WO2020017845A1

WO2020017845A1 - 알로페론을 포함하는 폐섬유증 치료용 조성물

Info

Publication number: WO2020017845A1
Application number: PCT/KR2019/008699
Authority: WO
Inventors: 강재승; 이왕재
Original assignee: 주식회사 에이티파머
Priority date: 2018-07-17
Filing date: 2019-07-15
Publication date: 2020-01-23
Also published as: US20200023033A1; KR20200008950A; KR102257913B1

Abstract

구조식 1의 컴파운드가 페섬유증의 치료에 있어서 우수한 효능을 나타냈다. 상세하게는, 구조식 1의 화합물을 사용하여 페섬유증을 치료하는 방법이 개시된다. [구조식 1] X₁-His-Gly-X₂-His-Gly-Val-X₃ (상기 구조식 1에서, X₁은 존재하지 않거나 또는 적어도 하나의 아미노산 잔기를 나타내고, X₂는 펩티드결합 또는 적어도 하나의 아미노산 잔기를 나타내고, X₃은 존재하지 않거나, 적어도 하나의 아미노산 잔기 또는 생리적으로 가능한 염을 나타낸다.)

Description

알로페론을 포함하는 폐섬유증 치료용 조성물

본 발명은 하기 구조식 1의 펩타이드인 알로페론의 사용에 관한 것이다.

[구조식 1]

X₁-His-Gly-X₂-His-Gly-Val-X₃

(상기 구조식 1에서, X₁내지 X₃은 청구범위 및 발명의 상세한 설명에 기재된 의미를 갖는다. 또는 폐섬유증의 치료에 있어 약학적으로 가능한 염을 의미한다.)

상기 구조식 1의 컴파운드(compound) 알로페론은 동물에서 항암활성 면역조절을 수행하는 것으로 나타났다. 특히, 알로페론은 인간 말초혈액 림프구의 자연적 세포독성을 자극시키고, 마우스 및 휴먼 모델에서 인터페론 생성을 유도하며, 마우스에서 항바이럴 및 항종양 저항을 증진시키는 것으로 나타났다(Chernysh, Proceedings of the National Academy of Science of the United States 99, 12628 (2002)). 알로페론은 인터페론과 유사한 치료적 효과를 갖는 것으로 알려졌지만, 알로페론의 화학적 구조는 인터페론, 다른 알려진 사이토카인 및 인터페론 인듀서 뿐 아니라 의학적으로 중요한 다른 어떤 물질과 어떤 유사점도 공유하지 않는다(US 6,692,747).

또한 알로페론은 자연살해세포(NK cell)의 세포독성을 향상시키는 것이 알려져 있다(Bae, Immunobiology 218(8), 1026 (2013)). 자연살해세포는 임파구의 일종으로 선천적 면역체계의 구성요소다. 자연살해세포는 항종양 및 항바이러스 면역에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 알로페론은 자연살해-활성 수용체 2B4의 상향조절 및 자연살해세포의 과립 방출(exocytosis) 증진을 통해 항종양 효과를 가진다는 것이 보고되었다.

상기 구조식 1에서, X₁은 아무것도 포함하지 않거나 또는 적어도 하나의 아미노산 잔기를 나타내고, X₂는 펩티드결합 또는 적어도 하나의 아미노산 잔기를 나타내고, X₃은 US6,692,747 및 US7,462,360에서 공개된 생물학적 활성, 특히 사람과 동물 면역 시스템에서 항바이러스, 항균 및 항종양 활성을 촉진시키는 펩타이드 중 적어도 하나의 아미노산 잔기를 나타낸다. US6,692,747 및 US7,462,360에서는 또한 상기 구조식 1의 펩타이드를 결합시키는 구성을 포함하는, 면역조절 활성을 갖는 조성물의 제조방법을 공개한다. US 6,692,747, US 7,462,360 및 WO 2005/037824는 참조에 의하여 통합된다.

폐섬유증(Pulmonary fibrosis)은 폐(alveoli)에 있는 기낭의 만성적이고 진행적인 흉터 및 경화로 인해 숨쉬기가 어렵고 충분한 산소를 혈류로 공급하기 어려운 것이 특징적인 질환이다. 폐섬유증은 여러 가지 조건에 의해 유발될 수 있는데, 이를테면 실리카 분진, 석면 섬유, 단단한 금속 분진, 석탄 분진, 곡물 분진, 및 조류와 동물의 배설물과 같은 특정한 물질을 흡입함으로 인해 유발될 수 있다. 폐의 염증과 관련된 많은 의학적인 질환들 또한 폐렴, 피부근염, 다발근염, 사르코이드증, 전신홍반루푸스, 혼합결합조직병, 류머티스 관절염 및 피부경화증을 포함한 폐섬유증으로 이어질 수 있다.

