WO2020075424A1 - 免疫賦活剤及び感染予防方法 - Google Patents

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WO2020075424A1
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glucan
mass
yeast
less
immunostimulant
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建史 白井
淳平 吉田
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アサヒグループホールディングス株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to an immunostimulant and a method for preventing infection.
  • Japanese Patent Publication No. 2017-511122 discloses a method of treating a yeast cell wall to obtain ⁇ -glucan soluble in dimethylsulfoxide.
  • JP-A-2009-263333 describes a composition containing selenium-enriched yeast and ⁇ -glucan and is said to have an immunostimulatory action.
  • JP 2004-099580 A describes an immune enhancing composition prepared by subjecting yeast cells to autolysis.
  • Japanese Unexamined Patent Publication No. 2003-169607 describes a feed for breeding fish and shellfish to which a yeast-decomposing composition obtained by autolyzing yeast is added, and it is said that the immune activity is improved.
  • an aspect of the present invention is to provide an immunostimulant containing glucan and having an immunostimulatory effect.
  • the first aspect of the present invention comprises a glucan derived from a yeast cell wall and a lipid, the total content of the glucan and the lipid is 80% by mass or more, and the content ratio of the lipid to the glucan is 0.1 or more and 0.4 or less. And is a water-insoluble immunostimulant.
  • the content ratio of ⁇ -glucan to ⁇ -glucan may be 0.2 or more and 0.85 or less.
  • the immunostimulant may contain mannan, and the content ratio of mannan may be 5% by mass or less.
  • the immunostimulant may be used against fish.
  • the second aspect is a food or drink or feed containing the immunostimulant.
  • a third aspect is an agent for preventing infection of fish, which contains glucan and lipid and has a total content of glucan and lipid of 80% by mass or more.
  • a fourth aspect is a method for preventing infection, which comprises administering the immunostimulant to a subject.
  • a fifth aspect is to prepare a composition containing the yeast cell wall that has been subjected to autolysis, obtain a hydrolyzate by subjecting the composition containing the yeast cell wall to alkaline hydrolysis, and recover glucan from the hydrolyzate.
  • a method for producing a yeast-derived glucan comprising:
  • a composition containing a yeast cell wall is obtained by a method including autolyzing yeast to obtain an autolysate, and subjecting the autolysate to centrifugation.
  • an alkali hydrolysis process is performed by heating in the presence of an alkali metal hydroxide.
  • the yeast-derived glucan has a mannan content of 5% by mass or less.
  • the yeast-derived glucan has a protein content of 10% by mass or less.
  • the yeast-derived glucan has a coefficient of variation in glucan content of 10% or less.
  • an immunostimulant containing glucan and having an immunostimulatory effect.
  • 5 is a graph showing the ability of porcine leukocytes to promote the production of reactive oxygen species.
  • 3 is a graph showing the ability to promote the production of reactive oxygen species on human neutrophil-like cells. It is a graph which shows the survival rate of the Vibrio disease infection test with respect to rainbow trout.
  • the term “process” is included in this term as long as the intended purpose of the process is achieved not only as an independent process but also when it cannot be clearly distinguished from other processes. .
  • the content of each component in the composition when there are a plurality of substances corresponding to each component in the composition, unless otherwise specified, means the total amount of the plurality of substances present in the composition .
  • the content of each component is a value in terms of dry matter of the immunostimulant, and may be an average value.
  • the content is taken as an average value in consideration of variations between manufacturing lots, and is, for example, an arithmetic average value of 6 or more samples arbitrarily selected.
  • the upper limit of the number of samples for calculating the average value is, for example, 20 or less.
  • the immunostimulant contains glucan and lipid, and the total content of glucan and lipid is 80% by mass or more.
  • the immunostimulant according to the present embodiment has good quality stability and a clear immunostimulatory effect. This not only is expected to suppress the morbidity and progression of infectious diseases in livestock, humans, cultured fish, etc., but can also provide a means for reducing the threat of drug-resistant bacteria development.
  • the glucan and lipid constituting the immunostimulant are preferably derived from, for example, the yeast cell wall and obtained by hydrolyzing the yeast cell wall.
  • the hydrolysis treatment includes alkali hydrolysis and acid hydrolysis.
  • the glucan that constitutes the immunostimulant is a polymer in which D-glucose is linked by a glycoside bond, and includes ⁇ -glucan and ⁇ -glucan.
  • ⁇ -Glucan has, for example, a ⁇ -1,3-bonded straight-chain main chain skeleton and a ⁇ -1,6-bonded side chain for branching.
  • the ⁇ -glucan has, for example, a linear main chain skeleton of ⁇ -1,4 bond and a side chain branched by ⁇ -1,6 bond.
  • the total content of glucan in the immunostimulant is, for example, 60% by mass or more, preferably 65% by mass or more, more preferably 70% by mass or more, and, for example, 90% by mass or less, preferably 85% by mass or less. It is not more than 80% by mass, more preferably not more than 80% by mass.
  • the content of ⁇ -glucan in the immunopotentiator is, for example, 30% by mass or more, preferably 35% by mass or more, or 40% by mass or more, and for example, 65% by mass or less, preferably 60% by mass. % Or less, or 50% by mass or less.
  • the content of ⁇ -glucan is, for example, 10% by mass or more, preferably 15% by mass or more, or 20% by mass or more, and for example, 40% by mass or less, preferably 35% by mass or less. Or 30% by mass or less.
  • the ratio of the ⁇ -glucan content to the ⁇ -glucan content in the immunostimulant is, for example, 0.2 or more and 0.85 or less, preferably 0.25 or more, 0.3 or more, 0.4 or more, 0 It is 0.45 or more, or 0.5 or more, and preferably 0.8 or less, 0.7 or less, or 0.6 or less.
  • the content ratio of ⁇ -glucan to ⁇ -glucan is within the above range, the immunostimulatory activity tends to be further enhanced.
  • the lipid in the immunostimulant includes a simple lipid formed by the ester bond of alcohol and a fatty acid, a complex lipid that is a lipid containing phosphate, sugar, protein, etc. in the molecule, and a simple lipid or a complex lipid by hydrolysis. Included are derived lipids that are derived.
  • the total content of lipids in the immunostimulant is, for example, 3% by mass or more, preferably 5% by mass or more, or 10% by mass or more, and for example, 20% by mass or less, preferably 16% by mass. Or less, or 14 mass% or less. When the lipid content is within the above range, the immunostimulatory activity tends to be enhanced.
  • the total content of glucan and lipid in the immunostimulant is 80% by mass or more, preferably 82% by mass or more. Further, for example, it is 95 mass% or less, preferably 90 mass% or less, or 88 mass% or less. When the total content of glucan and lipid is within the above range, the immunostimulatory activity tends to be further enhanced.
  • the ratio of the total content of lipids to the total content of glucans in the immunostimulant is, for example, 0.1 or more and 0.4 or less, preferably 0.12 or more, or 0.15 or more, and, for example, It is 0.3 or less, preferably 0.25 or less, or 0.2 or less.
  • the content ratio of lipid to glucan is within the above range, the immunostimulatory activity tends to be further enhanced.
  • the immunostimulant may further contain mannan in addition to glucan and lipid.
  • Mannan is a polysaccharide whose main constituent unit is D-mannose.
  • the content of mannan is, for example, 5% by mass or less, preferably 3% by mass or less, or 1.2% by mass or less, and for example, 0.1% by mass or more. And preferably 0.2% by mass or more, or 0.3% by mass or more.
  • the mannan content is in the above range, the immunostimulatory activity tends to be further enhanced.
  • the ratio of the total content of mannan to the total content of glucan in the immunostimulant is, for example, 0.004 or more and 0.05 or less, preferably 0.005 or more, or 0.008 or more, and preferably It is 0.02 or less, or 0.018 or less.
  • the immunostimulant may further contain protein in addition to glucan and lipid.
  • the protein content is, for example, 10% by mass or less, preferably 8% by mass or less, or 6% by mass or less, and for example, 1% by mass or more, preferably Is 2% by mass or more, or 3% by mass or more.
  • the immunostimulatory activity tends to be further enhanced.
  • the ratio of the total content of mannan and protein to the total content of glucan in the immunostimulant is, for example, 0.01 or more and 0.2 or less, preferably 0.02 or more, or 0.05 or more, and It is preferably 0.1 or less, or 0.09 or less.
  • the immunostimulant may further contain ash.
