CN113785197A - 凝固因子抑制剂效价的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种能够简便且短时间地测定凝固因子抑制剂的效价的方法。本发明提供一种凝固因子抑制剂的效价的测定方法。该方法包括：制备包含被检血液检体和正常血液检体的混合检体；将该混合检体加温，取得关于该加温后的混合检体的凝固反应曲线；取得未受该加温的该混合检体的凝固反应曲线；算出与未受该加温的该混合检体的凝固反应曲线相关的参数作为第1参数；算出与该加温后的混合检体的凝固反应曲线相关的参数作为第2参数；以及基于该第1参数与第2参数的比或差而算出该被检血液检体的凝固因子抑制剂的效价。
Description
技术领域
本发明涉及血液检体的凝固因子抑制剂效价的测定方法。
背景技术
凝血检査是用于通过向患者的血液检体添加规定的试剂来测定凝血时间等，从而诊断患者的凝血功能的检査。通过凝血检査能够掌握患者的止血能力、溶纤能力的状态。作为凝血时间的典型例，有凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间等。近年来，也通用进行凝血检査的自动测定的自动分析装置，能够简便地实施凝血检査。
作为产生凝血时间延长的原因，可举出凝固抑制药剂的影响、参与凝固的成分的减少、先天性凝血因子的缺乏、抑制后天性凝固反应的自身抗体等。例如，在发现APTT延长的情况下，一般进行交叉混合试验，判定APTT的延长是起因于凝固因子抑制剂(抗凝因子)、狼疮抗凝物(LA)、或血友病等凝固因子缺乏中的哪一个。交叉混合试验中，测定正常血浆、被检血浆以及以各种容量比包含被检血浆与正常血浆的混合血浆的刚混合后的APTT(即时反应)和在37℃孵育2小时后的APTT(延迟反应)。将纵轴设为APTT测定值(秒)，将横轴设为被检血浆与正常血浆的容量比而将测定值制成图表。所制作的即时反应和延迟反应的图表根据APTT延长因素而分别显示“向下凸”、“直线”或“向上凸”的图案。基于这些即时反应和延迟反应的图案来判定APTT延长因素。
判定APTT延长起因于凝固因子抑制剂时，一般通过贝提斯达(Bethesda)法来测定抑制剂效价。贝提斯达法中，将混合被检血浆的稀释系列和正常血浆而得的样品在37℃加温2小时后，测定该样品中的凝固因子的残留活性，由测定值并基于校准曲线测定该凝固因子的抑制剂的效价。贝提斯达法目前是对凝固因子VIII(FVIII)和因子IX(FIX)的抑制剂效价的标准的定量法。
在凝血检査中，通过经时地测定向血液检体添加试剂后的凝血反应量，能够求出凝固反应曲线。该凝固反应曲线根据凝血系统的异常类型而分别具有不同的形状(非专利文献1)。因此，公开了基于凝固反应曲线判定凝血系统的异常的方法。例如，在专利文献1～3中记载了基于与关于患者的血液的凝固反应曲线的一次微分曲线和二次微分曲线相关的参数、例如最大凝固速度、最大凝固加速度和最大凝固减速度等来评价该患者的凝固因子有无异常的方法。在专利文献4中记载了基于直至患者的凝固反应达到最大凝固速度或最大凝固加速度的时间为止的凝固速度的平均变化率来判定血友病的严重程度的方法。在专利文献5中记载了基于表示患者血浆的凝固时间相对于稀释倍率的直线的斜率与表示对照血浆的凝固时间相对于稀释倍率的直线的斜率的比来判定FVIII抑制剂的存在的方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2016－194426号公报
专利文献2：日本特开2016－118442号公报
专利文献3：日本特开2017－106925号公报
专利文献4：日本特开2018－017619号公报
专利文献5：日本特开2018－517150号公报
非专利文献
非专利文献1：British Journal of Haematology,1997,98:68-73
发明内容
贝提斯达法的包含样品的加温时间在内的测定需要2小时以上的长时间，并且不适于利用分析装置的自动测定。进而，如果还考虑上述的交叉混合试验的时间，则利用贝提斯达法的目前的抑制剂效价测定需要极大的劳力和时间。关于贝提斯达法，在日本血栓止血学会的术语集(www.jsth.org/glossary/)的“抑制剂(抗凝因子)测定”中有“基准值“未被检测出”，将0.5BU/ml以上判断为阳性”、“难以精度良好地测定0～0.5BU/ml的范围”的记载，因此，检测下限值为0.5BU/mL。
因此，要求一种简便且短时间地测定凝固因子抑制剂的效价的方法。如果能够将抑制剂效价测定自动化，则更优选。
本发明人发现，通过使用来自关于将被检血液检体与正常血液检体的混合检体进行短时间加温处理后的检体和未进行该加温处理的检体的凝固反应曲线的各种参数，与现有方法相比，能够极短时间地测定凝固因子抑制剂的效价。
本发明提供以下方案。
〔1〕一种方法，是凝固因子抑制剂的效价的测定方法，包括：
制备包含被检血液检体和正常血液检体的混合检体，
将该混合检体加温，取得关于该加温后的混合检体的凝固反应曲线，
取得未受该加温的该混合检体的凝固反应曲线，
算出与未受该加温的该混合检体的凝固反应曲线相关的参数作为第1参数，
算出与该加温后的混合检体的凝固反应曲线相关的参数作为第2参数，
基于该第1参数与第2参数的比或差而算出该被检血液检体的凝固因子抑制剂的效价。
〔2〕根据〔1〕所述的方法，其中，与上述凝固反应曲线相关的参数为与上述凝固反应曲线相关的参数、与该凝固反应曲线的一次微分曲线相关的参数以及与该凝固反应曲线的二次微分曲线相关的参数中的至少1种参数。
〔3〕根据〔1〕或〔2〕所述的方法，其中，上述参数为与上述一次微分曲线或二次微分曲线的规定区域的加权平均分有关的参数。
〔4〕根据〔3〕所述的方法，其中，上述加权平均分为由加权平均时间vT和加权平均高度vH规定的坐标(vT,vH)表示的上述1次微分曲线的加权平均分，
在将该1次微分曲线设为F(t)(t为时间)、将F(t)为规定值X的时间设为t1、t2(t1＜t2)时，该vT和该vH由下述式表示，
这里，
并且
与该加权平均分有关的参数包含选自该vT、该vH、峰宽vB、加权平均峰宽vW、B扁平率vAB、B时间率vTB、W扁平率vAW、W时间率vTW、平均时间vTa、平均高度vHa、vTm、vABa和vAWa中的1个以上的参数，
该峰宽vB为从该t1到t2中的F(t)≥X的时间长度，
该加权平均峰宽vW为从上述t1到t2的F(t)≥vH的时间长度，
该vAB表示该vH与该vB的比，
该vTB表示该vT与该vB的比，
该vAW表示该vH与该vW的比，
该vTW表示该vT与该vW的比，
F(t)、t1和t2为与上述F(t)、t1和t2相同的定义，在将从F(t1)到F(t2)的数据分数设为n时，该vTa、该vHa和该vTm分别由下述式表示，
该vABa表示该vHa与该vB的比，
该vAWa表示该vHa与该vW的比。
〔5〕根据〔3〕所述的方法，其中，上述加权平均分为由加权平均时间pT和加权平均高度pH规定的坐标(pT，pH)表示的上述2次微分曲线的正峰的加权平均分，
在将该2次微分曲线设为F′(t)(t为时间)、将F′(t)为规定值X的时间设为t1、t2(t1＜t2)时，该pT和该pH由下述式表示，
这里，
与该加权平均分有关的参数包含选自该pT、该pH、峰宽pB、加权平均峰宽pW、B扁平率pAB、B时间率pTB、W扁平率pAW和W时间率pTW中的1个以上的参数，
该峰宽pB为从该t1到t2中的F′(t)≥X的时间长度，
该加权平均峰宽pW为从上述t1到t2的F′(t)≥pH的时间长度，
该pAB表示该pH与该pB的比，
该pTB表示该pT与该pB的比，
该pAW表示该pH与该pW的比，
该pTW表示该pT与该pW的比。
〔6〕根据〔3〕所述的方法，其中，上述加权平均分为由加权平均时间mT和加权平均高度mH规定的坐标(mT，mH)表示的上述2次微分曲线的负峰的加权平均分，
在将该2次微分曲线设为F′(t)(t为时间)、将F′(t)为规定值X的时间设为t1、t2(t1＜t2)时，该mT和该mH由下述式表示，
这里，
并且
与该加权平均分有关的参数包含选自该mT、该mH、峰宽mB、加权平均峰宽mW、B扁平率mAB、B时间率mTB、W扁平率mAW和W时间率mTW中的1个以上的参数，
该峰宽mB为从该t1到t2中的F′(t)≤X的时间长度，
该加权平均峰宽mW为从上述t1到t2的F′(t)≤mH的时间长度，
该mAB表示该mH与该mB的比，
该mTB表示该mT与该mB的比，
该mAW表示该mH与该mW的比，
该mTW表示该mT与该mW的比。
〔7〕根据〔1〕～〔6〕中任一项所述的方法，其中，基于校准曲线，由上述第1参数与第2参数的比或差算出上述被检血液检体的凝固因子抑制剂的效价。
〔8〕根据〔1〕～〔7〕中任一项所述的方法，其中，上述凝固因子为凝血因子VIII。
〔9〕根据〔1〕～〔8〕中任一项所述的方法，其中，上述混合检体以1∶9～9∶1的容量比包含上述被检血液检体和上述正常血液检体。
〔10〕根据〔9〕所述的方法，其中，进一步包括：将上述被检血液检体在与上述正常血液检体混合前进行稀释，或者将制备的上述混合检体进行稀释。
