BR112021006128A2

BR112021006128A2 - imunoestimulador, alimento/bebida ou uma ração, agente preventivo de infecção para peixe, e, métodos para prevenir infecção e para fabricar glucano derivado de levedura.

Info

Publication number: BR112021006128A2
Application number: BR112021006128-2A
Authority: BR
Inventors: Takeshi Shirai; Jumpei Yoshida
Original assignee: Asahi Group Holdings, Ltd.
Priority date: 2018-10-09
Filing date: 2019-09-05
Publication date: 2021-07-20
Also published as: WO2020075424A1; EP3865138A1; EP3865138A4; TW202027757A; US20220211786A1; CN112805013A; JP6530846B1; JP2020059667A

Abstract

IMUNOESTIMULADOR, ALIMENTO/BEBIDA OU UMA RAÇÃO, AGENTE PREVENTIVO DE INFECÇÃO PARA PEIXE, E, MÉTODOS PARA PREVENIR INFECÇÃO E PARA FABRICAR GLUCANO DERIVADO DE LEVEDURA. É provido um imunoestimulador contendo glucano e com um efeito imunoestimulatório. Este imunoestimulador contém glucano derivado de paredes celulares de levedura e lipídio e é insolúvel em água. O teor total de glucano e lipídio é 80% em massa ou maior, e o teor de lipídio em relação ao teor de glucano é 0,1 a 0,4.

Description

1 / 24 IMUNOESTIMULADOR, ALIMENTO/BEBIDA OU UMA RAÇÃO, AGENTE PREVENTIVO DE INFECÇÃO PARA PEIXE, E, MÉTODOS

PARA PREVENIR INFECÇÃO E PARA FABRICAR GLUCANO DERIVADO DE LEVEDURA CAMPO TÉCNICO

[001] A presente invenção se refere a um imunoestimulador e um método para prevenir infecção.

FUNDAMENTOS DA TÉCNICA

[002] Nos anos recentes, existem preocupações em relação à propagação mundial de bactérias resistentes a fármacos. A Organização Mundial da Saúde (OMS) apontou um abuso de antibióticos para pecuária como uma das causas, e a atividade pecuária está necessitando de alternativas para antibióticos, isto é, soluções para doenças infecciosas. A melhoria de uma função imune inerente em um corpo vivo é eficiente como uma contramedida contra doenças infecciosas, e expectativas são depositadas em β-glucano, o que é amplamente reconhecido como um material com um efeito imunoestimulatório.

[003] Em relação a isso, a publicação de pedido de patente Japonesa não examinada (Tradução do pedido PCT) Nº 2017-511122 descreve um método para tratar uma parede celular de levedura para obter β-glucano solúvel em dimetil sulfóxido. Publicação de patente Japonesa submetida à inspeção pública 2009-263333 descreve uma composição contendo levedura rica em selênio e β-glucano, e considerada como tendo um efeito imunoestimulatório. Publicação de patente Japonesa submetida à inspeção pública 2004-099580 descreve uma composição imunointensificadora preparada ao realizar autólise de células de levedura. Publicação de patente Japonesa submetida à inspeção pública 2003-169607 descreve uma ração para cultivo de peixe e marisco, na qual uma composição de levedura de decomposição obtida ao realizar autólise de levedura é adicionada, e que é

2 / 24 considerada como melhoria da atividade imune.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO PROBLEMA A SER RESOLVIDO PELA INVENÇÃO

[004] Embora inúmeros materiais contendo β-glucano sejam distribuídos no mercado, os materiais tenham problemas, tal como grande variação na qualidade dependendo de um produto e da presença de muitos produtos sem garantia de funcionalidade. Portanto, um objetivo de um aspecto da presente invenção é prover um imunoestimulador contendo glucano e com um efeito imunoestimulatório.

MEIOS PARA RESOLVER O PROBLEMA

[005] Um primeiro aspecto da presente invenção provê um imunoestimulador compreendendo glucano e lipídio derivados de uma parede celular de levedura, o imunoestimulador com um percentual de teor total de glucano e lipídio de 80% em massa ou mais, com uma razão de teor de lipídio para glucano de 0,1 ou mais e 0,4 ou menos, e que é insolúvel em água. Em uma modalidade, uma razão de teor de α-glucano para β-glucano pode ser 0,2 ou mais e 0,85 ou menos. Em uma modalidade, o imunoestimulador pode compreender manana, e um percentual de teor de manana pode ser 5% em massa ou menos. Em uma modalidade, o imunoestimulador pode ser usado para peixe.

[006] Um segundo aspecto provê um alimento/bebida ou uma ração compreendendo o imunoestimulador. Um terceiro aspecto provê um agente preventivo de infecção para peixe compreendendo glucano e lipídio, o agente preventivo de infecção com um percentual de teor total de glucano e lipídio de 80% em massa ou mais. Um quarto aspecto provê um método para prevenir infecção, compreendendo administrar a um indivíduo o imunoestimulador.

[007] Um quinto aspecto provê um método para fabricar glucano derivado de levedura compreendendo: preparar uma composição contendo

3 / 24 uma parede celular de levedura submetida a um tratamento de autólise; submeter a composição contendo a parede celular de levedura a um tratamento de hidrólise alcalina para obter um hidrolisado; e recuperar glucano a partir do hidrolisado.

[008] Em uma modalidade, a composição contendo a parede celular de levedura é obtida por um método que inclui submeter uma levedura a um tratamento de autólise para obter um autolisado, e submeter o autolisado a um tratamento de centrifugação. Em uma modalidade, o tratamento de hidrólise alcalina é realizado pelo aquecimento na presença de um hidróxido de metal alcalino. Em uma modalidade, o glucano derivado de levedura tem um percentual de teor de manana de 5% em massa ou menos. Em uma modalidade, o glucano derivado de levedura tem um percentual de teor de proteína de 10% em massa ou menos. Em uma modalidade, o glucano derivado de levedura tem um coeficiente de variação de percentual de teor de glucano de 10% ou menos.

EFEITO DA INVENÇÃO

[009] De acordo com um aspecto da presente invenção, o imunoestimulador contendo glucano e tendo um efeito imunoestimulatório pode ser provido.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0010] A Fig. 1 é um gráfico que mostra uma capacidade de promover produção de espécie de oxigênio reativo por leucócitos de porcino.

[0011] A Fig. 2 é um gráfico que mostra uma capacidade de promover produção de espécie de oxigênio reativo por células do tipo neutrófilo humano.

