JP2017106925A

JP2017106925A - 血液検体の凝固能の評価方法、並びにその方法に用いるための試薬、試薬キット及び装置

Info

Publication number: JP2017106925A
Application number: JP2017012960A
Authority: JP
Inventors: 緑倫嶋; Ryokurin Shima; 恵嗣野上; Keiji Nogami; 智子松本; Tomoko Matsumoto; 剛久北沢; Takehisa Kitazawa; 哲弘添田; Tetsuhiro Soeda; 有香池田; Yuka Ikeda
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd; Sysmex Corp; Nara Medical University
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd; Sysmex Corp; Nara Medical University
Priority date: 2015-04-24
Filing date: 2017-01-27
Publication date: 2017-06-15
Anticipated expiration: 2036-03-30
Also published as: WO2016170944A1; US10302626B2; CN107533071A; JPWO2016170944A1; CN114578068A; EP3287791A4; JP6147945B2; JP6154969B2; EP3287791A1; US20180045709A1

Abstract

【課題】凝固第VIII因子代替活性を有する物質を投与された被検者から得た血液検体の凝固能の評価方法、血液凝固分析用試薬、血液凝固分析用試薬キット及び血液凝固分析装置を提供する。【解決手段】凝固第VIII因子代替活性を有する物質を投与された被検者から得た血液検体と、凝固第XII因子活性化剤と、リン脂質と、組織因子と、カルシウムイオン含有水溶液とから、測定試料を調製する工程と、測定試料に光を照射して、測定試料から光量に関する光学的情報を取得する工程と、取得した光学的情報に基づいて、血液検体の凝固能を評価する工程とを含む、血液検体の凝固能の評価方法、及び、測定試料を調製する測定試料調製部と、調製された測定試料に光を照射し、測定試料から光量に関する光学的情報を取得する光学的情報取得部と、制御部とを備え、光学的情報に基づいて、血液検体の凝固能についての参考情報を出力する、血液検体分析装置。【選択図】なし

Description

本発明は、凝固第VIII因子代替活性を有する物質を投与された被検者から得た血液検体の凝固能の評価方法に関する。また、本発明は、血液凝固分析用試薬、血液凝固分析用試薬キット及び血液凝固分析用装置に関する。さらに、本発明は、血液検体の凝固能の評価のための装置及びコンピュータプログラムに関する。

血友病は、凝固第VIII因子(FVIII)又は凝固第IX因子(FIX)の先天的欠損又は機能不全に起因する出血性疾患である。FVIIIが原因である場合は血友病Ａと呼ばれ、FIXが原因である場合は血友病Ｂと呼ばれる。血友病患者においては、関節内、筋肉内などの深部組織に出血症状が見られ、重篤な例では頭蓋内出血も生じる。

血友病の重症度は、血液中のFVIII活性又はFIX活性に基づいて分類される。具体的には、健常者のFVIII活性又はFIX活性を100％として、活性が１％未満の患者を重症に、活性が１％以上５％未満の患者を中等症に、活性が５％以上40％未満の患者を軽症に分類する。重症血友病患者は、中等症及び軽症の患者に比べて顕著に高い頻度で出血症状を呈する。しかし、FVIII又はFIXの補充療法により、患者の血液中のFVIII活性又はFIX活性を１％以上に維持することで、出血の頻度を劇的に減少させることができる。

補充療法には、主に、血漿から精製されたか又は遺伝子組換え技術により作製された凝固因子製剤が用いられる。近年では、FVIII代替活性を有する二重特異性抗体が開発されている。この二重特異性抗体は、活性化凝固第VIII因子(FVIIIa)の補因子としての機能を代替する。すなわち、この二重特異性抗体は、活性化凝固第IX因子(FIXa)と凝固第Ｘ因子(FX)の双方に結合することで、FIXaによるFXの活性化を促進させることができる。これにより、血液凝固が促進される。一方、上記の二重特異性抗体によって促進される血液凝固のプロセスは、FVIIIによる通常のプロセスとは異なり、FVIIIからFVIIIaへの活性化を要しない。

FVIIIなどの凝固因子製剤を用いる補充療法では、投与した凝固因子の薬効は、活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)測定や凝固波形解析などによってモニタリングされている。しかし、上記のように、二重特異性抗体による血液凝固は、FVIIIによる通常の血液凝固とはプロセスが異なるので、凝固因子製剤の薬効をモニタリングする既存の方法では、二重特異性抗体の実際の薬効を反映したデータを取得することは困難であった。

そのような状況下、本発明者らは、これまでに、血液試料中のトロンビン生成量を指標に用いて、FVIII代替活性を有する物質の薬効を適切な感度で評価できることを見出した(特許文献１参照)。しかし、この方法は、特殊な測定機器を要するので、臨床検査として普及させるには至っていない。また、本発明者らは、市販のAPTT測定試薬を用いる凝固波形解析により、上記の二重特異性抗体の第VIII因子代替活性を測定可能であることを見出した(非特許文献１参照)。しかし、この方法では、二重特異性抗体の薬効を適切な感度で評価できなかった。

国際公開第２０１４／０５０９２６号パンフレット

Matsumoto T.ら, A novel bispecific antibody (ACE910) againstcoagulation factors IXa and X improves procoagulant activity of patients with hemophilia A ex vivo to hemostatic level, ISTH, Abstract, OC 37.3. July 2, 2013 Muto A.ら, Anti-factor IXa/X bispecific antibody (ACE910): hemostatic potency against ongoing bleeds in a hemophilia A model and the possibility of routine supplementation, J Thromb Haemost. 2014 Feb;12(2):206-13

上記の二重特異性抗体のようなFVIII代替活性を有する物質を血友病などの治療に用いるためには、当該物質の薬効を適切に評価できる方法を確立することが重要である。よって、FVIII代替活性を有する物質を含む血液検体の凝固能を適切に評価する手段の開発が望まれる。また、そのような血液検体の凝固能を評価するための新たな手段の開発も望まれる。本発明者らは、FVIII代替活性を有する物質を含む血液検体の凝固能を適切に評価可能な条件、及びそのような血液検体の凝固能を評価するための新規なアプローチを見出して、本発明を完成した。

本発明の第１の態様は、血液検体の凝固能の評価方法を提供する。この方法は、凝固第VIII因子代替活性を有する物質を投与された被検者から得た血液検体と、凝固第XII因子活性化剤と、リン脂質と、カルシウムイオン含有水溶液とから、測定試料を調製する工程と、この測定試料に光を照射して、測定試料から光量に関する光学的情報を取得する工程と、取得した光学的情報に基づいて、凝固波形の微分に関するパラメータを少なくとも１つ取得する工程と、取得したパラメータの値に基づいて、上記血液検体の凝固能を評価する工程とを含み、上記測定試料における第XII因子活性化剤の終濃度が１μM以上22μM以下μM以下であり、且つリン脂質の終濃度が1.4μM以上33μM以下であるか、又は、上記測定試料における凝固第XII因子活性化剤の終濃度が１μM以上2.9μM以下であり、且つリン脂質の終濃度が1.4μM以上43μM以下であることを特徴とする。

本発明の第２の態様は、血液検体の凝固能の評価方法を提供する。この方法は、凝固第VIII因子代替活性を有する物質を投与された被検者から得た血液検体と、凝固第XII因子活性化剤と、リン脂質と、組織因子と、カルシウムイオン含有水溶液とから、測定試料を調製する工程と、この測定試料に光を照射して、測定試料から光量に関する光学的情報を取得する工程と、取得した光学的情報に基づいて、上記血液検体の凝固能を評価する工程とを含む。

本発明の第３の態様は、凝固第XII因子活性化剤を３μM以上66μM以下の濃度で含み、且つリン脂質を4.2μM以上99μM以下の濃度で含むか、又は、凝固第XII因子活性化剤を３μM以上8.7μM以下の濃度で含み、且つリン脂質を4.2μM以上129μM以下の濃度で含む、凝固第VIII因子代替活性を有する物質を投与された被検者から得た血液検体の凝固能を評価するための試薬を提供する。

本発明の第４の態様は、第１試薬と、カルシウムイオン含有水溶液からなる凝固開始試薬とを備え、第１試薬が、凝固第XII因子活性化剤を３μM以上66μM以下の濃度で含み、且つリン脂質を4.2μM以上99μM以下の濃度で含むか、又は、第１試薬が、凝固第XII因子活性化剤を３μM以上8.7μM以下の濃度で含み、且つリン脂質を4.2μM以上129μM以下の濃度で含む、凝固第VIII因子代替活性を有する物質を投与された被検者から得た血液検体の凝固能を評価するための試薬キットを提供する。

本発明の第５の態様は、凝固第XII因子活性化剤、リン脂質、及び組織因子を含む、凝固第VIII因子代替活性を有する物質を投与された被検者から得た血液検体の凝固能を評価するための試薬を提供する。

本発明の第６の態様は、凝固第XII因子活性化剤、リン脂質、及び組織因子を含む第１試薬と、カルシウムイオン含有水溶液からなる凝固開始試薬とを備える、凝固第VIII因子代替活性を有する物質を投与された被検者から得た血液検体の凝固能を評価するための試薬キットを提供する。

本発明の第７の態様は、第１試薬と、第２試薬と、カルシウムイオン含有水溶液からなる凝固開始試薬とを備え、第１試薬が、凝固第XII因子活性化剤及びリン脂質を含み、且つ第２試薬が組織因子を含むか、第１試薬が、凝固第XII因子活性化剤及びリン脂質を含み、且つ第２試薬が組織因子及びリン脂質を含むか、又は第１試薬が、凝固第XII因子活性化剤及び組織因子を含み、且つ第２試薬がリン脂質を含む、凝固第VIII因子代替活性を有する物質を投与された被検者から得た血液検体の凝固能を評価するための試薬キットを提供する。

本発明の第８の態様は、血液検体分析装置を提供する。この装置は、測定試料を調製する測定試料調製部と、調製された測定試料に光を照射し、測定試料から光量に関する光学的情報を取得する光学的情報取得部と、制御部とを備え、この制御部が、凝固第XII因子活性化剤及びリン脂質を含む活性化部分トロンボプラスチン時間測定用試薬を希釈液で所定の倍率に希釈し、希釈した試薬と、凝固第VIII因子代替活性を有する物質を投与された被検者から得た血液検体と、カルシウムイオン含有水溶液とから、測定試料を調製するように上記測定試料調製部を制御し、光学的情報に基づいて、凝固波形の微分に関するパラメータを少なくとも１つ取得し、取得したパラメータの値に基づいて、上記血液検体の凝固能についての参考情報を出力することを特徴とする。

本発明の第９の態様は、血液検体分析装置を提供する。この装置は、測定試料を調製する測定試料調製部と、調製された測定試料に光を照射し、測定試料から光量に関する光学的情報を取得する光学的情報取得部と、制御部とを備え、この制御部が、凝固第VIII因子代替活性を有する物質を投与された被検者から得た血液検体と、凝固第XII因子活性化剤と、リン脂質と、組織因子と、カルシウムイオン含有水溶液とから、測定試料を調製するように上記測定試料調製部を制御し、光学的情報に基づいて、上記血液検体の凝固能についての参考情報を出力することを特徴とする。

本発明の第１０の態様は、プロセッサ及びこのプロセッサの制御下にあるメモリを含むコンピュータを備える、血液検体の凝固能の評価のための装置を提供する。上記のメモリには、凝固第VIII因子代替活性を有する物質を投与された被検者から得た血液検体と、凝固第XII因子活性化剤と、リン脂質と、カルシウムイオン含有水溶液とから調製された測定試料から光量に関する光学的情報を取得するステップと、この光学的情報に基づいて、凝固波形の微分に関するパラメータを少なくとも１つ取得するステップと、取得したパラメータの値に基づいて、上記血液検体の凝固能についての参考情報を出力するステップとを、上記コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが記録されている。

本発明の第１１の態様は、コンピュータが読み取り可能な媒体に記録されている、血液検体の凝固能の評価のためのコンピュータプログラムを提供する。このコンピュータプログラムは、凝固第VIII因子代替活性を有する物質を投与された被検者から得た血液検体と、凝固第XII因子活性化剤と、リン脂質と、カルシウムイオン含有水溶液とから調製された測定試料から光量に関する光学的情報を取得するステップと、この光学的情報に基づいて、凝固波形の微分に関するパラメータを少なくとも１つ取得するステップと、取得したパラメータの値に基づいて、上記血液検体の凝固能についての参考情報を出力するステップとを、上記コンピュータに実行させることを特徴とする。

本発明の第１２の態様は、第１試薬と、第２試薬とを備え、第１試薬が、凝固第XII因子活性化剤及びリン脂質を含み、且つ第２試薬が組織因子及びカルシウムイオンを含む、凝固第VIII因子代替活性を有する物質を投与された被検者から得た血液検体の凝固能を評価するための試薬キットを提供する。