〔11〕根据〔1〕～〔10〕中任一项所述的方法，其中，上述混合检体的加温在30℃以上且40℃以下进行2～30分钟。
〔12〕根据〔1〕～〔11〕中任一项所述的方法，其中，上述被检血液检体是由于上述凝固因子抑制剂的存在而显示APTT延长的血液检体。
〔13〕根据〔1〕～〔12〕中任一项所述的方法，其中，上述凝固因子抑制剂的效价以贝提斯达单位算出。
根据本发明，与现有方法相比，能够极短时间地测定凝固因子抑制剂的效价。另外，本发明的方法与现有的贝提斯达法相比，能够进行更高灵敏度的抑制剂效价测定。进而，本发明的方法也能够应用于现有的凝血检査中使用的自动分析装置，因此，能够大幅减少测定所需的劳力。
附图说明
图1是本发明的凝固因子抑制剂效价的测定方法的顺序的一个实施方式。
图2是图1所示的数据解析工序的顺序的一个实施方式。
图3是凝固反应曲线的一个例子。
图4是基线调整后的凝固反应曲线的一个例子。
图5中的A是凝固反应曲线的一个例子的部分放大图，B是基线调整后的凝固反应曲线的一个例子的部分放大图。
图6是校正处理后的凝固反应曲线的一个例子。
图7中的A是校正1次曲线的一个例子，B是校正2次曲线的一个例子。
图8是由1次曲线算出的参数的概念图。
图9是用于对运算对象区域值、成为解析对象的校正0次曲线和校正1次曲线的范围以及加权平均分进行说明的概念图。
图10是由2次曲线算出的参数的概念图。
图11是表示加权平均分和vTs、vTe、vB、vW的概念图。虚线表示1次曲线的10％运算对象区域。
图12是表示vTa、vHa、vTm的概念图。
图12-2中的A是用于对运算对象区域值为10％时的加权平均分等进行说明的概念图，B是用于对运算对象区域值为80％时的加权平均分等进行说明的概念图。
图13是LA检体的加温和非加温下的校正1次曲线。
图14是FVIII抑制剂阳性检体的加温和非加温下的校正1次曲线。
图15是加温检体和非加温检体的校正1次曲线。A是LA阳性检体与正常检体的混合检体(LA－NP)，B是FVIII抑制剂阳性检体与正常检体的混合检体(IN－NP)。
图16是基于各种凝固因子的浓度的参数值的变化的一个例子。
图17中的A是参数组的回归直线，B是被检检体与参照的校正1次曲线。样品AF是被检检体、模板A是参照。
图18A是关于各种检体的APTT的、Pa、Pb、Pa/Pb和Pb－Pa的分布。
图18B是关于各种检体的Vmax的、Pa、Pb、Pa/Pb和Pb－Pa的分布。
图18C是关于各种检体的Amax的Pa、Pb、Pa/Pb和Pb－Pa的分布。
图18D是关于各种检体的vB10％的Pa、Pb、Pa/Pb和Pb－Pa的分布。
图18E是关于各种检体的vT10％的Pa、Pb、Pa/Pb和Pb－Pa的分布。
图18F是关于各种检体的vAB10％的Pa、Pb、Pa/Pb和Pb－Pa的分布。
图18G是关于各种检体的vTB10％的Pa、Pb、Pa/Pb和Pb－Pa的分布。
图19中的A是含有抑制剂的混合检体的APTT的Pb/Pa相对于被检检体的抑制剂效价的实测值的坐标图。B是校准曲线。C是基于B所示的校准曲线的运算值相对于被检检体的抑制剂效价的实测值的坐标图。D是关于低效价区域的运算值相对于实测值的坐标图。图中，效价由对数值表示。
图20中的A是含有抑制剂的混合检体的Vmax的Pb/Pa相对于被检检体的抑制剂效价的实测值的坐标图。B是校准曲线。C是基于B所示的校准曲线的运算值相对于被检检体的抑制剂效价的实测值的坐标图。D是关于低效价区域的运算值相对于实测值的坐标图。图中，效价由对数值表示。
图21中的A是含有抑制剂的混合检体的Amax的Pb/Pa相对于被检检体的抑制剂效价的实测值的坐标图。B是校准曲线。C是基于B所示的校准曲线的运算值相对于被检检体的抑制剂效价的实测值的坐标图。D是关于低效价区域的运算值相对于实测值的坐标图。图中，效价由对数值表示。
图22中的A是含有抑制剂的混合检体的VmaxT的Pb/Pa相对于被检检体的抑制剂效价的实测值的坐标图。B是校准曲线。C是基于B所示的校准曲线的运算值相对于被检检体的抑制剂效价的实测值的坐标图。D是关于低效价区域的运算值相对于实测值的坐标图。图中，效价由对数值表示。
图23中的A是含有抑制剂的混合检体的AmaxT的Pb/Pa相对于被检检体的抑制剂效价的实测值的坐标图。B是校准曲线。C是基于B所示的校准曲线的运算值相对于被检检体的抑制剂效价的实测值的坐标图。D是关于低效价区域的运算值相对于实测值的坐标图。图中，效价由对数值表示。
图24中的A是含有抑制剂的混合检体的vT10％的Pb/Pa相对于被检检体的抑制剂效价的实测值的坐标图。B是校准曲线。C是基于B所示的校准曲线的运算值相对于被检检体的抑制剂效价的实测值的坐标图。D是关于低效价区域的运算值相对于实测值的坐标图。图中，效价由对数值表示。
图25中的A是含有抑制剂的混合检体的vAB10％的Pb/Pa相对于被检检体的抑制剂效价的实测值的坐标图。B是校准曲线。C是基于B所示的校准曲线的运算值相对于被检检体的抑制剂效价的实测值的坐标图。D是关于低效价区域的运算值相对于实测值的坐标图。图中，效价由对数值表示。
图26中的A是含有抑制剂的混合检体的T5的Pb/Pa相对于被检检体的抑制剂效价的实测值的坐标图。B是校准曲线。C是基于B所示的校准曲线的运算值相对于被检检体的抑制剂效价的实测值的坐标图。D是关于低效价区域的运算值相对于实测值的坐标图。图中，效价由对数值表示。
图27中的A是含有抑制剂的混合检体的T5的Pb－Pa相对于被检检体的抑制剂效价的实测值的坐标图。B是校准曲线。C是基于B所示的校准曲线的运算值相对于被检检体的抑制剂效价的实测值的坐标图。D是关于低效价区域的运算值相对于实测值的坐标图。图中，效价由对数值表示。
图28是包含由高抑制剂效价检体的稀释检体求出的运算效价的运算效价相对于实测效价的坐标图。
具体实施方式
以下，参照附图对本发明的一个实施方式进行说明。本实施方式涉及血液检体、优选显示凝固时间延长的血液检体、进一步优选显示由凝固因子抑制剂的存在而引起的凝固时间延长的血液检体中的凝固因子抑制剂的效价测定。
1.测定方法
1.1.方法的概要
本实施方式的凝固因子抑制剂的效价的测定方法(以下，也称为本发明的方法)中，制备包含被检血液检体和正常血液检体的混合检体，接着取得加温后或没有该加温的该混合检体各自的凝固反应曲线，算出与该曲线相关的参数。接着，基于由该加温后或没有该加温的混合检体算出的参数之间的比或差算出该被检血液检体的凝固因子抑制剂的效价。优选在本发明的方法中，以贝提斯达单位(BU/mL)的形式算出该凝固因子抑制剂效价。
参照图1所示的流程图对本发明的方法的一个实施方式的概要进行说明。本方法中，首先，制备包含被检检体的混合检体(步骤1)，接着执行加温后的该混合检体和没有该加温的该混合检体各自的凝固反应测量(步骤2)，接着，对得到的测量数据进行解析，取得与该加温后的检体和没有该加温的检体各自的凝固反应曲线相关的参数(步骤3)。基于得到的该加温后的检体和没有该加温的检体的参数而算出该被检检体的凝固因子抑制剂效价(步骤4)。
1.2.检体制备和凝固反应测量
首先，制备血液检体(以下，也简称为检体)(步骤1)。作为该血液检体，优选使用血浆。该检体中可添加在凝固检査中通常使用的周知的抗凝固剂。例如，通过在使用装有柠檬酸钠的采血管采血后进行离心分离，可得到血浆。在本发明的方法中，可制备将来自要求凝固因子抑制剂效价测定的被检者的血液检体(也简称为被检血液检体或简称为被检检体)与正常血液检体(或也简称为正常检体)以规定的容量比混合而成的混合检体。
作为该被检检体的例子，可举出凝血检査中显示APTT延长的血液检体、优选显示由凝固因子抑制剂的存在而引起的凝固时间(例如，APTT)延长的血液检体。更优选该被检检体为已通过交叉混合试验等确认了显示由凝固因子抑制剂的存在而引起的凝固时间延长且通过凝固因子活性检査鉴定出了该抑制剂所抑制的凝固因子的种类的检体。
或者，该被检检体也可以是确认了显示凝固时间(例如，APTT)延长，但该凝固时间延长的原因未知的检体。本发明的方法中，能够通过后述的2.1～2.2中记载的方法进行被检检体的APTT延长因素的判定(例如APTT延长是否起因于凝固因子抑制剂的存在，或者该抑制剂所抑制的凝固因子的种类的判定)。因此，通过在效价测定的步骤之前或并行地进行被检检体的APTT延长因素的判定的步骤，能够在不预先进行交叉混合试验等的情况下仅通过凝固反应测量(APTT测定)和进行与由此得到的凝固反应曲线有关的解析来测定凝固因子抑制剂效价。
混合检体的制备中，将被检检体与另行准备的正常检体以规定的比率混合。该被检检体与该正常检体的混合比只要以将合计设为10容量的容量比计为被检检体：正常检体＝1：9～9：1的范围即可，优选为4：6～6：4的范围，更优选为5：5。应予说明，在被检检体的凝固因子抑制剂效价高的情况下，可以在与正常检体混合之前将被检检体预先稀释至2～100倍左右，将得到的稀释检体以上述的容量比与正常检体混合而制备混合检体。被检检体的稀释可使用正常血浆、缓冲液、FVIII缺乏血浆等。或者，也可以将以上述的容量比包含被检检体和正常检体的混合检体以被检检体的最终的容量比成为1/2～1/100左右的方式用正常检体稀释而制备稀释混合检体。
