３Ｄは、第VIII因子インヒビター陽性血漿のサンプルＬと正常血漿との等量混合血漿の加温処理なし及び３７℃で１０分加温処理後の補正１次曲線の例を示す図である。 図５３Ｅは、第VIII因子インヒビター陽性血漿のサンプルＭと正常血漿との等量混合血漿の加温処理なし及び３７℃で１０分加温処理後の補正１次曲線の例を示す図である。 図５３Ｆは、第VIII因子インヒビター陽性血漿のサンプルＮと正常血漿との等量混合血漿の加温処理なし及び３７℃で１０分加温処理後の補正１次曲線の例を示す図である。 図５３Ｇは、第VIII因子インヒビター陽性血漿のサンプルＳと正常血漿との等量混合血漿の加温処理なし及び３７℃で１０分加温処理後の補正１次曲線の例を示す図である。 図５３Ｈは、第VIII因子インヒビター陽性血漿のサンプルＴと正常血漿との等量混合血漿の加温処理なし及び３７℃で１０分加温処理後の補正１次曲線の例を示す図である。 図５３Ｉは、第VIII因子インヒビター陽性血漿のサンプルＵと正常血漿との等量混合血漿の加温処理なし及び３７℃で１０分加温処理後の補正１次曲線の例を示す図である。 図５４Ａは、ＬＡ陽性血漿の個々のサンプルと正常血漿との等量混合血漿に関わる「演算対象域値Sを10％としたときの扁平率」の加温処理なしと１０分加温処理後との比（vAB10% 10/0比）、及び第VIII因子インヒビター陽性血漿の個々のサンプルと正常血漿との等量混合血漿に関わる「演算対象域値Sを10％としたときの扁平率」の加温処理なしと１０分加温処理後との比（vAB10% 10/0比）を示す図である。 図５４Ｂは、ＬＡ陽性血漿の個々のサンプルと正常血漿との等量混合血漿に関わる「演算対象域値Sを60％としたときの重心高さ」の加温処理なしと１０分加温処理後との比（vH60% 10/0比）、及び第VIII因子インヒビター陽性血漿の個々のサンプルと正常血漿との等量混合血漿に関わる「演算対象域値Sを60％としたときの重心高さ」の加温処理なしと１０分加温処理後との比（vH60% 10/0比）を示す図である。 図５５Ａは、ＬＡ陽性血漿の個々のサンプルと正常血漿との等量混合血漿に関わる「演算対象域値Sを10％としたときの扁平率」の加温処理なしと１０分加温処理後との差（vAB10% 10/0差）、及び第VIII因子インヒビター陽性血漿の個々のサンプルと正常血漿との等量混合血漿に関わる「演算対象域値Sを10％としたときの扁平率」の加温処理なしと１０分加温処理後との差（vAB10% 10/0差）を示す図である。 図５５Ｂは、ＬＡ陽性血漿の個々のサンプルと正常血漿との等量混合血漿に関わる「演算対象域値Sを60％としたときの重心高さ」の加温処理なしと１０分加温処理後との差（vH60% 10/0差）、及び第VIII因子インヒビター陽性血漿の個々のサンプルと正常血漿との等量混合血漿に関わる「演算対象域値Sを60％としたときの重心高さ」の加温処理なしと１０分加温処理後との差（vH60% 10/0差）を示す図である。 図５５Ｃは、ＬＡ陽性血漿の個々のサンプルと正常血漿との等量混合血漿に関わる「演算対象域値Sを60％としたときの重心時間」の加温処理なしと１０分加温処理後との差（vT60% 10/0差）、及び第VIII因子インヒビター陽性血漿の個々のサンプルと正常血漿との等量混合血漿に関わる「演算対象域値Sを60％としたときの重心時間」の加温処理なしと１０分加温処理後との差（vT60% 10/0差）を示す図である。 図５６は、加温処理なし及び３７℃で２分加温処理後のＬＡ陽性血漿のサンプルに関わるクロスミキシング試験の結果を示す図である。 図５７は、３７℃で２分加温処理後及び１０分加温処理後のＬＡ陽性血漿のサンプルに関わるクロスミキシング試験の結果を示す図である。 図５８は、加温処理なし及び３７℃で２分加温処理後の第VIII因子インヒビター陽性血漿のサンプルに関わるクロスミキシング試験の結果を示す図である。 図５９は、３７℃で２分加温処理後及び１０分加温処理後の第VIII因子インヒビター陽性血漿のサンプルに関わるクロスミキシング試験の結果を示す図である。 図６０は、ＬＡ陽性血漿のサンプルと正常血漿との等量混合血漿の加温処理なし及び３７℃で２分加温処理後の補正１次曲線の例を示す図である。 図６１は、第VIII因子インヒビター陽性血漿のサンプルと正常血漿との等量混合血漿の加温処理なし及び３７℃で２分加温処理後の補正１次曲線の例を示す図である。 図６２は、５種類の試料のそれぞれについて、２分加温処理後の試料のAPTT測定データから得られる各種評価パラメータ、加温処理なしの試料のAPTT測定データから得られる各種評価パラメータ、及び、双方の各種評価パラメータの比を算出した結果を示す表の一例を示す図である。 図６３Ａは、混合血漿のAPTT時間（T50）及びVmaxについて、非加温血漿と加温血漿との差（Ｐｂ－Ｐａ）及び比（Ｐｂ／Ｐａ）を示す図である。LA：ＬＡ陽性血漿と正常血漿との混合血漿、Inhibitor：第VIII因子インヒビター陽性血漿と正常血漿との混合血漿。 図６３Ｂは、混合血漿（LA及びInhibitor）のvAB40％及びvABa40％について、非加温血漿と加温血漿との差（Ｐｂ－Ｐａ）及び比（Ｐｂ／Ｐａ）を示す図である。 図６３Ｃは、混合血漿（LA及びInhibitor）のvH40％及びvHa40％について、非加温血漿と加温血漿との差（Ｐｂ－Ｐａ）及び比（Ｐｂ／Ｐａ）を示す図である。 図６３Ｄは、混合血漿（LA及びInhibitor）のvAUC90％及びvW10％/vB10％について、非加温血漿と加温血漿との差（Ｐｂ－Ｐａ）及び比（Ｐｂ／Ｐａ）を示す図である。 図６３Ｅは、混合血漿（LA及びInhibitor）のpAUC80％及びmAUC20％について、非加温血漿と加温血漿との差（Ｐｂ－Ｐａ）及び比（Ｐｂ／Ｐａ）を示す図である。
　本発明は、波形解析を応用した血液試料の凝固特性の分析方法に関する。また本発明は、血液凝固検査の検査時間を短縮化することに関する。
　本発明によれば、血液試料の凝固特性の優れた分析を実現できる。例えば本発明によれば、患者検体の凝固因子の欠乏状況、凝固因子の濃度、様々な凝固因子の影響などを見積もることができる。また本発明によれば、クロスミキシング試験の検査時間を短縮化することができる。例えば、凝固因子インヒビターの有無の鑑別するにあたり、加温の時間を２時間よりも短く、例えば１０分とすることができる。さらに凝固因子インヒビターの有無の鑑別に際し、パラメータの比又は差を求めることにより定量的な判定が可能となる。
　本発明の一実施形態について図面を参照して説明する。本実施形態は、血液凝固に関連する検体の特性を分析することに関する。特に、内因系凝固機能の検査に用いられる活性化部分トロンボプラスチン時間（APTT）測定が行われ、得られたデータの解析が行われる。外因系凝固機能の検査に用いられるプロトロンビン時間（PT）を含む凝固反応曲線を利用する他の検査項目の測定で得られたデータの解析などにも同様に適用され得る。
１．分析方法
１．１．分析方法の概要
　本実施形態に係る分析方法の概要を図１に示すフローチャートを参照して説明する。初めに、検体に関して、検査に用いられる試料が調製される（ステップＳ１０１）。調製された試料を対象として、凝固時間の測定が実行される（ステップＳ１０２）。凝固時間の測定の例として、APTT、PTなどの測定が挙げられる。凝固時間の測定で得られたデータに対する所定の解析が行われる（ステップＳ１０３）。解析結果に基づいて、検体について血液凝固機能に関する評価が行われる（ステップＳ１０４）。
１．２．試料調製及び凝固時間測定
　ステップＳ１０１として行われる試料の調製と、ステップＳ１０２として行われる凝固時間の測定について説明する。ここでは、凝固時間の測定として、特にAPTTの測定を例に挙げて説明する。
　検査対象となる検体は、例えば、凝固因子に起因する異常の検査が要求されている被験者に由来する血液検体である。より具体的には、血液検体として、被験者の血漿が用いられる。血液検体には、凝固検査に通常用いられる周知の抗凝固剤が添加され得る。例えば、クエン酸ナトリウム入り採血管を用いて採血され、速やかに血漿が遠心分離され得る。
　被検血漿には、接触因子系の活性化剤とリン脂質とが加えられる。活性化剤としては、エラグ酸、セライト、カオリン、シリカ、ポリフェノール化合物などが用いられ得る。リン脂質としては、動物由来、植物由来、合成由来のリン脂質が用いられる。動物由来のリン脂質の例としては、ウサギ脳由来、ニワトリ由来、ブタ由来のものが挙げられる。植物由来のリン脂質の例としては、大豆由来のものが挙げられる。また、トリス塩酸等の緩衝液が適宜加えられてもよい。
　APTTを測定するためには、市販のAPTT測定試薬、又は試薬キットなどが用いられ得る。一例としては、コアグピアAPTT-N（積水メディカル株式会社製）が用いられる。
　上述の被検血漿に活性化剤及びリン脂質が加えられた試料は、加温され、血漿中の接触因子は活性化される。温度条件は、例えば３０℃以上４０℃以下であり、好ましくは３５℃以上３９℃以下である。
　その後、試料には、塩化カルシウム液（カルシウムイオン）が添加され、凝固反応が開始させられる。塩化カルシウム液添加後の混合液の凝固反応が計測され得る。計測には、光の散乱光量又は透過度（吸光度でもよい）を計測する光学的な方法、又は血漿の粘度を計測する力学的な方法などが用いられ得る。計測される時間は、例えば、最終試薬の添加タイミングを開始時点として数十秒から５分程度である。この期間の間、例えば周期的に計測が繰り返し行われる。例えば、光学的な方法であれば、０．１秒周期で測光が行われてもよい。例えば、塩化カルシウム液が添加された時点が、反応開始時間に設定され得る。他のタイミングが反応開始時間として定義されてもよい。計測中の温度条件は、例えば３０℃以上４０℃以下であり、好ましくは３５℃以上３９℃以下である。
　上述の測定は、一連の測定を自動で行うことができる装置を用いて行われてもよい。このような装置の一例として、血液凝固自動分析装置ＣＰ３０００（積水メディカル株式会社製）が挙げられる。また、一部の動作が用手法で行われてもよい。例えば、試料の調製は用手法で行われ、光学分析装置で測定が行われてもよい。また、混合方法、測定方法に応じて、各種条件は適当に設定され得る。
１．３．データ解析
１．３．１．データ解析の概略
　ステップＳ１０３として行われるデータ解析について説明する。図２は、データ解析の概略を示すフローチャートである。
　ステップＳ２０１において、分析対象であるデータが取得される。このデータは、血液凝固測定で得られるデータであり、例えば上述のAPTT測定で得られる凝固反応過程を反映するデータである。例えば、被検血漿に活性化剤及びリン脂質が加えられた試料に塩化カルシウム液が添加され、その後の散乱光量の時間変化を示すデータが取得される。データ解析は、測定後ただちに行われてもよいし、予め測定して記憶しておいたデータに対して後から行われてもよい。
　図３に取得されるデータの一例を示す。この図において、横軸は、塩化カルシウム液が添加された後の経過時間を示し、縦軸は散乱光量を示す。時間経過に伴って、混合液の凝固反応が進むため、散乱光量が増加している。本実施形態では、このような計測した光量の時間変化を示す曲線を、凝固反応曲線と称することにする。
　図３に示した例は、散乱光量の計測結果であり、凝固反応曲線はシグモイド状となっているが、透過光量が計測される場合には、凝固反応曲線は逆シグモイド状になる。以降の説明では、散乱光量が計測される場合を例に示すが、透過光量や吸光度が計測される場合にも、同様の処理が行われ得る。混合液の粘度変化で凝固反応曲線を得る方法を含め、その他の方法で得られた凝固反応量を示すデータが解析対象にされてもよい。
　ステップＳ２０２において、ベースライン調整が行われる。ベースライン調整には、平滑化処理と、ゼロ点調整とが含まれる。図４は、図３に示すデータに対してベースライン調整を行った後のデータの一例を示す。図５Ａは、図３に示すベースライン調整前のデータの拡大図を示す。図５Ｂは、図４に示すベースライン調整後のデータの拡大図を示す。図５Ａと図５Ｂとを比較してわかるように、ベースライン調整では、ノイズ除去を含む平滑化処理が行われる。平滑化処理には、ノイズ除去に関する種々の公知の方法の何れかが用いられ得る。図３に示すように、測定開始時点の散乱光量は0より大きい。これは、被検血漿を含む混合液が元々光を散乱させるためである。ベースライン調整では、図４に示すように、測定開始時点の散乱光量が0に調整される。
　ステップＳ２０３において、ベースライン調整後のデータに対して補正処理が行われる。本実施形態では、ベースライン調整後の凝固反応曲線の最大値が100となるように、補正が行われる。図６は、図４に示すデータに対して、補正処理を行った結果を示す。
　補正処理では、具体的には以下の処理が行われる。ベースライン調整後の凝固反応曲線をD(t)と表すことにする。D(t)の最大値をDmaxとし、D(t)の最小値をDminとする。D(t)の変化幅、すなわち、Dmax-Dminを、Drangeとする。補正後の値をP(t)としたときに、P(t)は下記式(1)で表される。
　　P(t)=[(D(t)-Dmin)/Drange]×100 (1)
　補正後のデータから得られる凝固反応曲線を、補正処理済み凝固反応曲線と称することにする。この補正処理の目的は、以下のとおりである。ベースライン調整後の凝固反応曲線の高さは、検体のフィブリノゲン濃度に依存する。フィブリノゲン濃度には個人差があり、検体によって異なり得る。この補正によって、フィブリノゲン濃度に依存しない凝固波形パラメータなどを求めることができる。すなわち、この補正によって、検体間でのベースライン調整後の凝固反応曲線の形状の差異を定量的に比較することができるようになる。なお、ここでは補正後の値が0から100までとなるように補正したが、他の値であってもよい。また、この補正処理は必ずしも行われなくてもよい。
　ステップＳ２０４において、凝固反応曲線を微分した微分曲線が算出される。図７は、図６に示す補正処理済み凝固反応曲線に対して１次微分に対応する処理を行って得られる１次微分曲線を示す。該１次微分曲線の算出方法については、後に詳述する。補正処理済み凝固反応曲線に関する１次微分（補正１次微分）は、総反応変化幅を100としたときの時間あたりの変化幅であるので、凝固反応進行率（凝固進行率）といえる。凝固進行率を全域で積分すると100になる。一方、補正処理を行っていない凝固反応曲線に関する１次微分は、実測した反応変化幅の時間あたりの値を示し、凝固速度を示す。
　図７に示す補正処理済み凝固反応曲線の１次微分曲線についてさらに微分して、図８に示すような２次微分曲線が取得されてもよい。また、補正処理なしの凝固反応曲線の１次微分曲線についてさらに微分して、凝固加速度を示す２次微分曲線が取得されてもよい。
　なお、本明細書においては、補正処理済み凝固反応曲線、及び補正処理なし凝固反応曲線を、それぞれ補正０次曲線、及び未補正０次曲線ともいい、またこれらを総称して「０次曲線」ともいう。また本明細書においては、該補正０次曲線、及び該未補正０次曲線の１次微分曲線を、それぞれ補正１次曲線、及び未補正１次曲線ともいい、またこれらを総称して「１次曲線」ともいう。また本明細書においては、該補正０次曲線、及び該未補正０次曲線の２次微分曲線、あるいは該補正１次曲線、及び該未補正１次曲線の１次微分曲線を、それぞれ補正２次曲線、及び未補正２次曲線ともいい、またこれらを総称して「２次曲線」ともいう。
　本明細書では、凝固進行率、凝固速度、その他凝固の進行を表す値を総称して１次微分値という。凝固進行率又は凝固速度を例に挙げて説明する事項は、１次微分値全般について同様に当てはまり得る。また本明細書では、凝固加速度、その他１次微分値の変化率を表す値を総称して２次微分値という。
　ステップＳ２０５において、各種の評価パラメータの算出が行われる。評価パラメータは、検体の血液凝固特性を示すパラメータである。評価パラメータについては、後に詳述する。
１．３．２．微分曲線の算出
　ステップＳ２０４で行われる凝固反応曲線（０次曲線）の微分曲線の算出の一例について説明する。凝固反応曲線A(n)から１次曲線B(n)を得るための微分処理としては、下記式(2)を用いた差分法が用いられ得る。
　　B(n)=A(n)-A(n-1) (2)
　ただし、凝固時間が顕著に遅くなる凝固異常検体の凝固反応曲線は、正常検体と比べて上昇時の曲線の傾斜が緩やかとなり、反応終了段階の凝固反応曲線の形状も緩やかなプラトー状になる。このような場合には、A(n)とA(n-1)の差が小さいために、１次曲線の最大値付近においても、B(n)の値が小さくなる。このような状態は、S/N比が悪化して数値演算上のノイズの影響を受け易い状態であり、凝固反応に起因する情報がノイズに埋もれ易い状態である。
　また、その変化量と測定のタイミングとによっては、上記式(2)を用いた１次微分の算出結果は離散的な値となり得る。例えば、0.1秒ごとに行われる測光で得られた血液凝固反応曲線について、n番目の値に関する１次微分値を、n番目の値とn-1番目の値との差分値として求めることを考える。凝固反応曲線の高さが低いとき、得られる１次微分曲線が離散的な値となってしまう場合がある。例えば、フィブリノゲン濃度が低いとき、凝固反応曲線の高さは低くなる。本実施形態のような血液分析では、このような現象が頻繁に発生し得る。一つの解決手段として、測定時間間隔を短くして測定感度を上げることが考えられる。しかしながら、測定時間間隔を短くすることは、装置のコストを上昇させる等、好ましくないこともある。
　そこで、次のようにして１次曲線を取得してもよい。補正処理を行っていない又は補正処理済みの凝固反応曲線における各測定点Nについて、平均傾き値を求める。平均傾き値の算出には、一定時間内の測定データが利用され得る。すなわち、各測定点Nの前後の一定数の測定データ、例えば、N-KからN＋Kまでの2K＋1個の測定データが利用され得る。例えば、N-2，N-1，N，N+1，N+2番目の5点の測定データが利用され得る。平均傾き値は、これら複数の測定点を直線近似したときの傾き値を意味する。直線近似の演算方法には、最小二乗法など周知の方法が利用され得る。これらの測定データの平均傾き値が、測定点Nでの１次微分値とみなされ得る。
　近似直線の演算方法の一例を次に示す。xを測光時間、yを凝固反応曲線の高さとする。例えば、測定点が(xi, yi)、ここで（i=N-K, …, N+K）のとき、下記式(3)の偏微分を考える。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000009
  
　区間内平均傾きaは、下記式(4)で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000010
  
上記式(4)に各時点Nに関するデータを代入することで、区間内平均傾きaが算出され得る。
　凝固反応曲線から得られる一連の区間内平均傾きaを１次曲線として用いることで、上記式(2)を用いて算出した１次曲線を用いる場合より詳細な情報が得られる。１次曲線から２次曲線を求める場合にも同様である。
１．３．３．評価パラメータ
　本実施形態では、上記の０次曲線、１次曲線、及び２次曲線に基づいて、種々の評価パラメータが算出される。それらパラメータについて説明する。
１．３．３．１．凝固時間
　本実施形態の評価パラメータの１つである凝固時間について、図９に示すベースライン調整後の凝固反応曲線を参照して説明する。ベースライン調整後の凝固反応曲線における散乱光量の変化量が所定条件を満たした時点を凝固終了判定点Teとする。例えば、単位時間当たりの散乱光量の変化量が所定値以下となった時点を凝固終了判定点Teとする。この凝固終了判定点Teの散乱光量を100%としたときに、散乱光量がc%に相当する反応経過時間を、凝固時間Tcとする。例えば、散乱光量が50%に相当する反応経過時間を、凝固時間T50とする。このように凝固時間Tcを定義することで、APTT測定中に、ベースライン調整後の凝固反応曲線が所定条件を満たした凝固終了判定点Te（=T100）が検出されたときに、直ちに凝固時間Tcが決定され得る。なお、凝固時間Tcの決定方法については本方法に限らない。他の方法により凝固時間が定義されてもよい。例えば、凝固速度が最大になる時間を凝固時間としてもよいし、図６に示したような補正後の散乱光量が50%となる反応経過時間T50を凝固時間Tcとしてもよい。
１．３．３．２．演算対象域値
　演算対象域値について、図１０Ａを参照して説明する。図１０Ａは、補正１次曲線の一例を示す。補正１次微分（凝固進行率）の最大値Vmaxも評価パラメータになり得る。ここでは、補正１次曲線を例に挙げたが、未補正１次曲線でも同様である。凝固速度の最大値も評価パラメータになり得る。
　本実施形態では、１次微分値の最大値Vmaxを100%としたときに、１次微分値がS%以上であるデータを以後の解析対象とする場合に、このSの値を演算対象域値S(%)と称することにする。演算対象域値Sは、１次曲線のピーク形状の特徴を反映するピーク範囲を限定するために設定され得る。ピーク形状を相対的に広く限定するためには、演算対象域値Sは5%～20%に設定され得る。演算対象域値Sを大きくするとピークの上部形状の影響が相対的に大きく解析結果に反映される。ピーク上部の形状を解析するためには、演算対象域値Sは20%～95%に設定され得る。演算対象域値Sは、凝固速度曲線に対しても同様に適用され得る。演算対象域値Sはまた、２次曲線にも適用され得る。図８に示すように、２次曲線は、プラス方向及びマイナス方向の双方にピークを有する。演算対象域値Sは、２次曲線のプラスピーク及びマイナスピークのそれぞれに対して設定され得る。
１．３．３．３．重心点
　１次曲線における重心点について、図１０Ａを参照して説明する。図１０Ａでは、補正１次曲線がF(t)で示される。このときに、F(t)について、演算対象域値Sがx%以上の値を演算対象データとした「重み付き平均値」に相当する位置を重心点（vTx, vHx）とする。
　１次曲線において、重心点を示す時間を重心時間vTとする。すなわち、１次曲線の重心時間vTは、反応開始時間から重心点までの時間であり、図１０Ａに示すようなグラフにおける重心点のx座標である。１次曲線において、重心点を示す１次微分値を重心高さvHとする。すなわち、１次曲線の重心高さvHは、図１０Ａに示すようなグラフにおける重心点のy座標である。
　より具体的には、重心時間vTと重心高さvHとは次のようにして求められる。V=F(t)の最大値をVmaxとする。演算対象域値S(%)を用いて、F(t)≧Vmax×S×0.01を満たす時間tのデータ群をt[t1, …t2]とする。すなわち、図１０Ａに示すように、t1＜t2とし、F(t1)=Vmax×S×0.01、F(t2)=Vmax×S×0.01としたときに、時刻t1～t2のデータ群をt[t1, …t2]とする。このとき、積算値Mを下記式(5)とする。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000011
  