  • the ash content is, for example, 10 mass% or less, preferably 6 mass% or less, or 4 mass% or less, and for example, 1 mass% or more, preferably Is 1.5% by mass or more, or 2% by mass or more.
  • the immunostimulatory activity tends to be further enhanced.
  • the content of each component of the immunostimulant can be measured by a conventional method.
  • the content of glucan can be measured by quantifying glucose produced by hydrolyzing glucan.
  • the content of lipid can be quantified by an acid decomposition method.
  • Immunosuppressant has excellent quality stability.
  • the stability of the quality of the immunostimulant can be evaluated, for example, by the variation in the content rate of each component due to the difference in the production lot. Specifically, the variation coefficient (%) of the content rate of each component is evaluated.
  • the coefficient of variation (%) is calculated by calculating the content ratio of each component of the immunostimulant for 6 or more arbitrarily selected samples, calculating the arithmetic mean value and standard deviation of the content ratio, and calculating the standard deviation. Calculated as a percentage of the value divided by the average value.
  • the coefficient of variation (%) of the total content of glucan in the immunostimulant is, for example, 10% or less, preferably 8% or less, or less than 5%.
  • the coefficient of variation (%) of the lipid content is, for example, 20% or less, preferably 15% or less, or 8% or less. Further, the coefficient of variation (%) of the total content of glucan and lipid is, for example, 6% or less, preferably 5% or less, or less than 5%. The lower limit of the coefficient of variation is 0%, but it is substantially larger than 0%.
  • the immunostimulant may further contain a known component having an immunomodulatory action in addition to the main components glucan and lipid.
  • a known component having an immunomodulating action examples include bean tea extract, fucoidan, arabinoxylan, lactoferrin, catechin, chitosan, chitosan oligosaccharide, chitin oligosaccharide, L-ascorbic acid, coenzyme Q 10 (including reduced form) and the like. be able to.
  • the immunostimulant if necessary, usually any component known to be used in medicines, foods, feeds, etc., for example, water, fats, sugars, vitamins, sweeteners, seasonings, sourness.
  • Preservatives, preservatives, fragrances, colorants, excipients, fillers, binders, thickeners, stabilizers, emulsifiers, pH adjusters and the like can be added.
  • the form of the immunostimulant may be any of solids such as powder and granules, liquid, paste and the like.
  • the dosage form of the immunostimulant can be appropriately selected depending on the administration method, administration subject, and the like.
  • examples of the dosage form include tablets, capsules, granules, troches, powders, liquid preparations and the like for oral administration.
  • These formulations can be produced according to a known method using additives such as an excipient, a lubricant, a binder, a disintegrant, a stabilizer, a flavoring agent and a diluent.
  • an immunostimulant may be contained to form food compositions such as health foods and health supplements, beverage compositions, feeds and the like.
  • an immunostimulant When an immunostimulant is administered to an administration subject such as a vertebrate, it exerts an immunostimulatory action on the subject. This can suppress the onset of infectious disease in the subject. That is, the immunostimulant can be applied to a method for preventing a target infectious disease.
  • the vertebrate to be administered include mammals, birds, fish and the like. Mammals may include humans and may be non-human mammals. Examples of mammals other than humans include pets such as pigs, cows, horses, sheep, monkeys, dogs, and cats. Examples of birds include meat chickens, layer chickens, turkeys, ducks, pigeons and the like. Examples of the fish include salmon, trout, yamame trout, charr, salmon, etc. salmonidae, carp, crucian carp, tilapia, catfish, perch, yellowtail, amberjack, yellowtail, flounder, Thailand, tuna, eel and the like.
  • an amount of 1 mg to 500 mg (dry weight) / kg body weight per time can be orally administered once to several times a day.
  • 0.1 to 1 g can be added per 100 g of food and drink and feed.
  • the immunostimulant When the immunostimulant is administered as a feed, for example, for mammals, birds, and fish, a mixture of 0.001% by mass or more and 1% by mass or less with respect to the food to be administered is mixed once to several times a day. It can be administered once.
  • the immunostimulant can be produced, for example, by the following production method using yeast cell wall as a raw material.
  • the method for producing an immunopotentiator includes, for example, a hydrolysis step of hydrolyzing a yeast cell wall with an aqueous acid solution or an aqueous alkali solution to obtain a hydrolyzate, and a recovery step of recovering a glucan-containing composition from the hydrolyzate.
  • the immunostimulant may be a composition containing yeast-derived glucan.
  • the yeast cell wall provided for the hydrolysis step here may be pretreated in the pretreatment step.
  • the pretreatment step is an auto-digestion step of self-digesting yeast as a raw material to obtain an auto-digestion product, a hot-water extraction step of hot-water extraction of yeast as a raw material to obtain a hot-water extract, and a yeast as a raw material as an enzyme.
  • a pre-decomposition step such as an enzyme treatment step for obtaining an enzyme-treated product by treatment, a first centrifugation step for centrifuging a pre-decomposition product such as an autolysate, a hot water extract, an enzyme-treated product to obtain a yeast cell wall included.
  • yeasts such as Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Pichia, and Torulopsis, and at least one selected from the group consisting of these.
  • yeasts belonging to the genus Saccharomyces is more preferable.
  • yeasts belonging to the genus Saccharomyces include Saccharomyces cerevisiae, S. cerevisiae, S. pastorianus, and S. bayanus, and at least one selected from the group consisting of these. It may be a seed.
  • the yeast is also called beer yeast, whiskey yeast, shochu yeast, baker's yeast, wine yeast, sake yeast, bioethanol yeast, etc., depending on its use, and may be at least one selected from the group consisting of these.
  • the yeast as a raw material may be used alone or in combination of two or more.
  • yeast proteins and the like are decomposed by the yeast's own protease, etc.
  • the self-digestion step is performed, for example, for 1 hour or more and 48 hours or less by adjusting the pH to 2 to 7 and the temperature to 40 ° C or more and 65 ° C or less.
  • the autolysate is centrifuged to obtain a fraction containing the yeast cell wall as heavy liquid.
  • a nozzle type centrifuge, an intermittent discharge type centrifuge, a Sharpless type centrifuge or the like can be used, and as long as the insoluble component in the autolysate can be recovered, the conditions of centrifugation Can be adjusted appropriately.
  • the yeast cell wall is hydrolyzed using, for example, an alkaline aqueous solution to obtain a hydrolyzate.
  • an alkaline aqueous solution for example, an aqueous solution containing an alkali metal hydroxide such as sodium hydroxide is used.
  • the concentration of the alkaline aqueous solution is, for example, 0.01% by mass or more and 10% by mass or less, preferably 0.1% by mass or more and 5% by mass or less, and more preferably 1% by mass or more and 3% by mass or less.
  • the temperature of the hydrolysis treatment is, for example, 70 ° C. or higher and 100 ° C. or lower, preferably 85 ° C. or higher and 95 ° C. or lower.
  • the time for the hydrolysis treatment is, for example, 1 hour or more and 48 hours or less, preferably 4 hours or more and 24 hours or less.
  • the recovering step includes, for example, a neutralizing step of neutralizing the hydrolyzate to obtain a neutralized product if necessary, and a second centrifugation to centrifuge the neutralized product or the hydrolyzate to obtain a glucan-containing composition. It includes a separation step and a drying step of drying the glucan-containing composition.
  • an acidic compound is added to the alkali hydrolyzate to adjust the pH to 6.5 to 7.5 to obtain a neutralized product.
  • the acidic compound inorganic acids such as hydrochloric acid, nitric acid, sulfuric acid and phosphoric acid, and organic acids such as formic acid and acetic acid are used.
  • the neutralized product is centrifuged to obtain a glucan-containing composition as a heavy liquid.
  • the glucan-containing composition is dried to obtain an immunostimulant.
  • a spray dryer, a freeze dryer, a drum dryer or the like can be used in industrial production, and the conditions can be appropriately adjusted.
  • a sterilization step of sterilizing the glucan-containing composition may be provided before the drying step.
  • the sterilization step can be performed, for example, by using a UHT sterilizer for heat treatment at 120 ° C. or higher for 10 seconds to 60 seconds, but can be appropriately adjusted so as to match the desired quality.
  • a method for producing yeast-derived glucan according to the present embodiment is a preparatory step of preparing a composition containing a self-digested yeast cell wall, and an alkaline hydrolysis treatment of the composition containing a yeast cell wall.