本発明によれば、第VIII因子代替活性を有する物質を投与された被検者から得た血液検体の凝固能を適切に評価することを可能にする。

正常血漿の凝固波形とその１次微分及び２次微分のグラフの一例である。本実施形態に係る試薬の一例を示す図である。本実施形態に係る試薬キットの一例を示す図である。本実施形態に係る試薬キットの一例を示す図である。血液検体分析装置の外観の構成を示す斜視図である。血液検体分析装置の測定部の内部を上側から見た場合の平面図である。血液検体分析装置の測定部の構成を示す図である。測定装置が備えるランプユニットの構成を示す図である。測定装置が備える検出部の構成を示す図である。測定装置が備える検出部の構成を示す図である。測定装置が備える検出部の構成を示す図である。測定装置が備える検出部の構成を示す図である。血液検体分析装置の制御装置の機能構成を示す図である。血液検体分析装置の制御装置のハードウェア構成を示す図である。血液検体分析装置による血液検体の測定処理を示すフローチャートである。血液検体分析装置による血液検体の分析処理を示すフローチャートである。血液検体分析装置による分析結果を表示する画面の一例を示す図である。 ACE910を含む血液検体及びrhFVIIIを含む血液検体のそれぞれから得られた凝固時間のグラフである。 ACE910を含む血液検体の凝固時間から換算したFVIII活性値のグラフである。 ACE910を含む血液検体及びrhFVIIIを含む血液検体のそれぞれから得られた|Min 1|のグラフである。 ACE910を含む血液検体の|Min 1|から換算したFVIII活性値のグラフである。 ACE910を含む血液検体及びrhFVIIIを含む血液検体のそれぞれから得られた|Min 2|のグラフである。 ACE910を含む血液検体の|Min 2|から換算したFVIII活性値のグラフである。 ACE910を含む血液検体及びrhFVIIIを含む血液検体のそれぞれから得られたMax 2のグラフである。 ACE910を含む血液検体のMax 2から換算したFVIII活性値のグラフである。３倍希釈したAPTT測定用試薬により得られた、ACE910を含む血液検体の凝固時間から換算したFVIII活性値のグラフである。３倍希釈したAPTT測定用試薬により得られた、ACE910を含む血液検体の|Min 1|から換算したFVIII活性値のグラフである。３倍希釈したAPTT測定用試薬により得られた、ACE910を含む血液検体の|Min 2|から換算したFVIII活性値のグラフである。３倍希釈したAPTT測定用試薬により得られた、ACE910を含む血液検体のMax 2から換算したFVIII活性値のグラフである。 ACE910及びrhFVIIIを含む血液検体から得られた|Min 1|のグラフである。 ACE910及びrhFVIIIを含む血液検体の|Min 1|から換算したFVIII活性値のグラフである。 ACE910及びrhFVIIIを含む血液検体から得られた|Min 2|のグラフである。 ACE910及びrhFVIIIを含む血液検体の|Min 2|から換算したFVIII活性値のグラフである。 ACE910及びrhFVIIIを含む血液検体から得られたMax 2のグラフである。 ACE910及びrhFVIIIを含む血液検体のMax 2から換算したFVIII活性値のグラフである。血液凝固分析用試薬１〜３を用いて、ACE910及びrhFVIIIのそれぞれを含むFVIIIヒト欠乏血漿(LotNo.899-3062)から得られた|Min 1|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬１〜３を用いて、ACE910及びrhFVIIIのそれぞれを含むFVIIIヒト欠乏血漿(LotNo.899-3062)から得られた|Min 2|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬１〜３を用いて、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿(LotNo.899-3062)から得られた|Min 1|から換算したFVIII活性値を示すグラフである。血液凝固分析用試薬１〜３を用いて、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿(LotNo.899-3062)から得られた|Min 2|から換算したFVIII活性値を示すグラフである。血液凝固分析用試薬１〜３を用いて、ACE910及びrhFVIIIのそれぞれを含むFVIIIヒト欠乏血漿(LotNo.895-2757)から得られた|Min 1|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬１〜３を用いて、ACE910及びrhFVIIIのそれぞれを含むFVIIIヒト欠乏血漿(LotNo.895-2757)から得られた|Min 2|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬１〜３を用いて、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿(LotNo.895-2757)から得られた|Min 1|から換算したFVIII活性値を示すグラフである。血液凝固分析用試薬１〜３を用いて、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿(LotNo.895-2757)から得られた|Min 2|から換算したFVIII活性値を示すグラフである。血液凝固分析用試薬１〜３を用いて、ACE910及びrhFVIIIのそれぞれを含むFVIIIヒト欠乏血漿(LotNo.899-2847)から得られた|Min 1|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬１〜３を用いて、ACE910及びrhFVIIIのそれぞれを含むFVIIIヒト欠乏血漿(LotNo.899-2847)から得られた|Min 2|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬１〜３を用いて、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿(LotNo.899-2847)から得られた|Min 1|から換算したFVIII活性値を示すグラフである。血液凝固分析用試薬１〜３を用いて、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿(LotNo.899-2847)から得られた|Min 2|から換算したFVIII活性値を示すグラフである。血液凝固分析用試薬４を用いて、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿(LotNo.899-3394)から得られた凝固時間を示すグラフである。血液凝固分析用試薬４を用いて、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿(LotNo.899-3394)から得られた|Min 1|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬４を用いて、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿(LotNo.899-3394)から得られた|Min 2|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬６〜９を用いて、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿(LotNo. 899-3062)から得られた凝固時間を示すグラフである。血液凝固分析用試薬10を用いて、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿(LotNo. 899-3062)から得られた凝固時間を示すグラフである。血液凝固分析用試薬11〜13を用いて、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿(LotNo. 899-3062)から得られた凝固時間を示すグラフである。血液凝固分析用試薬６〜９を用いて、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿(LotNo. 899-3062)から得られた|Min 1|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬10〜13を用いて、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿(LotNo. 899-3062)から得られた|Min 1|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬14及び15を用いて、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿(LotNo. 899-3062)から得られた|Min 1|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬６〜９を用いて、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿(LotNo. 899-3062)から得られた|Min 2|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬10〜13を用いて、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿(LotNo. 899-3062)から得られた|Min 2|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬14及び15を用いて、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿(LotNo. 899-3062)から得られた|Min 2|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬５を用いて、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿(LotNo. 899-3394)から得られた凝固時間を示すグラフである。血液凝固分析用試薬６〜９を用いて、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿(LotNo. 899-3394)から得られた凝固時間を示すグラフである。血液凝固分析用試薬12及び13を用いて、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿(LotNo. 899-3394)から得られた凝固時間を示すグラフである。血液凝固分析用試薬５を用いて、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿(LotNo. 899-3394)から得られた|Min 1|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬６〜９を用いて、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿(LotNo. 899-3394)から得られた|Min 1|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬10〜13を用いて、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿(LotNo. 899-3394)から得られた|Min 1|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬５を用いて、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿(LotNo. 899-3394)から得られた|Min 2|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬６〜９を用いて、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿(LotNo. 899-3394)から得られた|Min 2|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬11〜13を用いて、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿(LotNo. 899-3394)から得られた|Min 2|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬４を用いて、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿(LotNo.899-3394)から得られた|Min 1|から換算したFVIII活性値を示すグラフである。血液凝固分析用試薬６、11、12又は15を用いて、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿(LotNo. 899-3062)から得られた|Min 1|から換算したFVIII活性値を示すグラフである。血液凝固分析用試薬３を用いて、rhFVIIIを1 U/dLの濃度で添加した、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿(LotNo. 899-3062)から得られた|Min 1|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬３を用いて、rhFVIIIを1 U/dLの濃度で添加した、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿(LotNo. 899-3062)から得られた|Min 2|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬３を用いて、rhFVIIIを5 U/dLの濃度で添加した、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿(LotNo. 899-3062)から得られた|Min 1|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬３を用いて、rhFVIIIを5 U/dLの濃度で添加した、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿(LotNo. 899-3062)から得られた|Min 2|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬３を用いて、rhFVIIIを20 U/dLの濃度で添加した、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿(LotNo. 899-3062)から得られた|Min 2|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬12を用いて、rhFVIIIを1 U/dLの濃度で添加した、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿(LotNo. 899-3394)から得られた|Min 1|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬12を用いて、rhFVIIIを1 U/dLの濃度で添加した、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿(LotNo. 899-3394)から得られた|Min 2|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬12を用いて、rhFVIIIを5 U/dLの濃度で添加した、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿(LotNo. 899-3394)から得られた|Min 1|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬12を用いて、rhFVIIIを5 U/dLの濃度で添加した、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿(LotNo. 899-3394)から得られた|Min 2|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬12を用いて、rhFVIIIを20 U/dLの濃度で添加した、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿(LotNo. 899-3394)から得られた|Min 2|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬12を用いて、rhFVIIIを50 U/dLの濃度で添加した、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿(LotNo. 899-3394)から得られた|Min 1|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬12を用いて、rhFVIIIを50 U/dLの濃度で添加した、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿(LotNo. 899-3394)から得られた|Min 2|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬12を用いて、rhFVIIIを100 U/dLの濃度で添加した、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿(LotNo. 899-3394)から得られた|Min 1|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬12を用いて、rhFVIIIを100 U/dLの濃度で添加した、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿(LotNo. 899-3394)から得られた|Min 2|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬12を用いて、rhFVIIIを200 U/dLの濃度で添加した、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿(LotNo. 899-3394)から得られた|Min 1|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬12を用いて、rhFVIIIを200 U/dLの濃度で添加した、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿(LotNo. 899-3394)から得られた|Min 2|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬16を用いて、rhFVIIIを0 U/dL(無添加)、100 U/dL、又は200 U/dLの濃度で添加した、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿から得られた凝固時間を示すグラフである。血液凝固分析用試薬16を用いて、rhFVIIIを0 U/dL(無添加)、100 U/dL、又は200 U/dLの濃度で添加した、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿から得られた|Min 1|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬16を用いて、rhFVIIIを0 U/dL(無添加)、100 U/dL、又は200 U/dLの濃度で添加した、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿から得られた|Min 2|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬キット17〜21を用いて、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿から得られた凝固時間を示すグラフである。血液凝固分析用試薬キット22〜24を用いて、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿から得られた凝固時間を示すグラフである。血液凝固分析用試薬キット25及び26を用いて、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿から得られた凝固時間を示すグラフである。血液凝固分析用試薬キット27〜31を用いて、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿から得られた凝固時間を示すグラフである。血液凝固分析用試薬キット32〜34を用いて、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿から得られた凝固時間を示すグラフである。血液凝固分析用試薬キット17〜21を用いて、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿から得られた|Min 1|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬キット22〜24を用いて、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿から得られた|Min 1|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬キット25及び26を用いて、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿から得られた|Min 1|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬キット27〜31を用いて、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿から得られた|Min 1|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬キット32〜34を用いて、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿から得られた|Min 1|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬キット17〜21を用いて、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿から得られた|Min 2|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬キット22〜24を用いて、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿から得られた|Min 2|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬キット25及び26を用いて、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿から得られた|Min 2|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬キット27〜31を用いて、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿から得られた|Min 2|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬キット32〜34を用いて、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿から得られた|Min 2|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬キット19、20、23及び24を用いて、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿から得られた|Min 1|から換算したFVIII活性値を示すグラフである。血液凝固分析用試薬キット28、30、32、33及び34を用いて、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿から得られた|Min 1|から換算したFVIII活性値を示すグラフである。血液凝固分析用試薬キット22及び23を用いて、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿から得られた|Min 2|から換算したFVIII活性値を示すグラフである。血液凝固分析用試薬キット34を用いて、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿から得られた|Min 2|から換算したFVIII活性値を示すグラフである。血液凝固分析用試薬キット20を用いて、バイパス製剤であるAPCCを0.5 U/mLの濃度で添加した、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿から得られた|Min 1|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬キット20を用いて、APCCを1 U/mLの濃度で添加した、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿から得られた|Min 1|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬キット20を用いて、バイパス製剤であるFVIIaを0.25μg/mLの濃度で添加した、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿から得られた|Min 1|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬キット20を用いて、FVIIaを1.25μg/mLの濃度で添加した、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿から得られた|Min 1|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬キット21を用いて、APCCを0.5 U/mLの濃度で添加した、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿から得られた|Min 1|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬キット21を用いて、APCCを1 U/mLの濃度で添加した、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿から得られた|Min 1|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬キット21を用いて、FVIIaを0.25μg/mLの濃度で添加した、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿から得られた|Min 1|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬キット21を用いて、FVIIaを1.25μg/mLの濃度で添加した、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿から得られた|Min 1|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬キット28を用いて、APCCを0.5 U/mLの濃度で添加した、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿から得られた|Min 1|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬キット28を用いて、APCCを1 U/mLの濃度で添加した、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿から得られた|Min 1|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬キット28を用いて、FVIIaを0.25μg/mLの濃度で添加した、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿から得られた|Min 1|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬キット28を用いて、FVIIaを1.25μg/mLの濃度で添加した、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿から得られた|Min 1|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬キット30を用いて、APCCを0.5 U/mLの濃度で添加した、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿から得られた|Min 1|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬キット30を用いて、APCCを1 U/mLの濃度で添加した、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿から得られた|Min 1|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬キット30を用いて、FVIIaを0.25μg/mLの濃度で添加した、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿から得られた|Min 1|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬キット30を用いて、FVIIaを1.25μg/mLの濃度で添加した、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿から得られた|Min 1|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬キット33を用いて、APCCを0.5 U/mLの濃度で添加した、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿から得られた|Min 1|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬キット33を用いて、APCCを1 U/mLの濃度で添加した、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿から得られた|Min 1|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬キット33を用いて、FVIIaを0.25μg/mLの濃度で添加した、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿から得られた|Min 1|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬キット33を用いて、FVIIaを1.25μg/mLの濃度で添加した、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿から得られた|Min 1|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬キット35を用いて、APCCを0.5 U/mLの濃度で添加した、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿から得られた|Min 1|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬キット35を用いて、APCCを1 U/mLの濃度で添加した、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿から得られた|Min 1|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬キット35を用いて、FVIIaを0.25μg/mLの濃度で添加した、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿から得られた|Min 1|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬キット35を用いて、FVIIaを1.25μg/mLの濃度で添加した、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿から得られた|Min 1|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬キット36を用いて、APCCを0.5 U/mLの濃度で添加した、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿から得られた|Min 1|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬キット36を用いて、APCCを1 U/mLの濃度で添加した、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿から得られた|Min 1|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬キット36を用いて、FVIIaを0.25μg/mLの濃度で添加した、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿から得られた|Min 1|を示すグラフである。血液凝固分析用試薬キット36を用いて、FVIIaを1.25μg/mLの濃度で添加した、ACE910を含むFVIIIヒト欠乏血漿から得られた|Min 1|を示すグラフである。

[１．血液検体の凝固能の評価方法]
第１の態様に係る血液検体の凝固能の評価方法(以下、「第１の態様に係る方法」ともいう)では、まず、凝固第VIII因子(FVIII)代替活性を有する物質を含む血液検体と、凝固第XII因子活性化剤と、リン脂質と、カルシウムイオン含有水溶液とから、測定試料を調製する。第１の態様に係る方法では、活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)の測定原理に基づいて、FVIII代替活性を有する物質を含む血液検体の凝固能を評価する。