将所制备的混合检体的一部分加温。该加温的温度例如只要为30℃以上且40℃以下即可，优选为35℃以上且39℃以下，更优选为37℃。该加温的时间例如只要为2～30分钟的范围即可，优选为5～30分钟。该加温时间可以进一步延长，但优选为1小时以内，最大为2小时以内。本说明书中，也将本发明的方法所使用的上述的加温处理中得到的混合检体称为“加温检体”。另一方面，本发明的方法中，也可使用未经受上述的加温处理的混合检体，在本说明书也将其称为“非加温检体”。但是，该“非加温检体”也可以经受通常的凝固反应测量中的检体的预加温处理、例如在30℃以上且40℃以下的1分钟以下的加温，此时，该“加温检体”除上述的加温处理以外，也可以经受该预加温处理。
本发明的方法中，进行该加温检体和非加温检体的凝固反应测量(步骤2)。因此，本发明的方法中，所制备的混合检体中，一部分可在上述的加温处理后进行凝固反应测量，一部分在没有该加温处理的情况下进行凝固反应测量。该凝固反应测量具体而言为APTT测定。该加温检体和非加温检体的凝固反应测量的顺序没有特别限定。例如，可以对该混合检体的一部分进行加温后，进行该加温检体与非加温检体的凝固反应测量，或者也可以在非加温检体的凝固反应测量后，进行加温检体的凝固反应测量。
将凝固反应测量的混合检体与凝固时间测定试剂混合而制备成凝固反应测量用的检体溶液。该凝固时间测定试剂只要为用于测定APTT测定的试剂即可，例如可举出接触因子系的活化剂和磷脂。作为活化剂的例子，可举出鞣花酸、硅藻土、高岭土、二氧化硅、多酚化合物等。作为磷脂的例子，可举出动物来源、植物来源、合成来源的磷脂等。作为动物来源的磷脂的例子，可举出兔脑来源、鸡来源、猪来源的磷脂。作为植物来源的磷脂的例子，可举出大豆来源的磷脂。另外，该检体溶液中可以根据需要添加Tris盐酸等缓冲液。或者，用于该APTT测定的试剂可以使用市售的APTT测定试剂。作为市售的APTT测定试剂的例子，可举出COAGPIA APTT－N(积水医疗株式会社制)。将所制备的检体溶液加温，将该溶液中的接触因子活化。该加温的温度例如为30℃以上且40℃以下，优选为35℃以上且39℃以下。
然后，在上述检体溶液中添加氯化钙液(钙离子)，开始凝血反应。可测量氯化钙液添加后的溶液的凝固反应。凝固反应的测量只要使用一般的方法、例如测量散射光量、透射度、吸光度等的光学方法、或者测量血浆的粘度的力学方法等即可。测量的时间例如可以为从氯化钙液的添加时刻起几十秒～5分钟左右。可在该测量时间期间以规定的间隔反复进行测量。例如，只要以0.1秒间隔进行测量即可。测量中的反应液的温度例如为30℃以上且40℃以下，优选为35℃以上且39℃以下。凝固反应的反应开始时间典型而言可定义为在该检体溶液中添加氯化钙液的时刻，但也可以将其它时机定义为反应开始时间。另外，测量的各种条件可根据检体、试剂、测量方法等而适当地设定。
上述的凝固反应测量中的一系列操作可以使用自动分析装置进行。作为自动分析装置的一个例子，可举出凝血自动分析装置CP3000(积水医疗株式会社制)。或者，也可以手动进行一部分操作。例如，可以由人进行检体、凝固反应测量用的检体溶液的制备，其以后的操作利用自动分析装置进行。
1.3.数据解析
1.3.1.数据的基线调整和校正处理
接着，对凝固反应测量中得到的数据进行规定的解析(步骤3)。对步骤3的数据解析进行说明。将数据解析的流程的一个实施方式示于图2。步骤3中的数据解析可以与步骤2的凝固反应测量并行地进行，或者也可以使用预先测定的凝固反应测量的数据，其后进行数据解析。步骤3的数据解析对加温检体和非加温检体分别进行。以下的步骤3a～3e的步骤基本上对于加温检体和非加温检体是共同的。
步骤3a中，取得上述凝固反应测量的测量数据。该数据例如为上述的步骤2的APTT测定中得到的反映检体的凝固反应过程的数据。例如，取得表示包含检体和凝固时间测定试剂的反应液的氯化钙液添加后的凝固反应的进行量(例如散射光量)的时间变化的数据。在本说明书中也将这些凝固反应测量中得到的数据称为凝固反应信息。
将步骤3a中取得的凝固反应信息的一个例子示于图3。图3为基于散射光量的凝固反应曲线，横轴表示氯化钙液添加后的经过时间(凝固反应时间)，纵轴表示散射光量。随着时间经过，检体的凝固反应进行，因此，散射光量增加。本说明书中，将这样的散射光量等所示的表示凝固反应量相对于凝固反应时间的变化的曲线称为凝固反应曲线。
如图3所示的基于散射光量的凝固反应曲线通常为S形。另一方面，基于透射光量的凝固反应曲线通常为倒S形。以后的本说明书中，对使用基于散射光量的凝固反应曲线作为凝固反应信息的数据解析进行说明。使用基于透射光量、吸光度的凝固反应曲线作为凝固反应信息的数据解析的情况也可进行同样的处理，这对本领域技术人员而言是显而易见的。或者，也可以将作为凝固反应信息的利用混合液的粘度变化等力学方法得到的凝固反应曲线作为解析对象。
步骤3b中，进行凝固反应曲线的基线调整。该基线调整中包含用于除去噪声的平滑化处理和零点调整。图4表示经基线调整(平滑化处理和零点调整)的图3的凝固反应曲线的一个例子。平滑化处理可以使用公知的噪声除去方法中的任一种。另外，如图3随时，包含检体的反应液原本就使光散射，因此，在测定开始时刻(时间0)的散射光量大于0。通过平滑化处理后的零点调整，如图4所示将时间0处的散射光量调整为0。图5的A和B分别表示基线调整前和后的图3的凝固反应曲线的部分放大图。图5的B中，对图5的A的数据进行了平滑化处理和零点调整。
凝固反应曲线的高度依赖于检体的纤维蛋白原浓度。另一方面，由于纤维蛋白原浓度存在个人差异，因此，该凝固反应曲线的高度根据检体而不同。因此，本方法中，根据需要，在步骤3c中进行用于将基线调整后的凝固反应曲线转换成相对值的校正处理。通过该校正处理，能够得到不依赖于纤维蛋白原浓度的凝固反应曲线，由此能够将将检体间的基线调整后的凝固反应曲线的形状的差异进行定量比较。
一个实施方式中，该校正处理中，对基线调整后的凝固反应曲线以最大值达到规定值的方式进行校正。优选该校正处理中依照下述式(1)由基线调整后的凝固反应曲线求出校正凝固反应曲线P(t)。式(1)中，D(t)表示基线调整后的凝固反应曲线，Dmax和Dmin分别表示D(t)的最大值和最小值，Drange表示D(t)的变化幅度(即Dmax－Dmin)，A表示校正凝固反应曲线的最大值。
P(t)＝[(D(t)－Dmin)/Drange]×A (1)
作为一个例子，图6中示出将图4所示的凝固反应曲线以最大值成为100的方式进行了校正的数据。应予说明，图6中以校正后的值成为0～100的方式进行了校正，但也可以为其它值(例如0～10000，即式(1)中A＝10000)。另外，也可以未必进行该校正处理。
或者，如上所述的校正处理也可以对后述的与凝固速度相关的波形、或从该波形中选取的参数组进行。即，可以对未进行校正处理的基线调整后的凝固反应曲线D(t)算出与凝固速度相关的波形后，将其转换为相当于P(t)的值。或者，可以从该与凝固速度相关的波形选取参数组后，将该参数组中所含的各个参数的值转换为相当于P(t)的值。
1.3.2.与凝固速度相关的波形的算出
步骤3d中，算出将凝固反应曲线微分而得的微分曲线。本说明书中，作为该微分曲线，可举出通过凝固反应曲线(有或无上述的校正处理)的一次微分而得到的一次微分曲线和通过该凝固反应曲线的二次微分(或者一次微分曲线的一次微分)而得到的二次微分曲线。一次微分曲线中包含未校正一次微分曲线(凝固速度曲线)和校正一次微分曲线。凝固速度曲线表示将凝固反应曲线(无校正处理)进行一次微分而得到的值、即任意的凝固反应时间的凝固反应量的变化率(凝固速度)。校正一次微分曲线表示将凝固反应曲线(有校正处理)进行一次微分而得到的值、即任意的凝固反应时间的凝固反应量的相对变化率(本说明书中有时称为凝固进行率)。因此，该一次微分曲线可以为表示检体的凝固反应的凝固速度或其相对值的波形。
二次微分曲线可通过凝固反应曲线(有或无校正处理)的二次微分而得到。来自凝固反应曲线(无校正处理)的二次微分曲线也被称为凝固加速度曲线，相对于该时间的值表示凝固加速度。来自凝固反应曲线(有校正处理)的二次微分曲线也被称为校正二次微分曲线，表示凝固进行率的时间变化率。
应予说明，本说明书中，也将校正处理后的凝固反应曲线和无校正处理的凝固反应曲线分别称为校正0次曲线和未校正0次曲线，另外，将它们统称为“0次曲线”。另外，本说明书中，也将该校正0次曲线和该未校正0次曲线的一次微分曲线分别称为校正1次曲线和未校正1次曲线，另外，也将它们统称为“1次曲线”。另外，本说明书中，也将该校正0次曲线和该未校正0次曲线的二次微分曲线、或者该校正1次曲线和该未校正1次曲线的一次微分曲线分别称为校正2次曲线和未校正2次曲线，另外，也将它们统称为“2次曲线”。
另外，本说明书中，不论有得到的凝固反应曲线的校正处理，或是无校正处理，均将基于1次曲线的表示凝固进行的值统称为1次微分值。另外，本说明书中，不论有得到的凝固反应曲线的校正处理，还是无校正处理，均将基于2次曲线的表示1次微分值的变化率的值统称为2次微分值。