  • the method includes a hydrolysis step of obtaining a hydrolyzate and a recovery step of recovering glucan from the hydrolyzate.
  • the yeast-derived glucan obtained by subjecting the yeast cell wall obtained by subjecting the yeast cell to autolysis to alkaline hydrolysis exhibits good quality stability, and variation in quality between production lots is suppressed.
  • the yeast-derived glucan produced has sufficient recovery of glucan, but impurities such as mannan and protein are sufficiently removed.
  • the method for producing yeast-derived glucan may be a method for purifying yeast-derived glucan.
  • a composition containing the yeast cell wall that has been subjected to autolysis is prepared.
  • the composition containing the yeast cell wall may be appropriately selected and prepared from commercially available products, or the composition containing the yeast cell wall having a desired constitution may be produced and prepared.
  • the yeast as a raw material is as described above.
  • the composition containing the yeast cell wall is obtained by, for example, a method including an autolysis step of subjecting a yeast cell as a raw material to autolysis to obtain an autolysis product, and a first centrifugation step of centrifuging the autolysis product. It can be manufactured.
  • the details of the autolysis step and the first centrifugation step are as described above.
  • the yeast cells as a raw material may be purified before the autolysis step.
  • the purification treatment includes, for example, removing contaminants by sieving the yeast cells as a raw material with a vibrating sieve, and washing under alkaline conditions of pH 9 to 11.
  • the yeast cell wall is hydrolyzed using an alkaline aqueous solution to obtain a hydrolyzate.
  • the details of the hydrolysis step are as described above.
  • glucan is recovered from the hydrolyzate.
  • the glucan obtained in the collecting step is obtained, for example, as a glucan-containing composition.
  • the details of the recovery process are as described above.
  • the yeast-derived glucan production method achieves good glucan recovery rates and excellent mannan and protein removal rates.
  • the glucan recovery rate is calculated by dividing the total amount of glucan contained in the obtained yeast-derived glucan by the total amount of glucan contained in the composition containing the yeast cell wall subjected to autolysis. Further, the removal rate of mannan, the total amount of mannan contained in the composition containing the yeast cell wall subjected to self-digestion treatment, the removal amount obtained by subtracting the total amount of mannan contained in the obtained yeast-derived glucan, the self-digestion treatment It is calculated by dividing by the total amount of mannan contained in the composition containing the yeast cell wall. The same applies to the removal rate of proteins and the like.
  • the recovery rate of glucan in the method for producing yeast-derived glucan is, for example, 65% or more, preferably 70% or more, or 75% or more.
  • the upper limit of the glucan recovery rate is, for example, 95% or less, preferably 90% or less, or 85% or less.
  • the removal rate of mannan in the method for producing yeast-derived glucan is, for example, 85% or more, preferably 90% or more, or 95% or more.
  • the upper limit of the mannan removal rate is, for example, 100% or less, preferably less than 100%.
  • the protein removal rate in the method for producing yeast-derived glucan is, for example, 80% or more, preferably 85% or more, or 90% or more.
  • the upper limit of the protein removal rate is, for example, 100% or less, preferably less than 100%, or 98% or less.
  • the present invention includes an immunostimulatory method comprising administering an immunostimulant or a yeast-derived glucan to a subject.
  • an immunostimulant or a yeast-derived glucan in the production of a composition used in an immunostimulatory method or a method for preventing an infectious disease, an immunostimulant in an immunostimulatory method or a method for preventing an infectious disease.
  • it also includes an immunostimulant or a yeast-derived glucan used in the use of a yeast-derived glucan, an immunostimulatory method or a method for preventing an infectious disease.
  • the subject of the immunostimulatory method or the infectious disease prevention method may be the vertebrate described above, and includes mammals, birds, fish and the like.
  • Tochigi Koganei factory produced yeast cell wall derived from brewer's yeast belonging to the genus Saccharomyces (solid content 15%; derived from yeast autolysate), which was subjected to hydrolysis treatment I served. Specifically, sodium hydroxide is added to a slurry containing yeast cell walls so that the final concentration is about 1.5% by mass or about 2.0% by mass, and the mixture is heated at 90 ° C. for hydrolysis for 4 hours. Processed.
  • the treated yeast cell wall slurry was adjusted to pH 7.0 with hydrochloric acid and then subjected to batch type centrifugation at 8,000 g ⁇ 10 minutes using a high-speed cooling centrifuge (Avanti J-26S XP manufactured by BECKMAN COULTER). 1.5 L of distilled water was added to the precipitate, and the precipitate was suspended and then centrifuged under the above conditions. This operation was repeated 4 times, and the precipitate was dried for 2 nights or more with a freeze dryer (FDU-2100 manufactured by EYELA) to obtain an immunostimulant.
  • a freeze dryer FDU-2100 manufactured by EYELA
  • Tochigi Koganei factory produced yeast cell wall derived from brewer's yeast belonging to the genus Saccharomyces (solid content 15%; derived from yeast autolysate), which was subjected to hydrolysis treatment I served. Specifically, sodium hydroxide is added to a slurry containing yeast cell walls so that the final concentration is about 1.5% by mass or about 2.0% by mass, and the mixture is heated at 90 ° C. for hydrolysis for 4 hours. Processed.
  • the yeast cell wall slurry after the treatment was adjusted to pH 7.0 with hydrochloric acid, and then solid-liquid separated while adding water with a nozzle type continuous centrifuge (FEUX512T-31C-50 and FEUX412U-31C-50 manufactured by Alfa Laval).
  • the heavy liquid was sterilized under the conditions of 130 ° C. for 40 seconds and then dried in a drum dryer to obtain an immunostimulant.
  • Glucan analysis method 1 About 0.6 g of the sample was weighed, 4 mL of 72 (w / w)% sulfuric acid was added, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. Thereafter, the sulfuric acid concentration was adjusted to 4 (w / w)% using Milli-Q (registered trademark) water, and the mixture was reacted at 121 ° C. for 1 hour. After cooling, it was neutralized with an aqueous sodium hydroxide solution. After constant volume, filtration was performed and the filtrate was subjected to HPLC.
  • the injection volume was 0 mL / min and the injection volume was 2 ⁇ L.
  • As a reaction solution a mixed solution of 1 (w / v)% arginine and 3 (w / v)% boric acid was added at 0.7 mL / min. And then reacted at 150 ° C., and glucose was detected using a fluorescence detector (excitation wavelength 320 nm, measurement wavelength 430 nm). The total glucose content was calculated by multiplying the obtained glucose content by 0.9.
  • Glucan analysis method 2 Approximately 0.5 g of the sample was weighed, 25 ml of 0.08 mol / l phosphate buffer (pH 6.0) was added, and 0.1 ml of Termamyl 120 L (Novozymes) was added and reacted in a boiling water bath for 30 minutes. . After cooling, the pH was adjusted to 7.5 ⁇ 0.1 using a 0.275 mol / l sodium hydroxide solution, and a protease (Sigma Aldrich, P-5380) was allowed to act at 60 ° C for 30 minutes.
  • the content rate of ⁇ -glucan was calculated by subtracting the content rate of ⁇ -glucan from the total content rate of glucan obtained by analysis method 1.
  • Lipid analysis method The amount was determined by the acid decomposition method. To the collected sample, 2 ml of ethanol and 10 ml of concentrated hydrochloric acid were added, and the sample was decomposed in a thermostat at 70 ° C to 80 ° C for 30 minutes to 40 minutes. Thereafter, the sample was transferred to a Majorian tube, ethanol and diethyl ether were mixed, and petroleum ether was further mixed. The ether layer was recovered, and a mixed solution of diethyl ether / petroleum ether was further added to the aqueous layer for partitioning. The ether layer was recovered, the aqueous layer was again partitioned using diethyl ether and petroleum ether, and the ether layer was recovered. After distilling off diethyl ether / petroleum ether, it was dried at 105 ° C. for 1 hour, and the weight difference before and after drying was taken as the lipid amount, and the lipid content was calculated from the sampled amount.
  • Mannan analysis method About 0.6 g of a sample was weighed, 4 ml of 72 (w / w)% sulfuric acid was added, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. Then, Milli-Q (registered trademark) water was added so that the sulfuric acid concentration became 4 (w / w)%, and hydrolysis was performed at 121 ° C. for 1 hour. After allowing to cool, the mixture was neutralized and adjusted to a constant volume, and the content of mannose in the filtrate was quantified in the same manner as in the above-mentioned glucan analysis method. The mannose concentration in the sample was calculated and multiplied by 0.9 to calculate the mannan content.