本実施形態において、血液検体は、FVIII代替活性を有する物質を含む血液に由来するかぎり特に限定されない。検体の種類としては、全血及び血漿が挙げられる。それらの中でも血漿が好ましく、血小板除去血漿が特に好ましい。血小板は、遠心分離やフィルター分離などの公知の手法により除去できる。本実施形態では、血液検体として、市販の血漿にFVIII代替活性を有する物質を添加した混合物を用いてもよい。そのような市販の血漿としては、例えば、凝固因子欠乏血漿などが挙げられる。血液検体には、必要に応じて、FVIIIなどの凝固因子製剤が添加されてもよい。

好ましい実施形態では、FVIII代替活性を有する物質を含む血液検体として、FVIII代替活性を有する物質を投与された被検者から採取した血液又はこの血液から調製した血漿を用いる。そのような被検者としては、例えば、凝固因子の欠損又は機能異常を原因とする出血性疾患の患者が挙げられる。出血性疾患としては、例えば、血友病Ａ、血友病Ｂ、後天性血友病、フォンビルブランド病などが挙げられる。より好ましくは、被検者は、FVIII及びFVIIIaのいずれか一方又は両方の活性が低下しているか又はそれらを欠損している出血性疾患の患者である。そのような患者のFVIIIの活性値としては、健常者のFVIII活性値を100％として、例えば40％、30％又は20％より低く、好ましくは10％、９％、８％、７％又は６％より低く、より好ましくは５％、４％、３％又は２％より低く、特に好ましくは１％より低いことが挙げられる。なお、血液検体におけるFVIIIの活性値を測定する方法自体は当該技術において公知であり、例えば合成基質法などが挙げられる。

本実施形態において、FVIII代替活性を有する物質は、血液中でFVIIIaと同様の補因子活性を有する物質であれば特に限定されない。ただし、FVIII代替活性を有する物質には、FVIII及びFVIIIaは含まれない。FVIII代替活性を有する物質としては、FIX又はFIXa、及びFXの双方に特異的に結合することができ、且つFIXaによるFXの活性化(すなわち、FXaの産生)を促進させることができる物質が好ましい。そのような物質としては、例えば、FIX又はFIXa、及びFXの双方に特異的に結合する二重特異性抗体が挙げられる。なお、そのような二重特異性抗体自体は当該技術において公知であり、例えばWO2005/035756、WO2006/109592及びWO2012/067176に開示されている。より具体的には、FVIII代替活性を有する物質として、特許文献(WO 2012/067176)に記載の抗FIXa/FX二重特異性抗体であるACE910 (Q499-z121/J327-z119/L404-k)(Emicizumab)を挙げることができる。

本実施形態では、上記の二重特異性抗体の由来は特に限定されず、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ウマ、ラクダなどのいずれの哺乳動物に由来する抗体であってもよいが、好ましくはヒト抗体である。なお、ヒト抗体を取得する方法自体は当該技術において公知であり、例えば、ヒト抗体遺伝子を有する非ヒトトランスジェニック動物を利用する方法などが知られている。本実施形態では、二重特異性抗体のフラグメント及びその誘導体を用いてもよく、例えば、Fabフラグメント、F(ab')2フラグメント、ダイアボディ、線状抗体、一本鎖抗体などが挙げられる。また、二重特異性抗体は、キメラ抗体やヒト化抗体などの遺伝子改変抗体であってもよい。

本実施形態では、凝固第XII因子(FXII)活性化剤は、FXIIを活性化して活性化第XII因子(FXIIa)の生成を促進して、インビトロでの血液凝固を促進することが知られている公知の物質であれば、特に限定されない。そのような活性化剤として、陰性荷電を有する物質が挙げられる。そのような物質としては、例えば、エラグ酸、カオリン、セライト及びシリカなどが挙げられる。これらの中でも、エラグ酸が好ましい。なお、エラグ酸として、金属イオンとキレートを形成した状態のエラグ酸を添加してもよい。本実施形態では、FXII活性化剤は、適切な溶媒に溶解された液体の形態にあることが好ましい。

第１の態様に係る方法では、FVIII代替活性を有する物質を含む血液検体の凝固能を適切な感度で評価するために、測定試料におけるFXII活性化剤の終濃度を、通常１μM以上22μM以下、好ましくは2.9μM以上14μM以下とする。

本実施形態では、リン脂質としては、ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥ)、ホスファチジルコリン(ＰＣ)及びホスファチジルセリン(ＰＳ)が挙げられる。本実施形態では、ＰＥ、ＰＣ及びＰＳから選択される１種、好ましくは２種、より好ましくは全種のリン脂質を添加できる。リン脂質は、天然由来リン脂質であってもよいし、合成リン脂質であってもよい。それらの中でも、合成リン脂質又は純度99％以上に精製された天然由来リン脂質が好ましい。なお、ＰＥ、ＰＣ及びＰＳの脂肪酸側鎖は特に限定されないが、例えば、パルミチン酸、オレイン酸、ステアリン酸などが挙げられる。それらの中でもオレイン酸が好ましい。本実施形態では、リン脂質は、適切な溶媒に溶解された液体の形態にあることが好ましい。

第１の態様に係る方法では、FVIII代替活性を有する物質を含む血液検体の凝固能を適切な感度で評価するために、測定試料におけるリン脂質の終濃度を、通常1.4μM以上33μM以下、好ましくは4.3μM以上22μM以下とする。リン脂質としてＰＥ、ＰＣ及びＰＳを含むとき、測定試料におけるＰＥ、ＰＣ及びＰＳの各濃度の合計が、上記の範囲内であればよい。

第１の態様に係る方法では、測定試料におけるFXII活性化剤の終濃度を１μM以上2.9μM以下とする場合、測定試料におけるリン脂質の終濃度の上限を33μMより高く43μM以下の範囲内に設定できる。よって、本実施形態では、FVIII代替活性を有する物質を含む血液検体の凝固能を適切な感度で評価するために、測定試料におけるFXII活性化剤の終濃度を１μM以上2.9μM以下とする場合、測定試料におけるリン脂質の終濃度を、通常1.4μM以上43μM以下としてもよい。

測定試料の調製において、血液検体と、FXII活性化剤と、リン脂質とを混合する順序は特に限定されない。例えば、血液検体とFXII活性化剤とを混合してから、リン脂質を混合してもよい。また、血液検体とリン脂質とを混合してから、FXII活性化剤を混合してもよい。また、FXII活性化剤とリン脂質とを混合してから、血液検体を混合してもよい。あるいは、血液検体と、FXII活性化剤と、リン脂質とを実質的に同時に混合してもよい。

第１の態様に係る方法はAPTT測定の原理に基づいているので、本実施形態では、FXII活性化剤及びリン脂質を含む市販のAPTT測定用試薬を用いてもよい。この場合、測定試料におけるFXII活性化剤及びリン脂質のそれぞれの終濃度が上記の範囲内となるように、APTT測定用試薬を用いればよい。しかし、一般的な市販のAPTT測定用試薬は、測定試料におけるFXII活性化剤及びリン脂質のそれぞれの終濃度を上記の範囲内にして使用することを意図していない。そこで、本実施形態では、必要に応じて、市販のAPTT測定用試薬を希釈して用いてもよい。希釈液としては、例えば、生理食塩水、pH６〜８の緩衝液、水などが挙げられる。また、市販の緩衝液を用いてもよく、例えば、オーレンベロナール緩衝液(シスメックス株式会社)、ＴＣ緩衝液(シスメックス株式会社)、イミダゾール緩衝液(HYPHENBioMed社)などが挙げられる。

本実施形態では、血液検体とFXII活性化剤とリン脂質とを混合し、所定の条件下でインキュベートしてから、後述のカルシウム含有水溶液を添加することが好ましい。そのような所定の条件は、血液検体中の凝固因子及びFVIII代替活性を有する物質と、FXII活性化剤及びリン脂質との反応を促進させる公知の条件であればよく、例えば35℃以上40℃以下の温度にて、２分以上５分以下の時間でインキュベートする条件が挙げられる。

本実施形態では、血液凝固を開始させる試薬として、カルシウムイオン含有水溶液が用いられる。カルシウムイオン含有水溶液は、測定試料中で血液凝固に必要なカルシウムイオンを提供できるかぎり、特に限定されない。カルシウムイオン含有水溶液としては、カルシウム塩の水溶液が好ましく、例えば、塩化カルシウム水溶液などが挙げられる。測定試料におけるカルシウムイオン含有量としては、凝固を生じさせるのに十分な量であればよく、例えば、塩化カルシウムの濃度で表して、通常２mM以上20 mM以下、好ましくは４mM以上10 mM以下である。なお、カルシウムイオン含有水溶液を、以下では「カルシウム溶液」とも呼ぶ。

本実施形態では、血液検体とFXII活性化剤とリン脂質とを混合した後に、カルシウム溶液を添加して測定試料を得る。そして、カルシウム溶液を添加した時を測定開始点として、測定試料から後述の光量に関する光学的情報を取得する。

本実施形態では、測定試料の調製は、用手法で行ってもよいし、全自動測定装置で行ってもよい。そのような装置としては、例えば、CS-5100(シスメックス株式会社)、CS-2400(シスメックス株式会社)、CS-2000i(シスメックス株式会社)などが挙げられる。

第１の態様に係る方法では、上記のようにして得られた測定試料に光を照射して、この測定試料から光量に関する光学的情報を取得する。本実施形態において、測定試料に照射する光は、凝固時間の測定に通常用いられる光であればよく、例えば、波長が660 nm近傍、好ましくは660 nmの光が挙げられる。光源は特に限定されないが、例えば、発光ダイオード、ハロゲンランプなどが挙げられる。

上記の光源から測定試料に光を照射することにより、該測定試料から散乱光及び透過光が生じる。本実施形態では、光量に関する光学的情報として、例えば、散乱光量又は透過光量に関する情報が挙げられ、散乱光強度、透過度、吸光度などが好ましい。

本実施形態では、測定条件は特に限定されないが、光の照射と、光量に関する光学的情報の取得は、測定の開始(カルシウム溶液の添加時)から凝固反応の終了(フィブリン塊の形成)まで連続的又は断続的に行うことが好ましい。このように、凝固の全過程にわたって連続的又は断続的に測定された光量に関する光学的情報(例えば、散乱光強度、透過度又は吸光度)に基づけば、凝固過程の任意の時点又は時間において、後述の凝固波形の微分に関するパラメータを取得することが可能となる。なお、光の照射と、光量に関する光学的情報の取得は、全自動測定装置により行ってもよい。そのような装置としては、例えば、全自動血液凝固測定装置のCS-5100(シスメックス株式会社)、CS-2400(シスメックス株式会社)、CS-2000i(シスメックス株式会社)などが挙げられる。

本実施形態において、凝固波形は、光量に関する光学的情報(例えば、散乱光量、透過度又は吸光度)の経時的変化を表す波形である。図１を参照して、凝固波形及びその波形解析について説明する。図１の凝固波形(上段のグラフ)において、a点は測定開始点であり、b点はフィブリン析出(凝固の開始)点であり、a-bは凝固時間を表す。c点は凝固の中点であり、d点は凝固の終点であり、e点は測定の終点である。凝固波形を微分(１次微分)すると、凝固速度が算出される(図１の中段のグラフ参照)。なお、凝固波形のc点は１次微分の最大値に当たる。凝固速度を微分(２次微分)すると、凝固加速度が算出される(図１の下段のグラフ参照)。なお、本実施形態に係る方法では、凝固時間及び凝固波形の取得は任意である。

第１の態様に係る方法では、取得した光学的情報に基づいて、凝固波形の微分に関するパラメータを少なくとも１つ取得する。凝固波形の微分に関するパラメータは、取得した光学的情報に基づいて得られる、凝固速度、凝固加速度及び凝固減速度の少なくとも１つを示す値であれば、特に限定されない。凝固速度を示す値は、凝固波形の一次微分から得ることができる値に相当し、凝固加速度を示す値及び凝固減速度を示す値は、凝固波形の二次微分から得ることができる値に相当する。

凝固波形の微分に関するパラメータとしては、例えば、|Min 1|、|Min 2|、Max 2、AUC及びSlopeが挙げられる。|Min 1|とは、凝固波形の一次微分の最小値の絶対値であり、最大凝固速度を表す。|Min 2|とは、凝固波形の二次微分の最小値の絶対値であり、最大凝固加速度を表す。Max 2とは、凝固波形の二次微分の最大値であり、最大凝固減速度を表す。AUCとは、凝固波形又は凝固波形を一次微分若しくは二次微分した波形で囲まれた領域の面積である。傾き(Slope)とは、凝固波形又は凝固波形を一次微分若しくは二次微分した波形の任意の点における接線の傾きの大きさである。これらの中でも、|Min 1|、|Min 2|及びMax 2が好ましい。なお、|Min 1|、|Min 2|及びMax 2は、それぞれ|min 1|、|min 2|及びmax 2とも表記される。凝固波形の微分に関するパラメータは、これらの値を２つ以上組み合わせて得られる値であってもよい。例えば、|Min 1|、|Min 2|、Max 2、AUC及びSlopeから選択される少なくとも２つの値の和、差、積、比などが挙げられる。

凝固時間も取得している場合は、凝固波形の微分に関するパラメータは、凝固波形の一次微分又は二次微分から取得される値と、凝固時間とを組み合わせて得られる値でもよい。そのような値としては、例えば、|Min 1|、|Min 2|及びMax 2、AUC及びSlopeから選択される少なくとも１つの値と凝固時間の値の和、差、積、比などが挙げられる。

第１の態様に係る方法では、取得したパラメータの値に基づいて、上記のFVIII代替活性を有する物質を含む血液検体の凝固能を評価する。本実施形態では、FVIII代替活性を有する物質による血液凝固反応の促進の程度を、パラメータに基づいて定量的に評価することができる。よって、当該物質が有する補因子としての活性、すなわち当該物質の薬効を評価することができる。

本実施形態においては、取得したパラメータの値から、上記の血液検体の凝固能を示す値を取得することが好ましい。そのような凝固能を示す値としては、血液凝固の活性を反映する指標が好ましく、特にFVIII活性値が好ましい。なお、FVIII活性値は、健常者の活性値を100％としたときのパーセンテージで表してもよいし、所定量の血漿における国際単位(IU/dL又はU/dL)で表してもよい。

