CN110381979A - 结核分枝杆菌陪伴蛋白60.1肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及可衍生自多肽陪伴蛋白60.1的新型肽及其在医学中、诸如用于预防和/或治疗炎性病况的用途。

Description

结核分枝杆菌陪伴蛋白60.1肽及其用途
本发明涉及可衍生自结核分枝杆菌(Mycobacteria tuberculosis)多肽陪伴蛋白60.1的新型肽及其在医学中、诸如用于预防和/或治疗炎性病况的用途。
国际专利申请公开号WO02/040037公开了包含来自结核分枝杆菌的Cpn60.1(MtCpn60.1)及其编码核酸分子的药物组合物。该申请还公开了许多可衍生自全长多肽的特异性肽片段，其具有相似的生物活性。还公开了这些分子的各种治疗用途，包括治疗和/或预防自身免疫性疾病、变应性疾病、以Th2型免疫应答为典型的病况和与嗜酸性粒细胞增多相关的病况。
国际专利申请公开号WO2009106819公开了一系列可衍生自MtCpn60.1的新型肽，包括称为“肽4”的肽，其具有氨基酸序列：DGSVVVNKVSELPAGHGLNVNTLSYGDLAAD (SEQ IDNO:1)。SEQ ID NO:1表现出抗炎活性，并且已显示其在变应性气道炎症的动物模型中显著减少嗜酸性粒细胞的募集。
WO2013057499公开了SEQ ID NO:1的几个子片段，其显示具有生物活性。
本发明基于以下意外的发现，即SEQ ID NO:1(DGSVVVNKVSELPAGHGLNVNTLSYGDLAAD)的某些新型子片段和变体表现出生物活性和改进的药代动力学概况。本发明的新型肽由于其比较短的氨基酸链长度(其使得它们便于以高产率制备和分离)而尤其适合用于开发作为药物。还表明它们相对于MtCpn60.1及其已知肽片段具有改进的体内生物稳定性。具体而言，本文请求保护的肽具有提高的半衰期。
因此，在本发明的一个方面，本申请提供了分离的或重组的肽分子，其由选自组(i)至(ix)之一的氨基酸序列或其功能等效的片段或变体组成：
其中X不存在或选自β丙氨酸残基、9-氨基-3,6-二氧杂辛酸和乙酰基；或其变体，其包括i(i)至i(iii)中的一种或多种；
i(i) 一个或多个氨基酸残基呈D构象，
i(ii) GLNVNTLSYGD是反向的，或
i(iii) 将羧基末端氨基酸残基转化为伯羧酰胺基团
本发明人已令人惊讶地发现，相对于衍生自上述陪伴蛋白60.1的已知肽，上述肽作为抗炎剂是有效的，同时具有显著提高的血浆半衰期。
本发明的肽是化学或重组合成的，并且具有许多与全长陪伴蛋白60.1不同的化学、结构和功能特性。
“功能等效的”意指任何肽和/或其变体或片段，其具有与由定义的氨基酸序列(i)至(ix)中的一种或多种展现或归因于定义的氨基酸序列(i)至(ix)中的一种或多种的任何功能相同或实质上相似的功能(例如生物活性)。例如，由(i)至(ix)中定义的氨基酸序列组成的肽减少嗜酸性粒细胞和/或嗜中性粒细胞向炎症部位的运输，允许其用于预防和/或治疗各种疾病和病症，包括哮喘、多发性硬化症、克罗恩氏病、类风湿性关节炎和炎性肠病。可以使用常规模型和方法；例如，通过测量敏化(炎症原(inflammogen)-卵清蛋白)或未敏化(炎症原-LPS)动物中的炎症原诱导的嗜酸性粒细胞或嗜中性粒细胞肺内流，测量关于特定生物活性的功能等效性。
“变体”意指具有与上述序列(i)至(ix)具有或66%或更多、诸如70%、75%、80%、85%、90%或95%或更多同一性的氨基酸序列的肽。因此，术语“变体”是指使用例如重组DNA技术产生的与天然存在的分子差异之处在于氨基酸插入、缺失和取代的多肽和肽。可以通过如下找到确定哪些氨基酸残基可以替换、添加或缺失且不消除目标活性的指导：比较特定多肽的序列和同源肽的序列，并使在高同源性区域(保守区)中产生的氨基酸序列变化的数目最小，或用共有序列替换氨基酸。
或者，通过利用遗传密码中的“冗余”，可以合成或选择编码这些相同的或类似的多肽的重组变体。可以引入各种密码子取代，诸如产生不同的限制性位点的沉默变化，以优化向质粒或病毒载体中的克隆或在特定原核或真核系统中的表达。多核苷酸序列中的突变可以反映在多肽中或其他肽的结构域中，所述其他肽的结构域添加至多肽来修饰多肽的任何部分的性质、改变特征诸如配体结合亲和力、链间亲和力或降解/周转率。
优选地，氨基酸“取代”是用具有类似的结构和/或化学特性的另一种氨基酸替换一种氨基酸(即保守的氨基酸替换)的结果。“保守的”氨基酸取代可以基于所涉及的残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性进行。例如，非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；带正电荷(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；和带负电荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。“插入”或“缺失”优选地在约1至10个氨基酸、更优选1至5个氨基酸、诸如1、2、3、4或5个氨基酸的范围内。可以通过如下实验地确定允许的变异：使用重组DNA技术，在多肽分子中系统地产生氨基酸的插入、缺失或取代，并测定所得重组变体的生物活性。