该0次曲线和1次曲线的微分可以使用公知的方法。图7的A表示将图6所示的校正0次曲线进行一次微分而得到的校正1次曲线。图7的A的横轴表示凝固反应时间，纵轴表示1次微分值。图7的B表示将图7的A所示的校正1次曲线进行一次微分而得到的校正2次曲线。图7的B的横轴表示凝固反应时间，纵轴表示2次微分值。
1.3.3.参数的选取
步骤3e中，进行表征上述的0次曲线、1次曲线或2次曲线的参数的选取。该参数是与检体的凝固反应曲线相关的参数。本发明的方法中，在来自该1次曲线或2次曲线的参数的选取工序中，从该曲线选取1个以上的规定区域，另一方面，对该1个以上的规定区域分别选取表征其的参数。结果，可对该1个以上的规定区域分别选取表征其的1个以上的参数。更详细而言，来自该1次曲线或2次曲线的参数为与检体的该1次曲线或2次曲线的该规定区域的加权平均分有关的参数。以下，一边例示来自1次曲线的参数的选取步骤一边对该参数进行说明。
1.3.3.1.运算对象区域的选取
参数的选取中，首先，从1次曲线选取1个以上的规定区域。以下，也将该参数选取中使用的规定区域称为运算对象区域。该运算对象区域是1次曲线的1次微分值(y值)为规定的运算对象区域值以上的区域(部分)。换言之，该运算对象区域是1次曲线的1次微分值(y值)为规定的运算对象区域值以上且为最大值以下的区域(部分)。
参照图8对运算对象区域进行说明。图8中示出时间t的校正1次曲线F(t)。另外，图8中示出1次微分值的最大值Vmax、以及作为下述说明的参数的表示运算对象区域值X(将Vmax设为100％时的x％)处的运算对象区域的加权平均分(黑圆圈)的位置的坐标vTx和vHx，以及表示峰宽的vBx。图8中例举了校正1次曲线，但未校正1次曲线也可算出同样的参数。
运算对象区域值为指定运算对象区域的1次微分值的下限的规定值，本说明书中，也被称为运算对象区域值X。即运算对象区域是1次曲线中的1次微分值(图8中为校正1次微分值)为运算对象区域值X以上且为Vmax以下的(即F(t)≥X)区域。运算对象区域值X可为了限定反映1次曲线的峰形状的范围而设定。运算对象区域值X越大，1次曲线的峰的上部形状的影响越相对大地反映于解析结果。
本发明的方法中，只要选取1个以上的运算对象区域即可。本发明的方法中所选取的运算对象区域的数量未必受限定。在选取多个运算对象区域的情况下，该多个运算对象区域为不同的区域。
1.3.3.2.加权平均分
参照图8对运算对象区域的加权平均分进行说明。对于1次曲线(图8中为校正1次曲线)F(t)(F(t)＝1次微分值、t＝时间)，相当于将F(t)为运算对象区域值以上的值设为运算对象数据时的“加权平均值”的位置作为加权平均分(vT,vH)算出。本说明书中，为了识别来自不同的运算对象区域的加权平均分，有时依照其所来自的运算对象区域值X(这里为X＝Vmax×x％)而称为(vTx,vHx)。例如，X为Vmax的5％时的运算对象区域的加权平均分为(vT5％,vH5％)。
1次曲线中，将表示加权平均分的时间(t)设为加权平均时间vT。即，加权平均时间vT为从凝固反应开始时间到加权平均分的时间。1次曲线中，将表示加权平均分的1次微分值设为加权平均高度vH。即，加权平均时间vT和加权平均高度vH为如图8所示的1次曲线中的加权平均分的坐标。
更具体而言，加权平均时间vT和加权平均高度vH可通过以下的步骤求出。首先，F(t)的最大值为Vmax、运算对象区域值为Vmax的x％时，求出满足F(t)≥Vmax×x×0.01的时间t[t1,…,t2](t1＜t2)，由下述式(2)求出乘积和值M。
加权平均时间vT和加权平均高度vH分别由下式(3)和(4)算出。由求出的vT和vH导出加权平均分。
上述的说明中，参照图8算出校正1次曲线的运算对象区域的加权平均分，但在未校正1次曲线的情况下，也可同样地定义运算对象区域的加权平均分、加权平均时间vT和加权平均高度vH。这些加权平均时间vT和加权平均高度vH可用作表征运算对象区域的参数。本说明书中，为了识别来自不同的运算对象区域的vT和vH，有时依照其所来自的运算对象区域值X(这里为X＝Vmax×x％)而分别称为vTx和vHx。例如，X为Vmax的5％的运算对象区域的vT和vH为vT5％和vH5％。
图9中示出运算对象区域值X与此时的作为解析对象的校正0次曲线(左)和校正1次曲线(右)的区域(运算对象区域)和加权平均分的关系。图9中，上段、中段和下段表示运算对象区域值X分别为Vmax(＝100％)的10％、50％和80％的情况。实线表示校正0次曲线，虚线表示校正1次曲线的运算对象区域，黑圆圈表示加权平均分。伴随运算对象区域值X的变化，运算对象区域和加权平均分的位置如图9所示发生变化。
同样地，对于2次曲线，也可定义加权平均分、加权平均时间和加权平均高度。2次曲线如图10所示在2次微分值的正方向和负方向这两个方面具有峰。因此，2次曲线的加权平均分可以对正峰和负峰这两者算出。例如，对于正峰，2次曲线A＝F'(t)的最大值为Amax，运算对象区域值为Amax的x％时，求出满足F'(t)≥Amax×x×0.01的时间t[t1,…,t2](t1＜t2)，依照下式(2)’～(4)’而算出正峰的加权平均时间pT和加权平均高度pH。对于负峰，2次曲线A＝F'(t)的最小值为Amin，运算对象区域值为Amin的x％时，求出满足F'(t)≤Amin×x×0.01的时间t[t1,…,t2](t1＜t2)，依照上式(2)’、(3)”和(4)”而算出负峰的加权平均时间mT和加权平均高度mH。伴随运算对象区域值X的变化，加权平均分的位置发生变化。
1.3.3.3.峰宽、扁平率和时间率
满足上述的F(t)≥X的时间t[t1,…,t2]的最小值(t1)和最大值(t2)表示1次曲线的运算对象区域中的凝固反应时间的最小值和最大值，有时将它们分别称为区域起点时间vTs和区域终点时间vTe(vTs＜vTe)。将从vTs到vTe的时间中F(t)≥X的时间长度(从F(t)≥X的数据分数减去1的分数乘以测光时间间隔而得到的值)设为1次曲线的峰宽vB。更具体而言，将运算对象区域值为Vmax的x％时的vTs和vTe分别由vTsx和vTex表示时，从vTsx到vTex为止(包含vTsx和vTex)为峰宽vBx。
作为本发明中使用的参数的进一步的例子，可举出加权平均峰宽vW。vW为满足1次曲线F(t)≥vH的峰宽(从满足F(t)≥vH的最小时间到最大时间中，F(t)≥vH的时间长度)。如图11所示，vW为满足1次曲线F(t)≥vH的加权平均分的峰的宽度。作为本发明中使用的参数的进一步的例子，可举出vTr。vTr为从vTs到vTe的宽度。vTr通常为与vB相同的值，但曲线形状为双峰性峰，且运算对象区域值X为比该双峰性峰的谷底高的位置时，vB＜vTr。图11表示运算对象区域值X为Vmax的10％时的1次曲线的运算对象区域(虚线)。图11的A示出加权平均分(vT,vH)(黑圆圈)、vTs、vTe，图11的B中示出vB、vW。
同样地，对于2次曲线的正峰，满足F'(t)≥X的时间的最小值和最大值分别为pTs、pTe，将从pTs到pTe的时间中满足F'(t)≥X的时间长度(从F'(t)≥X的数据分数中减去1的分数乘以测光时间间隔而得到的值)设为峰宽pB，将满足F'(t)≥pH的时间长度设为加权平均峰宽pW。对于2次曲线的负峰，满足F'(t)≤X的时间的最小值和最大值分别为mTs、mTe，将从mTs到mTe的时间中满足F'(t)≤X的时间长度(从F'(t)≤X的数据分数中减去1的分数乘以测光时间间隔而得到的值)设为峰宽mB，将满足F'(t)≤mH的时间长度设为加权平均峰宽mW。
作为本发明中使用的参数的进一步的例子，可举出平均时间vTa、平均高度vHa和区域中央时间vTm。图12中示出运算对象区域值X为Vmax的10％时的1次曲线的平均分(vTa,vHa)(白色菱形)、加权平均分(vT,vH)(黑圆圈)、vTs、vTe和vTm。将从F(vTs)到F(vTe)的数据分数设为n时，vTa、vHa和vTm分别由下式表示。
作为本发明中使用的参数的进一步的例子，可举出基于1次曲线的峰宽的扁平率(B扁平率)vAB和vABa、以及基于加权平均峰宽的扁平率(W扁平率)vAW和vAWa。一个实施方式中，如下述式所示，vAB由加权平均高度vH与峰宽vB的比定义，vAW由加权平均高度vH与加权平均峰宽vW的比定义。vABa由平均高度vHa与峰宽vB的比定义，vAWa由平均高度vHa与加权平均峰宽vW的比定义。
vAB＝vH/vB (8a)
vAW＝vH/vW (8b)
vABa＝vHa/vB (8c)
vAWa＝vHa/vW (8d)
作为本发明中使用的参数的进一步的例子，可举出基于1次曲线的峰宽的时间率(B时间率)vTB和基于加权平均峰宽的时间率(W时间率)vTW。一个实施方式中，如下述式所示，vTB由加权平均时间vT与峰宽vB的比定义，vTW由加权平均时间vT与加权平均峰宽vW的比定义。
vTB＝vT/vB (9a)
vTW＝vT/vW (9b)