[0012] A Fig. 3 é um gráfico que mostra uma taxa de sobrevivência de um teste de infecção por vibrião para truta arco-íris.

MODOS PARA REALIZAR A INVEÇÃO

[0013] O termo “etapa” da maneira aqui usado inclui não apenas uma

4 / 24 etapa independente, mas também uma etapa não distinguível claramente de uma outra etapa, contanto que o propósito pretendido da etapa seja atingido. Se múltiplas substâncias corresponderem a um componente em uma composição, o teor do componente na composição significa a quantidade total das múltiplas substâncias presentes na composição, a menos que de outra forma especificada. O teor de cada componente é um valor equivalente de matéria seca de um imunoestimulador e pode ser um valor médio. Um valor médio é usado como o teor neste caso, tendo em conta variações entre lotes de produção e é, por exemplo, um valor aritmético médio para 6 ou mais amostras selecionadas arbitrariamente. Um limite superior do número de amostras para calcular o valor médio é 20 ou menos, por exemplo. Modalidades da presente invenção serão agora descritas em detalhes. Entretanto, as modalidades descritas a seguir exemplificam um imunoestimulador etc. para incorporar a ideia técnica da presente invenção, e a presente invenção não é limitada ao imunoestimulador, etc., descrito a seguir. Imunoestimulador

[0014] O imunoestimulador contém glucano e lipídio, e o percentual de teor total de glucano e lipídio é 80% em massa ou mais. O imunoestimulador de acordo com a presente modalidade tem estabilidade de boa qualidade e um efeito imunoestimulatório evidente. Isto não é apenas esperado para suprimir o início e progressão de doenças infecciosas no gado, humanos, peixe de cultura, etc., mas também pode prover um meio para reduzir uma ameaça de desenvolvimento de bactérias resistentes ao fármaco. O glucano e lipídio que constituem o imunoestimulador são preferivelmente derivados de uma parede celular de levedura, por exemplo, e são preferivelmente obtidos por um pré-tratamento de hidrólise da parede celular de levedura. O tratamento de hidrólise inclui hidrólise alcalina e hidrólise ácida.

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[0015] O glucano que constitui o imunoestimulador é um polímero no qual D-glicose é ligada por ligações glicosídicas, e inclui β-glucano e α- glucano. Por exemplo, β-glucano tem um esqueleto de cadeia principal linear de ligação β-1,3 e uma cadeia lateral ramificada por ligação β-1,6. Por exemplo, α-glucano tem um esqueleto de cadeia principal linear de ligação α- 1,4 e uma cadeia lateral ramificada por ligação α-1,6.

[0016] O percentual de teor total de glucano no imunoestimulador é, por exemplo, 60% em massa ou mais, preferivelmente 65% em massa ou mais, mais preferivelmente 70% em massa ou mais e, por exemplo, 90% em massa ou menos, preferivelmente 85% em massa ou menos, mais preferivelmente 80% em massa ou menos.

[0017] O percentual de teor de β-glucano no imunoestimulador é, por exemplo, 30% em massa ou mais, preferivelmente 35% em massa ou mais, ou 40% em massa ou mais e, por exemplo, 65% em massa ou menos, preferivelmente 60% em massa ou menos, ou 50% em massa ou menos. O percentual de teor de α-glucano é, por exemplo, 10% em massa ou mais, preferivelmente 15% em massa ou mais, ou 20% em massa ou mais e, por exemplo, 40% em massa ou menos, preferivelmente 35% em massa ou menos, ou 30% em massa ou menos.

[0018] A razão do teor de α-glucano para o teor de β-glucano no imunoestimulador é, por exemplo, 0,2 ou mais e 0,85 ou menos, preferivelmente 0,25 ou mais, 0,3 ou mais, 0,4 ou mais, 0,45 ou mais, ou 0,5 ou mais, e preferivelmente 0,8 ou menos, 0,7 ou menos, ou 0,6 ou menos. Em um caso no qual a razão de teor de α-glucano para β-glucano está na faixa, a atividade de imunoestimulação tende a ser intensificada adicionalmente.

[0019] O lipídio no imunoestimulador inclui lipídio simples formado por ligação éster de álcool e ácido graxo, lipídio complexo, isto é, lipídio contendo fosfato, açúcar, proteína, etc., em moléculas, e lipídio derivado, derivado a partir do lipídio simples ou do lipídio complexo por hidrólise. O

6 / 24 percentual de teor total de lipídio no imunoestimulador é, por exemplo, 3% em massa ou mais, preferivelmente 5% em massa ou mais, ou 10% em massa ou mais e, por exemplo, 20% em massa ou menos, preferivelmente 16% em massa ou menos, ou 14% em massa ou menos. Em um caso em que o percentual de teor de lipídio está na faixa, a atividade de imunoestimulação tende a ser intensificada adicionalmente.

[0020] O percentual de teor total de glucano e lipídio no imunoestimulador é 80% em massa ou mais, preferivelmente 82% em massa ou mais. O percentual de teor total é, por exemplo, 95% em massa ou menos, preferivelmente 90% em massa ou menos, ou 88% em massa ou menos. Em um caso em que o percentual de teor total de glucano e lipídio está na faixa, a atividade de imunoestimulação tende a ser intensificada adicionalmente.

[0021] A razão do teor total de lipídio para o teor total de glucano no imunoestimulador é, por exemplo, 0,1 ou mais e 0,4 ou menos, preferivelmente 0,12 ou mais, ou 0,15 ou mais e, por exemplo, 0,3 ou menos, preferivelmente 0,25 ou menos, ou 0,2 ou menos. Em um caso em que a razão de teor de lipídio para glucano está na faixa, a atividade de imunoestimulação tende a ser intensificada adicionalmente.

[0022] O imunoestimulador pode conter adicionalmente manana além dos glucanos e lipídios. Manana é um polissacarídeo com D-manose como uma unidade constituinte principal. Em um caso em que o imunoestimulador contém manana, o percentual de teor de manana é, por exemplo, 5% em massa ou menos, preferivelmente 3% em massa ou menos, ou 1.2% em massa ou menos e, por exemplo, 0,1% em massa ou mais, preferivelmente 0,2% em massa ou mais, ou 0,3% em massa ou mais. Em um caso em que o percentual de teor de manana está na faixa, a atividade de imunoestimulação tende a ser intensificada adicionalmente. A razão do teor total de manana para o teor total de glucano no imunoestimulador é, por exemplo, 0,004 ou mais e 0,05 ou menos, preferivelmente 0,005 ou mais, ou 0,008 ou mais, e preferivelmente

7 / 24 0,02 ou menos ou 0,018 ou menos.

