CN1681529B

CN1681529B - 免疫组合物及其诊断和治疗用途

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Publication number: CN1681529B
Application number: CN038217104A
Authority: CN
Inventors: L·斯科菲尔德
Original assignee: Inst Medical W & E Hall
Current assignee: Inst Medical W & E Hall
Priority date: 2002-07-26
Filing date: 2003-07-25
Publication date: 2012-09-19
Anticipated expiration: 2023-07-25
Also published as: US8038986B2; EP1545599A1; AU2003245127A1; EP1545599B1; CN1681529A; BR0312985A; AU2003245127B2; EP1545599A4; HUE025624T2; CA2493782C; US8501183B2; WO2004011026A1; CA2493782A1; US20120027762A1; US20060147476A1; DK1545599T3

Abstract

本发明涉及一种引发或者诱导对微生物的免疫应答的方法，以及其中使用的组合物。更具体而言，本发明涉及使用含有糖基磷脂酰肌醇(在此称为“GPI”)肌醇聚糖结构域或其衍生物或相当物的免疫原性组合物诱导对寄生虫的免疫应答的一种方法。本发明尤其可以用于预防和/或治疗处理哺乳动物的微生物感染，如寄生虫感染，特别是疟原虫种的感染。另一方面，本发明提供一种诊断、监测、筛查或者定性或定量评价对微生物(特别是寄生虫)的免疫应答的方法。更具体而言，本发明该方面涉及使用GPI肌醇聚糖结构域或其衍生物或相当物评价所述免疫应答。本发明该方面的发展尤其有利于定性和/或定量分析生物样品中的抗GPI抗体，鉴定和/或分离抗体的独特特性(如结合寄生虫产生的毒素或寄生虫本身)，表位特异的筛选，或者免疫原性分子的合理设计，以及由此产生功能上有效的免疫相互作用分子。

Description

免疫组合物及其诊断和治疗用途

发明领域

本发明涉及一种引发或者诱导对微生物的免疫应答的方法，以及其中使用的组合物。更具体而言，本发明涉及使用含有糖基磷脂酰肌醇(在此称为“GPI”)肌醇聚糖(inositolglycan)结构域或其衍生物或相当物的免疫原性组合物诱导对寄生虫的免疫应答的一种方法。本发明尤其可以用于预防和/或治疗处理哺乳动物的微生物感染，如寄生虫感染，特别是疟原虫种的感染。

另一方面，本发明提供一种诊断、监测、筛查或者定性或定量评价对微生物(特别是寄生虫)的免疫应答的方法。更具体而言，本发明该方面涉及使用GPI肌醇聚糖结构域或其衍生物或相当物评价所述免疫应答。本发明该方面的发展尤其有利于定性和/或定量分析生物样品中的抗GPI抗体，鉴定和/或分离抗体的独特特性(如结合寄生虫产生的毒素或寄生虫本身)，表位特异的筛选，或者免疫原性分子的合理设计，以及由此产生功能有效的免疫相互作用分子。

发明背景

作者在本说明书中提到的公开文本的详细目录在本说明书结尾处列出。

本说明书中的任何一种现有技术都不会也不应被视为承认或者以任何形式提出该现有技术构成澳大利亚公知常识的一部分。

疟原虫被认为是世界上最严重的病原体之一，感染了全球5％的人口，导致敏感人群的严重的死亡率和发病率，阻碍了社会经济的发展。

重度疟疾感染与细菌感染性休克有几个共同的临床特征。在这两种疾病中，巨噬细胞分别响应疟疾“毒素”和脂多糖(LPS)过度产生促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子(TNF)、白介素-1(IL-1)和IL-6，导致并发症，如发热和高热、白细胞减少、血小板减少、低血压、弥散性血管内凝血、白细胞浸润、血管渗透性和多器官炎症，最终可导致死亡。因此，急性和重度疟疾感染的许多指征、症状和综合征是由于在感染的血液阶段发育周期中释放到循环中的寄生虫“毒素”的活性引起的。

GPI已经被确定为一种寄生虫来源的候选毒素(Schofield，L.和Hackett，F.(1993)Journal of Experimental Medicine 177：145-153和Tachado，S.D.，Gerold，P.，Schwarz，R.，Novakovic，S.，McConville，M.和Schofield，L.(1997)Proceedings of the National Academy of SciencesUSA 94：4022-4027)。该分子的结构已经阐明(Gerold，P.，Dieckman-Schuppert A.和Schwarz，R.T.(1992)Bio.Soc.Trans.29：297和Gerold，P.，Schofield，L.，Brackman，M.，Holder，A.A.，Schwarz，R.T.(1996)Mol.Biochem.Parasitol 75：131)，它含有一个脂结构域和一个聚糖结构域。完整的GPI以两种密切相关的形式存在：Pfglα(NH-CH₂-CH₂-PO₄-(Manα1-2)-6Manα1-2Manα1-6Manα1-4GlcN-H₂α1-6(肉豆蔻酰)-肌-肌醇-1-PO₄-二棕榈酰甘油)和Pfglβ(NH-CH₂-CH₂-PO₄-6Manα1-2Manα1-6Manα1，4GlcN-H₂α1-6(肉豆蔻酰)-肌-肌醇-1-PO₄-二棕榈酰甘油)。

寄生虫来源的GPI分子通过激活基于内源GPI的信号转导途径，包括水解为第二信使，和激活酪氨酸和丝氨酸/苏氨酸激酶，调节多种组织中的宿主细胞功能和基因表达。这导致转录因子NFκB/c-rel家族的激活，这些转录因子调节与疟疾病理学有关的大量促炎基因座的表达，如TNF、IL-1、iNOS和ICAM-1。

疟疾发病机理的毒素理论能够追溯到Camillo Golgi，他在1886年假设发热的最可能的原因是释放的寄生虫来源的毒素(Golgi，C.(1886)Arch.Sci.Med.(Torino)10：109)。Clark提出，疟疾感染的全身炎症是由一种功能性疟疾内毒素引起的，并且提出这种内毒素主要通过诱导宿主来源的内源性热源发挥全身效应。Clark正确地鉴定了TNF是疾病的一种主要宿主介质(Clark，I.A.(1978)Lancet 2：75，和Clark，I.A.，Virelizier，J.-L.，Carswell，E.A.和Wood，P.R.(1981)Infect.Immun.32：1058)。因此，单核细胞/巨噬细胞产生这种以及相关的致热细胞因子(IL-1、IL-6)通常被视为疟疾感染中病理过程启动的一种有用的替代标志物。John Playfair和他的同事们开展了这项研究，表明啮齿类动物疟原虫的粗提物能够在体外诱使巨噬细胞分泌TNF(Bate，C.A.，Taverne，J.和Playfair，J.H.(1988)Immunology 64：227和Bate，C.A.，Taverne，J.和Playfair，J.H.(1989)Immunology 66：600)，并且推断该毒素包含一个磷脂部分。但是，在本发明之前，该寄生虫毒素的具体生物化学鉴别及其作用机理还不清楚。

在产生本发明的工作中，发明人研究了GPI的各个部分诱导对抗疟疾疾病的保护性免疫的用途。发明人意外地发现，不含脂结构域的GPI部分诱导保护性免疫，而含有脂结构域的部分不能诱导。

在另外一个令人惊讶的方面，已经确定上述GPI部分能够有效地用来促进定性和/或定量分析对一种寄生虫(特别是疟原虫属)、对寄生虫疾病(如疟疾)产生的免疫应答。另外，以这种独特的、令人惊讶的、基于抗原的有效方式分析免疫应答提供了一种方法，该方法有助于表位特异性筛选或合理设计功能有效的免疫原性分子。合成GPI分子的成功产生特别推动了本发明的这一方面。

发明概述

在本说明书和随后的权利要求书中，除非内容需要，否则单词“包含”或者其变化将被理解为包括所述整体或整体群，但是不排除其它任何整体或整体群。

本发明的一个方面涉及在哺乳动物中引发或诱导针对微生物的免疫应答的一种方法，该方法包括对该哺乳动物施用有效量的免疫原性组合物，该组合物含有一种分子，该分子能够诱导针对GPI的肌醇聚糖结构域的免疫应答，但是该分子基本上不能诱导针对该GPI的脂结构域的免疫应答。

本发明的另外一个方面提供在哺乳动物中引发或诱导针对微生物的免疫应答的一种方法，该方法包括对该哺乳动物施用有效量的免疫原性组合物，该组合物含有修饰的GPI分子或其衍生物或相当物，这种修饰的GPI分子含有不足以诱导或引发针对GPI脂结构域的免疫应答的脂结构域。

本发明的再另外一个方面涉及在哺乳动物中引发或诱导针对寄生虫的免疫应答的一种方法，该方法包括对该哺乳动物施用有效量的免疫原性组合物，该组合物含有寄生虫GPI的肌醇聚糖结构域部分或其衍生物或相当物，该肌醇聚糖结构域部分含有不足以诱导或引发针对该寄生虫GPI的脂结构域的免疫应答的脂结构域。

本发明的另外一个方面涉及在哺乳动物中引发或诱导针对恶性疟原虫(P.falciparum)的免疫应答的一种方法，该方法包括对该哺乳动物施用有效量的免疫原性组合物，该组合物含有GPI肌醇聚糖结构域，其中该肌醇聚糖结构域含有结构：

乙醇胺-磷酸-(Manα1，2)-Manα1，2Manα1，6Manα1，4GlcN-肌-肌醇磷酸甘油

或其衍生物或相当物。

本发明的另外一个方面涉及在哺乳动物中引发或诱导针对恶性疟原虫的免疫应答的一种方法，该方法包括对该哺乳动物施用有效量的免疫原性组合物，该组合物含有一种GPI肌醇聚糖结构域，其中该肌醇聚糖结构域含有结构：

X₁-X₂-X₃-X₄-乙醇胺-磷酸-(Manα1，2)-Manα1，2Manα1，6Manα1，4GlcN-肌-肌醇磷酸甘油

其中X₁、X₂、X₃和X₄是任意4种氨基酸，

或者该GPI肌醇聚糖结构域的衍生物或相当物。

本发明的另外一个方面涉及在哺乳动物中引发或诱导针对恶性疟原虫的免疫应答的一种方法，该方法包括对该哺乳动物施用有效量的一种免疫原性组合物，该组合物含有一种GPI肌醇聚糖结构域，其中该肌醇聚糖结构域含有结构：

EtN-P-[Mα2]Mα2 Mα6 Mα4Gα6Ino

EtN-P-[Mα2][G]Mα2 Mα6 Mα4Gα6Ino

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Mα6 Mα4G

EtN-P-[Mα2][G]Mα2 M

EtN-P-[Mα2][X]Mα2 M

EtN-P-[Mα2][EtN-P]Mα2 M

EtN-P-(Manα1，2)-6Mα1，2Mα1，6Manα1，4GlcNH₂α1-肌-肌醇-1，2-环磷酸

NH₂-CH₂-CH₂-PO₄-(Manα1-2)6Manα1-2，Manα1-6，Manα1-4GlcNH₂-6肌-肌醇-1，2-环磷酸

或其衍生物或相当物，其中EtN是乙醇胺，P是磷酸，M是甘露糖，G是非-N-乙酰化葡糖胺，[G]是任意非-N-乙酰化己糖胺，Ino是肌醇或肌醇-磷酸甘油，[X]是其它任何取代基，α代表α-键，在需要时它可以被β-键取代，数值代表位置键，需要时可以用其它任何位置键取代。

本发明的另外一个方面涉及一种治疗性或预防性处理哺乳动物的微生物感染的方法，该方法包括对该哺乳动物施用有效量的免疫原性组合物，该组合物含有一种分子，该分子能够诱导针对GPI的肌醇聚糖结构域的免疫应答，但是基本上不能诱导针对GPI的脂结构域的免疫应答，该组合物在一定条件下施用一段时间，使得该免疫应答足以减少、抑制或缓解与该微生物感染该哺乳动物有关的任何一种或多种症状。

本发明的另外一个方面涉及一种治疗性或预防性处理哺乳动物的微生物感染的方法，该方法包括对该哺乳动物施用有效量的免疫原性组合物，该组合物含有一种修饰的GPI分子或其衍生物或相当物，这种修饰的GPI分子含有不足以诱导或引发针对GPI脂结构域的免疫应答的脂结构域，该组合物在一定条件下施用一段时间，使得该免疫应答足以减少、抑制或缓解与该微生物感染该哺乳动物有关的任何一种或多种症状。

在一个有关方面，本发明提供了一种治疗和/或预防特征在于微生物感染的哺乳动物疾病的方法，该方法包括对该哺乳动物施用有效量的免疫原性组合物，该组合物含有一种分子，该分子能够诱导针对GPI的肌醇聚糖结构域的免疫应答，但是基本上不能诱导针对GPI的脂结构域的免疫应答，该组合物在一定条件下施用一段时间，使得该免疫应答足以减少、抑制或缓解与该微生物感染有关的任何一种或多种症状。

本发明的另外一个方面涉及一种治疗和/或预防特征在于微生物感染的哺乳动物疾病的方法，该方法包括对该哺乳动物施用有效量的免疫原性组合物，该组合物含有一种修饰的GPI分子或其衍生物或相当物，这种修饰的GPI分子含有不足以诱导或引发针对GPI脂结构域的免疫应答的脂结构域，该组合物在一定条件下施用一段时间，使得该免疫应答足以减少、抑制或缓解与该微生物感染有关的任何一种或多种症状。

本发明的另外一个方面涉及一种组合物在药物生产中的用途，该组合物含有一种分子，该分子能够诱导针对微生物GPI肌醇聚糖结构域的免疫应答，但是基本上不能诱导针对GPI的脂结构域的免疫应答，该药物用于治疗和/或预防性处理特征在于微生物感染的哺乳动物疾病。

本发明的另外一个方面涉及一种免疫原性组合物在药物生产中的用途，该组合物含有一种疟原虫GPI肌醇聚糖结构域或其衍生物或相当物，该GPI肌醇聚糖结构域含有不足以诱导或引发针对GPI脂结构域的免疫应答的疟原虫GPI的脂结构域，该药物用于治疗和/或预防性处理特征在于疟原虫感染的哺乳动物疾病。

本发明的另外一个方面涉及一种能够诱导针对微生物的免疫应答的组合物，该组合物含有一种分子，该分子能够诱导针对微生物GPI肌醇聚糖结构域的免疫应答，但是基本上不能诱导针对GPI的脂结构域的免疫应答。

本发明的另外一个方面涉及一种能够诱导针对微生物的免疫应答的组合物，该组合物含有一种修饰的GPI分子或其衍生物或相当物，这种修饰的GPI分子含有不足以诱导或引发针对GPI脂结构域的免疫应答的脂结构域。

本发明的另外一个方面涉及一种疫苗组合物，其含有一种分子作为活性成分，如上文充分描述的，该分子能够诱导针对微生物GPI肌醇聚糖结构域的免疫应答，但是基本上不能诱导针对GPI的脂结构域的免疫应答，该组合物还含有一种或多种药学可接受的载体和/或稀释剂。

本发明的另外一个方面涉及一种疫苗组合物，其含有一种修饰的GPI分子或其衍生物或相当物作为活性成分，这种修饰的GPI分子含有不足以诱导或引发针对GPI脂结构域的免疫应答的脂结构域。

本发明的另外一个方面涉及一种药物组合物，其含有一种分子，如上文充分描述的，该分子能够诱导针对一种微生物GPI肌醇聚糖结构域的免疫应答，但是基本上不能诱导针对GPI的脂结构域的免疫应答，该组合物还含有一种或多种药学可接受的载体和/或稀释剂。

本发明的另外一个方面涉及针对GPI肌醇聚糖结构域，但是基本上不能与GPI的脂结构域相互作用的抗体。

本发明的另外一个方面涉及一种药物组合物，其含有一种针对GPI肌醇聚糖结构域的抗体，以及一种或多种如上所述的药学可接受的载体或稀释剂。

本发明的另外一个方面涉及本发明的抗体与疾病有关的用途。例如，本发明特别可用于，但是绝非仅限于在治疗寄生虫感染、其症状和病理学中的用途。

本发明的另外一个方面涉及一种抑制、停止或延迟特征在于微生物感染的哺乳动物疾病的发病或进展的方法，该方法包括对该哺乳动物施用有效量的一种如上所述的抗体。

因此，本发明的另外一个方面提供了一种检测生物样品中针对微生物的免疫相互作用分子的方法，该方法包括使该生物样品接触一种含有该微生物GPI肌醇聚糖结构域或其衍生物或相当物的分子，以及定性和/或定量筛查该GPI肌醇聚糖结构域-免疫相互作用分子复合物的形成。

