JP2005515973A - Ｇタンパク質結合受容体アンタゴニストとしての環状ペプチド - Google Patents

Abstract

本発明は、Ｇタンパク質結合受容体の活性を調整する能力を有する新規の環状化合物に関する。この化合物は、好ましくはアンタゴニストとして作用する。好ましい実施態様において、本発明は、Ｃ５ａ受容体の環状ペプチドおよびペプチド様アンタゴニストを提供する。このものは多形核白血球およびマクロファージ上のＣ５ａ受容体に対して活性である。本発明の化合物は、強力かつ選択的であり、種々の炎症状態の処置に有用である。

Description

発明の詳細な説明

発明の分野
本発明は、Ｇタンパク質結合受容体の活性を調整する能力を有する新規の環状化合物に関する。この化合物は、好ましくはアンタゴニストとして作用する。好ましい実施態様において、本発明は、Ｃ５ａ受容体の環状ペプチドおよびペプチド様アンタゴニストを提供する。このものは多形核白血球およびマクロファージ上のＣ５ａ受容体に対して活性である。本発明の化合物は、強力かつ選択的であり、種々の炎症状態の処置に有用である。

発明の背景
特許および特許出願を含む、本明細書に引用されたすべての文献は、出典明示により本明細書の一部とする。いかなる文献も先行技術を構成すると認められるものではない。文献の説明において、これらの著者が主張することを述べるが、本出願人は、引用文献の正確さおよび妥当性について争う権利を留保する。明確に理解されるように、本明細書に多くの先行公表が引用されているが、この引用が、オーストラリアおよび他の国における当技術分野での一般知識の部分を構成することの容認を形成するものではない。

Ｇタンパク質結合受容体は、人体で広く認められており、既知細胞受容体型の約６０％を含み、非常に広範な外因性リガンドについて細胞膜を通るシグナル伝達を仲介する。このものは、生理学的および病態生理学的プロセスの種々のアレイに関与する。このプロセスには、限定でないが、心臓血管系、中枢および末梢神経系、生殖系、代謝系、消化系、免疫炎症系および成長の障害、ならびに他の調節的および増殖的障害に関連するものである。Ｇタンパク質結合受容体の機能を選択的に調整する物質は、重要な医療的適用を有する。これらの受容体は、そのシグナル伝達における極めて重要な役割からして、主要な薬物標的であると認められることが増えてきている（G protein-coupled Receptors, IBC Biomedical Library Series, 1996)。

最もよく研究されたＧタンパク質結合受容体のひとつはＣ５ａについての受容体である。Ｃ５ａは、既知の最も強力な走化性物質のひとつであり、好中球およびマクロファージを損傷部位に動員し、それらの形態を変え、顆粒減少を誘発し、カルシウム可動、血管透過性（浮腫）および好中球接着を増加し、平滑筋を収縮し、ヒスタミン、ＴＮＦ-α、ＩＬ-２、ＩＬ-６、ＩＬ-８、プロスタグランジンおよびロイコトリエンを含む炎症メジエーターの放出およびリソソーム酵素の放出を促進し、酸素ラジカルの形成を促進し、抗体の産生を高める（Gerard and Gerard, 1994)。

Ｃ５ａの過剰発現および過小調節は、免疫系仲介炎症状態の病因に関与する。例えば、関節リューマチ、成人呼吸切迫症候群（ＡＲＤＳ）、全身性エリテマトーデス、組織拒絶反応症、虚血性心疾患、再灌流障害、敗血症ショック、乾癬、歯肉炎、粥状動脈硬化症、アルツハイマー病、肺創傷疾患、体外透析後症候群およびその他の種々の症状に関与する（Whaley 1987; Sim 1993)。

Ｃ５ａの炎症後作用を制限する物質は、慢性炎症ならびにその随伴疼痛および組織障害を抑制するのに効力を有する。この理由によって、Ｃ５ａとその受容体との結合を防止する分子は、補体活性化によって起こされた慢性炎症障害の処置に有用である。そのような化合物も補体媒介免疫メカニズムに貴重な新しい観点を提供する。

われわれの前の出願ＰＣＴ／ＡＵ９８／００４９０（その全開示を出典明示により本明細書の一部とする）において、ヒトＣ５ａのＣ末端のいくつかの類似体についての三次元構造を記載し、その情報を、Ｃ５ａのアゴニストまたはアンタゴニストとして挙動する、ヒトＣ５ａ受容体（Ｃ５ａＲ）に結合する新規化合物を設計するのに使用した。かって、推定アンタゴニストは受容体結合およびアンタゴニスト活性にＣ末端アルギニンおよびＣ末端カルボキシレートを必要とすると考えられていた（Konteatis et al., 1994)。ＰＣＴ／ＡＵ９８／００４９０において、実際に末端カルボキシレート基を、Ｃ５ａＲとの高度の結合親和性あるいはアンタゴニスト活性に一般的に必要でないことを明らかにした。それに代えて、今まで認識されていなかった構造特性、回転配座が、好中球上のヒトＣ５ａ受容体との高い結合親和性について要の認識特性であることを発見した。これらの知見を用いて、われわれは、Ｃ５ａ受容体との相互作用についての疎水性アレイ中に疎水性基を集合せしめうる拘束的構造テンプレートを設計した。

われわれの前出願中に同定された最も強力な化合物における各アミノ酸残基での構造を変えることによる効果を調べて、今回、ヒト好中球上のＣ５ａ受容体の環状アンタゴニストについてのさらなる例を開発し、一連の化合物について強力なＣ５ａＲアンタゴニスト活性を同定した。これらの各化合物はＰＣＴ／ＡＵ９８／００４９０で規定された一般的三次元構造必要条件を満足する環状の骨格（scaffold) を含むが、今回、この環に接着する特定の置換基が驚くべきことに非常に予期できない結果をもたらし、前出願ＰＣＴ／ＡＵ９８／００４９０では正確に予測できなかった高と低の両方のアンタゴニスト効力をつくることを見いだした。これらの驚くべき新知見によって、Ｃ５ａ受容体の活性アンタゴニスムについての必要な薬種を純化し、さらに明確にできる。本明細書に記載の予期せざる構造−活性の関係は、ヒト多形核白血球（好中顆粒球）上のＣ５ａ受容体の活性アンタゴニスムについて純化された構造的薬物運搬を明確にする。この薬物運搬は他のヒトおよび哺乳動物の細胞上のＣ５ａ受容体についても適切であると思われる。