例えば、取得したパラメータの値からのFVIII活性値の取得は、次のようにして行うことができる。まず、市販のFVIII欠乏血漿にFVIII製剤を種々の濃度で添加して、FVIII活性値が既知の検体を調製する。なお、これらの検体のFVIII活性値は、合成基質法などの公知の方法によって決定してもよいし、製剤の添加量から決定してもよい。そして、これらの検体について、上記のFXII活性化剤、リン脂質及びカルシウム溶液を用いて、上記のようにして凝固波形の微分に関するパラメータを取得する。各検体について、FVIII活性値に対するパラメータの値をプロットして検量線を作成する。得られた検量線に基づいて、FVIII代替活性を有する物質を含む血液検体についてのパラメータの値を、FVIII活性値に変換する。なお、このような検量線は、血液検体の測定のたびに作成してもよいし、所定の検量線を用いてもよい。あるいは、データの蓄積により、パラメータの値から、血液検体の凝固能を示す値に直接換算するための式を導出してもよい。

本実施形態においては、取得した凝固能を示す値に基づいて、FVIII代替活性を有する物質を含む血液検体の凝固能を評価できる。例えば、取得したパラメータの値からFVIII活性値を取得している場合、FVIII代替活性を有する物質の効力を、FVIII製剤の効力と同様に評価することができる。FVIII代替活性を有する物質の効力をFVIII活性値に換算した際の適正な範囲は、ACE910 １μg/mL当たりFVIII 0.2 U/dL以上0.4 U/dL以下と定義してもよい。本範囲は、カニクイザル血友病モデルにおけるブタFVIII及びACE910の止血効果や薬物動態の効果に基づき算出した(非特許文献２参照)。同等の止血活性を示した際のそれぞれの投与量における最大血中濃度で比較し、ACE910は61μg/mL、ブタFVIIIは25 U/dLであり、１μg/mLのACE910で期待される止血効果はFVIII製剤の0.4 U/dL相当であった。一方、同等の止血活性を示した際のそれぞれの投与量における最少血中濃度で比較すると、ACE910は36μg/mL、ブタFVIIIは7.4 U/dLであり、１μg/mLのACE910で期待される止血効果はFVIII製剤の0.2 U/dL相当であった。なお、この換算値の範囲が、血友病Ａ患者におけるACE910の臨床試験での出血回数の結果とも乖離していないことを確認している。

本発明者らは、内因系凝固経路に関与するFXII活性化剤及びリン脂質に加えて、外因系凝固経路に関与する組織因子をさらに添加することにより、FVIII代替活性を有する物質を含む血液検体の凝固能を評価できることを新たに見出した。以下、組織因子をさらに用いる第２の態様に係る血液検体の凝固能の評価方法について説明する(以下、「第２の態様に係る方法」ともいう)。

第２の態様に係る方法では、FVIII代替活性を有する物質を含む血液検体(好ましくは、FVIII代替活性を有する物質を投与された被検者から得た血液検体)と、FXII活性化剤と、リン脂質と、組織因子と、カルシウムイオン含有水溶液とから、測定試料を調製する。本実施形態において、血液検体、FVIII代替活性を有する物質、FXII活性化剤、リン脂質、及びカルシウムイオン含有水溶液については、第１の態様に係る方法で述べたことと同様である。

第２の態様に係る方法では、組織因子をさらに用いることにより、血液検体が、バイパス製剤と、FVIII代替活性を有する物質とを併用している被検者から得た検体であっても、凝固能のモニタリングが可能となる。なお、バイパス製剤とは、血液中にFVIII及び／又はFIXが十分な量で存在していなくても、血液凝固を促進させることができる(すなわち、FVIII及び／又はFIXが関与する凝固経路を迂回できる)製剤の総称である。バイパス製剤としては、例えば、活性化凝固第VII因子(FVIIa)製剤、活性型プロトロンビン複合体製剤(activated prothombin complex concentrate：APCC)などが知られている。

組織因子は、ウサギ脳、ヒト胎盤などに由来する天然の組織因子であってもよいし、遺伝子組換え技術により作製した組織因子であってもよい。本実施形態において、測定試料における組織因子の終濃度は特に限定されないが、例えば0.002 ng/mL以上7.3 ng/mL以下であり、好ましくは0.002 ng/mL以上0.49 ng/mL以下である。本実施形態では、血液検体と、FXII活性化剤と、リン脂質と、組織因子とを混合する順序は特に限定されない。例えば、FXII活性化剤、リン脂質及び組織因子のいずれか１つと、血液検体とを混合してから、残りの２つを同時又は逐次混合してもよい。また、FXII活性化剤、リン脂質及び組織因子から選択される２つと、血液検体とを混合してから、残りの１つを混合してもよい。また、FXII活性化剤、リン脂質及び組織因子を混合してから、血液検体を混合してもよい。

第２の態様に係る方法では、測定試料におけるFXII活性化剤の終濃度は特に限定されないが、例えば0.1μM以上26μM以下であり、好ましくは0.1μM以上9.6μM以下である。また、測定試料におけるリン脂質の終濃度も特に限定されないが、例えば0.39μM以上43μM以下であり、好ましくは0.39μM以上13μM以下である。

第２の態様に係る方法では、上記のようにして得た測定試料に光を照射して、この測定試料から光量に関する光学的情報を取得する。そして、第２の態様に係る方法では、取得した光学的情報に基づいて、FVIII代替活性を有する物質を含む血液検体の凝固能を評価する。本実施形態においては、取得した光学的情報から、凝固時間、及び、凝固波形の微分に関するパラメータから選択される少なくとも１つ取得し、取得した値に基づいて、血液検体の凝固能を評価することが好ましい。ここで、光学的情報及び凝固波形の微分に関するパラメータの種類及び取得の手順については、第１の態様に係る方法で述べたことと同様である。また、血液検体の凝固能の評価の手順についても、第１の態様に係る方法で述べたことと同様である。

[２．血液検体の凝固能を評価するための試薬及び試薬キット]
本発明の範囲には、FVIII代替活性を有する物質を含む血液検体の凝固能を評価するための試薬も含まれる(以下、単に「試薬」ともいう)。第３の態様に係る試薬は、上記の第１の態様に係る方法での使用に適しており、FXII活性化剤及びリン脂質をそれぞれ所定の濃度で含む。図２に、本実施形態の試薬の外観の一例として、第１容器１１１に収容された試薬を示した。なお、FXII活性化剤及びリン脂質の種類については、上記の本実施形態の方法について述べたことと同じである。

第３の態様に係る試薬において、試薬中のFXII活性化剤の濃度は、測定試料における終濃度を上記の第１の態様に係る方法で述べた範囲に調整可能であるかぎり、特に限定されない。全自動凝固時間測定装置により測定試料を調製する場合、該装置が吸引可能な試薬量を考慮して、例えば３μM以上66μM以下である。

本実施形態において、試薬中のリン脂質の濃度は、測定試料における終濃度を上記の第１の態様に係る方法で述べた範囲に調整可能であるかぎり、特に限定されない。全自動凝固時間測定装置により測定試料を調製する場合、該装置が吸引可能な試薬量を考慮して、例えば4.2μM以上99μM以下である。リン脂質としてＰＥ、ＰＣ及びＰＳを含むとき、試薬におけるＰＥ、ＰＣ及びＰＳの各濃度の合計が、上記の範囲内であればよい。

本実施形態において、試薬中のFXII活性化剤の濃度を３μM以上8.7μM以下とする場合、試薬中のリン脂質の濃度を、例えば4.2μM以上129μM以下としてもよい。

また、本発明の範囲には、FVIII代替活性を有する物質を含む血液検体の凝固能を評価するための試薬キットも含まれる(以下、単に「試薬キット」ともいう)。第４の態様に係る試薬キットは、上記の第１の態様に係る方法での使用に適しており、FXII活性化剤及びリン脂質をそれぞれ所定の濃度で含む第１試薬と、カルシウムイオン含有水溶液からなる凝固開始試薬とを備える。図３Ａに、第４の態様に係る試薬キットの外観の一例として、第１容器１１１に収容された第１試薬と、第２容器１１２に収容された凝固開始試薬とを含む試薬キットを示した。なお、FXII活性化剤及びリン脂質の種類については、上記の本実施形態の方法について述べたことと同じである。また、試薬中のFXII活性化剤及びリン脂質の各濃度は上記のとおりである。

本実施形態において、凝固開始試薬は、上記の第１の態様に係る方法に用いられるカルシウムイオン含有水溶液と同じである。凝固開始試薬におけるカルシウムイオン含有量としては、凝固を生じさせることが可能な終濃度に調整可能であればよく、例えば、塩化カルシウムの濃度で表して、通常2.5 mM以上40 mM以下、好ましくは10 mM以上30 mM以下である。

さらなる実施形態においては、FVIII代替活性を有する物質を含む血液検体の凝固能を評価するための試薬は、FXII活性化剤及びリン脂質に加えて、組織因子をさらに含んでいてもよい。以下、組織因子をさらに用いる第５の態様に係る試薬について説明する。

第５の態様に係る試薬は、上記の第２の態様に係る方法での使用に適しており、FXII活性化剤、リン脂質、及び組織因子を含む。本実施形態の試薬の外観は、第３の態様に係る試薬と同様であり、例えば図２に示される。具体的には、FXII活性化剤、リン脂質、及び組織因子を含む試薬が第１容器１１１に収容されている。なお、FXII活性化剤、リン脂質及び組織因子の種類については、上記の第１及び第２の態様に係る方法について述べたことと同じである。また、第５の態様に係る試薬中のFXII活性化剤及びリン脂質のそれぞれの濃度は特に限定されないが、例えば、第３の態様に係る試薬について述べたことと同じであってもよい。第５の態様に係る試薬において、試薬中の組織因子の濃度は特に限定されないが、例えば0.006 ng/mL以上21.9 ng/mL以下である。

さらなる実施形態においては、FVIII代替活性を有する物質を含む血液検体の凝固能を評価するための試薬キットは、FXII活性化剤及びリン脂質に加えて、組織因子をさらに含んでいてもよい。以下、組織因子をさらに用いる第６及び第７の態様に係る試薬キットについて説明する。

第６及び第７の態様に係る試薬キットは、上記の第２の態様に係る方法での使用に適している。第６の態様に係る試薬キットは、FXII活性化剤、リン脂質、及び組織因子を含む第１試薬と、カルシウムイオン含有水溶液からなる凝固開始試薬とを備える。第６の態様に係る試薬キットの外観は、第４の態様に係る試薬キットと同様であり、例えば図３Ａに示される。具体的には、FXII活性化剤、リン脂質、及び組織因子を含む第１試薬が第１容器１１１に収容され、カルシウムイオン含有水溶液からなる凝固開始試薬が第２容器１１２に収容されている。

第７の態様に係る試薬キットは、第１試薬と、第２試薬と、カルシウムイオン含有水溶液からなる凝固開始試薬とを備える。図３Ｂに、第７の態様に係る試薬キットの外観の一例として、第１容器１１１に収容された第１試薬と、第２容器１１２に収容された第２試薬と、第３容器１１３に収容された凝固開始試薬とを含む試薬キットを示した。本実施形態では、FXII活性化剤、リン脂質、及び組織因子のそれぞれは、第１試薬及び第２試薬のいずれかに含まれていればよい。例えば、第１試薬がFXII活性化剤及びリン脂質を含み、且つ第２試薬が組織因子を含むか、第１試薬がFXII活性化剤及びリン脂質を含み、且つ第２試薬が組織因子及びリン脂質を含むか、又は、第１試薬がFXII活性化剤及び組織因子を含み、且つ第２試薬がリン脂質を含むことができる。

第６及び第７の態様に係る試薬キットにおいて、FXII活性化剤、リン脂質及び組織因子の種類及び試薬中の濃度は特に限定されないが、例えば、上記の第３及び第５の態様に係る試薬について述べた濃度と同じであってもよい。なお、第７の態様に係る試薬キットにおいて、第１試薬及び第２試薬の両方にリン脂質を含む場合は、各試薬におけるリン脂質の濃度は、第３の態様に係る試薬について述べた濃度の半分であってもよい。また、カルシウムイオン含有水溶液からなる凝固開始試薬は、上記の第４の態様に係る試薬キットについて述べたことと同じである。

第１２の態様に係る試薬キットは、上記の第２の態様に係る方法での使用に適している。第１２の態様に係る試薬キットは、第１試薬と、第２試薬とを備える。本実施形態では、第１試薬は、FXII活性化剤及びリン脂質を含み、第２試薬は、組織因子及びカルシウムイオンを含む。第２試薬は、リン脂質をさらに含んでいてもよい。第１２の態様に係る試薬キットの外観は、第４の態様に係る試薬キットと同様であり、例えば図３Ａに示される。具体的には、FXII活性化剤及びリン脂質を含む第１試薬が第１容器１１１に収容され、組織因子及びカルシウムイオンを含む第２試薬が第２容器１１２に収容されている。

第１２の態様に係る試薬キットにおいて、各試薬におけるFXII活性化剤、リン脂質及び組織因子の種類及び濃度は特に限定されないが、例えば、上記の第３及び第５の態様に係る試薬について述べた濃度と同じであってもよい。なお、第１２の態様に係る試薬キットにおいて、第１試薬及び第２試薬の両方にリン脂質を含む場合は、各試薬におけるリン脂質の濃度は、第３の態様に係る試薬について述べた濃度の半分であってもよい。また、第２試薬におけるカルシウムイオンの含有量は、上記の第４の態様に係る試薬キットの凝固開始試薬について述べたことと同じである。本実施形態では、第２試薬に凝固開始試薬であるカルシウムイオンが含まれている。したがって、まず、第１試薬と、凝固第VIII因子代替活性を有する物質を含む血液検体とを混合し、次に、得られた混合物に第２試薬を添加する。