[0023] O imunoestimulador pode conter adicionalmente uma proteína além do glucano e lipídio. Em um caso em que o imunoestimulador contém proteína, o percentual de teor de proteína é, por exemplo, 10% em massa ou menos, preferivelmente 8% em massa ou menos, ou 6% em massa ou menos e, por exemplo, 1% em massa ou mais, preferivelmente 2% em massa ou mais, ou 3% em massa ou mais. Em um caso em que o percentual de teor de proteína está na faixa, a atividade de imunoestimulação tende a ser intensificada adicionalmente.

[0024] A razão do teor total de manana e proteína para o teor total de glucano no imunoestimulador é, por exemplo, 0,01 ou mais e 0,2 ou menos, preferivelmente 0,02 ou mais, ou 0,05 ou mais, e preferivelmente 0,1 ou menos, ou 0,09 ou menos.

[0025] O imunoestimulador pode conter adicionalmente cinza. Em um caso em que o imunoestimulador contém cinza, o percentual de teor de cinza é, por exemplo, 10% em massa ou menos, preferivelmente 6% em massa ou menos, ou 4% em massa ou menos e, por exemplo, 1% em massa ou mais, preferivelmente 1.5% em massa ou mais, ou 2% em massa ou mais. Em um caso em que o percentual de teor de cinza está na faixa, a atividade de imunoestimulação tende a ser intensificada adicionalmente.

[0026] Os teores dos componentes do imunoestimulador podem ser medidos por um método convencional. Por exemplo, o teor de glucano pode ser medido quantificando a glicose gerada hidrolisando glucano. O teor de lipídio pode ser quantificado por um método para decomposição ácida.

[0027] O imunoestimulador tem estabilidade de qualidade excelente. A estabilidade da qualidade do imunoestimulador pode ser avaliada por variações no percentual de teor de cada componente, em virtude de uma diferença no lote da produção, por exemplo. Especificamente, a estabilidade é avaliada por um coeficiente de variação (%) do percentual de teor de cada

8 / 24 componente. O coeficiente de variação (%) é calculado como um percentual de um valor obtido medindo o percentual de teor de cada componente do imunoestimulador para 6 ou mais amostras selecionadas arbitrariamente, calculando um valor aritmético médio e um desvio padrão do percentual de teor, e dividindo o desvio padrão pelo valor aritmético médio. O coeficiente de variação (%) do percentual de teor total de glucano no imunoestimulador é, por exemplo, 10% ou menos, preferivelmente 8% ou menos, ou menos de 5%. O coeficiente de variação (%) do percentual de teor de lipídio é, por exemplo, 20% ou menos, preferivelmente 15% ou menos, ou 8% ou menos. O coeficiente de variação (%) do percentual de teor total de glucano e lipídio é, por exemplo, 6% ou menos, preferivelmente 5% ou menos, ou menos de 5%. O limite inferior do coeficiente de variação é 0% e é na realidade um valor maior que 0%.

[0028] O imunoestimulador pode conter adicionalmente um componente conhecido com um efeito imunorregulatório além dos componentes principais, isto é, glucano e lipídio. Exemplos do componente com um efeito imunorregulatório incluem extrato de chá, fucoidano, arabinoxilano, lactoferrina, catequina, quitosana, oligossacarídeo de quitosana, oligossacarídeo de quitina, ácido L-ascórbico, coenzima Q10 (incluindo uma forma reduzida), etc.

[0029] O imunoestimulador pode conter qualquer componente conhecido como um componente que pode ser em geral usado em produtos farmacêuticos, alimentos, rações, etc., se necessário, tal como água, gordura e óleo, açúcares, vitaminas, adoçantes, temperos, acidulantes, conservantes, flavorizantes, corantes, excipientes, expansores, aglutinantes, espessantes, estabilizantes, emulsificantes, e ajustadores de pH.

[0030] Uma forma do imunoestimulador pode ser quaisquer dos sólidos tais como pós e grânulos, líquidos, pastas, etc. Uma forma de dosagem do imunoestimulador pode ser selecionada apropriadamente, dependendo de

9 / 24 um método para administração, uma questão de administração, etc. Exemplos da forma de dosagem incluem formulações para administração oral tais como comprimidos, cápsulas, grânulos, trocisco, pós e líquidos. Estas formulações podem ser fabricadas de acordo com um método conhecido usando aditivos tais como excipientes, lubrificantes, aglutinantes, desintegrantes, estabilizantes, agentes flavorizantes e diluentes. O imunoestimulador pode estar contido para constituir uma composição alimentar, tal como um alimento saudável ou um suplemento dietético, uma composição de bebida, uma ração, etc.

[0031] Quando administrado a um indivíduo de administração, tal como um vertebrado, o imunoestimulador faz com que uma ação imunoestimulatório ocorra no indivíduo. Em função disso, um início de doenças infecciosas no indivíduo pode ser suprimido. Portanto, o imunoestimulador pode ser aplicado em um método para prevenir doenças infecciosas no indivíduo. Exemplos de vertebrados que recebem a administração incluem mamíferos, pássaros, peixes, etc. Mamíferos podem incluir humanos e podem ser mamíferos não humanos. Exemplos de mamíferos não humanos incluem porcos, gado, cavalos, ovelha, macacos e animais de estimação tais como cachorros e gatos. Exemplos de pássaros incluem aves de corte, galinhas poedeiras, perus e patos, pombos. Exemplos de peixes incluem salmonídeos tais como salmão, truta, truta yamame, char e Ito, carpa, carpa crussiana, tilápia, bagre, robalo japonês, olho-de-boi Japonês, olho-de-boi, cauda amarela, peixe-chato, dourada, atum e enguia.

[0032] Quando o imunoestimulador é administrado como um agente farmacêutico ou alimento/bebida, por exemplo, uma quantidade de 1 mg a 500 mg (peso seco)/kg de peso corporal pode ser administrada oralmente uma vez a várias vezes ao dia. Quando o imunoestimulador é usado como alimento, bebida, ração, etc., 0,1 g a 1 g pode ser adicionado por 100 g de alimento, bebida, ração, etc.