在一个有关方面，本发明提供一种检测、监测或评价受试者中对微生物的免疫应答的方法，该方法包括使来自该受试者的生物样品接触含有该微生物GPI肌醇聚糖结构域或其衍生物或相当物的一种分子，以及定性和/或定量筛查GPI肌醇聚糖结构域-免疫相互作用分子复合物的形成。

一方面，本发明因此更优选地提供一种检测生物样品中针对疟原虫的免疫反应性分子的方法，该方法包括使该生物样品接触疟原虫GPI的肌醇聚糖结构域部分或其衍生物或相当物，以及定性和/或定量筛查GPI肌醇聚糖结构域-免疫相互作用分子复合物的形成。

在一个有关方面，本发明更优选地提供一种检测、监测或评价受试者中对疟原虫的免疫应答的方法，该方法包括使来自该受试者的生物样品接触疟原虫GPI肌醇聚糖结构域或其衍生物或相当物，以及定性和/或定量筛查GPI肌醇聚糖结构域-免疫相互作用分子复合物的形成。

因此，本发明一方面最优选地提供一种检测生物样品中抗疟原虫抗体的方法，该方法包括使该生物样品接触疟原虫GPI的肌醇聚糖结构域部分或其衍生物或相当物，以及定性和/或定量筛查GPI肌醇聚糖结构域-抗体复合物的形成。

本发明的一个有关方面最优选地提供一种检测、监测或评价受试者中对疟原虫的免疫应答的方法，该方法包括使来自该受试者的生物样品接触疟原虫GPI的肌醇聚糖结构域部分或其衍生物或相当物，以及定性和/或定量筛查GPI肌醇聚糖结构域-抗体复合物的形成。

因此，本发明的另一方面涉及一种模块化试剂盒，其中含有一个或多个组件，其中至少一个组件是含有如上所述定义的GPI分子的固体支持体。

因此，本发明也应当被理解为涉及一种方法，该方法用于分析、设计和/或修饰能够与抗GPI聚糖免疫相互作用分子结合位点相互作用的试剂，这种免疫相互作用分子可以利用如上公开的诊断方法鉴定，该方法包括使该免疫相互作用分子或其衍生物接触一种推断的试剂，以及评价该试剂与该结合位点的相互作用互补性的程度。

本发明也涉及根据本发明该方法产生的分子在上述治疗、预防和诊断方法中的用途。

附图简述

图1是通过竞争ELISA测定的抗-GPI抗体的表位特异性的图示。在存在或不存在确定的竞争剂(磷脂酰肌醇或磷脂酰丝氨酸)的情况下，根据与疟疾GPI的反应性筛查用GPI免疫的小鼠的血清。

图2是用IFA中的游离GPI免疫的C57Bl/6小鼠和假免疫的小鼠(IFA单独)，用柏氏鼠疟原虫(P.berghei)ANKA攻击后的结果的图示，评价存活率15天。

图3是抗脂单克隆抗体的表位作图的图示。在存在或不存在PI和GPI聚糖竞争剂的情况下，通过竞争ELISA，根据与GPI的反应性筛查单克隆抗体1C7，该抗体针对来源于游离GPI(1，5)免疫的小鼠的GPI。

图4是针对疟疾GPI脂结构的单克隆抗体1C7的图示，哺乳动物GPI在细胞表面的识别通过FACS分析确定。实线，1C7与巨噬细胞的结合；点线，无抗体；短划线，PI-PLC处理巨噬细胞后1C7的结合。

图5是针对GPI的脂结构域的单克隆抗体1C7的照片，在宿主细胞中诱导快速发生的酪氨酰磷酸化。

图6是在诱导鼠C3H/HeJ巨噬细胞输出TNF中，单克隆1C7与GPI、佛波酯和寄生虫提取物协同作用的图示。

图7是在C57Bl/6小鼠中单克隆1C7加重柏氏鼠疟原虫ANKA脑型疟综合征的图示。

图8是多克隆抗血清的图示，其来自用纯化的与一种蛋白质载体共价偶联的恶性疟原虫GPI聚糖免疫的小鼠，它响应GPI或寄生虫总提取物抑制巨噬细胞输出TNF。数值表示抗-TNF ELISA(Pharmingen)获得的450mM的吸光度，与TNF的量成正比。

图9是用纯化的与KLH共价偶联的恶性疟原虫GPI聚糖免疫C57Bl/6小鼠的图示，产生对柏氏鼠疟原虫ANKA诱导的脑型疟综合征的显著水平的保护。

图10是GPI的图示，GPI是恶性疟原虫的主要的TNF诱导毒素。来源于OVA聚糖免疫的OVA-TCR小鼠的GPI聚糖特异性单克隆抗体1G7和3G6响应寄生虫总提取物抑制巨噬细胞输出TNF。

图11是针对恶性疟原虫GPI肌醇聚糖的单克隆抗体的图示，这些抗体在被动转移后基本上保护小鼠抵抗脑型疟和其它疾病。

图12是针对恶性疟原虫肌醇聚糖的单克隆抗体的图示，这些抗体在被动转移后保护小鼠抵抗寄生虫诱导的致死性中毒性休克。

图13是聚糖合成的图示。1.试剂：a.4，AgOTf，NIS，CH₂Cl₂/Et₂O(38％a)；b.NaOMe，CH₂Cl₂/MeOH(83％)；c.6，TMSOTf，CH₂Cl₂(75％)；d.NaOMe，CH₂Cl₂/MeOH(71％)；e.7，TMSOTf，CH₂Cl₂(92％)；f.NaOMe(69％)；g.8，TBSOTf，CH₂Cl₂(98％)；h.NaOMe(83％)；i.9，TMSOTF，CH₂Cl₂(84％)；j.(CH₂OH)₂，CSA，CH₃CN(81％)；k.Cl₂P(O)OMe，Pyr.(88％)；l.TBAF，THF(61％)；m，11，四唑，CH₃CN；n.t-BuOOH，CH₃CN(84％，两步)；o.DBU，CH₂Cl₂；P.Na，NH₃，THF(75％，两步)。(AgOTf，三氟甲磺酸银；NIS，N-碘代琥珀酰亚胺；CH₂Cl₂，二氯甲烷，Et₂O，乙醚；NaOMe，甲醇钠；MeOH，甲醇；TMFOTf，三甲基甲硅烷基三氟甲烷磺酸；TBSOTf，叔丁基二甲基甲硅烷基三氟甲烷磺酸；CSA，樟脑磺酸；CH₃CN，乙腈；Cbz，苄酯基；Pyr，吡啶；TBAF，氟化四丁铵；THF，四氢呋喃；DBU，1，8-二氮杂二环[5，4，0]十一碳-7-烯；Obn，O-苄基)。

图14是针对合成GPI聚糖的抗体的图示，该抗体识别天然GPI，并在体外中和毒性活性。a.左图，通过免疫荧光测定检测，抗聚糖IgG抗体与恶性疟原虫营养体和裂殖体的反应性，并且缺乏对未感染的红细胞的反应性。右图，在白光照明下的相同视野。b.左图，针对寄生虫感染的(1道)和未感染的红细胞(2道)的抗聚糖IgG抗体(1/200)的Western印迹。右图，来自KLH-聚糖免疫的小鼠的两种血清(3、4道)、来自3道供体的免疫前血清(5道)和假KLH-免疫的小鼠的血清(6道)对寄生虫的反应性的比较。所有血清都使用1/400的稀释度。检测抗体是过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠IgG(γ-链特异的)。DF，染料前沿。c.RAW264.7细胞培养上清液中TNFα的水平，该细胞分别暴露于单独的培养基(空心正方形)，单独的寄生虫(三角形)，或者寄生虫和免疫前(实心圆形)、假免疫的(实心正方形)或聚糖免疫的小鼠(空心环形)的血清的不同稀释液。

图15是针对合成GPI聚糖免疫的图示，这种免疫基本上保护其抵抗脑型疟、肺水肿和酸中毒。到感染15天后，KLH-聚糖免疫的(实心圆形)和假免疫的(空心正方形)小鼠在柏氏鼠疟原虫ANKA攻击后的a.Kaplan-Meier生存率图，b.寄生虫血症。c.苏木精-伊红染色的脑组织切片，显示在感染6天后杀死的KLH-聚糖免疫的(左图和中图)和假免疫的(右图)小鼠的血管。d.感染6天后KLH-聚糖免疫的和假免疫的动物的肺的湿重与干重比，以与年龄/性别匹配的未感染对照的肺湿重∶干重比的比例表示，作为肺水肿的指标。e.第6天从未感染的和柏氏鼠疟原虫-ANKA-感染的免疫及假免疫的供体中采集的血清的pH。＊，p＞0.05。

图16是合成聚糖核心单元的示意图。

图17是用来偶联聚糖与一种载体蛋白质的方法的图示。也用半胱氨酸取代聚糖进行假偶联方法。

图18是使用多种载体蛋白质卵清蛋白(OVA)、匙孔血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)获得的偶联比的图示。通过GC/MS分析蛋白质-聚糖偶联物的肌-肌醇含量测定偶联效率。

图19是对合成聚糖PNG血清93的IgG应答的图示。具体而言，该图显示以一种ELISA检测，该检测使用自然暴露于疟疾感染的巴布亚新几内亚(PNG)供体的人血清，这些血清对一系列抗原发生反应，包括No Ag(根本没有抗原)、BSA-Cys(假偶联的BSA-半胱氨酸)、BSA-GLY(与合成GPI聚糖偶联的BSA)和PfAg(总恶性疟原虫疟疾抗原)。数据表明，合成GPI聚糖能够特异性检测暴露于疟疾的个体人血清中的抗聚糖抗体。

图20是巴布亚新几内亚和墨尔本个体对合成聚糖PNG的IgG应答的图示。具体而言，该图显示，当使用合成聚糖作为捕获抗原时，来自巴布亚新几内亚疟疾流行地区的个体比未接触疟疾的墨尔本个体有明显更高的滴度。

图21是对合成聚糖与GPI进行的竞争ELISA的图示和列表。具体而言，该图显示，当摩尔过量地使用它们作为竞争剂时，合成GPI聚糖能够竞争对天然GPI毒素的大多数人抗体应答。这解释了合成物质是与天然物质匹配的一种可靠抗原的事实，也证明大多数抗毒素血清学反应性都包含于聚糖区内。这些发现与宣称大多数人抗GPI血清学反应性都针对脂结构域的其它一些发现不一致(例如，Naik，R.S.等人.(2000)恶性疟原虫糖基磷脂酰肌醇锚：分子特征和可提供针对疟疾病原体的免疫的天然引发抗体应答J.Exp.Med.192，1563-1576)。

发明详述

本发明部分地基于以下意外的发现：不含脂部分的疟原虫GPI分子可诱导保护性免疫，而含有脂结构域的GPI分子不诱导。这一发现推动了组合物以及在预防或治疗性处理微生物感染中的应用方法的发展。

另外还意外地发现，所述GPI分子，特别是此处公开的合成GPI分子，推动了一种高度有效并且可提供大量信息的基于抗原的分析，用于定性和/或定量分析对寄生虫本身或寄生虫病的免疫应答的一个或多个方面。这些分析的实现进一步推动了抗体独特特性的鉴定和/或分离，免疫原性分子的表位特异的筛选或合理设计，和功能有效的免疫相互作用分子的产生。

因此，本发明的一个方面涉及在哺乳动物中引发或诱导针对微生物的免疫应答的一种方法，该方法包括对该哺乳动物施用有效量的免疫原性组合物，该组合物含有一种分子，该分子能够诱导针对GPI的肌醇聚糖结构域的免疫应答，但是该分子基本上不能诱导针对该GPI的脂结构域的免疫应答。

本发明基于以下意外发现：用纯化的、完整、游离的GPI免疫的小鼠产生了IgM占优势的应答，该应答主要针对该分子的脂结构域，与暴露于宿主细胞表面的宿主GPI脂结构域交叉反应。这些抗体对随后的寄生虫感染没有临床保护性。实际上，被动转移这些抗体加重了疾病的严重程度。然而，用疟疾GPI的聚糖结构域免疫产生可以与GPI的聚糖结构域相互作用的IgG抗体，这样免疫的小鼠对于随后疟疾攻击诱导的疾病基本上得到保护。被动转移这些IgG抗体对疾病具有保护性。因此发明人已经证明，针对疟疾GPI脂结构域的IgM抗体和针对聚糖结构域的IgG抗体在效应上不同，前者促进疾病，后者预防疾病。应当理解，在防止或最小化对一种微生物GPI的免疫应答的诱导方面，由于可与宿主GPI交叉反应的抗微生物GPI抗体的产生最小化，所述哺乳动物(宿主)发生对脂结构域的免疫应答从而被防止或最小化。

GPI普遍存在于真核细胞中，如布氏锥虫(T.brucei)、克氏锥虫(T.cruzi)、疟原虫、利什曼原虫属(Leishmania)和弓形体属(Toxoplasma)，以及酵母、昆虫、鱼类和大量哺乳动物来源(最近的综述见McConville，M.J.和Ferguson，M.A.，(1993)Biochem.J.294：305和Stevens，V.L.(1995)Biochem.J.310：361)。GPI由一个保守核心聚糖(Manα1-2Manα1-6Mana1-4GlcNH₂)组成，该聚糖与磷脂酰肌醇(PI)的肌-肌醇环的6-位连接。通过糖基转移酶的作用向PI上顺序添加糖残基，GPI在内质网(ER)的细胞质面上形成。成熟的GPI然后穿过膜移位到ER的腔侧。在此它可以游离或者与蛋白质共价结合地输出到细胞表面。四糖核心聚糖可以进一步用糖、磷酸和乙醇胺基团以种和组织特异的方式取代。GPI脂肪酸部分可以是二酰甘油、烷酰基甘油、单烷基甘油或神经酰胺，在肌醇环上另外棕榈酰化或豆蔻酰化。总图是一个密切相关的糖脂家族，它们共有某些核心特征，但是在脂肪酸组成和保守核心聚糖的侧链修饰上具有高水平的变化。

因此，此处所指“GPI肌醇聚糖结构域”包括所有形式的GPI肌醇聚糖结构域及其衍生物或相当物。术语“GPI肌醇聚糖”可以与例如但是不仅限于“肌醇聚糖”(IG)、“肌醇磷酸聚糖”(IPG)、“磷酸肌醇聚糖”(PIG)、“磷酸寡糖”(POS)的术语互换使用，这些术语描述的分子应当理解为是“GPI肌醇聚糖”分子。也应当理解，“GPI肌醇聚糖结构域”包括与非肌醇聚糖分子连接、结合或缔合的GPI肌醇聚糖结构域，所述非肌醇聚糖分子例如但是不仅限于连接脂结构域与肌醇聚糖结构域的甘油连接序列，脂结构域的非免疫原部分或氨基酸肽。

优选地，该分子是GPI的一部分，其含有肌醇聚糖结构域或其衍生物或相当物，但是基本不含能够诱导针对该GPI的脂结构域的免疫应答的部分。

因此更具体而言，本发明提供在哺乳动物中引发或诱导针对微生物的免疫应答的一种方法，该方法包括对该哺乳动物施用有效量的免疫原性组合物，该组合物含有一种修饰的GPI分子或其衍生物或相当物，这种修饰的GPI分子含有不足以诱导或引发针对GPI脂结构域的免疫应答的脂结构域。

优选地，这种修饰的GPI分子是GPI的肌醇聚糖结构域部分或其衍生物或相当物。

绝非限制本发明，一种免疫原组合物，如上所述，其含有GPI的肌醇聚糖结构域部分或其衍生物或相当物，基本上缺乏脂结构域，施用该组合物也认为有利于所述哺乳动物，因为它使在免疫应答诱导中可能偶然发生的某些不希望的应答最小化，但是如果所述免疫原分子含有一个脂结构域，则加重疾病的严重程度。具体而言：

(i)完整的GPI是一种毒素，在受体中可能诱导非免疫学生理致敏，使得在疟疾攻击后对天然GPI毒素的应答加强。发明人证明，完整GPI的脂部分是全毒性必需的，因为它能够启动宿主细胞中依赖脂类的信号传导，并且作为一种脂类第二信使；

(ii)完整的糖脂可以与宿主的CD1分子结合，以呈递于CD1限制的NKT细胞或其它不常见的T细胞谱系。已知这些T细胞响应刺激非常快速地产生高水平的细胞因子，如干扰素-γ和IL-4，可能是下游TH1/TH2分化的重要调节剂。用纯化的完整(即脂化的)游离GPI免疫可导致这些T细胞的引发(priming)，随后在寄生虫攻击后以高水平的干扰素作为回应，从而加重疾病的症状。即，不常见的T细胞的免疫致敏可能导致疾病严重程度加重的现象。