[３．血液検体分析装置、血液検体の凝固能の評価のための装置及びコンピュータプログラム]
以下に、本実施形態に係る血液検体分析装置の一例を、図面を参照して説明する。しかし、本実施形態はこの例のみに限定されない。図４に示されるように、血液検体分析装置１０は、測定試料の調製及び光学的測定を行う測定装置５０と、測定装置５０により取得された測定データを分析すると共に測定装置５０に指示を与える制御装置４０とを備える。測定装置５０は、測定試料からの光量に関する光学的情報を取得する測定部２０と、測定部２０の前方に配置された検体搬送部３０とを備える。

測定部２０には、蓋２０ａ及び２０ｂと、カバー２０ｃと、電源ボタン２０ｄが設けられている。ユーザは、蓋２０ａを開けて、試薬テーブル１１及び１２(図５参照)に設置されている試薬容器１０３を新たな試薬容器１０３と交換したり、また、別の試薬容器１０３を新たに追加したりすることができる。試薬容器１０３には、収容する試薬の種類と、試薬に付与されたシリアルナンバーからなる試薬ＩＤとを含むバーコードが印刷されたバーコードラベル１０３ａが貼付されている。

ユーザは、蓋２０ｂを開けて、ランプユニット２７(図５参照)を交換できる。また、ユーザは、カバー２０ｃを開けて、ピアサ１７ａ(図５参照)を交換できる。検体搬送部３０は、検体ラック１０２に支持された検体容器１０１を、ピアサ１７ａによる吸引位置まで搬送する。検体容器１０１は、ゴム製の蓋１０１ａにより密封されている。

血液検体分析装置１０を使用する場合、ユーザは、まず、測定部２０の電源ボタン２０ｄを押して測定部２０を起動させ、制御装置４０の電源ボタン４３９を押して制御装置４０を起動させる。制御装置４０が起動すると、表示部４１にログオン画面が表示される。ユーザは、ログオン画面にユーザ名及びパスワードを入力して制御装置４０にログオンし、血液検体分析装置１０の使用を開始する。

測定装置の構成について、以下に説明する。図５に示されるように、測定部２０は、試薬テーブル１１及び１２と、キュベットテーブル１３と、バーコードリーダ１４と、キュベット供給部１５と、キャッチャ１６と、検体分注アーム１７と、試薬分注アーム１８と、緊急検体セット部１９と、光ファイバ２１と、検出部２２と、キュベット移送部２３と、加温部２４と、廃棄口２５と、流体部２６と、ランプユニット２７とを備えている。

(測定試料調製部)
試薬テーブル１１及び１２とキュベットテーブル１３は、それぞれ、円環形状を有し、回転可能に構成されている。試薬テーブル１１及び１２は試薬収納部に相当し、ここには試薬容器１０３が載せ置かれる。試薬テーブル１１及び１２に載せ置かれた試薬容器１０３のバーコードは、バーコードリーダ１４により読み取られる。バーコードから読み取られた情報(試薬の種類、試薬ＩＤ)は、制御装置４０に入力され、ハードディスク４３４(図１０参照)に格納される。

第８の態様に係る装置では、試薬テーブル１１及び／又は１２には、FXII活性化剤及びリン脂質を含むAPTT測定用試薬、該試薬を希釈するための希釈液、カルシウム溶液などがそれぞれ収容された試薬容器１０３が載せ置かれる。第９の態様に係る装置では、試薬テーブル１１及び／又は１２には、FXII活性化剤、リン脂質、組織因子、カルシウム溶液などがそれぞれ収容された試薬容器１０３が載せ置かれる。あるいは、第５の態様に係る試薬、又は第６若しくは第７の態様に係るキットの各試薬がそれぞれ収容された試薬容器１０３が載せ置かれてもよい。また、いずれの装置においても、試薬テーブル１１及び／又は１２に、FVIII製剤、及びFVIII欠損血漿のそれぞれが収容された試薬容器１０３が載せ置かれてもよい。

キュベットテーブル１３には、キュベット１０４を支持可能な複数の孔からなる支持部１３ａが形成されている。ユーザによってキュベット供給部１５に投入された新しいキュベット１０４は、キュベット供給部１５により順次移送され、キャッチャ１６によりキュベットテーブル１３の支持部１３ａに設置される。

検体分注アーム１７と試薬分注アーム１８には、それぞれ、上下移動及び回転移動できるようステッピングモータが接続されている。検体分注アーム１７の先端には、検体容器１０１の蓋１０１ａを穿刺できるよう先端が鋭利に形成されたピアサ１７ａが設置されている。試薬分注アーム１８の先端にはピペット１８ａが設置されている。ピペット１８ａの先端は、ピアサ１７ａと異なり平坦に形成されている。また、ピペット１８ａには、静電容量式の液面検知センサ２１３(図６参照)が接続されている。

検体搬送部３０(図４参照)によって検体容器１０１が所定位置に搬送されると、ピアサ１７ａが、検体分注アーム１７の回転移動により検体容器１０１の真上に位置付けられる。そして、検体分注アーム１７が下方向に移動され、ピアサ１７ａが検体容器１０１の蓋１０１ａを貫通し、検体容器１０１に収容されている血液検体が、ピアサ１７ａにより吸引される。緊急を要する血液検体が緊急検体セット部１９にセットされている場合、ピアサ１７ａは、検体搬送部３から供給される検体に割り込んで、緊急を要する血液検体を吸引する。ピアサ１７ａにより吸引された血液検体は、キュベットテーブル１３上の空のキュベット１０４に吐出される。

血液検体が吐出されたキュベット１０４は、キュベット移送部２３のキャッチャ２３ａにより、キュベットテーブル１３の支持部１３ａから、加温部２４の支持部２４ａに移送される。加温部２４は、支持部２４ａに設置されたキュベット１０４に収容されている血液検体を、所定の温度(例えば37℃)で一定時間加温する。加温部２４による血液検体の加温が終了すると、このキュベット１０４は、キャッチャ２３ａによって再び把持される。そして、このキュベット１０４は、キャッチャ２３ａにより把持されたまま所定位置に位置付けられ、この状態で、ピペット１８ａにより吸引された試薬がキュベット１０４内に吐出される。

ピペット１８ａによる試薬の分注では、まず、試薬テーブル１１及び１２が回転され、測定項目に対応する試薬を収容する試薬容器１０３が、ピペット１８ａによる吸引位置に搬送される。そして、原点位置を検知するためのセンサに基づいて、ピペット１８ａの上下方向の位置が原点位置に位置付けられた後、液面検知センサ２１３によりピペット１８ａの下端が試薬の液面に接触するまで、ピペット１８ａが下降される。ピペット１８ａの下端が試薬の液面に接触すると、必要な量の試薬を吸引できる程度に、さらにピペット１８ａが下降される。そして、ピペット１８ａの下降が停止され、ピペット１８ａにより試薬が吸引される。ピペット１８ａにより吸引された試薬は、キャッチャ２３ａによって把持されたキュベット１０４に吐出される。そして、キャッチャ２３ａの振動機能により、キュベット１０４内の血液検体と試薬が攪拌される。これにより、測定試料の調製が行われる。その後、測定試料を収容するキュベット１０４は、キャッチャ２３ａにより、検出部２２の支持部２２ａに移送される。

(光学的情報取得部)
ランプユニット２７は、検出部２２による光学的信号の検出に用いられる複数種類の波長の光を供給する。図７を参照して、ランプユニット２７の構成の一例を説明する。ランプユニット２７は光源に相当し、ハロゲンランプ２７ａと、ランプケース２７ｂと、集光レンズ２７ｃ〜２７ｅと、円盤形状のフィルター部２７ｆと、モータ２７ｇと、光透過型のセンサ２７ｈと、光ファイバカプラ２７ｉとを備える。

図５を参照して、ランプユニット２７からの光は、光ファイバ２１を介して、検出部２２に供給される。検出部２２には、穴状の支持部２２ａが複数設けられており、各支持部２２ａには、キュベット１０４が挿入可能となっている。各支持部２２ａには、それぞれ、光ファイバ２１の端部が装着され、支持部２２ａに支持されたキュベット１０４に光ファイバ２１からの光が照射可能となっている。検出部２２は、光ファイバ２１を介して、ランプユニット２７から供給される光をキュベット１０４に照射し、キュベット１０４を透過する光(又はキュベット１０４からの散乱光)の光量を検出する。

図８Ａ〜Ｄを参照して、検出部２２に配された複数の支持部２２ａのうちの一つの構成の例を示すが、他の支持部２２ａも同様の構成を有する。図８Ａを参照して、検出部２２には、光ファイバ２１の先端が挿入される円形の穴２２ｂが形成される。さらに、検出部２２には、穴２２ｂを支持部２２ａに連通させる円形の連通孔２２ｃが形成されている。穴２２ｂの径は、連通孔２２ｃの径よりも大きい。穴２２ｂの端部には、光ファイバ２１からの光を集光するレンズ２２ｄが配置されている。さらに、支持部２２ａ内壁面には、連通孔２２ｃに対向する位置に孔２２ｆが形成される。この孔２２ｆの奥に、光検出器２２ｇが配置されている。光検出器２２ｇは受光部に相当し、受光光量に応じた電気信号を出力する。レンズ２２ｄを透過した光は、連通孔２２ｃ、支持部２２ａ及び孔２２ｆを介して、光検出器２２ｇの受光面に集光される。光ファイバ２１は、端部が穴２２ｂに挿入された状態で、板ばね２２ｅによって抜け止めされる。

図８Ｂを参照して、支持部２２ａにキュベット１０４が支持されると、レンズ２２ｄによって集光された光は、キュベット１０４およびキュベット１０４に収容された試料を透過して、光検出器２２ｇに入射する。試料において血液凝固反応が進むと、試料の濁度が上昇する。これに伴い、試料を透過する光の光量(透過光量)が減少し、光検出器２２ｇの検出信号のレベルが低下する。

図８Ｃを参照して、散乱光を用いる場合の検出部２２の構成を説明する。支持部２２ａの内側面において、連通孔２２ｃと同じ高さの位置に、孔２２ｈが設けられる。この孔２２ｈの奥に、光検出器２２ｉが配置される。支持部２２ａにキュベット１０４が挿入され、光ファイバ２１から光が出射されると、キュベット１０４内の測定試料によって散乱された光が、孔２２ｈを介して光検出器２２ｉに照射される。この例では、光検出器２２ｉからの検出信号は、測定試料による散乱光の強度を示す。また、図８Ｄに示されるように、測定試料を透過する透過光と、測定試料により散乱される散乱光との両方を検出できるようにしてもよい。

上記のように、検出部２２は、ランプユニット２７から供給される光をキュベット１０４に照射し、測定試料からの光学的情報を取得する。取得された光学的情報は、制御装置４０に送信される。制御装置４０は、光学的情報に基づいて分析を行い、分析結果を表示部４１に表示する。

測定終了後、不要となったキュベット１０４は、キュベットテーブル１３により搬送され、キャッチャ１６により廃棄口２５に廃棄される。なお、測定動作の際に、ピアサ１７ａとピペット１８ａは、流体部２６から供給される洗浄液などの液体により、適宜洗浄される。

測定装置のハードウェア構成について、以下に説明する。図６に示されるように、測定部２０は、制御部２００と、ステッピングモータ部２１１と、ロータリーエンコーダ部２１２と、液面検知センサ２１３と、センサ部２１４と、機構部２１５と、光学的情報取得部２１６と、バーコードリーダ１４とを含む。

図６を参照して、制御部２００は、ＣＰＵ２０１と、メモリ２０２と、通信インターフェース２０３と、Ｉ／Ｏインターフェース２０４を含んでいる。ＣＰＵ２０１は、メモリ２０２に記憶されているコンピュータプログラムを実行する。メモリ２０２は、ＲＯＭ、ＲＡＭ、ハードディスクなどからなる。また、ＣＰＵ２０１は、通信インターフェース２０３を介して、検体搬送部３０を駆動させると共に、制御装置４０との間で指示信号及びデータの送受信を行う。また、ＣＰＵ２０１は、Ｉ／Ｏインターフェース２０４を介して、測定部２０内の各部を制御すると共に、各部から出力された信号を受信する。

ステッピングモータ部２１１は、試薬テーブル１１及び１２と、キュベットテーブル１３と、キャッチャ１６と、検体分注アーム１７と、試薬分注アーム１８と、キュベット移送部２３を、それぞれ駆動するためのステッピングモータを含んでいる。ロータリーエンコーダ部２１２は、ステッピングモータ部２１１に含まれる各ステッピングモータの回転変位量に応じたパルス信号を出力するロータリーエンコーダを含んでいる。

液面検知センサ２１３は、試薬分注アーム１８の先端に設置されたピペット１８ａに接続されており、ピペット１８ａの下端が試薬の液面に接触したことを検知する。センサ部２１４は、ピペット１８ａの上下方向の位置が原点位置に位置付けられたことを検知するセンサと、電源ボタン２０ｄが押されたことを検知するセンサを含んでいる。機構部２１５は、キュベット供給部１５と、緊急検体セット部１９と、加温部２４と、流体部２６を駆動するための機構と、ピアサ１７ａとピペット１８ａによる分注動作が可能となるようピアサ１７ａとピペット１８ａに圧力を供給する空圧源を含んでいる。光学的情報取得部２１６は、図５を参照して、少なくとも、ランプユニット２７と、光ファイバ２１と、検出部２２とを含む。

制御装置４０の構成について、以下に説明する。図４に示されるように、制御装置４０は、表示部４１と、入力部４２と、コンピュータ本体４３とから構成されている。制御装置４０は、測定部２０から光学的情報を受信する。そして、制御装置４０のプロセッサは、光学的情報に基づいて、凝固波形の微分に関するパラメータを算出する。また、制御装置４０のプロセッサは、光学的情報に基づいて凝固時間を算出してもよい。そして、制御装置４０のプロセッサは、血液検体の凝固能の評価のためのコンピュータプログラムを実行する。よって、制御装置４０は、血液検体の凝固能の評価のための装置としても機能する。

制御装置４０の機能構成について、図９に示されるように、制御装置４０は、取得部４０１と、記憶部４０２と、算出部４０３と、出力部４０４とを備える。取得部４０１は、測定部２０と、ネットワークを介して通信可能に接続されている。出力部４０４は、表示部４１と通信可能に接続されている。