　このとき、重心時間vT及び重心高さvHは、それぞれ次式(6)及び(7)で算出される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000012
  
　上述の説明では、図１０Ａを参照して補正１次曲線の場合を示したが、未補正１次曲線の場合にも、同様に、重心点、重心時間vT及び重心高さvHが定義され得る。すなわち、凝固速度及び補正１次微分を含む１次微分値について、重心点、重心時間vT及び重心高さvHが定義され得る。これら重心時間vT及び重心高さvHは、評価パラメータになり得る。なお、上記のF(t1)=Vmax×S×0.01、F(t2)=Vmax×S×0.01を満たすt1及びt2（t1＜t2）も評価パラメータとなり得、以下、該１次曲線に関するt1及びt2を、それぞれ領域始点時間vTs、及び領域終点時間vTe（vTs＜vTe）と呼ぶことがある（図１０Ａ）。
　図１１に、あるデータに関して、演算対象域値Sと、その際の解析対象となる補正０次曲線及び補正１次曲線の範囲と、得られる重心点との関係を示す。図１１において、上段、中断、及び下段は、演算対象域値Sがそれぞれ10%、50%及び80%の場合を示す。左列は補正０次曲線を示し、右列は補正１次曲線及び重心点を示す。演算対象域値Sの変化に伴って、重心点の位置は、図１１に示すように変化する。
　同様に、２次曲線についても、重心点、重心時間、及び重心高さが定義され得る。２次曲線は、図８に示すように２次微分値のプラス方向及びマイナス方向の双方にピークを有する。そのため、２次曲線の重心点は、プラスピーク及びマイナスピークの両方に対して算出され得る。例えば、プラスピークについては、２次曲線A=F'(t)の最大値がAmaxであり、演算対象域値がS(%)のとき、F'(t)≧Amax×S×0.01を満たす時間t[t1, …, t2]（t1＜t2）を求め、上式（5）～(7)に従って、プラスピークの重心時間pT、及び重心高さpHを算出する。マイナスピークについては、２次曲線A=F'(t)の最小値がAminであり、演算対象域値がS(%)のとき、F'(t)≦Amin×S×0.01を満たす時間t[t1, …, t2]（t1＜t2）を求め、上式（5）～(7)に従って、マイナスピークの重心時間mT、及び重心高さmHを算出する。演算対象域値Sの変化に伴って、重心点の位置は変化する。
１．３．３．４．ピーク幅、平均点、扁平率及び時間率
　反応時間が重心時間vTより短い領域において１次微分値が演算対象域値S以上となる最少の反応時間から、反応時間が重心時間vTより長い領域において１次微分値が演算対象域値S以上となる最大の反応時間までの時間のうち、F(t)≧Sとなる時間長（F(t)≧Sとなるデータ点数から１を引いたものに測光時間間隔を乗じて得られた値）を、１次曲線のピーク幅vBとする。図１０Ａに示す例では、時刻vTsから時刻vTeまでがピーク幅vBとなる。同様に、２次曲線のプラスピークにおける２次微分値が演算対象域値S以上となる反応時間の最小値及び最大値はそれぞれpTs、pTeであり、pTsからpTeまでの時間のうち、F’(t)≧Sとなる時間長（F’(t)≧Sとなるデータ点数から１を引いたものに測光時間間隔を乗じて得られた値）を２次曲線のプラスピークのピーク幅pBとする。同様に、２次曲線のマイナスピークにおける２次微分値が演算対象域値S以下となる反応時間の最小値及び最大値はそれぞれmTs、mTeであり、mTsからmTeまでの時間のうち、F’(t)≦Sとなる時間長（F’(t)≦Sとなるデータ点数から１を引いたものに測光時間間隔を乗じて得られた値）を２次曲線のマイナスピークのピーク幅mBとする。
　本発明で用いられるパラメータのさらなる例としては、重心ピーク幅vWが挙げられる。図１０Ｂに示すとおり、vWは、１次曲線F(t)≧vHを満たすピーク幅（F(t)≧vHを満たす最小時間から最大時間までの間で、F(t)≧vHとなる時間長）である。本発明で用いられるパラメータのさらなる例としては、vTrが挙げられる。vTrは、vTsからvTeまでの幅である。図１０Ｂは、演算対象域値Sが10％のときの１次曲線の演算対象域（点線）を示す。図１０Ｂの上には重心点（vT, vH）（黒丸印）、vTs、vTeが、図１０Ｂの下には、vB、vWが示されている。同様に、２次曲線のプラスピークについては、F'(t)≧pHを満たすピーク幅を重心ピーク幅pWとする。２次曲線のマイナスピークについては、F'(t)≦mHを満たす凝固反応時間の幅を重心ピーク幅mWとする。図１０Ｃには、演算対象域値Sが10％のときの２次曲線のプラスピークの重心点（pT, pH）及びマイナスピークの重心点（mT, mH）が示されている。
　本発明で用いられるパラメータのさらなる例としては、平均時間vTa、平均高さvHa、及び領域中央時間vTmが挙げられる。図１０Ｄには、演算対象域値Sが10％のときの１次曲線の平均点（vTa, vHa）（白菱印）、重心点（vT, vH）（黒丸印）、vTs、vTe、及びvTmが示されている。vTa、vHa、及びvTmは、F(vTs)からF(vTe)までのデータ点数をｎとしたときにそれぞれ以下の式で表される。同様に、２次曲線のプラスピーク及びマイナスピークについての領域中央時間vTmを求めることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000013
  