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[0033] Quando administrado como ração, por exemplo, para mamíferos, pássaros e peixes, o imunoestimulador pode ser misturado em 0,001% em massa ou mais, e 1% em massa ou menos, com a ração a ser administrada e pode ser administrado uma vez a várias vezes ao dia. Método para Fabricar Imunoestimulador

[0034] O imunoestimulador pode ser fabricado seguindo o método para fabricação que usa uma parede celular de levedura como uma matéria- prima, por exemplo. O método para fabricar o imunoestimulador inclui, por exemplo, uma etapa de hidrólise de hidrolisar a parede celular de levedura com uma solução aquosa ácida ou uma solução aquosa alcalina para obter um hidrolisado, e uma etapa de recuperação de recuperar uma composição contendo glucano a partir do hidrolisado. Portanto, o imunoestimulador pode ser uma composição contendo glucano derivado de levedura.

[0035] A parede celular de levedura submetida à etapa de hidrólise pode ser pré-tratada em uma etapa de pré-tratamento. A etapa de pré- tratamento inclui uma etapa de autólise para realizar a autólise de levedura usada como uma matéria-prima para obter um autolisado, uma etapa de extração com água quente de submeter a levedura usada como uma matéria- prima à extração com água quente para obter um extrato em água quente, uma etapa de pré-decomposição, tal como um etapa com tratamento enzimático de tratar a levedura usada como uma matéria-prima com uma enzima para obter um produto tratado por enzima, e uma primeira etapa de centrifugação de centrifugar um produto de pré-decomposição tal como um autolisado, um extrato em água quente, e um produto tratado por enzima para obter a parede celular de levedura.

[0036] Exemplos da levedura usada como uma matéria-prima incluem leveduras de Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyberomyces, Candida, Pichia e Torulopsis, pelo menos uma selecionada a partir do grupo que consiste nestes gêneros é preferível, e leveduras de Saccharomyces é mais

11 / 24 preferível. As leveduras de Saccharomyces incluem, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces bayanus, etc., e pode ser pelo menos uma selecionada a partir do grupo que consiste nestas leveduras. As leveduras também são referidas como levedura de cerveja, levedura de uísque, levedura de shochu, levedura de padaria, levedura de vinho, levedura de saquê, levedura de bioetanol, etc., dependendo de seu uso, e pode ser pelo menos uma selecionada a partir do grupo que consiste nestas leveduras. Uma levedura pode ser usada sozinha ou duas ou mais leveduras podem ser usadas em combinação como uma matéria-prima.

[0037] Na etapa de autólise, proteína, etc., de levedura são decompostos por protease da própria levedura para obter um autolisado. Por exemplo, a etapa de autólise é realizada ajustando pH de 2 a 7 e temperatura a 40ºC ou mais, e 65ºC ou menos, por 1 hora ou mais, e 48 horas ou menos. Na primeira etapa de centrifugação, o autolisado é centrifugado para obter uma fração contendo a paredes celulares de levedura como um líquido pesado. Para centrifugação, por exemplo, uma centrífuga de bico, uma centrífuga de descarte intermitente, uma centrífuga Sharples, etc., pode ser usada na produção industrial, e condições para centrifugação podem ser ajustadas adequadamente, contanto que um componente insolúvel no autolisado possa ser recuperado.

[0038] Na etapa de hidrólise, a parede celular de levedura é hidrolisada com, por exemplo, uma solução aquosa alcalina para obter um hidrolisado. Por exemplo, uma solução aquosa contendo um hidróxido de metal alcalino, tal como hidróxido de sódio, é usado como a solução aquosa alcalina. A concentração da solução aquosa alcalina é, por exemplo, 0,01% em massa ou mais e 10% em massa ou menos, preferivelmente 0,1% em massa ou mais e 5% em massa ou menos, mais preferivelmente 1% em massa ou mais e 3% em massa ou menos. A temperatura do tratamento de hidrólise é, por exemplo, 70ºC ou mais e 100ºC ou menos, preferivelmente 85ºC ou

12 / 24 mais e 95ºC ou menos. O período do tratamento de hidrólise é, por exemplo, 1 hora ou mais e 48 horas ou menos, preferivelmente 4 horas ou mais e 24 horas ou menos.

[0039] A etapa de recuperação inclui, por exemplo, uma etapa de neutralização de neutralizar o hidrolisado para obter um produto neutralizado, se necessário, uma segunda etapa de centrifugação de centrifugar o produto neutralizado ou o hidrolisado para obter uma composição contendo glucano, e uma etapa de secagem de secar a composição contendo glucano. Realizando um tratamento de hidrólise alcalina da parede celular de levedura, obtida a partir da autolisado de levedura etc., o imunoestimulador contendo glucano e lipídio pode ser produzido com qualidade estável.

[0040] Na etapa de neutralização, um composto acídico é adicionado ao hidrolisado alcalino para ajustar o pH de 6,5 para 7,5, para obter um produto neutralizado. Ácidos inorgânicos tais como ácido clorídrico, ácido nítrico, ácido sulfúrico e ácido fosfórico, ou ácidos orgânicos tais como ácido fórmico e ácido acético são usados para o composto acídico. Na segunda etapa de centrifugação, o produto neutralizado é centrifugado para obter uma composição contendo glucano como um líquido pesado. Para centrifugação, por exemplo, uma centrífuga de bico, uma centrífuga de descarte intermitente, uma centrífuga Sharples, etc., pode ser usada em produção industrial, e condições para centrifugação podem ser ajustadas adequadamente, contanto que um componente insolúvel no produto neutralizado ou hidrolisado possa ser recuperado. Na etapa de secagem, a composição contendo glucano é seca para obter o imunoestimulador. Em relação às condições de secagem, um secador pulverizador, um secador por congelamento, um secador rotativo, etc., pode ser usado na produção industrial, e as condições podem ser ajustadas adequadamente. Uma etapa de esterilização de esterilizar a composição contendo glucano pode ser incluída antes da etapa de secagem. A etapa de esterilização pode ser realizada realizando um tratamento térmico a

13 / 24 120ºC ou mais, por 10 a 60 segundos com um esterilizador UHT, por exemplo, e pode ser ajustada adequadamente para satisfazer uma qualidade desejada. Método para Fabricar Glucano Derivado de Levedura

[0041] Um método para fabricar glucano derivado de levedura, de acordo com esta modalidade inclui uma etapa de prover para prover uma composição contendo uma parede celular de levedura autolisada, uma etapa de hidrólise de realizar um tratamento de hidrólise alcalina da composição contendo a parede celular de levedura para obter um hidrolisado, e uma etapa de recuperação de recuperar glucano a partir do hidrolisado. O glucano derivado de levedura obtido por hidrólise alcalina da parede celular de levedura, obtido ao realizar autólise de células de levedura, exibe estabilidade favorável de qualidade e suprime variações de qualidade entre os lotes de produção. O glucano derivado de levedura fabricado tem uma boa taxa de recuperação de glucano, e impurezas tais como manana e proteína são removidas de maneira suficiente. O método para fabricar glucano derivado de levedura pode ser um método para purificar glucano derivado de levedura.