或者，当期望功能的改变时，可以工程改造插入、缺失或非保守改变，以产生改变的多肽。此类改变可以例如改变本发明的多肽的一种或多种生物学功能或生物化学特征。例如，此类改变可以改变多肽特征，诸如配体结合亲和力、链间亲和力或降解/周转率。此外，可以选择此类改变，以便生成更好地适合在选择用于表达的宿主细胞中的表达、比例放大等的多肽。
本发明也涵盖能够表现出生物活性的本发明的肽的片段。此类片段可以呈线性形式，或它们可以使用已知的方法环化，例如，如H. U. Saragovi, 等人, Bio/Technology 10, 773-778 (1992)和R. S. McDowell, 等人, J. Amer. Chem. Soc. 114, 9245-9253(1992)所述，其二者通过引用并入本文。为了许多目的，包括增加蛋白结合位点的价，此类片段可以与载体分子(例如免疫球蛋白)融合。
“同一性”意指，在比对序列并引入空位(如果必要的话)以实现最大的序列同一性百分比且不将任何保守取代视作序列同一性的一部分后，候选序列中与目标序列的氨基酸残基相同的氨基酸残基的数目或百分比(根据结果的呈现)。
使用合适的计算机程序，例如威斯康辛大学遗传计算组(University ofWisconsin Genetic Computing Group)的GAP程序，可以测定2个多肽之间的序列同一性百分比，且可以理解，相对于已经最佳比对其序列的多肽，计算同一性百分比。或者，可以使用Clustal W程序(Thompson 等人, (1994) Nucleic Acids Res. 22, 4673-80)进行比对。使用的参数可以如下: 快速配对比对参数: K-元组(字)大小; 1, 窗口大小; 5, 空位罚分; 3, 顶部对角线数目; 5。评分方法: x 百分比; 多重比对参数: 空位开口罚分; 10,空位延伸罚分; 0.05。评分矩阵: BLOSUM。
例如使用Jotun Hein 方法(Hein, J. (1990) Methods Enzymol. 183:626-645)，可以测定序列同一性。通过本领域已知的其他方法，例如通过改变杂交条件，也可以测定序列之间的同一性。
本发明的优选实施方案涉及分离的或重组的肽分子，其由选自组(a)至(n)之一的氨基酸序列组成：
其中大写字母表示L-氨基酸残基，小写字母表示D-氨基酸残基，X不存在或选自β丙氨酸残基、9-氨基-3,6-二氧杂辛酸和乙酰基。
氨基酸和肽衍生物的命名法符合IUPAC-IUB规则(J. Peptide Sci. 1999, 5,465-471)。D-氨基酸通过小写缩写表示，例如Ala或A代表L-丙氨酸，ala或a代表D-丙氨酸。
本发明的肽优选由5至40个氨基酸残基、优选5至30个、最优选5至20个氨基酸残基组成。
在一个优选实施方案中，所述分离的或重组的肽分子由氨基酸序列HGLNVNTLSYGD-NH2(SEQ ID NO:17)或其功能等效的片段或变体组成。
在一个优选实施方案中，所述分离的或重组的肽分子由氨基酸序列bAla-HGLNVNTLSYGD-NH2 (SEQ ID NO:18)或其功能等效的片段或变体组成。
在另一个优选实施方案中，所述分离的或重组的肽分子由氨基酸序列Ac-dGysltnvnlGh-NH2 (SEQ ID NO:19)、Ac-hGlnvntlsyGd-NH2 (SEQ ID NO:20)或其功能等效的片段或变体组成。
在一个进一步优选实施方案中，本发明提供了分离的或重组的肽分子，其由氨基酸序列hGLNVNTLSYGd-NH2 (SEQ ID NO:14)或其功能等效的片段或变体组成。
在一个额外优选实施方案中，本发明提供了分离的或重组的肽分子，其由氨基酸序列HGLNVNTLSYGd-NH2 (SEQ ID NO:15)；或其功能等效的片段或变体组成。
在一个进一步优选实施方案中，提供了分离的或重组的肽分子，其由氨基酸序列hGLNVNTLSYGD-NH2 (SEQ ID NO:16)；或其功能等效的片段或变体组成。
在另一个优选实施方案中，提供了分离的或重组的肽分子，其由氨基酸序列DGSVVVNKVSEL-NH2 (SEQ ID NO:3)；或其功能等效的片段或变体组成。
MtCpn60.1可以使用T.H. Kong等人, Proc. Natl. Acad. Sci., 1993, 90,2608-2612和J.C. Lewthwaite等人, Infection and Immunity, 2001, 69(12), 7349-7355中描述的方法克隆和表达。MtCpn60.1也可从Lionex(德国)商购获得。
可以使用本领域已知的常规方法制备和/或分离本发明的肽。例如，通过使用传统方法的溶液或固相合成或使用固相自动合成仪，例如如I. Coin, Nature Protocols, 2007,2, 3247-3256中所述。优选地，使用类似于G.B. Fields和R.L. Noble, Int.J. Peptide Protein Res., 1990, 35(3), 161-214中所述的方法的方法，通过Fmoc固相合成制备本发明的肽。肽可以使用已知的方法环化，例如，如H. U. Saragovi, 等人, Bio/ Technology 10, 773-778 (1992)和R. S. McDowell, 等人, J. Amer. Chem. Soc. 114,9245-9253 (1992)所述的方法，其二者通过引用并入本文。为了许多目的，包括增加蛋白结合位点的价，此类肽可以与载体分子(例如免疫球蛋白)融合。