　本実施形態では、１次曲線の重心高さvH、平均高さvHa、ピーク幅vB、及び重心ピーク幅vWを用いて、１次曲線のピーク幅に基づく扁平率vAB、vABa、及び重心ピーク幅に基づく扁平率vAW、vAWaを下記式(8a)、(8b)、(8c)、(8d)のように定義する。
　　vAB=vH/vB (8a)
　　vAW=vH/vW (8b)
　　vABa=vHa/vB (8c)
　　vAWa=vHa/vW (8d)
　また、本実施形態では、１次曲線の重心時間vT、ピーク幅vB、及び重心ピーク幅vWを用いて、１次曲線のピーク幅に基づく時間率vTB及び重心ピーク幅に基づく時間率vTWを下記式(9a)、(9b)のように定義する。
　　vTB=vT/vB (9a)
　　vTW=vT/vW (9b)
　なお、扁平率は、vAB=vB/vH、vAW=vW/vHであってもよく、またvABa=vB/vHa、vAWa=vW/vHaであってもよい。すなわち、扁平率は、重心高さvT又は平均高さvHaと、ピーク幅vB又はvWとの比であればよい。同様に、時間率は、vTB=vB/vT、vTW=vW/vTであってもよい。すなわち、時間率は、重心時間vTとピーク幅vB又はvWとの比であればよい。また、これら比に定数Kを乗じてもよい。すなわち、例えば、扁平率は、vAB=(vH/vB)K、vAB=(vB/vH)K、vAW=(vH/vW)K、又はvAW=(vW/vH)Kであってもよく、又は、vABa=(vHa/vB)K、vABa=(vB/vHa)K、vAWa=(vHa/vW)K、又はvAWa=(vW/vHa)Kであってもよく、時間率は、vTB=(vT/vB)K、vTB=(vB/vT)K、vTW=(vT/vW)K、又はvTW=(vW/vT)Kであってもよい。
　以上のような、ピーク幅vB、重心ピーク幅vW、平均時間vTa、平均高さvHa、領域始点時間vTs、領域終点時間vTe、領域中央時間vTm、ピーク幅vTr、扁平率vAB、vAW、vABa、vAWa、及び時間率vTB、vTWも重心点に関係するパラメータであり、本発明における評価パラメータになり得る。
　また、上記のような扁平率及び時間率は、２次曲線についても求めることができる。例えば、２次曲線のプラスピークについて、pHと、pB又はpWとの比として、ピーク幅に基づく扁平率pAB又は重心ピーク幅に基づく扁平率pAWを求めることができ、一方、pTと、pB又はpWとの比として、ピーク幅に基づく時間率pTB又は重心ピーク幅に基づく時間率pTWを求めることができる。同様に、２次曲線のマイナスピークについて、mHと、mB又はmWとの比として、ピーク幅に基づく扁平率mAB又は重心ピーク幅に基づく扁平率mAWを求めることができ、一方、mTと、mB又はmWとの比として、ピーク幅に基づく時間率mTB又は重心ピーク幅に基づく時間率mTWを求めることができる。
　本明細書においては、異なる演算対象域に由来するパラメータを識別するため、各パラメータに、それが由来する演算対象域値Sを付けて表示することがある。例えば、Sがx(％)のときの１次曲線の重心点に関係するパラメータは、vHx、vTx、vBx、vWxなどと称されることがある。例えば、Sが10％のときの１次曲線の重心点に関係するパラメータvH、vT、vB、vW、vTa、vHa、vTs、vTe、vTm、vTr、vAB、vAW、vABa、vAWa、vTB、vTWは、それぞれvH10％、vT10％、vB10％、vW10％、vTa10％、vHa10％、vTs10％、vTe10％、vTm10％、vTr10％、vAB10％、vAW10％、vABa10％、vAWa10％、vTB10％、vTW10％と称されることがある。２次曲線の重心点に関係するパラメータについても同様である。
　図１２Ａ及び図１２Ｂは、同一の１次曲線に関して、演算対象域値Sが異なる場合の各パラメータを示す。図１２Ａは、演算対象域値Sが10%の場合を示し、図１２Ｂは、演算対象域値Sが80%の場合を示す。演算対象域値Sが10%の図１２Ａの場合には、１次曲線の重心高さvH10%は0.4であり、重心時間vT10%は149秒であり、ピーク幅vB10%は200秒である。これに対して、演算対象域値Sが80%の図１２Ｂの場合には、重心高さvH80%は0.72であり、重心時間vT80%は119秒であり、ピーク幅vB80%は78秒である。
１．３．３．５．その他
　本発明で用いられる重心点に関係するパラメータのさらなる例としては、１次曲線又は２次曲線の演算対象域における曲線下面積（AUC）が挙げられる。２次曲線はプラス側ピークとマイナス側ピークを有するため、２次曲線の最大ピーク高さを100％とした演算対象域における曲線下面積（AUC）は、プラス側ピークについての演算対象域におけるAUC（pAUC）とマイナス側ピークの演算対象域におけるAUC（mAUC）があり得る。本明細書においては、異なる演算対象域に由来するAUCを識別するため、それが由来する演算対象域値Sに従って、AUCxと称することがある。例えば、Sが5%である演算対象域のvAUC、pAUC、及びmAUCは、それぞれvAUC5%、pAUC5%、及びmAUC5%である。さらに、上述の重心点に関係するパラメータ以外のさらなるパラメータが、本発明で用いられるパラメータに含まれ得る。該パラメータの例としては、上述の凝固時間Tc、最大１次微分値Vmax、最大２次微分値Amax、最小２次微分値Amin、及びそれらに到達する時間を表すVmaxT、AmaxT、AminTなどが挙げられる。これらのパラメータも、評価パラメータとして使用され得る。
　上述した一連のパラメータは、補正処理済み凝固反応曲線（補正０次～２次曲線）由来のパラメータと、補正処理なし凝固反応曲線（未補正０次～２曲線）由来のパラメータとを含み得る。
１．４．評価
　ステップＳ１０４で行われる評価の一例について説明する。
　後述する表１に示すパラメータ、すなわち凝固時間Tc、最大１次微分値Vmax、最大２次微分値Amax、最小２次微分値Amin、及びそれらに到達する時間を表すVmaxT、AmaxT、AminT、１次曲線の重心点に関係するパラメータ（重心時間vT、重心高さvH、平均時間vTa、平均高さvHa、ピーク幅vB、重心ピーク幅vW、それらから求められた扁平率vAB、vAW、vABa、vAWa、及び時間率vTB、vTW、ならびにvAUC、vTs、vTe、vTr、vTm）、２次曲線の重心点に関係するパラメータ（重心時間pT、mT、重心高さpH、mH、ピーク幅pB、mB、重心ピーク幅pW、mW、それらから求められた扁平率pAB、pAW、mAB、mAW及び時間率pTB、pTW、mTB、mTW、ならびにpAUC、mAUC、pTs、pTe、pTm、mTs、mTe、mTm）は、血液凝固に関する特性を反映する。この際、１次曲線及び２次曲線の重心時間、重心高さ、ピーク幅、平均時間、平均高さ、扁平率、時間率、及びAUCは、演算対象域値Sの設定によっても、血液凝固に関する特性の反映結果が変わり得る。また、上記のパラメータの組み合わせも、血液凝固に関する特性を反映し得る。例えば、これらパラメータ同士の四則演算その他の各種演算の結果も、血液凝固に関する特性をより顕著に反映する場合がある。例えば、凝固時間Tc、重心時間vT、重心高さvH、ピーク幅vB、重心ピーク幅vW、平均時間vTa、平均高さvHa、扁平率vABやvAW、vABa、vAWa、時間率vTBやvTW、又はvAUC、あるいはそれらの組み合わせに基づいて、凝固因子の欠乏状況、ループスアンチコアグラント又は抗カルジオリピン抗体といった抗リン脂質抗体の存在、凝固因子インヒビターの存在、フォンヴィレブランド因子の低下などを含む血液凝固の異常の有無、各成分の濃度など、血液凝固に関する特性が判定され得る。
　凝固時間Tc、重心時間vT、重心高さvH、ピーク幅vB、重心ピーク幅vW、平均時間vTa、平均高さvHa、扁平率vABやvAW、vABa、vAWa、時間率vTBやvTW、又はvTm、vAUCといった後述する表１に示す評価パラメータは、凝固因子などの成分の濃度と相関関係を示すことがある。したがって、凝固因子などの成分の濃度が既知の試料の評価パラメータを取得することで検量線が作成され得る。この検量線を用いて、計測及び解析された患者検体の評価パラメータに基づいて、凝固因子などの成分の濃度が算出され得る。
　上記のパラメータの比や差が凝固因子などの成分の濃度と相関関係を示すことがある。評価パラメータの比の例としては、上述した扁平率vABやvAW、vABa、vAWa、時間率vTBやvTW、領域中央時間vTmなどが挙げられる。評価パラメータの差の例としては、凝固時間Tcと重心時間vTとの差、ピーク幅と重心ピーク幅との差、異なるSにおけるvT間の差が挙げられる。これらのパラメータ間の比や差を取得することで検量線が作成され得る。この検量線を用いて、計測及び解析された患者検体の評価パラメータに基づいて、凝固因子などの成分の濃度が算出され得る。
　例えば、演算対象域値Sを0%以上70%以下に設定したとき、好ましくは5%以上70%以下に設定したときの時間率vTBは、第VIII因子の濃度と高い相関関係を有する。また、演算対象域値Sを0%以上80%以下に設定したとき、好ましくは5%以上80%以下に設定したときの扁平率vABは、第VIII因子の濃度と高い相関関係を有する。特に、例えば、演算対象域値Sを70%に設定したときの扁平率vABは、濃度が比較的高い場合に、第VIII因子の濃度と高い相関関係を有し、演算対象域値Sを80%に設定したときの扁平率vABは、濃度が比較的低い場合に、第VIII因子の濃度と高い相関関係を有する。
　また最大１次微分値Vmax、最大２次微分値Amax、及びそれらに到達した時間VmaxT、AmaxTといった評価パラメータは、凝固因子などの成分の濃度と相関関係を示すことがある。したがって、凝固因子などの成分の濃度が既知の試料の評価パラメータを取得することで検量線が作成され得る。この検量線を用いて、計測及び解析された患者検体の評価パラメータに基づいて、凝固因子などの成分の濃度が算出され得る。
　また、凝固時間Tcと重心時間vTとは、１次曲線の形状に応じて挙動が異なる場合がある。特に、凝固異常検体の１次曲線の形状は、ピークが１つの単峰性の形状を取らず、ピークが２つの二峰性の形状を取ったり、二峰性のピークのうち一方が不完全なピークとなるショルダー状の形状を取ったりすることがある。このような１次曲線の形状に起因して、凝固異常検体では、例えば図１０Ａに示す凝固時間Tcと重心時間vTとの差dが大きくなる。したがって、この差dに基づいて、血液凝固の異常の有無など血液凝固に関する特性が判定され得る。また、１次曲線の形状に応じて、重心高さvH又は重心時間vTと、最大１次微分値Vmax又はそれを示す時間との関係が種々に変化し得る。したがって、重心高さvH又は重心時間vTと、最大１次微分値Vmax又はそれを示す時間VmaxTとの関係に基づいて、血液凝固の異常の有無や程度など血液凝固に関する特性が判定され得る。
　また、演算対象域値S (=x(%))を様々に変化させながら求めた重心高さvHx又は重心時間vTx、あるいは、これらを用いて求めた扁平率vABx又は時間率vTBxなどといった評価パラメータは、凝固因子や他の凝固機能関与成分などの特性を示すことがある。したがって、演算対象域値xを様々に変化させながら求めた評価パラメータの挙動に基づいて、血液凝固の異常の有無や程度など血液凝固に関する特性が判定され得る。
　上述の種々の特性は、凝固因子や凝固機能関与成分などの種類に応じても異なり得る。そこで、上述の評価パラメータに基づいて、何れの凝固因子などに起因して異常があるのかが鑑別され得る。
　例えば、第VIII因子が欠乏している場合には、例えば第IX因子が欠乏している場合などの場合よりも、演算対象域値S (=x(%))を変化させたときの重心時間vTxの変化量が顕著となる。したがって、演算対象域値S (=x(%))を変化させたときの重心時間vTxの変化率から、欠乏している血液凝固因子の鑑別が可能である。
　また、例えば、第VIII因子の濃度が低いとき、他の凝固因子が欠乏しているときに比較して、演算対象域値xを80%に設定したときに求まる時間率vTB80%が顕著に低下するので、演算対象域値xを80%に設定したときに求まる時間率vTB80%は、第VIII因子の欠乏の判定に用いられ得る。
　凝固因子に関する鑑別事項と、該鑑別のために使用されるパラメータの具体的な例としては、以下（末尾に付加する演算対象域値xの添え字xを省略）が挙げられる：
・第VIII因子の濃度に対して、T50、vH、vT、vTe、vTr、vTa、vHa、vTm、vB、vW、vAB、vTB、vAW、pH、pAB、pAW、pAUC、VmaxT、Amax、AmaxT、mAUC、又はそれらの２種以上の組み合わせ。このときの演算対象域Sは、Vmaxが100％のとき、好ましくは0.5～99％、より好ましくは1～95％、さらに好ましくは5～80％、さらに好ましくは30～80％、さらに好ましくは30～70％又は50～80％である。
・第IX因子の濃度に対して、T50、vT、vTs、vTa、vTm、pT、又はそれらの２種以上の組み合わせ。このときの演算対象域Sは、Vmaxが100％のとき、0.5～99％、より好ましくは10～95％、さらに好ましくは10～80％である。
　上記の評価パラメータは、補正０次～２次曲線から求めてもよいが、未補正０次～２次曲線から求めてもよい。例えば、補正０次曲線では凝固速度を相対値化するが、ある種の血液凝固異常は、凝固速度の大きさに反映される。したがって、いくつかの評価パラメータ、好ましくは凝固速度に関連するパラメータ、例えば重心高さ、平均高さ、扁平率、AUCなどは、補正０次～２次曲線よりも、未補正０次～２次曲線から求めた値のほうが、血液凝固特性をよりよく反映することがある。
１．５．重心点について
　１次曲線のピーク形状は、正常検体では単峰性になることが多いが、試薬の種類や検体に含まれる凝固機能関与成分の影響の差異などによって二峰性になったり、ショルダー状の曲線になったりする場合がある。例えば、特許文献１乃至３に開示されている技術のように、凝固速度の最大値を評価パラメータとして用いる場合に、実際は凝固速度曲線が単峰性の形状とならないような場合であっても強力なスムージング処理によって単峰性となる凝固速度曲線を得て、凝固速度の最大値を特定することがある。しかしながら、このようなスムージング処理によって、測定データに含まれている有用な情報が失われているおそれがある。血液凝固反応では様々な因子が複雑に作用している。種々の形状の１次曲線及び２次曲線は、そのような様々な因子に関する情報を含んでいる可能性がある。本実施形態に係る分析方法は、重心点に関係する評価パラメータを用いることで、必要な情報を失う程の過度のスムージング処理などを行う必要がない。したがって、本実施形態に係る分析方法によれば、様々な因子の状態を詳細に反映した分析結果を得ることができる。
　本実施形態に係る重心点の算出は、平均に関する演算を含んでいる。このため、測定データに含まれるランダムなノイズの影響は演算によって低減できる。したがって、ノイズ除去のためのスムージング処理を過度に行う必要がなく、多くの情報が維持される。また、本方法は、Ｓ／Ｎ比がよい分析方法となっている。特に、１次曲線又は２次曲線に関するデータはノイズを多く含み易いが、本方法の重心点を用いる方法によれば、１次曲線又は２次曲線のデータからも有益な情報が得られる。
　本実施形態に係る重心点の算出では、演算対象域値Sが種々に設定され得るし、演算対象域値Sの設定ごとに異なる重心点が算出され得る。例えば演算対象域値Sを0%から99%まで1%毎に異なるものとすれば、100個の重心点が得られ、それぞれの重心点について重心高さvHなど各種の評価パラメータが得られる。また、上述のとおり、これらの評価パラメータの組み合わせも有益な情報となり得る。したがって、重心点を用いると、多くの情報が得られる。
　本実施形態で重心点を求める元となるデータである凝固反応曲線は、例えばAPTT測定といった、臨床現場で日常的に測定されているものである。したがって、本実施形態に係る分析は、データ解析の方法を導入するのみで、容易に臨床現場で利用され得る。
　また、例えば、１次曲線の最大値（Vmax）といったパラメータは、１次微分値のうちある一点を表すパラメータであるのに対して、重心点は、時間軸に関して幅のあるデータを反映するパラメータである。したがって、例えば時間軸について非対称なデータに関してもその非対称性を示すパラメータになり得る。
　本実施形態に係る分析方法では、ステップＳ２０３として示した補正処理が行われる。この補正処理によって、検体ごとのフィブリノゲン濃度の大きさの差異をキャンセルし、検体間での凝固反応曲線の形状の差異を定量的に比較することができるようになる。
　本実施形態では、凝固反応曲線（０次曲線）から１次曲線又は２次曲線を求める際の微分処理において、上記式(4)で示した区間内平均傾きを用いる。この方法によれば、上記式(2)に示した差分法を用いる場合よりも、詳細な情報が得られる。特に、凝固反応曲線における値の変化量が小さい場合であっても、良好なＳ／Ｎ比を得ることができる。
２．凝固時間の延長要因の鑑別
　本発明のさらなる一態様は、
　被検血漿と正常血漿とを混合した混合血漿を調製することと、
　前記混合血漿の加温処理なしでの凝固時間測定を行うことと、
　前記混合血漿の加温処理後の凝固時間測定を行うことと、
　前記混合血漿の加温処理なしでの凝固時間測定データに基づいて凝固反応状態と関係する第１のパラメータを算出することと、
　前記混合血漿の加温処理後の凝固時間測定データに基づいて凝固反応状態と関係する第２のパラメータを算出することと、
　前記第１のパラメータと前記第２のパラメータとの比又は差に基づいて、凝固時間の延長の要因を鑑別することと、
を含む、血液検体の凝固特性の分析方法に関する。
　本実施形態について図面を参照して説明する。本実施形態は、血液凝固に関連する検体の特性を分析することに関する。特に、内因系凝固機能の検査に用いられるAPTT測定が行われ、得られたデータの解析が行われ、APTTの延長の要因の鑑別が行われる。
２．１．分析方法の概要
　本実施形態に係る分析方法の概要を図１に示すフローチャートを参照して説明する。
　初めに、検査に用いられる試料が調製される（ステップＳ１０１）。試料としては、検体の血漿（被検血漿）、正常血漿、及び被検血漿と正常血漿の混合比を変えた少なくとも一つの混合血漿が用いられる。次に、調製された試料を対象として、混合血漿の加温処理なしのAPTT測定、及び、混合血漿の加温処理後のAPTT測定が実行される（ステップＳ１０２）。
　次に、APTT測定で得られたデータに対する所定の解析が行われる（ステップＳ１０３）。ここでは、混合血漿の加温処理なしのAPTT測定の結果から第１のパラメータが算出されるとともに、混合血漿の加温処理後のAPTT測定の結果から第２のパラメータが算出される。
　最後に、解析結果に基づいて、検体について血液凝固機能に関する評価が行われる（ステップＳ１０４）。ここでは、算出された第１のパラメータと算出された第２のパラメータとの比又は差に基づいて、APTTの延長の要因が鑑別され、例えばインヒビターの有無などが鑑別される。例えば、第１のパラメータと第２のパラメータとの比が１を含む所定の範囲内に収まらない場合には、APTTの延長の要因は、インヒビターが存在することなど、インヒビターの影響によると判定され、第１のパラメータと第２のパラメータとの比が１を含む所定の範囲内に収まる場合には、APTTの延長の要因は、インヒビターの影響ではなく、LA等が存在することなど、LAの影響によると判定される。例えば、第１のパラメータと第２のパラメータとの差が０を含む所定の範囲内に収まらない場合には、APTTの延長の要因がインヒビターの影響によると判定され、第１のパラメータと第２のパラメータとの差が０を含む所定の範囲内に収まる場合には、APTTの延長の要因はインヒビターの影響ではなく、LA等の影響によると判定される。なお、インヒビター又はLAの影響は、インヒビター又はLAが存在するか否かのみならず、これらの存在量の多少によっても変化し得る。
２．２．試料調製及びAPTT測定
　ステップＳ１０１として行われる試料の調製と、ステップＳ１０２として行われるAPTT測定について説明する。検査対象となる検体は、上記１．２．で述べたとおりである。試料の調製では、被検血漿と、別途に準備した正常血漿とが所定容量比率で混合される。被検血漿と正常血漿との混合比は、合計を１０容量とした容量比で、被検血漿：正常血漿＝１：９～９：１の範囲であればよく、好ましくは４：６～６：４の範囲、より好ましくは５：５である。例えば１：１、１：４、４：１である。
　調製された混合血漿について、一部は速やかにAPTT測定が行われ、一部は所定時間加温処理後にAPTT測定が行われる。加温する際の温度は、例えば３０℃以上４０℃以下、好ましくは３５℃以上３９℃以下であり、さらに好ましくは３７℃である。加温時間は、例えば、２～３０分間の範囲であればよく、好ましくは５～３０分間である。一例では２分から１０分程度である。加温時間は、３０分、１時間などさらに長くてもよいが、好ましくは１時間以内、最大でも２時間以内である。以下の本明細書において、未加温又は加温済み混合血漿のAPTT測定の基本的手順は、上記１．２．で述べたとおりである。本明細書においては、上記の加温処理で得られた混合血漿を「加温血漿」とも称する。一方、上記の加温処理を受けていない混合血漿を「非加温血漿」とも称する。ただし、該「非加温血漿」は、通常の凝固反応計測における検体の加温処理、例えば、３０℃以上４０℃以下で１分以下の加温を受けていてもよい。
２．３．データ解析
　上記１．３．で述べた手順に従って、分析対象である加温処理なし及び加温処理後の混合血漿のについてのデータが取得される。上記１．３．１．及び１．３．２．で述べた手順に従って、加温処理なし及び加温処理後のそれぞれの混合血漿についての凝固反応曲線に対して、平滑化処理、ゼロ点調整を行うことができ、又は補正処理済み凝固反応曲線を得ることができ、さらに得られた補正処理済み凝固反応曲線及び補正処理なし凝固反応曲線（０次曲線）から、１次曲線、又は２次曲線を取得することができる。得られた曲線から、種々の評価パラメータが算出される。取得される評価パラメータの詳細は、上記１．３．３．で述べたとおりである。
２．４．評価
　ステップＳ１０４で行われる評価の一例について説明する。本実施形態では、例えばLAといった抗リン脂質抗体が延長要因の場合、加温処理有無によるAPTTの変化はあまり認められないのに対して、インヒビターが要因の場合、加温処理後にAPTTが延長することが高感度に検出される。
　例えば、上述の各評価パラメータについて、非加温血漿で得られた値（第１のパラメータ、Ｐａ）と加温血漿で得られた値（第２のパラメータ、Ｐｂ）との比（Ｐｂ／Ｐａ）あるいは差（Ｐｂ－Ｐａ）に基づいて評価が行われる。
　例えば、凝固時間は、LA陽性血漿と正常血漿との混合血漿では、比（Ｐｂ／Ｐａ）がおよそ１になるのに対して、第VIII因子インヒビター陽性血漿と正常血漿との混合血漿では、比（Ｐｂ／Ｐａ）が１よりも明らかに大きくなる。
　例えば、補正１次微分の最大値Vmaxは、LA陽性血漿と正常血漿との混合血漿では、比（Ｐｂ／Ｐａ）がおよそ１になるのに対して、第VIII因子インヒビター陽性血漿と正常血漿との混合血漿では、比（Ｐｂ／Ｐａ）が１よりも明らかに小さくなる。
　例えば、ピーク幅vBは、LA陽性血漿と正常血漿との混合血漿では、比（Ｐｂ／Ｐａ）がおよそ１になるのに対して、第VIII因子インヒビター陽性血漿と正常血漿との混合血漿では、比（Ｐｂ／Ｐａ）が１よりも明らかに大きくなる。
　例えば、扁平率vAWは、LA陽性血漿と正常血漿との混合血漿では、比（Ｐｂ／Ｐａ）がおよそ１になるのに対して、第VIII因子インヒビター陽性血漿と正常血漿との混合血漿では、比（Ｐｂ／Ｐａ）が１よりも明らかに小さくなる。
　例えば、重心時間vTは、LA陽性血漿と正常血漿との混合血漿では、比（Ｐｂ／Ｐａ）がおよそ１になるのに対して、第VIII因子インヒビター陽性血漿と正常血漿との混合血漿では、比（Ｐｂ／Ｐａ）が１よりも明らかに大きくなる。
　例えば、重心高さvHは、LA陽性血漿と正常血漿との混合血漿では、比（Ｐｂ／Ｐａ）がおよそ１になるのに対して、第VIII因子インヒビター陽性血漿と正常血漿との混合血漿では、比（Ｐｂ／Ｐａ）が１よりも明らかに小さくなる。
　例えば、時間率vTWは、LA陽性血漿と正常血漿との混合血漿では、比（Ｐｂ／Ｐａ）がおよそ１になるのに対して、第VIII因子インヒビター陽性血漿と正常血漿との混合血漿では、比（Ｐｂ／Ｐａ）が１よりも小さくなる。
　比（Ｐｂ／Ｐａ）に限らず、差（Ｐｂ－Ｐａ）についても同様のことが成り立つ。例えば、重心時間vTは、ＬＡ陽性血漿と正常血漿との混合血漿では、差（Ｐｂ－Ｐａ）がおよそ０になるのに対して、第VIII因子インヒビター陽性血漿と正常血漿との混合血漿では、差（Ｐｂ－Ｐａ）が０よりも明らかに大きくなる。
　これらの傾向を利用して比（Ｐｂ／Ｐａ）又は差（Ｐｂ－Ｐａ）に基づいて、例えば、被験者の検体が、LA陽性であるか、VIII因子インヒビター陽性であるかが鑑別され得る。この鑑別には、上述の評価パラメータの何れかが用いられてもよいし、これらの何れかの組み合わせが用いられてもよいし、これらの何れかとその他の評価パラメータとの組み合わせが用いられてもよい。例えば、上述の評価パラメータ同士の四則演算その他の各種演算の結果も、被験者の検体が、LA陽性であるか、VIII因子インヒビター陽性であるかを反映する場合がある。
　また、凝固因子欠乏が要因の場合にも、加温処理有無に関わらずAPTTの延長が補正されるため、比（Ｐｂ／Ｐａ）がおよそ１になる。したがって、本方法は、APTTの延長要因がインヒビターか、LAか、それとも因子欠乏かを判定できる方法であるともいえる。
　解析で設定される演算対象域値Sは、種々の値に設定され得る。また、加温処理時間も、種々に設定され得る。加温時間は、２時間以内で２分以上３０分以下が好ましく、さらに好ましくは、１０分程度である。混合血漿の混合比は１：１に限らず、他の比でもよい。
　本実施形態によれば、遅延型クロスミキシング試験の検査時間を短縮化することができる。例えば、インヒビターの有無を鑑別するにあたり、検体の加温時間を短くできる。また、インヒビターの有無の鑑別に際し、評価パラメータの比又は差という指標を用いて定量的な判定が可能となる。
３．自動分析装置
　上述のデータ解析及び評価は、コンピュータを用いて自動的に行われ得る。また、試料の調製及び凝固時間の測定も含めて、上述の一連の分析は、自動分析装置によって、自動的に行われ得る。このような分析を行う自動分析装置について、説明する。
３．１．装置構成
　図１３は、本実施形態に係る自動分析装置１の構成例の概略を示すブロック図である。自動分析装置１は、制御ユニット１０と、測定ユニット３０と、タッチスクリーン９０とを備える。
　制御ユニット１０は、自動分析装置１の全体の動作を制御する。制御ユニット１０は、例えばパーソナルコンピュータ（ＰＣ）によって構成される。制御ユニット１０は、バスライン２２を介して互いに接続されたCenTral Processing Unit（ＣＰＵ）１２と、Random Access Memory（ＲＡＭ）１４と、Read Only Memory（ＲＯＭ）１６と、ストレージ１８と、通信インターフェース（Ｉ／Ｆ）２０とを備える。ＣＰＵ１２は、各種信号処理等を行う。ＲＡＭ１４は、ＣＰＵ１２の主記憶装置として機能する。ＲＡＭ１４には、例えば、Dynamic ＲＡＭ（ＤＲＡＭ）、Static ＲＡＭ（ＳＲＡＭ）等が用いられ得る。ＲＯＭ１６は、各種起動プログラム等を記録している。ストレージ１８には、例えば、Hard Disk Drive（ＨＤＤ）、Solid StaTe Drive（ＳＳＤ）等が用いられ得る。ストレージ１８には、ＣＰＵ１２で用いられるプログラム、パラメータ等各種情報が記録されている。また、ストレージ１８には、測定ユニット３０で取得されたデータが記録される。ＲＡＭ１４及びストレージ１８は、これに限らず各種記憶装置に置換され得る。制御ユニット１０は、通信Ｉ／Ｆ２０を介して外部の機器、例えば測定ユニット３０及びタッチスクリーン９０との通信を行う。
　タッチスクリーン９０は、表示装置９２とタッチパネル９４とを備える。表示装置９２は、例えば液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）又は有機ＥＬディスプレイ等を含み得る。表示装置９２は、制御ユニット１０の制御下で、各種画面を表示する。この画面には、自動分析装置１の操作画面、測定結果を示す画面、解析結果を示す画面など、各種画面が含まれ得る。タッチパネル９４は、表示装置９２の上に設けられている。タッチパネル９４は、ユーザからの入力を取得し、得られた入力情報を制御ユニット１０へと伝達する。
　制御ユニット１０は、通信Ｉ／Ｆ２０を介して、プリンター、ハンディコードリーダ、ホストコンピュータなど、他の機器と接続してもよい。
　測定ユニット３０は、制御回路４２と、データ処理回路４４と、恒温槽５２と、反応容器５４と、光源６２と、散乱光検出器６４と、透過光検出器６６と、検体容器７２と、試薬容器７４と、検体プローブ７６と、試薬プローブ７８とを備える。
　制御回路４２は、制御ユニット１０からの指令に基づいて、測定ユニット３０の各部の動作を制御する。制御回路４２は、図示を省略しているが、データ処理回路４４、恒温槽５２、光源６２、散乱光検出器６４、透過光検出器６６、検体プローブ７６、試薬プローブ７８等と接続し、各部の動作を制御する。
　データ処理回路４４は、散乱光検出器６４及び透過光検出器６６に接続されており、散乱光検出器６４及び透過光検出器６６から検出結果を取得する。データ処理回路４４は、取得した検出結果に対して各種処理を行い、処理結果を出力する。データ処理回路４４が行う処理には、例えば、散乱光検出器６４及び透過光検出器６６から出力されるデータの形式を、制御ユニット１０で処理できる形式に変更するＡ／Ｄ変換処理等が含まれ得る。
　制御回路４２及びデータ処理回路４４は、例えば、ＣＰＵ、Application Specific Integrated Circuit（ＡＳＩＣ）、又はField Programmable Gate Array（ＦＰＧＡ）等を含み得る。制御回路４２及びデータ処理回路４４は、それぞれ１つの集積回路等で構成されてもよいし、複数の集積回路等が組み合わされて構成されてもよい。また、制御回路４２及びデータ処理回路４４が１つの集積回路等で構成されてもよい。制御回路４２及びデータ処理回路４４の動作は、例えば記憶装置や当該回路内の記録領域に記録されたプログラムに従って行われ得る。
　検体容器７２には、例えば患者の血液などといった検体が収容される。試薬容器７４には、測定に用いる各種試薬が収容される。検体容器７２及び試薬容器７４は、それぞれいくつ設けられていてもよい。試験に用いられる試薬は通常複数種類あるので、試薬容器７４は一般に複数ある。検体プローブ７６は、制御回路４２の制御下で、検体容器７２に収容された検体を反応容器５４に分注する。試薬プローブ７８は、制御回路４２の制御下で、試薬容器７４に収容された試薬を反応容器５４に分注する。検体プローブ７６及び試薬プローブ７８の数もいくつであってもよい。
　恒温槽５２は、制御回路４２の制御下で、反応容器５４の温度を所定の温度に維持する。反応容器５４内では、検体プローブ７６によって分注された検体と、試薬プローブ７８によって分注された試薬とが混合された混合液が反応する。なお、反応容器５４は、いくつあってもよい。
　光源６２は、制御回路４２の制御下で、所定の波長の光を照射する。光源６２は、測定の条件に応じて、異なる波長を有する光を照射するように構成されていてもよい。したがって、光源６２は、複数の光源素子を有していてもよい。光源６２から照射された光は、例えば光ファイバによって導かれ、反応容器５４に照射される。反応容器５４に照射された光は、反応容器５４内の混合液の成分や成分の分布状態によって、一部は散乱し、一部は透過する。散乱光検出器６４は、反応容器５４で散乱した光を検出し、例えばその光量を検出する。透過光検出器６６は、反応容器５４を透過した光を検出し、例えばその光量を検出する。データ処理回路４４は、散乱光検出器６４で検出された散乱光量の情報を処理したり、透過光検出器６６で検出された透過光量の情報を処理したりする。散乱光検出器６４及び透過光検出器６６は、測定条件に応じて何れか一方が動作してもよい。したがって、データ処理回路４４は、測定条件に応じて、散乱光検出器６４で検出された散乱光量の情報と透過光検出器６６で検出された透過光量の情報とのうち何れかを処理してもよい。データ処理回路４４は、処理済のデータを制御ユニット１０に送信する。なお、図１３に示した測定ユニット３０は、散乱光検出器６４と透過光検出器６６との２つを備えているが、どちらか一方のみを備えていてもよい。
　制御ユニット１０は、測定ユニット３０から取得したデータに基づいて、各種解析を行う。この解析には、上述した評価パラメータの算出、評価パラメータに基づく被検体の評価等が含まれる。これらの解析の一部又は全部を、データ処理回路４４が行ってもよい。
　なお、ここでは、測定ユニット３０の動作を制御するＰＣと、データ解析及び評価を行うＰＣとが同一の制御ユニット１０である場合を示したが、これらは、別体であってもよい。言い換えると、測定結果が入力されてデータ解析及び評価を行うＰＣは、単体として存在し得る。
３．２．分析装置の動作
３．２．１．動作の概略
　本実施形態に係る自動分析装置１の動作について説明する。図１４は、制御ユニット１０の動作の概略を示す図である。
　ステップＳ３０１において、制御ユニット１０は、ユーザによって設定モードが選択されたか否かを判定する。制御ユニット１０は、ユーザによる選択として、例えば、タッチスクリーン９０の表示装置９２に示されたメニュー画面において、設定モードが選択されたことを、タッチパネル９４を用いて検出する。設定モードが選択されていないとき、処理はステップＳ３０３に進む。設定モードが選択されたとき、処理はステップＳ３０２に進む。
　ステップＳ３０２において、制御ユニット１０は、設定処理を行う。設定処理において、制御ユニット１０は、ユーザの入力に基づいて各種設定を実行する。例えば、測定条件、被検体の情報、試薬の情報、測定パラメータ、解析パラメータ等が設定される。設定処理の後、処理はステップＳ３０３に進む。
　ステップＳ３０３において、制御ユニット１０は、測定開始の指示が入力されたか否かを判定する。測定開始の指示が入力されていないとき、処理はステップＳ３０６に進む。測定開始の指示が入力されたとき、処理はステップＳ３０４に進む。
　ステップＳ３０４において、制御ユニット１０は、測定ユニット３０に測定開始の指示を出力する。この指示に基づいて、測定ユニット３０は、後述する測定処理に係る動作を実行する。この動作によって、測定ユニット３０を用いた測定が行われる。その後、処理はステップＳ３０５に進む。ステップＳ３０５において、制御ユニット１０は、後述する分析処理を実行する。分析処理では、制御ユニット１０は、測定によって得られたデータを設定に基づいて解析する。その後、処理はステップＳ３０６に進む。
　ステップＳ３０６において、制御ユニット１０は、他の処理が選択されたか否かを判定する。他の処理が選択されていないとき、処理はステップＳ３０８に進む。他の処理が選択されたとき、処理はステップＳ３０７に進む。ステップＳ３０７において、制御ユニット１０は、選択された処理を行う。例えば、制御ユニット１０は、ストレージ１８に保存されているデータに基づいて、改めて分析を行ってもよい。また、制御ユニット１０は、測定ユニット３０のメンテナンスの指示を出力してもよい。その後、処理はステップＳ３０８に進む。
　ステップＳ３０８において、制御ユニット１０は、処理を終了するか否かを判定する。例えば処理終了の入力がされたとき、処理を終了すると判定する。処理を終了しないとき、処理はステップＳ３０１に戻る。その結果、上述の処理が繰り返される。処理を終了すると判定されたとき、本処理は終了する。
３．２．２．測定動作
　図１５は、測定ユニット３０が行う測定に関する動作の概略を示すフローチャートである。
　ステップＳ４０１において、制御回路４２は、検体プローブ７６に、検体容器７２内の被検体を所定量だけ吸引後に反応容器５４に吐出させる。被検体の反応容器５４への吐出の前又は後に、反応容器５４の温度は、恒温槽５２によって、測定条件に応じた温度に調整される。
　ステップＳ４０２において、制御回路４２は、試薬プローブ７８に、試薬容器７４内の試薬を所定量だけ吸引後に反応容器５４に吐出させて被検体との混合液を調製する。吐出される試薬は、試験の種類等に応じて、複数であり得るし、種類も様々あり得る。反応を開始させる試薬の吐出によって、混合液の凝固反応が始まる。
　ステップＳ４０３において、制御回路４２は、各部に反応量の検出（測光）を開始させる。すなわち、制御回路４２は、光源６２に、測定条件に応じて適切な波長の光を照射することを開始させる。制御回路４２は、測定条件に応じて、散乱光検出器６４と透過光検出器６６とのうち一方又は両方に、光検出を開始させる。散乱光検出器６４は、反応容器５４での散乱光の検出を開始する。透過光検出器６６は、反応容器５４での透過光の検出を開始する。
　ステップＳ４０４において、制御回路４２は、散乱光検出器６４及び透過光検出器６６のうち、必要な方から検出データを取得する。ステップＳ４０５において、制御回路４２は、測定を終了するか否かを判定する。例えば、所定の終了条件を満たしたとき、測定を終了すると判定される。終了条件は、例えば試薬添加からの経過時間が所定時間となったことであってもよい。測定を終了しないと判定されたとき、処理はステップＳ４０４に戻る。このようにして、例えば所定間隔で連続的にデータが取得される。
　ステップＳ４０５において測定を終了すると判定されたとき、処理はステップＳ４０６に進む。ステップＳ４０６において、制御回路４２は、測定を終了する。例えば、制御回路４２は、光源６２に、光の照射を停止させる。制御回路４２は、散乱光検出器６４及び透過光検出器６６に、光検出を停止させる。
　ステップＳ４０７において、制御回路４２は、データ処理回路４４に、取得したデータに対するデータ処理を行わせる。ステップＳ４０８において、制御回路４２は、処理後のデータを制御ユニット１０に送信する。以上で測定処理は終了する。
３．２．３．分析処理
　ステップＳ３０５において行われる分析処理の一例について、図１６に示すフローチャートを参照して説明する。ここに示す分析処理は、分析対象についての、上述した例えばAPTTといった凝固時間の測定データを解析して、種々の評価パラメータを算出し、得られた評価パラメータに基づいて、血液凝固の異常の有無など血液凝固に関する特性を解析する処理である。ここで、分析対象は、上記１．２．で述べたような被検血漿であってもよく、又は上記２．２．で述べたような混合血漿（加温血漿及び非加温血漿）であってもよい。