  • Protein analysis method The content of protein in the sample was quantified by the combustion method.
  • a total nitrogen measuring device (Sumika Chemical Analysis Center) was used for the analysis.
  • a sample was taken in a quartz boat, the temperature of the reaction furnace was set to 870 ° C. or higher, the temperature of the reduction furnace was set to 600 ° C., the temperature of the detector was set to 100 ° C., and the temperature of the column was set to 70 ° C. for analysis.
  • the detected nitrogen gas was quantified and multiplied by a nitrogen / protein conversion coefficient of 6.25 to calculate the protein content.
  • the content of ash in the sample was quantified by the direct ashing method.
  • a sample was taken in a porcelain crucible and pre-ashed. Then, ashing was performed at 550 ° C. After allowing to cool in a silica gel desiccator, it was weighed. The difference in weight before and after ashing was taken as the ash content, and the ash content was calculated from the sampled amount.
  • Table 1 shows the results of component analysis of 14 samples of the immunostimulant obtained by the above production method.
  • the content of each component shown in Table 1 is a dry matter conversion value of the immunostimulant calculated on a mass basis.
  • the content of glucan in Table 1 is the total content of ⁇ -glucan and ⁇ -glucan, and so on.
  • the immunostimulant had an average total content of lipids and glucan of 80% by mass or more, and the content variation among samples was small.
  • the average value of the total content of lipids and glucan in the commercial product A was less than 80% by mass, and the variation among the samples was large.
  • the immunostimulant obtained above and the commercially available product A were evaluated for their ability to promote the production of reactive oxygen species (ROS) against white blood cells.
  • ROS reactive oxygen species
  • Monocytes were fractionated from peripheral blood collected from 10-week-old weaned piglets. Specifically, peripheral blood mononuclear cells (PBMC) suspended in RPMI1640 medium containing 10% fetal bovine serum were seeded in a 96-well plate at 2 ⁇ 10 6 cells / well, and then cultured for 2 hours. The monocytes were attached and fixed in the wells by. After removing the culture supernatant and washing with HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution) to remove lymphocytes, the immunostimulant (# 5, # 6) or commercial product A was added at a final concentration of 100 ⁇ g / mL to 400 ⁇ g / mL.
  • HBSS Horts' Balanced Salt Solution
  • the luminescent reagent (luminol) and HBSS were added to each well so that the amount of the solution became mL. Then, the integrated luminescence amount for 120 minutes was measured with a luminometer (ThermoFisher Scientific). Only the luminescent reagent (luminol) and HBSS were added to the negative control, and the relative luminescence unit (RLU) was evaluated as the ROS production amount. For the positive control, phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) was added together with the luminescent reagent (luminol) and HBSS so that the concentration was 50 ⁇ g / mL. The results are shown in FIG.
  • Human leukocyte cell line HL- according to the method of Collins et al. (Collins SJ, Ruscetti FW, Gallagher RE, Gallo RC, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 2458-2462, 1978). 60 was cultured in RPMI1640 medium containing 1.25 vol% dimethyl sulfoxide and 10% fetal bovine serum for 6 days to induce neutrophil-like differentiation. Neutrophil-like HL-60 suspended in the above-mentioned medium was seeded on a 96-well plate at 4 ⁇ 10 5 cells / well, and then adhered and fixed in the well by culturing for 1 hour to give an immunostimulant.
  • the immunostimulant # 14 of the present invention produced more ROS than the commercial product A at all addition concentrations from 100 ⁇ g / mL to 800 ⁇ g / mL.
  • the total content of glucan and lipid in the immunostimulant # 14 used at this time was 83.8% by mass.