“衍生物”和“相当物”应当理解为包括片段、部分、化学相当物、突变体、同源物和类似物。GPI肌醇聚糖结构域的化学相当物能够作为GPI肌醇聚糖结构域的一种功能类似物。例如，GPI肌醇聚糖结构域的一种化学相当物包括GPI肌醇聚糖结构域，其中肌醇聚糖的磷酸甘油成分已经被修饰以提高疏水性。这可以如下实现：将其置换为截短的、部分或修饰的脂肪酸或其它疏水性部分，并且用来提高该分子的免疫原性或稳定性，而不产生不希望的抗体应答。在另外一个例子中，一种化学相当物含有GPI聚糖，其中末端肌醇-磷酸甘油被置换为肌醇-1，2环磷酸。绝非限制本发明，这种改变基本上不会改变衍化的GPI聚糖相对于未衍化分子的功能性质。而且，这种置换是某些化学合成方法的固有结果。化学相当物也许不一定来源于一种GPI肌醇聚糖结构域，但是可能共有某些确定的相似性。此外，化学相当物也可以具体地设计为模拟GPI肌醇聚糖结构域的某些免疫学和物理化学性质。化学相当物可以化学合成，或者例如可以在筛选天然产物之后检测。化学相当物也包括合成的碳水化合物和拟肽。此处所述的GPI肌醇聚糖结构域的同源物包括但不限于来自不同种(包括例如酵母属)的GPI肌醇聚糖结构域。片段包括如肌醇聚糖结构域的聚糖成分的部分，这些部分在实现本发明的目的方面有效。

适合本发明使用的GPI肌醇聚糖结构域可以来源于任何天然、重组或合成来源。包括，例如：通过遗传操作表达系统产生的GPI肌醇聚糖结构域，和利用重组DNA技术，如糖基化抑制剂，通过操作蛋白质的GPI翻译后修饰产生的GPI肌醇聚糖结构域。也包括通过化学方法(包括使用酶添加或去除残基)产生的化学合成或半合成的肌醇聚糖结构域及其片段。

术语“微生物”应当最广义地理解，包括，例如：寄生虫和真菌分类单位：疟原虫属、锥虫属(Trypanosoma)、利什曼原虫属、弓形体属和念珠菌属。“微生物”也应当理解为涉及由所述生物分泌或脱落的分子。可包括，例如毒素分子或从微生物表面清除的分子。优选地，适用于本发明的GPI肌醇聚糖结构域是一种寄生虫GPI肌醇聚糖结构域，更优选地是一种疟原虫GPI肌醇聚糖结构域。

因此，本发明优选地涉及在哺乳动物中引发或诱导针对疟原虫的免疫应答的一种方法，该方法包括对该哺乳动物施用有效量的免疫原性组合物，该组合物含有一种寄生虫GPI的肌醇聚糖结构域部分或其衍生物或相当物，该肌醇聚糖结构域部分含有不足以诱导或引发针对该脂结构域的免疫应答的该寄生虫GPI的脂结构域。

更优选地，该寄生虫GPI肌醇聚糖结构域是一种疟原虫GPI肌醇聚糖结构域或其衍生物或相当物。

最优选地，所述疟原虫恶性疟原虫。

更优选地，本发明涉及在哺乳动物中引发或诱导针对恶性疟原虫的免疫应答的一种方法，该方法包括对该哺乳动物施用有效量的免疫原性组合物，该组合物含有一种GPI肌醇聚糖结构域，其中该肌醇聚糖结构域含有结构：

或其衍生物或相当物。

在另外一个最优选的实施方案中，该免疫原性组合物含有GPI肌醇聚糖结构域，其中该GPI肌醇聚糖结构域含有结构

其中X₁、X₂、X₃和X₄是任意4种氨基酸，

或者该GPI肌醇聚糖结构域的衍生物或相当物。

在另外一个优选实施方案中，该免疫原性组合物含有GPI肌醇聚糖结构域，其中该GPI肌醇聚糖结构域含有选自下列的结构：

EtN-P-[Mα2]Mα2 Mα6 Mα4Gα6Ino

EtN-P-[Mα2][G]Mα2 Mα6 Mα4Gα6Ino

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EtN-P-[Mα2][G]Mα2 M

EtN-P-[Mα2][X]Mα2 M

EtN-P-[Mα2][EtN-P]Mα2 M

这些结构中的任何一个都可以在任何位置并用任何类型的键用带正、负或中性电荷的取代基进一步修饰，例如磷酸、磷酸甘油、己糖胺、氨基酸、硫醇等。通过添加任意数量的氨基酸以提供连接序列，可以进一步修饰这些结构。

在此提到的“衍生物”应当理解为，在一个优选实施方案中，包括一种免疫原性组合物，该组合物含有GPI肌醇聚糖结构域衍生物，其中末端肌醇-磷酸甘油被置换为肌醇-1，2-环磷酸。绝非限制本发明，这种置换是使用某些化学合成形式的一个特有的结果，如实施例18所述。

因此，在另外一个优选实施方案中，该免疫原性组合物含有GPI肌醇聚糖结构域，其中该GPI肌醇聚糖结构域含有结构

或其衍生物或相当物，其中EtN是乙醇胺，P是磷酸，M是甘露糖。

更优选地，该免疫原性组合物含有GPI肌醇聚糖结构域，其中该GPI肌醇聚糖结构域含有结构

NH₂-CH₂-CH₂-PO₄-(Manα1-2)6Manα1-2Manα1-6Manα1-4GlcNH₂-6肌-肌醇-1，2-环磷酸

或其衍生物或相当物。

应当理解，非-N-乙酰化的己糖胺包括葡糖胺或其它任何对亚硝酸不稳定的取代基。应当进一步理解，这些结构中的任何一个都可以在任何位置并用任何类型键用取代基进一步修饰，包括但不限于带正、负或中性电荷的取代基，如磷酸、磷酸甘油、己糖胺、氨基酸或硫醇。

本发明的GPI肌醇聚糖结构域可以与另外的分子偶联。这种偶联可以为了任何一个或多个原因进行，例如但不限于：

(i)GPI肌醇聚糖结构域可能太小而没有抗原性。因此，可能需要与载体分子如蛋白质偶联，使得构成GPI肌醇聚糖结构域-偶联物一部分的该GPI肌醇聚糖结构域作为一种半抗原，并且诱导针对该GPI肌醇聚糖结构域的免疫。这种载体蛋白质可以选自一系列抗原蛋白质，例如但不限于由疟原虫基因序列产生的重组蛋白质、破伤风类毒素、纯化的蛋白质衍生物、乙型肝炎或匙孔

血蓝蛋白和白喉类毒素。

(ii)当与特异性抗病原体疫苗分子(如抗疟疾疫苗分子)偶联时，GPI肌醇聚糖结构域可以产生抗肌醇聚糖结构域抗体，这些抗体逆转可能在暴露于天然形式的疫苗分子(该分子本身是GPI锚定的)后发生的免疫抑制。例如，GPI肌醇聚糖结构域可以与既能够用作载体蛋白质又能够作为疫苗的一种疟疾重组蛋白偶联。

并不打算将本发明的这一方面局限于任何一种理论或作用模式，GPI锚抑制对一些GPI锚定的表面蛋白质抗原的初级和次级T淋巴细胞应答。这些蛋白质抗原的例子包括恶性疟原虫和柏氏鼠疟原虫的环子孢子(CS)蛋白和布氏锥虫的可变表面糖蛋白的膜形式。由于针对GPI锚定的表面分子(如CS蛋白、MSP-1、MSP-2或MSP-4)的合成或重组肽或蛋白质的免疫可能不足以使MHC II类记忆加强，当在自然寄生虫攻击过程中遇到天然抗原时，由于诱导免疫抑制，对GPI部分的免疫提供一种减轻这种免疫抑制的方法。

(iii)GPI肌醇聚糖结构域可能只含靶表位的一部分。例如，肽序列，对应于天然GPI锚定的蛋白质或GPI锚定的糖偶联物的C末端结构域的其它一些碳水化合物(和任何相关的翻译后修饰)，也可以构成靶GPI肌醇聚糖结构域表位的一部分。(通过除去构成GPI肌醇聚糖结构域表位一部分的C末端结构域的一部分)除去表位的任一部分可以导致抗体结合减少或丧失。该肽序列或碳水化合物因此与该GPI肌醇聚糖结构域偶联。例如，一些可特异中和GPI功能的抗疟疾GPI抗体可识别如下表位：其主要包含肌醇聚糖，但是也包括GPI实际上自然结合的蛋白质部分，即GPI锚定蛋白质的相邻的C末端部分。例如通过帮助在构象上稳定肌醇聚糖，肽结构域的存在也能够提高某些抗体的亲和力。此外，这种偶联也能够使一种相对没有免疫原性的肌醇聚糖结构域具有充分的免疫原性。具体而言，例如，含有C末端肽测定簇通过形成在免疫学上比单独的肌醇聚糖更加外源的一种复合抗原，可能有助于增强肌醇聚糖的免疫原性。

产生的GPI肌醇聚糖结构域-偶联物可以作为在一种佐剂中或者用该佐剂配制的制品施用。该佐剂选自已知可诱导高水平抗体的佐剂，包括油包水型乳剂、水包油型乳剂、水包油包水型双乳剂、皂苷、Quil A提取物和皂苷的其它衍生物、DEAE-葡聚糖、硫酸葡聚糖、铝盐和非离子型嵌段共聚物。佐剂可能包括其它免疫调节剂，如胞壁酰二肽和衍生物、细胞因子和分枝杆菌或棒状杆菌种的细胞壁成分。佐剂制剂可能包含两种或多种所列佐剂的组合。这些列表不应被视为全部。佐剂的选择部分取决于针对的种，根据需要的免疫应答的水平和持续时间以及致反应性的缺乏(即组织相容性)来选择。选择活性成分的水平和佐剂，以达到希望的免疫应答水平和持续时间。

宿主GPI在高等真核生物多种细胞应答的正常生理调节中起重要作用。外源GPI，如寄生虫来源的GPI，通过作为内源宿主GPI信号传导途径的模拟，发挥病理生理效应，并特异地调节宿主细胞功能。例如，由恶性疟原虫、布氏锥虫和墨西哥利什曼原虫(L.mexicana)的GPI在宿主细胞中诱导的信号转导在加入细胞30秒内激活蛋白质酪氨酸激酶src-家族的巨噬细胞谱系特异的hck成员(Tachado等人(1997)，同上文)。蛋白质酪氨酸激酶(PTK)激活是下游基因表达所需的，导致磷酸化、细胞信号传导和TNF、IL-1、iNOS、ICAM-1和VCAM的表达(Schofield，L.，Novakovic，S.，Gerold，P.，Schwarz，R.T.，McConville，M.J.和Tachado S.D.(1996)J.Immunol.156：1886-1896，Tachado，S.D.，Gerold，P.，McConville，M.J.，Baldwin，T.，Quilici，D.，Schwarz，R.T.和Schofield，L.(1996)Journal of Immunology 156：1897-1907和Tachado等人(1997)，同上文)。PTK激活对GPI的肌醇聚糖部分作图，并且使核心聚糖与细胞表面的受体结合(Tachado等人(1997)，同上文)。寄生虫GPI似乎激活与在细胞表面干扰内源GPI锚定蛋白质后激活的激酶类似的激酶。

外源GPI，如寄生虫GPI的毒性性质，能够用疟疾GPI举例说明。当在体内接种时，疟疾GPI诱导发热和急性疟疾的症状，在TNF所致致死率的标准测定中导致受体死亡(Schofield和Hackett(1993)，同上文)。除了在巨噬细胞中诱导TNF和IL-1表达之外，GPI还对宿主组织发挥其它几种不依赖TNF的效应，这些效应在疟疾感染中可导致疾病进展。GPI直接增强血管内皮细胞中E-选择蛋白、ICAM和VCAM的表达(Schofield等人(1996)，同上文)。GPI也诱导可诱导的一氧化氮合酶的蛋白质从头合成和巨噬细胞以时间和剂量依赖的方式产生NO，以及以这种活性与干扰素-γ协同(Tachado等人(1996)，同上文)。在低氧或局部缺血模型上，提出脑型疟起因于与粘附分子ICAM、VCAM和E-选择蛋白结合的隔离寄生虫感染的红细胞对脑毛细血管后小静脉的阻断(Berendt.A.R.，Turner，G.D.H.和Newbold，C.I.(1994)ParasitolToday 10：412，1994)。因此GPI在体内可能是致死性的，并且诱导疟疾的症状，包括全身炎症和器官特异的疾病，如大脑综合征。

外源GPI也可以诱导免疫抑制。例如，从恶性疟原虫和布氏锥虫中分离的GPI，当以低浓度添加到CD4+和CD8+α/β TCR+T细胞的培养物中时，阻断细胞周期进展和细胞增殖，抑制IL-2R/CD25和CD28表达的上调，并阻断IL-2、干扰素-γ和IL-4的表达。GPI也抑制对IL-2的T细胞增殖应答。在体内，GPI锚定的表面蛋白，如疟疾CS蛋白、MSP-1、MSP-2，和布氏锥虫变异表面糖蛋白的膜形式，通过共价结合的GPI锚抑制对该抗原的初级和次级T淋巴细胞应答。

不准备将本发明局限于任何一种理论或作用模式，用缺乏脂结构域的GPI分子免疫诱导对肌醇聚糖结构域的IgG应答，这阻断了随后寄生虫GPI的作用。如上所述的毒性和免疫抑制都显著降低。

本发明的另外一个方面涉及本发明与疾病有关的用途。例如，本发明特别可用于，但是绝非仅限于治疗性或预防性处理寄生虫感染，例如免疫哺乳动物对抗寄生虫感染。在这方面，应当理解，本发明的方法诱导免疫应答，以缓解或防止出现与寄生虫感染有关的症状(如毒性和免疫抑制)，和/或GPI结构域与一种合适的抗病原体分子偶联，减少或者预防寄生虫感染。在此与微生物感染有关的“症状”应当理解为指感染本身以及这种感染的物理和/或生理后果(如毒性或免疫抑制)。

因此，本发明的另外一个方面涉及治疗性或预防性处理哺乳动物的微生物感染的一种方法，该方法包括对该哺乳动物施用有效量的免疫原性组合物，该组合物含有一种分子，该分子能够诱导针对GPI的肌醇聚糖结构域的免疫应答，但是基本上不能诱导针对GPI的脂结构域的免疫应答，该组合物在一定条件下施用一段时间，使得该免疫应答足以减少、抑制或缓解与该微生物感染该哺乳动物有关的任何一种或多种症状。

更具体而言，本发明涉及一种治疗性或预防性处理哺乳动物的微生物感染的一种方法，该方法包括对该哺乳动物施用有效量的免疫原性组合物，该组合物含有一种修饰的GPI分子或其衍生物或相当物，这种修饰的GPI分子含有不足以诱导或引发针对GPI脂结构域的免疫应答的脂结构域，该组合物在一定条件下施用一段时间，使得该免疫应答足以减少、抑制或缓解与该微生物感染该哺乳动物有关的任何一种或多种症状。

优选地，该微生物是一种寄生虫，更优选地，是恶性疟原虫。

根据本发明的这个优选方面，该免疫原性组合物优选地含有一个GPI肌醇聚糖结构域，其中该GPI肌醇聚糖结构域含有结构

或其衍生物或相当物。

在另外一个优选实施方案中，该肌醇聚糖结构域含有结构：

其中X₁、X₂、X₃和X₄是任意4种氨基酸，

或者该GPI肌醇聚糖结构域的衍生物或相当物。

在另外一个优选实施方案中，该肌醇聚糖结构域含有选自下列的一种结构：

EtN-P-[Mα2]Mα2 Mα6 Mα4Gα6Ino

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Mα2 Mα6 M

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在另外一个优选实施方案中，该免疫原性组合物含有GPI肌醇聚糖结构域，其中该GPI肌醇聚糖结构域含有结构

或其衍生物或相当物。

术语“哺乳动物”包括人、灵长类动物、家畜(例如马、牛、绵羊、猪、驴)、实验动物(例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠)、宠物(例如狗、猫)和捕获的野生动物(例如袋鼠、鹿、狐狸)。优选地，所述哺乳动物是人或实验动物。更优选地，所述哺乳动物是人。

进行处理的哺乳动物可以是需要治疗或预防性处理一种疾病或潜在疾病的人或动物。

并非限制本发明的这一方面，施用这种免疫原性组合物可以导致抗体的产生，该抗体可预防出现症状，如毒性和免疫抑制，或者直接影响寄生虫，例如，通过与其表面结合杀死寄生虫并且抑制其生长、发育或总体感染的进展。