应理解，本发明的化合物包括盐。还包括代谢物和前药。根据本发明的化合物还包括任何同位素衍生物。
当向患者进一步施用一种或多种治疗剂时或当肽与一种或多种治疗剂组合提供时，可以根据本发明使用肽。所述治疗剂可以选自，但不限于，疾病调节剂，包括生物免疫调节剂、镇痛药、支气管扩张剂、抗炎剂、抗过敏药、过敏原免疫疗法、抗病毒药、抗生素、抗体、类固醇和根据本发明治疗任何慢性和复发缓解型病况中常用的药物。
疾病调节剂包括例如羟氯喹，柳氮磺吡啶，来氟米特(leflunamide)，甲氨蝶呤和米诺环素以及靶向TNFα的生物制剂，诸如阿巴西普，阿达木单抗，依那西普，英夫利昔单抗和戈利木单抗，或免疫调节剂诸如阿仑单抗，干扰素β-1b，β干扰素-1a富马酸二甲酯，克帕松，那他珠单抗和特立氟胺。镇痛药包括对乙酰氨基酚，非甾体抗炎药，诸如布洛芬和阿司匹林，可待因，曲马多，吗啡，阿米替林，加巴喷丁和阿片类。
抗炎剂包括白三烯受体拮抗剂，茶碱和PDE4抑制剂，诸如罗氟司特，低、中和高剂量皮质类固醇，经由吸入、皮下、肌肉内、舌下、静脉内和经口给药。抗病毒药包括奥司他韦。抗生素包括阿莫西林。抗体包括抗IgE抗体(例如奥马利珠单抗(omaluzimab))，改变细胞因子信号传导的抗体(例如抗IL-5mab 美泊利单抗(mepoluzimab))。类固醇包括丙酸氟替卡松和糠酸氟替卡松(fluticasone furorate)，二丙酸倍氯米松，布地奈德，环索奈德，氟尼缩松和莫米松。当另外的一种或多种治疗剂选自皮质类固醇、抗白三烯、细胞因子单克隆抗体或茶碱时，根据本发明使用可以是优选的。当另外的药剂是支气管扩张剂时使用也是优选的。优选的支气管扩张剂包括，短效B2激动剂诸如沙丁胺醇，长效B2激动剂诸如沙美特罗、福莫特罗、奥达特罗和维兰特罗，短效毒蕈碱受体拮抗剂诸如异丙托溴铵和长效毒蕈碱受体拮抗剂诸如阿地溴铵(aclidinum bromide)、噻托溴铵和格隆溴铵。
肽的用途
根据本发明的一个进一步方面，提供了如本文所定义的肽，其用于医学或兽医学中。
本发明的肽可用于人或非人动物，通常是哺乳动物。
优选地，本发明的肽用于治疗和/或预防急性和/或慢性炎性病况。急性和/或慢性炎性病况的优选实例包括与感染相关的炎症(诸如脓毒性休克、败血症或全身炎性应答综合征(SIRS))，缺血-再灌注损伤，包括冠状动脉血栓形成和脑动脉阻塞，休克肺综合征，内毒素致死性，关节炎(特别是类风湿性关节炎或慢性炎性关节炎)，补体介导的超急性排斥，肾炎，细胞因子或趋化因子诱导的肺损伤，非变应性哮喘，变应性哮喘，变应性鼻炎，特应性皮炎，囊性纤维化，肺纤维化，炎性肠病，克罗恩氏病和溃疡性结肠炎。
进一步优选的炎性病况包括：与外科手术相关的急性器官衰竭，诸如急性肾损伤，与以下外科手术干预(非详尽列表)相关的急性呼吸窘迫综合征：心脏外科手术、冠状动脉旁路、主动脉瘤、瓣膜外科手术、食管切除术、肾脏疾病、冠状动脉旁路移植术、主动脉根部和升主动脉瘤修复外科手术。
在一个替代实施方案中，本发明提供了如本文所定义的肽用于预防和/或治疗慢性阻塞性肺病的用途。
在一个替代实施方案中，本发明提供了如本文所定义的肽用于预防和/或治疗自身免疫性病症的用途。
如本文所用的术语“自身免疫性病症”中包括这样的病况，其中可以显示自身免疫过程促成疾病的发病机理。此类病症通常与T辅助淋巴细胞-1 (Th-1)型免疫应答相关。
可以用本发明的肽分子预防和/或治疗的自身免疫性病症的实例包括自身免疫性病症，诸如溶血性贫血、血小板减少、恶性贫血、艾迪生氏病、自身免疫性糖尿病、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、动脉粥样硬化、自身免疫性脑炎、结缔组织病、多发性硬化、自身免疫性肺炎症、格林-巴利综合征、自身免疫性甲状腺炎、移植物抗宿主病和自身免疫性炎性眼病。优选的自身免疫性病症包括类风湿性关节炎和多发性硬化。
在一个可选的实施方案中，本发明提供了如本文所定义的肽用于预防和/或治疗变应性病况的用途。可以用本发明的肽分子预防和/或治疗的变应性病况和病症的实例包括湿疹、皮炎、变应性鼻炎(枯草热)、变应性气道疾病、嗜酸性粒细胞过多综合征、接触性皮炎；特征在于嗜酸性粒细胞性气道炎症和气道高反应性的呼吸系统疾病，诸如哮喘，包括变应性哮喘和内源性哮喘、变应性支气管肺曲霉病、嗜酸性粒细胞性肺炎、变应性支气管炎支气管扩张、职业性哮喘、反应性气道病综合征、间质性肺病、嗜酸性粒细胞过多综合征、肺寄生虫病；过敏反应、血清病、药物反应、食物过敏、昆虫毒液过敏、肥大细胞增多病、超敏感性肺炎、荨麻疹、血管性水肿、湿疹、特应性皮炎、变应性接触性皮炎、多形性红斑、史蒂文斯—约翰逊综合征、变应性结膜炎、特应性角膜结膜炎、性病性角膜结膜炎和巨乳头性结膜炎。使用本发明的肽分子，也可以治疗其中期望免疫调节的其他病况(包括，例如，器官移植)。优选的变应性病症和病况包括哮喘、变应性鼻炎和特应性皮炎。
如本文所用的术语“变应性病症”或“变应性病况”中包括与T辅助淋巴细胞-2(Th-2)型免疫应答相关的病况。在变应性反应中，产生高IgE水平，Th-2免疫应答相对于Th-1应答占优势，导致炎性应答。
WO2013057499公开了用于评价以下的合适测定；
(a) 多肽或其拮抗剂对变应性反应的治疗作用，