应予说明，扁平率可以为vAB＝vB/vH或vAW＝vW/vH，另外，也可以为vABa＝vB/vHa或vAWa＝vW/vHa。同样地，时间率可以为vTB＝vB/vT或vTW＝vW/vT。另外，这些比可以乘以常数K。即，例如，扁平率可以为vAB＝(vH/vB)K、vAB＝(vB/vH)K、vAW＝(vH/vW)K或vAW＝(vW/vH)K(K为常数)，或者也可以为vABa＝(vHa/vB)K、vABa＝(vB/vHa)K、vAWa＝(vHa/vW)K或vAWa＝(vW/vHa)K，时间率可以为vTB＝(vT/vB)K、vTB＝(vB/vT)K、vTW＝(vT/vW)K或vTW＝(vW/vT)K(K为常数)。
如上所述的峰宽vB、pB、mB、加权平均峰宽vW、pW、mW、平均时间vTa、平均高度vHa、区域起点时间vTs、区域终点时间vTe、区域中央时间vTm、扁平率vAB、vAW、vABa、vAWa和时间率vTB、vTW可以为表征运算对象区域的参数。本说明书中，为了识别来自不同的运算对象区域的参数，有时将各参数依照其所来自的运算对象区域值X(这里为X＝Vmax×x％)而分别称为vBx、vABx、vTBx等。此时，例如，vABx和vTBx可由vBx和vHx或vTx算出。例如是X为Vmax的5％的运算对象区域的vB、vW、vTa、vHa、vTs、vTe、vTm、vAB、vAW、vABa、vAWa、vTB、vTW为vB5％、vW5％、vTa5％、vHa5％、vTs5％、vTe5％、vTm5％、vAB5％、vAW5％、vABa5％、vAWa5％、vTB5％、vTW5％。另外，X为Amax或Amin的5％的运算对象区域的pB、mB、pW、mW为pB5％、mB5％、pW5％、mW5％。
图12－2的A和B表示基于相同的1次曲线的关于不同的运算对象区域值X的vH、vT和vB。图12－2的A示出运算对象区域值X为Vmax的10％的情况，图12－2的B示出运算对象区域值X为Vmax的80％的情况。Vmax均为100％。
对于2次曲线，也同样地基于峰宽或加权平均峰宽求出扁平率和时间率，它们可用作本发明的参数。
1.3.3.4.曲线下面积(AUC)
作为本发明中使用的参数的进一步的例子，可举出1次曲线或2次曲线的运算对象区域的曲线下面积(AUC)。2次曲线由于具有正侧峰和负侧峰，因此，将2次曲线的最大峰高度设为100％的运算对象区域的曲线下面积(AUC)可具有关于正侧峰的运算对象区域的AUC(pAUC)和负侧峰的运算对象区域的AUC(mAUC)(其中，在mAUC的情况下，准确而言为曲线上面积)。本说明书中，为了识别来自不同的运算对象区域的AUC，有时依照其所来自的运算对象区域值X(这里为X＝Vmax×x％)而称为AUCx。例如，X为Vmax、Amax和Amin的5％的运算对象区域的vAUC、pAUC和mAUC分别为vAUC5％、pAUC5％和mAUC5％。
1.3.3.5.其它
与上述的加权平均分有关的参数以外的进一步的参数可包含在与本发明中使用的凝固反应曲线相关的参数中。作为进一步的参数的例子，可举出最大1次微分值Vmax、最大2次微分值Amax、最小2次微分值Amin、以及表示到达它们的时间的VmaxT、AmaxT、AminT。进而，在将0次曲线中的散射光量的变化量满足规定条件的时刻的散射光量设为100％时，散射光量相当于c％的反应经过时间可作为凝固时间Tc包含在本发明中使用的参数中。c可以为任意的值，例如Tc为T50。
以上，依据基于散射光量的凝固反应曲线，对与凝固反应曲线相关的参数进行了说明。另一方面，能够由基于其它凝固测量手段(例如透射光量、吸光度)的凝固反应曲线取得同等的参数对本领域技术人员而言是显而易见的。例如，由基于透射光量这样的倒S形的凝固反应曲线得到的1次曲线F(t)相对于上述的基于散射光量的曲线，正负是相反的。在这样的情况下，参数的计算中，F(t)的符号反转，例如，最大值Vmax被调换为最小值Vmin，运算对象区域为满足F(t)≤X的区域，vB和vW分别为从t1到t2的F(t)≤X和F(t)≤vH的时间长度等，这对本领域技术人员而言是显而易见的。
2.使用与凝固反应曲线相关的参数的凝固因子抑制剂效价的测定
通过上述的步骤取得与混合检体的凝固反应曲线相关的参数。该参数可依赖于该凝固反应曲线的形状而值发生变化。包含正常血浆和具有凝固异常的被检检体的混合检体有时由于凝固异常的原因或加温的影响而凝固反应曲线的形状不同。因此，根据凝固异常的原因，由该加温检体得到的参数与由非加温检体得到的参数有时具有不同的值。应予说明，本说明书中，对于参数的值，例如对其比、差进行描述时，“参数”和“参数值”意义相同。另一方面，对参数的种类进行描述时，“参数”和“参数种类”意义相同。
本发明的方法中，对该加温检体和非加温检体分别取得选自与上述的凝固反应曲线相关的参数(优选为后述的表1中记载的参数)中的至少1种。将从该非加温检体取得的参数称为第1参数，将从该加温检体取得的参数称为第2参数。本发明的方法中，基于该第1参数与该第2参数的比或差算出混合检体中所含的被检检体的凝固因子抑制剂的效价(步骤4)。
本发明的方法的一个实施方式中，混合检体中所含的被检检体通过交叉混合试验等判定为是显示由特定的凝固因子抑制剂的存在而引起的APTT延长的血液检体。此时，可依照后述的2.3的步骤，基于该第1和第2参数算出凝固因子抑制剂效价。本发明的方法的另一个实施方式中，混合检体中所含的被检检体是否显示由特定的凝固因子抑制剂的存在而引起的APTT延长是未知的。此时，本发明的方法中，可依照后述的2.1～2.2的步骤实施APTT延长因素的判定和凝固因子抑制剂的鉴别。其后，可依照后述的2.3的步骤，基于该第1和第2参数算出凝固因子抑制剂效价。后者的实施方式中，由于不需要进行需要时间的交叉混合试验，因此，可更简便地实现凝固因子抑制剂效价的测定。
2.1 APTT延长因素的判定
如上所述，检体中所含的凝固异常原因成分或检体的加温有时对凝固反应曲线的形状造成影响。参照图13～15表示因凝固异常的原因或加温所致的凝固反应曲线的变化的例子。图13表示LA血浆(LA)的加温和非加温下的校正1次曲线。图14表示FVIII抑制剂阳性血浆(IN)的加温和非加温下的校正1次曲线。图15的A表示LA血浆(LA)与正常血浆的1：1混合血浆(LA－NP)的加温和非加温下的校正1次曲线。图15的B表示FVIII抑制剂阳性血浆(IN)与正常血浆的1：1(IN－NP)的加温和非加温下的校正1次曲线。
如图13所示，LA血浆(LA)中，几乎没有因加温所致的曲线形状的变化。另外，如图14所示，FVIII抑制剂阳性血浆(IN)中，与LA同样地，几乎没有因加温所致的曲线形状的变化。
如图15的A所示，LA血浆(LA)与正常血浆的1：1混合血浆(LA－NP)通过与正常血浆混合，与图13相比，峰较早地出现(凝固时间缩短)，形状也尖锐化。LA－NP中，与LA同样地几乎没有因加温所致的曲线形状的变化。
如图15的B所示，FVIII抑制剂阳性血浆(IN)与正常血浆的1：1混合血浆(IN－NP)中，非加温检体通过与正常血浆混合，与图14相比，与LA－NP同样地峰较早地出现，形状也尖锐化。另一方面，加温检体中，峰较慢地出现，峰高度变低并且峰宽变宽。判断该形状变化是因为在加温处理中进行IN中所含的抑制剂(抗FVIII抗体)与正常血浆中所含的FVIII的抗原抗体反应，因此，混合血浆的凝固反应被抑制。通过将该非加温与加温的形状变化作为参数的变化进行指标化，从而能够确认可将IN与LA鉴别的可能性。
如图15所示，混合检体的凝固反应曲线可根据凝固异常原因成分或加温而发生变化，这是指通过对与非加温检体和加温检体的凝固反应曲线有关的参数进行解析，从而能够检测出显示由凝固因子抑制剂的存在而引起的APTT延长的被检检体。将基于该参数的APTT延长因素的评价例示于后述的表2。表2中示出关于正常检体(NP)、LA阳性检体(LA)、LA阳性检体与正常检体的1：1混合检体(LA－NP(mix))、FVIII抑制剂阳性检体(IN)和FVIII抑制剂阳性检体与正常检体的1：1混合检体(IN－NP(mix))的由非加温检体的凝固反应曲线取得的第1参数(Pa)、由加温10分钟的加温检体的凝固反应曲线取得的第2参数(Pb)和这些参数的比(Pb/Pa)。
表2所示的参数中，APTT表示已基线调整的凝固反应曲线的散射光量为50％的反应经过时间(T50(秒))，Vmax表示校正1次曲线的最大值，VmaxT表示从测光开始后到成为Vmax为止的时间。另外，表2中示出与运算对象区域值10％处的加权平均分相关的参数vH10％、vT10％、vB10％、vAB10％和vTB10％。
如表2所示，不被加温影响的正常检体(NP)中，全部参数中比(Pb/Pa)是接近1的值。LA阳性检体(LA)和与正常检体的混合检体(LA－NP(mix))中，如图15的A所示，凝固反应不太受加温的影响，因此，比(Pb/Pa)是接近1的值。