発明の要旨
第１態様において、本発明は、Ｇタンパク質結合受容体のアンタゴニストである化合物を提供する。このものは、アゴニスト活性を実質的に有さず、下記の式Ｉの環状ペプチドまたはペプチド様化合物である。

式中、Ａは、Ｈ、アルキル、アリール、ＮＨ_２、ＮＨ−アルキル、Ｎ（アルキル）_２、ＮＨ−アリール、ＮＨ−アシル、ＮＨ−ベンゾイル、ＮＨＳＯ_３、ＮＨＳＯ_２−アルキル、ＮＨＳＯ_２−アリール、ＯＨ、Ｏ−アルキルまたはＯ−アリールである。

Ｂは、アルキル、アリール、フェニル、ベンジル、ナフチルもしくはインドール基、またはＬ−フェニルアラニンやＬ−フェニルグリシンなどのＤ−もしくはＬ−アミノ酸の側鎖であるが、しかし、グリシン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−ホモフェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−ホモトリプトファン、ＬーチロシンまたはＬ−ホモチロシンの側鎖でない。

Ｃは、小さい置換基、例えば、グリシン、アラニン、ロイシン、バリン、プロリン、ヒドロキシプロリンまたはチオプロリンなどのＤ−、Ｌ−もしくはホモアミノ酸の側鎖であるが、しかし、好ましくは、かさ高い置換基、例えば、イソロイシン、フェニルアラニンまたはシクロヘキシルアラニンでない。

Ｄは、Ｄ−ロイシン、Ｄ−ホモロイシン、Ｄ−シクロヘキシルアラニン、Ｄ−ホモシクロヘキシルアラニン、Ｄ−バリン、Ｄ−ノルロイシン、Ｄ−ホモノルロイシン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−テトラヒドロイソキノリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−グルタメートまたはＤ−チロシンなどの中性Ｄ−アミノ酸の側鎖であるが、しかし、好ましくは、グリシンまたはＤ−アラニンの側鎖などの小さい側鎖、Ｄ−トリプトファンなどのかさ高い平面側鎖、あるいはＤ−アルギニンまたはＤ−リシンなどのかさ高い電荷側鎖でない。

Ｅは、かさ高い置換基、例えば、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファンおよびＬ−ホモトリプトファンよりなる群から選ばれるアミノ酸の側鎖であり、あるいはＬ−ナフチルもしくはＬ−３−ベンゾチエニルアラニンであるが、しかし、Ｄ−トリプトファン、Ｌ−Ｎ−メチルトリプトファン、Ｌ−ホモフェニルアラニン、Ｌ−２−ナフチル−Ｌ−テトラヒドロイソキノリン、Ｌ−シクロヘキシルアラニン、Ｄ−ロイシン、Ｌ−フルオレニルアラニンまたはＬ−ヒスチジンの側鎖でない。

Ｆは、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ホモアルギニン、Ｌ−シトルリンまたはＬ−カナバニンの側鎖、あるいはこれらのバイオ同配体であり、すなわち末端のグアニジンまたはウレア基が拘束され、炭素骨格が異なる構造を有する基で置き換えられている側鎖であり、その側鎖が全体として親基と同様に標的タンパク質と反応するような側鎖である。

Ｘは、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨ−または−（ＣＨ_２）_ｎＳ−、ｎが１〜４の整数、好ましくは２または３；−（ＣＨ_２）_２Ｏ−；−（ＣＨ_２）_３Ｏ−；−（ＣＨ_２）_３−；−（ＣＨ_２）_４−；−ＣＨ_２ＣＯＣＨＲＮＨ−；−ＣＨ_２ＣＨＣＯＣＨＲＮＨ−、Ｒが普通のまたは稀なアミノ酸の側鎖；である。

ただし、この化合物は、下記に示す化合物１ではない。
Ｃにおいて、ヒドロキシプロリンおよびチオプロリンのシスおよびトランス両方の型を使用できる。

好ましくは、Ａは、アセトアミド基、アミノメチル基、あるいは置換または非置換のスルホンアミドである。
好ましくは、Ａが置換スルホンアミドであるとき、置換基は、１〜６、好ましくは１〜４炭素原子のアルキル鎖、あるいはフェニルまたはトルイル基である。

好ましくは、Ｇタンパク質結合受容体はＣ５ａ受容体である。しかし、われわれの前出願の代表的化合物もバソプレシンおよびニューロキニン受容体で顕著な結合親和性を有することを見いだしたので、これらの受容体も本発明の範囲内にある。

特に好ましい実施態様において、化合物はＣ５ａに対するアンタゴニスト活性化を有し、Ｃ５ａアゴニスト活性を有さない。

本発明の環状化合物は、好ましくはヒトまたは哺乳動物の細胞上のＣ５ａ受容体のアンタゴニストである。この細胞には、限定でないが、ヒト多形核白血球およびヒトマクロファージがある。本発明の化合物は、Ｃ５ａ受容体に好ましくは強力かつ選択的に結合し、さらに好ましくはサブマイクロモル濃度で強力なアンタゴニスト活性を有する。さらにより好ましくは、化合物は受容体親和性ＩＣ５０＜２５μＭおよびアンタゴニスト強度ＩＣ５０＜１μＭを有する。

さらに好ましくは、化合物は、本明細書に記載の化合物２〜６、１０〜１５、１７、１９、２０、２２、２５、２６、２８、３０、３１、３３〜３７、３９〜４５、４７〜５０、５２〜５８および６０〜７０よりなる群から選ばれる。最も好ましくは、化合物は、化合物３３、化合物６０または化合物４５である。