(b) 胸腺细胞或脾细胞的细胞毒性，
(c) T细胞依赖性免疫球蛋白应答和同种型转换(其将尤其鉴定调节T细胞依赖性抗体应答并影响Th1/Th2概况的蛋白)，
(d) 混合的淋巴细胞反应(MLR)测定(其将尤其鉴定主要生成Th1和CTL应答的蛋白)，
(e) 树突细胞依赖性测定(其将尤其鉴定由活化未敏化的T细胞的树突细胞表达的蛋白)，
(f) 淋巴细胞存活/凋亡(其将尤其鉴定防止超抗原诱导后的凋亡的蛋白和调节淋巴细胞内稳态的蛋白)，
(g) 影响T细胞定向(commitment)和发育的早期步骤的蛋白，
(h) 可以在实验动物模型系统中测定本发明的肽分子针对类风湿性关节炎的免疫调节作用。
如本文所用，“治疗”意指相对于治疗前的症状，减轻、缓解或消除正在治疗的病况的一种或多种症状。例如，可能受影响的症状包括嗜酸性粒细胞增多，特定细胞因子的分泌减少，Th2-偏向(baised)的免疫应答，变应性应答和自身抗体的存在。
如本文所用，“预防”意指延迟或阻止病况的发作或降低其严重程度，如通过所述病况的一种或多种症状的出现或程度所评价。
本发明进一步提供了预防和/或治疗如上所定义的病况的方法，其包括向哺乳动物(包括人)施用如本文所定义的肽。
本发明仍进一步提供了如本文所定义的肽在制备用于预防和/或治疗如上所定义的病况的药物中的用途。
药物组合物
在一个额外方面，本发明提供了用于如上所定义的方法中的药物组合物，其包含如上所定义的肽分子和一种或多种药学上可接受的赋形剂。
本文所述的化合物可以以任何方便的方式配制用于施用。本发明提供了用于如上所定义的方法中的药物组合物，其包含如上所定义的肽分子和一种或多种药学上可接受的赋形剂。
可以使用任何合适的施用途径。例如，经口、局部、肠胃外、经眼、直肠、阴道、吸入、经颊、舌下和鼻内递送途径中的任一种可以是合适的。
本发明的肽分子和药物组合物可以肠胃外、例如静脉内、动脉内、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内、颅内、肌肉内地或皮下施用，或它们可以通过输注技术来施用。它们最好以无菌水溶液的形式使用，所述无菌水溶液可以含有其他物质，例如足够的盐或葡萄糖，以使溶液与血液等渗。如果必要的话，水溶液应当合适地缓冲(优选至pH 3-9)。通过本领域技术人员众所周知的标准制药技术，可以容易地在无菌条件下制备合适的肠胃外制剂。
适合用于肠胃外施用的药物和药物组合物包括：水性和非水性的无菌注射溶液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与目标受体的血液等渗的溶质；和水性和非水性的无菌悬浮液，其可以包含助悬剂和增稠剂。药物和组合物可以呈现在单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和小瓶，且可以在冷冻干燥(冻干)条件下储存，其仅需要在临使用前添加无菌的液体载体例如注射用水。从前述类型的无菌粉末、颗粒和片剂，可以制备临时的注射溶液和悬浮液。
本发明的分子、药物和药物组合物也可以鼻内或通过吸入来施用，且利用合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、氢氟烷烃诸如1,1,1,2-四氟乙烷(HFA 134A3)或1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷(HFA 227EA3)、二氧化碳或其他合适的气体，从加压的容器、泵、喷雾器或雾化器以干粉吸入剂或喷雾剂呈递的形式方便地递送。在加压的气雾剂的情况下，通过提供阀门来递送计量的量，可以确定剂量单位。加压的容器、泵、喷雾器或雾化器可以含有活性剂的溶液或悬浮液，例如使用乙醇和推进剂的混合物作为溶剂，其可以另外含有润滑剂例如脱水山梨糖醇三油酸酯。可以将用于吸入器的胶囊和药筒(例如，由明胶制成) 配制成含有本发明的药剂和合适的粉末基料(诸如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
优选地安排气雾剂或干粉制剂，使得每个计量的剂量或“喷量(puff)”含有至少200pg本发明的分子，用于递送给患者。应当理解，气雾剂的总每日剂量随患者不同而异，且可以在一天中以单次剂量或者更经常地以分份剂量施用。
本发明的肽分子和药物组合物也可以经口递送。该过程可以采用在体内经口摄取维生素B12和/或维生素D的天然过程来共同递送蛋白和肽。通过搭乘维生素B12和/或维生素D摄取系统，本发明的核酸、分子和药物制剂可以穿过肠壁移动。在维生素B12类似物和/或维生素D类似物与药物之间合成复合物，其既保留对复合物的维生素B12部分/维生素D部分中的内在因子(IF)的显著亲和力，又保留复合物的活性物质的显著生物活性。
本发明的肽分子和药物组合物通常通过任何肠胃外途径或鼻内且在一些实施方案中经口以包含活性成分的药物组合物的形式施用。根据待治疗的病症和患者以及施用途径，组合物可以以不同的剂量施用。
在人治疗中，本发明的肽分子和药物组合物可以单独施用，但通常与根据预期的施用途径和标准的药物实践来选择的合适的药物赋形剂、稀释剂或载体混合地施用。
优选地，本发明的药物组合物是活性成分的单位剂量，其含有每日剂量或单位、每日亚剂量或其适当部分。
例如，本发明的肽分子和药物组合物可以经口、经颊或舌下，以片剂、胶囊、珠剂(ovule)、酏剂、溶液或悬浮液(其可以含有矫味剂或着色剂)的形式施用，用于立即的、延迟的或控制的释放应用。本发明的肽分子和药物组合物也可以通过海绵体内注射来施用。