另一方面，包含FVIII抑制剂阳性检体的混合检体(IN－NP(mix))的凝固反应如图15的B所示大幅受到加温的影响，其被反映到参数比(Pb/Pa)中。如表2所示，IN－NP(mix)中，比(Pb/Pa)在APTT、VmaxT、vT、vB中显著变大，在Vmax、vH中变小。这些参数可成为检测FVIII抑制剂阳性检体的指标。另外，如表2所示，vAB的比(Pb/Pa)在IN－NP(mix)中显示从1显著减少，显示与LA、NP明显不同的行为。进而，在后述的图18中示出了对于APTT、Vmax、Amax、vB10％、vT10％、vAB10％和vTB10％，它们的比(Pb/Pa)在包含FVIII抑制剂阳性检体的混合检体中显示从1增加或减少，但在LA、NP或包含凝固因子缺乏(例如血友病A和血友病B)的混合检体中是接近1的值，另外，它们的差(Pb－Pa)在包含FVIII抑制剂阳性检体的混合检体中大幅偏离0，但在LA、NP或包含凝固因子缺乏的混合检体中是接近0的值。
如上所述，FVIII抑制剂阳性检体中，来自非加温检体的第1参数与来自加温检体的第2参数不同，且在正常检体、LA阳性检体中看不到加温对这样的参数值的影响。因此，能够基于由加温检体和非加温检体取得的上述的参数来判定混合检体中所含的被检检体是否为FVIII抑制剂阳性。优选可基于能够反映第1参数和第2参数的值的变化率、变化幅度的指标、例如如表2所示的第1参数与第2参数的比或第1参数与第2参数的差而检测FVIII抑制剂阳性检体。
以上，对使用第1参数和第2参数判定起因于FVIII抑制剂的存在而显示APTT延长的血液检体的步骤进行了说明。也可以通过同样的步骤来区别其它凝固因子(例如FIX)抑制剂阳性检体和LA阳性检体。
2.2凝固因子抑制剂的鉴别
在上述2.1的步骤中检测出起因于凝固因子抑制剂的存在而显示APTT延长的血液检体的情况下，接着，在凝固因子抑制剂的种类不明的情况下，需要判定其种类。凝固因子抑制剂按照发生件数变多的顺序已知有FVIII抑制剂、FIX抑制剂和其它因子的抑制剂。
图16中示出各种凝固因子的浓度与vTB80％的关系。应予说明，凝固因子的浓度为对数值，浓度0.1％以下对数转换为0.1％。对于因子浓度10％以下的vTB80％，相同浓度的各种凝固因子中，FVIII的值明显低于其它凝固因子的值，因此，能够将FVIII缺乏与其它凝固因子缺乏相区别。由此，能够通过vTB80％的值来判定抑制剂的种类为FVIII抑制剂。
另一个实施方式中，通过使用上述的本发明的参数的模板匹配来评价缺乏的凝固因子的种类、浓度。更详细而言，取得上述的参数时，设定多个运算对象区域，求出各个运算对象区域的加权平均分，取得vT、vH、vB、vAB、vTB等上述的表征运算对象区域的参数。这些参数只要对各运算对象区域求出任1种即可，优选取得2种类以上。运算对象区域的数量没有特别限定，优选可以为3～100个，更优选可以为5～20个。进而，也可以取得Vmax、VmaxT、Amax、AmaxT等值。另一方面，准备凝固因子的浓度已知且各种不同的检体(参照)，对其同样地进行参数的取得。此时，对参照检体设定的运算对象区域和取得的参数的种类与被检检体对应。接着，求出得到的被检检体的参数组与各参照的参数组之间的直线回归式，求出回归直线的相关性(例如斜率、截距、相关系数、决定系数等)。将与被检检体的相关性最高的参照的凝固因子的浓度推定为被检检体的该凝固因子的浓度。将被检检体与参照的直线回归式的例子示于图17。图17的A表示FVIII活性均小于0.2％的被检检体(样品AF)与参照(模板A)之间的参数组的回归直线。参数组使用由10个运算对象区域(相对于Vmax，X＝5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％和90％)的50个参数(vB[vB5％,vB10％,…,vB90％]、vT[vT5％,vT10％,…,vT90％]、vH[vH5％,vH10％,…,vH90％]、vAB[vAB5％,vAB10％,…,vAB90％]和vTB[vTB5％,vTB10％,…,vTB90％])构成的参数组。图17的B表示图17的A的被检检体(样品AF)和参照(模板A)的校正1次曲线。2个曲线具有非常相似的形状，表示凝血特性的近似度反映到检体的参数组彼此的相关性中。
或者，可以依照以往的方法，通过交叉混合试验、凝固因子活性检査来确定被检检体的APTT延长是否起因于凝固因子抑制剂的存在，以及该凝固因子抑制剂的种类。
2.3凝固因子抑制剂效价的算出
如上述2.1中所描述的那样，包含显示因凝固因子抑制剂所致的APTT延长的被检检体的混合检体通过加温，其凝固反应曲线的形状发生变化。进而，该凝固反应曲线的形状的变化的大小依赖于凝固因子抑制剂的活性(效价)。因此，可基于来自该非加温检体和加温检体的第1参数的值与第2参数的值的比或差而算出该被检血液检体的凝固因子抑制剂的效价。
更详细而言，求出第1参数的值与第2参数的值的比或差，基于校准曲线，由该值算出凝固因子抑制剂的效价。该校准曲线可预先制作。例如，只要对于特定的凝固因子抑制剂的效价已知且各种不同的一系列的标准检体，通过与上述的被检检体的情况同样的步骤求出第1参数和第2参数，接着，使用该标准检体的抑制剂效价和该第1参数与第2参数的比或差制作校准曲线即可。
作为利用本发明的方法进行的效价测定中使用的优选的参数的例子，可举出Vmax、vT、vH、vB、vAB、vTB、vAW、vTW、pAUC、mAUC。用于使用这些参数的运算对象区域值X为Vmax100％时，优选为5～90％，更优选为30～70％。
本发明的方法中进行效价测定的凝固因子抑制剂的种类没有特别限定，可举出FVIII抑制剂、FIX抑制剂等，优选可举出FVIII抑制剂。通过预先制作关于应测定效价的目标凝固因子抑制剂的校准曲线，从而可基于混合检体的第1参数与第2参数的比或差算出目标凝固因子抑制剂的效价。
实施例
以下，通过实施例对本发明详细地进行说明，但本发明并不限定于以下的实施例。
以下的实施例中使用的参数只要没有特别说明，则表示来自校正0次～2次曲线的参数。另一方面，来自未校正0次～2次曲线的参数在各参数的名称开头标注R来表示。例如，校正1次曲线的加权平均高度为vH时，未校正1次曲线的加权平均高度由RvH表示，校正1次曲线的加权平均时间为vT时，未校正1次曲线的加权平均时间由RvT表示。将参数的一览示于下述的表1。在以下的说明中，组合的波形参数的B扁平率、W扁平率、B时间率和W时间率有时使用可理解省略了系数k的参数的运算内容的表述。
[表1]
凝固反应曲线(0次曲线)的波形参数
1次曲线和2次曲线的波形参数
组合波形参数
x：运算对象区域值(相对于Vmax的％)k：常数
来自无校正处理的凝固反应曲线的参数在前头标注R
参考例1
1)被检检体
将实施例中使用的被检检体示于以下。正常血浆(NP)使用由健康人得到的加柠檬酸血浆。LA血浆(LA)使用George King Biomedical，Inc.的阳性狼疮抗凝血浆(PositiveLupus Anticoagulant Plasma)。第VIII因子缺乏血浆(HA)和第IX因子缺乏血浆(HB)使用George King Biomedical的VIII因子缺乏(Factor VIII Deficient)、IX因子缺乏(FactorIX Deficient)。第VIII因子(FVIII)抑制剂阳性血浆(InL、InM和InH)使用George KingBiomedical,Inc.的VIII因子缺乏抑制剂(Factor VIII Deficient with Inhibitor)。
应予说明，抑制剂效价的“低”、“中”、“高”根据贝提斯达单位(BU/mL)的值如下分类：
低：0.3～1.6(BU/mL)
中：2.0～40.5(BU/mL)
高：66～302(BU/mL)
2)混合检体的制备
将1)的各被检检体与正常血浆以1：1的容量比混合而制备混合检体。该正常血浆使用将1)的正常血浆全部混合而得的血浆。
3)抑制剂效价(贝提斯达单位)的测定
通过本领域技术人员周知的求出贝提斯达单位的方法测定检体的抑制剂效价。用缓冲液稀释检体后，与正常血浆以1：1的容量比混合，在37℃孵育2小时后，进行FVIII活性的测定，由残留的FVIII活性求出贝提斯达单位(BU/mL)。
4)APTT测定
APTT试剂使用COAGPIA APTT－N(积水医疗株式会社制)，氯化钙液使用COAGPIAAPTT－N氯化钙液(积水医疗株式会社制)。APTT测定使用凝血自动分析装置CP3000(积水医疗株式会社制)。通过以下的步骤以通常模式(非加温)或加温模式进行处理：
向样本池(Cuvette)(反应容器)排出检体50μL后，
(通常模式)在37℃进行45秒的加温
(加温模式)在37℃进行600～720秒的加温
然后，向样本池添加加温到约37℃的APTT试剂50μL，经过171秒后添加25mM氯化钙液50μL，开始凝固反应。凝固反应以将样本池维持在约37℃的状态下进行。凝固反应的检测通过照射以波长660nm的LED为光源的光，以0.1秒间隔测定90度侧方散射的散射光量。测光时间为360秒间。对相同的检体分别进行非加温(通常模式)和加温(加温模式)条件下的APTT的测定，作为基于APTT测定的凝固反应数据，得到测光数据。