폐섬유증의 진단은 특정 물질에 대한 노출, 건강진단, 고해상도 단층촬영술(HRCT) 및 개흉폐 또는기관지 생검을 포함한 흉부 방사선 촬영을 포함하는 신중한 이력(history)에 의해 이루어질 수 있다. 폐섬유증의 증상을 보이는 환자의 최대 3분의 2에서는 폐섬유증의 근본적인 원인을 찾을 수 없다. 이러한 알려지지 않은 병인 질환을 특발성 간질성 폐렴이라고 한다. 개흉폐 생검에서 얻은 조직의 히스토릭 검사를 통해 이러한 환자를 특발성 폐섬유증(UIP), 박리성간질성 폐렴 (DIP), 비특이성 간질성 폐렴(NSIP) 을 포함한 여러 범주로 분류할 수 있다.

폐섬유증은 콜라겐과 같은 세포외기질요소의 섬유아세포(fibroblast)에 의한 과잉 침착으로 발생되는 폐조직의 과성장, 경화 및 흉터를 포함한다. 섬유아세포는 염증과 조직 손상 부위로의 면역세포 모집(recruitment)에 역할을 한다. 게다가 섬유아세포는 많은 염증성 사이토카인을 생성하며 그에 반응한다. 따라서, 섬유아세포는 만성 염증에 기여할 수 있으며, 역으로 염증성 사이토카인은 섬유아세포의 근섬유아세포로의 전환을 촉진시켜 섬유증을 촉진한다. 따라서 폐조직의 부상이나 염증은 폐섬유증으로 이어질 수 있다.

피르페니돈(Pirfenidone, Esbriet®)과 닌테다닙(Nintanib, Ofev®)은 미국 F.D.A.로부터 폐섬유증 치료 승인을 받았다. 피르페니돈의 경우, 환자에게 첫 번째 주(치료일 1~7일) 동안 매일 267mg의 정제 한알 처리로 시작하는 것이 권장 치료법이다. 8일차에는 2주차(치료일 8-14일) 동안 매일 267mg 정제 2정으로 복용량을 늘린다. 15일차에 복용량은 매일 267mg 정제 3정으로 증가한다. 267mg 정제 3정 또는 캡슐 TID를 충분히 투여한 후, 매일 처방되는 알약이 보다 적은 유지옵션을 위해 매일 801mg 정제 1정을 처방받는 조건으로 이행된다. 닌테다닙 권장 복용량은 하루에 두번, 150mg을 12시간 간격을 두고 처리하는 것이다.

현재로서는 폐섬유증의 진행을 역전시키거가 정지시킬 수 있는 치료방법은 없다. 최근 승인된 치료법들, 피르페니돈과 닌테다닙과 같은 치료 요법들은 폐섬유증의 진행을 늦출 뿐이며 몇 가지 심각한 부작용과 연관되어 있다. 따라서, 폐섬유증의 진행을 멈추기 위한 안전하고 효과적인 치료 요법이 필요하다.

[선행기술문헌]

[특허문헌]

(특허문헌 1) US6692747 B2

(특허문헌 2) US7462360 B2

(특허문헌 3) WO2005037824 A2

(특허문헌 4) WO2013176563 A1

[비특허문헌]

(비특허문헌 1) Chernysh, Proceedings of the National Academy of Science of the United States 99, 12628 (2002)

(비특허문헌 2) Bae, Immunobiology 218(8), 1026 (2013)

(비특허문헌 3) Evans, J. Med. Chem. 30, 1229 (1987)

(비특허문헌 4) Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th edition, (ed. A. Gennaro; Lippincott, Williams & Wilkins 2000)

본 발명의 일 측면은 상기 구조식 1의 컴파운드를 포함하는 폐섬유증 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 다른 측면은 폐섬유증을 치료하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 환자에게 단일요법으로 상기 구조식 1의 컴파운드의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 구조식 1의 컴파운드를 유효성분으로 함유하는, 폐섬유증 치료용 약학적 조성물이 제공된다.

[구조식 1]

X₁-His-Gly-X₂-His-Gly-Val-X₃

(상기 구조식 1에서,

X₁은 존재하지 않거나 또는 적어도 하나의 아미노산 잔기를 나타내고, X₂는 펩티드결합 또는 적어도 하나의 아미노산 잔기를 나타내고, X₃은 존재하지 않거나, 적어도 하나의 아미노산 잔기 또는 생리적으로 가능한 염을 나타낸다.)

또한, 상기 구조식 1의 컴파운드는 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

또한, 콜라겐 침착을 억제할 수 있다.

또한, 염증성 세포의 침윤을 억제할 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 조성물을 포함하는 폐섬유증 치료용 약제학적 제제가 제공된다.

상기 구조식 1 의 컴파운드가 폐섬유증 치료에 있어 예기치 않은 이점을 제공하는 것으로 나타났다. 상기 구조식 1 의 컴파운드는 폐섬유증과 관련된 염증을 현저하게 저하시키는 것으로 나타났다. 게다가, 상기 컴파운드의 처리는 섬유조직에서의 콜라겐 침착을 완전히 억제하는 효과를 나타냈다.