“有效量”是指至少部分达到希望的免疫应答或者防止或延迟所治疗的具体疾病的发病或或抑制其进展或同时停止其发病或进展所需的量。这种量因治疗个体的健康和身体状况、治疗个体的分类群、个体免疫系统合成抗体的能力、希望的保护程度、疫苗制剂、医学状况的评价和其它有关因素而异。预计这种量位于能够通过常规试验确定的相对较广的范围之内。

此处所述“治疗”和“预防”被认为是最广义的。术语“治疗”不一定是指治疗哺乳动物直到总体恢复。类似地，“预防”也不一定是指受试者最终不患一种疾病。因此，治疗和预防包括一种具体疾病的症状的好转，或者防止或减少发展为一种具体疾病的危险。术语“预防”可以被认为是降低一种具体疾病发病的严重程度。“治疗”也可以降低存在的疾病的严重程度或急性发作的频率(例如，降低初期感染的严重程度)。

按照这些方法，根据本发明定义的调节剂可以与一种或多种其它化合物或分子共施用。“共施用”是指在同一制剂中或者在两种不同制剂中通过相同或不同的途径同时施用，或者通过相同或不同的途径连续施用。“连续”施用是指施用两种类型分子之间数秒钟、数分钟、数小时或数天的时间上的差异。这些分子可以按照任何顺序施用。

在一个相关方面，本发明提供治疗和/或预防特征在于微生物感染的哺乳动物疾病的方法，该方法包括对该哺乳动物施用有效量的免疫原性组合物，该组合物含有一种分子，该分子能够诱导针对GPI的肌醇聚糖结构域的免疫应答，但是基本上不能诱导针对GPI的脂结构域的免疫应答，该组合物在一定条件下施用一段时间，使得该免疫应答足以减少、抑制或缓解与该微生物感染有关的任何一种或多种症状。

更具体而言，本发明涉及一种治疗和/或预防特征在于微生物感染的哺乳动物疾病的方法，该方法包括对该哺乳动物施用有效量的免疫原性组合物，该组合物含有一种修饰的GPI分子或其衍生物或相当物，这种修饰的GPI分子含有不足以诱导或引发针对GPI脂结构域的免疫应答的脂结构域，该组合物在一定条件下施用一段时间，使得该免疫应答足以减少、抑制或缓解与该微生物感染有关的任何一种或多种症状。

优选地，所述疾病是疟疾，所述微生物是恶性疟原虫。

或其衍生物或相当物。

在另外一个优选实施方案中，该肌醇聚糖结构域含有结构：

其中X₁、X₂、X₃和X₄是任意4种氨基酸，

或者该GPI肌醇聚糖结构域的衍生物或相当物。

EtN-P-[Mα2]Mα2 Mα6 Mα4Gα6Ino

EtN-P-[Mα2][G]Mα2 Mα6 Mα4Gα6Ino

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EtN-P-[Mα2][EtN-P]Mα2 Mα6M

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Mα2 Mα6M

Mα6 Mα4G

EtN-P-[Mα2][G]Mα2M

EtN-P-[Mα2][X]Mα2M

EtN-P-[Mα2][EtN-P]Mα2M

在另外一个方面，本发明涉及一种组合物在药物生产中的用途，该组合物含有一种分子，该分子能够诱导针对微生物GPI肌醇聚糖结构域的免疫应答，但是基本上不能诱导针对GPI的脂结构域的免疫应答，该药物用于治疗和/或预防性处理特征在于该微生物感染的一种哺乳动物疾病。

在另外一个优选实施方案中，该免疫原性组合物含有一个GPI肌醇聚糖结构域，其中该GPI肌醇聚糖结构域含有结构

更优选地，该免疫原性组合物含有一个GPI肌醇聚糖结构域，其中该GPI肌醇聚糖结构域含有结构

或其衍生物或相当物。

因此，本发明的另外一个方面涉及一种免疫原性组合物在药物生产中的用途，该组合物含有一种疟原虫GPI肌醇聚糖结构域或其衍生物或相当物，该GPI肌醇聚糖结构域含有不足以诱导或引发针对GPI脂结构域的免疫应答的疟原虫GPI的脂结构域，该药物用于治疗和/或预防性处理特征在于该疟原虫感染的一种哺乳动物疾病。

优选地，所述疾病是疟疾。

本发明也应当理解为涉及在如上所述的方法中使用的免疫原性组合物。

因此，在一个有关方面，本发明涉及一种能够诱导对微生物的免疫应答的组合物，该组合物含有一种分子，该分子能够诱导针对微生物GPI肌醇聚糖结构域的免疫应答，但是基本上不能诱导针对GPI的脂结构域的免疫应答。

更具体而言，本发明涉及一种能够诱导对微生物的免疫应答的组合物，该组合物含有一种修饰的GPI分子或其衍生物或相当物，这种修饰的GPI分子含有不足以诱导或引发针对GPI的脂结构域的免疫应答的脂结构域。

优选地，这种修饰的GPI分子是GPI的肌醇聚糖结构域部分。

更优选地，所述微生物是一种寄生虫，所述寄生虫是疟原虫。

根据本发明的这一优选方面，该免疫原性组合物优选地含有一个GPI肌醇聚糖结构域，其中该GPI肌醇聚糖结构域含有结构

或其衍生物或相当物。

在另外一个优选实施方案中，所述肌醇聚糖结构域含有结构：

其中X₁、X₂、X₃和X₄是任意4种氨基酸，

或者该GPI肌醇聚糖结构域的衍生物或相当物。

在另外一个优选实施方案中，所述肌醇聚糖结构域含有选自下列的一种结构：

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在另外一个优选实施方案中，该免疫原性组合物含有一个GPI肌醇聚糖结构域，其中该GPI肌醇聚糖结构域含有结构：

更优选地，该免疫原性组合物含有一个GPI肌醇聚糖结构域，其中该GPI肌醇聚糖结构域含有结构：

或其衍生物或相当物。

更具体而言，本发明涉及一种疫苗组合物，其含有一种修饰的GPI分子或其衍生物或相当物作为活性成分，这种修饰的GPI分子含有不足以诱导或引发针对GPI脂结构域的免疫应答的脂结构域。

优选地，这种修饰的GPI分子是一种GPI肌醇聚糖结构域。

更优选地，所述GPI肌醇聚糖结构域是一种寄生虫GPI肌醇聚糖结构域，更优选地，是一种疟原虫GPI肌醇聚糖结构域。

最优选地，所述疟原虫是恶性疟原虫。

在一个最优选的实施方案中，所述分子是一种GPI肌醇聚糖结构域，其含有结构：

乙醇胺-磷酸-(Manα1，2)-Manα1，2Manα1，6Manα1，4GlcN-磷脂酰-肌-肌醇磷酸甘油。

在另外一个最优选的实施方案中，所述分子是一种GPI肌醇聚糖结构域，其含有结构：

其中X₁、X₂、X₃和X₄是任意4种氨基酸。

在另外一个优选实施方案中，该肌醇聚糖结构域含有选自下列的结构：

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或其衍生物或相当物。

本发明的另外一个方面涉及一种药物组合物，其含有一种分子，如上文充分描述的，该分子能够诱导针对微生物GPI肌醇聚糖结构域的免疫应答，但是基本上不能诱导针对GPI的脂结构域的免疫应答，该组合物还含有一种或多种药学可接受的载体和/或稀释剂。

适合注射使用的药物形式包括无菌水溶液(水溶性时)和无菌粉末，用于即时制备无菌注射溶液或分散液，或者可以是乳膏形式或适合局部应用的其它形式。它在生产和贮藏条件下必须是稳定的，必须能够防止微生物如细菌和真菌的污染。载体可以是一种溶剂或分散介质，例如其中含有水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)，它们的适当的混合物，和植物油。，适当的流动性能够保持，例如使用一种包被，如卵磷脂，在分散时保持需要的颗粒大小，以及使用表面活性剂。微生物作用的预防能够用多种抗细菌和抗真菌剂进行，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，优选地包含等渗剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，能够使注射组合物的吸收延长。

无菌注射溶液如下制备：将活性化合物以需要的量掺入含有多种上述其它成分的适当溶剂中，需要时随后过滤除菌。分散剂通常如下制备：将多种无菌活性成分掺入含有基本分散介质和需要的上述其它成分的一种无菌载体内。对于制备无菌注射溶液的无菌粉末，优选的制备方法是真空干燥和冻干技术，由预先无菌过滤的溶液产生活性成分加其它任何希望的成分的粉末。

当活性成分适当保护时，它们可以经口施用，例如，含有一种惰性稀释剂或一种可吸收的可食用载体，或者可以包封于硬或软壳明胶胶囊中，或者可以压制成片剂，或者可以直接掺入食物中。对于经口治疗性施用，活性化合物可以与掺入赋形剂，并且以可摄食片剂、颊含片、糖锭、胶囊、酏剂、悬液、糖浆、薄片(wafers)等的形式使用。这些组合物和制剂应当含有至少1％重量的活性成分。组合物和制剂的百分比当然可能不同，适当地可能为大约5％-大约80％单位重量。这些治疗上有用的组合物中活性成分的量是获得合适剂量的量。制备根据本发明优选的组合物或制剂，使得口服剂量单位形式含有约0.1μg-2000mg活性化合物。

片剂、糖锭、丸剂、胶囊等也可以含有如下所列的成分：结合剂，如树胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，如磷酸二钙；崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等；润滑剂，如润滑剂；也可以添加甜味剂，如蔗糖、乳糖或糖精，或者增香剂，如薄荷、冬青油或樱桃香料。当剂量单位形式是一种胶囊时，除了上述类型的材料之外，它还可以含有一种液体载体。其它不同物质可以作为包衣存在，或者可以修饰剂量单位的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可以用紫胶、糖或这两者包衣。糖浆或酏剂可以含有活性化合物，蔗糖作为甜味剂，对羟基苯甲酸甲酯和丙酯作为防腐剂，染料和香料如樱桃或橙香料。当然，在制备任何剂量单位形式中使用的任何材料应当是制药纯的，在使用的量上基本上无毒。另外，活性化合物也可以掺入缓释制剂中。

药物可接受的载体和/或稀释剂包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。这些介质和试剂用于药学活性物质的应用在本领域公知。除了任何一种常规介质或试剂与活性成分一定程度地不相容之外，考虑它在治疗组合物中的应用。补充的活性成分也能够掺入该组合物中。

以易于施用和剂量均一的剂量单位形式配制肠胃外组合物是特别有利的。如此处所用的剂量单位形式是指适合以统一剂量用于治疗的哺乳动物受试者的物理分离的单位；计算含有预定含量的活性物质的每个单位，产生与需要的药学载体有关的希望的治疗效果。本发明的新剂量单位形式的规格基于并且直接取决于(a)活性物质的独特特征和将要达到的具体治疗效果，和(b)复合一种活性物质的技术所固有的限制，该活性物质用于治疗患有一种疾病的活受试者的疾病，其中如此处详细公开的，其身体健康受到损害。

为了以有效的量方便、有效地施用，主要活性成分与合适的药学可接受的载体在如上公开的剂量单位形式中复合。例如，一种单位剂型可含有含量为0.5μg-约2000mg的主要活性化合物。按照比例表示，活性化合物的含量通常是约0.5μg-约2000mg/ml载体。对于含有补充活性成分的组合物，剂量取决于常用的剂量和所述成分的施用方法。

该药物组合物也可含有遗传分子，如能够转染靶细胞的载体，其中该载体携带一种核酸分子，该分子例如能够表达一种GPI肌醇聚糖结构域或其衍生物的一种功能相当物。例如，该载体可以是一种病毒载体，它可以通过任何适当的方法施用，包括，例如：直接转染所治疗的哺乳动物的细胞，或者转染一种宿主细胞，如细菌、酵母或减毒寄生虫，然后将其引入哺乳动物中。

本发明的免疫原性GPI肌醇聚糖结构域的施用诱导抗体产生，特别是IgG产生。这些抗体涉及抑制、停止或延迟与微生物感染有关的症状的发作或进展，例如对寄生虫感染的病理应答。这些抗体如下起作用：例如，中和寄生虫诱导的TNF诱导，或者通过直接抗寄生虫效应，例如通过与其表面结合杀死寄生虫，以及抑制其生长或发育或抑制其进展。针对GPI肌醇聚糖结构域或其衍生物的抗体因此也可以用于治疗或预防性处理寄生虫感染。

因此，本发明的另外一个方面涉及针对GPI肌醇聚糖结构域、但是基本上不能与GPI的脂结构域相互作用的抗体。

这些抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，可以是任何同种型，可以选自自然存在的针对内源或外源GPI肌醇聚糖结构域的抗体，或者可以特异性针对GPI肌醇聚糖结构域。抗体也可以针对GPI肌醇聚糖结构域之外的抗原，但是与该GPI肌醇聚糖结构域的一种或多种表位具有交叉反应性。对于针对GPI肌醇聚糖结构域的抗体，一种GPI肌醇聚糖首先可能需要与如上所述的一种载体分子结合。

本发明的抗体和/或GPI肌醇聚糖结构域尤其可以用作治疗或诊断剂。例如，能够利用GPI肌醇聚糖结构域筛选自然存在的针对GPI肌醇聚糖结构域的抗体。例如，它们可能存在于一些传染病和自身免疫病中。此外，也能够利用特异性抗体筛选GPI肌醇聚糖结构域。这些测定技术在本领域公知，包括，例如：夹心测定、ELISA、Western blot和流式细胞术。为了诊断某些疾病，如寄生虫感染、自身免疫病(例如1型糖尿病)、退行性疾病(例如2型糖尿病)和身体获得性遗传缺陷(例如阵发性夜间血红蛋白尿)，或者为了监测某些治疗方案，知道GPI肌醇聚糖结构域的水平可能非常重要。这些抗体可以用作研究工具或检测GPI肌醇聚糖结构域的试剂。这些抗体也是重要的工具，例如用于筛选细胞提取物或其它生物液体中GPI肌醇聚糖结构域的水平，或者纯化通过重组方法从培养上清液中产生的GPI。在此涉及的这些测定技术在本领域公知，包括，例如：夹心测定和ELISA、Western印迹和亲和层析。

本发明的抗GPI肌醇聚糖结构域的抗体可以是单克隆或多克隆抗体。此外，也可以使用抗体片段，如Fab片段。此外，本发明也涉及重组和合成抗体、杂合抗体和人源化抗体。“合成抗体”在此被认为包括抗体的片段和杂合体。本发明该方面的抗体尤其可用于免疫治疗和免疫预防，也可以作为一种诊断工具，例如用来评价寄生虫感染，或者监测治疗方案的进展。

本发明的范围内包括针对上述第一抗体的任何第二抗体(单克隆、多克隆或抗体片段或合成抗体)。第一抗体和第二抗体都可以在检测试验中使用，或者第一抗体可以与商品获得的抗免疫球蛋白抗体一起使用。在此所述的一种抗体包括对于GPI肌醇聚糖结构域的任何区域特异的任何抗体。

多克隆和单克隆抗体都可以通过用GPI肌醇聚糖结构域免疫获得，并且可用于免疫测定。获得这两种类型的血清的方法在领域公知。多克隆血清不是优选的，但是相对容易制备，制备方法包括对合适的实验动物注射有效量的GPI肌醇聚糖结构域，或其抗原部分，从动物中采集血清，利用已知的任何免疫吸附技术分离特异性血清。尽管利用该方法生产的抗体实际上可以在任何类型的免疫测定中使用，但是它们通常不是优选的，因为产物可能具有不均一性。

在免疫测定中使用单克隆抗体是特别优选的，因为它们能够大量生产并且产物均一。通过将无限增殖细胞系与对免疫原性制品致敏的淋巴细胞融合，产生用于生产单克隆抗体的杂交瘤细胞系，它们的制备可以用本领域技术人员公知的技术进行。

本发明的另外一个方面涉及一种药物组合物，其含有抗GPI肌醇聚糖结构域的抗体，以及一种或多种如上所述的药学可接受的载体或稀释剂。

因此，本发明的另外一个方面涉及抑制、停止或延迟特征在于微生物感染的哺乳动物疾病的发病或进展的一种方法，该方法包括对该哺乳动物施用有效量的如上所述的一种抗体。

优选地，所述疾病是一种寄生虫感染，最优选地是疟疾。

另一方面，本发明涉及一种抗体在药物生产中的用途，该药物用于抑制、停止或延迟特征在于微生物感染哺乳动物的疾病的发病或进展。

优选地，所述疾病是寄生虫感染，最优选地是疟疾。

另一方面，本发明涉及一种诊断、监测、筛查或者基于抗原地定性或定量评价针对一种微生物(如寄生虫)的免疫应答或一群免疫相互作用分子的方法，其中使用上文公开的GPI肌醇聚糖分子，特别是在此公开的合成GPI肌醇聚糖分子。