5)测光数据的解析
对得到的测光数据进行包含噪声除去的平滑化处理以及以测光开始时刻的散射光量成为0的方式进行零点调整而得到凝固反应曲线。接下来，以凝固反应曲线的最大高度成为100的方式进行校正而得到校正0次曲线。将该校正0次曲线进行1次微分而得到校正1次曲线，进一步将其进行微分而得到校正2次曲线。
6)参数选取
由得到的校正0次曲线求出凝固时间(APTT)。APTT为将校正0次曲线的最大高度设为100％时达到50％高度的时间(T50)。由校正1次曲线取得最大1次微分值(Vmax)，以及由校正2次曲线取得最大和最小2次微分值(Amax和Amin)。进而，由校正1次曲线和校正2次曲线算出与加权平均分相关的参数。用于算出加权平均分的运算对象区域值X相对于校正1次曲线的最大高度Vmax(100％)设定为0.5％～90％中的任一者。对于各X，算出校正1次曲线的值满足X以上的区间作为峰宽vB。对于各运算对象区域，使用上述式(2)、(3)和(4)算出加权平均时间vT和加权平均高度vH。通过下述式由求出的vT和vH算出扁平率vAB和时间率vTB。
vAB＝(vH/vB)K1(K1＝100)
vTB＝(vT/vB)K2(K2＝1)
对取得的各参数求出参数比Pb/Pa或参数差(Pb－Pa)。这里，Pa为非加温检体的参数，Pb为加温检体的参数。应予说明，根据未校正0次曲线，也同样地算出未校正1次曲线和未校正2次曲线，由这些曲线同样地算出参数，求出比Pb/Pa或差(Pb－Pa)。
实施例1因被检检体的加温所致的对1次曲线的影响
图13示出LA血浆(LA)的加温和非加温下的校正1次曲线。LA中几乎没有因加温所致的曲线形状的变化。另外，图14中示出FVIII抑制剂阳性血浆(IN)的加温和非加温下的校正1次曲线。IN中，与LA同样地几乎没有因加温所致的曲线形状的变化。
实施例2因混合检体的加温所致的对1次曲线的影响
图15的A中示出LA血浆(LA)与正常血浆的1：1混合血浆(LA－NP)的加温和非加温下的校正1次曲线。通过与正常血浆混合，与图13相比，峰较早地出现(凝固时间缩短)，形状也尖锐化。LA－NP中，与LA同样地几乎没有因加温所致的曲线形状的变化。另一方面，图15的B中示出FVIII抑制剂阳性血浆与正常血浆的1：1(IN－NP)的加温和非加温下的校正1次曲线。非加温中，通过与正常血浆混合，与图14相比，与LA－NP同样地，峰较早地出现，形状也尖锐化。另一方面，加温中，峰较慢地出现，峰高度变低并且峰宽变宽。判断该形状变化是因为在加温处理中进行IN中所含的抑制剂(抗FVIII抗体)与正常血浆中所含的FVIII的抗原抗体反应，因此，混合血浆的凝固反应被阻害。通过将该非加温与加温的形状变化作为参数的变化进行指标化，从而能够确认可将IN与LA鉴别的可能性。
对于由各被检检体制备的与正常检体的混合检体，算出与加温和非加温下的凝固反应曲线相关的参数。对得到的参数求出非加温检体的参数Pa、加温检体的参数Pb、参数比Pb/Pa和参数差Pb－Pa。
表2中示出由非加温检体和加温检体(加温10分钟)得到的各种参数值和它们的比(Pb/Pa)。FVIII抑制剂血浆的混合血浆(IN－NP(mix))的Pb/Pa大幅偏离1，与正常血浆(NP)、LA血浆(LA)、LA混合血浆(LA－NP(mix))明显不同。因此，显示出可基于各种参数的Pb/Pa来进行FVIII抑制剂阳性血浆的判定。
[表2]
关于各种参数，图18A～G示出各种血浆的非加温下的参数Pa、加温下的参数Pb、它们的比Pa/Pb和差Pb-Pa。FVIII抑制剂中效价血浆(InM)存在Pa/Pb大于1或小于1的趋势或者Pb-Pa偏离0的趋势。另一方面，FVIII抑制剂高效价血浆(InH)整体存在Pa/Pb大于1或小于1的趋势、或者Pb-Pa偏离0的趋势，但一部分参数(APTT、vT)存在Pa/Pb接近1的情况。但是，InH的APTT或vT即使在Pa/Pb约为1的情况下，Pb-Pa也不为0，至少延长5秒。因此，通过组合使用Pa与Pb的比和差，能够使用APTT或vT来判别InH。
根据图18A，对APTT示出以下的结果。应予说明，APTT的“延长”表示APTT比正常血浆长，APTT的“缩短”表示APTT是与正常血浆相同或接近其的值。
·包含LA的混合检体的Pa和Pb均延长，Pb/Pa约为1。
·包含HA和HB的混合检体的Pa和Pb均缩短，Pb/Pa约为1。
·包含InL的混合检体的Pa和Pb均缩短，Pb/Pa约为1。
·包含InM的混合检体的Pa稍微延长，Pb比Pa进一步延长，Pb/Pa大于1。
·包含InH的混合检体的Pa延长，Pb与Pa相同程度或进一步延长，Pb/Pa约为1或大于1。
将上述的结果示于表3。显示出能够基于加温和非加温下的APTT如下判别混合检体中所含的被检检体。
(1)如果Pa和Pb均延长，且Pb/Pa约为1，则被检检体为LA或InH。
(2)如果Pa和Pb均缩短，且Pb/Pa约为1，则被检检体为HAB(HA或HB)或InL。
(3)如果Pa和Pb均延长，且Pb/Pa大于1，则被检检体为InM或InH。
[表3]
另外，根据图18B，Vmax处的Pb/Pa在LA、HA、HB、InL和一部分InH中与APTT同样地约为1，另一方面，InM和除一部分以外的InH中小于1。凝固反应受到抑制剂的抑制时，根据抑制剂效价，APTT延长，并且凝固速度变小，结果，它们的参数比Pb/Pa偏离1。因此，InM和除一部分以外的InH中，APTT的Pb/Pa大于1，Vmax的Pb/Pa小于1。一部分InH即使在高效价组中也是效价高的检体(超高效价检体)，Vmax在非加温(Pa)中降低至1附近，在加温(Pb)中也几乎没有变化，因此，参数比Pb/Pa为1附近。为了在InH中判别超高效价检体，作为一个例子，只要定义为非加温(Pa)下的Vmax为2以下的检体即可。
另外，如图18C～G所示，Amax显示与Vmax同样的趋势，vB、vT显示与APTT同样的趋势，vAB和vTB显示与Vmax、Amax同样的趋势。
根据以上的结果，显示出能够基于各种参数的Pa与Pb的比、差或它们的组合来判别APTT延长因素为凝固因子抑制剂的检体。
实施例3使用参数的比或差的凝固因子抑制剂效价的算出
1)抑制剂效价与参数值的关系
使用具有不同的FVIII抑制剂效价的被检检体，通过参考例1中记载的步骤制备混合检体，求出该混合检体的Pa、Pb和Pb/Pa。调查FVIII抑制剂效价与Pb/Pa的关系性。被检检体使用InL和InM的47个检体(FVIII抑制剂效价为0.3～40.5(BU/mL))。将由各混合检体得到的各种参数的Pb/Pa相对于该混合检体中所含的被检检体的抑制剂效价的对数值的坐标图的例子示于图19的A～26的A。对于Pb/Pa的算出中使用的参数，图19的A为APTT，图20A为Vmax，图21的A为Amax，图22的A为VmaxT，图23的A为AmaxT，图24的A为vT10％，图25的A为vAB10％，图26的A为凝固时间T5。如图19的A～26的A所示，这些参数的比Pb/Pa与抑制剂效价一起增加或减少，显示出Pb/Pa与抑制剂效价具有相关关系。另一方面，在抑制剂效价低的区域和高的区域中，可见Pb/Pa的分布不同的趋势。由此表明，如果使低抑制剂效价区域和高抑制剂效价区域以不同的直线进行回归，则效价与Pb/Pa的相关性提高。
图27的A示出凝固时间T5的参数差Pb－Pa相对于该混合检体中所含的被检检体的抑制剂效价的对数值的坐标图。与Pb/Pa同样地，显示出Pa－Pb与抑制剂效价具有相关关系。
2)基于校准曲线的抑制剂效价的算出
如上所述利用参数比Pb/Pa或差Pb－Pa与经对数转换的抑制剂效价相关这种情况，使用FVIII抑制剂效价已知的检体制作校准曲线。校准曲线作成用的检体使用FVIII缺乏(HA)这1个检体和FVIII抑制剂效价为0.5、1.1、2.2、4.4、8.7、17.4、34.9(BU/mL)的校准曲线用检体(Cal)这7个检体的合计8个检体。
FVIII缺乏检体的抑制剂效价视为0.1，求出各检体的抑制剂效价的对数转换值与Pb/Pa或Pb－Pa的回归直线。此时，将检体分成抑制剂效价低的组和高的组，分别求出回归直线。作为低抑制剂效价组与高抑制剂效价组的边界的效价为2.2(BU/mL)。将制作的校准曲线的例子示于图19的B～图27的B。使用的参数分别与A图相同。任一校准曲线均为由2个直线构成的折线。
基于制作的校准曲线，由参数比Pb/Pa或差Pb－Pa算出被检检体的FVIII抑制剂效价(的推测值)。图19的C～图27的C是基于校准曲线的运算值相对于各被检检体的抑制剂效价的实测值的坐标图。图19的D～图27的D是仅使用C图的实测值20BU/mL以下的数据进行再标绘而得的图。
表4～5中示出基于使用各种参数的比Pb/Pa制作的校准曲线的运算效价(y)相对于实测效价(x)的回归式的斜率和截距，以及相关系数。表4表示来自有校正的曲线(校正0次～2次曲线)的参数，表5表示来自无校正的曲线(未校正0次～2次曲线)的参数。进行，将它们中的显示高相关性的参数示于表6。另外，表7中示出基于使用各种参数的差Pb－Pa制作的校准曲线的运算效价(y)相对于实测效价(x)的回归式的斜率和截距，以及相关系数。表7示出来自有校正的曲线(校正0次～2次曲线)的参数和来自无校正的曲线(未校正0次～2次曲线)的参数。进而，将它们中显示高相关性的参数示于表8。