도 1은 콜라겐 침착을 보여주기 위한 염색된 폐조직의 조직학,

도 2는 알로페론이 처리된 후의 콜라겐 침착을 보여주기 위한 염색된 폐조직의 조직학,

도 3은 콜라겐을 위해 염색된 폐조직을 보여주는 것으로, (a) 대조군 동물, (b)블레오마이신 처리된 동물, (c)알로페론 및 블레오마이신 처리된 동물로부터 얻은 것,

도 4는 폐조직의 콜라겐 함량을 측정한 것으로, (a) 대조군 동물, (b) 블레오마이신 처리된 동물, (c)알로페론 및 블레오마이신 처리된 동물로부터 얻은 것,

도 5는 블레오마이신 유도된 폐섬유증 조직의 기관지폐포세척액 세포분석을 나타낸 것,

도 6은 알로페론 처리된 기관지폐포세척액에서의 염증 세포군 분석을 나타낸 것,

도 7은 PBS 처리 대조군에 비해 알로페론 처리된 실험군의 IL-17⁺ 및 IFN-γ⁺ 세포가 현저하게 증가한 것을 보여주는 것,

도 8은 은 PBS 처리 대조군에 비해 알로페론 처리된 실험군에서 IL-6, TNF-α, MCP-1, MIP-1 및 MIP-2 의 현저한 감소를 보여주는 것.

이하 설명에서는 개시하는 발명의 일 측면에 대한 이해를 제공하기 위한 많은 구체적인 세부사항이 기재되어 있다. 그러나, 이러한 세부사항 없이도 구조, 시스템 및 방법을 포함하는 구체적인 실시예가 수행될 수 있다는 것은 당 기술분야의 기술자들에게 자명할 것이다. 본 발명에 대한 설명 및 표현은 당 기술분야에 능숙 또는 숙련된 사람이 자신의 작업 실체를 다른 사람들에게 가장 효과적으로 전달하기 위하여 사용되는 당업계 일반적인 수단이다. 다른 경우에서, 본 발명에 개시된 발명의 실시예들을 모호하지 않게 하기 위하여 잘 알려진 방법, 공정, 구성요소 및 회로를 자세히 설명하지 않았다.

여기에 통합되어 규격의 일부를 구성하는 수반되는 도면은 현재 공개의 구현을 예시하며, 또한 설명과 함께, 구현의 원리를 설명하고 관련 기술에 숙련된 사람이 구현을 만들고 사용할 수 있도록 하는 역할을 한다.

본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 일 측면 및 다른 측면 모두에 있어서 구조식 1은 하기와 같이 표현된다.

[구조식 1]

X₁-His-Gly-X₂-His-Gly-Val-X₃

또한, 상기 구조식 1에서, X₁내지 X₃은 각각 다음과 같은 컴파운드를 포함하도록 정의된다.

X₁은 존재하지 않거나 또는 적어도 하나의 아미노산 잔기를 나타내고, X₂는 펩티드결합 또는 적어도 하나의 아미노산 잔기를 나타내고, X₃은 존재하지 않거나 또는 적어도 하나의 아미노산 잔기를 나타낸다. 또는 면역조절 활성을 나타내는 펩타이드로 약학적으로 적용가능한 염 또는 에테르이다.

본 발명의 일 실시예를 설명함에 있어서, 상기 구조식 1의 컴파운드를 ‘알로페론(alloferon)’이라 하기로 한다. 본 발명의 바람직한 일 실시예에서, 상기 알로페론은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가진다. 보다 바랍직한 일 실시예에서, 상기 알로페론은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가진다. 상기 알로페론은 천연으로부터 분리 및 정제하거나 또는 합성하여 얻은 것일 수 있다.

상기 구조식 1의 펩타이드는 당 분야에 공지된 방법으로 합성될 수 있다. 상기 합성은, 예를 들면, 페닐아세타마이드 메틸 폴리머(phenyl acetamide methyl polymer, PAM)의 Boc/Bzl전략 고체상 펩타이드 합성일 수 있다(WO2013/176563). 본 발명의 일 측면에 따른 펩타이드의 정제가 수행될 수 있으며, 예를 들면, 두단계 프로토콜(two-step protocol)을 통해 수행될 수 있다. 이의 첫번째 단계는 C18 흡수제(Waters)가 있는 Sep-Pak Vac 컬럼에서 40% 아세토나이트릴(acetonitrile) 로 녹이고 0.05% 트리플루오로초산(trifluoroacetic acid)으로 산성화되어 수행된다. 다음으로, 펩타이드는 C18 column 을 장착한 HPLC의 0.05% 트리플루오로초산 및 산성화된 아세토나이트릴의 선형 그래디언트 (40분동안 0-20% 아세토나이트릴을 유속 2.5 ml/min 및 검출파장 225 nm)를 이용해 동질성을 갖도록 정제된다. 펩타이드 순도는 MALDI-TOF 질량분석법으로 확인되고, 펩타이드의 아미노산 서열은 마이크로시퀀싱으로 확인된다.