因此，本发明的另外一个方面提供了一种检测生物样品中针对一种微生物的免疫相互作用分子的方法，该方法包括使该生物样品接触含有该微生物GPI肌醇聚糖结构域或其衍生物或相当物的分子，以及定性和/或定量筛查该GPI肌醇聚糖结构域-免疫相互作用分子复合物的形成。

在一个有关方面，本发明提供一种检测、监测或评价受试者中对微生物的免疫应答的方法，该方法包括使来自该受试者的生物样品接触含有该微生物GPI肌醇聚糖结构域或其衍生物或相当物的分子，以及定性和/或定量筛查GPI肌醇聚糖结构域-免疫相互作用分子复合物的形成。

“GPI肌醇聚糖结构域”应当理解为与上文所述同义。

更具体而言，根据本发明的这些方面，所述GPI肌醇聚糖结构域基本上不含能够诱导针对该GPI脂结构域的免疫应答的一个部分。最优选地，该GPI分子是GPI的肌醇聚糖结构域部分或其衍生物或相当物。

“衍生物”和“相当物”应当理解为与上文所述同义。

术语“微生物”应当最广义地理解，包括，例如：寄生虫和真菌分类单位：疟原虫属、锥虫属、利什曼原虫属、弓形体属和念珠菌属。“微生物”也应当理解为涉及由所述生物分泌或脱落的分子。可包括，例如毒素分子或从微生物表面清除的分子。优选地，适用于本发明的GPI肌醇聚糖结构域是一种寄生虫GPI肌醇聚糖结构域，更优选地是一种疟原虫GPI肌醇聚糖结构域。

一方面，本发明因此更优选地提供一种检测生物样品中针对疟原虫的免疫相互作用分子的方法，该方法包括使该生物样品接触疟原虫GPI的肌醇聚糖结构域部分或其衍生物或相当物，以及定性和/或定量筛查GPI肌醇聚糖结构域-免疫相互作用分子复合物的形成。

在一个有关方面，本发明更优选地提供一种检测、监测或评价受试者中对疟原虫的免疫应答的方法，该方法包括使来自该受试者的生物样品接触一种疟原虫GPI的肌醇聚糖结构域部分或其衍生物或相当物，以及定性和/或定量筛查GPI肌醇聚糖结构域-免疫相互作用分子复合物的形成。

更优选地，所述疟原虫是恶性疟原虫。

在这些优选方面的一个实施方案中，所述GPI肌醇聚糖结构域含有结构

或其衍生物或相当物。

在这些优选方面的另外一个实施方案中，所述GPI肌醇聚糖结构域含有结构：

其中X₁、X₂、X₃和X₄是任意4种氨基酸，

或者该GPI肌醇聚糖结构域的衍生物或相当物。

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最优选地，所述GPI肌醇聚糖结构域是一种合成分子，含有结构：

或其衍生物或相当物，其中EtN是乙醇胺，P是磷酸，M是甘露糖；或者

或其衍生物或相当物。

“生物样品”应当理解为来源于个体的生物物质的任何标本，例如，但不限于：粘液、粪便、尿、血液、血清、细胞提取物、活检标本以及导入个体体内，随后又取出的液体，例如通过肺灌洗从肺中提取的盐溶液，或由灌肠洗涤回收的溶液。根据本发明的方法检测的生物样品可以直接检测，或者可能在检测前需要一些处理。例如，活检标本在检测前可能需要匀浆化或切片。此外，样品也可能需要一些其它形式的处理，以使其适合分析。优选地，所述样品是血液样品。

“免疫相互作用分子”是具有对GPI肌醇聚糖结构域或其抗原部分的特异性和结合亲和力的任何分子。尽管优选的免疫相互作用分子是免疫球蛋白分子，但是本发明也涉及其它一些免疫相互作用分子，如抗体片段、单链抗体、去免疫的抗体，包括人源化抗体，和T细胞结合的抗原结合分子(TABMs)。最优选地，免疫相互作用分子是一种抗体，如多克隆或单克隆抗体。应当理解，所述免疫相互作用分子可以与其它任何蛋白质或非蛋白质分子或细胞连接、结合或缔合。最优选地，该抗体是一种单克隆抗体。

免疫相互作用分子显示对GPI的特异性，或者更具体而言，展示对GPI肌醇聚糖结构域的抗原决定簇或表位的特异性。GPI肌醇聚糖结构域的抗原决定簇或表位包括免疫应答可能针对的分子部分。抗原决定簇或表位优选地是一种B细胞表位，但是有时也可以是T-细胞受体结合肽。术语“抗原部分”包括抗原决定簇或表位。

本发明的一方面因此最优选地提供一种检测生物样品中的抗疟原虫抗体的方法，该方法包括使该生物样品接触一种疟原虫GPI的肌醇聚糖结构域部分或其衍生物或相当物，以及定性和/或定量筛查GPI肌醇聚糖结构域-抗体复合物的形成。

本发明的一个有关方面最优选地提供一种检测、监测或评价受试者中对疟原虫的免疫应答的方法，该方法包括使来自该受试者的生物样品接触一种疟原虫GPI的肌醇聚糖结构域或其衍生物或相当物，以及定性和/或定量筛查GPI肌醇聚糖结构域-抗体复合物的形成。

更优选地，所述疟原虫是恶性疟原虫。

“免疫应答”应当理解为任何形式的特异性免疫应答。优选地，所述应答是一种B细胞/抗体应答。也应当理解，所述免疫应答可以处于任何发育阶段。例如，在一个最优选的实施方案中，根据分泌的抗疟原虫抗体(即效应B细胞应答的产生)进行筛选。然而，也可以在细胞水平上使用方法筛查或者分析针对疟原虫GPI肌醇聚糖结构域的B细胞亚群的扩增和/或成熟，因此将产生保护性免疫。尽管优选方法是评价受试者中免疫应答的产生，但是应当理解，本发明也包括基于体外的免疫应答的分析，如在产生或分析B细胞杂交瘤中进行的分析。

“检测、监测或评价”免疫应答或免疫相互作用分子应当理解为可能设法在所述免疫应答范围内进行的任何形式的分析，包括但不限于：

(i)评价个体的临床免疫的存在、发生或程度。这涉及评价接种个体的血清转换，以及测定自然获得的抗毒素抗体的程度。如实施例18所述，能够利用GPI聚糖检测来自聚糖免疫的小鼠的抗体。也利用相同的聚糖:蛋白质偶联方法产生聚糖:蛋白质构建体，该构建体能够检测接触疟疾的人的血清中的IgG。这些抗体提供对疟疾的保护性临床免疫力，个体在接触疟疾感染后可以获得这种免疫力。这些抗体的检测可用来指示个体的临床免疫状态。例如，在大量接种工作后，希望评价目标群体的血清转换，GPI聚糖可以作为这种血清转换的一种指示物。

(ii)确定一种免疫应答是初级(例如IgM)类型的还是次级(IgG)类型的。这可能与推断个体的寄生虫感染状态是急性的还是慢性的具体相关。

(iii)监测疾病的进展，例如评价治疗应答的效果。

(iv)检测，从而可能有利于分离和分析能够中和寄生虫产生的毒素(如疟疾毒素)的抗体。

(v)检测，从而可能有利于分离和分析动物或人来源的单克隆或多克隆抗体，这些抗体针对寄生虫GPI肌醇聚糖结构域，因此能够用于治疗疾病。

本发明因此可以用作one off试验或者在体外或体内用作进行中的监测。因此，本发明的方法应当理解为涉及监测GPI抗体复合物形成水平相对于正常水平(如下文所述)或者相对于测定的指定情况的一个或多个早期水平的增加或降低。对此而言，“定性和/或定量筛查”GPI-抗体复合物的形成应当理解为包括根据复合物形成的存在与否筛查，或者根据复合物形成的水平筛查，以获得绝对数值，或者与正常水平或先前获得的水平相关联。“正常水平”是对应于未感染或者未发展免疫应答的个体的生物样品中的复合物水平。“正常”水平可以是一个标准结果，它反映由所述患者之外的健康个体获得的单个或总体结果。“正常水平”可以是分离的水平或者是一个水平范围。显示高于正常范围的复合物水平的个体通常被视为经历针对一种寄生虫感染的免疫应答的发生或扩展。

如上详述，本发明的方法已经广泛应用。上文也详述了这种筛查方法可以定性或定量进行的事实。但是定量分析可能是优选的，因为它提供与发生或不发生免疫应答或者含有具体一群免疫相互作用分子有关的信息，定性分析也有价值。具体而言，由于针对寄生虫来源的细胞分子的抗体在未感染的个体的血液中通常未发现，旨在评价所述免疫相互作用分子存在与否的一种试验可提供有用的信息。它也将提供建立极其简单且便宜的筛查方法的机会。

设计并进行这种诊断筛查测定的方法本领域技术人员公知，包括但不限于：

(i)复合物形成的体内检测。在施用能够显示受试者中免疫相互作用分子表达产物水平改变的成像剂后可以进行分子成像。

分子成像(Moore，A.，Basilion，J.，Chiocca，E.和Weissleder，R.，BBA，1402：239-249，1988；Weissleder，R.，Moore，A.，Ph.D.，Mahmood-Bhorade，U.，Benveniste，H.，Chiocca，E.A.，Basilion，J.P.Nature Medicine，6：351-355，2000)是分子表达的体内成像，它与当前使用“经典”诊断成像技术，如X-射线、计算机断层摄影术(CT)、MRI或正电子发射断层摄影术(PET)显示的总体特征相关。

(ii)适当生物样品中复合物水平改变的定性或定量测定，例如通过免疫测定。例如，在免疫测定中可以使用含有与之结合的报道分子的第二抗体检测复合物的形成。这类免疫测定包括但不限于放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)和免疫色谱技术(ICT)，本领域技术人员公知的Western印迹。例如，可以参考“Current Protocols inImmunology”，1994，其中公开了可以根据本发明使用的多种免疫测定。免疫测定可包括竞争测定。应当理解，本发明包括定性和定量免疫测定。

例如，美国专利号4,016,043、4,424,279和4,018,653公开了合适的免疫测定技术。包括非竞争型的单位点和双位点测定，以及传统竞争结合测定。

双位点测定特别适合本发明使用。这些测定具有多种变化，都包括于本发明内。简言之，在一种典型正向测定中，一种未标记的抗原分子(即GPI)固定于固体基底上，使待测样品接触结合的分子。在温育适当时间后，即足以形成抗体-抗原复合物的时间后，加入另外一种抗原结合分子并温育，该分子适当地是抗原特异的第二抗体，用一种能够产生可检测信号的报道分子标记，使反应时间足以形成抗体-抗原-标记的抗体的另外一种复合物。洗掉所有未反应的物质，通过观察报道分子产生的信号检测抗原的存在。结果可以是定性的，通过简单观察可见信号，或者可以是定量的，通过与含有已知量第一抗体的对照样品相比较。正向测定的变化包括一种同时测定，其中向结合的抗原上同时添加样品和标记的抗体。这些技术本领域技术人员公知，包括明显的较小的变化。

在典型的正向测定中，具有免疫应答效应免疫相互作用分子特异性的GPI分子与一个固体表面共价结合或者被动结合。该固体表面一般是玻璃或聚合物，最通用的聚合物是纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固体支持体可以是试管、珠、微孔板的盘或适合进行免疫测定的其它任何表面的形式。结合方法在本领域公知，通常包括交联、共价结合或物理吸附，在用于待测样品的制品中洗涤聚合物-抗体复合物。然后将一等份待测样品添加到固相复合物上，在适当条件下温育一段时间，使得所含的任何抗体都与GPI抗体结合。在温育期后，洗涤抗原-抗体复合物，干燥，与对于该抗体一部分特异的第二抗体温育。第二抗体通常含有一种与之结合的一种报道分子，用来指示第二抗体与第一抗体的结合。根据结合的报道分子测定，结合的标记抗体的量与结合在固定抗原上的第一抗体的量成正比。

根据前述，应当理解，与抗原结合分子结合的报道分子可包括：

(a)报道分子与抗体的直接附着；

(b)报道分子与抗体的间接附着；即，报道分子与另外一种测定试剂附着，该试剂随后与该抗体结合；和

(c)该抗体随后反应产物的附着。

报道分子可以选自：色原、催化剂、酶、荧光染料、化学发光分子、顺磁离子、镧系元素离子，如铕(Eu³⁴)、放射性同位素，包括其它核标记，和直接目视标记。

对于一种直接可见标记，可以使用胶体金属或非金属颗粒、染料颗粒、酶或底物、有机聚合物、乳胶颗粒、脂质体或含有一种产生信号物质的其它小泡，等等。

美国专利号4,366,241、U.S.4,843,000和U.S.4,849,338公开了适合用作报道分子的许多酶。在本发明中有用的酶包括碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、萤光素酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶等。这些酶可以单独使用，或者与溶液中的第二种酶组合使用。

合适的荧光染料包括但不限于：异硫氰酸荧光素(FITC)、四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)、R-藻红蛋白(RPE)和德克萨斯红。其它典型的荧光染料包括Dower等人的国际专利号WO 93/06121所述。也可以提到美国专利号5,573,909(Singer等人)、5,326,692(Brinkley等人)所述的荧光染料。此外，也可以提到美国专利号5,227,487、5,274,113、5,405,975、5,433,896、5,442,045、5,451,663、5,453,517、5,459,276、5,516,864、5,648,270和5,723,218所述的荧光染料。

对于一种酶免疫测定，通常利用戊二醛或高碘酸盐将一种酶与第二抗体偶联。然而可以认识到，存在技术人员易于使用的多种不同的偶联技术。通常选择特定酶使用的底物，以在用相应酶水解后产生一种可检测的颜色改变。合适的酶的例子包括上文所述。也能够使用荧光底物，它产生与上述显色底物不同的荧光产物。在所有情况下，都向第一种抗体-抗原复合物中添加酶标抗体，使之结合，然后洗掉过量的试剂。然后向抗体-抗原-抗体复合物中添加含有适当底物的溶液。该底物与连接于第二抗体的酶反应，产生定性的可见信号，这可以进一步定量，通常用分光光度计定量，指示样品中所含的抗原的量。

此外，荧光化合物，如荧光素、罗丹明和镧系元素、铕(EU)，也可以与抗体化学偶联，而不改变它们的结合能力。当用特定波长的光线照明激活时，荧光染料标记的抗体吸收光能，诱导分子的激发状态，随后发射特有颜色的光线，这可以用光学显微镜目视检测。荧光标记的抗体与第一抗体-抗原复合物结合。洗去未结合的试剂后，使剩余的三级复合物暴露于适当波长的光线下。所见的荧光表明存在目的抗原。免疫荧光测定(IFMA)在本领域公知，特别可用于该方法。然而，也可以使用其它报道分子，如放射性同位素、化学发光或生物发光分子。

(iii)除了以上第(iii)点所述之外，也利用任何适当的功能试验、酶试验或免疫学试验测定抗体产量的改变。

如上所述，可以利用任何适当的技术检测抗寄生虫抗体。选择使用的技术的性质主要取决于需要分析的生物样品的类型。这些测定属于本领域技术人员的技术范围。将要分析的一种典型样品是血液样品。

本发明还提供一种检测针对一种寄生虫感染的免疫应答的试剂盒。该试剂盒可以是任何合适的形式，但是通常含有一个如此处所述的固体支持体，它适合接受或者含有上文所述的GPI分子。该试剂盒也可以含有试剂、能够产生可检测信号的报道分子和任选地使用说明书。该试剂盒可以是模块化形式，其中各种成分可以分别购买。

因此，本发明的另外一方面涉及一种模块化试剂盒，其含有一个或多个组件，其中至少一个组件是含有如上所述的PGI分子的固体支持体。

在一个备选实施方案中，该固体支持体含有该GPI分子的结合配偶体阵列。

该试剂盒任选地可以适合电子或分光光度或荧光分析，可进一步适用于高通量筛选。

在另外一个有关方面，GPI肌醇聚糖结构域，特别是该分子的合成形式的测定，有利于高价值地分析寄生虫特异的效应免疫应答的重要方面的发生和监测，进一步有利于合理化抗毒性疫苗的设计。抗GPI聚糖的人IgG显示对聚糖内较小部分结构的表位特异性。利用合成GPI对这些表位作图能够减少需要掺入终疫苗内的残基数量。此外，对于一些表位是“自身的”而另外一些是“非自身的”来说，利用GPI聚糖及其片段对这些特异性作图提高了终产物的免疫原性和安全性。因此，用聚糖检测人IgG对于疫苗结构的下游“药物化学”合理化非常重要。