　ステップＳ５０１において、制御ユニット１０は、分析対象の凝固時間の測定データを取得する。データは、例えば測定ユニット３０から取得され得る。制御ユニット１０は、例えばネットワークや媒体を介して、他の装置から測定データを取得してもよいし、記憶装置に記憶されているデータを取得してもよい。
　ステップＳ５０２において、制御ユニット１０は、ベースライン調整を行う。このベースライン調整は、上述したステップＳ２０２の処理を制御ユニット１０が行うものである。ステップＳ５０３において、制御ユニット１０は、データ補正処理を行う。このデータ補正処理は、上述したステップＳ２０３の処理を制御ユニット１０が行うものである。ステップＳ５０４において、制御ユニット１０は、１次又は２次曲線等の微分曲線の算出処理を行う。この微分曲線算出処理は、上述したステップＳ２０４の処理を制御ユニット１０が行うものである。
　ステップＳ５０５において、制御ユニット１０は、評価パラメータ算出処理を行う。この評価パラメータ算出処理は、上述したステップＳ２０５の処理を制御ユニット１０が行うものである。ここで、混合血漿（加温血漿及び非加温血漿）を解析する場合、制御ユニット１０は、算出した加温血漿及び非加温血漿のそれぞれの各種評価パラメータに基づいて、非加温血漿からの第１のパラメータと加温血漿からの第２のパラメータとの比又は差を算出する。ステップＳ５０６において、制御ユニット１０は、評価処理を行う。この評価処理は、上述したステップＳ１０４の処理を制御ユニット１０が行い、評価結果を導出するものである。
　ステップＳ５０７において、制御ユニット１０は、評価結果を、ストレージ１８に記録させたり、表示装置９２に出力させたり、ホストコンピュータに送信したりする。
　以上の通り、本実施形態に係る分析は、自動分析装置１によって自動的に行われ得る。
　上述の方法を用いた血液凝固についての分析方法に関する実施例を示す。
　以下の実施例に用いられるパラメータは、特に言及しない限り、補正０次～２次曲線由来のパラメータを表す。一方、未補正０次～２次曲線由来のパラメータは、各パラメータの名称の頭にRを付けて表される。例えば、補正１次曲線の重心高さがvHであるとき、未補正１次曲線の重心高さはRvHで表され、補正１次曲線の重心時間がvTであるとき、未補正１次曲線の重心時間はRvTで表される。パラメータの一覧を下記の表１に示す。以降の説明においては、組み合わせ波形パラメータのＢ扁平率、Ｗ扁平率、Ｂ時間率及びＷ時間率は、係数ｋを省略したパラメータの演算内容が分かる表記をする場合がある。
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４．第１の実施例
４．１．方法
４．１．１．血液検体の凝固反応の測定方法
　血液凝固因子に起因して異常のある被験者に由来する血液検体と正常な血液検体（正常血漿）を特定の割合で混合した複数の混合試料について、本実施形態に係る解析を行った。すなわち、複数の混合試料の各々と、凝固時間測定試薬とを混和した測定対象試料を用意した。測定対象試料の凝固反応データとして、散乱光量の測光データを取得した。取得した測光データについて本実施形態に係る解析を行った。
　本実施例では検体として、Factor VIII Deficient Plasma（George King Bio-Medical,Inc.製）又はFactor IX Deficient Plasma（George King Bio-Medical, Inc.製）と、VIII因子濃度及びIX因子濃度が100%と看做せる正常プール血漿（以下、正常血漿）との混合液を用いた。VIII因子濃度が0.1%以下のFactor VIII Deficient Plasma又はIX因子濃度が0.1%以下のFactor IX Deficient Plasmaと正常血漿との混合比率を変えてVIII因子濃度及びIX因子濃度がそれぞれ、50%、25%、10%、5%、2.5%、1%、0.75%、0.5%、0.25%、0.1%以下となるような混合血漿を調製した。
　本実施例では測定用試薬として、APTT測定用試薬であるコアグピア APTT-N（積水メディカル株式会社製）及びコアグピア APTT-N 塩化カルシウム液50μL（積水メディカル株式会社製）を用いた。
　本実施例では、凝固反応測定を、血液凝固自動分析装置CP3000（積水メディカル株式会社製）を用いて行った。本実施例では、キュベット（反応容器）に吐出され37℃で45秒間加温した試料50μLに、約37℃に加温したAPTT試薬50μLを添加（吐出）し、さらに171秒経過後に25 mM塩化カルシウム液50μLを添加（吐出）して凝固反応を開始させた。反応は、37℃に維持した状態で行った。凝固反応の検出（測光）は、波長660 nmのLEDライトを光源とする光を照射し、0.1秒間隔で90度側方散乱光の散乱光量を検出することによって行った。検出時間は360秒間とした。
４．１．２．測光データの解析方法
　上述のようにして取得した凝固反応の経時的な測光データを、凝固反応曲線とした。この凝固反応曲線に関して、解析を行った。まず、凝固反応曲線に対して、ベースライン調整を行った。すなわち、凝固反応曲線に対してノイズ除去を含む平滑化処理を行い、測定開始時点の散乱光量が0となるように調整した。続いて、凝固反応曲線（未補正０次曲線）の最大高さが100となるように補正し、補正処理済み凝固反応曲線（補正０次曲線）を得た。補正０次曲線を１次微分して、補正１次曲線を得た。補正１次曲線の算出には、上述の式(4)による区間内平均傾きを用いた。
　得られた補正１次曲線について、１次微分値の最大値Vmaxと、最大値となる時間VmaxTとを求めた。また、補正１次曲線に基づいて、上述のピーク幅vBを特定した。さらに、補正１次曲線と上記式(5)、(6)及び(7)とを用いて、重心時間vT及び重心高さvHを算出した。
４．２．解析結果及び考察
４．２．１．　０次曲線及び１次曲線
　図１７Ａに、得られた凝固反応曲線（未補正０次曲線）の例を示す。実線は、正常血漿の未補正０次曲線を示し、破線は、第VIII因子濃度0.1%以下の未補正０次曲線を示し、一点鎖線は、第IX因子濃度0.1%以下の未補正０次曲線を示す。図１７Ｂは、図１７Ａに示した各検体の未補正０次曲線について、それぞれ散乱光量の最大値が100となるように補正した、補正０次曲線を示す。
　第VIII因子欠乏血漿及び第IX因子欠乏血漿では、それぞれの凝固因子が欠乏しているため、凝固時間の延長が認められる。すなわち、これらの凝固因子欠乏血漿では、散乱光量が増加し始める時間、また、散乱光量の増加が終了する時間が、正常血漿の場合よりも遅い。また、散乱光量の上昇時の傾きが、正常血漿の場合よりも小さい。
　図１８Ａは、図１７Ａに示した正常血漿と凝固因子欠乏血漿の０次曲線を微分して得られた未補正１次曲線を示す。図１８Ｂは、図１７Ｂに示した正常血漿と凝固因子欠乏血漿の補正０次曲線を微分して得られた補正１次曲線を示す。
　第VIII因子欠乏血漿及び第IX因子欠乏血漿では、正常血漿の場合と比較して、１次微分値の最大値は小さく、また、１次微分値が最大となる時間が遅い。
４．２．２．凝固因子濃度と評価パラメータとの関係
　図１９Ａは、第VIII因子濃度の対数に対する凝固時間の関係を示す。なお、濃度0.1%以下に関して対数変換をするときには、濃度0.1%として計算した。他の図においても同様である。この図において、三角印（△）は１次微分値が最大値となる時間（VmaxT）を示し、丸印（○）は重心時間vTを示す。重心時間vTを求めるにあたって、演算対象域値Sは10%に設定した。図１９Ｂは、第IX因子濃度の対数に対する凝固時間の関係を示す。この図において、三角印（△）は１次微分値が最大値となる時間（VmaxT）を示し、丸印（○）は重心時間vTを示す。重心時間vTを求めるにあたって、演算対象域値Sは10%に設定した。
　図１９Ｃは、第VIII因子濃度の対数に対する１次微分値の関係を示す。図１９Ｄは、第IX因子濃度の対数に対する１次微分値の関係を示す。これらの図において、三角印（△）は１次微分値の最大値Vmaxを示し、丸印（〇）は、重心高さvHを示す。重心高さvHを求めるにあたって、演算対象域値Sは60%に設定した。
　図１９Ａ及び図１９Ｂから明らかなように、重心時間vTは、第VIII因子濃度及び第IX因子濃度と高い相関関係を示した。また、図１９Ｃ及び図１９Ｄから明らかなように、重心高さvHも、第VIII因子濃度及び第IX因子濃度と高い相関関係を示した。
　以上より、患者検体の重心時間vT又は重心高さvHを求め、図１９Ａ、図１９Ｂ、図１９Ｃ及び図１９Ｄに示すようにして求めた関係を検量線として、患者検体の第VIII因子濃度又は第IX因子濃度を算出することができることが示された。
　上述の通り、重心点は平均に関する演算から算出されるため、測定データに含まれるランダムなノイズ影響は演算によって低減化される。したがって、重心点を用いた本方法はノイズの影響を受けにくく、本方法によれば高い精度で凝固因子濃度を取得できることが期待される。また、図１９Ａ及び図１９Ｂに示した例は演算対象域値Sを10%に設定した場合であり、図１９Ｃ及び図１９Ｄに示した例は演算対象域値Sを60%に設定した場合である。しかしながらこれに限らず、演算対象域値Sは各種の値に設定され得るので、種々のパラメータが得られ、種々の情報が得られる。
　図２０Ａは、第VIII因子濃度の対数に対するピーク幅vBの関係を示す。ピーク幅vBを求めるにあたって、演算対象域値Sは10%に設定した。図２０Ｂは、第IX因子濃度の対数に対するピーク幅vBの関係を示す。ピーク幅vBを求めるにあたって、演算対象域値Sは10%に設定した。
　図２０Ａ及び図２０Ｂに示したように、ピーク幅vBと第VIII因子濃度及び第IX因子濃度とは高い相関関係を示した。したがって、これらから求めた検量線を基にして、患者検体のピーク幅vBを測定することによって患者検体に含まれる第VIII因子濃度又は第IX因子濃度を算出することができる。算出されたこれらの濃度に基づいて、凝固因子の欠乏状況を判定することができることが示された。
４．２．３．演算対象域値と重心点との関係
　図２１Ａは、正常血漿の補正１次曲線を示す。図２１Ｂは、第VIII因子欠乏血漿（Factor FIII Deficient Plasma）の補正１次曲線を示す。図２１Ｃは、第IX因子欠乏血漿（Factor IX Deficient Plasma）の補正１次曲線を示す。各図において、黒丸は、下から順に、演算対象域値Sがそれぞれ10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%に設定されたときに得られる重心点を示す。
　図２１Ａの補正１次曲線は、ピークの数が１つである単峰性の形状を示している。この場合、演算対象域値Sの増加に伴って、重心時間vTは単調にわずかに短縮している。これに対して、図２１Ｂ及び図２１Ｃの補正１次曲線は、ピークの数が２つある二峰性の形状を示している。このため、一つ目の小さなピークの影響を受けて、演算対象域値Sの増加に伴って、重心時間vTは途中までは比較的大きな割合の短縮を示している。また、演算対象域値Sが１つ目の小さなピークの極大値を超えたとき、重心時間vTは比較的大きな割合の延長を示す。このように、演算対象域値Sが異なる複数の重心点を求めることで得られる、それらの値、変化内容、比、差なども評価パラメータになり得る。
　図２１Ｂ及び図２１Ｃに示す例のように、補正１次曲線は、２つの極大値を示すことがある。図２１Ｂに示す例における約80秒のところ、及び図２１Ｃに示す例における約60秒のところに認められるような右側の比較的幅の広い極大値をメインピークと称し、図２１Ｂに示す例における約50秒のところ、及び図２１Ｃに示す例における約50秒のところに認められるような左側の比較的幅の狭い極大値をサイドピークと称することにする。演算対象域値Sが10%より小さいとき、補正１次曲線のメインピークの形状の影響が解析結果に大きく反映され、サイドピークの形状の影響はあまり反映されないことが見出された。また、演算対象域値Sが60%～70%のときに、補正１次曲線のサイドピークの形状の影響が解析結果に現れることが見出された。
　演算対象域値Sをどのように設定するかは重要な意味を持つ。第VIII因子欠乏血漿の測定において、演算対象域値Sを50%～70%に設定した際に、補正１次曲線に現れるサイドピークが第VIII因子濃度と深い関連を有することが見出された。したがって、第VIII因子欠乏血漿の解析のためには、演算対象域値Sを50%～70%に設定することが一つの好ましい設定である。
　様々な凝固因子の欠乏血漿の１次曲線に現れるピークを分析することによって凝固に関わる様々な因子の影響を見積もることが可能になる。
　図２２Ａは、演算対象域値Sの設定値（10%～90%）と重心時間vTとの関係を示す。図２２Ｂは、演算対象域値Sが10%の場合に得られた重心時間vTと、演算対象域値Sの設定値が20%～90%の各々の場合に得られた重心時間vTとの差を示す。図２２Ｃは、演算対象域値Sの設定値（10%～90%）と重心高さvHとの関係を示す。
　図２２Ａ及び図２２Ｂに示したように、正常血漿の重心時間vTと凝固因子欠乏血漿の重心時間vTとは大きく異なることが明らかになった。すなわち、例えば正常血漿の重心時間vTと患者検体の重心時間vTとを比較することで、凝固因子の欠乏状況を検出できることが明らかになった。
　また、図２２Ｂに示したように、特に第VIII因子欠乏血漿では、他に比べて重心時間vTの演算対象域値S依存性が高いことが明らかになった。すなわち、患者検体の重心時間vTの演算対象域値S依存性を調べることで、第VIII因子の欠乏状況を検出できることが明らかになった。
　また、図２２Ｃに示したように、正常血漿の重心高さvHと凝固因子欠乏血漿の重心高さvHとは大きく異なることが明らかになった。すなわち、例えば正常血漿の重心高さvHと患者検体の重心高さvHとを比較することで、凝固因子の欠乏状況を検出できることが明らかになった。
　重心高さvHの有用性を示す別の一例を、図２３を参照して説明する。図２３の左列は、第VIII因子欠乏血漿のみを含む被検血漿について得られた補正１次曲線を示す。図２３の右列は、第VIII因子濃度0.25%の被検血漿について得られた補正１次曲線を示す。それぞれ最大１次微分値Vmaxが三角印（△）で示されている。上段は演算対象域値Sを70%に設定した場合、中段は演算対象域値Sを80%に設定した場合、下段は演算対象域値Sを90%に設定した場合にそれぞれ得られる重心点を丸印（〇）で示したものである。左列に示した第VIII因子欠乏血漿のみの場合に得られた補正１次曲線では、最大１次微分値Vmaxは左側の細いサイドピークに位置している。演算対象域値Sが70%又は80%に設定されている場合には、重心点は、右側の幅の広いメインピークの方に位置するのに対して、演算対象域値Sが90%に設定されている場合には、重心点は、最大１次微分値Vmaxを示すサイドピークの方に位置する。これに対して、右列に示した第VIII因子濃度0.25%の被検血漿の場合に得られた補正１次曲線では、最大１次微分値Vmaxは右側のメインピークに位置している。そして、演算対象域値Sが70%、80%及び90%の何れに設定されている場合にも、重心点は、右側の幅の広いメインピークの方に位置し、最大１次微分値Vmaxを示す時間に近い。このように、本実施形態の方法によれば、0.25%の第VIII因子が存在する場合のような血漿であっても、その判別が可能である。
４．２．４．区間内平均傾きについて
　図２４Ａは、上記式(2)を用いて算出した、第IX因子欠乏血漿の補正１次曲線の例を示す。図２４Ｂは、上記式(4)を用いて算出した、第IX因子欠乏血漿の補正１次曲線の例を示す。図２４Ａと図２４Ｂとを比較して明らかなように、図２４Ｂの上記式(4)に基づく方が、１次微分値がより詳細に把握され得る。例えば図２４Ｂでは時間４５秒近辺でのサイドピークの情報が詳細に把握され得る。このように区間内平均傾きによる補正１次曲線を用いることで、上述の解析によってより詳細な情報を得ることができることが明らかになった。
　区間内平均傾きによる補正１次曲線は、一連の測定データから算出することができる。区間内平均傾き値の算出は、光学的な検出器を用いて測光量変化が小さくなる分析装置、例えば血液凝固分析装置における解析に適している。
５．第２の実施例
５．１．方法
５．１．１．血液検体の凝固反応の測定方法
　被検血漿として、第VIII因子欠乏血漿と正常血漿との混和物を用いた。第VIII因子欠乏血漿には、Factor VIII Deficient Plasma（George King Bio-Medical, Inc.製）を用いた。正常血漿には、VIII因子濃度及びIX因子濃度が100%と看做せる正常プール血漿を用いた。被検血漿として、第VIII因子欠乏血漿（George King Bio-Medical, Inc.製）と正常血漿とを混合し、第VIII因子濃度が50%、25%、10%、5%、2.5%、1%、0.75%、0.5%及び0.25%となるように調製した試料、及び第VIII因子欠乏血漿（第VIII因子濃度が0.1%以下）を用いた。
　同様に、他の凝固因子の欠乏血漿（濃度0.1%以下）と正常血漿とを混合し、各因子の濃度が50%、25%、10%、5%、2.5%、1%、0.75%、0.5%及び0.25%となるように調製した試料も、被検血漿として調製した。他の凝固因子欠乏血漿としては、第V因子欠乏血漿、第IX因子欠乏血漿、第X因子欠乏血漿、第XI因子欠乏血漿、第XII因子欠乏血漿、プレカリクレイン欠乏血漿を用いた。なお、欠乏血漿のみの対数変換をするときには、濃度0.1%として計算した。
　第V因子欠乏血漿には、Factor V Deficient Plasma（George King Bio-Medical, Inc.製）を用いた。第IX因子欠乏血漿には、Factor IX Deficient Plasma（George King Bio-Medical, Inc.製）を用いた。第X因子欠乏血漿には、Factor X Deficient Plasma（George King Bio-Medical, Inc.製）を用いた。第XI因子欠乏血漿には、Factor XI DeficientPlasma（George King Bio-Medical, Inc.製）を用いた。第XII因子欠乏血漿には、FactorXII Deficient Plasma（George King Bio-Medical, Inc.製）を用いた。プレカリクレイン欠乏血漿には、Prekallikrein Deficient Plasma（George King Bio-Medical, Inc.製）を用いた。なお、第V因子、第XI因子及び第XII因子の測定には次のような臨床的意義があり、波形解析技術を用いて測定できることが期待されている。先天性凝固第V因子欠乏症は、凝固第V因子遺伝子変異により発症する凝固第V因子の量的欠乏や機能異常による出血性疾患でありその診断には凝固第V因子の測定が必要である。また、第XI因子欠乏症を疑う場合は凝固第XI因子の測定が必要となる。更に、最近になって不育症との関連が報告されている第XII因子の先天生欠損は凝固第XII因子測定で検査される。
　APTT測定試薬として、コアグピア APTT-N（積水メディカル株式会社製）及びコアグピア APTT-N 塩化カルシウム液（積水メディカル株式会社製）を用いた。
　上記の各被検血漿のAPTT測定を、血液凝固自動分析装置CP3000（積水メディカル株式会社製）を用いて行った。CP3000でのAPTTの測定手順は、第１の実施例と同じ手順とした。
４．１．２．測光データの解析方法
　測光データを基にして補正１次曲線を得る手順は、第１の実施例と同じ手順とした。
　得られた１次微分値Vを示す曲線をV=F(t)と表現し、その最大値をVmaxとしたときに、演算対象域値S(%)を設定し、F(t)≧Vmax×S×0.01を満たすデータを用いて、上記式(5)、(6)及び(7)に基づいて、重心時間vT及び重心高さvHを算出した。また、ピーク幅vBも算出した。これらのパラメータを用いて、上記式(8)及び(9)に基づいて、扁平率vAB及び時間率vTBを算出した。
５．２．解析結果及び考察
５．２．１．補正処理の有効性について
　ステップＳ２０３の補正処理の効果について検討を行った。第VIII因子濃度が異なる被検血漿に関してAPTT測定を行い、補正０次曲線から得られた補正１次曲線に基づいて、演算対象域値が80%の場合の扁平率vAB80%を算出した。なお、このときの扁平率vABは、値が1以上になるようにするため、定数100を掛けて演算している。また、未補正０次曲線から得られた未補正１次曲線に基づいて、演算対象域値が80%の場合の扁平率RvAB80%を算出した。図２５Ａは、第VIII因子濃度と補正１次曲線に基づくvAB80%との関係を示す。図２５Ｂは、第VIII因子濃度と未補正１次曲線に基づくRvAB80%との関係を示す。いずれのグラフも横軸は、第VIII因子濃度の対数を示す。図２５Ｂに示す未補正１次曲線より、図２５Ａに示す補正１次曲線の方が、わずかであるが回帰曲線によく一致した。
　また、図２５Ａ及び図２５Ｂのそれぞれについて、縦軸についても対数変換した場合の例を、それぞれ図２５Ｃ及び図２５Ｄに示す。図２５Ｃに示す補正１次曲線のほうが、図２５Ｄに示す未補正１次曲線よりも、直線回帰式の傾きが大きく、切片が0に近いことが分かった。通常、濃度を横軸とした直線状の検量線では、再現性は、傾きが大きい方が良くなり、切片が０に近い方が測定濃度域の制約が小さくなる。これらの結果から、vAB80%を基にして検量線から第VIII因子の濃度を算出することを考えると、図２５Ｃのように、傾きが大きく、切片が0に近い方が好ましい。
　以上のことから、補正処理が有用であることが明らかになったため、以下に示す解析においては、補正処理済みの凝固反応曲線から得られる補正１次曲線を用いた。また、以下の解析結果でも、評価パラメータについて、両対数グラフによる表示を行う。
５．２．２．補正１次曲線について
　被検血漿として、第VIII因子濃度がそれぞれ、50%、25%、10%、5%、2.5%、1%、0.75%、0.5%、0.25%及び0%となる第VIII因子欠乏血漿（以下、それぞれFVIII(50%)、FVIII(25%)、FVIII(10%)、FVIII(5%)、FVIII(2.5%)、FVIII(1%)、FVIII(0.75%)、FVIII(0.5%)、FVIII(0.25%)、FVIII(0%)と表記する）を調製し、APTT測定を行って得られた補正１次曲線を図２６に示す。図２６に示されるように、補正１次曲線の形状は、以下のようになった。第VIII因子濃度の低下に従って、最大ピーク高さは低下していき、ピーク形状は扁平化していった。また、第VIII因子濃度の低下に従って、二峰性ピークが出現した。
　演算対象域値Sを60%に設定して、重心点（vT, vH）を求めた。図２７は、第VIII因子濃度（%）の対数変換値と、重心高さvH60%の対数変換値との関係を示したグラフである。両者は良好な直線関係を示すことが明らかになった。このことから、重心高さvHといった重心点に関係する評価パラメータを用いることで、第VIII因子濃度が算出され得ること、すなわち、第VIII因子の欠乏レベルが判定され得ることが明らかになった。
５．２．３．時間率vTBについて
　各種の凝固因子欠乏血漿について時間率vTBの解析を行った。演算対象域値をx%に設定したときに得られる評価パラメータとして、重心点の重心時間vTをvTx%と表記し、ピーク幅vBをvBx%と表記し、時間率vTBをvTBx%と表記する。時間率vTBは、vTBx%=(vTx%/vBx%)×100である。
　各種因子欠乏血漿について、各種因子の濃度が0%、0.25%、0.5%、0.75%、1%、2.5%、5%、10%、25%、50%の各場合について、演算対象域値Sを5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%の各々に設定したときの、各種欠乏因子の濃度と時間率vTBとの関係を、図２８Ａ、図２８Ｂ、図２８Ｃ、図２８Ｄ、図２８Ｅ、図２８Ｆ、図２８Ｇ、図２８Ｈ、図２８Ｉ、図２８Ｊ、図２８Ｋにそれぞれ示す。各図において、横軸は、凝固因子の濃度(%)の対数を示す。各図において縦軸は、時間率vTBの対数を示す。各図には、第V因子欠乏血漿（FV）、第VIII因子欠乏血漿（FVIII）、第IX因子欠乏血漿（FIX）、第X因子欠乏血漿（FX）、第XI因子欠乏血漿（FXI）、第XII因子欠乏血漿（FXII）、プレカリクレイン欠乏血漿（PK）の各々に関するデータが示されている。なお、第XII因子欠乏血漿の第XII因子濃度が0%及び0.25%のAPTT測定において、凝固反応が測定時間内に終了しなかったためにこれらのデータはプロットされていない。
　各第VIII因子濃度について、演算対象域値Sを各値に設定した場合の時間率vTBx%の値を図２９に示す。また、各第VIII因子濃度について、各時間率vTBx%の値が、図２８Ａ乃至図２８Ｋのうち該当する図に示した全ての凝固因子欠乏血漿に関する時間率vTBx%の中で、低い方から数えて何番目の値であるかを示す順位を、図３０に示す。例えば、図２８Ａに示す結果において、時間率vTBが低い方から順に並べるとFVIII(0%)、FVIII(0.25%)、FVIII(0.5%)、FVIII(0.75%)、FVIII(1%)、FVIII(2.5%)、FIX(0%)、FVIII(5%)、FXI(0%)、FXI(0.25%)、FVIII(10%)、…であるので、FVIII(0%)、FVIII(0.25%)、FVIII(0.5%)、FVIII(0.75%)、FVIII(1%)、FVIII(2.5%)、FVIII(5%)、FVIII(10%)のそれぞれの順位は、1、2、3、4、5、6、8、11となる。また、第VIII因子欠乏血漿に関して、図２８Ａ乃至図２８Ｋの各図及び図２９に基づいて得られた、Log(vTB)と、Log(第VIII因子濃度)との相関係数、直線回帰式の傾き及び切片を図３１に示す。また、図３１に示した相関係数を表すグラフを図３２に示す。
　図２８Ａ及び図３０に基づくと、次のことが言える。例えば演算対象域値Sを5%に設定したとき、Log(vTB5%)≦0となるのは、第VIII因子が欠乏している場合のみであり、第VIII因子濃度が2.5%以下の場合のみである。すなわち、第VIII因子濃度が2.5%以下では、第VIII因子欠乏血漿のデータは、他の凝固因子欠乏血漿のデータと区別され得る。すなわち、凝固時間の延長の要因が第VIII因子の欠乏であることが鑑別され得る。ここで検討した因子以外について不明な点もあるが、少なくともここで検討した各種因子の中で、第VIII因子の欠乏に関する鑑別が可能であることが分かる。仮に他の因子について本方法で鑑別できなくても、別途の方法で鑑別され得るので、本方法は有効である。
　演算対象域値Sが5%から30%までに設定されたときには、同様に、第VIII因子濃度が2.5%以下では、第VIII因子欠乏血漿のデータは、他の凝固因子欠乏血漿のデータと区別され得る。すなわち、凝固時間の延長の要因が第VIII因子の欠乏であることが鑑別され得る。このことは、図２８Ａ乃至図２８Ｄにおいて、第VIII因子欠乏血漿の場合に得られた時間率vTBが、他の凝固因子欠乏血漿の場合に得られた時間率vTBよりも明らかに低いことに対応する。また、図３１に示されるように、演算対象域値Sが5%から30%までに設定されたときには、高い相関係数が得られることから、最小二乗法で得られる回帰直線を検量線として用いることで、第VIII因子の濃度が算出され得ることが分かる。
　また、演算対象域値Sが40%から70%までに設定されたときには、第VIII因子濃度が1%以下では、第VIII因子欠乏血漿のデータは、他の凝固因子欠乏血漿のデータと区別され得る。すなわち、凝固時間の延長の要因が第VIII因子の欠乏であることが鑑別され得る。このことは、図２８Ｅ乃至図２８Ｈにおいて、第VIII因子濃度が１%以下では、第VIII因子欠乏血漿の場合に得られた時間率vTBが、他の凝固因子欠乏血漿の場合に得られた時間率vTBよりも低いことに対応する。また、図３１に示されるように、演算対象域値Sが40%から70%までに設定されたときには、高い相関係数が得られることから、最小二乗法で得られる回帰直線を検量線として用いることで、第VIII因子の濃度が算出され得ることが分かる。なお、図３１及び図３２に示したように、演算対象域値Sが70%のときに相関係数が最大となった。
　また、演算対象域値Sが80%に設定されたときには、第VIII因子濃度が10%以下では、第VIII因子欠乏血漿のデータは、他の凝固因子欠乏血漿のデータと区別され得る。すなわち、凝固時間の延長の要因が第VIII因子の欠乏であることが鑑別され得る。しかしながら、図３１に示されるように相関係数は相対的に低くなるため、第VIII因子の濃度の算出には好適ではない。
　なお、演算対象域値Sが90%以上に設定されたときには、第VIII因子欠乏血漿のデータは、他の凝固因子欠乏血漿のデータと区別できない。すなわち、凝固時間の延長の要因を鑑別できない。
　以上より、演算対象域値Sを80%以下に設定して時間率vTBを求めることで、APTTの延長が第VIII因子の濃度が低レベルであることに起因するか否かを鑑別できることが明らかになった。また、演算対象域値Sを70%以下に設定して求めた時間率vTBに基づいて、第VIII因子濃度が算出され得ることが明らかになった。特に、演算対象域値Sを80%に設定して解析を行うことで、APTTの延長の要因が第VIII因子の欠乏であるか否かを、第VIII因子の濃度が比較的高い10%以下である場合まで鑑別することができることが明らかになった。また、演算対象域値Sを70%に設定して解析を行うことで、第VIII因子の濃度を高精度に算出できることが分かった。
　また、図２８Ａ乃至図２８Ｋを参照すると、第IX因子について時間率vTBの濃度依存性が認められる。したがって、何らかの方法で第IX因子の欠乏があることが鑑別できる場合、第IX因子についても、時間率vTBに基づいて、濃度を算出できることが分かった。
５．２．４．扁平率vABについて
　各種凝固因子欠乏血漿について扁平率vABの解析を行った。演算対象域値Sをx%に設定したときに得られる評価パラメータとして、重心点Wの重心高さvHをvHx%と表記し、ピーク幅vBをvBx%と表記し、扁平率vABをvABx%と表記する。扁平率vABは定数100を掛けた、vABx%=vHx%/vBx%である。
　第VIII因子欠乏血漿について、第VIII因子の濃度が0%、0.25%、0.5%、0.75%、1%、2.5%、5%、10%、25%、50%の各場合について、演算対象域値Sを5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%の各々に設定したときの、各種欠乏因子の濃度と重心高さvHとの関係を図３３に示す。図３３には、併せて各第VIII因子濃度の最大１次微分値Vmaxも表示されている。また、演算対象域値Sを同じ各条件に設定したときの、各種欠乏因子の濃度とピーク幅vBとの関係を図３４に示す。これら重心高さvH及びピーク幅vBに基づいて得られる扁平率vABを図３５Ａに示す。また、扁平率vABの対数を図３５Ｂに示す。
　演算対象域値Sを同じ各条件に設定したときの、各種欠乏因子の濃度と扁平率vABとの関係を、図３６Ａ、図３６Ｂ、図３６Ｃ、図３６Ｄ、図３６Ｅ、図３６Ｆ、図３６Ｇ、図３６Ｈ、図３６Ｉ、図３６Ｊ、図３６Ｋにそれぞれ示す。各図において、横軸は、凝固因子の濃度(%)の対数を示し、縦軸は、扁平率vABの対数を示す。各図には、第V因子欠乏血漿（FV）、第VIII因子欠乏血漿（FVIII）、第IX因子欠乏血漿（FIX）、第X因子欠乏血漿（FX）、第XI因子欠乏血漿（FXI）、第XII因子欠乏血漿（FXII）、プレカリクレイン欠乏血漿（PK）の各々に関するデータが示されている。なお、第XII因子欠乏血漿の第XII因子濃度が0%及び0.25%のAPTT測定において、凝固反応が測定時間内に終了しなかったためにこれらのデータはプロットされていない。
　また、最大１次微分値Vmaxについても、同様に図３７Ａに示す。なお、Vmaxは、演算対象域値Sを100%に設定したときの重心高さvH100%に相当する。さらに、補正１次曲線を１次微分して得られる補正２次曲線に関して、演算対象域値Sを90%に設定した場合に得られたプラスピークの重心高さpH90％についても、同様に図３７Ｂに示す。
　各第VIII因子濃度について、演算対象域値Sを各値に設定した場合の扁平率vABx%の値及び最大１次微分値Vmax（vH100%）を図３８に示す。また、第VIII因子欠乏血漿に関して、図３６Ａ乃至図３６Ｋの各図及び図３８に基づいて得られた、Log(第VIII因子濃度)とLog(vAB)及びLog(Vmax)との相関に関する各値を図３９に示す。
　図３９に示すように、特に演算対象域値Sを80%以下に設定したときに、Log(第VIII因子濃度)とLog(vAB)との間に高い相関係数が得られた。すなわち、扁平率vABを用いることで、第VIII因子濃度を定量することができることが明らかになった。また、扁平率vABを用いた検量線は、図３７Ａに示した最大１次微分値Vmaxを用いた検量線よりも傾きが大きく、定量性が高いことが明らかになった。扁平率vABを用いた検量線は、図３７Ｂに示した補正２次曲線のプラスピークの重心高さpH90%よりも傾きが大きく、定量性が高いことが明らかになった。
　また、第VIII因子濃度と、図３９に示した値を用いた検量線から求めた演算濃度との比（回収率）を図４０に示す。この図において、網掛けの値は、演算濃度が第VIII因子濃度の±10%以内となっている値を示す。図４０を見ると、最大１次微分値Vmaxは、第VIII因子濃度が0.25%以下において回収率が悪化する。それに対してvAB80%は、第VIII因子濃度が0.25%以下において回収率が良好であるが、第VIII因子濃度が0.5%以上では、0.5%、2.5%及び50%において回収率が低下する。一方、vAB70%は、第VIII因子濃度が0.75%を除いた0.5%以上において回収率が良好である。すなわち、vAB70%とvAB80%を用いれば、第VIII因子濃度が0%から50%の範囲で高い回収率で第VIII因子濃度の定量が可能となる。
　以上のように、扁平率vABについては、演算対象域値Sを変えることによって、濃度領域毎に適当な検量線が選択できることが明らかになった。適当な検量線を選択することで、第VIII因子の濃度を正確に求めることができる。
　なお、第VIII因子欠乏血漿に関する扁平率vABの分布範囲は、他の因子欠乏血漿に関する扁平率vABの分布範囲と区別がつかなかった。すなわち、扁平率vABに基づいて凝固時間の延長の要因が第VIII因子の欠乏であることを鑑別することは困難であることが明らかになった。
　また、図３６Ａ乃至図３６Ｋを参照すると、多くの凝固因子について、扁平率vABの濃度依存性が認められる。したがって、これらの凝固因子についても、扁平率vABに基づいて、濃度を算出できることが分かった。特に、第V因子及び第X因子については、演算対象域値Sに係わらず、扁平率vABは因子濃度と良好な相関性が認められた。第IX因子については、演算対象域値Sを95%以外に設定した場合において、扁平率vABは因子濃度と良好な相関性が認められた。また、第XI因子については、演算対象域値xを50%以上で80%以下に設定した場合に、扁平率vABは因子濃度と良好な相関性が認められた。
　また、図３７Ｂを参照すると、凝固因子濃度（対数変換後）に対する補正２次曲線の重心点高さpH（対数変換後）は、第VIII因子で非常に高い相関性を示し、他の因子においても、第V因子、第X因子、第IX因子、第XI因子の順で良好な相関性が認められた。したがって、補正２次曲線の重心点高さpHを用いても、これら因子の濃度が算出され得ることが明らかになった。
６．第３の実施例
６．１．方法
６．１．１．血液検体の凝固反応の測定方法
　被検血漿として、第２の実施例と同様に、凝固因子欠乏血漿と正常血漿との混合血漿を調製した。凝固因子欠乏血漿としては、第２の実施例で用いた第V因子欠乏血漿（V）、第VIII因子欠乏血漿（VIII）、第IX因子欠乏血漿（IX）、第X因子欠乏血漿（X）、第XI因子欠乏血漿（XI）及び第XII因子欠乏血漿（XII）を用いた。比較対照用として正常血漿（PNP）を用いた。凝固因子欠乏血漿のみを含む被検血漿（濃度0％）で凝固因子濃度の対数変換をするときには、濃度0.1%として計算した。第１の実施例と同じ手順で各被検血漿のAPTT測定を行った。
６．１．２．測光データの解析方法
　第１の実施例と同じ手順で、測光データから未補正０次曲線及び補正０次曲線を得た。得られた未補正０次曲線及び補正０次曲線から、第１の実施例と同様の手順で上述の式(4)による区間内平均傾きを求めることで、未補正１次曲線及び補正１次曲線をそれぞれ算出した。さらに得られた１次曲線に対して同じ計算を繰り返し、未補正２次曲線及び補正２次曲線をそれぞれ算出した。補正０次曲線、補正１次曲線、及び補正２次曲線からパラメータを算出した。
６．２．解析結果及び考察
６．２．１．凝固因子に依存した曲線形状の変化
　図４１Ａに、凝固因子欠乏（実施例においては因子濃度を0.1％として取り扱った。）を被検血漿として得られた未補正０次曲線及び未補正１次曲線の例を示す。また図４１Ｂに、同じ被検血漿から得られた補正０次曲線及び補正１次曲線の例を示す。図４２Ａは、同じ被検血漿から得られた未補正２次曲線の例を示す。図４２Ａの右図は、図４２Ａ左図のｙ軸方向の縮尺を変えた図である。図４２Ｂは、同じ被検血漿から得られた補正２次曲線の例を示す。図４２Ｂの右図は、図４２Ｂ左図のｙ軸方向の縮尺を変えた図である。図４１～４２から分かるとおり、欠乏する凝固因子の種類によって凝固時間、及び１次曲線及び２次曲線における最大ピークの高さ及び時間が異なっていた。
６．２．２．凝固因子濃度と評価パラメータとの関係
　補正０次～２次曲線から算出したパラメータを表２に示す。演算対象域値xは、ピークの最大値（Vmax、Amax、Amin）を100％としたときの、0％～99％に設定した。なおAPTTとはT50（０次曲線が最大高さの50%に達するまでの時間）を表す。図４３Ａ乃至図４３Ｖには、上図に各種凝固因子濃度の対数とパラメータ値の対数との関係を示す。この関係から検量線を作成した。該検量線を基にパラメータ値から演算濃度を算出した。中左図には、Ｘ軸が実測濃度、Ｙ軸が演算濃度となるように各種凝固因子の相関関係をプロットした。中右図には、低濃度での相関関係が確認できるように両軸を対数表示でプロットした。中図の下に記載した式は、各凝固因子濃度に対する演算濃度の直線回帰式と相関係数である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
  