取得部４０１は、測定部２０から送信された光学的情報を取得する。記憶部４０２は、凝固波形の微分に関する各種パラメータの値を算出するための式などを記憶する。また、記憶部４０２は、凝固時間を算出するための式、及び凝固波形の微分に関するパラメータをFVIII活性値などに換算する式、該パラメータの値又はその換算値についての閾値を記憶していてもよい。算出部４０３は、取得部４０１で取得された情報を用い、記憶部４０２に記憶された式にしたがって、各種パラメータの値を算出する。また、算出部４０３は、算出されたパラメータの値をFVIII活性値に換算してもよい。出力部４０４は、算出部４０３によって算出されたパラメータの値又はその換算値を、血液検体についての参考情報として出力する。

図１０に示されるように、制御装置４０のコンピュータ本体４３は、ＣＰＵ４３１と、ＲＯＭ４３２と、ＲＡＭ４３３と、ハードディスク４３４と、読出装置４３５と、入出力インターフェース４３６と、通信インターフェース４３７と、画像出力インターフェース４３８と、電源ボタン４３９とを備える。ＣＰＵ４３１、ＲＯＭ４３２、ＲＡＭ４３３、ハードディスク４３４、読出装置４３５、入出力インターフェース４３６、通信インターフェース４３７、画像出力インターフェース４３８及び電源ボタン４３９は、バス４４０によって通信可能に接続されている。

ＣＰＵ４３１は、ＲＯＭ４３２に記憶されているコンピュータプログラム及びＲＡＭ４３３にロードされたコンピュータプログラムを実行する。ＣＰＵ４３１がアプリケーションプログラムを実行することにより、上述した各機能ブロックが実現される。これにより、コンピュータシステムが、血液検体の凝固能を評価するための判定装置としての端末として機能する。

ＲＯＭ４３２は、マスクＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭなどによって構成されている。ＲＯＭ４３２には、ＣＰＵ４３１によって実行されるコンピュータプログラム及びこれに用いるデータが記録されている。

ＲＡＭ４３３は、ＳＲＡＭ、ＤＲＡＭなどによって構成されている。ＲＡＭ４３３は、ＲＯＭ４３２及びハードディスク４３４に記録されているコンピュータプログラムの読み出しに用いられる。また、ＲＡＭ４３３は、これらのコンピュータプログラムを実行するときに、ＣＰＵ４３１の作業領域としても利用される。

ハードディスク４３４は、オペレーティングシステム、ＣＰＵ４３１に実行させるためのアプリケーションプログラム(血液検体の凝固能の評価のためのコンピュータプログラム)などのコンピュータプログラム、当該コンピュータプログラムの実行に用いるデータ、及び制御装置４０の設定内容がインストールされている。

読出装置４３５は、フレキシブルディスクドライブ、ＣＤ−ＲＯＭドライブ、ＤＶＤ−ＲＯＭドライブなどによって構成されている。読出装置４３５は、ＣＤ、ＤＶＤなどの可搬型記録媒体４４１に記録されたコンピュータプログラムまたはデータを読み出すことができる。

入出力インターフェース４３６は、例えば、ＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ−２３２Ｃなどのシリアルインターフェイスと、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４などのパラレルインターフェイスと、Ｄ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器などからなるアナログインターフェイスとから構成されている。入出力インターフェース４３６には、キーボード、マウスなどの入力部４２が接続されている。ユーザは入力部４２を介して指示を入力し、入出力インターフェース４３６は、入力部４２を介して入力された信号を受け付ける。

通信インターフェース４３７は、例えば、Ethernet(登録商標)インターフェースなどである。制御装置４０は、通信インターフェース４３７により、プリンタへの印刷データの送信が可能である。通信インターフェース４３７は測定部２０に接続されており、ＣＰＵ４３１は、通信インターフェース４３７を介して、測定部２０との間で指示信号及びデータの送受信を行う。

画像出力インターフェース４３８は、ＬＣＤ、ＣＲＴなどで構成される表示部４１に接続されている。画像出力インターフェース４３８は、画像データに応じた映像信号を表示部４１に出力し、表示部４１は、画像出力インターフェース４３８から出力された映像信号に基づいて画像を表示する。

図６を参照して、測定動作の際、測定部２０のＣＰＵ２０１は、検出部２２(図５参照)から出力された検出信号をデジタル化したデータ(光学的情報)を、メモリ２０２に一時格納する。メモリ２０２の記憶領域は、支持部２２ａ毎にエリア分割される。各エリアには、対応する支持部２２ａに支持されたキュベット１０４に対して所定波長の光を照射したときに取得されるデータ(光学的情報)が、順次格納される。こうして、所定の測定時間にわたって順次、データがメモリ２０２に格納される。測定時間が経過すると、ＣＰＵ２０１は、メモリ２０２に対するデータの格納を中止し、格納したデータを、通信インターフェース２０３を介して制御装置４０に送信する。制御装置４０は、受信したデータを処理して解析を行い、解析結果を表示部４１に表示する。

測定部２０における処理は、主として測定部２０のＣＰＵ２０１の制御の下で行われ、制御装置４０における処理は、主として制御装置４０のＣＰＵ４３１の制御の下で行われる。図１１を参照して、測定処理が開始されると、測定部２０は、検体搬送部により搬送された検体容器１０１から所定量の被検血漿を吸引し、これを、キュベットテーブル１３上の空のキュベット１０４に分注する。なお、対照としてFVIII欠損血漿も測定する場合、測定部２０は、試薬収容部に収容されたFVIII欠損血漿が入った試薬容器１０３から所定量のFVIII欠損血漿を吸引し、これを空のキュベット１０４に分注する。また、FVIII製剤を添加したFVIII欠損血漿も測定する場合、測定部２０は、FVIII欠損血漿が収容された試薬容器１０３から所定量のFVIII欠損血漿を吸引して、これを空のキュベット１０４に分注する。そして、測定部２０は、FVIII製剤が収容された試薬容器１０３から所定量のFVIII製剤を吸引し、これを、FVIII欠損血漿が入っているキュベット１０４に分注して攪拌する。

次いで、測定部２０は、血漿が分注されたキュベット１０４を加温部２４に移送して、キュベット１０４内の血漿を所定温度(例えば37℃)に加温する。その後、測定部２０は、キュベット１０４に試薬及びカルシウム溶液を添加して、測定試料を調製する(ステップＳ１１)。ここで、第８の態様に係る装置では、FXII活性化剤及びリン脂質を含む通常のAPTT測定用試薬を載せ置いている場合、測定部２０は、希釈液で該APTT測定用試薬を所定の倍率で希釈して、血液凝固分析用試薬を調製できる。具体的には、次のとおりである。測定部２０は、通常のAPTT測定用試薬が収容された試薬容器１０３から所定量の試薬を吸引して、これを空の試薬容器１０３に分注する。そして、測定部２０は、希釈液が収容された試薬容器１０３から所定量の希釈液を吸引し、これを、通常のAPTT測定用試薬を分注した試薬容器１０４に添加して攪拌する。希釈倍率は、用いるAPTT測定用試薬に応じて適宜決定できるが、一般的な市販のAPTT測定用試薬であれば、例えば1.3倍以上30倍以下であり、好ましくは２倍以上10倍以下である。第８の態様に係る装置では、一般的な市販のAPTT測定用試薬を希釈して得た試薬が、血液凝固分析用試薬として用いられる。

好ましい実施形態において、測定部２０は、上記の希釈したAPTT測定用試薬を用いて、測定試料におけるFXII活性化剤の終濃度が１μM以上22μM以下となり且つリン脂質の終濃度が1.4μM以上33μM以下となるか、又は、測定試料におけるFXII活性化剤の終濃度が１μM以上2.9μM以下となり且つリン脂質の終濃度が1.4μM以上43μM以下となるように、測定試料を調製する。

その後、測定部２０は、試薬が添加されたキュベット１０４を検出部２２に移送し、キュベット１０４に光を照射して測定試料を測定する(ステップＳ１２)。測定部２０は、キュベット１０４にカルシウム溶液を添加した時点から時間の計測を開始する。この測定では、波長660 nmの光に基づくデータ(散乱光量又は透過光量)が、測定時間の間、順次、メモリ２０２に格納される。このとき、データは、カルシウム溶液の添加時点からの経過時間に対応付けられた状態でメモリ２０２に格納される。そして、測定時間が経過すると、測定部２０は、測定を中止し、メモリ２０２に格納された測定結果(データ)を制御装置４０に送信する(ステップＳ１３)。これにより、制御装置４０が測定部２０から測定結果(データ)を受信すると(ステップＳ２１：ＹＥＳ）、制御装置４０は、受信した測定結果に対して分析処理を実行する(ステップＳ２２)。すなわち、制御装置４０は、測定試料について、凝固波形の微分に関するパラメータ(|Min 1|、|Min 2|、Max 2、AUC及びSlope)から、血液検体の凝固能を示す値(例えば、FVIII活性値)に換算する。なお、制御装置４０は、測定試料の凝固時間及び凝固波形も算出してもよい。分析処理を行った後、制御装置４０は、分析結果の表示処理を実行する(ステップＳ２３)。

図１２を参照して、凝固波形の微分に関するパラメータを一つ用いる場合の処理のフローを説明する。ここでは、測定試料からの光量に関する光学的情報から、凝固波形の微分に関するパラメータの値として|min 1|の値を取得し、取得した値を換算してFVIII値を取得し、このFVIII値を血液検体の凝固能に関する参考情報として出力する場合を例として説明する。しかし、本実施形態は、この例のみに限定されるものではない。この例においては、|min 1|に代えて、|min 2|、max 2、AUC又はSlopeの値を取得してもよい。あるいは、複数のパラメータを取得して、それぞれのパラメータの値からFVIII値を取得してもよい。この場合、参考情報として、複数のパラメータの値から換算されたFVIII値の平均値、最小値、最大値などを出力してもよい。

まず、ステップＳ１０１において、制御装置４０の取得部４０１は、測定部２０から受信したデータ(散乱光量又は透過光量)に基づいて、光学的情報(散乱光強度、又は透過度もしくは吸光度)を取得する。次に、ステップＳ１０２において、算出部４０３は、取得部４０１が取得した光学的情報から、記憶部４０２に記憶された凝固波形の微分に関するパラメータを算出するための式にしたがって、|min 1|の値を算出する。なお、凝固時間及び凝固波形は後述の判定の処理には利用されないが、算出部４０３は、取得部４０１が取得した光学的情報から凝固時間及び凝固波形をさらに算出してもよい。

ステップＳ１０３において、算出部４０３は、算出した|min 1|の値から、記憶部４０２に記憶された換算式にしたがって、FVIII活性値を算出する。ステップＳ１０３において、算出部４０３は、取得したFVIII活性値を出力部４０４に送信する。ステップＳ１０４において、出力部４０４は、FVIII活性値を出力し、表示部４１に表示させたり、プリンタに印刷させたりする。あるいは、音声で出力してもよい。これにより、FVIII活性値を、被検血漿の凝固能についての参考情報としてユーザに提供できる。

分析結果を表示する画面の一例として、図１３を参照して、FXII活性化剤及びリン脂質を含む試薬を用いて被検血漿の凝固過程を分析した結果を表示する画面について説明する。画面Ｄ１は、検体番号を表示する領域Ｄ１１と、測定項目名を表示する領域Ｄ１２と、詳細画面を表示させるためのボタンＤ１３と、測定日時を表示するための領域Ｄ１４と、測定結果を表示する領域Ｄ１５と、解析情報を表示する領域Ｄ１６と、凝固波形及びそれを微分したグラフを表示する領域Ｄ１７を含む。

領域Ｄ１５には、測定項目と測定値が表示される。領域Ｄ１５において、「APTT sec」は、活性化部分トロンボプラスチン時間である。領域Ｄ１５には、凝固波形の微分に関するパラメータの値として、|Min 1|、|Min 2|、Max 2などが表示されてもよい。

領域Ｄ１６には、解析項目と参考情報が表示される。領域Ｄ１６において、「Index」は、FVIII活性値の算出に用いた凝固波形の微分に関するパラメータの値である。「FVIII換算値(参考)」は、Indexの値から換算されたFVIII活性値の値である。なお、FVIII代替活性を有する物質の薬効の評価は、この結果だけでなく、他の検査結果や被検者の身体所見などの情報も考慮して行われることが望ましい。よって、本実施形態に係る血液検体分析装置によるFVIII換算値が参考情報であることを示すために、「(参考)」と表示している。

以下に、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。

実施例１
市販のAPTT測定試薬を希釈して、FXII活性化剤及びリン脂質の濃度を調整した血液凝固分析用試薬として用いることで、FVIII代替活性を有する物質を含む血液検体の凝固能を適切に評価できるか否かを検討した。

(１)試薬
市販のAPTT測定試薬として、トロンボチェックAPTT-SLA(シスメックス株式会社)を用いた。この試薬は、FXII活性化剤としてのエラグ酸(86.4μM)と、合成リン脂質(130μM)とで構成される。このAPTT測定試薬とオーレンベロナール緩衝液(シスメックス株式会社)とを、体積比で表して、試薬：緩衝液＝３：１、１：１、１：２、１：９、及び１：29の割合で混合して、血液凝固分析用試薬を調製した(それぞれ、トロンボチェックAPTT-SLAを1.33倍、２倍、３倍、10倍及び30倍希釈した試薬に相当する)。カルシウムイオンを含む凝固開始試薬として、20 mM塩化カルシウム液(シスメックス株式会社)を用いた。また、対照として、トロンボチェックAPTT-SLAを希釈しないで用いた。

(２)凝固第VIII因子代替活性を有する物質
FVIII代替活性を有する物質として、特許文献(WO 2012/067176)に記載の抗FIXa/FX二重特異性抗体であるACE910 (Q499-z121/J327-z119/L404-k)を用いた。この抗体は、WO2005/035756、WO2006/109592及びWO2012/067176に記載の方法により取得した。具体的には、次のようにして抗体を取得した。まず、WO2012/067176に記載の抗体遺伝子を動物細胞発現用ベクターに組み込み、得られた構築物をHEK293細胞にトランスフェクションして、抗FIXa/FX二重特異性抗体を発現させた。そして、該細胞の培養上清に含まれる二重特異性抗体を、Protein A及びゲル濾過により精製した。なお、得られた二重特異性抗体がFXa産生促進活性を有することは、WO 2012/067176、WO2014/050926などに記載された方法で確認した。