[0042] Na etapa de prover, a composição contendo uma parede celular de levedura autolisada é provida. A composição contendo a parede celular de levedura pode ser selecionada apropriadamente e provida a partir de produtos comercialmente disponíveis, ou a composição contendo a parede celular de levedura com uma composição desejada pode ser fabricada e provida. A levedura usada como uma matéria-prima é da maneira descrita anteriormente.

[0043] A composição contendo a parede celular de levedura pode ser fabricado, por exemplo, por um método que inclui uma etapa de autólise para realizar a autólise das células de levedura usadas como uma matéria-prima para obter um autolisado, e uma primeira etapa de centrifugação de centrifugar o autolisado. Detalhes da etapa de autólise e a primeira etapa de

14 / 24 centrifugação são da maneira descrita anteriormente.

[0044] No método para obter a composição contendo a parede celular de levedura, as células de levedura usadas como uma matéria-prima podem ser submetidas a um tratamento de purificação antes da etapa de autólise. O tratamento de purificação inclui, por exemplo, remover contaminantes peneirando as células de levedura usadas como uma matéria-prima com uma peneira de vibração, lavando em condições alcalinas em pH 9 a 11, etc.

[0045] Na etapa de hidrólise, a parede celular de levedura é hidrolisada com uma solução aquosa alcalina para obter um hidrolisado. Detalhes da etapa de hidrólise são da maneira descrita anteriormente.

[0046] Na etapa de recuperação, o glucano é recuperado a partir do hidrolisado. O glucano obtido na etapa de recuperação é obtido como uma composição contendo glucano, por exemplo. Detalhes da etapa de recuperação são da maneira descrita anteriormente.

[0047] O método para fabricar glucano derivado de levedura é excelente nas taxas de remoção de manana, proteína, etc., atingindo ao mesmo tempo uma boa taxa de recuperação de glucano. A taxa de recuperação de glucano é calculada dividindo a quantidade total de glucano, contida no glucano derivado de levedura obtido, pela quantidade total de glucano contida na composição contendo a parede celular de levedura autolisada. A taxa de remoção de manana é calculada dividindo, pela quantidade total de manana contida na composição contendo a parede celular de levedura autolisada, uma quantidade de remoção obtida subtraindo a quantidade total de manana contida no glucano derivado de levedura, obtido a partir da quantidade total de manana contida na composição contendo a parede celular de levedura autolisada. O mesmo se aplica às taxas de remoção de proteína etc.

[0048] A taxa de recuperação de glucano no método para fabricar glucano derivado de levedura é, por exemplo, 65% ou mais, preferivelmente

15 / 24 70% ou mais, ou 75% ou mais. Um limite superior da taxa de recuperação de glucano é, por exemplo, 95% ou menos, preferivelmente 90% ou menos, ou 85% ou menos.

[0049] A taxa de remoção de manana no método para fabricar glucano derivado de levedura é, por exemplo, 85% ou mais, preferivelmente 90% ou mais, ou 95% ou mais. Um limite superior da taxa de remoção de manana é, por exemplo, 100% ou menos, preferivelmente menos de 100%.

[0050] A taxa de remoção de proteína no método para fabricar glucano derivado de levedura é, por exemplo, 80% ou mais, preferivelmente 85% ou mais, ou 90% ou mais. Um limite superior da taxa de remoção de proteína é, por exemplo, 100% ou menos, preferivelmente menos de 100%, ou 98% ou menos.

[0051] A presente invenção inclui, como um outro aspecto, um método de imunoestimulação que inclui administrar um imunoestimulador ou glucano derivado de levedura a um indivíduo. A presente invenção inclui, entre outros aspectos, um uso de um imunoestimulador ou glucano derivado de levedura na fabricação de uma composição usada no método de imunoestimulação ou o método para prevenir doenças infecciosas, um uso de um imunoestimulador ou glucano derivado de levedura no método de imunoestimulação, ou o método para prevenir doenças infecciosas, e um imunoestimulador ou glucano derivado de levedura usada no método de imunoestimulação ou o método para prevenir doenças infecciosas. Indivíduos do método de imunoestimulação, ou do método para prevenir doenças infecciosas, podem ser o vertebrados descritos anteriormente e incluem mamíferos, pássaros, peixe, etc. Exemplos

[0052] A presente invenção será daqui por diante especificamente descrita com referência aos Exemplos; entretanto, a presente invenção não é limitada a estes Exemplos.

16 / 24 Método para Fabricar Imunoestimulador 1

[0053] Paredes celulares de levedura (15% de teor sólido; derivado de levedura autolisado) derivadas a partir de levedura de cerveja que pertence ao gênero Saccharomyces, fabricadas em Tochigi Koganei Plant of Asahi Group Foods Co., Ltd., foram preparadas e submetidas a um tratamento de hidrólise. Especificamente, hidróxido de sódio foi adicionado a uma pasta fluida contendo as paredes celulares de levedura em uma concentração final de cerca de 1,5% em massa, ou cerca de 2,0% em massa, e a pasta fluida foi aquecida a 90ºC para o tratamento de hidrólise por 4 horas. A pasta fluida da parede celular de levedura tratada foi ajustada para pH 7,0 com ácido clorídrico, e foi então submetida à centrifugação em lotes em 8.000 g×10 minutos usando uma centrífuga de resfriamento em alta velocidade (Avanti J-26S XP fabricada por BECKMAN COULTER). Após um precipitado ser suspenso adicionando 1,5 L de água destilada, a centrifugação foi realizada nas condições descritas anteriormente. Esta operação foi repetida quatro vezes, e o precipitado foi seco em um secador por congelamento (FDU-2100 fabricado por EYELA) por duas noites ou mais para obter um imunoestimulador. Método para Fabricar Imunoestimulador 2