本明細書の目的において、用語「アルキル」は、１〜６、好ましくは１〜４炭素の直鎖、分枝または環状の置換または非置換のアルキル鎖を意味する。最も好ましくは、アルキル基はメチル基である。用語「アシル」は、１〜６、好ましくは１〜４炭素の置換または非置換のアシルを意味する。最も好ましくは、アルキル基はアセチルである。用語「アリール」は、置換または非置換のホモ環またはヘテロ環を意味し、好ましくは環が５または６員環である。

「普通の」アミノ酸は、グリシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパルテート、アスパラギン、グルタメート、グルタミン、システイン、メチオニン、アルギニン、リシン、プロリン、セリン、トレオニン、ヒスチジンよりなる群から選ばれるＬ−アミノ酸である。

「稀な」アミノ酸には、限定でないが、Ｄ−アミノ酸、ホモアミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、デヒドロアミノ酸、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン以外）、オルト−、メタ−もしくはパラ−アミノ安息香酸、オルニチン、シトルリン、カナバニン、ノルロイシン、δ−グルタミン酸、アミノ酪酸、Ｌ−フルオレニルアラニン、Ｌ−３−ベンゾチエニルアラニン、α，α−ジ置換アミノ酸がある。

第２態様において、本発明は、本発明の化合物を薬学的に許容される担体または賦形剤とともに含む組成物を提供する。

本発明の組成物は、経口、非経口、噴霧、鼻腔内、膜貫通または他の局所適用での使用のために製剤し得るが、経口または局所の製剤が好ましい。局所投与には、ジメチルスルホネートまたはプロピレングリコールなどのビヒクルを使用し得る。他のビヒクルも処置される組織表面に応じて好ましい。

本発明の化合物は、すべてではないが大部分が、代謝酵素、例えば、消化管、血液、肺などの細胞内酵素の存在で安定であると思われる。この安定性は、当業者に既知の通常的な方法で容易に試験できる。

所望の経路によるいかなる投与のためにも適した製剤を、標準的な方法で調製できる。例えば、下記のような周知のテキストブックを参照できる。Remington: The Science and Practice of Pharmacy, vol. II, 2000 (20th edition), A. R. Gennaro (ed), Williams & Wilkins, Pennsylvania。

第３の態様において、本発明は、Ｇタンパク質結合受容体により仲介される病的状態の処置法を提供する。これは、本発明の化合物の有効量を処置を必要とする哺乳動物または脊椎動物に投与する工程を含む。

Ｇタンパク質結合受容体により仲介される状態は、好ましくはＣ５ａ受容体により仲介される状態であって、さらに好ましくはＣ５ａの過剰発現または過小調節を含む。このような状態には、限定でないが、関節リューマチ、成人呼吸切迫症候群（ＡＲＤＳ）、全身性エリテマトーデス、組織拒絶反応症、虚血性心疾患、再灌流障害、敗血症ショック、歯肉炎、線維症、粥状動脈硬化症、多発性硬化症、アルツハイマー病、喘息、痴呆、中枢神経系障害、肺創傷疾患、体外透析後症候群、および乾癬、湿疹、接触性皮膚炎などの皮膚炎症性障害がある。

ひとつの好ましい実施態様において、この状態は関節リューマチである。
第２の好ましい実施態様において、この状態は再灌流障害である。この第２実施態様において、式Ｉについての条件が適用されないことが明確に理解されるであろう。

本発明がいずれにしても特定の動物または種類の処置に限定されるものではないが、本発明の化合物がヒトの医療上の処置に有用であり、さらに動物の獣医学上の処置に有用であることを特に理解すべきである。動物には、イヌやネコなどの愛玩動物、ウシ、ウマ、ヒツジなどの家畜、およびヒト以外の霊長類、大きいウシ科、ネコ科、有蹄類、イヌ科を含む動物園の動物がある。処置し得る他の種類に爬虫類、魚類、両生類がある。

化合物は、適当な用量および適当な経路で投与できる。経口、局所、膜貫通または鼻腔内の投与が、その経路での大きい便利さおよび許容性からして、好ましい。局所適用には、膣または直腸投与のためのペッサリーまたは座剤などの製剤の使用、あるいは耳や眼への局所投与のための水滴剤の使用がある。有効量は、個々の処置について、処置される症状の性質、年齢、体重、健康状態などに依存する。これは、担当の医師または獣医師の裁量である。適当な用量レベルは、当技術分野でよく知られる方法を用いて、試行錯誤の試験により容易に決定できる。

本明細書の目的において、用語「含むこと」は、「含んでいること」であって、「限定されること」を意味しないことは、明確に理解されるであろう。用語「含む」は対応する意味を有する。

（図面の簡単な説明）
図１は、静脈内（Ａ）、経口（Ｂ）、局所（Ｃ）、ＡｃＦ-[ＯＰｄＣｈａＷＲ] および適当な対照（Ｄ）による皮膚アルサス(Arthus)反応に関連する血管滲出の阻害を示す。
図２は、静脈内（Ａ）、経口（Ｂ）、局所（Ｃ）のＡｃＦ-[ＯＰｄＣｈａＷＲ] および適当な対照（Ｄ）による皮膚アルサス反応に関連する循環ＴＮＦ-α上昇の阻害を示す。

図３は、静脈内、経口、局所の ＡｃＦ-[ＯＰｄＣｈａＷＲ] による皮膚アルサス反応に関連する病因指標の低下を示す。
図４は、消化器虚血−再灌流誘発の腸浮腫に対するＣ５ａアンタゴニストの作用を示す。

図５は、消化器虚血−再灌流誘発の好中球減少症に対するＣ５ａアンタゴニストの作用を示す。
図６は、消化器虚血−再灌流誘発の血漿ＴＮＦ-α上昇に対するＣ５ａアンタゴニストの作用を示す。

図７は、消化器虚血−再灌流誘発の血漿ハプトグロビン上昇に対するＣ５ａアンタゴニストの作用を示す。
図８は、消化器虚血−再灌流誘発のアスパルテート・アミノトランスフェラーゼに対するＣ５ａアンタゴニストの作用を示す。