(３)血液検体
FVIII欠乏ヒト血漿(George King Bio-Medical)に、二重特異性抗体ACE910を０、10、30、100又は300μg/mLの濃度となるように添加して、FVIII代替活性を有する物質を含む血液検体を調製した。また、検量線を作成するための検体として、FVIII欠乏ヒト血漿(George King Bio-Medical)に、リコンビナントヒトFVIII(rhFVIII、バイエル株式会社)を０、１、３、10、30、100又は200 IU/dLの濃度となるように添加した血液検体を調製した。

(４)測定試料の調製及び測定
測定試料の調製及び測定には、全自動血液凝固測定装置CS-5100(シスメックス株式会社)を用いた。血液検体(50μL)に血液凝固分析用試薬(50μL)を添加して、37℃で３分間インキュベーションした。そして、20 mM塩化カルシウム液(50μL)を添加して測定試料を調製した。測定試料の透過度を、塩化カルシウム液の添加時から420秒間連続的に測定した。なお、測定試料におけるエラグ酸及びリン脂質のそれぞれの終濃度は、表１に示すとおりである。

(５)解析結果
得られた透過度の経時的変化に基づいて、凝固時間と、凝固波形の微分に関するパラメータとして|Min 1|、|Min 2|及びMax 2を算出し、グラフにプロットした。ACE910を含む血液検体及びrhFVIIIを含む血液検体から得られた凝固時間、|Min 1|、|Min 2|及びMax 2のグラフを、それぞれ図１４Ａ、図１５Ａ、図１６Ａ及び図１７Ａに示す。rhFVIIIを含む血液検体のグラフを検量線として、ACE910を含む血液検体の凝固時間、|Min 1|、|Min 2|及びMax 2をFVIII活性値に換算し、得られた換算値からグラフを作成した。得られたグラフを、それぞれ図１４Ｂ、図１５Ｂ、図１６Ｂ及び図１７Ｂに示す。

本発明者らは、あらかじめ、血友病の動物モデルからACE910血中濃度とFVIII活性値との関係を見出している。具体的には、抗FVIII中和抗体の投与により後天性血友病Ａと同様の症状を呈するカニクイザルにおけるACE910及びrhFVIIIの止血効果に基づいて、ACE910は１μg/mL当たり0.2〜0.4 IU/dLのFVIII活性値に換算されることを定義した。なお、本発明者らは、この換算値が、血友病Ａ患者における臨床試験の結果(出血回数)とも乖離しないことを確認している。図１４Ｂ、図１５Ｂ、図１６Ｂ及び図１７Ｂ中の２本の破線は、ACE910濃度を１μg/mL当たり0.2又は0.4 IU/dLのFVIII活性値に換算したグラフを示す。この２本の破線で挟まれた領域を理想範囲と定めて、各パラメータから換算されたFVIIIがこの理想範囲内に上記の血液凝固分析用試薬が、ACE910を含む血液検体の凝固能の適切な評価を可能にするか否かを検討した。特に、ACE910の血中濃度として臨床的に重要と考えられる10〜100μg/mLの範囲の結果を検討した。

図１４Ｂに示されるように、凝固時間から換算されたFVIII活性値は、いずれの試薬を用いた場合でも理想範囲から大きく外れていた。これは、凝固時間から換算されたFVIII活性値は、動物モデルから予測される活性値から乖離していることを示す。よって、凝固時間に基づいても、ACE910を含む血液検体の凝固能を適切に評価できないことが示された。図１５Ｂ、図１６Ｂ及び図１７Ｂに示されるように、希釈していないAPTT試薬を用いた場合では、|Min 1|、|Min 2|及びMax 2のそれぞれから換算されたFVIII活性値は理想範囲内になかった。よって、市販のAPTT試薬では、ACE910を含む血液検体の凝固能を適切に評価できないことが示された。一方、1.33〜30倍に希釈した試薬を用いた場合、|Min 1|から換算されたFVIII活性値が、ACE910濃度10〜100μg/mLの範囲において、少なくとも１点のFVIII活性値が理想範囲内に含まれていた。また、２〜３倍に希釈した試薬を用いた場合、|Min 2|から換算されたFVIII活性値が、ACE910濃度10〜100μg/mLの範囲において、少なくとも１点のFVIII活性値が理想範囲内に含まれていた。また、1.33〜10倍に希釈した試薬を用いた場合、Max 2から換算されたFVIII活性値が、ACE910濃度10〜100μg/mLの範囲において、少なくとも１点のFVIII活性値が理想範囲内に含まれていた。よって、希釈によりAPTT測定試薬の活性化剤及びリン脂質の濃度を調整することで、FVIII代替活性を有する物質を含む血液検体の凝固能を適切に評価できることが示された。

実施例２
実施例１で用いた試薬とは異なる市販のAPTT測定試薬についても、希釈して用いることにより、FVIII代替活性を有する物質を含む血液検体の凝固能を適切に評価できる同様に検討した。

(１)試薬
市販のAPTT測定試薬として、トロンボチェックAPTT-SLA(シスメックス株式会社)、アクチンFSL(シスメックス株式会社)、及びデータファイ・APTT(FS)(シスメックス株式会社)を用いた。アクチンFSLは、エラグ酸と、大豆及びウサギ脳由来のリン脂質とで構成される。データファイ・APTT(FS)は、エラグ酸と、大豆由来のリン脂質とで構成される。各APTT測定試薬とオーレンベロナール緩衝液(シスメックス株式会社)とを、体積比で表して、試薬：緩衝液＝１：２の割合で混合して、血液凝固分析用試薬を調製した(各試薬を３倍希釈した試薬に相当する)。カルシウムイオンを含む凝固開始試薬として、20 mM塩化カルシウム液(シスメックス株式会社)を用いた。また、対照として、各試薬を希釈しないで用いた。

(２)血液検体
FVIII欠乏ヒト血漿(George King Bio-Medical)に、二重特異性抗体ACE910を０、0.3、１、３、10、30、100又は300μg/mLの濃度となるように添加して、FVIII代替活性を有する物質を含む血液検体を調製した。また、検量線を作成するための検体として、FVIII欠乏ヒト血漿(George King Bio-Medical)に、リコンビナントヒトFVIII(rhFVIII、バイエル株式会社)を０、１、３、10、30、100又は200 IU/dLの濃度となるように添加した血液検体を調製した。

(３)測定試料の調製及び測定
測定試料の調製及び測定は、実施例１と同様にして行った。

(４)解析結果
得られた透過度の経時的変化に基づいて、凝固時間と、凝固波形の微分に関するパラメータとして|Min 1|、|Min 2|及びMax 2を算出し、グラフにプロットした。rhFVIIIを含む血液検体のグラフを検量線として、ACE910を含む血液検体の凝固時間、|Min 1|、|Min 2|及びMax 2をFVIII活性値に換算し、得られた換算値からグラフを作成した。３倍希釈した試薬により得た各パラメータの換算値をそれぞれ図１８Ａ〜Ｄに示す。これらの図において、破線で示されるグラフは、実施例１と同様、動物モデルから定義した理想範囲である。

希釈していない各試薬を用いて得た凝固時間から換算されたFVIII活性値は、理想範囲から大きく外れていた。また、図１８Ａに示されるように、３倍希釈した各試薬を用いて得た凝固時間から換算されたFVIII活性値も理想範囲から大きく外れていた。また、希釈していない各試薬を用いて得た|Min 1|、|Min 2|及びMax 2からのFVIII活性値は、ACE910濃度10〜100μg/mLにおいて理想範囲から外れているものが多かった。よって、市販のAPTT試薬では、ACE910を含む血液検体の凝固能を適切に評価することは難しいことが示された。一方、図１８Ｂ〜Ｄに示されるように、３倍希釈した各試薬を用いて得た|Min 1|、|Min 2|及びMax 2からのFVIII活性値は、ACE910濃度10〜100μg/mLにおいて理想範囲に含まれるものが多かった。よって、市販のAPTT試薬を希釈することで、FVIII代替活性を有する物質を含む血液検体の凝固能を適切に評価できることが示された。

実施例３
FVIII代替活性を有する物質及びFVIIIの両方を含む血液検体であっても、希釈したAPTT測定試薬により、凝固能を適切に評価できるか否かを検討した。

(１)試薬
市販のAPTT測定試薬として、トロンボチェックAPTT-SLA(シスメックス株式会社)を用いた。このAPTT測定試薬とオーレンベロナール緩衝液(シスメックス株式会社)とを、体積比で表して、試薬：緩衝液＝１：２の割合で混合して、血液凝固分析用試薬を調製した(トロンボチェックAPTT-SLAを３倍希釈した試薬に相当する)。カルシウムイオンを含む凝固開始試薬として、20 mM塩化カルシウム液(シスメックス株式会社)を用いた。

(２)血液検体
FVIII欠乏ヒト血漿(George King Bio-Medical)に、二重特異性抗体ACE910を０、0.3、１、３、10、30、100又は300μg/mLの濃度となるように添加して、FVIII代替活性を有する物質を含む血液検体を調製した。この種々の濃度でACE910を含む血液検体のシリーズをさらに３セット調製し、各セットにリコンビナントヒトFVIII(rhFVIII、バイエル株式会社)を１又は５IU/dLの濃度となるように添加して、ACE910及びFVIIIの両方を含む血液検体を調製した。また、検量線を作成するための検体として、FVIII欠乏ヒト血漿(George King Bio-Medical)に、リコンビナントヒトFVIII(rhFVIII、バイエル株式会社)を０、１、３、10、30、100又は200 IU/dLの濃度となるように添加した血液検体を調製した。

(３)測定試料の調製及び測定
測定試料の調製及び測定は、実施例１と同様にして行った。なお、測定試料におけるエラグ酸の終濃度は9.6μMであり、リン脂質の終濃度は14.4μMである。

(４)解析結果
得られた透過度の経時的変化に基づいて、凝固波形の微分に関するパラメータとして|Min 1|、|Min 2|及びMax 2を算出し、グラフにプロットした。得られたグラフを、それぞれ図１９Ａ、図２０Ａ及び図２１Ａに示す。rhFVIIIを含む血液検体のグラフを検量線として、各血液検体の|Min 1|、|Min 2|及びMax 2をFVIII活性値に換算し、得られた換算値からグラフを作成した。得られたグラフを、それぞれ図１９Ｂ、図２０Ｂ及び図２１Ｂに示す。これらのグラフに示されるように、FVIII存在下においても、ACE910濃度に依存的なパラメータ値の変化が見られた。よって、希釈によりAPTT測定試薬の活性化剤及びリン脂質の濃度を調整することで、FVIII代替活性を有する物質及びFVIIIの両方を含む血液検体であっても、凝固能を適切に評価できることが示された。

実施例４
(１)エラグ酸とリン脂質で構成された凝固開始試薬を用いたFVIII欠乏血漿における二重特異性抗体の凝固波形解析
二重特異性抗体ACE910又はリコンビナントヒトFVIII（rhFVIII、バイエル株式会社）を添加した第VIII因子(FVIII)欠乏ヒト血漿(George King Bio-Medical, Lot No. 899-3062,895-2757, 899-2847) 50μLに、エラグ酸とリン脂質で構成された血液凝固分析用試薬１〜３のそれぞれを50μL添加した。３分間インキュベーション後、0.02 mol/L塩化カルシウム溶液50 μLを添加して凝固反応を開始し、血液凝固自動測定装置CS-2000i(シスメックス株式会社)で測定した。測定試料におけるエラグ酸及びリン脂質のそれぞれの終濃度を、以下の表２に示した。なお、血液凝固分析用試薬１〜３は、図２２〜図２４中では、それぞれ試薬１〜試薬３と表記される。

なお、表２中のエラグ酸及びリン脂質の各濃度は、血漿、血液凝固分析用試薬、及び塩化カルシウム溶液を混合した後の終濃度(測定試料中の終濃度)で記載した。

(２)組織因子とエラグ酸とリン脂質で構成された血液凝固分析用試薬を用いたFVIII欠乏血漿における二重特異性抗体の凝固波形解析
ACE910又はリコンビナントヒトFVIII(rhFVIII、バイエル株式会社)を添加したFVIII欠乏ヒト血漿(George King Bio-Medical, Lot No. 899-3062, 895-3394) 50μLに、組織因子とエラグ酸とリン脂質で構成された血液凝固分析用試薬４〜16のそれぞれを50μL添加した。３分間インキュベーション後、0.02 mol/L塩化カルシウム溶液50μLを添加して凝固反応を開始し、血液凝固自動測定装置CS-2000i(シスメックス株式会社)で測定した。測定試料における組織因子、エラグ酸及びリン脂質のそれぞれの終濃度を、以下の表３に示した。なお、血液凝固分析用試薬４〜15は、図２５〜図２９中では、それぞれ試薬４〜試薬15と表記される。

なお、表３中の組織因子、エラグ酸、及びリン脂質の各濃度は、血漿、血液凝固分析用試薬、及び塩化カルシウム溶液を混合した後の終濃度(測定試料中の終濃度)で記載した。

(３)エラグ酸及びリン脂質を含む血液凝固分析用薬を用いたFVIII存在下のFVIII欠乏血漿における二重特異性抗体の凝固波形解析
1、５、又は20 U/dLのリコンビナントヒトFVIII(rhFVIII、バイエル株式会社)を添加したFVIII欠乏ヒト血漿(George King Bio-Medical, Lot No. 899-3062)に、ACE910を添加して得たサンプル50μLに、エラグ酸とリン脂質で構成された血液凝固分析用試薬(表２の血液凝固分析用試薬３)を50μL添加した。３分間インキュベーション後、0.02 mol/L塩化カルシウム溶液50μLを添加して凝固反応を開始し、血液凝固自動測定装置CS-2000i(シスメックス株式会社)で測定した。