[0054] Paredes celulares de levedura (15% de teor sólido; derivado de levedura autolisado) derivadas a partir de levedura de cerveja que pertence ao gênero Saccharomyces, fabricadas em Tochigi Koganei Plant of Asahi Group Foods Co., Ltd., foram preparadas e submetidas a um tratamento de hidrólise. Especificamente, hidróxido de sódio foi adicionado a uma pasta fluida contendo as paredes celulares de levedura em uma concentração final de cerca de 1,5% em massa, ou cerca de 2,0% em massa, e a pasta fluida foi aquecida a 90ºC para o tratamento de hidrólise por 4 horas. A seguir a pasta fluida da parede celular de levedura tratada é ajustada para pH 7,0 com ácido clorídrico, e é a seguir separada em sólido e líquido, adicionando ao mesmo tempo água usando centrífugas contínuas do tipo bico (FEUX512T-31C-50 e

17 / 24 FEUX412U-31C-50, fabricadas por Alfa Laval), e o líquido obtido pesado foi esterilizado nas condições de 130ºC por 40 segundos, e a seguir foi seco em um secador rotativo para obter um imunoestimulador. Método de Análise de Glucano 1

[0055] Após aproximadamente 0,6 g de uma amostra ser pesada e 4 mL de 72 (p/p)% ácido sulfúrico ser adicionado, a mistura foi agitada em temperatura ambiente por 1 hora. Subsequentemente, a concentração de ácido sulfúrico foi ajustada para 4 (p/p)% com água Milli-Q (marca comercial registrada), e uma reação foi realizada a 121ºC por 1 hora. Após resfriar, a mistura foi neutralizada com uma solução aquosa de hidróxido de sódio. Após ajuste em volume constante, a filtração foi realizada, e o filtrado foi submetido à HPLC. A coluna foi Wakopak (marca comercial registrada), Wakosil (marca comercial registrada), 5NH2 (⌀4,6 mm×250 mm, FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation), a temperatura da coluna foi temperatura ambiente, o fase móvel foi acetonitrila:água=75:25, a vazão foi 1,0 mL/min, e a quantidade de injeção foi 2 μL. Para uma solução de reação, uma solução mista de 1 (p/v)% de arginina e 3 (p/v)% de ácido bórico foi adicionada em 0,7 mL/min, e reagida a 150ºC para detectar glicose, usando um detector de fluorescência (comprimento de onda de excitação: 320 nm, comprimento de onda de medição: 430 nm). Um percentual de teor de glicose obtido foi multiplicado por 0,9 para calcular um percentual de teor total de glicose. Método de Análise de Glucano 2

[0056] Aproximadamente 0,5 g de uma amostra foi pesada, 25 mL de 0,08 mol/L de tampão fosfato (pH 6,0) foi adicionado, 0,1 mL de Termamyl 120L (Novozymes) foi adicionado, e a mistura foi reagida em um banho- maria em ebulição por 30 minutos. Após resfriamento por radiação, pH foi ajustado para 7,5±0,1 com uma solução de hidróxido de sódio 0,275 mol/L, e protease (Sigma-Aldrich, P-5380) agiu naturalmente a 60ºC por 30 minutos. Após resfriamento por radiação, pH foi ajustado para 4,3±0,1 com 0,325

18 / 24 mol/L de ácido clorídrico, e amiloglucosidase (Sigma-Aldrich, A-9913) agiu naturalmente a 60ºC por 30 minutos. Após o tratamento enzimático, foi adicionado ao líquido quatro vezes a quantidade de etanol 95%, e a mistura permaneceu naturalmente por 1 hora ou mais. O líquido foi vertido em um filtro contendo terra de diatomácea, e filtração por sucção foi realizada. O resíduo foi lavado com etanol e acetona. O resíduo foi recuperado, 5 mL de 72 (p/p)% de ácido sulfúrico foram adicionados, e a mistura foi decomposta a 20ºC por 4 horas. Água foi adicionada em uma concentração de 4 (p/p)%, e a mistura foi decomposta em um banho-maria em ebulição por 2 horas. Resfriamento por radiação foi seguido por neutralização, ajuste para volume constante e filtração. A glicose no filtrado foi quantificada por um método de oxidase de glicose, e uma concentração de glicose foi obtida e multiplicada por 0,9 para calcular o percentual de teor de β-glucano.

[0057] O percentual de teor de α-glucano foi calculado subtraindo o percentual de teor de β-glucano a partir do percentual de teor total de glucano obtido no método de análise 1. Método de Análise de Lipídio

[0058] A quantificação foi realizada por um método para decomposição ácida. À amostra coletada, 2 mL de etanol e 10 mL de ácido clorídrico concentrado foram adicionados, e a amostra foi decomposta em um banho em temperatura constante a 70ºC até 80ºC por 30 a 40 minutos. Subsequentemente, a amostra foi transferida para um tubo de Mojonnier, misturada com etanol e dietil éter, e misturada adicionalmente com éter petróleo. Uma camada de éter foi recuperada, e uma mistura líquida de dietil éter e éter petróleo foi adicionada adicionalmente a uma camada aquosa para separar. A camada de éter foi recuperada, e a camada aquosa foi separada novamente usando dietil éter e éter petróleo para recuperar a camada de éter. Dietil éter e éter petróleo foram destilados e a seguir secos a 105ºC por 1 hora, e uma diferença de peso antes e após secagem foi obtida como uma

19 / 24 quantidade lipídica para calcular um lipídio percentual de teor a partir de uma quantidade de coleta de amostra. Método de Análise de Manana

[0059] Após aproximadamente 0,6 g de uma amostra ser pesada e 4 mL de 72 (p/p)% de ácido sulfúrico ser adicionado, a mistura foi agitada em temperatura ambiente por 1 hora. Subsequentemente, água Milli-Q (marca comercial registrada) foi adicionada para atingir a concentração de ácido sulfúrico de 4 (p/p)%, e hidrólise foi realizada a 121ºC por 1 hora. Após resfriamento por radiação, a mistura foi neutralizada e ajustada em volume constante, e um teor de manose em um filtrado foi quantificada da mesma maneira como o método de análise de glucano descrito anteriormente. A concentração de manose na amostra foi calculada e multiplicada por 0,9 para calcular um percentual de teor de manose. Método de Análise de Proteína

[0060] Um percentual de teor de proteína em uma amostra foi quantificado por um método de combustão. Um dispositivo de medir nitrogênio total (Sumika Chemical Analysis Service) foi usado para a análise. A amostra foi coletada em um barco de quartzo, uma temperatura de forno da reação foi ajustada a 870ºC ou mais, e a análise foi realizada ajustando uma temperatura de forno da reação a 600ºC, uma temperatura de detecção a 100ºC, e uma temperatura de coluna de 70ºC. Um gás de nitrogênio detectado foi quantificado e multiplicado por um coeficiente de conversão de nitrogênio-proteína de 6,25 para calcular um percentual de teor de proteína. Método de Análise de Cinza

[0061] Um percentual de teor de cinza em uma amostra foi quantificado por um método de método de incineração direto. Uma amostra foi coletada em um cadinho de porcelana e pré-incineração foi realizada. Subsequentemente, incineração foi realizada a 550ºC. Após resfriamento por radiação em um dessecador de sílica gel, o peso foi medido. Uma diferença de

20 / 24 peso antes e após incineração foi obtida como uma quantidade de cinza para calcular um percentual de teor de cinza, a partir de uma quantidade de coleta de amostra.