図９は、消化器虚血−再灌流の組織病理に対するＣ５ａアンタゴニストの作用を示す。
図１０は、２〜１４日に経口投与されたＡｃＦ-[ＯＰｄＣｈａＷＲ]による関節炎右膝関節肥厚の阻害を示す。

図１１は、関節洗浄における右膝関節ＴＮＦ-αおよびＩＬ-６レベルの阻害を示す。「非処置」は、ＡｃＦ-[ＯＰｄＣｈａＷＲ]で処置されていない動物を意味する。ただし、右膝は抗原後に感作を受けた。

図１２は、３Ｄ５３のＤＭＳＯ／蒸留水またはＰＧ・Ｈ_２Ｏ液の皮膚適用が１５分以内に循環血漿中にＣ５ａアンタゴニストの出現をもたらすこと、および有意のレベルが少なくとも４時間持続することを示す。ポイントは各群（ｎ＝６〜８）で平均±ＳＥＭを表示する。

図１３は、Ｃ５ａアンタゴニストの局所投与によるＣ５ａ誘発の好中球減少症の阻害を示す。結果を０時間ベースラインからの％変化で表す。
図１４は、ラットにおいてＣ５ａアンタゴニストの局所投与が静注のＬＰＳの全身的作用を阻害することを示す。データによると、静脈（１ｍｇ／ｋｇ）または皮膚適用による局所（５０ｍｇ／ｋｇ全適用量：溶媒ビヒクル５０％ＤＭＳＯ／５０％Ｈ_２Ｏ）での種々のＣ５ａアンタゴニストの投与が静注ＬＰＳ（１ｍｇ／ｋｇ）による好中球減少症を阻害する。（ａ）３Ｄ５３（化合物１）、（ｂ）化合物４５、（ｃ）化合物１７。

図１５は、ラットでの灌流時における（Ａ）クレアチニン・キナーゼ（ＣＫ）および（Ｂ）乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の血漿レベルの増加に対するＣ５ａアンタゴニストＡｃＦ-[ＯＰｄＣｈａＷＲ]の作用を示す。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝６〜１０）を表示する。^＊Ｐ＜０.０５、全薬物処置群対虚血／灌流（Ｉ／Ｒ）単独群；†Ｐ＜０.０５、全薬物処置群対シャム手術群。

図１６は、ラットでの灌流２、３、４時間後における（Ａ）アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）および（Ｂ）アスパラテートアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の血漿レベルの増加に対するＣ５ａアンタゴニストＡｃＦ-[ＯＰｄＣｈａＷＲ]の作用を示す。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝６〜１０）を表示する。^＊Ｐ＜０.０５、全薬物処置群対虚血／灌流（Ｉ／Ｒ）単独群；†Ｐ＜０.０５、全薬物処置群対シャム手術群。

図１７は、ラットにおける（Ａ）循環ＰＭＮ、（Ｂ）筋肉ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、（Ｃ）肺ＭＰＯ、（Ｄ）肝ＭＰＯレベルを示す。レベルはラットにおける試験完了時に測定した。データはで平均±ＳＥＭ（ｎ＝４〜１０）を表示する。^＊Ｐ＜０.０５、対虚血／灌流（Ｉ／Ｒ）単独群；†Ｐ＜０.０５、対シャム手術群。

図１８は、試験完了時に採取されたラット肝ホモゲネートサンプル中のＴＮＦ-αレベルを示す。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝４〜１０）を表示する。^＊Ｐ＜０.０５、対虚血／灌流（Ｉ／Ｒ）単独群；†Ｐ＜０.０５、対シャム手術群。

図１９は、試験完了時のラット後足筋肉の浮腫量（ウエット・ツー・ドライ比率）を示す。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝４〜１０）を表示する。^＊Ｐ＜０.０５、対虚血／灌流（Ｉ／Ｒ）単独群；†Ｐ＜０.０５、対シャム手術群。

発明の詳細な説明
一般的に、用語「処置する」「処置」および類似用語は、所望の薬理学的および／または生理学的作用を得るために対象、組織または細胞に影響を及ぼすことを意味して、本明細書で使用する。作用は、疾患やその兆候または症候を完全にまたは部分的に防ぐことで予防的であり、および／または疾患を部分的または完全に治癒することで治療的であり得る。本明細書で用いられる「処置する」は、脊椎動物、哺乳類、特にヒトでの疾患のすべての治療または予防を包含する。それには、疾患に罹り得るが、まだそうとは診断されていない対象における発症の予防；疾患の阻止、すなわち疾患進行の停止；疾患の作用の緩解または軽減、すなわち疾患作用の退行がある。

本発明は、疾患の軽減に有用な種々の医薬組成物を含む。本発明のひとつの実施態様における医薬組成物は、式Ｉの化合物、あるいはその類似体、誘導体または塩と１以上の医薬活性物質、または式Ｉの化合物と１以上の医薬活性物質の組合せ物を、担体、賦形剤、添加剤または補助剤を用いて、対象への投与に適した形態につくることにより調製する。

よく使用される担体または補助剤には、炭酸マグネシウム、二酸化チタン、乳糖、マニトールおよび他の糖類、タルク、乳タンパク、ゼラチン、デンプン、ビタミン、セルロースおよびその誘導体、動物性および植物性油、ポリエチレングリコール、および滅菌水、アルコール類、グリセロールおよび多価アルコールなどの溶媒がある。静脈用ビヒクルは液体または栄養充填物を含む。保存剤には、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスがある。他の薬学的に許容される担体には、水性溶液、塩を含む非毒性賦形剤、保存剤、緩衝液などがあり、例えば、下記に記載されている。Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th ed. Williams & Wilkins (2000) および The British National Formulary 43rd ed. (British Medical Association and Royal Pharmaceutical Society of Great Britain, 2002; http://bnf.rhn.net)（出典明示により本明細書の一部とする）。医薬組成物の種々の成分のｐＨおよび厳密な濃度は、通常の技術で調整できる。参照、Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis for Therapeutics (7th ed., 1985)。