优选地，该免疫相互作用分子是一种抗体。

因此，本发明也应当理解为涉及一种分析、设计和/或修饰一种能够与抗GPI聚糖免疫相互作用分子结合位点相互作用的试剂的方法，该免疫相互作用分子可以利用以上公开的诊断方法鉴定，该方法包括使该免疫相互作用分子或其衍生物接触一种推断的试剂，评价该试剂与该结合位点的相互作用互补性的程度。

应当理解，为了评价相互作用互补性，与推断的试剂，例如一种合成GPI聚糖分子接触的免疫相互作用分子，例如一种抗体，可以在鉴定后重组产生。然而，也应当理解，所述分子可以采取一种图像的形式，该图像以阐明的结合位点结构为基础，如电子密度图，分子模型(包括但不限于棍、球和棍、空间充满或表面展示模型)或其它数字或非数字表面展示模型或图像，它有助于利用本领域技术人员公知的技术和软件分析分子位点：试剂相互作用。例如，能够利用如下技术进行相互作用分析：配体结合的开关速度和解离常数的Biacore实时分析(Gardsvoll，H.，Dano，K.，和Ploug，M.，(1999)，J Biol Chem，274(53)：37995-38003；Hoyer-Hansen，G.，Behrendt，N.，Ploug，M.，Dano，K.，和Preissner，K.T.，(1997)，FEBS Lett，420(1)79-85；Ploug，M.，(1998)，Biochemistry，37(47)：16494-16505；Ploug，M.，Ostergaard，S.，Hansen，L.B.，Holm，A.，和Dano，K.，(1998)，Biochemistry，37(11)：3612-3622；Ploug，M.，Rahbek-Nielsen，H.，Ellis，V.，Roepstorff，P.，和Dano，K.，(1995)，Biochemistry，34(39)：12524-12534；Ploug，M.，Ellis，V.，和Dano，K.，(1994)，Biochemistry，33(30)：8991-8997)和NMR干扰研究(Stephens，R.W.，Bokman，A.M.，Myohanen，H.T.，Reisberg，T.，Tapiovaara，H.，Pedersen，N.，Grondahl-Hansen，J.，Llinas，M.，和Vaheri，A.，(1992)，Biochemistry，31：7572-7579)。

“评价一种试剂与所述分子的相互作用互补性的程度”应当理解为阐明任何目标特征，包括但不限于：所述分子与目的试剂相互作用的性质和/或程度。如上所述，能够使用任何合适的技术。这些技术本领域技术人员公知，能够在此使用。关于所述相互作用的性质，可能希望评价在任何指定试剂的特定残基与分子的残基之间发生的相互作用机制的类型(例如，肽键合或氢键、离子键、范德华力等的形成)和/或它们的相对强度。也可能希望评价目的试剂与所述分子之间发生的相互作用的程度。例如，通过分析所述试剂与分子之间相互作用的实际位点的位置，能够确定该试剂向分子区域内的拟合质量，和这种结合相互作用的相对强度和稳定性。发生的结合的形式也许不一定包括如传统上理解的任何化学相互作用键合机制的形成，但是可以包括一种非键合机制，如试剂区域相对于分子结合区的邻近定位，例如，给活化分子的结合造成位阻。当相互作用采用位阻形式或产生其它排斥力时，仍然应当理解是“相互作用”的形式，尽管不能形成任何传统的键合机制形式。

也应当理解，如上所述，以一种物理形式或者作为一种图像用来评价推断试剂的相互作用互补性的分子可以一种自然存在的分子形式，或者可以是它的一种衍生物、同源物、类似物、突变体、片段或相当物。它的衍生物、同源物、类似物、突变体、片段或相当物可以采取一种物理或非物理(如图像)形式。

在上述诊断应用中用来筛选GPI聚糖免疫相互作用分子的方法学的发展有助于测定免疫相互作用分子结合位点的三维结构，以及鉴定和/或合理修饰和设计能够与该位点相互作用的试剂，例如，在抗毒性疫苗发展中应用。

绝非限制本发明的应用，本发明的方法有利于分析、设计和/或修饰能够与这些免疫相互作用分子相互作用的试剂。在这方面，一种试剂的“分析、设计和/或修饰”应当最广义地理解，包括：

(i)随机筛选(例如，使用常规高通量筛选技术)，以鉴定与所述分子相互作用的试剂。为此，能够用所述试剂浸泡晶体，或者能够进行共结晶。这些试剂通常被称为“先导”试剂，用来根据以希望的方式起作用的能力随机筛选蛋白质或非蛋白质分子。此外，例如，修饰先导试剂，使得与该分子的相互作用最大化，能够提高结合亲和力和特异性。这些分析将有利于选择最适合指定目的的试剂。这样，选择步骤不仅基于体外数据，而且基于试剂：分子相互作用位点在频率、稳定性和用于指定目的的适用性方面的技术分析。例如，这些分析可能显示，由于存在位于近端的试剂：分子位点，它显示明显的排斥力，从而使该试剂与分子之间的总体相互作用不稳定，这种非常不稳定的相互作用实际诱导对于随机鉴定的试剂的可以接受的体外活性。这将有利于选择另外一种有希望的先导化合物，它显示水平相当的体外活性，但是该试剂在进一步分析后不存在这种去稳定的排斥力。

对于此处所述的试剂的筛选能够用几种适当方法之一来实现，包括本领域技术人员公知的计算机模拟(in silico)法，例如，通常用来随机筛选蛋白质和非蛋白质分子，以鉴定先导化合物。

这些方法提供对推断的调节剂，如蛋白质或非蛋白质试剂，进行高通量筛选的一种机制，包括合成、重组、化学和天然文库。

(ii)能够修饰候选物或先导试剂(例如，根据(i)点所述的方法鉴定的试剂)，以最大化希望的与分子的相互作用(例如结合亲和力和特异性)，并最小化不希望的相互作用(如排斥或去稳定相互作用)。

本领域技术人员公知根据如此处所述的目的修饰候选物或先导试剂的方法。例如，这方面可以使用一种分子置换程序，如Amore(Navaza，J.，(1994)，Acta Cryst，A50：157-163)所述。本发明的方法也有利于已知信号诱导剂的诱变，以消除或提高信号传导活性。

(iii)除了分析拟合和/或结构修饰存在的分子之外，本发明的方法也有助于根据理论模建一种显示希望的相互作用结构特征的试剂，合理设计并合成一种试剂，随后合成并检测该试剂。

应当理解，上述(i)-(iii)中的任何一项或几项都可以用于鉴定一种具体试剂。

本发明也涉及根据本发明该方面产生的分子在如上所述的治疗、预防和诊断方法中的用途。

本发明进一步通过下列非限制性实施例描述。

实施例1

试剂、动物和寄生虫制品

链霉蛋白酶获自Boehringer Mannheim。磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C来自Calbiochem。辛基-Sepharose、蛋白-G Sepharose、n-辛基硫代吡喃葡糖苷(n-otg)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、对甲苯基磺酰-L-赖氨酸-氯甲基酮(TLCK)、N-甲苯磺酰基-L-苯丙氨酸氯甲基酮(TPCK)、对氯-汞基苯磺酸(p-CMPS)、抑酶肽、亮抑酶肽、抑胃酶肽、碘乙酰胺、n-乙基-马来酰亚胺(NEM)和伴刀豆球蛋白-A获自Sigma Chemical Co.。Sephadex来自Pharmacia。Biogel P4来自Biorad。分析或HPLC级乙酸、丁醇、氯仿、乙醚、乙醇、甲醇和水获自BDH和Waters。Silica G60TLC板来自Merck Darmstadt。氚标记的甘露糖、葡糖胺、肉豆蔻酸和棕榈酸来自Amersham。

成年雌性C57BL/6和C3H/HeJ小鼠在Walter and Eliza HallInstitute的无特定病原体(SPF)动物设施中采血及饲养。

恶性疟原虫的FCB-1系按照标准方法在体外生长，证实不含支原体污染。为了生物合成标记寄生虫蛋白质，在晚期营养体/早期甘露糖阶段，向2×10¹⁰个寄生虫的RPMI 1640培养物中添加以1∶1摩尔比与脱脂牛血清白蛋白偶联的3H-棕榈酸、3H-葡糖胺或3H-甘露糖，使终比活性为10μCurie/ml，2小时(用于标记GPI前体)或8小时(用于标记蛋白质结合的GPI)。通过0.05％皂苷裂解收获寄生虫，在低温下以15，000g离心20分钟，随后用PBS洗涤两次，贮存于-70℃下。

实施例2

195KD MSP-1和56KD MSP-2抗原的纯化

如前所述(Schofield and Hackett(1993)，同上文)，将GPI-锚定的MSP-1和MSP-2裂殖子表面蛋白纯化为均一的。在晚期裂殖阶段生物合成标记的疟原虫在0.05％皂苷中裂解，以15,000g离心20分钟，如上所述洗涤。通过在冰上超声处理，用25mM n-辛基硫代吡喃葡糖苷(n-otg)，1％BSA，1mM EDTA，0.1mM EGTA，1mM PMSF，1mM TPCK，0.1mM TLCK，5mM pCMPS，1μg/ml抑胃酶肽，1μg/ml亮抑酶肽，1mMNEM，5mM碘乙酰胺，150mM NaCl，25mM Tris/HCl pH 7.4提取沉淀。通过在低温下以20,000g离心30分钟澄清提取物，倾出上清液，上样到顺序排列的两个免疫亲和柱上，该柱含有约10mg单克隆抗体111.4或单克隆抗体113.1，每种抗体均通过戊二醛与蛋白质G-Sepharose交联(所有步骤都在冰上进行)。蛋白质提取物以0.3ml/min的速度通过该柱。首先用100ml 10mM n-otg，1％BSA，300mM NaCl洗柱，随后用100ml 10mM n-otg，300mM NaCl洗柱。用4倍柱体积的10mM n-otg，200mM甘氨酸pH 2.8从每个柱上洗脱抗原。洗脱物的pH用2M Tris中和。通过SDS-PAGE，随后用考马斯亮蓝染色，分析蛋白质等份的纯度。剩余的纯化蛋白质对100mM NH₄HCO₃充分透析，使用预先在10mM EDTA中煮沸完全，随后更换10次双蒸馏水煮沸的透析膜。蛋白质浓度用标准方法测定。

剩余的去污剂可溶性提取物用1mM CaCl₂，1mM MgCl₂和1mMMnCl₂补充，通过一个Con-A sepharose柱，随后用10倍柱体积的提取缓冲液洗涤。该柱首先用含有0.5M α-甲基-吡喃甘露糖苷和0.5M α-吡喃葡糖苷的去污剂缓冲液洗脱，随后用8M尿素中的25mM n-otg洗涤。等份进行SDS-PAGE和荧光自显影或者用考马斯蓝染色。

实施例3

确定的寄生虫抗原的C末端GPI锚的纯化

为了纯化不含去污剂、非共价结合的脂类、糖脂、磷脂和蛋白质或肽片段的完整C末端GPI，首先用有机溶剂洗涤亲和纯化的MSP-1和MSP-2。将10mg/ml GPI-锚定的蛋白质加入清洁玻璃试管中的150μl等份中。加入600μl MeOH，振荡，随后加入150μl氯仿和450μl水，进一步振荡。样品以14000rpm离心3分钟，弃去上清液，界面和下层相与450μl MeOH混合，以14000rpm再离心3分钟。蛋白质沉淀用C/M/W 10∶10∶3抽提5次，最后在-20℃下用丙酮抽提过夜。完全除去丙酮，蛋白质在6M尿素，1mM DTT，1mM碘乙酸中超声处理。在室温下15分钟后，样品稀释6倍，制成5mM CaCl₂。加入2.5％预消化的链霉蛋白酶B，在37℃下72小时，添加2次0.3％链霉蛋白酶。消化的样品在水与水饱和丁醇之间相分离，用水回提有机相。将丁醇相点样到TLC板(Si-60)上，在溶剂系统C/M/HAc/W 25∶15∶4∶2中进行。链霉蛋白酶消化的不含污染物的GPI片段仍然接近起点，根据Berthold数字放射自显影照片检测。刮下适当的区域，物质用C/M/W 10∶10∶3洗脱两次，随后用40％1-丙醇水溶液洗脱。物质在氮气下干燥，再一次在水与水饱和丁醇之间分离。

实施例4

通过TLC纯化GIPL和GPI生物合成前体

GPI生物合成中间产物和非蛋白质结合的成熟GPI种通过TLC纯化。2×10¹⁰个恶性疟原虫裂殖体在补充40mM果糖和0.5％Albumax(GIBCO)的250ml葡萄糖缺陷的RPMI 1640中用1mCi ³[H]-甘露糖或³[H]-棕榈酸标记2小时。寄生虫通过皂苷裂解收获，用PBS洗涤两次。用氯仿/甲醇(2∶1)抽提3次，用氯仿/甲醇/水(1∶1∶0.3)抽提3次。氯仿/甲醇抽提物进行重复Folch洗涤，氯仿相在Speedvac中干燥。干燥氯仿/甲醇/水抽提物，在水与水饱和丁醇之间分配。丁醇相用水洗涤，在Speedvac中干燥。这两种残余物然后通过TLC分离，该板用Bertold数字放射自显影照片TLC扫描仪扫描。鉴定放射标记的峰，刮下，再次抽提，随后干燥。位于可鉴定的峰之间及之外的区域用与假板相同的方法处理。在一些实验中，GPI进一步在辛基-Sepharose上纯化。样品加入100mM乙酸铵中的5％1-丙醇中，以0.1ml/min的流速上样到辛基-Sepharose柱上，用100mM乙酸铵，5％1-丙醇洗柱。该柱以100mM乙酸铵，5％1-丙醇到60％1-丙醇水溶液的梯度洗脱。冻干含有GPI的级分，在甲醇中闪蒸。

实施例5

GPI的化学和酶水解片段的产生

纯化的葡糖胺标记的恶性疟原虫GPI，其中所有dpms都在丁醇/水分配后在有机相中检测，通过在甲醇/氨1∶1中悬浮进行碱水解，50℃6小时，随后在水与水饱和丁醇之间分配。然后从水相中回收基本上100％的标记物。水相用水饱和丁醇抽提两次，冻干，用甲醇闪蒸。

实施例6

DEAE阴离子交换层析

将GPI上样到在99％甲醇，1％水的A DEAE柱上，用10倍柱体积的溶剂洗涤。随后用100mM乙酸铵在99％甲醇，1％水中的溶液洗脱，在氮气下干燥。

实施例7

BIOGEL P4大小排阻层析

碱水解的GPI聚糖用溶于100mM乙酸铵的酚红和葡聚糖蓝显示(spike)，通过用100mM乙酸铵水溶液平衡的1cm×1.2m Biogel P4柱进一步大小分级分离。该柱预先用与酸水解的葡聚糖标记混合的GPI重复分析，完全校准，通过用溶于浓硫酸的苔黑酚染色检测，产生葡萄糖单位的相对洗脱位置。柱层析证明是可以高度重现的。制备可省略葡聚糖标记。GPI峰通过等份的闪烁计数检测。

实施例8

通过GC/MS的组成分析

在酸甲醇分解和三甲基甲硅烷基(TMS)衍化后，通过GC-MS测定聚糖浓度和组成纯度。在酸水解(6N HCl，110℃，16h)和TMS衍化后测定肌醇的含量，选择离子监测m/z 305和318。始终使用鲨肌醇作为内部标准。

实施例9

GPI聚糖与马来酰亚胺活化的KLH的偶联

在低温和氮气下，GPI聚糖暴露于60mM三乙醇胺，7mM磷酸钾，100mM NaCl，1mM EDTA，pH 8.0中的1mM Traut′s试剂(2-亚氨基硫烷(thiolane))，90分钟。样品然后通过一个用7mM磷酸钾，100mM NaCl，1mM EDTA，pH 7.2平衡的小Biogel P4柱，通过凝胶过滤脱盐，将其加至偶联缓冲液(7mM磷酸钾，100mM NaCl，1mM EDTA，pH 7.2)中的马来酰亚胺活化的匙孔血蓝蛋白(KLH)或卵清蛋白(OVA)中过夜。通过比较透析之前及之后样品对PBS的cpm，或者利用定量巯基的埃尔曼试剂，估计偶联程度。过量的反应位点用半胱氨酸封闭。