여기에 기재된 펩타이드 외에 펩티도미메틱(peptidomimetics; 펩타이드유사체) 또한 고려된다. 펩타이드 유사체(apatide analogs)는 템플릿 펩타이드와 유사한 성질을 갖는 비펩타이드 약물로서 제약산업에서 흔히 사용된다. 이러한 펩티도미메틱은 화학적으로 변형된 펩타이드, 비자연적으로 발생하는 아미노산을 포함하는 펩타이드 유사분자 및 펩토이드를 포함한다. 이런 종류의 비펩타이드 화합물은 “펩타이드 미메틱” 또는 “펩티도미메틱스”라고 불리며(Evans, J. Med. Chem. 30, 1229 (1987)), 흔히 컴퓨터화된 분자적 모델링에 의해 개발된다. 펩타이드 미메틱은 구조적으로는 치료적으로 유용한 펩타이드와 유사하며, 이러한 유사체(mimetic)를 사용하여 펩타이드와 동등한 치료 또는 예방 효과를 낼 수 있다

펩타이드 또는 펩티도미메틱은 환형 또는 다른 구조로 결합될 수 있다. 구조적으로 결합된 분자들은 향상된 특성, 이를 테면 향상된 친밀성, 대사적 안정성, 막 투과성 또는 용해성을 가질 수 있다. 구조적 결합 방법은 당업계에 공지되어 있다.

본 발명의 일 측면에서, 상기 구조식 1의 컴파운드를 포함하는 조성물이 준비될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 비경구적 투여를 위한 조성물로, 일반적으로 약학적으로 수용가능한 캐리어, 바람직하게는 수용성 캐리어에 담긴 펩타이드의 용액 또는 현탁액의 형태로 되어 있다. 사용가능한 수용성 캐리어로는, 예를 들면 물, 완충액, 식염수(0.4%), 글라이신 용액(0.3%), 히알루론산 및 이와 유사하게 알려진 캐리어들이 있다. 수용성 캐리어 외에도 디메틸설폰(dimethylsulphoxide), 프로필렌글라이콜(propyleneglycol), 디메틸포름아미드(dimethylformamide) 및 이들의 혼합물과 같은 용매도 사용할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 약학적으로 수용가능한 첨가제, 예를 들면, 정상 삼투압 및/또는 효과적인 동결건조를 위한 완충 물질 및 무기염을 포함할 수 있다. 상기 첨가제로는, 예를 들면 나트륨(sodium) 및 칼륨(potassium) 염, 염소 및 인산염, 수크로스, 글루코스, 단백질 가수분해효소, 덱스트란(dextran), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone) 또는 폴리에틸렌 글라이콜(polyethylene glycol)이 있다. 상기 조성물은 종래 방법, 예를 들면 멸균 여과와 같은 방법에 의하여 멸균될 수 있다. 상기 조성물은 그 형태 그대로 사용되거나 또는 동결건조시킨후 사용전에 멸균 용액과 혼합하여 사용될 수도 있다. 상기 조성물은 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화할 수 있다. 상기 조성물은 공지된 방법을 통해 약제학적 제제로 제조될 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 실시예는 폐섬유증을 치료하기 위한 단일요법으로 상기 구조식 1 의 컴파운드를 사용하는 것과 관련된다.

질병의 종류와 정도에 따라, 상기 구조식 1의 컴파운드를 체중의 1 μg/kg 에서 1000 mg/kg의 농도로 1일 1회 환자에게 초기투여할 수 있으며, 또한, 예를 들어, 별도 분리 투여 또는 연속 투여로 투여할 수 있다. 일반적인 일일 복용량은 전술한 요인에 따라 약 1 μg/kg에서 100mg/kg 이상까지 다양할 수 있으며, 바람직하게는 체중의 약 0.1 내지 20mg/kg인 것이 좋으며, 피하 또는 근육 투여시에는 체중의 약 1 내지 20mg/kg일 수 있다. 이 용량 범위에 있어서 필요적인 변형은 여기 주어진 일상적 실험만을 통해 당업계의 일반적 기술자에 의해 결정될 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th edition, (ed. A. Gennaro; Lippincott, Williams & Wilkins 2000)). 수일 또는 그 이상에 거쳐 반복 투여되는 경우에는, 상태에 따라 원하는 정도로 질병 증상이 억제될 때까지 치료를 지속한다. 그러나, 다른 복용량 요법이 유용할 수 있다. 본 발명에 따른 치료의 진행은 종래 기술 및 분석을 통해 쉽게 모니터링될 수 있다.