医薬組成物は、好ましくは用量単位で調製し投与する。固体の用量単位には、錠剤、カプセル、座剤がある。対象の処置のために、化合物の活性、投与形態、障害の性質および重篤度、対象の年齢および体重に従って、異なる１日用量を用い得る。しかし、ある種の状況においては、さらに高いまたは低い１日用量が適している。１日用量の投与は、個々の用量単位の形態での単回投与またはいくつかの小用量単位の投与で、あるいは具体的な間隔での分割用量の多回投与でもって行い得る。

本発明の医薬組成物は、医療的有効量で局所的または全身的に投与できる。この使用での有効量は、もちろん、疾患の重篤度ならびに対象の体重および一般的状態に依存する。典型的には、インビトロで使用される用量は、医薬組成物のインシトゥ投与に有用な量について役立つ指標であり、また動物モデルを用いて、細胞毒性副作用の処置のための効果的な量を決定し得る。種々の考察すべき事項が、例えば、Langer, Science, 249: 1527, (1990) に記載されている。経口使用の製剤は硬カプセルの形態であり得る。カプセル中で、活性成分を不活性の固体希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリンと混合する。また、経口使用の製剤は軟ゼラチンカプセルの形態であり得る。カプセル中で、活性成分を水または油性媒体、例えば、ピーナッツ油、液体パラフィンまたはオリーブ油と混合する。

水性懸濁液は、活性物質を水性懸濁液の製造に適した賦形剤とともに混合物中に通常含有する。このような賦形剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガム、アカシアガムなどの懸濁剤；分散剤や湿潤剤、（ａ）レシチンなどの自然界に存在のホスファチドであり得るもの；（ｂ）アルキレンオキシドと脂肪酸の縮合産物、例えば、ポリオキシエチレンステアレート；（ｃ）エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールの縮合産物、例えば、ヘプタデカエチルエノキシセタノール；（ｄ）エチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトールから誘導された部分的エステルの縮合産物、例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート；または（ｅ）エチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール無水物から誘導された部分的エステルの縮合産物、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートであり得る。

医薬組成物は、無菌の注射用水性または油性の懸濁液であり得る。この懸濁液は、上記のような適当な分散剤や湿潤剤および懸濁剤を用いる既知の方法により製剤できる。無菌の注射用製剤は、非経口的に許容される希釈剤すなわち溶媒中無菌の注射用溶液または懸濁液、例えば、１，３−ブタノール溶液であり得る。使用し得る許容のビヒクルおよび溶媒には、水、リンゲル液、等張塩化ナトリウム液がある。さらに、無菌の不揮発性油を溶媒または懸濁媒体として通常的に使用できる。この目的のために、すべての緩和な不揮発性油を使用でき、合成モノまたはジグリセリドがある。さらに、オレイン酸などの脂肪酸を注射用の調製に使用できる。

式Ｉの化合物は、リポソーム送達システムの形態、例えば、小さい単層小胞、大きい単層小胞、多層小胞などの形態でも投与し得る。リポソームは、種々のホスホリピド、例えば、コレステロール、ステアリルアミン、ホスファチジルコリンなどから形成され得る。

本発明の式Ｉの化合物についての用量レベルは、体重ｋｇ当たり約０.５ｍｇから約２０ｍｇの範囲に通常あり、好ましい用量は１日体重ｋｇ当たり約０.５ｍｇから約１０ｍｇの範囲である（患者１人あたり１日に約０.５ｇから約３ｇ）。１回量をつくるための担体材料と組合せ得る活性成分の量は、処置される対象および投与の特定の状態によって変わってくる。例えば、ヒトへの経口投与を意図する製剤は、約５ｍｇから１ｇの活性化合物を、適当で便利な量の担体材料とともに含有し得る。担体は全組成物の約５から９０％であり得る。用量単位形態は、約５ｍｇから５００ｍｇの活性成分を一般的に含有し得る。

しかし、理解されるように、特定の患者についての具体的な用量レベルは、種々の因子によって変わってくる。それには、使用する具体的な化合物の活性、年齢、体重、全身的健康状態、性別、食事、投与時間、投与経路、排泄速度、併用薬剤、治療を施そうとする疾患の重篤度などがある。

さらに、本発明化合物のいくつかは、水または共通の有機溶媒と溶媒和物を形成し得る。この溶媒和物は、本発明の範囲に包含される。
本発明の化合物はさらに、他の化合物と追加的に組み合されて、効果的な組み合せをつくり得る。医薬活性物質と本発明の式Ｉの化合物とのすべての化学的に両立し得る組合せを含むことを意図する。
明確に理解されるように、医薬製剤、投与経路、用量レベルなどについての上記の説明は等しく化合物１に適用可能である。

本明細書で使用する略号は次のとおりである。
ＢＯＰ：ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリ−(ジメチルアミノ)−ホスホニウム・ヘキサフルオロホスフェート
Ｃ５ｃＲ：Ｃ５ａ受容体
ｄＨ_２Ｏ：蒸留水
Ｄ−Ｃｈａ：Ｄ−シクロヘキシルアミン
ＤＩＰＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ：Ｎ,Ｎ−ジメチルホルマミド
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＨＢＴＵ：Ｏ−ベンゾトリアゾールＮ',Ｎ',Ｎ',Ｎ'−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＥＰＥＳ：Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィ−
ＲＰ−ＨＰＬＣ：逆相高速液体クロマトグラフィ−
ｉ．ｖ．：静脈内
ＬＰＳ：リポポリサッカライド
ＰＭＮ：多形核顆粒球
ｐｏ：経口
ＲＭＳＤ：二乗平均平方根偏差
ｒｐ−ＨＰＬＣ：逆相高速液体クロマトグラフィ−
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸;
本明細書を通じて、通常の三文字表記および一文字表記をアミノ酸に使用する。