实施例10

抗GPI抗体的表位作图

纯化的GPI聚糖与蛋白质的偶联如上所述进行。为了测定抗脂反应性，我们使用可以从Sigma购得的磷脂酰肌醇，它与疟疾GPI，即二棕榈酰-PI具有相同的组成。按照发表的方案，2mg PI与脱脂BSA偶联(Bate，C.A.W.，Taverne，J.，Kwiatkowski，D.和Playfair，J.H.L.(1993)Immunology 79：138-145)。

实施例11

ELISA测定

在磷酸结合缓冲液中的20μg/ml抗原(GPI-OVA、聚糖-OVA、BSA-PI、OVA或单独的BSA)在平底Immunlon 96-孔板中以50μl的体积温育过夜，随后用缓冲液充分洗涤。平板用溶于PBS的1％BSA、1％OVA封闭数小时。从1/32稀释开始，血清在溶于PBS的1％BSA、1％OVA中双倍滴定，50μl等份一式三份在室温下温育2小时，随后用溶于PBS的1％BSA、1％OVA、0.05％Tween-20充分洗涤。一等份亲和纯化的、生物素标记的同种型特异性山羊抗小鼠第二抗体如上所述温育，随后进一步洗涤，加入链霉抗生物素蛋白-碱性磷酸酶。30分钟后，再次洗板，加入溶于二乙醇胺缓冲液的对硝基苯酚磷酸开始比色显色。与BSA/OVA-包被的平板结合的背景平行测定。获得的终滴度是根据相同血清与BSA/OVA-包被平板非特异性结合的双向方差分析得到统计学上有差异的数值的最后一点。

实施例12

竞争ELISA

从1/32稀释开始，血清或mAb在溶于PBS，0.05％Tween-20的1％BSA中双倍滴定，在室温下与摩尔过量的竞争剂(20μg/ml PI或磷脂酰丝氨酸(PS)或单独的稀释剂)预温育4小时。在磷酸结合缓冲液中的20μg/ml抗原(BSA-PI或单独的BSA)在平底Immunlon 96-孔板中以50μl的体积温育过夜，随后用缓冲液充分洗涤。平板用溶于PBS的1％BSA封闭数小时。50μl等份滴定抗体与竞争剂或者不与竞争剂一式三份在室温下温育2小时，随后用溶于PBS的1％BSA、0.05％Tween-20充分洗涤。一等份亲和纯化的、生物素标记的同种型特异性山羊抗小鼠第二抗体如上所述温育，随后进一步洗涤，加入链霉抗生物素蛋白-碱性磷酸酶。30分钟后，再次洗板，加入溶于二乙醇胺缓冲液的对硝基苯酚磷酸开始比色显色。与BSA/OVA-包被的平板结合的背景平行测定。获得的终滴度是根据相同血清与BSA/OVA-包被平板非特异性结合的双向方差分析得到统计学上有差异的数值的最后一点。

实施例13

单克隆抗体的生产

抗GPI脂结构域的单克隆抗体如前所述生产(Tachado等人(1996)，同上文)。抗聚糖的单克隆抗体如下产生：用OVA-聚糖免疫Balb/c背景的OVA-TCR转基因小鼠，随后融合并筛选针对BSA及BSA-聚糖的杂交瘤培养上清液。

实施例14

巨噬细胞培养和TNF输出

LPS-非反应性C3H/HeJ巨噬细胞如前所述获得(Schofield andHackett(1993)，同上文，和Tachado等人(1996)，同上文)。2×10⁵个粘附细胞/孔加入单独的培养基或检测试剂。温育3小时后，通过捕获ELISA(Pharmingen)测定上清液中的TNF-α水平和标准曲线。

酪氨酸磷酸化

快速发生的酪氨酰磷酸化如前所述测定(Tachado等人(1997)，同上文)。

实施例15

PI-PLC处理和FACS分析

2×10⁵个细胞在37℃下暴露于1U/ml PI-PLC 2小时，随后洗涤。然后在冰冷的含有0.05％叠氮钠和1％BSA的鼠等渗度RPMI 1640中与单克隆抗体或鼠血清一起温育，随后洗涤，与同种型特异的FITC-偶联的抗小鼠免疫球蛋白抗体进一步温育。用相同培养基洗涤后，用0.5μg/ml碘化丙锭染色复染，通过FACSscan分析。

实施例16

用游离GPI对小鼠的免疫

以两周的间隔，用在弗氏不完全佐剂中乳化的游离完整疟疾GPI连续三次加强，免疫小鼠。对照小鼠接受等量的单独的IFA。免疫后，采集血清，抗-GPI抗体的滴度通过ELISA测定。在各种动物中，GPI免疫的所有动物均广泛产生类似水平的抗-GPI抗体(范围为1/1024-1/4096)。抗-GPI应答主要是IgM，通过竞争ELISA进行的表位作图研究表明，抗体应答主要针对该分子的脂(磷脂酰肌醇，PI)结构域，与其它磷脂决定簇有一定的交叉反应性(图1)。最后一次加强两周后，小鼠用柏氏鼠疟原虫ANKA攻击。每天记录寄生虫血症，神经并发症的进展和死亡率。寄生虫血症未见差异。在对照组中，100％的动物在第5-9天表现攻击性大脑综合征，伴有神经学指征，进而在12小时内快速死亡。然而，在完整游离GPI免疫的动物中，死亡以明显更快的速度发生(图2)。

游离GPI免疫、随后用疟疾攻击的动物中死亡率的增加可能是由于抗-GPI抗体的意料之外的自身反应性。一组IgM单克隆抗体来源于用游离GPI免疫的小鼠。从该组中随机选择的mAb通过PI-特异性ELISA证明与该分子的PI结构域有反应性(图3)，如供体免疫小鼠的多克隆血清的确定的血清特异性所预料的(图1)。另外，这些mAb和GPI-免疫小鼠的多克隆抗血清通过FACS分析也显示可与细胞表面表达的宿主GPI分子反应。尽管这是令人惊讶的，但是GPI-结合的脂决定簇在细胞表面的识别优先(Xia，M.-Q.，Hale，G.，Lifely，M.R.，Ferguson，M.A.J.，Campbell，D.，Packman，L.，和Waldmann，H.(1993)BiochemicalJournal 293：633-640)。用磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C预处理宿主细胞导致这些mAb不能结合，正式证明GPI分子的脂部分暴露于细胞表面，可被暴露于游离疟疾GPI产生的自身反应性抗体结合(图4)。这种结合也导致大量快速发生细胞内酪氨酸磷酸化(图5)，这是在细胞表面交联的宿主GPI的一种众所周知且可以预测的后果(Shenoy-Scaria，A.M.，Kwong，J.，Fujita，T.，Olszowy，M.S.，Shaw，A.S.和Lublin，D.M.(1992)Journal of Immunology 149：3535-3541和Stefanova，I.，Corcoran，M.L.，Horak，E.M.，Wahl，L.M.，Bolen，J.B.和Horak，I.D.(1993)Journal ofBiological Chemistry 268：20725-20728)。在这些抗体与巨噬细胞结合后，细胞更强烈地响应PGI、佛波酯或疟原虫提取物的刺激(图6)。在被动转移到小鼠中后，这些mAb足以导致死亡率比对照IgM mAb增加(图7)。

于是概括为：(i)用游离柏氏鼠疟原虫GPI免疫小鼠产生主要与GPI的PI结构域反应的IgM；(ii)这种免疫似乎加重了柏氏鼠疟原虫脑型疟综合征；(iii)根据死亡率升高所检测到的，在被动转移具有相同反应性的IgM单克隆抗体后也观察到致病性加强；(iv)通过FACS分析，显示这些mAb与宿主GPI交叉反应，从而导致大量细胞内酪氨酰磷酸化和巨噬细胞致敏，导致添加激动剂所致TNF输出增加。因此提出存在一种新型机制，通过这种机制，某些自身反应性免疫学特性的获得导致对疟疾毒素的生理致敏增加。

实施例17

与KLH偶联的GPI聚糖对小鼠的免疫

以前涉及抗疟疾疫苗的前景的公开文本提出了针对推测的毒素内的一个磷脂结构域进行免疫(Bate，C.A.W.，Taverne，J.，和Playfair，J.H.L.(1992c)Infection and Immunity 60：1894-1901，Bate，C.A.，Taverne，J.，Roman，E.，Moreno，C.，和Playfair，J.H.L.(1992a)Immunology 75：129-135，Bate，C.A.W.，Taverne，J.，Bootsma，H.J.，Mason，R.C.S.H.，Skalko，N.，Gregoriadis，G.，和Playfair，J.H.L.(1992b)Immunology 76：35-41，Bate等人(1993)同上文，Jakobsen，P.H.，Morris-Jones，S.D.，Hviid，L.，Theander，T.G.，Hoier-Madsen，M.，Bayoumi，R.，和Greenwood，B.M.(1993b)Immunology 79：653-657，Bate，C.A.W.和Kwiatkowski，D.(1994)Infection and Immunity 62：5261-5266和Playfair，J.H.L.(1994)Immunology Letters 43：83-86)。当前的数据强烈地表明这可能是有害的，应当避免。正在寻求发展一种新方法，即解毒并去酰化GPI，并确定针对该分子的聚糖结构域免疫是否加重疾病或者足以保护小鼠抵抗疟疾。以两周间隔，用在弗氏不完全佐剂中乳化的50μg KLH-聚糖连续三次加强，免疫小鼠(n＝7)。两个不同的对照组(每组n＝8)包括接受在IFA中的等量假偶联的KLH的动物，或者未处理的动物。免疫后，采集血清，通过ELISA测定抗GPI抗体的滴度。用KLH-聚糖免疫的所有动物都产生可以检测到的抗GPI聚糖IgG抗体，但是各动物的终滴度不同(范围为1/128-1/4096)。来自疫苗受体(而不是假-KLH对照)的血清能够抑制柏氏鼠疟原虫粗提物刺激的巨噬细胞输出TNF，在原理上确切地证明了致病性的中和(图8)。与针对GPI脂结构域的宿主反应性抗体不同，巨噬细胞预先接触血清不会导致其它激动剂引起的TNF输出增加。利用这些血清不能检测在细胞表面与宿主GPI的显著交叉反应性，这通过FACS分析与宿主细胞结合的抗体来判断。

柏氏鼠疟原虫ANKA鼠脑型疟模型与人脑型疟综合征有几个共同的特点。它是一种依赖TNF-α和干扰素-γ(IFN-γ)的脑炎，与大脑微血管内皮上ICAM-1的上调、寄生虫和巨噬细胞/嗜中性粒细胞与这些靶细胞的粘附增加以及伴随的神经并发症有关。与人脑型疟不同，在鼠综合征的末期，血脑屏障遭到破坏。然而，在近期，鼠疾病更准确地反映导致人大脑累及的炎症级联。为了确定抗GPI免疫是否能在体内防止大脑的发病，用与KLH偶联的柏氏鼠疟原虫IPG免疫小鼠。最后一次加强两周后，用柏氏鼠疟原虫ANKA攻击小鼠。每天记录寄生虫血症，神经并发症的进展和死亡率。在这些组中寄生虫血症未见差异。在两个对照组中，87.5％的动物在第7-12天表现攻击性大脑综合征，伴有神经学指征，进而在12小时内快速死亡，12.5％不发展为该综合征。由于假免疫组和未处理组之间没有显著性差异，合并这两个对照组的数据(图9)。在KLH-聚糖的受体中，一只动物(14.2％)以相似的动力学死亡，两只动物(28.5％)发展为大脑综合征，动力学大大延迟(在第10天和第11天，显示死亡前综合征过程延长)，四只动物(57.2％)完全受到保护，在所有阶段均未发展为大脑综合征(图9)。因此，用与一种载体蛋白质共价连接的恶性疟原虫GPI聚糖免疫小鼠提供了对柏氏鼠疟原虫脑型疟综合征的基本保护。

一组单克隆抗体来自用纯化的与OVA偶联的GPI聚糖(OVA-聚糖)免疫的小鼠。开始时与单独的BSA相比，根据与BSA-聚糖的结合筛选杂交瘤融合产物。检测到超过80种聚糖反应性IgG单克隆抗体。根据间接荧光抗体试验，其中许多可以与寄生虫反应，但是不与宿主红细胞反应。当以低浓度加至寄生虫总粗提物中时，纯化的单克隆抗体1G7和3G6足以100％地阻断TNF的诱导(图10)。为了确定单独的抗-GPI抗体是否足以预防重度疟疾，小鼠腹膜内感染10⁶柏氏鼠疟原虫ANKA。第4天，将它们随机分成10个接受无关IgG的对照组，和接受抗恶性疟原虫GPI肌醇磷酸聚糖mAb 1D12、2C4、3G5和4C3的5个组。所有小鼠都腹膜内接受100μg抗体/天，共7天。每日监测小鼠的寄生虫血症，每6小时监测一次临床指征。在感染后的第6-8天，100％的对照都死于脑型疟综合征。在这个过程中，接受4种抗-GPI单克隆抗体的动物尽管与对照一样寄生，但是均不显示疾病指征。在第10天，接受单克隆抗体3G5的5只动物之一死亡。除了这个个体之外，没有其它动物显示大脑指征，也没有死亡(图11)。因此，接受抗-GPI mAb的20只动物中有19/20(95％)存活，与之相比，对照组存活率为零(总共n＝30)。在整个实验过程中，寄生虫血症在试验组和对照组中相同。为了看起来清楚，该图集中显示了4个处理组。另外有5只动物单独接受抗体，而不进行寄生虫攻击。在单独接受抗体的这些小鼠中未检测到急性或毒性反应。

另外，也利用TNF-致死率的一种标准鼠模型确定GPI是否介导寄生虫诱导的急性中毒性休克。该模型表现弥散性血管内凝血、周围血管性衰竭和休克，因此与人“寒冷型疟”综合征有相同的临床特征。LPS无反应性C3H/HeJ和C57Bl6小鼠用20mg D-半乳糖胺引发(prime)，1小时后用纯化的GPI、PE或单独的PBS进行。接受D-半乳糖胺，随后单独接受载体的小鼠显示100％存活。在100％的D-半乳糖胺引发的C3H/HeJ和C57Bl6受体中，PE和纯化的GPI都诱发致死性休克。抗GPI聚糖的mAb基本上都在体内预防TNF致死性(图12)。

实施例18

合成GPI作为对抗疟疾的一种候选抗毒性疫苗

方法

蛋白质/聚糖偶联

在低温和氮气下，合成GPI聚糖1与10倍摩尔过量的Traut′s试剂(2-亚胺硫烷)在60mM三乙醇胺，7mM磷酸钾，100mM NaCl，1mM

EDTA，pH8.0中反应90分钟，向游离伯胺(乙醇胺)上引入一个巯基。样品在4℃下在偶联缓冲液中通过Giogel P4过滤脱盐，将新品加到马来酰亚胺活化的KLH或OVA(Pierce)中过夜。对水充分透析后，通过气相色谱/质谱法估计偶联率。样品在6N HC1中水解，使用鲨肌醇作为内部标准，通过选择性离子监测定量三甲基甲硅烷基衍生物的肌-肌醇含量。为了产生假偶联的载体蛋白质，马来酰亚胺活化的KLH或OVA(Pierce)进行相同的程序，不同之处在于用半胱氨酸代替巯基修饰的聚糖。

感染

所有实验都遵守当地动物伦理委员会的规定。来自JacksonLaboratories的年轻的成年C57Bl6小鼠预先采血，接种在弗氏完全佐剂中乳化的6.5μg KLH-聚糖(0.176μg聚糖，n＝16)或KLH-半胱氨酸(假免疫的，n＝24)，以2周间隔，用弗氏不完全佐剂中的等量免疫原加强。在2次加强后，它们休息，腹膜内注射1×10⁶柏氏鼠疟原虫ANKA-感染的红细胞。幼稚小鼠(n＝12)作为未免疫的对照。根据姬姆萨染色的薄膜评价寄生虫血症。死亡率每周检查两次。如果显示神经学指征，如失去反射或共济失调，在感染后的第5-12天死亡，具有相对较低的寄生虫血症水平(低于15％)，则该小鼠被判断为发展脑型疟。通过对Kaplan-Meier图进行Cox-Mantel logrank转化，估计柏氏鼠疟原虫感染的小鼠在这一阶段的存活曲线的差异。从第14天开始的伴有高寄生虫血症(＞60％)和低脑血管阻塞率的死亡可归因于高寄生虫血症/溶血，不发展脑型疟的所有动物最终都死于该综合征。