此类片剂可以含有，赋形剂诸如微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙和甘氨酸，崩解剂诸如淀粉(优选玉米、马铃薯或木薯淀粉)、羟基乙酸淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠和某些复合硅酸盐，和颗粒粘合剂诸如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、明胶和阿拉伯胶。另外，可以包括润滑剂诸如硬脂酸镁、硬脂酸和山嵛酸甘油酯。
类似类型的固体组合物也可以用作明胶胶囊中的填充剂。在这方面优选的赋形剂包括乳糖、淀粉、纤维素、乳糖或高分子量聚乙二醇。对于水性悬浮液和/或酏剂，本发明的药剂可以与下述物质相组合：各种甜味剂或矫味剂、着色物或染料，乳化剂和/或助悬剂，和稀释剂诸如水、乙醇、丙二醇和甘油，和它们的组合。
对于给人患者经口和肠胃外施用，本发明的分子、药物和药物组合物的每日剂量水平通常是每个成年人每日200pg至100 mg，以单次剂量或分份剂量施用。
因此，例如，本发明的分子的小瓶、片剂或胶囊可以含有200pg至100mg活性剂，用于在适当时每次以一份、两份或更多份来施用。无论如何，医师将决定最适合于任何单个患者的实际剂量，且其随具体患者的年龄、体重和反应而不同。上述剂量是平均情况的示例。当然，可以存在需要更高或更低剂量范围的个别情况，并且此类在本发明的范围内。
或者，本发明的分子、药物和药物组合物可以以栓剂或阴道栓剂的形式施用，或者它们可以以洗剂、溶液、乳剂、凝胶、软膏剂或扑粉的形式局部应用。本发明的分子、药物和药物组合物也可以经皮施用，例如，通过使用皮肤贴剂。它们也可以通过经眼途径来施用，特别用于治疗眼病。
对于眼睛用途，本发明的分子、药物和药物组合物可以配制成在等渗的、pH调节的、无菌盐水中的微粒化的悬浮液，或者，优选地，作为在等渗的、pH调节的、无菌盐水中的溶液，任选地与防腐剂诸如苯扎氯铵(benzylalkonium chloride)相组合。或者，它们可以配制在软膏剂诸如凡士林中。
对于局部应用于皮肤，本发明的分子、药物和药物组合物可以配制成合适的软膏剂，其含有悬浮或溶解于例如具有一种或多种下述物质的混合物中的活性剂：矿物油，液体矿脂，白凡士林，丙二醇，聚氧乙烯聚氧丙烯剂，乳化蜡和水。或者，它们可以配制成合适的洗剂或乳剂，其悬浮或溶解于例如一种或多种下述物质的混合物中：矿物油，脱水山梨醇单硬脂酸酯，聚乙二醇，液体石蜡，聚山梨醇酯60，十六烷基酯蜡，鲸蜡硬脂醇，2-辛基十二烷醇，苯甲醇和水。
适合在口中局部施用的制剂包括：锭剂(lozenge)，其包含在矫味基料(通常是蔗糖和阿拉伯胶或西黄蓍胶)中的活性成分；软锭剂(pastille)，其包含在惰性基料(诸如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶)中的活性成分；和漱口剂，其包含在合适的液体载体中的活性成分。
对于兽医用途，本发明的分子、药物和药物组合物根据正常的兽医实践作为合适地可接受的制剂来施用，且兽医医师会确定最适合于具体动物的给药方案和施用途径。
方便地，制剂是药物制剂。有利地，制剂是兽医制剂。
有利地，在根据本发明的使用中，每日剂量水平是10pg至100mg。优选地，每日剂量水平将是20pg至50mg，20pg至10mg或20pg至8mg，其以单次剂量或分份剂量施用。
优选的药物制剂包括其中活性成分以至少0.000001重量%直至5重量%存在的药物制剂。也就是说，药物组合物的活性成分与其他组分(即加入的佐剂、稀释剂和载体)的比率是按重量计至少1:99 (例如至少10:90, 优选至少30:70和最优选至少50:50)。
优选地，将本发明的药物组合物或药物配制成允许通过至少一种选自下述的途径施用：鼻内；经口；肠胃外；局部；经眼；栓剂；阴道栓剂；或吸入途径。适合于此类施用途径的制剂是药学和医学领域的技术人员众所周知的，并且在上文和附随的实施例中描述了示例性的制剂。
典型地，向患者施用剂量之间的时间是6至12小时；在一个优选实施方案中，向患者施用剂量之间的时间是前次剂量后9至12小时；更优选地，向患者施用剂量之间的时间是12小时至12天；甚至更优选地，向患者施用剂量之间的时间是12天至6个月。
优选地，将本发明的药物组合物或药物配制成允许通过至少一种选自下述的途径施用：鼻内；舌下；经口；肠胃外；局部；经眼；栓剂；阴道栓剂；或吸入途径。适合于此类施用途径的制剂是药学和医学领域的技术人员众所周知的，并且在上文和附随的实施例中描述了示例性的制剂。
附图说明
现在将参考以下附图描述非限制性实施例：
图1显示当在施用LPS前0、30和60分钟施用SEQ ID NO:1时，SEQ ID NO:1 (0.5 pg/小鼠i.v)对小鼠中的LPS诱导的肺嗜中性粒细胞流入的影响。
图2显示当在施用LPS前0、30和60分钟施用SEQ ID NO:3时，SEQ ID NO:3 (50 pg/小鼠i.v)对小鼠中的LPS诱导的肺嗜中性粒细胞流入的影响。
图3显示当在施用LPS后0、30、60和120分钟施用SEQ ID NO:3时，SEQ ID NO:3 (50pg/小鼠i.v)对小鼠中的LPS诱导的肺嗜中性粒细胞流入的影响。