[0062] A tabela 1 mostra resultados de análise de componentes de 14 amostras do imunoestimulador obtido pelo método de fabricação descrito anteriormente. Os percentuais de teor dos componentes mostrados na tabela 1 são valores equivalentes ao material seco do imunoestimulador, calculados em uma base de massa. O percentual de teor de glucano na Tabela 1 é o percentual de teor total de α-glucano e β-glucano, e o mesmo se aplica a seguir. [Tabela 1] NaOH 1,5% NaOH 2,0% Todas as amostras Método de Método de Método de fabricação 1 Método de Média Desvio Coeficiente fabricação 1 fabricação fabricação 2 padrão de variação 2 (%) #1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 #8 #9 #10 #11 #12 #13 #14 Proteína 5,1 5,1 5,4 5,1 6,2 6,3 4,0 3,8 3,0 4,1 4,1 6,9 5,9 4,3 5,0 1,11 22,5 (%) Lipídio 15,1 13,8 13,9 12,7 13,9 14,2 12,9 14,0 9,1 10,7 13,2 10,2 12,8 12,2 12,8 1,69 13,2 (%) Cinza 2,1 1,9 2,0 2,1 2,5 2,6 2,5 2,9 1,2 2,6 2,4 5,1 4,8 3,5 2,7 1,07 39,1 (%) Carboidra 77,6 79,2 78,7 80,0 77,4 76,9 80,6 79,2 86,6 82,5 80,3 77,8 76,5 80,0 79,5 2,64 3,3 to (%) β-glucano 47,1 48,0 49,4 48,4 41,2 44,5 53,8 56,2 45,4 41,1 51,2 43,0 45,2 48,9 47,4 4,42 9,3 (%) α- 24,6 24,0 20,1 20,2 30,3 25,2 19,9 14,4 32,7 32,7 20,2 24,1 23,1 22,7 23,9 5,18 21,7 glucano (%) glucano 71,7 72,1 69,5 68,6 71,5 69,7 73,6 70,6 78,2 73,7 71,3 67,1 68,3 71,5 71,2 2,77 3,9 (%) manana 0,7 0,7 0,6 0,6 1,1 1,1 0,6 0,5 0,5 0,6 0,7 2,2 1,4 1,1 0,9 0,47 51,7 (%) Lipídio + 86,9 85,9 83,4 81,3 85,4 83,9 86,5 84,6 87,3 84,4 84,5 77,3 81,1 83,8 84,0 2,66 3,2 glucano (%) α- 0,52 0,50 0,41 0,42 0,74 0,57 0,37 0,26 0,72 0,80 0,39 0,56 0,51 0,46 0,52 0,15 29,5 glucano/ β-glucano Lipídio/gl 0,21 0,19 0,20 0,19 0,19 0,20 0,17 0,20 0,12 0,15 0,18 0,15 0,19 0,17 0,18 0,03 14,5 ucano

[0063] Como um exemplo de referência, 9 amostras de um imunoestimulador comercialmente disponível contendo β-1,3/1,6-glucano como um componente principal (daqui por diante, também referido como “produto comercial A”) foram obtidas a partir de diferentes lotes de produção,

21 / 24 e a análise do componente foi realizada da mesma maneira. A tabela 2 mostra valores médios, desvios padrões, e coeficientes de variação (%) de percentuais do teor dos componentes. Os percentuais do teor dos componentes mostrados na tabela 2 são valores equivalentes ao material seco em uma base de massa. [Tabela 2] Média Desvio padrão Coeficiente de variação (%) Proteína (%) 4,7 1,68 35,4 Lipídio (%) 17,8 4,98 28,0 Cinza (%) 3,7 2,74 74,3 Carboidrato (%) 73,8 7,26 9,8 β-glucano (%) 52,5 6,09 11,6 α-glucano (%) 8,6 3,30 38,6 Glucano total (%) 61,0 8,49 13,9 Manana (%) 1,4 0,72 50,8 Lipídio + glucano (%) 78,8 5,53 7,0 α-glucano/ β-glucano (%) 0,16 0,05 31,3 Lipídio/glucano (%) 0,30 0,10 33,7

[0064] Da maneira mostrada na tabela 1, o valor médio do percentual de teor total de lipídio e glucano do imunoestimulador foi 80% em massa ou mais, e a variação no percentual de teor entre as amostras foi pequena. Ao contrário, da maneira mostrada na tabela 2, o valor médio do percentual de teor total de lipídio e glucano do produto comercial A foi menos de 80% em massa, e a variação entre as amostras foi grande.

[0065] O imunoestimulador obtido da maneira descrita anteriormente e o produto comercial A foram avaliados em relação a uma capacidade de promover produção de espécie reativa ao oxigênio (ROS) para leucócitos. Capacidade de Promover Produção de ROS para Leucócitos de Porcino

[0066] Os monócitos foram isolados a partir de sangue periférico coletado de um leitão desmamado de 10 semanas. Especificamente, células mononucleares do sangue periférico (PBMC) suspensas em meio RPMI1640 contendo soro bovino fetal 10% foram semeadas em uma placa de 96 poços em 2×106 células/poço, e a seguir cultivadas por 2 horas para adesão e fixação dos monócitos nos poços. Após remover o sobrenadante da cultura e lavar com HBSS (Solução de sal balanceada de Hanks) para remover linfócitos, o

22 / 24 imunoestimulador (#5, #6) ou o produto comercial A foi adicionado em cada poço junto com um reagente luminescente (luminol) e HBSS para atingir uma concentração final de 100 μg/mL a 400 μg/mL. Subsequentemente, uma quantidade integrada de luminescência por 120 minutos foi medida com um luminômetro (Thermo Fisher Scientific). A um controle negativo, apenas o reagente luminescente (luminol) e HBSS foram adicionados, e uma unidade luminescente relativa (RLU) foi avaliada como uma quantidade de produção de ROS. A um controle positivo, forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) foi adicionado a 50 μg/mL junto com o reagente luminescente (luminol) e HBSS. Os resultados são mostrados na Fig. 1.