상기 구조식 1의 컴파운드를 포함하는 조성물은 여러 가지 방법으로 투여될 수 있다. 대표적인 전달 요법은 경구, 피하, 근육내 및 정맥 주사를 포함하는 비경구, 직장, 설하를 포함한 구강, 경피, 흡입, 눈 및 비강 투여를 포함한다.

본 발명의 일 실시예에서, 펩타이드의 전달은 제어된 방출 주입 가능한 제형의 피하주입을 수반한다. 다른 실시예에서, 여기에서 설명된 펩타이드 및/또는 단백질은 피하, 비강 및 흡입 투여에 유용하다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 좀 더 상세하게 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 첨부된 특허청구범위를 제한하는 것이 아니며, 본 발명의 범주 및 기술사상범위 내에서 실시예에 대한 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.

실시예

<실시예 1 : 재료 및 방법>

블레오마이신(bleomycin)의 기관내 접종은 다음과 같이 수행되었다. 몸무게 24~28g의 8~10주 수컷 생쥐(C57BL/6)가 사용되었다. 체중을 측정한 후, 생쥐들은 아베르틴(avertin, Sigma Aldrich) 복강내 주사로 마취되었다. 생쥐 기관지는 생쥐 목의 1.0cm 세로 절개에 의해 노출되었고, 체중 1kg당 멸균된 인산염완충식염수 용액에 용해된 블레오마이신 1.5mg 또는 2.0mg을 함유한 블레오마이신 염산염(bleomycin hydrochloride, Nippon Kayaku Co., Tokyo, Japan) 용액 55μl를 주입하였다. 생쥐들은 블레오마이신 접종 당일부터 매일 50 μg의 알로페론이 복강내 처리되었다. 모든 절차는 무균 환경에서 이루어졌으며 서울대 윤리위원회의 심사와 승인을 받았다.

조직병리학적 점수 측정을 위한 샘플링은 다음과 같이 수행되었다. 생쥐들은 CO₂ 질식사로 안락사되었다. 개흉 후 폐는 우측 심실을 통해 식염수로 관류되어 기관지를 통해 4% 파라포름알데히드 용액(인산염 버퍼) 2ml로 팽창시켜 24시간 동안 고정되었다. 일상적인 광학 현미경 기법은 파라핀 임베딩에 적용되었고, 섹션은 H&E 및 Masson's trichrome 염색법으로 염색되었다.

기관지폐포(Bronchoalveolar, BAL) 세포 카운팅은 다음과 같이 수행되었다. 생쥐들은 CO₂ 질식사로 안락사되었다. 생쥐들은 생물안전 작업대(biosafety cabinet)에서 70% 에탄올로 적셔졌다. 그리고 나서 생쥐들을 스티로폼 판넬 위에 앞쪽을 향하게 놓고, 팔과 다리는 바늘이나 테이프로 고정시켰다. 가위로 복부에서 목까지 피부를 절개하고, 피부는 포셉으로 수축시켜 가슴우리와 목을 노출시켰다. 목 주위의 근육을 부드럽게 제거하여 기관지를 노출시켰다. 포셉으로 기관 밑에 약 10 cm 길이의 나일론 끈을 놓았다. 그런 다음 갈비뼈를 절단하여 기관지와 폐의 절단 없이 심장과 폐를 노출시켰다. 22G 카테터(22G x 1 in. Exel Safelet Catheter) 를 기관지에 삽입하고 탐침 허브(stylet hub)를 제거한 후 카테터와 기관지를 나일론 실로 단단히 묶었다. 1ml 주사기에 0.8ml의 인산완충식염수(PBS)를 담고 카테터 끝에 두었다. PBS는 4번 주입 및 흡인되었다. 그런 다음 주사기는 카테터에서 제거되었고, 회수된 세척액은 얼음 위에 둔 1.5ml 에펜도르프 튜브에 저장되었다. BAL 볼륨은 1.5ml 에펜도르프 튜브의 척도에 따라 기록되었다. BAL액(BAL fluid)은 800xg, 4℃, 10분 조건으로 원심분리하였다. 다음, 상등액을 새로운 5ml 튜브로 옮기고, 프로테아제 억제 칵테일을 최종 농도 1X가 되도록, PMSF를 최종농도 1mM가 되도록 첨가하여 잘 섞어주었다. BAL 세포 펠렛은 400 μl PBS에 풀어주고, 세포 샘플에서 20 μl를 취해 헤모사이토미터로 옮겨 현미경으로 세포를 카운팅하여 세포수를 계산하였다.