  • Vibrio Disease Infection Test of Rainbow Trout Twenty-five rainbow trout with an average body weight of 2 g were respectively bred with a feed spread so that the final concentration of the immunostimulant # 4 or the commercial product A was 0.2% by mass. Seven days after the start of breeding, 0.05 mL of Vibrio anguillarum bacterium diluted with PBS to 9 ⁇ 10 4 cfu / mL was intraperitoneally injected into the rainbow trout to perform infection treatment. After that, breeding was continued for 10 days, and the survival rate was calculated every day. The results are shown in Fig. 3. In FIG. 3, the vertical axis represents the survival rate (%), and the horizontal axis represents the number of days elapsed after infection treatment.
  • the survival rate on the 7th day after injection was 64% for the negative control (untreated), 76% for the immunostimulant administration group, and 68% for the commercial product A administration group.
  • the total content of glucan and lipid in the immunostimulant # 4 used at this time was 81.3% by mass.
  • the immunostimulant of the present invention showed higher survival rate than the commercially available immunostimulant.

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Abstract

グルカンを含有し、免疫賦活効果を有する免疫賦活剤を提供する。免疫賦活剤は、酵母細胞壁に由来するグルカンと脂質とを含み、グルカンと脂質の総含有率が８０質量％以上であり、グルカンに対する脂質の含有比が０．１以上０．４以下であり、水不溶性である。

Description

免疫賦活剤及び感染予防方法
　本発明は、免疫賦活剤及び感染予防方法に関する。
　近年、薬剤耐性菌の世界的な広まりが懸念されている。世界保健機関（ＷＨＯ）は、原因の１つとして家畜用抗生物質の乱用を指摘しており、畜産業界からは抗生物質の代替、すなわち感染症に対する解決策が求められている。生体がもともと持つ免疫機能の向上は感染症対策として有効であり、免疫賦活効果を持つ資材として認知度の高いβ－グルカンが期待されている。
　上記に関連して、特表２０１７－５１１１２２号公報には、酵母細胞壁を処理してジメチルスルホキシドに可溶なβ－グルカンを得る方法が記載されている。特開２００９－２６３３３３号公報には、セレン強化イーストとβ－グルカンとを含む組成物が記載され、免疫刺激作用を有するとされている。特開２００４－０９９５８０号公報には、酵母菌体を自己消化処理して調製される免疫増強組成物が記載されている。特開２００３－１６９６０７号公報には、酵母を自己消化処理して得られる酵母分解組成物を添加した魚介類の飼育用飼料が記載され、免疫活性が向上するとされている。
　β－グルカンを含む資材は市場に多数流通しているが、製品による品質のばらつきが大きい、機能性が担保されていない製品も多く存在するなどの課題がある。そこで本発明の一態様は、グルカンを含有し、免疫賦活効果を有する免疫賦活剤を提供することを目的とする。
　本発明の第１態様は、酵母細胞壁に由来するグルカンと脂質とを含み、グルカンと脂質の総含有率が８０質量％以上であり、グルカンに対する脂質の含有比が０．１以上０．４以下であり、水不溶性である免疫賦活剤である。ある一形態において、β－グルカンに対するα－グルカンの含有比が０．２以上０．８５以下であってもよい。ある一形態において、免疫賦活剤は、マンナンを含み、マンナンの含有率が５質量％以下であってもよい。ある一形態において、免疫賦活剤は、魚類に対して用いられてもよい。
　第２態様は、前記免疫賦活剤を含む飲食品又は飼料である。第３態様は、グルカンと脂質とを含み、グルカンと脂質の総含有率が８０質量％以上である魚類に対する感染予防剤である。第４態様は、前記免疫賦活剤を対象に投与することを含む感染予防方法である。
　第５態様は、自己消化処理された酵母細胞壁を含む組成物を準備することと、酵母細胞壁を含む組成物をアルカリ加水分解処理して加水分解物を得ることと、加水分解物からグルカンを回収することと、を含む酵母由来グルカンの製造方法である。
　ある一形態において、酵母細胞壁を含む組成物は、酵母を自己消化処理して自己消化物を得ることと、自己消化物を遠心分離処理することと、を含む方法で得られる。ある一形態において、アルカリ加水分解処理は、アルカリ金属水酸化物の存在下に加熱して行われる。ある一形態において、酵母由来グルカンは、マンナンの含有率が５質量％以下である。ある一形態において、酵母由来グルカンは、タンパク質の含有率が１０質量％以下である。ある一形態において、酵母由来グルカンは、グルカン含有率の変動係数が１０％以下である。
　本発明の一態様によれば、グルカンを含有し、免疫賦活効果を有する免疫賦活剤を提供することができる。
ブタ白血球に対する活性酸素種の産生促進能を示すグラフである。 ヒト好中球様細胞に対する活性酸素種の産生促進能を示すグラフである。 ニジマスに対するビブリオ病感染試験の生存率を示すグラフである。
　本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。また、組成物中の各成分の含有量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。更に、各成分の含有量は、免疫賦活剤の乾物換算の値であり、平均値であってもよい。ここで含有量を平均値とするのは、製造ロット間のばらつきを考慮するものであり、例えば、任意に選択される６個以上の試料についての算術平均値である。平均値を算出する試料数の上限としては例えば２０個以下である。以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。ただし、以下に示す実施形態は、本発明の技術思想を具体化するための、免疫賦活剤等を例示するものであって、本発明は、以下に示す免疫賦活剤等に限定されない。
免疫賦活剤
　免疫賦活剤は、グルカンと脂質とを含み、グルカンと脂質の総含有率が８０質量％以上である。本実施形態に係る免疫賦活剤は、良好な品質安定性と明確な免疫賦活効果を有する。これにより、家畜、ヒト、養殖魚等における感染症の罹患、進行を抑制することが期待されるだけでなく、薬剤耐性菌発生の脅威を軽減する手段を提供しうる。免疫賦活剤を構成するグルカンと脂質は、例えば、酵母細胞壁に由来し、酵母細胞壁を加水分解処理して得られるものであることが好ましい。加水分解処理にはアルカリ加水分解、酸加水分解が含まれる。
　免疫賦活剤を構成するグルカンは、Ｄ－グルコースがグリコシド結合で連結したポリマーであり、β－グルカン及びα－グルカンが含まれる。β－グルカンは、例えば、β－１，３結合の直鎖の主鎖骨格及びβ－１，６結合して分岐する側鎖を有する。また、α－グルカンは、例えば、α－１，４結合の直鎖の主鎖骨格及びα－１，６結合して分岐する側鎖を有する。
　免疫賦活剤におけるグルカンの総含有率は、例えば、６０質量％以上であり、好ましくは６５質量％以上、より好ましくは７０質量％以上であり、また例えば、９０質量％以下であり、好ましくは８５質量％以下、より好ましくは８０質量％以下である。
　免疫賦活剤におけるβ－グルカンの含有率は、例えば、３０質量％以上であり、好ましくは３５質量％以上、又は４０質量％以上であり、また例えば、６５質量％以下であり、好ましくは６０質量％以下、又は５０質量％以下である。また、α－グルカンの含有率は、例えば、１０質量％以上であり、好ましくは１５質量％以上、又は２０質量％以上であり、また例えば、４０質量％以下であり、好ましくは３５質量％以下、又は３０質量％以下である。
　免疫賦活剤におけるβ－グルカン含有量に対するα－グルカン含有量の比は、例えば、０．２以上０．８５以下であり、好ましくは０．２５以上、０．３以上、０．４以上、０．４５以上、又は０．５以上であり、また好ましくは０．８以下、０．７以下、又は０．６以下である。β－グルカンに対するα－グルカンの含有比が前記範囲であると、免疫賦活活性がより増強される傾向がある。
　免疫賦活剤における脂質には、アルコールと脂肪酸とがエステル結合して形成する単純脂質、分子中にリン酸、糖、タンパク質などを含む脂質である複合脂質、及び単純脂質又は複合脂質から加水分解によって誘導される誘導脂質が含まれる。免疫賦活剤における脂質の総含有率は、例えば、３質量％以上であり、好ましくは５質量％以上、又は１０質量％以上であり、また例えば、２０質量％以下であり、好ましくは１６質量％以下、又は１４質量％以下である。脂質の含有率が前記範囲内であると、免疫賦活活性がより増強される傾向がある。