(４)組織因子、エラグ酸及びリン脂質を含む血液凝固分析用薬を用いたFVIII存在下のFVIII欠乏血漿における二重特異性抗体の凝固波形解析
1、５、20、50、100、又は200 U/dLのリコンビナントヒトFVIII (rhFVIII、バイエル株式会社)を添加したFVIII欠乏ヒト血漿(George King Bio-Medical, Lot No. 899-3394)に、ACE910を添加して得たサンプル50μLに、組織因子とエラグ酸とリン脂質で構成された血液凝固分析用試薬(表３の血液凝固分析用試薬12又は16)を50μL添加した。３分間インキュベーション後、0.02 mol/L塩化カルシウム溶液50μLを添加して凝固反応を開始し、血液凝固自動測定装置CS-2000i(シスメックス株式会社)で測定した。

結果
＜エラグ酸とリン脂質で構成された血液凝固分析用試薬＞
血液凝固分析用試薬１中に含まれるエラグ酸及びリン脂質の各濃度は、市販のAPTT測定試薬であるトロンボチェック中に含まれるエラグ酸及びリン脂質と同じである。血液凝固分析用試薬２はエラグ酸濃度を変更せずに、リン脂質濃度を1/10に希釈した試薬であり、血液凝固分析用試薬３はエラグ酸濃度を1/10に希釈し、リン脂質濃度を変更していない試薬である。血液凝固分析用試薬１、２及び３のいずれにおいてもrhFVIII及びACE910をそれぞれ含むFVIII欠乏血漿における凝固速度、及び凝固加速度を上昇させた(図２２Ａ及びＢ、図２３Ａ及びＢ、並びに図２４Ａ及びＢ参照)。一方、rhFVIIIを含む検体の｜Min 1|及び｜Min 2|の検量線から10、30、又は100μg/mLのACE910を含む検体の｜Min 1|及び｜Min 2|のそれぞれをFVIII活性に換算した値が、止血効果から期待する理想の範囲(ACE910 １μg/mL当たりFVIII 0.2〜0.4 U/dL)に入ったのは血液凝固分析用試薬３を用いた場合のみであった(図２２Ｃ及びＤ、図２３Ｃ及びＤ、並びに図２４Ｃ及びＤ参照。図中、二本の破線で挟まれた領域は理想範囲を示す)。なお、血液凝固分析用試薬３を用いた場合、ACE910を含む検体の｜Min1|から換算したFVIII活性値は、10、30、又は100μg/mLのうち２点以上が理想の範囲に入っていた。これらの結果より、市販のAPTT試薬(血液凝固分析用試薬１)はACE910の薬効を過大評価するのに対して、血液凝固分析用試薬３はACE910の薬効を適正にモニタリングできることが示された。

さらに、一例ではあるが、血液凝固分析用試薬３を用いてFVIII製剤が含まれるFVIII欠乏血漿におけるACE910の効果を評価したところ、ACE910の添加により凝固速度及び凝固加速度が上昇した(図３０Ａ〜Ｅ参照)。これらの結果より、血液凝固分析用試薬３のような濃度のエラグ酸とリン脂質で構成された血液凝固分析用試薬を用いることにより、FVIII存在下であっても、ACE910の薬効をモニタリングできることが示された。

＜組織因子とエラグ酸とリン脂質で構成された血液凝固分析用試薬＞
血液凝固分析用試薬４〜16は、組織因子とエラグ酸とリン脂質のそれぞれが種々の濃度となるように調製した試薬である。血液凝固分析用試薬４〜16のいずれを用いた条件であっても、ACE910の凝固時間、凝固速度及び加速度は上昇した(図２５Ａ〜Ｃ、図２６Ａ〜Ｉ、図２７Ａ〜Ｉ及び図３２Ａ〜Ｃ参照)。以上より、組織因子とエラグ酸とリン脂質で構成された血液凝固分析用試薬を用いることにより、ACE910の薬効をモニタリングできることが示された。なお、一例ではあるが、血液凝固分析用試薬4、6、11、12及び15を用いることで、rhFVIIIを含む検体の｜Min 1|の検量線から10、30、又は100μg/mLのACE910の凝固速度をFVIII活性に換算した値が、止血効果から期待する理想の範囲(ACE910 1μg/mL当たりFVIII 0.2〜0.4 U/dL)に入ることを示した(図２８及び図２９参照。図中、二本の破線で挟まれた領域は理想範囲を示す)。

さらに、一例ではあるが、血液凝固分析用試薬12及び16をそれぞれ用いて、FVIII製剤が含まれるFVIII欠乏血漿におけるACE910の効果を評価したところ、ACE910の添加により凝固速度及び凝固加速度が上昇した(図３１Ａ〜Ｋ及び図３２Ａ〜Ｃ参照)。これらの結果より、組織因子とエラグ酸とリン脂質で構成された血液凝固分析用試薬を用いることで、FVIII存在下であってもACE910の薬効をモニタリングできることが示された。

実施例５
組織因子とエラグ酸とリン脂質とを含む血液凝固分析用試薬キットを用いたFVIII欠乏血漿における二重特異性抗体の凝固波形解析
実施例５では、エラグ酸及びリン脂質を含む第１試薬と、組織因子及び塩化カルシウム溶液(0.02 mol/L)を含む第２試薬とで構成された血液凝固分析用試薬キット17〜34を用いた。ACE910又はリコンビナントヒトFVIII(rhFVIII、バイエル株式会社)を添加したFVIII欠乏ヒト血漿(George King Bio-Medical) 50μLに、第１試薬を50μL添加した。３分間インキュベーション後、第２試薬を50μL添加して凝固反応を開始し、血液凝固自動測定装置CS-5100(シスメックス株式会社)で測定した。血液凝固分析用試薬キット17〜34を用いて調製した測定試料における組織因子、エラグ酸及びリン脂質のそれぞれの終濃度を、以下の表４に示した。なお、血液凝固分析用試薬キット17〜34は、図３３〜図３７中では、それぞれ試薬17〜試薬34と表記される。

なお、表４中の組織因子、エラグ酸、及びリン脂質の各濃度は、血漿、第１試薬、及び第２試薬を混合した後の終濃度(測定試料中の終濃度)で記載した。

血液凝固分析用試薬キット17〜34のいずれを用いた条件であっても、ACE910の凝固速度及び加速度は上昇した(図３３Ａ〜Ｅ、図３４Ａ〜Ｅ及び図３５Ａ〜Ｅ参照)。以上より、組織因子とエラグ酸とリン脂質で構成された血液凝固分析用試薬を用いることにより、ACE910の薬効をモニタリングできることが示された。なお、一例ではあるが、血液凝固分析用試薬キット19、20、23、24、28、30、32、33及び34を用いることで、rhFVIIIを含む検体の｜Min 1|の検量線から10、30、又は100μg/mLのACE910の凝固速度をFVIII活性に換算した値が、止血効果から期待する理想の範囲(ACE910 1μg/mL当たりFVIII 0.2〜0.4 U/dL)に入ることを示した(図３６Ａ及びＢ参照。図中、二本の破線で挟まれた領域は理想範囲を示す)。

また、一例ではあるが、血液凝固分析用試薬キット22、23及び34を用いることで、rhFVIIIを含む検体の｜Min 2|の検量線から10、30、又は100μg/mLのACE910の凝固速度をFVIII活性に換算した値が、止血効果から期待する理想の範囲(ACE910 1μg/mL当たりFVIII 0.2〜0.4 U/dL)に入ることを示した(図３７Ａ及びＢ参照。図中、二本の破線で挟まれた領域は理想範囲を示す)。

実施例６
組織因子とエラグ酸とリン脂質とを含む血液凝固分析用試薬キットを用いたバイパス製剤存在下のFVIII欠乏血漿における二重特異性抗体の凝固波形解析
実施例６では、エラグ酸及びリン脂質を含む第１試薬と、組織因子及び塩化カルシウム溶液(0.02 mol/L)を含む第２試薬とで構成された血液凝固分析用試薬キット20、21、28、30、33、35及び36を用いた。試薬キット20、21、28、30及び33は実施例５と同じである。0.5又は1.0 U/mLのAPCC(ファイバ(登録商標)、バクスター株式会社)を添加したFVIII欠乏ヒト血漿(George King Bio-Medical)、又は0.25若しくは1.0μg/mLのFVIIa(ノボセブン(登録商標)、ノボノルディスクファーマ)を添加したFVIII欠乏ヒト血漿(George King Bio-Medical)にACE910を添加して得たサンプル50μLに、第１試薬を50μL添加した。３分間インキュベーション後、第２試薬を50μL添加して凝固反応を開始し、血液凝固自動測定装置CS-2000i(シスメックス株式会社)で測定した。上記の各試薬キットを用いて調製した測定試料における組織因子、エラグ酸及びリン脂質のそれぞれの終濃度を、以下の表５に示した。

なお、表５中の組織因子、エラグ酸、及びリン脂質の各濃度は、血漿、第１試薬、及び第２試薬を混合した後の終濃度(測定試料中の終濃度)で記載した。

血液凝固分析用試薬キット20、21、28、30、33、35及び36を用いて、バイパス製剤が含まれるFVIII欠乏血漿におけるACE910の効果を評価したところ、ACE910の添加により凝固速度が上昇した(試薬キット20については図３８Ａ〜Ｄ、試薬キット21については図３９Ａ〜Ｄ、試薬キット28については図４０Ａ〜Ｄ、試薬キット30については図４１Ａ〜Ｄ、試薬キット33については図４２Ａ〜Ｄ、試薬キット35については図４３Ａ〜Ｄ、及び試薬キット36については図４４Ａ〜Ｄを参照)。これらの結果より、組織因子とエラグ酸とリン脂質で構成された血液凝固分析用試薬を用いることで、バイパス製剤の存在下であってもACE910の薬効をモニタリングできることが示された。

１０血液検体分析装置
１１、１２試薬テーブル(試薬収容部)
２０測定部
２２ｇ、２２ｉ光検出器(受光部)
２７ランプユニット(光源)
３０検体搬送部
４０制御装置(制御部)
４１表示部
４２入力部
４３コンピュータ本体
５０測定装置(測定試料調製部及び光学的情報取得部)
１１１第１容器
１１２第２容器
１１３第３容器

Claims

凝固第VIII因子代替活性を有する物質を投与された被検者から得た血液検体と、凝固第XII因子活性化剤と、リン脂質と、組織因子と、カルシウムイオン含有水溶液とから、測定試料を調製する工程と、
前記測定試料に光を照射して、前記測定試料から光量に関する光学的情報を取得する工程と、
取得した光学的情報に基づいて、前記血液検体の凝固能を評価する工程と
を含む、
血液検体の凝固能の評価方法。
前記評価工程が、取得した光学的情報に基づいて、凝固波形の微分に関するパラメータを少なくとも１つ取得し、取得したパラメータの値に基づいて、前記血液検体の凝固能を評価する工程である請求項１に記載の方法。
前記評価工程において、取得したパラメータの値から前記凝固第VIII因子代替活性を有する物質を含む血液検体の凝固能を示す値を取得し、取得した凝固能を示す値に基づいて、前記血液検体の凝固能を評価する請求項２に記載の方法。
前記凝固能を示す値が、凝固第VIII因子活性値である請求項３に記載の方法。
前記光学的情報が、連続的又は断続的に測定された散乱光量、透過度又は吸光度であり、前記凝固波形が、前記散乱光量、透過度又は吸光度の経時的変化を表す波形である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
前記凝固波形の微分に関するパラメータが、最大凝固速度(|Min 1|)、最大凝固加速度(|Min 2|)、最大凝固減速度(Max 2)、波形下部面積(AUC)及び傾き(Slope)からなる群より選択される少なくとも１つである請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
前記凝固第XII因子活性化剤が、エラグ酸、カオリン、セライト及びシリカから選択される少なくとも１種である請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
凝固第XII因子活性化剤、リン脂質、及び組織因子を含む、凝固第VIII因子代替活性を有する物質を投与された被検者から得た血液検体の凝固能を評価するための試薬。
凝固第XII因子活性化剤、リン脂質、及び組織因子を含む第１試薬と、カルシウムイオン含有水溶液からなる凝固開始試薬とを備える、凝固第VIII因子代替活性を有する物質を投与された被検者から得た血液検体の凝固能を評価するための試薬キット。
第１試薬と、第２試薬と、カルシウムイオン含有水溶液からなる凝固開始試薬とを備え、
前記第１試薬が、凝固第XII因子活性化剤及びリン脂質を含み、且つ前記第２試薬が組織因子を含むか、
前記第１試薬が、凝固第XII因子活性化剤及びリン脂質を含み、且つ前記第２試薬が組織因子及びリン脂質を含むか、又は
前記第１試薬が、凝固第XII因子活性化剤及び組織因子を含み、且つ前記第２試薬がリン脂質を含む、
凝固第VIII因子代替活性を有する物質を投与された被検者から得た血液検体の凝固能を評価するための試薬キット。
第１試薬と、第２試薬とを備え、
前記第１試薬が、凝固第XII因子活性化剤及びリン脂質を含み、且つ前記第２試薬が組織因子及びカルシウムイオンを含む、
凝固第VIII因子代替活性を有する物質を投与された被検者から得た血液検体の凝固能を評価するための試薬キット。
前記第２試薬が、リン脂質をさらに含む請求項１１に記載の試薬キット。
測定試料を調製する測定試料調製部と、
調製された測定試料に光を照射し、前記測定試料から光量に関する光学的情報を取得する光学的情報取得部と、
制御部と
を備え、
前記制御部が、
凝固第VIII因子代替活性を有する物質を投与された被検者から得た血液検体と、凝固第XII因子活性化剤と、リン脂質と、組織因子と、カルシウムイオン含有水溶液とから、測定試料を調製するように前記測定試料調製部を制御し、
前記光学的情報に基づいて、前記血液検体の凝固能についての参考情報を出力する、
血液検体分析装置。
制御部が、前記光学的情報に基づいて、凝固波形の微分に関するパラメータを少なくとも１つ取得し、取得したパラメータの値に基づいて、前記血液検体の凝固能についての参考情報を出力する請求項１３に記載の血液検体分析装置。
前記参考情報が、凝固第VIII因子活性値である請求項１３又は１４に記載の血液検体分析装置。
前記光学的情報が、連続的又は断続的に測定された散乱光量、透過度又は吸光度である請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の血液検体分析装置。