图4显示当在施用LPS后0、30、60和120分钟施用SEQ ID NO:1时，SEQ ID NO:1 (50pg/小鼠i.v)对小鼠中的LPS诱导的肺嗜中性粒细胞流入的影响。
图5显示SEQ ID NO:17 (0.05、0.5和5 pg/剂量)对LPS诱导的嗜中性粒细胞流入小鼠肺的影响。
图6显示SEQ ID NO:21、22和18 (50pg/小鼠)对LPS诱导的嗜中性粒细胞流入小鼠肺的影响。
图7显示SEQ ID NO:4 (0.5、5和500 pg/剂量)对LPS诱导的嗜中性粒细胞流入小鼠肺的影响。
实施例
实施例1
合成
合成和纯化使用自动化芴基甲氧基羰基固相肽合成(Fmoc SPSS)。使用基于Fmoc/叔丁基的固相合成策略，在2-氯三苯甲基或TentaGel树脂上合成肽，用许多可切割接头之一衍生化。暂时的N-氨基保护由Fmoc-基团提供，其中叔丁基醚用于保护酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸羟基侧链，而叔丁基酯保护天冬氨酸和谷氨酸残基的侧链。组氨酸和赖氨酸侧链分别作为它们的N-三苯甲基和N-Boc衍生物进行保护，半胱氨酸作为其S-三苯甲基衍生物进行保护，并且精氨酸胍部分作为其Pbf衍生物进行保护。
合成完成后，从固体支持物切下肽，并通过用含有三异丁基硅烷和水作为清除剂的三氟乙酸(TFA)处理来除去侧链保护基团。在通过蒸发除去TFA和清除剂并在二乙醚中研磨之后，通过反相制备型HPLC进行肽纯化，随后冻干。随后通过反相HPLC和质谱法分析纯化的产物。
实施例2
新肽在LPS炎症模型中的活性
SEQ ID NO:3是根据本发明的肽，其是肽SEQ ID NO:1(表1)(WO2009/106819中公开的肽4)的片段。
表 1：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3的氨基酸序列
LPS小鼠方法
6至8周龄的BALB/c雌性和雄性小鼠(Harlan, UK)在接受无菌盐水中稀释的鼻内肽或仅盐水后立即鼻内接受25μg/小鼠的大肠杆菌脂多糖(LPS)。4小时后，将小鼠用过度剂量的乌拉坦安乐死，并将插管插入暴露的气管中，并将三份0.5 ml等分试样的盐水注入肺中。从BAL(支气管肺泡灌洗)液中，将一份等分试样(50μl)添加至50μl溶血溶液(Turk氏溶液,Fluka, UK)中。用改进的Neubauer血细胞计数器计数灌洗液中的细胞总数。对于差异细胞计数，从在室温下以1000 rpm离心1 min的BAL液(100μL)的等分试样制备细胞离心涂片制备物。将细胞用Diff Quick染色，并计数总共100个细胞以使用标准形态学标准测定嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和单核细胞的比例。
当在LPS攻击前立即静脉内给药时，SEQ ID NO:1在小鼠LPS模型中非常有效，显示LPS诱导的肺嗜中性粒细胞流入的显著抑制。然而，当在较早(图1)或较晚(图4)时间点给予时，SEQ ID NO:1在该模型中其活性减弱(looses)。
当静脉内给药时，SEQ ID NO:1的片段SEQ ID NO:3在LPS小鼠模型中是有效的。令人惊讶地，当在LPS攻击前最长达60 min给药(图2)和在LPS攻击后最长达120min给药(图3)时，SEQ ID NO:3在该模型中针对LPS诱导的肺嗜中性粒细胞流入也是有效的，这与SEQ IDNO:1不同，SEQ ID NO:1仅当在LPS攻击前立即给药时表明效力(图1和4)。
结论
SEQ ID NO:3扩大的给药选项允许临床采用治疗性和预防性的给药方案。该概况扩大能够用该肽治疗的适应症的数目。
实施例3
SEQ ID NO:1的小片段显示血浆稳定性的显著提高
由于蛋白酶的代谢，许多肽具有差的血浆稳定性。合成SEQ ID NO:1(WO2009/106819中的肽4)的小肽片段并测试其在LPS小鼠肺嗜中性粒细胞增多模型中的效力和在小鼠、大鼠和人血浆中的血浆稳定性(SEQ ID NO:17)。然后进行该肽的修饰，并在相同的系统中测试所得分子。
表 2：SEQ ID NO:17、21、22和18的氨基酸序列
在37℃下小鼠、大鼠和人血浆中的血浆稳定性
血浆：小鼠(C57 Black 6雄性)、大鼠(Sprague Dawley)和人，含有肝素作为抗凝血剂。
在37℃下在振荡下将一式两份的血浆样品与3μM的肽在600μl体积中孵育。在2、5、30、60和120 min之后取出50μl等分试样并猝灭至150μl含有内部标准品(甲苯磺丁脲)的冰冷甲醇中。将样品在-20℃下储存≥2小时以允许蛋白沉淀。然后将样品以2500 x g离心，并将所得上清液转移至96孔板用于LC-MS/MS分析。对于每种肽在所有基质中计算T半。
结果
表 3：SEQ ID NO:17、21、22和18的血浆稳定性结果
在N-末端(SEQ ID NO:18)、C-末端(SEQ ID NO:21)或两个末端(SEQ ID NO:22)添加β-丙氨酸基团提高肽的血浆稳定性。
图5、6和7显示如上文对实施例2所述的LPS小鼠方法中肽的测试结果。
图5和6显示SEQ ID NO:17对小鼠中的LPS诱导的肺嗜中性粒细胞流入的影响，其中施用不同剂量的SEQ ID NO:17(0.5、5或50 pg/小鼠)后的嗜中性粒细胞的数目减少。