　免疫賦活剤におけるグルカンと脂質の総含有率は、８０質量％以上であり、好ましくは８２質量％以上である。また例えば９５質量％以下であり、好ましくは９０質量％以下、又は８８質量％以下である。グルカンと脂質の総含有率が前記範囲内であると、免疫賦活活性がより増強される傾向がある。
　免疫賦活剤におけるグルカンの総含有量に対する脂質の総含有量の比は、例えば、０．１以上０．４以下であり、好ましくは０．１２以上、又は０．１５以上であり、また例えば、０．３以下であり、好ましくは０．２５以下、又は０．２以下である。グルカンに対する脂質の含有比が前記範囲であると、免疫賦活活性がより増強される傾向がある。
　免疫賦活剤は、グルカンと脂質に加えてマンナンを更に含んでいてもよい。マンナンはＤ－マンノースを主な構成単位とする多糖類である。免疫賦活剤がマンナンを含む場合、マンナンの含有率は、例えば、５質量％以下であり、好ましくは３質量％以下、又は１．２質量％以下であり、また例えば、０．１質量％以上であり、好ましくは０．２質量％以上、又は０．３質量％以上である。マンナンの含有率が前記範囲であると、免疫賦活活性がより増強される傾向がある。免疫賦活剤におけるグルカンの総含有量に対するマンナンの総含有量の比は、例えば、０．００４以上０．０５以下であり、好ましくは０．００５以上、又は０．００８以上であり、また好ましくは０．０２以下、又は０．０１８以下である。
　免疫賦活剤は、グルカンと脂質に加えてタンパク質を更に含んでいてもよい。免疫賦活剤がタンパク質を含む場合、タンパク質の含有率は、例えば、１０質量％以下であり、好ましくは８質量％以下、又は６質量％以下であり、また例えば、１質量％以上であり、好ましくは２質量％以上、又は３質量％以上である。タンパク質の含有率が前記範囲であると、免疫賦活活性がより増強される傾向がある。
　免疫賦活剤におけるグルカンの総含有量に対するマンナンとタンパク質の総含有量の比は、例えば、０．０１以上０．２以下であり、好ましくは０．０２以上、又は０．０５以上であり、また好ましくは０．１以下、又は０．０９以下である。
　免疫賦活剤は、灰分を更に含んでいてもよい。免疫賦活剤が灰分を含む場合、灰分の含有率は、例えば、１０質量％以下であり、好ましくは６質量％以下、又は４質量％以下であり、また例えば、１質量％以上であり、好ましくは１．５質量％以上、又は２質量％以上である。灰分の含有率が前記範囲であると、免疫賦活活性がより増強される傾向がある。
　免疫賦活剤の各成分の含有量は、常法により測定することができる。例えば、グルカンの含有量は、グルカンを加水分解して生成するグルコースを定量することで測定することができる。また、脂質の含有量は、酸分解法で定量することができる。
　免疫賦活剤は、品質安定性に優れる。免疫賦活剤の品質の安定性は、例えば、製造ロットの相違に起因する各成分の含有率のばらつきで評価できる。具体的には、各成分の含有率の変動係数（％）で評価される。変動係数（％）は、免疫賦活剤の各成分の含有率を、任意に選択される６個以上の試料について測定して、含有率の算術平均値と標準偏差を算出し、標準偏差を算術平均値で除した値の百分率として算出される。免疫賦活剤におけるグルカンの総含有率の変動係数（％）は、例えば、１０％以下であり、好ましくは８％以下、又は５％未満である。また、脂質の含有率の変動係数（％）は、例えば、２０％以下であり、好ましくは１５％以下、又は８％以下である。更に、グルカンと脂質の総含有率の変動係数（％）は、例えば、６％以下であり、好ましくは５％以下、又は５％未満である。なお、変動係数の下限値は０％であるが、実質的には０％より大きい値となる。
　免疫賦活剤は、主要成分であるグルカンと脂質に加えて、免疫調整作用を有する公知の成分を更に含んでいてもよい。免疫調整作用を有する成分としては、例えば、甜茶抽出物、フコイダン、アラビノキシラン、ラクトフェリン、カテキン、キトサン、キトサンオリゴ糖、キチンオリゴ糖、Ｌ－アスコルビン酸、コエンザイムＱ１０（還元型を含む）等を挙げることができる。
　免疫賦活剤には、必要に応じて通常、医薬品、食品、飼料等に用いられ得ることが知られている任意の成分、例えば、水、油脂、糖類、ビタミン類、甘味料、調味料、酸味料、保存料、香料、着色料、賦形剤、増量剤、結合剤、増粘剤、安定剤、乳化剤、ｐＨ調整剤等を配合することができる。
　免疫賦活剤の形態は、粉末、顆粒等の固体、液体、ペースト等のいずれであってもよい。また、免疫賦活剤の剤型は、投与方法、投与対象等に応じて適宜選択することができる。剤型としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、トローチ剤、散剤、液剤等の経口投与用製剤が挙げられる。これらの製剤は、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤等の添加剤を用いて公知の方法に従って製造することができる。また、免疫賦活剤を含有させて、健康食品、健康補助食品等の食品組成物、飲料組成物、飼料等を構成することもできる。
　免疫賦活剤は、脊椎動物等の投与対象に投与されると、対象において免疫賦活作用を発現する。これにより、対象における感染症の発症を抑制することができる。すなわち、免疫賦活剤は対象の感染症の予防方法に適用することができる。投与の対象となる脊椎動物としては、哺乳動物、鳥類、魚類等が挙げられる。哺乳動物は、ヒトを含んでいてもよく、ヒト以外の哺乳動物であってもよい。ヒト以外の哺乳動物としては、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サルの他イヌ、ネコ等の愛玩動物等が挙げられる。鳥類としては、肉鶏、産卵鶏、七面鳥、アヒル、ハト等が挙げられる。また、魚類としては、サケ、マス、ヤマメ、イワナ、イトウ等のサケ科魚類、コイ、フナ、ティラピア、ナマズ、スズキ、ブリ、カンパチ、ハマチ、ヒラメ、タイ、マグロ、ウナギ等が挙げられる。
　免疫賦活剤を医薬品又は飲食品として投与する場合、例えば、１回あたり１ｍｇから５００ｍｇ（乾燥重量）／ｋｇ体重の量を、１日に１回から数回の経口投与とすることができる。また、飲食品、飼料等として使用する場合、飲食品、飼料等の１００ｇあたり０．１ｇから１ｇを添加することができる。
　免疫賦活剤を飼料として投与する場合、例えば、哺乳動物、鳥類、魚類に対しては投与する餌に対して０．００１質量％以上１質量％以下で混合したものを一日に１回から数回投与することができる。
免疫賦活剤の製造方法
　免疫賦活剤は、例えば、酵母細胞壁を原料とする以下のような製造方法で製造することができる。免疫賦活剤の製造方法は、例えば、酵母細胞壁を酸水溶液又はアルカリ水溶液で加水分解処理して加水分解物を得る加水分解工程と、加水分解物からグルカン含有組成物を回収する回収工程とを含む。すなわち、免疫賦活剤は酵母由来グルカンを含む組成物であってよい。
　ここで加水分解工程に供される酵母細胞壁は、前処理工程で前処理されていてもよい。前処理工程には、原料となる酵母を自己消化して自己消化物を得る自己消化工程、原料となる酵母を熱水抽出して熱水抽出物得る熱水抽出工程、原料となる酵母を酵素処理して酵素処理物を得る酵素処理工程等の予備分解工程、自己消化物、熱水抽出物、酵素処理物等の予備分解物を遠心分離して酵母細胞壁を得る第１遠心分離工程等が含まれる。
　原料となる酵母としては、例えば、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロマイセス属、カンジダ属、ピキア属、トルロプシス属等の酵母が挙げられ、これらからなる群から選択される少なくとも１種が好ましく、サッカロマイセス属の酵母がより好ましい。サッカロマイセス属の酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレシビエ（S.cerevisiae）、サッカロマイセス・パストアヌス（S.pastorianus）、サッカロマイセス・バヤヌス（S.bayanus）等が含まれ、これらからなる群から選択される少なくとも１種であってよい。また酵母は、その用途により、ビール酵母、ウィスキー酵母、焼酎酵母、パン酵母、ワイン酵母、清酒酵母、バイオエタノール酵母等とも呼ばれ、これらからなる群から選択される少なくとも１種であってよい。原料となる酵母は、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　自己消化工程では、酵母自体のプロテアーゼ等により酵母のタンパク質等を分解して自己消化物を得る。自己消化工程は、例えば、ｐＨを２から７に、温度を４０℃以上６５℃以下に調整して、１時間以上４８時間以下で行われる。第１遠心分離工程では、自己消化物を遠心分離して重液として酵母細胞壁を含む画分を得る。遠心分離には、例えば、工業生産においてはノズル型遠心機、間欠排出型遠心機、シャープレス型遠心機等を用いることができ、自己消化物中の不溶性成分を回収できる限り、遠心分離の条件は適宜調整することができる。
　加水分解工程では、酵母細胞壁を、例えば、アルカリ水溶液を用いて加水分解処理して加水分解物を得る。アルカリ水溶液としては、例えば、水酸化ナトリウム等のアルカリ金属水酸化物を含む水溶液が用いられる。アルカリ水溶液の濃度は、例えば、０．０１質量％以上１０質量％以下であり、好ましくは０．１質量％以上５質量％以下、より好ましくは１質量％以上３質量％以下である。加水分解処理の温度は、例えば７０℃以上１００℃以下であり、好ましくは８５℃以上９５℃以下である。加水分解処理の時間は、例えば１時間以上４８時間以下であり、好ましくは４時間以上２４時間以下である。