　第VIII因子、第IX因子、第V因子、第X因子、第XI因子、及び第XII因子について、凝固因子濃度（Ｘ軸）に対する演算濃度（Ｙ軸）の直線回帰式が傾き１±０．１、ｙ切片±１、及び相関係数（Ｒ）０．９以上であったパラメータを表３～８中に「＋」で示した。表９には、各凝固因子に対して「＋」条件の直線回帰式が得られたS値の数をパラメータごとに示す。「＋」条件の直線回帰式が得られたパラメータは、凝固因子の濃度測定又は欠乏の判定に用いられ得る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
  
７．第４の実施例
　本実施例に示す本発明の実施形態は、被検血漿が凝固異常（APTT延長）を示す場合に、上述した０次曲線～２次曲線に関するパラメータを用いて、APTT延長要因を判定、又はAPTT延長要因が凝固因子インヒビター（抗凝固因子抗体）であった場合には該凝固因子インヒビターの種類の鑑別を実施する方法である。
　本実施形態においては、凝固異常を有する被検血漿と、正常血漿との混合血漿を用いる。該混合血漿の調製では、被検血漿と、別途に準備した正常血漿とが所定の比率で混合される。該被検血漿と該正常血漿との混合比は、合計を１０容量とした容量比で、被検血漿：正常血漿＝１：９～９：１の範囲であればよく、好ましくは４：６～６：４の範囲、より好ましくは５：５である。
　調製された混合血漿の一部は、加温される。該加温の温度は、例えば３０℃以上４０℃以下であればよく、好ましくは３５℃以上３９℃以下、より好ましくは３７℃である。該加温の時間は、例えば、２～３０分間の範囲であればよく、好ましくは５～３０分間である。該加温時間はさらに長くてもよいが、好ましくは１時間以内、最大でも２時間以内である。
　本実施形態では、当該加温血漿及び非加温血漿についてのAPTT測定が行われ、測光データが取得される。したがって、本実施形態においては、調製された混合血漿のうち、一部は上記の加温処理後にAPTT測定が行われ得、一部は該加温処理なしでAPTT測定が行われ得る。
　得られた測光データから、該加温血漿及び非加温血漿についての、未補正及び補正０次曲線～２次曲線を得ることができる。データの補正処理及び微分は、第１の実施例と同様の手順で実施することができる。得られた該加温血漿及び非加温血漿のそれぞれについての未補正及び補正０次曲線～２次曲線から、表１に示すパラメータを算出することができる。本実施例において、該非加温血漿から取得されたパラメータを第１のパラメータと呼び、該加温血漿から取得されたパラメータを第２のパラメータと呼ぶ。該第１及び第２のパラメータの比、差又はそれらの組み合わせに基づいて、APTT延長要因を判定、又はAPTT延長要因が凝固因子インヒビターであった場合に、該凝固因子インヒビターの種類の鑑別をすることができる。
７．１．方法
７．１．１．被検血漿
　本実施例で用いた被検血漿を以下に示す。正常血漿（ＮＰ）には、健常人より得られたクエン酸加血漿を用いた。ＬＡ血漿（ＬＡ）には、George King Biomedical, Inc.のPositive Lupus Anticoagulant Plasmaを用いた。第VIII因子欠乏血漿（ＨＡ）及び第IX因子欠乏血漿（ＨＢ）には、George King BiomedicalのFactor VIII Deficient、Factor IX Deficientを用いた。第VIII因子インヒビター血漿（ＩｎＬ、ＩｎＭ及びＩｎＨ）には、George King Biomedical, Inc.のFactor VIII Deficient with Inhibitorを用いた。
　群No. 　検体種　　　　　　　　　　　　　　　　　　検体数
　１　　　正常血漿（ＮＰ）　　　　　　　　　　　　　２３
　２　　　ＬＡ血漿（ＬＡ）　　　　　　　　　　　　　　６
　３　　　血友病Ａ（ＨＡ）　　　　　　　　　　　　　１４
　４　　　血友病Ｂ（ＨＢ）　　　　　　　　　　　　　１２
　５　　　第VIII因子インヒビター低力価血漿（ＩｎＬ）１２
　６　　　第VIII因子インヒビター中力価血漿（ＩｎＭ）３５
　７　　　第VIII因子インヒビター高力価血漿（ＩｎＨ）　８
なお、インヒビター力価の「低」、「中」、「高」とは、以下を意味する：
　中：２～４０（ＢＵ／ｍＬ）（ＢＵ／ｍＬ：ベセスダ単位）
　低：中より低い力価
　高：中より高い力価
７．１．２．混合血漿の調製
　各被検血漿と正常血漿（ＮＰの混合物）とを１：１の容量比で混合して混合血漿を調製した。
７．１．３．APTT測定
　APTT試薬には、コアグピアAPTT-N（積水メディカル株式会社製）を、塩化カルシウム液には、コアグピアAPTT-N　塩化カルシウム液（積水メディカル株式会社製）を用いた。APTT測定には、血液凝固自動分析装置CP3000（積水メディカル株式会社製）を用いた。装置のキュベット（反応容器）に混合血漿５０μＬを吐出し、以下の手順で通常（非加温）モード又は加温モードで処理した。：
（通常モード）３７℃で４５秒間の加温
（加温モード）３７℃で６００～７２０秒間の加温
　その後、キュベットに約３７℃に加温したAPTT試薬５０μＬを添加し、１７１秒経過後に２５ｍＭ塩化カルシウム液５０μＬ添加して、凝固反応を開始させた。凝固反応はキュベットを約３７℃に維持した状態で行った。凝固反応の検出は、波長６６０ｎｍのＬＥＤを光源とする光を照射し、０．１秒間隔で９０度側方散乱した散乱光量を測光した。測光時間は３６０秒間とした。同じ混合血漿について、非加温（通常モード）及び加温（加温モード）条件でのAPTT測定をそれぞれ行い、測光データを得た。
７．１．４．測光データの解析
　非加温血漿及び加温血漿のそれぞれについて得られた測光データに対し、第１の実施例と同様の手順で補正０次～２次曲線を得た。得られた曲線から、表１に示すパラメータを算出した。非加温血漿についてのパラメータをＰａ、加温血漿についての同じパラメータをＰｂとし、パラメータ比Ｐｂ／Ｐａを求めた。
７．２．解析結果及び考察
　図４４Ａに、ＬＡ血漿（ＬＡ）の加温及び非加温での補正１次曲線を示す。ＬＡでは、加温による曲線形状の変化はほとんどなかった。
　図４４Ｂに、第VIII因子インヒビター血漿（ＩＮ）の加温及び非加温での補正１次微分曲線を示す。ＩＮでは、ＬＡと同様に加温による曲線形状の変化はほとんどなかった。
　図４５Ａに、ＬＡ血漿（ＬＡ）と正常血漿との１：１混合血漿（ＬＡ－ＮＰ）の加温及び非加温での補正１次微分曲線を示す。正常血漿と混合したことにより、図４５Ａと比較するとピークが早く現われ（凝固時間が短縮）、形状もシャープ化している。ＬＡ－ＮＰでは、ＬＡと同様に加温による曲線形状の変化はほとんどなかった
　図４５Ｂに、第VIII因子インヒビター血漿（ＩＮ）と正常血漿との１：１（ＩＮ－ＮＰ）の加温及び非加温での補正１次微分曲線を示す。非加温は、正常血漿と混合したことにより、図４４Ｂと比較するとＬＡ－ＮＰと同様にピークが早く現われて形状もシャープ化している。一方、加温は、ピークが遅く現われ、ピーク高さが低くなると共にピーク幅は広くなった。この形状変化は、加温処理中にＩＮに含まれていたインヒビター（抗第VIII因子抗体）が正常血漿に含まれていた第VIII因子と抗原抗体反応が進行したために、混合血漿の凝固反応が阻害されたことによると判断された。この非加温と加温との形状変化をパラメータの変化として指標化することによってＩＮをＬＡと鑑別できる可能性が確認できた。
　表１０に、非加温血漿及び加温血漿（１０分加温）から得た各種パラメータ値と、それらの比（Ｐｂ／Ｐａ）を示す。第VIII因子インヒビター血漿の混合血漿（ＩＮ－ＮＰ）のＰｂ／Ｐａは１から大きく外れており、正常血漿（ＮＰ）、ＬＡ血漿（ＬＡ）、ＬＡ混合血漿（ＬＡ－ＮＰ）とは明らかに相違した。したがって、各種パラメータのＰｂ／Ｐａに基づいて第VIII因子インヒビター陽性血漿を判別可能であることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
  