用語「３Ｄ５３」および「ＰＭＸ５３」は同義語であり、化合物Ａｃ-Ｐｈｅ-[Ｏｒｎ-Ｐｒｏ-ｄＣｈａ-Ｔｒｐ-Ａｒｇ]を表す。
用語「ＬＰ−１０」および「ＰＭＸー２０１」は同義語であり、化合物Ａｃ-Ｐｈｅ-［Ｏｒｎ-Ｐｒｏ-ｄＣｈａ-Ｔｒｐ-Ｃｉｔ]を表す。
用語「ＬＰ−１６」および「ＰＭＸー２０５」は同義語であり、化合物ＨＣ- [Ｏｒｎ-Ｐｒｏ-ｄＣｈａ-Ｔｒｐ-Ａｒｇ]（「ＨＣ」はヒドロシナメートを示す）を表す。

本発明を下記の一般的方法および実施例のみについての参考として記載する。
現在までに試験した式Ｉの全化合物が広い類似の薬理学的活性を有することを見出した。この活性は、化合物１（３Ｄ５３またはＰＭＸ５３とも呼ぶ）の活性に類似するが、個々の化合物の物理化学的性質、効力およびバイオアベイラビリティが具体的な置換基によってある程度異なる。このように、化合物１でインビトロまたはインビボで得られた結果でもって、対応するアッセイにおける式Ｉの化合物の活性を合理的に推測できるであろう。

一般的方法
保護されたアミノ酸および樹脂をNovabiochemから得た。ＴＦＡ、ＤＩＰＥＡおよびＤＭＦ(ペプチド合成等級)をAuspepから購入した。すべての他の材料は、特に断わらない限り試薬等級である。暫定的規模での逆相ＨＰＬＣ分離をVydac Ｃ１８逆相カラム(２.２×２５cm)で行い、そして分析逆相ＨＰＬＣ分離をWaters Delta−Pak PrepPak Ｃ１８逆相カラム(０.８×１０cm)で行った。これには、溶媒Ａ＝水/０.１％ ＴＦＡおよび溶媒Ｂ＝水１０％/アセトニトリル９０％、０.０９％ＴＦＡの勾配混合物を用いた。ペプチドの分子量の測定は電子スプレー質量分析で３重四極子質量分析計(PE SCIEX API III)により記録した。参照(Haviland et al, 1995)。^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルをBruker ARX 500 MHzまたはVarian Unity 400分析計で記録した。プロトン移行は２Ｄ ＮＭＲ試験(DFCOSY, TOCSY, NOESY)で測定した。
化合物は質量分析法および逆相分析ＨＰＬＣで調べた。

化合物の合成
直線的ペプチド配列を当業者に周知のマニュアル工程型標準的固相ペプチド合成法（ＳＰＰＳ）により会合した。アミノ酸またはペプチド末端をＨＢＴＵ、ＤＩＥＡでインシトゥ中性化で活性にした。カップリングを標準の定量的ニンヒドリン試験でモニターした。Ｂｏｃ化学をアミノ酸の一時的Ｎ^α保護のために用い、Ｂｏｃ基除去のためにＴＦＡで１分間２回処理した。ペプチドを、Novabiochem Boc-D-Arg(Tos)-PMA または Boc-L-Arg(Tos)-PAM 樹脂上で置換値約０.２−０.５ｎｍｏｌ／ｇで合成した。ペプチドを、液体ＨＦ（１０ｍＬ）、ｐ−クレゾールの−５℃、１−２時間の処理で完全に脱保護し、開裂した。ペプチドを、逆相ＨＰＬＣ（例えば、勾配：０％Ｂから７５％Ｂ，６０分間以上）で精製し、電子スプレー質量分光法により分析した。

あるいは、直線状ペプチドは、Fmoc-D-Arg(Mtr)-Wang 樹脂上でのＨＢＴＵ／ＤＩＥＡ活性化を用いるＦｍｏｃ化学により合成できる。Ｆｍｏｃ基除去は、５０％ピペリジン／ＤＭＦでの２回の１分間処置を用いて行った。９５％ＴＦＡ／２.５％ＴＩＰＳ／２.５％Ｈ_２Ｏを用いる開裂および脱保護で Mtr-保護ペプチドを得る。これはＲＰ−ＭＰＬＣで精製できる。

直線状ペプチドの環化についての一般的方法で、ペプチド（１等量）およびＢＯＰ（５等量）をＤＭＦに溶かし（１０ｍＭペプチド濃度）、激しく攪拌し、ＤＩＥＡ（１５等量）を加える。ほとんどの場合、反応は２時間で完了するが、通常、室温で溶液の攪拌を１夜続ける。ＤＭＦを高度の真空、３０℃、回転蒸留器で除去し、ＲＰ−ＨＰＬＣで精製する。遊離Ｎ末端を含有する環状ペプチドのために、環化工程の際に一時的Ｎ末端保護基としてＦｍｏｃ基を使用した。ＤＭＦを高度の真空、３０℃、回転蒸留器で除去し、ついでペプチドを３０％ピペリジン／ＤＭＦで１時間、室温で処理し、Ｆｍｏｃ基を除去した。その後に、高度真空での溶媒除去およびＲＰ−ＨＰＬＣによる精製を行った。環合成についての代表的例を下記する。

ＮＭＲ構造決定
^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを試験化合物(７５０μｌ ｄ_６−ＤＭＳＯ中３mg、δ ２.５０)について溶媒対照で、Varian Unity ４００分光計により２４℃で記録した。２次元^１Ｈ−ＮＭＲ NOESY(遅延時間２.０秒、混合時間５０−３００分)、DFQ−COSYおよびTOCSY(混合時間７５分)試験で収集し、相感受性モードで記録した。すべての実験について、データ収集時間＝０.１８６秒、スペクトル幅＝５５００Hz、複数点(ｔ_１軸)＝１０２４。データは両軸において、ゼロ付加して、１０２４の実質点へFourier移行した。