　回収工程は、例えば、必要な場合には加水分解物を中和して中和物を得る中和工程と、中和物又は加水分解物を遠心分離してグルカン含有組成物を得る第２遠心分離工程と、グルカン含有組成物を乾燥する乾燥工程とを含む。酵母の自己消化物等から得られる酵母細胞壁を、アルカリ加水分解処理することで、グルカン及び脂質を含む免疫賦活剤を安定した品質で製造することができる。
　中和工程では、アルカリ加水分解物に酸性化合物を加えてｐＨを６．５から７．５に調整して中和物を得る。酸性化合物としては、塩酸、硝酸、硫酸、リン酸等の無機酸、ギ酸、酢酸等の有機酸が用いられる。第２遠心分離工程では中和物を遠心分離して重液としてグルカン含有組成物を得る。遠心分離には、例えば、工業生産においてはノズル型遠心機、間欠排出型遠心機、シャープレス型遠心機等を用いることができ、中和物又は加水分解物中の不溶性成分を回収できる限り、遠心分離の条件は適宜調整することができる。乾燥工程ではグルカン含有組成物を乾燥処理して、免疫賦活剤を得る。乾燥条件としては、工業生産においては噴霧乾燥機、凍結乾燥機又はドラム乾燥機等を用いることができ、条件は適宜調整することができる。乾燥工程の前に、グルカン含有組成物を殺菌処理する殺菌工程を設けてもよい。殺菌工程は、例えば、ＵＨＴ殺菌機を用いて１２０℃以上で１０秒から６０秒間熱処理して行うことができるが、目的の品質に合致するよう適宜調整することができる。
酵母由来グルカンの製造方法
　本実施形態に係る酵母由来グルカンの製造方法は、自己消化処理された酵母細胞壁を含む組成物を準備する準備工程と、酵母細胞壁を含む組成物をアルカリ加水分解処理して加水分解物を得る加水分解工程と、加水分解物からグルカンを回収する回収工程と、を含む。酵母菌体を自己消化処理して得られる酵母細胞壁をアルカリ加水分解して得られる酵母由来グルカンは、良好な品質安定性を示し、製造ロット毎の品質のばらつきが抑制される。また、製造される酵母由来グルカンは、グルカンの回収率が良好でありながら、マンナン、タンパク質等の不純物が充分に除去される。酵母由来グルカンの製造方法は、酵母由来グルカンの精製方法であってよい。
　準備工程では、自己消化処理された酵母細胞壁を含む組成物を準備する。酵母細胞壁を含む組成物は、市販品から適宜選択して準備してもよく、所望の構成を有する酵母細胞壁を含む組成物を製造して準備してもよい。原料となる酵母は、既述の通りである。
　酵母細胞壁を含む組成物は、例えば、原料となる酵母菌体を自己消化処理して自己消化物を得る自己消化工程と、自己消化物を遠心分離処理する第１遠心分離工程とを含む方法で製造することができる。自己消化工程及び第１遠心分離工程の詳細については、既述の通りである。
　酵母細胞壁を含む組成物を得る方法では、自己消化工程に先立って、原料となる酵母菌体を精製処理してもよい。精製処理には、例えば、原料となる酵母菌体を振動篩で篩過することで夾雑物を除去すること、ｐＨ９から１１のアルカリ性条件下で洗浄すること等が含まれる。
　加水分解工程では、酵母細胞壁を、アルカリ水溶液を用いて加水分解処理して加水分解物を得る。加水分解工程の詳細については、既述の通りである。
　回収工程では、加水分解物からグルカンを回収する。回収工程で得られるグルカンは、例えば、グルカン含有組成物として得られる。回収工程の詳細については、既述の通りである。
　酵母由来グルカンの製造方法は、良好なグルカンの回収率を達成しつつ、マンナン、タンパク質等の除去率に優れる。グルカンの回収率は、自己消化処理された酵母細胞壁を含む組成物に含まれるグルカンの総量で、得られる酵母由来グルカンに含まれるグルカンの総量を除することで算出される。また、マンナンの除去率は、自己消化処理された酵母細胞壁を含む組成物に含まれるマンナンの総量から、得られる酵母由来グルカンに含まれるマンナンの総量を差し引いた除去量を、自己消化処理された酵母細胞壁を含む組成物に含まれるマンナンの総量で除することで算出される。タンパク質等の除去率についても同様である。
　酵母由来グルカンの製造方法におけるグルカンの回収率は、例えば６５％以上であり、好ましくは７０％以上、又は７５％以上である。また、グルカンの回収率の上限は、例えば９５％以下、好ましくは９０％以下、又は８５％以下である。
　酵母由来グルカンの製造方法におけるマンナンの除去率は、例えば８５％以上であり、好ましくは９０％以上、又は９５％以上である。また、マンナンの除去率の上限は、例えば１００％以下、好ましくは１００％未満である。
　酵母由来グルカンの製造方法におけるタンパク質の除去率は、例えば８０％以上であり、好ましくは８５％以上、又は９０％以上である。また、タンパク質の除去率の上限は、例えば１００％以下、好ましくは１００％未満、又は９８％以下である。
　本発明は別の態様として、免疫賦活剤又は酵母由来グルカンを対象に投与することを含む免疫賦活方法を包含する。また、本発明は別の態様として、免疫賦活方法又は感染症の予防方法に用いられる組成物の製造における免疫賦活剤又は酵母由来グルカンの使用、免疫賦活方法又は感染症の予防方法における免疫賦活剤又は酵母由来グルカンの使用、免疫賦活方法又は感染症の予防方法に使用される免疫賦活剤又は酵母由来グルカンをも包含する。免疫賦活方法又は感染症の予防方法の対象は、既述の脊椎動物であってよく、哺乳動物、鳥類、魚類等が含まれる。
　以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
免疫賦活剤の製造方法１
　アサヒグループ食品（株）栃木小金井工場にて製造したサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属するビール酵母に由来する酵母細胞壁（固形分１５％；酵母の自己消化物由来）を準備し、これを加水分解処理に供した。具体的には、酵母細胞壁を含むスラリーに、最終濃度が約１．５質量％、又は約２．０質量％となるように水酸化ナトリウムを添加し、９０℃に加熱して４時間加水分解処理した。処理後の酵母細胞壁スラリーを塩酸でｐＨ７．０に調整後、高速冷却遠心機（ＢＥＣＫＭＡＮ　ＣＯＵＬＴＥＲ社製　Ａｖａｎｔｉ　Ｊ－２６Ｓ　ＸＰ）を用い、８，０００ｇ×１０分間のバッチ式遠心分離を行った。沈殿に１．５Ｌの蒸留水を添加し、懸濁した後に上述の条件で遠心分離を行った。本操作を４回繰り返し、沈殿を凍結乾燥機（ＥＹＥＬＡ社製ＦＤＵ－２１００）にて２晩以上乾燥して免疫賦活剤を得た。
免疫賦活剤の製造方法２
　アサヒグループ食品（株）栃木小金井工場にて製造したサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属するビール酵母に由来する酵母細胞壁（固形分１５％；酵母の自己消化物由来）を準備し、これを加水分解処理に供した。具体的には、酵母細胞壁を含むスラリーに、最終濃度が約１．５質量％、又は約２．０質量％となるように水酸化ナトリウムを添加し、９０℃に加熱して４時間加水分解処理した。処理後の酵母細胞壁スラリーを塩酸でｐＨ７．０に調整後、ノズル式連続遠心分離機（アルファラバル社製ＦＥＵＸ５１２Ｔ－３１Ｃ－５０およびＦＥＵＸ４１２Ｕ－３１Ｃ－５０）により加水しながら固液分離し、得られた重液を１３０℃４０秒の条件で殺菌し、次いでドラム乾燥機にて乾燥して免疫賦活剤を得た。
グルカンの分析方法１
　試料を約０．６ｇ秤量し、７２（ｗ／ｗ）％硫酸を４ｍＬ添加後、室温にて１時間撹拌した。その後、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ（登録商標）水を用いて硫酸濃度を４（ｗ／ｗ）％に調整し、１２１℃で１時間反応させた。冷却後に水酸化ナトリウム水溶液を用いて中和した。定容後にろ過を行い、ろ液をＨＰＬＣに供した。カラムはＷａｋｏｐａｋ（登録商標）Ｗａｋｏｓｉｌ（登録商標）５ＮＨ２（φ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、富士フイルム和光純薬工業株式会社）、カラム温度は室温、移動相はアセトニトリル：水＝７５：２５、流量１．０ｍＬ／分、注入量は２μＬとした。反応液として１（ｗ／ｖ）％アルギニンおよび３（ｗ／ｖ）％ホウ酸混合溶液を０．７ｍＬ／ｍｉｎ．で流し、１５０℃で反応させ、蛍光検出器を用いてグルコースを検出した（励起波長３２０ｎｍ、測定波長４３０ｎｍ）。得られたグルコース含有率に０．９を乗じてグルカンの総含有率を算出した。
グルカンの分析方法２
　試料を約０．５ｇ秤量し、０．０８ｍｏｌ／ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を２５ｍｌ添加し、ターマミル１２０Ｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社）を０．１ｍｌ添加し、沸騰水浴中で３０分間反応させた。放冷後、０．２７５ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを７．５±０．１に調整し、プロテアーゼ（シグマアルドリッチ社、Ｐ－５３８０）を６０℃で３０分間作用させた。放冷後、０．３２５ｍｏｌ／ｌの塩酸を用いてｐＨを４．３±０．１に調整し、アミログルコシダーゼ（シグマアルドリッチ社、Ａ－９９１３）を６０℃で３０分間作用させた。酵素処理後の液に４倍量の９５％エタノールを添加し、１時以上放置した。珪藻土を入れたろ過器に、液を流し入れ、吸引濾過を行った。残渣をエタノール、アセトンで洗浄した。残渣を回収し、７２（ｗ／ｗ）％硫酸を５ｍｌ添加し、２０℃で４時間分解した。４（ｗ／ｗ）％になるよう水を添加し、沸騰水浴中で２時間分解した。放冷後に中和、定容、ろ過を行った。ろ液中のグルコースをグルコースオキシダーゼ法により定量し、グルコース濃度を求め、０．９を乗じ、β－グルカンの含有率を算出した。