[0067] Da maneira mostrada na Fig. 1, o imunoestimulador #5, #6 de dois lotes diferentes de produção tem uma quantidade de produção de ROS maior que o produto comercial A, em todas as concentrações de adição de 100 μg/mL a 400 μg/mL. O percentual de teor total de glucano e lipídio do imunoestimulador #5 foi 85,4% em massa, e o percentual de teor total de glucano e lipídio do imunoestimulador #6 foi 83,9% em massa. Capacidade de Promover Produção de ROS para Leucócitos Humanos

[0068] A linhagem celular de leucemia humana HL-60 foi cultivada em meio RPMI1640 contendo 1,25% em volume de dimetil sulfóxido e soro bovino fetal 10% por 6 dias para induzir a diferenciação do tipo neutrófilo, de acordo com o método para Collins et al. (Collins SJ, Ruscetti FW, Gallagher RE, Gallo RC, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 2458-2462, 1978). A HL-60 do tipo neutrófilo suspensa no meio descrito anteriormente foi semeada em uma placa de 96 poços em 4×105 células/poço, e a seguir foi aderida e fixada nos poços cultivando por 1 hora para adesão e fixação nos poços, o imunoestimulador #14 ou o produto comercial A foi adicionado em cada poço junto com um reagente luminescente (luminol, fabricado por Nacalai Tesque) e HBSS para atingir uma concentração final de 100 μg/mL a 800 μg/mL. Subsequentemente, uma quantidade integrada de luminescência por 120

23 / 24 minutos foi medida com um luminômetro. A um controle negativo, apenas o reagente luminescente (luminol) e HBSS foram adicionados, e uma unidade luminescente relativa (RLU) foi avaliada como uma quantidade de produção de ROS. Os resultados são mostrados na Fig. 2.

[0069] Da maneira mostrada na Fig. 2, o imunoestimulador #14 da presente invenção tem uma quantidade de produção de ROS maior que o produto comercial A em todas as concentrações de adição de 100 μg/mL a 800 μg/mL. O percentual de teor total de glucano e lipídio do imunoestimulador #14 usado neste caso foi 83,8% em massa. Teste de Infecção da Doença do Vibrião da Truta Arco-íris

[0070] Vinte e cinco trutas arco-íris com um peso corporal médio de 2 g foram cultivadas com uma ração com o imunoestimulador #4 ou o produto comercial A, espalhado na concentração final de 0,2% em massa. Após sete dias a partir do início do levantamento, 0,05 mL de Vibrio anguillarum diluído com PBS, em 9×104 cfu/mL, foi injetado intraperitonealmente nas trutas arco-íris para tratamento da infecção. Subsequentemente, o levantamento continuou por 10 dias, e uma taxa de sobrevivência foi calculada a cada dia. Os resultados são mostrados na Fig. 3. Na Fig. 3, o eixo vertical indica a taxa de sobrevivência (%), e o eixo horizontal indica o número de dias decorridos após o tratamento da infecção.

[0071] A taxa de sobrevivência no 7º dia após injeção foi 64% para o controle negativo (sem tratamento), 76% para o grupo de administração do imunoestimulador, e 68% para o grupo de administração do produto comercial A. O percentual de teor total de glucano e lipídio do imunoestimulador #4 usado neste caso foi 81,3% em massa.

[0072] Da maneira mostrada na Fig. 3, o imunoestimulador da presente invenção mostrou uma taxa de sobrevivência maior que o imunoestimulador comercialmente disponível.

[0073] As descrições do pedido de patente Japonesa 2018-191154

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(Data de depósito: 9 de outubro de 2018) são aqui incorporadas pela referência na sua íntegra.

Todos os documentos, pedidos de patente, e padrões técnicos descritos nesta descrição são aqui incorporados pela referência na mesma medida, como se cada um dos documentos, pedidos de patente e padrões técnicos fossem especificamente e individualmente descritos como sendo incorporados pela referência.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Imunoestimulador, caracterizado pelo fato de que compreende glucano e lipídio derivados de uma parede celular de levedura, o imunoestimulador com um percentual de teor total de glucano e lipídio de 80% em massa ou mais, com uma razão de teor de lipídio para glucano de 0,1 ou mais e 0,4 ou menos, e sendo insolúvel em água.

2. Imunoestimulador de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que uma razão de teor de α-glucano para β-glucano é 0,2 ou mais e 0,85 ou menos.

3. Imunoestimulador de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende manana, em que um percentual de teor de manana é 5% em massa ou menos.

4. Imunoestimulador de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o imunoestimulador é usado para peixe.

5. Alimento/bebida ou uma ração, caracterizado pelo fato de que compreende o imunoestimulador como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

6. Agente preventivo de infecção para peixe, caracterizado pelo fato de que compreende glucano e lipídio, o agente preventivo de infecção com um percentual de teor total de glucano e lipídio de 80% em massa ou mais.

7. Método para prevenir infecção, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um indivíduo o imunoestimulador como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

8. Método para fabricar glucano derivado de levedura, caracterizado pelo fato de que compreende: prover uma composição contendo uma parede celular de levedura submetida a um tratamento de autólise;

submeter a composição contendo a parede celular de levedura a um tratamento de hidrólise alcalina para obter um hidrolisado; e recuperar glucano a partir do hidrolisado.

9. Método para fabricar de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a composição contendo a parede celular de levedura é obtida por um método que inclui submeter uma levedura a um tratamento de autólise para obter um autolisado, e submeter o autolisado a um tratamento de centrifugação.

10. Método para fabricar de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que o tratamento de hidrólise alcalina é realizado pelo aquecimento na presença de um hidróxido de metal alcalino.

11. Método para fabricar de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizado pelo fato de que o glucano derivado de levedura tem um percentual de teor de manana de 5% em massa ou menos.

12. Método para fabricar de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11, caracterizado pelo fato de que o glucano derivado de levedura tem um percentual de teor de proteína de 10% em massa ou menos.

13. Método para fabricar de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 12, caracterizado pelo fato de que o glucano derivado de levedura tem um coeficiente de variação de percentual de teor de glucano de 10% ou menos.