[表4]
基于来自有校正的曲线的参数比Pb/Pa的运算值相对于实测值的回归式
[表5]
基于来自无校正的曲线的参数比Pb/Pa的运算值相对于实测值的回归式
[表6]
基于Pb/Pa的回归式具有斜率：1±0.2以内、截距：±3以内、相关系数：0.8以上的参数
基于Pb/Pa的回归式具有斜率：1±0.1以内、截距：±3以内、相关系数：0.9以上的参数
A：有校正处理、无校正处理这两者
B：有校正处理
C：无校正处理
[表7]
基于参数差Pb-Pa的运算值相对于实测值的回归式
[表8]
基于Pb-Pa的回归式具有斜率：1±0.2以内、截距：±3以内、相关系数：0.8以上的参数
基于Pb-Pa的回归式具有斜率：1±0.1以内、截距：±3以内、相关系数：0.9以上的参数
A：有校正处理、无校正处理这两者
B：有校正处理
C：无校正处理
表9～10中示出基于使用与表4～5的参数不同的各种参数的比Pb/Pa制作的校准曲线的运算效价(y)相对于实测效价(x)的回归式的斜率和截距，以及相关系数。表9表示来自校正1次曲线的参数，表10表示来自未校正1次曲线的参数。进而，将它们中的显示高相关性的参数示于表11。
[表9]
基于来自校正1次曲线的参数比Pb/Pa的运算值相对于实测值的回归式
[表10]
基于来自未校正1次曲线的参数比Pb/Pa的运算值相对于实测值的回归式
[表11]
基于Pb/Pa的回归式具有斜率：1±0.2以内、截距：±3以内、相关系数：0.8以上的参数
基于Pb/Pa的回归式具有斜率：1±0.1以内、截距：±3以内、相关系数：0.9以上的参数
A：有校正处理、无校正处理这两者
B：有校正处理
C：无校正处理
实施例5高抑制剂效价检体的基于检体稀释的抑制剂效价的算出
对于抑制剂效价高于实施例3中求出的校准曲线的效价范围的高抑制剂效价检体，使用稀释检体实施基于使用与上述同样的参数的校准曲线的效价运算，通过其结果乘以稀释倍率而求出运算效价。
具体而言，作为被检检体，使用抑制剂效价为99、113、166、253和259(BU/mL)的InH的5个检体。将该被检检体利用正常血浆稀释10倍，将该10倍稀释检体与正常血浆以容量比1∶1混合而制备混合检体。通过与参考例1同样的步骤求出该混合检体的Pa、Pb和Pb/Pa，基于实施例3中使用的校准曲线而算出稀释检体的运算效价，通过该运算效价乘以稀释倍率而求出被检检体的运算效价。将该结果与InL和InM的47个检体的结果相结合。图28是InL和InM的47个检体的运算效价和上述求出的5个检体的InH的运算效价相对于实测效价的坐标图。各坐标图的下方示出运算效价与实测效价的回归式和相关系数。任一参数均可得到良好的相关关系，确认了能够通过检体稀释处理来进行高效价检体的测定。
Claims (13)
1.一种方法，是凝固因子抑制剂的效价的测定方法，包括：
制备包含被检血液检体和正常血液检体的混合检体，
将该混合检体加温，取得关于该加温后的混合检体的凝固反应曲线，
取得未受该加温的该混合检体的凝固反应曲线，
算出与未受该加温的该混合检体的凝固反应曲线相关的参数作为第1参数，
算出与该加温后的混合检体的凝固反应曲线相关的参数作为第2参数，
基于该第1参数与第2参数的比或差而算出该被检血液检体的凝固因子抑制剂的效价。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，与所述凝固反应曲线相关的参数为与所述凝固反应曲线相关的参数、与该凝固反应曲线的一次微分曲线相关的参数以及与该凝固反应曲线的二次微分曲线相关的参数中的至少1种参数。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述参数为与所述一次微分曲线或二次微分曲线的规定区域的加权平均分有关的参数。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述加权平均分为由加权平均时间vT和加权平均高度vH规定的坐标(vT,vH)表示的所述1次微分曲线的加权平均分，
在将该1次微分曲线设为F(t)、将F(t)为规定值X的时间设为t1、t2时，该vT和该vH由下述式表示，其中，t为时间，t1＜t2，
这里，
并且
与该加权平均分有关的参数包含选自该vT、该vH、峰宽vB、加权平均峰宽vW、B扁平率vAB、B时间率vTB、W扁平率vAW、W时间率vTW、平均时间vTa、平均高度vHa、vTm、vABa和vAWa中的1个以上的参数，
该峰宽vB为从该t1到t2中的F(t)≥X的时间长度，
该加权平均峰宽vW为从所述t1到t2的F(t)≥vH的时间长度，
该vAB表示该vH与该vB的比，
该vTB表示该vT与该vB的比，
该vAW表示该vH与该vW的比，
该vTW表示该vT与该vW的比，
F(t)、t1和t2为与所述F(t)、t1和t2相同的定义，在将从F(t1)到F(t2)的数据分数设为n时，该vTa、该vHa和该vTm分别由下述式表示，
该vABa表示该vHa与该vB的比，
该vAWa表示该vHa与该vW的比。
5.根据权利要求3所述的方法，其中，所述加权平均分为由加权平均时间pT和加权平均高度pH规定的坐标(pT,pH)表示的所述2次微分曲线的正峰的加权平均分，
在将该2次微分曲线设为F'(t)、将F'(t)为规定值X的时间设为t1、t2时，该pT和该pH由下述式表示，其中，t为时间，t1＜t2，
这里，
与该加权平均分有关的参数包含选自该pT、该pH、峰宽pB、加权平均峰宽pW、B扁平率pAB、B时间率pTB、W扁平率pAW和W时间率pTW中的1个以上的参数，
该峰宽pB为从该t1到t2中的F'(t)≥X的时间长度，
该加权平均峰宽pW为从所述t1到t2的F'(t)≥pH的时间长度，
该pAB表示该pH与该pB的比，
该pTB表示该pT与该pB的比，
该pAW表示该pH与该pW的比，
该pTW表示该pT与该pW的比。
6.根据权利要求3所述的方法，其中，所述加权平均分为由加权平均时间mT和加权平均高度mH规定的坐标(mT,mH)表示的所述2次微分曲线的负峰的加权平均分，
在将该2次微分曲线设为F'(t)、将F'(t)为规定值X的时间设为t1、t2时，该mT和该mH由下述式表示，其中，t为时间，t1＜t2，
这里，
并且
与该加权平均分有关的参数包含选自该mT、该mH、峰宽mB、加权平均峰宽mW、B扁平率mAB、B时间率mTB、W扁平率mAW和W时间率mTW中的1个以上的参数，
该峰宽mB为从该t1到t2中的F'(t)≤X的时间长度，
该加权平均峰宽mW为从所述t1到t2的F'(t)≤mH的时间长度，
该mAB表示该mH与该mB的比，
该mTB表示该mT与该mB的比，
该mAW表示该mH与该mW的比，
该mTW表示该mT与该mW的比。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，基于校准曲线，由所述第1参数与第2参数的比或差算出所述被检血液检体的凝固因子抑制剂的效价。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，所述凝固因子为凝血因子VIII。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，所述混合检体以1：9～9：1的容量比包含所述被检血液检体和所述正常血液检体。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，进一步包括：将所述被检血液检体在与所述正常血液检体混合前进行稀释，或者将制备的所述混合检体进行稀释。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的方法，其中，所述混合检体的加温在30℃以上且40℃以下进行2～30分钟。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的方法，其中，所述被检血液检体是由于所述凝固因子抑制剂的存在而显示APTT延长的血液检体。
13.根据权利要求1～12中任一项所述的方法，其中，所述凝固因子抑制剂的效价以贝提斯达单位算出。
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN114324218A (zh) * | 2022-03-07 | 2022-04-12 | 深圳市帝迈生物技术有限公司 | 样本纤维蛋白原浓度确定方法、装置、凝血分析仪和介质 |
| CN114324218B (zh) * | 2022-03-07 | 2022-08-09 | 深圳市帝迈生物技术有限公司 | 样本纤维蛋白原浓度确定方法、装置、凝血分析仪和介质 |
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