　図４６Ａ～Ｇは、健常者（ＮＰ）、ＬＡ、ＨＡ、ＨＢ、第VIII因子インヒビターが低力価（ＩｎＬ）、中力価（ＩｎＬ）及び高力価（ＩｎＨ）の血漿を正常血漿と容量比１：１で混合した混合血漿を用いて、各種のパラメータの非加温でのパラメータＰａ、加温でのパラメータＰｂ、ならびにそれらの比Ｐａ／Ｐｂ及び差Ｐｂ－Ｐａを示す。第VIII因子インヒビター中力価血漿（ＩｎＭ）は、Ｐａ／Ｐｂが１より大きく又は小さくなる傾向があった。第VIII因子インヒビター低力価血漿（ＩｎＬ）は、Ｐａ／ＰｂとＰｂ－Ｐａの両方ともＨＡと同じような分布となる傾向であったが、パラメータによってはＨＡの分布よりも広がりが大きくなるものがあった。一方、第VIII因子インヒビター高力価血漿（ＩｎＨ）は、全体的にはＰａ／Ｐｂが１より大きくもしくは小さくなる傾向、又はＰｂ－Ｐａが０から外れる傾向があったが、一部のパラメータ（APTT、vT）はＰａ／Ｐｂが１に近い場合があった。しかし、ＩｎＨのAPTTは、Ｐａ／Ｐｂが約１になる場合でもＰｂ－Ｐａは０ではなく、少なくとも５秒は延長した。したがって、ＰａとＰｂの比及び差を組み合わせて用いることでAPTTを用いてＩｎＨを判別可能であることが示された。
　より詳細には、本実施例により、APTT（秒）について以下の結果が示された。なお、APTTの「延長」とは、APTTが正常血漿より長いことを示し、APTTの「短縮」とは、APTTが正常血漿と同じかそれに近い値であることを示す。
・ＬＡを含む混合血漿は、Ｐａ及びＰｂともに延長し、Ｐｂ／Ｐａは約１である。
・ＨＡとＨＢを含む混合血漿は、Ｐａ及びＰｂともに短縮し、Ｐｂ／Ｐａは約１である。
・ＩｎＬを含む混合血漿は、Ｐａ及びＰｂともに短縮し、Ｐｂ／Ｐａは約１である。
・ＩｎＭを含む混合血漿は、Ｐａで僅かに延長し、ＰｂではＰａよりさらに延長し、Ｐｂ／Ｐａは１より大になる。
・ＩｎＨを含む混合血漿は、Ｐａは延長し、ＰｂはＰａと同程度かさらに延長し、Ｐｂ／Ｐａは約１か又は１より大になる。
　上記の結果を表１１にまとめた。加温及び非加温でのAPTTに基づいて、混合血漿に含まれる被検血漿を次のように判別できることが示された。
（１）ＰａとＰｂがともに延長し、かつＰｂ／Ｐａが約１であれば、被検血漿はＬＡ又はＩｎＨである。
（２）ＰａとＰｂがともに短縮し、かつＰｂ／Ｐａが約１であれば、被検血漿はＨＡＢ（ＨＡ又はＨＢ）又はＩｎＬである。
（３）ＰａとＰｂがともに延長し、かつＰｂ／Ｐａが１より大であれば、被検血漿はＩｎＭ又はＩｎＨである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
  