化合物１についてのＮＭＲデータをSilicon Graphics Ind 計算センターでのTRIAD ソフトウェアー(Tripos Assoc.)で処理した。２Ｄ ＮＯＥ交差ピークを積分し、強(１.８−２.５Å)、中程度(２.３−３.５Å)および弱(３.３−５.０Å)に分類した。暫定的３次元構造を、Ｄiana２.８(６９距離制約、隣接残基について２７およびさらに離れるもの６を含む)を用いて重複２面角制約法(ＲＥＤＡＣ)で上限および下限距離制限ファイルから計算した。上限および下限距離制約をMARDIGRASで正確に計算した。この段階で、可能な水素結合についてペプチドを調べ、結合を距離制約として加えた。５０最低エネルギーＤiana構造を制約分子動力法(ＲＭＤ)および制約エネルギー最小化(ＲＥＭ)の対象とした。ＲＥＭは、最初に５０段階急勾配低下、次いで１００段階共役傾斜最小化法からなる。ＲＭＤは、構造の模擬加熱で行い、１ps につき３００Ｋ、次いで１ps につき５００Ｋで行った。温度を徐々に下げ、２ps 以上で３００Ｋ、最終的に２ps につき２００Ｋとした。ＲＥＭを再び５０段階急勾配低下、２００段階勾配、次いで３００段階 Powell最小化を行った。最終構造を調べて、骨格重原子(Ｎ、ＣαおよびＣ)を越える平均対の平方自乗平均差異を得る。５０構造中３０ですべての骨格原子(Ｏ、Ｎ、Ｃ)につき平方自乗平均＜０.５であった。

受容体結合アッセイ
新鮮ヒトＰＭＮを(Sanderson et al, 1995)記載のように単離し、アッセイを行った。それには、緩衝液の５０mM ＨＥＰＥＳ、１mＭ ＣａＣｌ_２、５mＭ ＭｇＣｌ_２、０.５％ウシ血清アルブミン、０.１％バシトラシンおよび１００μＭフェニルメチルスルホニルフルホライド(ＰＭＳＦ)を用いた。４℃でのアッセイにおいて、緩衝液、非標識ヒト組換えＣ５ａ(Sigma)またはペプチド、Hunter/Bolton標識^１２５Ｉ−Ｃ５ａ(〜２０pM)(New England Nuclear, MA)およびＰＭＮ(０.２×１０^６)を、Millipore Multiscreenアッセイプレート(ＨＶ ０.４５)に順次加え、最終容量を２００μｌ/ウエルとした。６０分間４℃でインキュベートした後、サンプルを濾過しプレートを１回緩衝液で洗った。フィルターを乾燥し、パンチし、ＬＫＢガンマ計で計数した。非特異的結合を１mMペプチドまたは１００nM Ｃ５ａで調べた。これは典型的に１０−１５％の全結合をもたらすものであった。データ解析は非直線的回帰およびDunnett postテストで統計処理した。

アンタゴニスト活性についてのミエロペルオキシダーゼ放出アッセイ
細胞を(Sanderson et al, 1995)記載のように単離し、シトチャラシンＢとともにインキュベートした(５μg/mL、１５分間、３７℃)。０.１５％ゼラチンおよびペプチドを含む Hank's Balanced Salt 溶液を９６ウエルプレート(全量１００μｌ/ウエル)に加え、次いで２５μｌ 細胞４×１０^６/mL)を加えた。Ｃ５ａに拮抗する各ペプチドの能力を調べるために、細胞を５分間３７℃各ペプチドとともにインキュベートし、Ｃ５ａ(１００nM)を加え、さらに５分間インキュベートした。次いで、５０μｌ のリン酸ナトリウム(０.１Ｍ、ｐＨ６.８)を各ウエルに加え、プレートを室温に冷やし、等量のジメトオキシベンジジン(５.７mg/mL)とＨ_２Ｏ_２(０.５１％)からなる２５μｌ の新鮮混合物を各ウエルに加えた。反応を１０分で、２％アジドナトリウムを加えて停止した。吸光度を４５０nmで Bioscan ４５０ plate reader により測定し、対照値(ペプチドなし)で修正し、非直線回帰で解析した。

抗炎症活性のインビボアッセイ
下記のよく知られたインビボアッセイ系を用いて、本発明の化合物の抗炎症活性を調べる。すべてのアッセイデータの解析には、非直線回帰解析、Student's ｔ−検定、分散分析を用いた。有意水準の閾値はＰ＜０.０５である。

(ａ)カラゲナン足蹠浮腫
麻酔(腹腔内、ケタミンおよびキシラジン)ウイスターラット(１５０−２００ｇ)またはマウスに滅菌空気(２０ml １日目、１０ml ４日目)を背中の皮下組織へ注射した。空洞を６日後に使用できる。カラゲナン(２ml、１％ w/w ０.９％塩類溶液)を空気ポーチに注入し、滲出液を１０時間後に採取した。試験化合物を６日後に毎日投与し、抗炎症作用を空気ポーチ滲出液中の細胞を示差計数して調べた。動物を注射後の適当な時に殺し、２ml ０.９％塩類溶液を用いて空洞を洗い、ヘパリンを入れた管に洗液を移し、細胞を血球計およびDiff−Quik染色細胞遠心製剤で計数した。

あるいは、通常のカラゲナン足蹠浮腫をウイスターマウスで、カラゲナンを足蹠に注射してつくり、２時間後に可視でき、４時間後に最大となる浮腫が生じた。試験化合物を炎症起剤の４０分前に与え、２および４時間後の足蹠をマイクロカリパスで測定した。参照、Fairlie,D.P. et al (1987) および Walker and Whitehouse (1978)。

(ｂ)アジュバント関節炎
アジュバント関節炎をラット（３種）に、関節原性アジュバントをフロイントアジュバントなどの油状担体とともに尾基部に接種して、微生物学的に（殺菌 Mycobacterium tuberculosis を注射)または化学的に(アヴリジンで)起こした(参照 Whitehouse, M. W., Handbook of Animal Models for the Rheumatic Diseases, Eds. Greenwald, R. A.; Diamond, H. S.; Vol. １, pp. 3-16, CRC Press)