图7显示SEQ ID NO:21、22和18 (50pg/小鼠，i.v)对小鼠中的LPS诱导的肺嗜中性粒细胞流入的影响。
SEQ ID NO:18在LPS小鼠模型中保留抗炎活性，同时在小鼠、大鼠和人血浆中显示出相对于亲本肽SEQ ID NO:17的血浆半衰期(Th)的显著提高(表3)。SEQ ID NO:21和SEQID NO:22显示出优于SEQ ID NO:17的Th、但在LPS小鼠肺炎症模型中减弱的(loose)效力。因此，在C-末端添加β-丙氨酸基团仅提高血浆稳定性，而非保持效力。
实施例4
表4显示SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:5(来自WO2013057499的肽片段2和3)在3种物种中的血浆稳定性数据。
表 4
合成更长的片段(SEQ ID NO:4)，片段3的延伸形式并测试血浆稳定性。该片段显示优异的半衰期(表5)并且在小鼠LPS肺炎症模型中维持体内效力(图7)。
表 5
实施例5
修饰肽的血浆稳定性
然后对肽SEQ ID NO:17进行结构修饰以提高血浆稳定性，如表6中所示。然后在与上述相同的条件下评价肽的血浆稳定性。
表 6
小鼠、大鼠或人中上述肽的血浆半衰期列于表7中。
表 7
在SEQ ID NO:17的一端添加β-丙氨酸基团显著提高血浆稳定性，同时维持活性，而向两端添加该基团甚至进一步提高稳定性(参见SEQ ID NO:22)，但导致生物活性的丧失。已知β-丙氨酸添加增强合成蛋白片段在氨肽酶和血清蛋白水解酶的降解作用下存活的能力。
使用d-构型重新配置片段，在活生物体中很少发现的氨基酸(SEQ ID NO:19和20)显示增强的血浆稳定性，这可能也是由于保护增强免于氨肽酶和血清蛋白水解酶的蛋白水解。向这些肽添加N-末端乙酰化（已知具有稳定活性）进一步增加血浆稳定性的提高。
令人惊讶地，环化(SEQ ID NO:25)，增加肽的构象稳定性的最广泛使用的方法之一，并不提高血浆稳定性。

Claims (25)

1.分离的或重组的肽分子，其由选自组(i)至(ix)之一的氨基酸序列或其功能等效的片段或变体组成：
(i) XHGLNVNTLSYGD (SEQ ID NO:2)
其中X不存在或选自β丙氨酸残基、9-氨基-3,6-二氧杂辛酸和乙酰基；或其变体，其包括i(i)至i(iii)中的一种或多种；
i(i) 一个或多个氨基酸残基呈D构象，
i(ii) GLNVNTLSYGD是反向的，或
i(iii) 将羧基末端氨基酸残基转化为伯羧酰胺基团
(ii) DGSVVVNKVSEL-NH2 (SEQ ID NO:3);
(iii) SELPAGHGLNVNTLSYGDLAAD (SEQ ID NO:4);
(iv) SELPAGHGLNVNTLS (SEQ ID NO:5);
(v) PAGHGLNVNTLS-NH2 (SEQ ID NO:6);
(vi) VVVNKVSELPAGHGLNVNTLSYGDLAAD (SEQ ID NO:7);
(vii) NKVSELPAGHGLNVNTLSYGDLAAD (SEQ ID NO:8);
(viii) PAGHGLNVNTLSYGDLAAD (SEQ ID NO:9)；和
(ix) HGLNVNTLSYGDLAAD (SEQ ID NO:10)。
2.根据权利要求1所述的分离的或重组的肽分子，其由选自组(a)至(n)之一的氨基酸序列组成：
(a) XHGLNVNTLSYGD-NH2 (SEQ ID NO:11)
(b) XdGysltnvnlGh-NH2 (SEQ ID NO:12);
(c) XhGlnvntlsyGd-NH2 (SEQ ID NO:13);
(d) hGLNVNTLSYGd-NH2 (SEQ ID NO:14);
(e) HGLNVNTLSYGd-NH2 (SEQ ID NO:15);
(f) hGLNVNTLSYGD-NH2 (SEQ ID NO:16);
(g) DGSVVVNKVSEL-NH2 (SEQ ID NO:3);
(h) SELPAGHGLNVNTLSYGDLAAD (SEQ ID NO:4);
(i) SELPAGHGLNVNTLS (SEQ ID NO:5);
(j) PAGHGLNVNTLS-NH2 (SEQ ID NO:6);
(k) VVVNKVSELPAGHGLNVNTLSYGDLAAD (SEQ ID NO:7);
(l) NKVSELPAGHGLNVNTLSYGDLAAD (SEQ ID NO:8);
(m) PAGHGLNVNTLSYGDLAAD (SEQ ID NO:9)；和
(n) HGLNVNTLSYGDLAAD (SEQ ID NO:10)
其中大写字母表示L-氨基酸残基，小写字母表示D-氨基酸残基，X不存在或选自β丙氨酸残基、9-氨基-3,6-二氧杂辛酸和乙酰基。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的分离的或重组的肽分子，其由氨基酸序列HGLNVNTLSYGD-NH2 (SEQ ID NO:17)或其功能等效的片段或变体组成。
4.根据权利要求1或权利要求2所述的分离的或重组的肽分子，其由氨基酸序列bAla-HGLNVNTLSYGD-NH2 (SEQ ID NO:18)或其功能等效的片段或变体组成。