콜라겐 함량 측정은 다음과 같이 수행되었다. 폐조직은 100 μl ddH₂O로 균질화(homogenization)되었다. 기밀 바이알(pressure-tight Teflon capped vial) 에서, 샘플 호모제네이트(homogenate) 100 μl에 100μl의 농축 HCl(~12M)을 첨가했다. 샘플들은 120℃에서 3시간 동안 가수분해되었다. 균질화 후 샘플들에 활성탄 4 mg을 첨가하여 활성탄 첨가로 샘플들을 명확하게 하였다. 그 다음 샘플들은 볼텍스되고 침전물과 활성탄을 제거하기 위해 10000x g에서 3분간 원심분리되었다. 각 가수 분해 샘플의 10-30 μl는 96-well 플레이트로 옮겨져 진공 상태/핫 플레이트 위/오븐에서 증발시켜 건조되었다. 1.0 mg/ml Collagen I 표준(Standard)은 2 mg/ml Type I Standard 50 μl을 50 μl 0.02 M 아세트산에 첨가하고 0, 2, 4, 6, 8 및 10 μg 의 collagen/well을 제조하는데 사용되었다. 볼륨은 0.02 M Acetic Acid로 조정되었다. 다음, 12 M HCl 10 μl를 기밀 바이알에 첨가하고 120℃에서 3시간 동안 가수분해하였다. 바이알들은 얼음 위에 두었고, 내용물은 스핀다운하였다. 각 바이알의 내용물(~15 μl)은 96-well 플레이트로 옮겨져 진공 상태/핫 플레이트 위/오븐에서 증발시켜 건조되었다. 각 샘플 시료 및 표준(standard)에 100 μl의 Chloramine T 시약을 첨가하여 상온에서 5분간 배양했다. 그런 다음 DMAB 시약 100μl를 각 웰에 넣고 60℃에서 90분간 배양했다. 흡광도는 마이크로플레이트 판독기로 560nm에서 측정되었다. 총 콜라겐 농도(C)는 하기 수학식 1을 이용하여 다음과 같이 계산되었다.

(상기 수학식 1에서, B; 표준 곡선으로부터의 샘플 내 콜라겐 양(μg), V; 반응 웰로 첨가된 샘플 볼륨(μl), D: 샘플 희석 계수)

BAL의 염증 세포군 분석은 다음과 같이 수행되었다. 생쥐들은 CO₂챔버에서 CO₂ 질식사로 안락사되었다. 생쥐들은 생물안전 작업대(biosafety cabinet)에서 70% 에탄올로 적셔졌다. 그리고 나서 생쥐들을 스티로폼 판넬 위에 앞쪽을 향하게 놓고, 팔과 다리는 바늘이나 테이프로 고정시켰다. 가위로 복부에서 목까지 피부를 절개하고, 피부는 포셉으로 수축시켜 가슴우리와 목을 노출시켰다. 목 주위의 근육을 부드럽게 제거하여 기관지를 노출시켰다. 포셉으로 기관 밑에 약 10 cm 길이의 나일론 끈을 놓았다. 그런 다음 갈비뼈를 절단하여 기관지와 폐의 절단 없이 심장과 폐를 노출시켰다. 22G 카테터(22G x 1 in. Exel Safelet Catheter) 를 기관지에 삽입하고 탐침 허브(stylet hub)를 제거한 후 카테터와 기관지를 나일론 실로 단단히 묶었다. 1ml 주사기에 0.8ml의 인산완충식염수(PBS)를 담고 카테터 끝에 두었다. PBS는 4번 주입 및 흡인되었다. 그런 다음 주사기는 카테터에서 제거되었고, 회수된 세척액은 얼음 위에 둔 1.5ml 에펜도르프 튜브에 저장되었다. BAL 볼륨은 1.5ml 에펜도르프 튜브의 척도에 따라 기록되었다. BAL액은 800xg, 4℃, 10분 조건으로 원심분리하였다. 다음, 상등액을 새로운 5ml 튜브로 옮기고, 프로테아제 억제 칵테일을 최종 농도 1X가 되도록, PMSF를 최종농도 1mM가 되도록 첨가하여 잘 섞어주었다. BAL 세포 펠렛은 400 μl PBS에 풀어주고, 세포 샘플에서 20 μl를 취해 헤모사이토미터로 옮겨 현미경으로 세포를 카운팅하여 세포수를 계산하였다.

BAL의 IL-17⁺ 및 IFN-γ⁺ 세포 분석은 다음과 같이 수행되었다. 세포는 전술한“BAL의 염증 세포군 분석”에 설명된 대로 분리되고, 종래의 세포내 흐름세포측정 분석법에 기반하여 IL-17⁺ 및 IFN-γ⁺ 항체로 염색되었다. 염색 후, 알로페론 처리된 후 BAL에서의 IL-17⁺ 및 IFN-γ⁺ 변화를 흐름세포측정 분석으로 확인하였다.