　α－グルカンの含有率は、分析方法１で求めたグルカンの総含有率から、β－グルカンの含有率を差し引いて算出した。
脂質の分析方法
　酸分解法により定量した。採取した試料に２ｍｌのエタノールと１０ｍｌの濃塩酸を添加し、７０℃から８０℃の恒温槽で３０分間から４０分間分解処理した。その後、試料をマジョニア管に移し、エタノールとジエチルエーテルを混合し、さらに石油エーテルを混合した。エーテル層を回収し、水層にさらにジエチルエーテル・石油エーテルの混合液を添加して分配を行った。エーテル層を回収し、水層は再度ジエチルエーテルと石油エーテルを用いて分配を行ってエーテル層を回収した。ジエチルエーテル・石油エーテルを留去後、１０５℃で１時間乾燥させて、乾燥前後の重量差を脂質量とし、試料採取量から脂質の含有率を算出した。
マンナンの分析方法
　試料を約０．６ｇ秤量し、７２（ｗ／ｗ）％硫酸を４ｍｌ添加し、室温で１時間撹拌した。その後、硫酸濃度が４（ｗ／ｗ）％になるようＭｉｌｌｉ－Ｑ（登録商標）水を添加し、１２１℃で１時間加水分解を行った。放冷後に中和、定容し、ろ液中のマンノースの含有量を、上述したグルカンの分析方法と同様にして定量した。試料中のマンノース濃度を算出し、０．９を乗じて、マンナン含有率を算出した。
タンパク質の分析方法
　試料中のタンパク質の含有率は、燃焼法にて定量した。分析には全窒素測定装置（住化分析センター）を用いた。試料を石英ボートに採取し、反応炉の温度を８７０℃以上、還元炉の温度を６００℃、検出器の温度を１００℃、カラムの温度を７０℃に設定し、分析を行った。検出された窒素ガスを定量し、窒素・タンパク質換算係数６．２５を乗じ、タンパク質含有率を算出した。
灰分の分析方法
　試料中の灰分の含有率は、直接灰化法により定量した。磁製るつぼに試料を採取し、予備灰化を行った。その後、５５０℃にて灰化を行った。シリカゲルデシケーター内で放冷後、秤量した。灰化前後の重量差を灰分量とし、試料採取量から灰分含有率を算出した。
　上記の製造方法で得られた１４サンプルの免疫賦活剤について、成分分析を行った結果を表１に示す。なお、表１に示す各成分の含有率は、質量基準で算出された免疫賦活剤の乾物換算値である。また、表１中のグルカンの含有率は、α－グルカンとβ－グルカンの総含有率であり、以下同様である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　参考例として、β－１，３／１，６－グルカンを主成分とする市販の免疫賦活剤（以下、「市販品Ａ」ともいう）について、製造ロットが異なる９サンプルを入手して、同様にして成分分析を行った。各成分の含有率の平均値、標準偏差及び変動係数（％）を表２に示す。表２に示す各成分の含有率は、質量基準の乾物換算値である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表１に示すように、免疫賦活剤は、脂質とグルカンの総含有率の平均値が８０質量％以上であり、また、サンプル間の含有率のばらつきが小さかった。一方、表２に示すように、市販品Ａの脂質とグルカンの総含有率の平均値は８０質量％未満であり、サンプル間のばらつきが大きかった。
　次に上記で得られた免疫賦活剤と市販品Ａについて、白血球に対する活性酸素種（ＲＯＳ）産生促進能を評価した。
ブタ白血球に対するＲＯＳ産生促進能
　１０週齢の離乳子豚より採取した末梢血から単球を分取した。具体的には、１０％ウシ胎児血清入りＲＰＭＩ１６４０培地で懸濁させた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を２×１０６個／ウェルとなるように９６ウェルプレートに播種した後、２時間の培養によりウェル内に単球を付着固定した。培養上清を除去し、ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ’Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で洗浄してリンパ球を除去した後、免疫賦活剤（＃５、＃６）又は市販品Ａを最終濃度が１００μｇ／ｍＬから４００μｇ／ｍＬとなるように発光試薬（ルミノール）とＨＢＳＳとともに各ウェルに添加した。その後、ルミノメーター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で１２０分間の積算発光量を測定した。陰性対照には発光試薬（ルミノール）とＨＢＳＳのみを添加し、相対発光単位（ＲＬＵ）をＲＯＳ産生量として評価した。陽性対照にはホルボール１２－ミリステート１３－アセテート（ＰＭＡ）を５０μｇ／ｍＬとなるように発光試薬（ルミノール）とＨＢＳＳとともに添加した。結果を図１に示す。
　図１に示すように、２つの異なる製造ロットの免疫賦活剤＃５、＃６は、１００μｇ／ｍＬから４００μｇ／ｍＬの全て添加濃度において、市販品ＡよりもＲＯＳ産生量が多かった。なお、免疫賦活剤＃５のグルカンと脂質の総含有率は８５．４質量％、免疫賦活剤＃６のグルカンと脂質の総含有率は８３．９質量％であった。
ヒト白血球に対するＲＯＳ産生促進能
　Ｃｏｌｌｉｎｓらの方法（Ｃｏｌｌｉｎｓ　ＳＪ，Ｒｕｓｃｅｔｔｉ　ＦＷ，Ｇａｌｌａｇｈｅｒ　ＲＥ，Ｇａｌｌｏ　ＲＣ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，２４５８－２４６２，１９７８）に従い、ヒト白血病細胞株ＨＬ－６０を１．２５体積％のジメチルスルホキシドと１０％ウシ胎児血清入りＲＰＭＩ１６４０培地で６日間培養して好中球様に分化誘導した。前述の培地で懸濁させた好中球様ＨＬ－６０を４×１０５個／ウェルとなるように９６ウェルプレートに播種した後、１時間の培養によりウェル内に付着固定し、免疫賦活剤＃１４又は市販品Ａを最終濃度が１００μｇ／ｍＬから８００μｇ／ｍＬとなるように発光試薬（ルミノール、ナカライテスク社製）とＨＢＳＳとともに各ウェルに添加した。その後、ルミノメーターで１２０分間の積算発光量を測定した。陰性対照には発光試薬（ルミノール）とＨＢＳＳのみを添加し、相対発光単位（ＲＬＵ）をＲＯＳ産生量として評価した。結果を図２に示す。
　図２に示すように、本発明の免疫賦活剤＃１４は、１００μｇ／ｍＬから８００μｇ／ｍＬの全て添加濃度において、市販品ＡよりもＲＯＳ産生量が多かった。このとき使用した免疫賦活剤＃１４のグルカンと脂質の総含有率は８３．８質量％であった。
ニジマスのビブリオ病感染試験
　平均体重２ｇのニジマス２５匹を、免疫賦活剤＃４又は市販品Ａの最終濃度が０．２質量％となるように展着した飼料でそれぞれ飼育した。飼育開始から７日後にＰＢＳにより９×１０４ｃｆｕ／ｍＬに希釈したＶｉｂｒｉｏ　ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ菌をニジマス腹腔内に０．０５ｍＬ注射して感染処理した。その後、１０日間にわたって飼育を継続し、１日毎に生存率を算出した。結果を図３に示す。図３において縦軸は生存率（％）、横軸は感染処理後の経過日数を示す。
　注射後７日目の生存率は、陰性コントロール（無処理）が６４％、免疫賦活剤投与区が７６％、市販品Ａ投与区が６８％であった。このとき使用した免疫賦活剤＃４のグルカンと脂質の総含有率は８１．３質量％であった。
　図３に示すように、本発明の免疫賦活剤は、市販の免疫賦活剤に比べて高い生存率を示した。
　日本国特許出願２０１８－１９１１５４号（出願日：２０１８年１０月９日）の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書に参照により取り込まれる。

Claims (13)

  1. 　酵母細胞壁に由来するグルカンと脂質とを含み、グルカンと脂質の総含有率が８０質量％以上であり、グルカンに対する脂質の含有比が０．１以上０．４以下であり、水不溶性である免疫賦活剤。
  2. 　β－グルカンに対するα－グルカンの含有比が、０．２以上０．８５以下である請求項１に記載の免疫賦活剤。
  3. 　マンナンを含み、マンナンの含有率が５質量％以下である請求項１又は２に記載の免疫賦活剤。
  4. 　魚類に対して用いられる請求項１から３のいずれか１項に記載の免疫賦活剤。
  5. 　請求項１から４のいずれか１項に記載の免疫賦活剤を含む飲食品又は飼料。
  6. 　グルカンと脂質とを含み、グルカンと脂質の総含有率が８０質量％以上である魚類に対する感染予防剤。
  7. 　請求項１から４のいずれか１項に記載の免疫賦活剤を、対象に投与することを含む感染予防方法。
  8. 　自己消化処理された酵母細胞壁を含む組成物を準備することと、
    　前記酵母細胞壁を含む組成物をアルカリ加水分解処理して加水分解物を得ることと、
    　前記加水分解物からグルカンを回収することと、を含む酵母由来グルカンの製造方法。
  9. 　前記酵母細胞壁を含む組成物は、酵母を自己消化処理して自己消化物を得ることと、
    　前記自己消化物を遠心分離処理することと、を含む方法で得られる請求項８に記載の製造方法。
  10. 　前記アルカリ加水分解処理は、アルカリ金属水酸化物の存在下に加熱して行われる請求項８又は９に記載の製造方法。
  11. 　前記酵母由来グルカンは、マンナンの含有率が５質量％以下である請求項８から１０のいずれか１項に記載の製造方法。
  12. 　前記酵母由来グルカンは、タンパク質の含有率が１０質量％以下である請求項８から１１のいずれか１項に記載の製造方法。
  13. 　前記酵母由来グルカンは、グルカン含有率の変動係数が１０％以下である請求項８から１２のいずれか１項に記載の製造方法。
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