5.根据权利要求1或权利要求2所述的分离的或重组的肽分子，其由氨基酸序列Ac-dGysltnvnlGh-NH2 (SEQ ID NO:19)、Ac-hGlnvntlsyGd-NH2 (SEQ ID NO:20)或其功能等效的片段或变体组成。
6.根据权利要求1或权利要求2所述的分离的或重组的肽分子，其由氨基酸序列hGLNVNTLSYGd-NH2 (SEQ ID NO:14)或其功能等效的片段或变体组成。
7.根据权利要求1或权利要求2所述的分离的或重组的肽分子，其由氨基酸序列HGLNVNTLSYGd-NH2 (SEQ ID NO:15)或其功能等效的片段或变体组成。
8.根据权利要求1或权利要求2所述的分离的或重组的肽分子，其由氨基酸序列hGLNVNTLSYGD-NH2 (SEQ ID NO:16)或其功能等效的片段或变体组成。
9.根据权利要求1或权利要求2所述的分离的或重组的肽分子，其由氨基酸序列DGSVVVNKVSEL-NH2 (SEQ ID NO:3)或其功能等效的片段或变体组成。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的分离的或重组的肽分子，其用于医学或兽医学中。
11.根据权利要求10所述的分离的或重组的肽分子，其用于治疗和/或预防急性和/或慢性炎性病况。
12.根据权利要求11所述的分离的或重组的肽分子，其用于根据权利要求11所述的用途，其中所述炎性病况与嗜酸性粒细胞增多和/或嗜中性粒细胞增多相关。
13.根据权利要求11或权利要求12所述的分离的或重组的肽分子，其用于根据权利要求11或权利要求12所述的用途，其中所述炎性病况选自与感染相关的炎症(诸如脓毒性休克、败血症或全身炎性应答综合征(SIRS))，缺血-再灌注损伤，内毒素致死性，关节炎，补体介导的超急性排斥，肾炎，细胞因子或趋化因子诱导的肺损伤，非变应性哮喘，变应性哮喘，变应性鼻炎，特应性皮炎，囊性纤维化，肺纤维化，炎性肠病，克罗恩氏病和溃疡性结肠炎。
14.根据权利要求11或权利要求12所述的分离的或重组的肽分子，其用于根据权利要求11或权利要求12所述的用途，其中所述炎性病况是与外科手术相关的急性器官衰竭，诸如急性肾损伤，与外科手术干预相关的急性呼吸窘迫综合征，所述外科手术干预诸如胸外科手术并且包括但不限于：心脏外科手术、冠状动脉旁路、主动脉瘤、瓣膜外科手术、肾脏疾病、冠状动脉旁路移植术、主动脉根部和升主动脉瘤修复外科手术。
15.根据权利要求10所述的分离的或重组的肽分子，其用于治疗和/或预防慢性阻塞性肺病。
16.根据权利要求10所述的分离的或重组的肽分子，其用于治疗和/或预防自身免疫性病症。
17.根据权利要求16所述的分离的或重组的肽分子，其用于根据权利要求16所述的用途，其中所述自身免疫性病症选自溶血性贫血、血小板减少、恶性贫血、艾迪生氏病、自身免疫性糖尿病、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、动脉粥样硬化、自身免疫性脑炎、结缔组织病、多发性硬化、系统性红斑狼疮、自身免疫性肺炎症、格林-巴利综合征、自身免疫性甲状腺炎、重症肌无力、移植物抗宿主病和自身免疫性炎性眼病。
18.根据权利要求10所述的分离的或重组的肽分子，其用于治疗和/或预防变应性病症。
19.根据权利要求18所述的分离的或重组的肽分子，其用于根据权利要求18所述的用途，其中所述变应性病症选自湿疹、皮炎、变应性鼻炎(枯草热)、变应性气道疾病、嗜酸性粒细胞过多综合征、接触性皮炎；特征在于嗜酸性粒细胞性气道炎症和气道高反应性的呼吸系统疾病，诸如哮喘，包括变应性哮喘和内源性哮喘、变应性支气管肺曲霉病、嗜酸性粒细胞性肺炎、变应性支气管炎支气管扩张、职业性哮喘、反应性气道病综合征、间质性肺病、嗜酸性粒细胞过多综合征、肺寄生虫病；过敏反应、血清病、药物反应、食物过敏、昆虫毒液过敏、肥大细胞增多病、超敏感性肺炎、荨麻疹、血管性水肿、湿疹、特应性皮炎、变应性接触性皮炎、多形性红斑、史蒂文斯—约翰逊综合征、变应性结膜炎、特应性角膜结膜炎、性病性角膜结膜炎和巨乳头性结膜炎。
20.药物组合物，其包含如权利要求1至9中任一项中所定义的肽分子和一种或多种药学上可接受的赋形剂。
21.预防和/或治疗患者中的如任一前述权利要求中所定义的病况的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的如任一前述权利要求中所定义的分离的或重组的肽分子或如权利要求20中所定义的药物组合物的步骤。
22.根据任一前述权利要求所述的分离的或重组的肽分子、所用的分离的或重组的肽分子肽、药物组合物或方法，其中向所述患者进一步施用一种或多种治疗剂或当提供所述肽时与一种或多种治疗剂组合。
23.根据权利要求22所述的分离的或重组的肽分子、所用的分离的或重组的肽分子肽、药物组合物或方法，其中所述治疗剂选自疾病调节剂、镇痛药、支气管扩张剂、抗炎剂、抗过敏药、过敏原免疫治疗剂、抗病毒药、抗生素、抗体和类固醇。
24.根据权利要求22所述的分离的或重组的肽分子、所用的分离的或重组的肽分子肽、药物组合物或方法，其中所述治疗剂是支气管扩张剂。
25.根据权利要求22所述的分离的或重组的肽分子、所用的分离的或重组的肽分子肽、药物组合物或方法，其中所述治疗剂选自皮质类固醇、抗白三烯、细胞因子单克隆抗体和茶碱。
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