IL-6, TNF-α, MCP-1, MIP-1, 및 MIP-2의 발현 분석은 다음과 같이 수행되었다. 폐 시료는 블레오마이신 처리된 생쥐에 대하여 알로페론 처리가 수행된 후 3일 후에 채취되었으며, 염증성 사이토킨 분석을 서열번호 3 내지 16중 선택되는 각 한 쌍의 특정된 서열번호(IL-6 : 서열번호 3 및 4, IL-17A : 서열번호 5 및 6, MCP-1 : 서열번호 7 및 8, MIP-1 : 서열번호 9 및 10, MIP-2 : 서열번호 11 및 12, CXCL10 : 서열번호 13 및 14, 및 18s rRNA : 서열번호 15 및 16)의 프라이머를 이용하여 수행하였다.

<실시예 2 : 결과>

블레오마이신 유도 폐섬유증은 사람 간질성 폐섬유증의 잘 알려진 동물 모델이다. 간질섬유증의 병리 생리학은 알려져 있거나 알려지지 않은 원인에 의한 반복적 염증과 반응성 섬유증이 특징적이다.　알로페론이 이러한 병태생리학적 과정에 어떤 영향을 미치는지 테스트하기 위해 블레오마이신 유도 섬유증 모델을 셋업했다. C57BL/6 수컷 생쥐는 55 μl 볼륨의 1.5 mg/kg 블레오마이신이 경기관지 접종되었으며, 21일 후에 이들 생쥐의 폐를 분석하였다. 폐는 4% 파라포름알데히드 용액으로 기관내 팽창을 통해 고정되었으며, 파라핀 임베딩되고, H&E 및 Masson's trichrome 방법으로 염색되었다. 결합조직이 염색된 모습은 도 1에 나타냈다. 도 1의 각 세부도는 대조군의 서로 다른 개체(알로페론이 투여되지 않은 동물)로부터 얻었다. 도 1을 참조하면, 블레오마이신 처리는 폐 구조를 파괴하는 것으로 나타났다. 거대한 섬유아세포 증식 및 단핵성 염증 세포 침윤이 폐의 사이질조직에서 두드러졌다. Masson's trichrome 염색법에서 푸른색으로 보이는 콜라겐 침착물물은 광범위하고 대부분 밀집하여 주 기관지를 둘러싸고 있었다.

알로페론의 처리는 블레오마이신 처리로 유도된 폐섬유증의 중등도(severity)를 극적으로 감소시켰다. 블레오마이신 유도 폐섬유증의 발병에 대한 알로페론의 영향을 평가하기 위해, 블레오마이신 주입 당일부터 매일 50 μg의 알로페론을 복강내 주입하였다. 21일 후 생쥐의 폐를 4% 파라포름알데히드 용액을 통해 세포내 팽창시켜 고정시키고, 파라핀 임베딩하여 H&E 및 Masson's trichrome 법으로 염색하였다. 도 2를 참조하면, 알로페론 처리후, 폐 구조는 염증세포의 침윤 및 섬유아세포 증식없이 거의 정상이었다. 기도 공간과 구조는 잘 보존되어 있었으며, 주요 기관지 주위에 콜라겐 침착물이 일부 발견되었다. 도 2의 각 세부도는 알로페론이 처리된 실험군의 서로 다른 개체로부터 얻었다.

콜라겐은 세포외기질과 결합조직에서 발견되는 가장 풍부한 불용성 단백질이다. 그것은 다른 조직들 사이에서, 피부, 힘줄, 뼈, 연골, 근육, 유리액 및 인대에서 발견될 수 있다. 섬유성 폐에 있는 콜라겐의 총 함량을 측정하여 블레오마이신 폐섬유증 모델에서 알로페론의 항섬유화 효과를 평가하였는데, 이는 섬유아세포의 과다증식과 콜라겐 생성 증가는 폐섬유증의 말기 단계에서 돌이킬 수 없는 심각한 사건이기 때문이다. 도 3 및 4를 참조하면, 블레오마이신은 폐의 콜라겐 함량을 증가시키지만, 이러한 증가는 알로페론 처리에 의해 완전히 억제되는 것으로 나타났다. 도 3 및 4에 나타낸 동물의 알로페론 처리는 도 2에 나타낸 것과 동일하게 처리하였다. 도 3에 나타낸 고정 및 염색은 도 1 및 2에 나타낸 것과 동일하게 처리하였다.