病理学

为了组织分析脑的病理学，大脑吸收10％中性缓冲的甲醛溶液，切片(5μ)，用苏木精/伊红染色。在其它实验中，6只幼稚、假免疫和KLH-聚糖免疫的小鼠组如上所述攻击。全部小鼠都与年龄/性别匹配的未感染对照一起在第6天杀死，收集它们的血清测定pH，取出肺。取出器官后立即称量湿重，在80℃温育过夜后称量干重(25)。如上所述取脑进行组织学检查。

TNF输出

不含支原体的恶性疟原虫裂殖体(3D7株)如下制备：明胶浮选，随后用(用于SDS-PAGE和Western印迹的)样品缓冲液提取，或者皂苷裂解，并且用等渗缓冲液洗涤三次。通过超声处理将寄生虫吸收到完全培养基中，5×10⁶细胞等份在100μl体积中与指定浓度的待测或对照血清预温育1小时，随后向96-孔板中加入4×10⁵靶RAW264.7细胞，16小时。按照厂商方案(Pharmingen，San Diego，USA)，通过捕获ELISA测定培养上清液中TNFα的水平，通过对重组蛋白标准曲线插值定量。

免疫荧光

10％寄生虫血症的成熟恶性疟原虫培养物的薄膜在-20℃下用丙酮固定，暴露于待测和对照抗血清(1/80)，用PBS洗涤后暴露于1/200稀释的荧光染料偶联的山羊抗-小鼠IgG(γ-链特异的)。载玻片在适当照明下照相。

统计学

实验组与对照组的统计学比较用Student′s t-检测进行，不同之处在于对于Kaplan-Meier存活率图，通过Cox-Mantel logrank转化检测。

结果

恶性疟原虫独特地显示低水平的N-和O-连接的糖基化(Dieckmann-Schuppert，A.，Bender，S.，Odenthal-Schnittler，M.，Bause，E.和Schwarz，R.T.(1992)Eur.J.Biochem.205：815-825；Dieckmann-Schuppert，A.，Bause，E.和Schwarz，R.T.(1993)Eur.J.Biochem.216：779-788)，因此GPI代表寄生虫蛋白质至少95％的翻译后碳水化合物修饰(Gowda，D.C.，Gupta，P.和Davidson，E.A.(1997)J.Biol.Chem.272：6428-6439)。在迄今为止检测的所有寄生虫分析株中，GPI结构均保守(Berhe，S.，Schofield，L.，Schwarz，R.T.和Gerold，P.(1999)Mol.Biochem.Parasitol.103：273-278)。GPI对靶宿主组织的生物活性需要脂和碳水化合物结构域两者的贡献，通过酶或化学水解的脱酰作用使碳水化合物部分无毒性(Schofield等人(1993)，同上文；Tachado，S.D.，和Schofield，L.(1994)Biochem.Biophys.Res.Commun.205：984-991；Schofield等人(1996)，同上文；Tachado等人.(1996)，同上文；Tachado等人.(1997)，同上文)。根据无毒恶性疟原虫GPI聚糖的序列(Gerold，P.，Dieckmann-Schuppert，A.和Schwarz，R.T.(1994)J.Biol.Chem.269：2597-2606)，化学合成结构NH₂-CH₂-CH₂-PO₄-(Manα1-2)6Manα1-2Manα1-6Manα1-4GlcNH₂α1-6肌-肌醇-1，2环磷酸(图13)。其结构通过MALDI-TOF质谱法和³¹P-NMR(D₂O)证明。为了制备免疫原，合成GPI聚糖用2-亚胺硫烷处理，以在磷酸乙醇胺内的伯胺处引入一个巯基，脱盐，与马来酰亚胺活化的卵清蛋白(OVA，摩尔比为3.2∶1)或匙孔

血蓝蛋白(KLH，摩尔比为191∶1)偶联。用这种材料免疫小鼠。

合成的疟疾GPI聚糖在啮齿类动物中具有免疫原性。来自KLH-聚糖免疫的动物的抗体产生针对OVA-聚糖，但是不针对含有相同载体和巯基桥接基团的假偶联OVA-半胱氨酸的阳性IgG滴度。在免疫前血清或接受假偶联的KLH的动物中未检测到对GPI聚糖的反应性。更具体而言，根据几种方法判断，针对合成的恶性疟原虫GPI聚糖的抗体与天然GPI结合。根据免疫荧光所示，这些IgG抗体可识别完整的营养体和裂殖体(图14a)，具有一种亚细胞分布，提示不包括裂殖子核。免疫前和假免疫的血清不能反应。抗GPI不能结合未感染的红细胞，尽管这些细胞表达宿主来源的内源GPI(图14a)。然而，与疟疾GPI不同，迄今为止表征的所有哺乳动物GPI都显示核心聚糖结构有氨基糖或磷酸乙醇胺修饰(McConville等人(1993)，同上文)，这些表位差异可以说明交叉反应性的缺乏。如预期的，在Western印迹中，抗GPI聚糖IgG检测多种分子，其针对恶性疟原虫感染的红细胞，但是不针对未感染的红细胞(图14b)，这符合成熟裂殖体中存在多种GPI修饰蛋白质(如MSP-1、MSP-2、MSP4、MSP-5及其加工产物)的事实。这些结果表明，蛋白质特异的特征不会显著影响抗聚糖抗体与天然GPI锚的结合。结构相同的、未与蛋白质连接的游离GPI与蛋白质连接形式的摩尔比为4∶1，经常观察到与这些部分有强反应性，在染料-front处迁移(图14b)。在Western印迹中，免疫前和假免疫的血清不能反应(图14b)。

巨噬细胞产生TNFα被广泛用作疟疾内毒素的体外活性的一种生物化学标志。纯化的疟疾GPI足够用于TNF的产生(Schofield等人(1993)，同上文；Tachado等人(1994)，同上文；Schofield等人(1996)，同上文；Tachado等人(1996)，同上文；Tachado等人(1997)，同上文)，但是仍然不清楚该试剂是否主要负责寄生虫中的这种活性。设法确定恶性疟原虫GPI特异性抗体是否能够中和寄生虫内毒素的体外活性，并且定量GPI对疟疾的总内毒素活性的贡献。与免疫前血清或采自假偶联的KLH免疫对照的血清不同，来自KLH-聚糖免疫的小鼠的抗体特异中和恶性疟原虫总粗提物诱导的巨噬细胞的TNFα输出(图14c)。这些抗体对巨噬细胞的生存力或无关激动剂(如脂多糖)引起的TNFα产生没有影响。因此，疟原虫在体外诱导宿主促炎应答需要GPI。

鼠柏氏鼠疟原虫ANKA重度疟疾模型具有与人重度和脑型疟综合征相同的显著特征。这是一种依赖TNFα的脑病，与大脑微血管内皮上ICAM-1的上调和伴随的神经并发症有关(Grau，G.E.，(1987)Science237：1210-1212；Grau，G.E.等人.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：5572-5574；Grau，G.E.等人(1991)Eur.J.Immunol.21：2265-2267；Jennings，V.M.，Actor，J.K.，Lai，A.A.& Hunter，R.L.(1997)Infect.Immun.65：4883-4887)。也观察到肺水肿和乳酸性酸中毒。与大多数但是不是全部人脑型疟病例不同，在鼠综合征的终期或末期，血脑屏障遭到破坏。然而，在近期或发育阶段，鼠病更准确地反映导致人大脑累及的细胞因子依赖的炎症级联。因此早期氏鼠疟原虫ANKA感染似乎是临床重度疟疾的最易于获得的小动物模型。为了在这个临床前模型上确定抗GPI免疫是否能够预防全身和大脑的发病，用弗氏佐剂中的6.5μgKLH-聚糖(0.18μg聚糖)或KLH-半胱氨酸引发并加强两次的C57Bl6小鼠用柏氏鼠疟原虫ANKA攻击，并监测疾病过程。100％的假免疫和幼稚对照小鼠均死于大脑综合征，显示重度神经指征，包括自行扶正反射丧失、共济失调和偏瘫，伴有明显的体温过低和偶发性血尿(图15)。这些死亡率在感染早期(第5-8天)非常明显，伴相对较低的寄生虫血症。幼稚和假免疫的小鼠之间没有差异，表明接触弗氏佐剂中的单独的载体蛋白不影响发病率。相反，用与KLH偶联的化学合成恶性疟原虫GPI聚糖免疫的小鼠基本上保护抵抗脑型疟，死亡率显著下降(75％存活率，p＜0.02，图15a)。在4个分开的其它实验中，获得如下结果：在疫苗受体(总共n＝50)中，这个时间段的存活率范围为58.3-75％，在假免疫对照(n＝85)中，存活率为0-8.7％。在这些实验中，实验组与对照组之间的寄生虫血症没有显著差异，证明抗-GPI接种不能通过影响寄生虫复制防止死亡(图15b)。脑型疟或者未患这种疾病的诊断，通过组织学检查感染6天后采集的大脑加以证实。假免疫的小鼠显示典型的病理学，包括高水平的血管阻塞，伴寄生的RBCs和宿主白细胞(图15c)。相反，免疫的动物尽管具有相似的寄生虫荷载，但是显示没有血管阻塞或者大大减少(图15c)。

人和啮齿类动物的重度疟疾都可能与其它器官特异的和全身紊乱有关，包括肺水肿和血清酸中毒。酸中毒可能是一个prime病理生理过程，是最强的单项预后指标。酸中毒的生物化学病因学还不清楚，可能是由于以下几个原因，包括：细胞因子过量的代谢后果，寄生虫产生乳酸盐，乳酸盐的肝清除率降低，组织缺氧和呼吸功能不全。人疟疾酸中毒与啮齿类动物模型的关系也有待于阐明。但是，已经设法确定抗GPI接种在小鼠中是否能够保护抵抗这些其它的非脑病综合征。到感染后6天，根据肺干重∶湿重比确定，假免疫的和幼稚个体都发展明显的肺水肿，而在疫苗受体中则显著减少(图15d)。类似地，在感染后第6天血液pH降低，表明假免疫的和未免疫的小鼠都发展显著的酸中毒，在接种的小鼠中，血液pH保持在生理水平(图15e)。由于实验组与对照组的寄生虫荷载相似，因此在这个模型上，寄生虫产生乳酸，以及该阶段任何轻度溶血性贫血对寄生虫血症的影响，都不是酸中毒的主要原因。然而，显然，针对GPI进行免疫可预防柏氏鼠疟原虫感染后肿水肿和酸中毒以及脑型疟的发展。

为了该研究进行的实验用来检验GPI与疟疾炎症级联和代谢紊乱有关的假说，并且用来确定在可以获得的最好的小动物模型上针对该靶标进行接种是否提供临床保护。小鼠每次用176ng聚糖引发并加强，这个剂量可能是次最佳剂量。对免疫方案的制剂、载体/半抗原比、佐剂、剂量或时间安排的系统优化是本领域技术人员的常规程序。因此，按照这种常规优化，在此观察到的对疾病的保护程度能够进一步提高。类似地，对于用急性柏氏鼠疟原虫ANKA感染不能充分模建的其它一些疟疾综合征，抗GPI接种可能也是有利的。

在高传播地区，对疟疾的免疫分两个阶段获得：在对重度和致死性疾病易感2-3年后，儿童产生获得性临床免疫，这保护他们抵抗危及生命的疾病，尽管持续存在高寄生虫血症(Christophers，S.R.(1924)Ind.J.Med.Res.12：273-294；Sinton，J.A.(1939)Journal of the MalariaInstitute of India 2：71-83；McGregor，I.A.，Gilles，H.M.，Walters，J.H.，Davies，A.H.和Pearson，F.A.(1956)Br.Med.J.2：686-692)。此处报告的GPI片段的化学合成有助于血清学研究和人抗GPI抗体的表位作图。

与获得的临床免疫力不同，抗寄生虫免疫需要很多年才能产生(McGregor等人(1956)，同上文)，并且容易丧失，这反映了抗原多样性、抗原变异、侵袭途径过多、免疫逃避策略等问题，以及对寄生虫抗原的免疫应答中与MHC有关的遗传限制问题。现有的抗疟疾疫苗途径是通过针对寄生虫蛋白质抗原的杀寄生虫机制诱导抗寄生虫免疫。非常有效的破伤风和白喉类毒素疫苗通过针对细菌毒素提供了对大多数有害感染后果的保护，它们证明了抗病疫苗的公共卫生潜能(Schofield，F.(1986)Rev.Infect.Dis.8：144-156)。该研究的发现证明，GPI是疟原虫来源的主要内毒素。与载体蛋白质偶联的一种无毒GPI寡糖具有免疫原性，在临床前啮齿类动物模型上提供对抗疟疾发病和死亡的显著保护。因此，GPI能够对人类疟疾的危及生命的疾病作出贡献。这些数据提示，对抗疟疾的抗毒素疫苗是可行的，所以可以进一步开发恶性疟原虫GPI的合成片段。

本领域技术人员应当理解，此处所述的本发明可以进行除具体所述之外的改变和修饰。应当理解，本发明包括所有这些改变和修饰。本发明也包括本说明书中分别或者集中提到或说明的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及任意两个或多个步骤或特征的任意或全部组合。

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Claims

1.一种免疫组合物，其含有GPI肌醇聚糖结构域部分但排除脂结构域，所述肌醇聚糖结构域部分具有被肌醇-1，2-环磷酸取代的末端肌醇-磷酸甘油，所述组合物用于治疗和/或预防哺乳动物的寄生虫感染。

2.一种药物组合物，其含有寄生虫GPI肌醇聚糖结构域部分但排除脂结构域，所述部分具有被肌醇-1，2-环磷酸取代的末端肌醇-磷酸甘油，以及一种或多种药学可接受的载体和/或稀释剂。

3.根据权利要求2的组合物，其是用于诱导针对寄生虫的免疫应答之疫苗组合物。

4.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其中所述寄生虫是疟原虫。

5.根据权利要求4的组合物，其中所述疟原虫是恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)。

6.根据权利要求4或5的组合物，其中所述GPI分子是恶性疟原虫GPI肌醇聚糖结构域。

7.一种针对合成GPI肌醇聚糖结构域的抗体，所述肌醇聚糖结构域具有被肌醇-1，2-环磷酸取代的末端肌醇-磷酸甘油，但是该抗体不能与GPI的脂结构域相互作用。

8.根据权利要求1-6任一项的组合物或根据权利要求7的抗体，其中所述GPI肌醇聚糖结构域含有结构：

EtN-P-(Manα1，2)-6Mα1，2Mα1，6Manα1，4GlcNH2α1-肌-肌醇-1，2-环磷酸，

其中EtN是乙醇胺，P是磷酸，M是甘露糖。

9.根据权利要求1-6任一项的组合物或根据权利要求7的抗体，其中所述GPI肌醇聚糖结构域含有结构：

NH₂-CH₂-CH₂-PO₄-(Manα1-2)6Manα1-2Manα1-6Manα1-4GlcNH₂-6肌-肌醇-1，2-环磷酸。

10.根据权利要求1或4-6中任一项的免疫组合物，其中所述疾病是疟疾。

11.一种包含权利要求7的抗体的药物组合物。

12.权利要求7的抗体用于制备抑制、停止或延迟特征在于寄生虫感染的哺乳动物疾病之发病或进展的药物的用途。

13.一种检测生物样品中针对微生物的免疫相互作用分子的方法，该方法包括使该生物样品接触所述分子，所述分子包含经修饰的GPI肌醇聚糖结构域，所述结构域含有不足以诱导或引发针对GPI的脂结构域的免疫应答之脂结构域，以及定性和/或定量筛查该GPI肌醇聚糖结构域-免疫相互作用分子复合物的形成。

14.权利要求13所述的方法用于检测、监测或评价受试者中对所述微生物的免疫应答。

15.权利要求13或14的方法，其中所述经修饰的GPI分子是经修饰的寄生虫GPI分子。

16.根据权利要求13-15中任一项的方法，其中所述肌醇聚糖结构域是1，2-环磷酸。

17.根据权利要求15的方法，其中所述寄生虫是疟原虫。

18.根据权利要求17的方法，其中所述疟原虫是恶性疟原虫。

19.根据权利要求18的方法，其中所述经修饰的恶性疟原虫GPI分子是恶性疟原虫GPI肌醇聚糖结构域。

20.根据权利要求19的方法，其中所述GPI肌醇聚糖结构域含有结构：

EtN-P-(Manα1，2)-6Mα1，2Mα1，6Manα1，4GlcNH₂α1-肌-肌醇-1，2-环磷酸，

其中EtN是乙醇胺，P是磷酸，M是甘露糖。

21.根据权利要求19的方法，其中所述GPI肌醇聚糖结构域含有结构：

22.一种模块化试剂盒，其含有一个或多个组件，其中至少一个组件是含有如权利要求13-21中任一项所述的GPI分子的固体支持体。