　また図４６Ｂより、VmaxでのＰｂ／Ｐａは、ＬＡ、ＨＡ、ＨＢ、ＩｎＬ及び一部のＩｎＨではAPTTと同様に約１となり、一方ＩｎＭと一部を除いたＩｎＨでは１より小となった。凝固反応がインヒビターによる阻害を受ける場合、インヒビター力価に応じてAPTTが延長すると共に凝固速度は小さくなり、結果、それらのパラメータ比Ｐｂ／Ｐａは１から外れる。そのため、ＩｎＭと一部を除いたＩｎＨでは、APTTのＰｂ／Ｐａは１より大になり、VmaxのＰｂ／Ｐａは１より小になる。一部のＩｎＨは、高力価群の中でも力価が高い検体（超高力価検体）であり、図４４Ｂで示すようにVmaxは、非加温（Ｐａ）において１付近まで低下しており、加温（Ｐｂ）においてもほとんど変化が無いためにパラメータ比Ｐｂ／Ｐａは１付近になる。ＩｎＨの中で超高力価検体を判別するためには、一例として、非加温（Ｐａ）でのVmaxが２以下となる検体と定義すればよい。
　また図４６Ｃ～Ｇに示すとおり、AmaxはVmaxと同様の傾向を示し、vB、vTはAPTTと同様の傾向を示し、vAB及びvTBはVmaxやAmaxと同様の傾向を示した。
　以上の結果から、各種パラメータのＰａとＰｂの比、差、又はそれらの組み合わせに基づいて、APTT延長要因が凝固因子インヒビターである検体を判別可能であることが示された。
８．第５の実施例
８．１．方法
８．１．１．血液検体
　血液凝固因子に異常のある被験者に由来する血液検体と正常な血液検体（正常血漿）とを用いて、以下の５種類の測定対象試料を用意した。
(1) 正常血漿
　正常血漿には、CRYOcheck Pooled Normal Plasma（Precision BioLogic Incorporated）を用いた。
(2) ＬＡ陽性血漿
　ＬＡ陽性血漿には、Positive Lupus Anticoagulant Plasma (George King Biomedical,Inc.)を用いた。
(3) 第VIII因子インヒビター陽性血漿
　第VIII因子インヒビター陽性血漿には、Factor VIII Deficient with Inhibitor (George King Biomedical,Inc.)を用いた。
(4) ＬＡ陽性血漿と正常血漿との等量混合血漿
　上で述べた「(2) ＬＡ陽性血漿」と「(1) 正常血漿」とを１：１の容量比で混合した混合血漿を調製した。
(5) 第VIII因子インヒビター陽性血漿と正常血漿との等量混合血漿
　上で述べた「(3) 第VIII因子インヒビター陽性血漿」と「(1) 正常血漿」とを１：１の容量比で混合した混合血漿を調製した。
８．１．２．血液検体の凝固反応の測定方法
　上記５種類の試料のそれぞれについて、３７℃にて、加温処理なしでのAPTT測定、１０分加温処理後のAPTT測定、３０分加温処理後のAPTT測定、１２０分加温処理後のAPTT測定をそれぞれ実施した。
　本実施例では、各APTT測定を、血液凝固自動分析装置ＣＰ３０００（積水メディカル株式会社製）を用いて行った。本実施例では、キュベット（反応容器）に吐出され３７℃で４５秒間加温した試料５０μＬに、約３７℃に加温したＡＰＴＴ試薬５０μＬを添加（吐出）し、さらに１７１秒経過後に２５ｍＭ塩化カルシウム液５０μＬを添加（吐出）して凝固反応を開始させた。反応は、３７℃に維持した状態で行った。凝固反応の検出（測光）は、波長６６０ｎｍのＬＥＤライトを光源とする光を照射し、０．１秒間隔で９０度側方散乱光の散乱光量を検出することによって行った。検出時間は３６０秒間とした。
８．１．３．測光データの解析方法
　上記５種類の試料のそれぞれについて行われた、加温処理なしでのAPTT測定の結果、１０分加温処理後のAPTT測定の結果、３０分加温処理後のAPTT測定の結果、１２０分加温処理後のAPTT測定の結果をそれぞれ示す、経時的な光学的情報、すなわち測光データを取得して凝固反応曲線を得た。
　凝固反応曲線に対して、ベースライン調整を行った。すなわち、凝固反応曲線に対してノイズ除去を含む平滑化処理を行い、測定開始時点の散乱光量が０となるように調整した。続いて、凝固反応曲線の最大高さが１００となるように補正し、補正０次曲線を得た。該補正０次曲線を一次微分して、補正１次曲線を得た。補正１次曲線の算出には、上述の式(4)による区間内平均傾きを用いた。
　ベースライン調整後の凝固反応曲線に基づいて、凝固時間を算出した。
　また、補正１次曲線の最大値Vmax及び最大値となる時間VmaxTを算出した。また、補正２次曲線を求め、その最大値Amax及び最大値となる時間AmaxTを算出した。
　また、補正１次曲線に基づいて、演算対象域値Sを10%に設定したときのピーク幅vB10%を算出した。また、演算対象域値Sを60%に設定したときの重心時間vT60%と、重心高さvH60%とを算出した。また、演算対象域値Sを10%に設定したときの扁平率vAB10%を算出した。また、演算対象域値Sを5%に設定したときの時間率vTB5%を算出した。
８．２．解析結果及び考察
　上述した５種類の試料の代表的な補正１次曲線をそれぞれ図４７Ａ乃至図４７Ｅに示す。各図の中の４つの曲線M0、M10、M30、M120は、それぞれ、混合血漿の加温処理なし、加温処理１０分後、加温処理３０分後、加温処理１２０分後の補正１次曲線を示す。
　図４７Ａに、「(1) 正常血漿」の補正１次曲線を示す。この曲線は、他の試料と比較して、ピーク高さは高く、ピーク幅は狭くなった。また、単峰性の形状を示した。加温処理時間の違いによる影響を見ると、曲線M0、M10、M30、M120間で曲線の形状変化は殆ど見られなかった。
　図４７Ｂに、「(2) ＬＡ陽性血漿」の補正１次曲線を示す。この曲線は、正常血漿と比較すると延長が認められ、ピーク高さは低く、ピーク幅が広い。また、二峰性のピークのうち一方が不完全なピークとなるショルダー状、又は二峰性の形状を示した。加温処理時間の違いによる影響を見ると、曲線M0、M10、M30、M120間で曲線の形状変化が少し見られるが、特段大きな変化は見られない。
　図４７Ｃに、「(3) 第VIII因子インヒビター陽性血漿」の補正１次曲線を示す。この曲線は、正常血漿と比較すると延長が認められ、ピーク高さは低く、ピーク幅が広く、形状は顕著な二峰性を示した。また、ＬＡ陽性血漿と比較すると、ピーク高さはさらに低く、ピーク幅もさらに広い。加温処理時間の違いによる影響を見ると、曲線M0、M10、M30、M120間で頂上部などに小さな形状変化が見られるが、特段大きな変化は見られない。
　図４７Ｄに、「(4) ＬＡ陽性血漿と正常血漿との等量混合血漿」の補正１次曲線を示す。この曲線は、図４７Ｂに示した「(2) ＬＡ陽性血漿」と比較して、ピーク高さは高く、ピーク幅が狭くなった。加温処理時間の違いによる影響を見ると、曲線M0、M10、M30、M120間で波形の形状変化が少し見られるが、特段大きな変化は見られない。
　図４７Ｅに、「(5) 第VIII因子インヒビター陽性血漿と正常血漿との等量混合血漿」の補正１次曲線を示す。この曲線は、図４７Ｃに示した「(3) 第VIII因子インヒビター陽性血漿」と比較して、特に、加温処理なしでのM0で顕著にピーク高さが高くなり、ピーク幅が狭くなった。一方で、加温処理時間が長くなるとともに、ピーク高さは低くなり、ピーク幅は広くなった。特に曲線M0、M10間で大きな形状変化が見られた。例えば、加温処理なし（M0）に対し、１０分加温処理後（M10）は、ピーク高さが半分以下となり、二峰化した。１０分加温処理後（M10）の曲線は扁平化しており、大きな形状変化が見られる。３０分加温処理後（M30）までは形状変化が確認できたが、その後の形状変化が認められなかった。
　このように曲線M0、M10間では大きな形状変化があることから、「(5) 第VIII因子インヒビター陽性血漿と正常血漿との等量混合血漿」では、加温処理時間を２時間よりも短くした１０分においても、補正１次曲線を解析することで、第VIII因子インヒビター陽性を鑑別可能であることが分かった。図４７Ｅに示すように、加温処理なし（M0）と１０分加温処理後（M10）の場合とで明らかに曲線の形状が異なる。この形状の差異を表す評価パラメータは種々あり得る。第VIII因子インヒビター陽性の鑑別には、当該鑑別の指標として有効な評価パラメータを各補正１次曲線から見出して利用することが望ましい。
　図４８に、上述した５種類の試料のそれぞれについて、１０分加温処理後の混合血漿のAPTT測定から得られる各種評価パラメータ、加温処理なしでの混合血漿のAPTT測定から得られる各種評価パラメータ、及び、双方の各種評価パラメータの比を算出した結果を示す表の一例を示す。
　なお、図４８において、「NP」は「正常血漿」を表しており、「LA」は「ＬＡ陽性血漿」を表しており、「LA M」は「ＬＡ陽性血漿と正常血漿との等量混合血漿」を表しており、「IN」は「第VIII因子インヒビター陽性血漿」を表しており、「IN M」は「第VIII因子インヒビター陽性血漿と正常血漿との等量混合血漿」を表している。また、「10min」は「３７℃での１０分間の加温処理」を表しており、「0min」は「加温処理なし」を表している。
　図４８に示す各種の評価パラメータは以下のとおりである。凝固時間は、ベースライン調整後の凝固反応曲線の散乱光量が50%となる反応経過時間を示す。Vmaxは、補正１次曲線の最大値を示す。VmaxTは、測光開始後からVmaxとなるまでの時間を示す。Amaxは、補正２次曲線の最大値を示す。AmaxTは、測光開始後からAmaxとなるまでの時間を示す。vB10%は、演算対象域値Sを10％にしたときのピーク幅を示す。vAB10%は、演算対象域値Sを10％としたときの扁平率を示し、演算対象域値Sを10％としたときの重心高さvH10%をピーク幅vB10%で除した値（vH10%/vB10%）を示す。vTB5%は、演算対象域値Sを5%に設定したときの時間率を示し、演算対象域値Sを5%に設定したときの重心時間vT5%をピーク幅vB5%で除した値（vT5%/vB5%）を示す。vT60%は、演算対象域値Sを60%に設定したときの重心時間を示す。vH60%は、演算対象域値Sを60％に設定したときの重心高さを示す。
　ＬＡ陽性血漿は、即時反応と遅延反応での違いが見られないことが知られているので、ＬＡ陽性血漿と正常血漿との等量混合血漿（LA M）では、比（Ｐｂ／Ｐａ）は、１に近い値となると予想された。解析結果は、図４８に示すとおり、Amaxを除いて、比（Ｐｂ／Ｐａ）は、１に近い値となった。Amaxが1.0から大きく外れているのは、二次微分によりＰｂとＰａの値が小さくなることによるS/N比の悪化影響を受けているためと推察される。その他の評価パラメータについて、「ＬＡ陽性血漿と正常血漿との等量混合血漿（LA M）」での値と「第VIII因子インヒビター陽性血漿と正常血漿との等量混合血漿（IN M）」での値との比（Ｐｂ／Ｐａ）について検討した。
　凝固時間は、LA Mでは、比（Ｐｂ／Ｐａ）が0.988であるのに対して、IN Mでは、比（Ｐｂ／Ｐａ）が1.596であり明らかに大きくなる。IN Mの比（Ｐｂ／Ｐａ）が1.596となっているのは、この検体では１０分間の加温処理により第VIII因子インヒビターの凝固阻害反応の作用が強くなっていることを示している。LA Mの比（Ｐｂ／Ｐａ）が0.988となっているのは、ＬＡが１０分間の加温処理では凝固反応には影響しないことを示している。
　Vmaxでの加温処理なしと１０分加温処理の差は、図４７Ｄに示すように、LA Mではほとんど変化していないのに対して、図４７Ｅに示すように、IN Mでは１０分加温処理により明確に低下している。これを反映してVmaxの比（Ｐｂ／Ｐａ）は、LA Mでは1.038であるのに対して、IN Mでは0.435であり、明らかに小さくなっている。このように、Vmaxは、第VIII因子インヒビターの存在など第VIII因子インヒビターの影響を判定するための評価パラメータとして、一つの好ましい例であると考えられる。
　VmaxTでの加温処理なしと１０分加温処理の差は、図４７Ｄに示すように、LA Mではほとんど変化していないのに対して、図４７Ｅに示すように、IN Mでは１０分加温処理により明確に延長している。これを反映して、VmaxTの比（Ｐｂ／Ｐａ）も、LA Mで0.998であるのに対して、IN Mでは、1.589となっている。しかしながら、図４７Ｅに示すように、加温処理後では補正１次曲線の二峰性が顕著になっており、１つ目のピークと２つ目のピークとでどちらが最大値をとるかによってVmaxTの値が大きく変わることになるので、VmaxTは、第VIII因子インヒビターの存在など第VIII因子インヒビターの影響を判定するための評価パラメータとしては好ましくないと考えられる。
　凝固反応の進行率を表すパラメータとして、重心高さvHが挙げられる。重心高さvH60%の比（Ｐｂ／Ｐａ）は、LA Mでは1.052であるのに対して、IN Mでは0.427であり、IN Mは明らかに小さくなっている。このように、重心高さvHは、第VIII因子インヒビターの存在など第VIII因子インヒビターの影響を判定するための評価パラメータとして、一つの好ましい例であると考えられる。
　凝固反応の進行状態の時間的変化を反映するパラメータとして、重心時間vTが挙げられる。重心時間vT60%の比（Ｐｂ／Ｐａ）は、LA Mでは0.988であるのに対して、IN Mでは1.592であり、IN Mは明らかに大きくなっている。このように、重心時間vTは、第VIII因子インヒビターの存在など第VIII因子インヒビターの影響を判定するための評価パラメータとして、一つの好ましい例であると考えられる。VmaxTが二峰性ピークの影響を受けやすいのに対して、重心時間vTは、補正１次曲線全体を平均化した形状を反映するパラメータである点で、VmaxTよりも優れた評価パラメータになり得る。
　図４７Ｄに示すように、LA Mでは１０分の加温処理をしても曲線形状はほとんど変化していないのに対して、図４７Ｅに示すように、IN Mでは１０分の加温処理により曲線が扁平化している。これを反映してピーク幅vB10%の比（Ｐｂ／Ｐａ）は、LA Mでは0.958であるのに対して、IN Mでは2.270であり、IN Mは明らかに大きくなっている。このように、ピーク幅vBは、第VIII因子インヒビターの存在など第VIII因子インヒビターの影響を判定するための評価パラメータとして、一つの好ましい例であると考えられる。
　同様に、扁平率vAB10%の比（Ｐｂ／Ｐａ）は、LA Mでは1.087であるのに対して、IN Mでは0.191であり、IN Mは明らかに小さくなっている。このように、扁平率vABは、第VIII因子インヒビターの存在など第VIII因子インヒビターの影響を判定するための評価パラメータとして、一つの好ましい例であると考えられる。
　時間率vTB5%の比（Ｐｂ／Ｐａ）は、LA Mでは1.019であるのに対して、IN Mでは0.718であり、IN Mは小さくなっている。IN Mでは、加温処理により重心時間vTxが延長化しているとともにピーク幅vBが大きくなっているので、これらの変化が相殺して、他のパラメータに比較して値が1.0からそれ程大きく離れていない。
　各パラメータの差（Ｐｂ－Ｐａ）についても、ＰｂとＰａが近似していれば差は0付近の値となり、ＰｂとＰａが近似していなければ差は0から離れた値になるため、差も判定指標となることが分かる。
　これらの結果から、凝固反応状態に関するパラメータ、特に例えば、最大一次微分値Vmax、ピーク幅vB、扁平率vAB、重心時間vT、重心高さvH、時間率vTBなどに基づいて、被験者の検体が、第VIII因子インヒビター陽性であるか、ＬＡ陽性であるかが鑑別され得ることが分かった。
　第VIII因子インヒビター陽性とＬＡ陽性を鑑別するにあたって、補正一次曲線に関するパラメータが有効であることを確認するために、複数の検体に対して、クロスミキシング試験と、本方法に係る解析とを行った。ここで、通常の遅延型クロスミキシング試験と異なり、３７℃での加温処理時間を１０分とした。即時型試験は従来と同様に加温処理は実施しない。
　図４９Ａ乃至図４９Ｌは、それぞれ異なるＬＡ陽性検体のクロスミキシング試験の結果を示す。図４９Ａ乃至図４９Ｌは、それぞれサンプルＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｈ，Ｉ，Ｊ，Ｋ，Ｏ，Ｐ，Ｑ，Ｒの結果を示す。各グラフの横軸は、ＬＡ陽性血漿と正常血漿との混合比を示し、ＬＡ陽性血漿の割合が0%、50%、100%であることを示す。縦軸は、測定されたAPTTの凝固時間を示す。各図において、実線で示したm0は、加温処理なしでのAPTT測定結果を示し、破線で示したm10は、混合血漿の加温処理時間が１０分の場合でのAPTT測定結果を示す。
　ＬＡ陽性血漿は、即時反応と遅延反応での違いが見られないことが知られている。この知見の通り、図４９Ａ乃至図４９Ｌのいずれの場合においても、加温処理の有無で測定結果の差異はほとんどなかった。図４９Ｉに示したサンプルＯ及び図４９Ｌに示したサンプルＲの場合を除いて、加温処理の有無に関係なくグラフは「上に凸」のパターンを示した。サンプルＯは、m0とm10で「下に凸」のパターンを示した。また、サンプルＲは、m0でわずかに下に凸になったが、m10では「直線状」のパターンを示した。
　図５０Ａ乃至図５０Ｉは、それぞれ異なる第VIII因子インヒビター陽性検体のクロスミキシング試験の結果を示す。図５０Ａ乃至図５０Ｉは、それぞれサンプルＥ，Ｆ，Ｇ，ＬＭ，Ｎ，Ｓ，Ｔ，Ｕの結果を示す。各グラフの横軸は、第VIII因子インヒビター陽性血漿と正常血漿との混合比を示し、第VIII因子インヒビター陽性血漿の割合が0%、50%、100%であることを示す。縦軸は、測定されたAPTTの凝固時間を示す。各図において、実線で示したm0は、加温処理なしでのAPTTの測定結果を示し、破線で示したm10は、混合血漿の加温処理時間が１０分の場合での測定結果を示す。
　第VIII因子インヒビター陽性血漿は、遅延反応で「上に凸」のパターンを示すことが知られている。この知見の通り、図５０Ａ乃至図５０Ｉのいずれの場合においても、第VIII因子インヒビター陽性血漿と正常血漿との混合血漿では、加温処理後の凝固時間が延長し、図５０Ｈに示したサンプルＴの場合を除いて、m10で「上に凸」のパターンを示した。図５０Ｈに示したサンプルＴの場合には、m0からm10で凝固時間の延長が認められたものの、m10で「下に凸」のパターンを示した。
　図５１Ａに、各サンプルについて、被検血漿100%での加温処理なしと、３７℃で１０分加温処理したときのAPTT測定結果を示す。
　ＬＡ陽性血漿のサンプルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｏ、Ｐ、Ｑ、Ｒの場合及び第VIII因子インヒビター陽性血漿のサンプルＥ、Ｆ、Ｇ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｕの場合の何れも、加温処理によりAPTT測定結果の変化は５％以内であり、加温処理による影響は僅かであることが確認できた。
　図５１Ｂに、各サンプルについて、被検血漿と正常血漿との等量混合血漿での加温処理なしと、３７℃で１０分加温処理したときのAPTT測定結果を示す。
　図５１Ｂにおいて、ＬＡ陽性血漿のサンプルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｏ、Ｐ、Ｑ、Ｒの場合は、加温処理によりAPTT測定結果の変化は５％以内であり、加温処理による影響は僅かであることが確認できた。一方、第VIII因子インヒビター陽性血漿のサンプルＥ、Ｆ、Ｇ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｕの場合は、加温処理によりAPTT測定結果の変化はまちまちであったがいずれも１０％を超えたことから加温処理による影響が確認できた。
　従来のクロスミキシング試験は、試料を３７℃で２時間加温処理することで、第VIII因子インヒビター陽性の検体で凝固時間の延長が認められように加温処理条件が設定されている。これに対して本願の方法は、１０分の加温処理では「下に凸」のパターンを示すような第VIII因子インヒビター陽性の検体（サンプルＴ）において、わずか１０分の加温処理でも第VIII因子インヒビターを検出しようとするものである。
　上述の複数のＬＡ陽性血漿及び第VIII因子インヒビター陽性血漿の各々について、正常血漿との等量混合血漿の加温処理なしと、３７℃で１０分加温処理したAPTT測定データに基づいて、補正１次曲線を算出した。
　図５２Ａ乃至図５２Ｌは、上述の１２例のＬＡ陽性血漿と正常血漿を容量比１：１で混合した混合血漿、すなわち、サンプルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｏ、Ｐ、Ｑ、Ｒの加温処理なしと、３７℃で１０分加温処理したときの補正１次曲線を示す。各曲線において、実線M0は、加温処理なしの場合を示し、破線M10は、３７℃で１０分加温処理した場合を示す。
　いずれのサンプルにおいても、曲線M0、M10間で形状変化は殆ど見られず、加温処理による曲線形状への影響が認められないことが確認できた。
　図５３Ａ乃至図５３Ｉは、上述の９例の第ＶＩＩＩ因子インヒビター陽性血漿と正常血漿を容量比１：１で混合した混合血漿、すなわち、サンプルＥ、Ｆ、Ｇ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｕの加温処理なしと、３７℃で１０分加温処理したときの補正１次曲線を示す。各曲線において、実線M0は、加温処理なしの場合を示し、破線M10は、３７℃で１０分加温処理した場合を示す。
　いずれのサンプルにおいても、曲線M0、M10間で大きな形状変化が見られ、加温処理による曲線形状への顕著な影響が認められることが確認できた。特に、加温処理によって、いずれのサンプルもピーク高さが低下し、ピーク幅が広がった。このような形状変化は、加温処理時間１０分のクロスミキシング試験において「下に凸」のパターンを示したサンプルＴにおいても、図５３Ｈに示すように確認できた。
　図５２Ａ乃至図５２Ｌに示した加温処理なしでのデータと１０分加温処理でのデータとの各々に基づいて、「ＬＡ陽性血漿と正常血漿との等量混合血漿」に関わる「演算対象域値Sを10％としたときの扁平率vAB10%」を算出した。そして、加温処理なしでの扁平率vAB10%と10分加温処理での扁平率vAB10%との比（vAB10% 10/0比）を算出した。同様に、図５３Ａ乃至図５３Ｉに示した加温処理なしでのデータと１０分加温処理でのデータとの各々に基づいて、「第VIII因子インヒビター陽性血漿と正常血漿との等量混合血漿」に関わる「演算対象域値Sを10％としたときの扁平率vAB10%」を算出した。そして、加温処理なしでの扁平率vAB10%と10分加温処理での扁平率vAB10%との比（vAB10% 10/0比）を算出した。それらの算出結果を図５４Ａに示す。
　図５４Ａに示されるように、「ＬＡ陽性血漿と正常血漿との等量混合血漿」のデータ（LA）では、「vAB10% 10/0比」の値が1.0を含む一定の範囲内に分布することが分かった。一方、「第VIII因子インヒビター陽性血漿と正常血漿との等量混合血漿」のデータ（Inhibitor）では、「vAB10% 10/0比」の値が0.6未満に分布することが分かった。したがって、双方の分布の間に閾値を設けることにより、被験者の検体がＬＡ陽性であるか第VIII因子インヒビター陽性であるかの鑑別が可能になることが明らかになった。例えば、サンプルＴのような検体であっても、この方法で正しく鑑別され得ることが確認できた。
　このように、加温処理なしでのAPTT測定で得られたデータから求めた扁平率vABと10分加温処理後のAPTT測定で得られたデータから求めた扁平率vABとの比（vAB 10/0比）は、被験者の検体がＬＡ陽性であるか第VIII因子インヒビター陽性であるかの鑑別に有効な指標と成り得ることが確認できた。
　図５２Ａ乃至図５２Ｌに示した加温処理なしでのデータと１０分加温処理でのデータとの各々に基づいて、「ＬＡ陽性血漿と正常血漿との等量混合血漿」に関わる「演算対象域値Sを60％としたときの重心高さvH60%」を算出した。そして、加温処理なしでの重心高さvH60%と１０分加温処理での重心高さvH60%との比（vH60% 10/0比）を算出した。同様に、図５３Ａ乃至図５３Ｉに示した加温処理なしでのデータと１０分加温処理でのデータとの各々に基づいて、「第VIII因子インヒビター陽性血漿と正常血漿との等量混合血漿」に関わる「演算対象域値Sを60％としたときの重心高さvH60%」を算出した。そして、加温なしでの重心高さvH60%と10分加温処理での重心高さvH60%との比（vH60% 10/0比）を算出した。それらの算出結果を図５４Ｂに示す。
　この図に示されるように、「ＬＡ陽性血漿と正常血漿との等量混合血漿」のデータ（LA）では、「vH60% 10/0比」の値が1.0を含む一定の範囲内に分布することが分かった。一方、「第VIII因子インヒビター陽性血漿と正常血漿との等量混合血漿」のデータ（Inhibitor）では、「vH60% 10/0比」の値が0.8未満に分布することが分かった。したがって、双方の分布の間に閾値を設けることにより、被験者の検体がＬＡ陽性であるか第VIII因子インヒビター陽性であるかの鑑別が可能になることが明らかになった。例えば、サンプルＴのような検体であっても、この方法で正しく鑑別され得ることが確認できた。
　このように、加温処理なしでのAPTT測定で得られたデータから求めた重心高さvHと10分加温処理でのAPTT測定で得られたデータから求めた重心高さvHとの比（vH 10/0比）は、被験者の検体がＬＡ陽性であるか第VIII因子インヒビター陽性であるかの鑑別に有効な指標と成り得ることが確認できた。
　図５２Ａ乃至図５２Ｌに示した加温処理なしでのデータと１０分加温処理でのデータとの各々に基づいて、「ＬＡ陽性血漿と正常血漿との等量混合血漿」に関わる「演算対象域値Sを10％としたときの扁平率vAB10%」を算出した。そして、加温処理なしでの扁平率vAB10%と１０分加温処理での扁平率vAB10%との差（vAB10% 10/0差）を算出した。同様に、図５３Ａ乃至図５３Ｉに示した加温処理なしでのデータと１０分加温処理でのデータとの各々に基づいて、「第VIII因子インヒビター陽性血漿と正常血漿との等量混合血漿」に関わる「演算対象域値Sを10％としたときの扁平率vAB10%」を算出した。そして、加温処理なしでの扁平率vAB10%と１０分加温処理での扁平率vAB10%との差（vAB10% 10/0差）を算出した。それらの算出結果を図５５Ａに示す。
　図５５Ａに示されるように、「ＬＡ陽性血漿と正常血漿との等量混合血漿」のデータ（LA）では、「vAB10% 10/0差」の値は-0.2から0.2までの範囲内に分布することが分かった。一方、「第VIII因子インヒビター陽性血漿と正常血漿との等量混合血漿」のデータ（Inhibitor）では、「vAB10% 10/0差」の値は-1.2から0.0まで広く分布することが分かった。双方の分布の間に閾値を設けることはできず、「vAB10% 10/0差」では、被験者の検体がＬＡ陽性であるか第VIII因子インヒビター陽性であるかの鑑別はできないことが明らかになった。
　図５２Ａ乃至図５２Ｌに示した加温処理なしでのデータと１０分加温処理でのデータとの各々に基づいて、「ＬＡ陽性血漿と正常血漿との等量混合血漿」に関わる「演算対象域値Sを60％としたときの重心高さvH60%」を算出した。そして、加温処理なしでの重心高さvH60%と１０分加温処理での重心高さvH60%との差（vH60% 10/0差）を算出した。同様に、図５３Ａ乃至図５３Ｉに示した加温処理なしでのデータと１０分加温処理でのデータとの各々に基づいて、「第VIII因子インヒビター陽性血漿と正常血漿との等量混合血漿」に関わる「演算対象域値Sを60％としたときの重心高さvH60%」を算出した。そして、加温なしでの重心高さvH60%と１０分加温処理での重心高さvH60%との差（vH60% 10/0差）を算出した。それらの算出結果を図５５Ｂに示す。
　この図に示されるように、「ＬＡ陽性血漿と正常血漿との等量混合血漿」のデータ（LA）では、「vH60% 10/0差」の値は-0.05から0.05の範囲内に分布することが分かった。一方、「第VIII因子インヒビター陽性血漿と正常血漿との等量混合血漿」のデータ（Inhibitor）では、「vH60% 10/0差」の値は、-0.30から0.00まで広く分布することが分かった。したがって、双方の分布の間に閾値を設けることはできず、「vH60% 10/0差」では、被験者の検体がＬＡ陽性であるか第VIII因子インヒビター陽性であるかの鑑別はできないことが明らかになった。
　図５２Ａ乃至図５２Ｌに示した加温処理なしでのデータと１０分加温処理でのデータとの各々に基づいて、「ＬＡ陽性血漿と正常血漿との等量混合血漿」に関わる「演算対象域値Sを60％としたときの重心時間vT60%」を算出した。そして、加温処理なしでの重心時間vT60%と10分加温処理での重心時間vT60%との差（vT60% 10/0差）を算出した。同様に、図５３Ａ乃至図５３Ｉに示した加温処理なしでのデータと１０分加温処理でのデータとの各々に基づいて、「第VIII因子インヒビター陽性血漿と正常血漿との等量混合血漿」に関わる「演算対象域値Sを60％としたときの重心時間vT60%」を算出した。そして、加温なしでの重心時間vT60%と10分加温処理での重心時間vT60%との差（vT60% 10/0差）を算出した。それらの算出結果を図５５Ｃに示す。
　この図に示されるように、「ＬＡ陽性血漿と正常血漿との等量混合血漿」のデータ（LA）では、「vT60% 10/0差」の値が0.0を含む一定の範囲内に分布することが分かった。一方、「第VIII因子インヒビター陽性血漿と正常血漿との等量混合血漿」のデータ（Inhibitor）では、「vT60% 10/0差」の値が10より大きい値に分布することが分かった。したがって、双方の分布の間に閾値を設けることにより、被験者の検体がＬＡ陽性であるか第VIII因子インヒビター陽性であるかの鑑別が可能になることが明らかになった。例えば、サンプルＴのような検体であっても、この方法で正しく鑑別され得ることが確認できた。
　このように、加温処理なしでのAPTT測定で得られたデータから求めた重心時間vTと１０分加温処理でのAPTT測定で得られたデータから求めた重心時間vTとの差（vT 10/0差）は、被験者の検体がＬＡ陽性であるか第VIII因子インヒビター陽性であるかの鑑別に有効な指標と成り得ることが確認できた。
９．第６の実施例
９．１．方法
　第５の実施例では、混合血漿の加温処理時間を１０分に設定した場合の実験結果を説明したが、第６の実施例では混合血漿の加温処理時間を２分に設定した場合の実験結果について説明する。第５の実施例と異なる条件は、被検血漿とその数、混合血漿の加温処理時間であり、その他の条件は同じである。
９．２．解析結果及び考察
　図５６は、ＬＡ陽性検体のクロスミキシング試験の結果を示す。図において、実線で示したm0は、加温処理なしでのAPTT測定結果を示し、破線で示したm2は、混合血漿の加温処理時間が2分の場合でのAPTT測定結果を示す。図５６において、混合血漿加温処理時間が０分（未加温）及び２分で測定結果の差異はほとんどなく、グラフは「上に凸」のパターンを示した。
　図５７もＬＡ陽性検体のクロスミキシング試験の結果を示す。図において、実線で示したm10は、混合血漿の加温処理時間が１０分の場合でのAPTT測定結果を示し、破線で示したm2は、混合血漿の加温処理時間が２分の場合でのAPTT測定結果を示す。図５７において、混合血漿加温処理時間が１０分及び２分で測定結果の差異はほとんどなかった。すなわち、混合血漿加温処理時間が０分（未加温）、２分及び１０分で測定結果の差異はほとんどなかった。
　図５８は、第VIII因子インヒビター陽性検体のクロスミキシング試験の結果を示す。図において、実線で示したm0は、加温処理なしでのAPTT測定結果を示し、破線で示したm2は、混合血漿の加温処理時間が２分の場合でのAPTT測定結果を示す。図５８において、混合血漿の加温処理時間が０分（未加温）及び２分とも「上に凸」のパターンを示し、２分加温処理後の凝固時間は、未加温と比較して延長し、「上に凸」のパターンは強くなった。
　図５９も第VIII因子インヒビター陽性検体のクロスミキシング試験の結果を示す。図において、実線で示したm10は、混合血漿の加温処理時間が１０分の場合でのAPTT測定結果を示し、破線で示したm2は、混合血漿の加温処理時間が２分の場合でのAPTT測定結果を示す。図５９において、混合血漿加温処理時間が１０分及び２分で測定結果の差異はほとんどなかった。
　図６０は、ＬＡ陽性血漿と正常血漿を容量比１：１で混合した混合血漿の加温処理なしと、３７℃で２分加温処理したときの補正１次曲線を示す。実線LA_0は、加温処理なしの場合を示し、破線LA_2は、３７℃で２分加温処理した場合を示す。曲線LA_0、LA_2間で形状変化は殆ど見られず、加温処理による曲線形状への影響が認められないことが確認できた。
　図６１は、第VIII因子インヒビター陽性血漿と正常血漿を容量比１：１で混合した混合血漿の加温処理なしと、３７℃で２分加温処理したときの補正１次曲線を示す。各曲線の意味は図６０と同じである。曲線8M_0、8M_2間で大きな形状変化が見られ、加温処理による曲線形状への顕著な影響が認められることが確認できた。２分の加温処理によっても第５の実施例での１０分の加温処理と同様にピーク高さが低下し、ピーク幅が広がった。
　図６２に、第５の実施例と同様に５種類の試料のそれぞれについて、２分加温処理後の混合血漿のAPTT測定から得られる各種評価パラメータ、未加温での混合血漿のAPTT測定から得られる各種評価パラメータ、及び、双方の各種評価パラメータの比を算出した結果を示す表の一例を示す。
　なお、図６２において、「2min」は「３７℃での２分間の加温処理」を表しており、他は図４８と同じ意味を表している。
　凝固時間は、LA Mでは、比（Ｐｂ／Ｐａ）が1.045であるのに対して、IN Mでは、比（Ｐｂ／Ｐａ）が1.082であり、差は見られなかった。この結果は、ＬＡ陽性検体が２分間の加温処理では凝固反応には影響しないことを示しており、第VIII因子インヒビター陽性検体の凝固阻害反応があまり強く影響していないことを示している。
　Vmaxでの未加温に対する２分加温処理の差は、図６２に示すように、LA Mではほとんど変化していないのに対して、IN Mでは明確に低下している。これを反映してVmaxの比（Ｐｂ／Ｐａ）は、LA Mでは0.953であるのに対して、IN Mでは0.731であり、明らかに小さくなっている。
　VmaxTでの未加温に対する２分加温処理の差は、図６２に示すように、LA Mではほとんど変化していないのに対して、IN Mでは延長している。これを反映して、VmaxTの比（Ｐｂ／Ｐａ）も、LA Mで1.020であるのに対して、IN Mでは、1.182となっている。図６１に示すように、２分の加温処理によっても第５の実施例での１０分の加温処理と同様に加温処理後では補正１次率曲線の二峰性が顕著になった。
　重心高さvH60%の比（Ｐｂ／Ｐａ）は、LA Mでは0.947であるのに対して、IN Mでは0.737であり、IN Mは明らかに小さくなっている。
　重心時間vT60%の比（Ｐｂ／Ｐａ）は、LA Mでは1.044であるのに対して、IN Mでは1.146であり、IN Mは大きくなっている。
　図６０に示すように、LA Mでは２分の加温処理をしても曲線形状はほとんど変化していないのに対して、図６１に示すように、IN Mでは曲線が扁平化している。図６２に示すように、これを反映してピーク幅vB10%の比（Ｐｂ／Ｐａ）は、LA Mでは1.076であるのに対して、IN Mでは1.405であり、IN Mは明らかに大きくなっている。
　同様に、扁平率vAB10%の比（Ｐｂ／Ｐａ）は、LA Mでは0.864であるのに対して、IN Mでは0.490であり、IN Mは明らかに小さくなっている。
　時間率vTBの比（Ｐｂ／Ｐａ）は、LA Mでは0.975であるのに対して、IN Mでは0.840であり、IN Mは小さくなっている。
　これらの結果から、２分の加温処理によっても第５の実施例での１０分の加温処理と同様に、凝固反応状態に関するパラメータ、特に例えば、最大１次微分値Vmax、ピーク幅vB、扁平率vAB、重心時間vT、重心高さvH、時間率vTBなどに基づいて、被験者の検体が、第VIII因子インヒビター陽性であるか、ＬＡ陽性であるかが鑑別され得ることが分かった。
　なお、ここでは有効な指標と成り得る評価パラメータとして「vAB10% 10/0比」、「vH60% 10/0比」及び「vT60% 10/0差」を挙げたが、これらに限らず、これら以外の評価パラメータも被験者の検体がＬＡ陽性であるか第VIII因子インヒビター陽性であるかの鑑別に有効な指標に成り得る。例えば、扁平率vABxを求めるにあたって設定される演算対象域値Sは、10%に限らず、他の値でもよい。同様に、重心高さvHxを求めるにあたって設定される演算対象域値Sは、60%に限らず、他の値でもよい。また、重心時間vTxを求めるにあたって設定される演算対象域値Sは、60%に限らず、他の値でもよい。また、扁平率vABx、重心高さvHx及び重心時間vTxに限らず、最大１次微分値Vmax、ピーク幅vBx、時間率vTBxなどに基づいても、同様に、被験者の検体が、ＬＡ陽性であるか、第VIII因子インヒビター陽性であるかが鑑別され得る。また、加温時間は１０分に限らない。図４７Ｅの補正１次曲線によれば、加温処理時間は３０分より長くする必要はないと考えられる。一方で、インヒビターが反応する時間は必要であるので、２分以上は加温することが好ましい。したがって、加温時間は２分以上３０分以下で適宜に変更されてもよい。いずれにしても従来の２時間と比較して、十分に検査の時間短縮となる。
１０．第７の実施例
１０．１．方法
　第５実施例と同じ手順で、混合血漿（ＬＡ陽性血漿について１２検体、第VIII因子インヒビター陽性血漿について９検体）を調製し、３７℃にて、加温処理なし、及び１０分加温処理後にAPTT測定を実施した。取得した測光データから各種評価パラメータを算出し、非加温血漿のパラメータ（Ｐａ）と加温血漿のパラメータ（Ｐｂ）との比（Ｐｂ／Ｐａ）及び差（Ｐｂ－Ｐａ）を求めた。ＬＡ陽性血漿と正常血漿との等量混合血漿（LA）と、第VIII因子インヒビター陽性血漿と正常血漿との等量混合血漿（Inhibitor）との間で、該比（Ｐｂ／Ｐａ）及び差（Ｐｂ－Ｐａ）の分布の平均値の有意差を評価した。各々の分布についてＦ検定（有意水準1%）により等分散と非等分散を判断し、次いでＴ検定（両側）でLAの分布とInhibitorの分布の平均値の差のP値を算出した。
１０．２．結果
　図６３Ａ～Ｅに、LA及びInhibitorについての非加温血漿と加温血漿との各種評価パラメータの差（Ｐｂ－Ｐａ）及び比（Ｐｂ／Ｐａ）の例を示す。図６３ＡはAPTT時間（T50）及びVmax、図６３ＢはvAB40％及びvABa40％、図６３ＣはvH40％及びvHa40％、図６３ＤはvAUC90％及びvW10％/vB10％、図６３ＥはpAUC80％及びmAUC20％についての結果を示す。
　表１２～１５に、LAとInhibitorとの間での各種パラメータのＰｂ／Ｐａ及びＰｂ－Ｐａの分布の差（P値）を示す。表中の値は、－：P値≧１％、１：０．１％≦P値＜１％、２：０．０１％≦P値＜０．１％、３：０．００１％≦P値＜０．０１％、４：０．０００１％≦P値＜０．００１％、５：P値＜０．０００１％、を示す。表１３～１５に示されるとおり、全体的に、比（Ｐｂ／Ｐａ）は差（Ｐｂ－Ｐａ）と比べてLAとInhibitorの間での分布の差が大きかった。多くのパラメータの比（Ｐｂ／Ｐａ）の分布は、P値＜０．０１％のレベルでLAとInhibitorの間で異なっていた。一方、差（Ｐｂ－Ｐａ）の分布がP値＜０．１％のレベルでLAとInhibitorの間で異なるパラメータも見出された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
  