알로페론 처리는 블레오마이신 유도 폐섬유증의 폐에 염증성 세포가 침투하는 것을 효과적으로 억제했다.　BAL은 폐질환을 진단하기 위해 흔히 행해지는 간단하고 전형적인 방법으로, 폐에 있는 면역세포를 결정하기 위해 폐의 요소를 샘플링하는데 사용된다. 폐의 만성 염증은 폐암의 시작과 진행에 중요한 역할을 한다.　염증의 근본적인 메커니즘을 명확히 하기 위해, 생쥐의 염증 발생된 폐조직에서의 BAL 세포 카운팅을 통해 폐면역 반응을 측정하였다. 블레오마이신 주입 당일부터 매일 50 μg의 알로페론을 복강내 주입하였다. 21일 후, 회수된 세척액을 얻어 얼음 위에 둔 1.5ml 에펜도르프 튜브에 저장하였다. BAL 세포 펠렛은 400 μl PBS에 풀어주고, 세포 샘플에서 20 μl를 취해 헤모사이토미터로 옮겨 현미경으로 세포를 카운팅하여 세포수를 계산하였다. 도 1 내지 3의 참조를 통해 확인한 바 있듯, 알로페론은 블레오마이신 유도로 발생하는 심각한 폐섬유증의 유발을 효과적으로 방지하였고, 염증 유발 세포가 염증 발생된 폐에 침투하는 것을 방지하는 것도 조사되었다. 도 5를 참조하면, 알로페론을 생쥐에 처리함으로써 BAL 액의 염증 세포는 효과적으로 억제되는 것으로 나타났다.

매일 50 μg/ea 알로페론을 주입한 실험군에서 염증유발 세포의 침투와 섬유증 정도가 현저하게 감소하였다.　도 6을 참조하면, BLM 주입 후 7일 및 10일에서의 BAL 액 내 염증유발 세포의 수는 PBS가 주입된 대조군에 비해 알로페론을 주입한 실험군에서 50% 이상 감소한 것으로 나타났다. 각 부분(fraction)별 염증유발 세포의 분석은 림프구와 호중구 수가 더욱 감소되는 것을 보여주었다. 도 7을 참조하면, BLM 주입 후 7일과 11일 에서 BAL액 내 CD4+T 세포의 세포내 염색은 PBS 처리 대조군에 비해 IL-17⁺ 및 IFN-η⁺ 세포가 알로페론 주입 실험군에서 유의하게 증가한 것으로 나타났다. 도 8을 참조하면, 염증성 사이토카인인 IL-6, TNF-α, MCP-1, MIP-1, 및 MIP-2 발현이 알로페론 주입 실험군에서 감소된 것을 확인할 수 있었다.

전술한 특정 구현에 대한 설명은 본 발명의 일반적인 특성을 충분히 나타낼 것인바, 다른 사람들은 당업 분야의 기술내 지식을 통해, 과도한 실험 없이, 그리고 본 발명의 일반적인 개념에서 크게 벗어나지 않고, 그러한 특정 구현에 대해 다양한 적용을 통해 손쉽게 수정 및/또는 적응할 수 있다. 따라서, 그러한 적응 및 변경은 여기 기재된 가르침 및 지침에 기초하여 본 실시예들과 동등한 범위 및 평균 내에서 의도되는 것이다. 여기 기재된 어법 또는 용어는 본 발명을 제한하기 위함이 아니고 본 발명의 설명을 위한 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서, 기재된 어법 또는 용어는 가르침 및 지침에 비추어 숙련된 장인에 의하여 해석된다.

“일 실시예(구현예)”, “실시예”, “모법적인 실시예” 등에 대한 규격의 참조는 기술된 실시예에 특정한 특징,구조 또는 특성이 포함될 수 있음을 나타내지만, 모든 실시예에 반드시 그 특정한 특징, 구조 또는 특성이 포함되어야 하는 것은 아니다. 더욱이 그러한 구절이 반드시 같은 실시예를 가리키는 것은 아니다. 또한, 특정한 특징, 구조 또는 특성이 일 실시예와 관련되어 기술될 때, 명시적으로 기술되거나 그러지 않거나에 관계없이 다른 실시예와 관련되어 그 특징, 구조 또는 특성에 영향을 미치는 것은 당해 기술분야에 숙련된 사람의 지식 내에 있는 것이다.

여기 기재된 모범적인 실시예는 설명을 위한 목적으로 제공되는 것으로 제한되지 않는다. 다른 모범적 실시예가 가능하고, 그의 변형도 가능하다. 따라서, 본 명세서는 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니다. 오히려, 본 발명의 범위는 후술할 청구범위 및 그와 균등한 요소에 의하여만 정의되는 것이다.

유

Claims

구조식 1의 컴파운드를 유효성분으로 함유하는, 폐섬유증 치료용 약학적 조성물.

[구조식 1]

X₁-His-Gly-X₂-His-Gly-Val-X₃

(상기 구조식 1에서,

X₁은 존재하지 않거나 또는 적어도 하나의 아미노산 잔기를 나타내고, X₂는 펩티드결합 또는 적어도 하나의 아미노산 잔기를 나타내고, X₃은 존재하지 않거나, 적어도 하나의 아미노산 잔기 또는 생리적으로 가능한 염을 나타낸다.)
제 1항에 있어서,

상기 구조식 1의 컴파운드는 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는, 폐섬유증 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서,

콜라겐 침착을 억제하는, 폐섬유증 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서,

염증성 세포의 침윤을 억제하는, 폐섬유증 치료용 약학적 조성물.
제 1항의 조성물을 포함하는, 폐섬유증 치료용 약제학적 제제.