　上述の実施形態及び実施例では、APTT測定を例に挙げて説明したが、これに限らない。上述の技術は、例えば、プロトロンビン時間測定、希釈プロトロンビン時間測定、希釈部分トロンボプラスチン時間測定、カオリン凝固時間測定、希釈ラッセル蛇毒時間測定などといった他の凝固時間測定に対しても、同様に適用され得る。
　また、上述の実施形態及び実施例では、凝固因子インヒビターとして、第VIII因子のインヒビターを例に挙げて説明したが、第VIII因子以外の他の因子のインヒビターに関しても、上述の技術は同様に適用され得る。
　以上、本発明の実施形態を例示したが、上記実施形態はあくまで一例であって、発明の範囲を限定することは意図していない。上記実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置換、変更を行うことができる。また、各構成や、形状、大きさ、長さ、幅、厚さ、高さ、数等は適宜変更して実施することができる。さらにそれぞれの実施例を組み合わせて新たな実施形態とすることもできる。
１…自動分析装置、１０…制御ユニット、１２…Central Processing Unit（ＣＰＵ）、１４…Random Access Memory（ＲＡＭ）、１６…Read Only Memory（ＲＯＭ）、１８…ストレージ、２０…通信インターフェース（Ｉ／Ｆ）、２２…バスライン、３０…測定ユニット、４２…制御回路、４４…データ処理回路、５２…恒温槽、５４…反応容器、６２…光源、６４…散乱光検出器、６６…透過光検出器、７２…検体容器、７４…試薬容器、７６…検体プローブ、７８…試薬プローブ、９０…タッチスクリーン、９２…表示装置、９４…タッチパネル。
 

Claims (28)

  1. 　血液検体の凝固特性の分析方法であって、
    （１）血液試料と試薬とを含む混合液の、反応時間に対する凝固反応量を示す凝固反応曲線のデータを取得することと、
    （２）前記凝固反応曲線に関する微分によって得られる微分曲線のデータを算出することと、
    （３）前記微分曲線の重心点に関係する情報を算出することと、
    （４）前記重心点に関係する情報を用いて前記血液試料の凝固特性を評価することと、
    を含む、方法。
  2. 　前記微分曲線が、前記凝固反応曲線に関する１次微分曲線及び該凝固反応曲線に関する２次微分曲線からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１記載の方法。
  3. 　前記微分曲線の重心点が、重心時間vT及び重心高さvHで規定される座標（vT, vH）で表される前記１次微分曲線の重心点であり、該vT及び該vHは、該１次微分曲線をF(t)（tは時間）、F(t)が所定値xである時間をt1、t2（t1<t2）とするとき、下記式で表される、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
      
    請求項２記載の分析方法。
  4. 　前記重心点に関係する情報が、前記vT、前記vH、ピーク幅vB、重心ピーク幅vW、B扁平率vAB、B時間率vTB、W扁平率vAW、W時間率vTW、平均時間vTa、平均高さvHa、vTm、vABa及びvAWaからなる群より選択される１つ以上のパラメータを含み、
    　該ピーク幅vBが、前記t1からt2までのF(t)≧xとなる時間長であり、
    　該重心ピーク幅vWが、前記t1からt2までのF(t)≧vHとなる時間長であり、
    　該vABが、該vHと該vBとの比を表し、
    　該vTBが、該vTと該vBとの比を表し、
    　該vAWが、該vHと該vWとの比を表し、
    　該vTWが、該vTと該vWとの比を表し、
    　該vTa、該vHa、及び該vTmは、F(t)、t1及びt2が前記と同じ定義であり、F(t1)からF(t2)までのデータ点数をｎとするとき、それぞれ下記式で表され、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
      
    　該vABaが、該vHaと該vBとの比を表し、
    　該vAWaが、該vHaと該vWとの比を表す、
    請求項３記載の分析方法。
  5. 　前記微分曲線の重心点が、重心時間pT及び重心高さpHで規定される座標（pT, pH）で表される前記２次微分曲線のプラスピークの重心点であり、該pT及び該pHは、該２次微分曲線をF'(t)（tは時間）、F'(t)が所定値xである時間をt1、t2（t1<t2）とするとき、下記式で表される、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
      
    請求項２記載の分析方法。
  6. 　前記重心点に関係する情報が、前記pT、前記pH、ピーク幅pB、重心ピーク幅pW、B扁平率pAB、B時間率pTB、W扁平率pAW、及びW時間率pTWからなる群より選択される１つ以上のパラメータを含み、
    　該ピーク幅pBが、前記t1からt2までのF'(t)≧xとなる時間長であり、
    　該重心ピーク幅pWが、前記t1からt2までのF'(t)≧pHとなる時間長であり、
    　該pABが、該pHと該pBとの比を表し、
    　該pTBが、該pTと該pBとの比を表し、
    　該pAWが、該pHと該pWとの比を表し、
    　該pTWが、該pTと該pWとの比を表す、
    請求項５記載の分析方法。
  7. 　前記微分曲線の重心点が、重心時間mT及び重心高さmHで規定される座標（mT, mH）で表される前記２次微分曲線のマイナスピークの重心点であり、該mT及び該mHは、該２次微分曲線をF'(t)（tは時間）、F'(t)が所定値xである時間をt1、t2（t1<t2）とするとき、下記式で表される、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
      
    請求項２記載の分析方法。
  8. 　前記重心点に関係する情報が、前記mT、前記mH、ピーク幅mB、重心ピーク幅mW、B扁平率mAB、B時間率mTB、W扁平率mAW、及びW時間率mTWからなる群より選択される１つ以上のパラメータを含み、
    　該ピーク幅mBが、前記t1からt2までのF'(t)≦xとなる時間長であり、
    　該重心ピーク幅mWが、前記t1からt2までのF'(t)≦mHとなる時間長であり、
    　該mABが、該mHと該mBとの比を表し、
    　該mTBが、該mTと該mBとの比を表し、
    　該mAWが、該mHと該mWとの比を表し、
    　該mTWが、該mTと該mWとの比を表す、
    請求項７記載の分析方法。
  9. 　前記所定値xが、前記１次微分曲線F(t)の最大値の0.5～99％である値である、請求項３～８のいずれか１項記載の分析方法。
  10. 　前記凝固特性が凝固因子濃度であり、該凝固因子が、凝固第V因子、凝固第VIII因子、凝固第IX因子、凝固第X因子、凝固第XI因子、及び凝固第XII因子からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項４、６、又は８記載の分析方法。
  11. 　前記（４）が、分析対象成分の濃度と前記扁平率との関係と、得られた前記扁平率とに基づいて、分析対象成分を定性すること及び分析対象成分の濃度を定量することを含む、請求項４、６、又は８記載の分析方法。
  12. 　前記（４）が、前記重心時間と前記ピーク幅との比（時間率）を用いた解析を含む、請求項４、６、又は８記載の分析方法。
  13. 　前記（４）が、前記時間率に基づいて、凝固時間延長の要因が凝固第VIII因子であるか否かを判定することを含む、請求項１２記載の分析方法。
  14. 　前記（４）が、分析対象成分の濃度と前記時間率との関係と、得られた前記時間率とに基づいて、分析対象成分を定性すること及び分析対象成分の濃度を定量することを含む、請求項１２又は１３記載の分析方法。
  15. 　前記凝固反応曲線のデータは、活性化部分トロンボプラスチン時間の測定によって得られたデータである、請求項１～１４のいずれか１項記載の分析方法。
  16. 　前記（２）が、取得した前記凝固反応曲線のデータの最大値に基づいて補正処理を行って補正処理済み凝固反応曲線のデータを算出することを更に含み、かつ
    　該（２）において、前記微分曲線のデータの算出には該補正処理済み凝固反応曲線のデータを用いる、
    請求項１～１５のいずれか１項記載の分析方法。
  17. 　前記（１）が、
    　　被検血漿と正常血漿とを混合した混合血漿を調製することと、
    　　該混合血漿の加温処理なしでの凝固時間測定を行うことと、
    　　該混合血漿の加温処理後の凝固時間測定を行うことと、
    を含み、
    　前記（３）が、
    　　該混合血漿の加温処理なしでの凝固時間測定データに基づいて凝固反応状態と関係する第１のパラメータを算出することと、
    　　該混合血漿の加温処理後の凝固時間測定データに基づいて凝固反応状態と関係する第２のパラメータを算出することと、
    を含み、
    　前記（４）が、
    　　該第１のパラメータと該第２のパラメータとの比又は差に基づいて、凝固時間の延長の要因を鑑別することと
    を含む、
    請求項１～１６のいずれか１項記載の分析方法。
  18. 　前記凝固時間測定は、プロトロンビン時間測定、活性化部分トロンボプラスチン時間測定、希釈プロトロンビン時間測定、希釈部分トロンボプラスチン時間測定、カオリン凝固時間測定、及び希釈ラッセル蛇毒時間測定のうち、少なくとも何れか１つである、請求項１７記載の分析方法。
  19. 　前記鑑別は、凝固時間の延長の要因が凝固因子インヒビターの影響であるかループスアンチコアグラントの影響であるかを判定することを含む、請求項１７又は１８記載の分析方法。
  20. 　前記混合血漿の加温時間は２分以上３０分以下である、請求項１７～１９のいずれか１項記載の分析方法。
  21. 　前記第１のパラメータ及び前記第２のパラメータが、前記１次微分曲線の最大値、重心高さvH、重心時間vT、ピーク幅vB、重心ピーク幅vW、B扁平率vAB、B時間率vTB、W扁平率vAW、W時間率vTW、平均時間vTa、平均高さvHa、vTm、vABa及びvAWaからなる群より選択される少なくとも１つを含む、請求項１７～２０のいずれか１項記載の分析方法。
  22. 　前記鑑別は、前記第１のパラメータと前記第２のパラメータとの比が１を含む所定の範囲内に収まらない場合に、凝固時間の延長の要因が凝固因子インヒビターの影響にあると判定することを含む、請求項１７～２１のいずれか１項記載の分析方法。
  23. 　前記鑑別は、前記第１のパラメータと前記第２のパラメータとの比が１を含む所定の範囲内に収まる場合に、凝固時間の延長の要因はループスアンチコアグラントの影響にあると判定することを含む、請求項１７～２１のいずれか１項記載の分析方法。
  24. 　前記鑑別は、前記第１のパラメータと前記第２のパラメータとの差が０を含む所定の範囲内に収まらない場合に、凝固時間の延長の要因が凝固因子インヒビターの影響にあると判定することを含む、請求項１７～２１のいずれか１項記載の分析方法。
  25. 　前記鑑別は、前記第１のパラメータと前記第２のパラメータとの差が０を含む所定の範囲内に収まる場合に、凝固時間の延長の要因はループスアンチコアグラントの影響にあると判定することを含む、請求項１７～２１のいずれか１項記載の分析方法。
  26. 　前記被検血漿と前記正常血漿との混合比は１対１である、請求項１７～２５のいずれか１項記載の分析方法。
  27. 　前記混合血漿の加温処理温度は３５℃以上３９℃以下である、請求項１７～２６のいずれか１項記載の分析方法。
  28. 　請求項１～２７のいずれか１項記載の分析方法を実行するための分析装置。
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