１３日以内に、アジュバント関節炎が、尾の局所的炎症および潰瘍、全４足蹠の腫脹、足蹠および耳の炎症性損傷および体重減少や発熱で表われる。これらの症状は、ヒトの炎症疾患に似ており(Winter and Nuss, 1966)、ヒトで効果を現すインドメサシンやシクロスポリンなどの薬剤により改善される(例えば、Ward and Cloud, 1966)。１４日目での薬剤処置をしないと、関節炎ラットに足蹠の肥厚が生じ、血清中のアルブミンが低下し、急性相反応タンパク質が増加し、バルビテュレートによる睡眠時間の延長で表されるように生体異物の肝代謝を抑制した。

活性を調べるために、アルトリトゲン（０日目）の接種１０−１３日後に化合物を４日間経口（１０mg／kg／日以下）または腹腔内投与した。足蹠の厚さおよび尾の容量のマイクロカリパス測定、および炎症損傷の観察によって調べたところ、炎症は前足および後足で認められないか、非常に減少していた。動物を１８日目に頚部切断で殺した。ただし、炎症徴候がなかった場合は、倫理委員会の特別の許可を得て観察を続けた。試験を続けて情報量を最大にし、化合物間の初期の比較を可能にした。この日常的なアッセイは、ヒトに用いられる抗炎症剤を同定するのに、よく受け入れられる。

薬物動態
雄および雌のウィスターラット（２００−２５０ｇ）を、ゾレチル（５０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ；Lyppard, Australia）の腹腔内投与により麻酔した。面積５ｘ１０ｃｍの毛を剃り、ラットの下腹部に印をつけて、その上に薬物を適用した。１０ｍｇ／ｋｇのＣ５ａアンタゴニストを含有する保存液を溶媒プロピレングリコールまたはジメチルスルホキシド中に水で種々の濃度として溶解し、へらでラットの剃毛下腹部に均等に塗った。足の加熱でラットの体重を保持し、血液サンプルを最初の１時間は１５分の間隔で、その後は１時間の間隔で計３時間で採取した。

血液サンプルをヘパリン含有（５００単位／μｌ）の管に直ちに加え、遠心分離した（１１０００ｘｇ）。各サンプルの血漿層を取り出し、−２０℃で保存した。重水素化内部標準液、^２Ｈ_３ＣＯ−Ｆ−[ＯＰｄＣＨａＷＲ]５０μｌ（５０％アセトニトリル／水中５μｇ／ｍＬ）を加え、攪拌した。サンプルをさらに１：３に高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）級アセトニトリルで希釈し、激しく攪拌し（２０秒）、ついで遠心分離した（１１０００ｘｇ）。この操作でサンプル中に多量の血漿タンパク質を得て、血漿から薬物の完全な抽出をなす。サンプルの液体部分を Eppendorf 管に入れ、分析まで保存した。

これらのサンプルを９６ウエルプレートに移し、GeneVac 遠心蒸留器で蒸発乾固しついで動相でウエル中に再構築した（２０μｌ）。液体クロマトグラフィー（ＬＣＭＳ）によるサンプルの分析を、PE Sciex Qstar Pulsar ESI-TOP 質量分光器と結合したウエルプレート自動サンプラーを備えた Agilent 1100 シリーズＨＰＬＣで行った。濃度を薬物：内部標準のピーク面積比の標準曲線から決定した。標準は、適当な量の薬物および内部標準を非処置ラットからの血漿に加えて調製し、抽出し、実験サンプルと同じ方法で調製した。

実施例１：環状化合物の合成
環状ＡｃＦ-[ＯＰｄＣｈａＷＲ](１)の合成
直鎖状ペプチドＡｃ−Ｐｈｅ−Ｏｒｎ−Ｐｒｏ−ｄＣha−Ｔｒｐ−Ａｒｇを、Ｂｏｃ−Ｌ-Ａｒｇ(Ｔｏｓ)-ＰＡＭ樹脂(３３８ mg, ＳＶ＝０.５９１mmol/g)上で、ＨＢＴＵ／ＤＩＥＡ活性化およびイン・シチュでの中和を用いる、０.２０ mmoleスケールでＢoc化学によって合成した。樹脂(４５７mg)の開裂および脱保護を、−５〜０℃で１〜２時間、ＨＦ(１０ml)およびｐ−クレゾール(１ml)で処理することによって達成し、粗製ペプチド(１６０mg, ９０％)を得た。環状化には、ＤＭＦ(５７mL)中で、１５時間、粗製ペプチド(４１mg, ４５μmol)、ＢＯＰ(１２６mg, ０.２８mmol)およびＤＩＥＡ(１５８Ab, ０.９mmol)を攪拌することが含まれる。該溶媒を真空で除去し、環状ペプチドをｒｐＨＰＬＣ(１８.８ mg, ４７％) Ｒt=１０.８ 分(勾配:７０％Ａ／３０％Ｂから０％Ａ／１００％Ｂ、３０分にわたって)によって精製した。ＭＳ:[Ｍ＋Ｈ]⁺(計算値)=８９６.５， [Ｍ＋Ｈ]⁺ (実測値)=８９６.５．

環状ＡｃＦ−[ＯＰｄＰｈｅＷＲ](３３)の合成
直鎖状ペプチドＡｃ−Ｐｈｅ−Ｏｒｎ−Ｐｒｏ−ｄＰhe−Ｔｒｐ−Ａｒｇを、Ｂｏｃ−Ｌ-Ａｒｇ(Ｔｏｓ)-ＰＡＭ樹脂上で、ＨＢＴＵ／ＤＩＥＡ活性化およびイン・シチュでの中和を用いて、Ｂｏｃ化学によって合成した。該樹脂の開裂および脱保護を、−５℃〜０℃で１〜２時間、ＨＦ(１０ ml)およびｐ−クレゾール(１ml)で該樹脂を処理することによって達成し、粗製ペプチドを得た。環状化には、ＤＭＦ(１０mL)中で、１５時間、粗製ペプチド(８５mg)、ＢＯＰ(２００mg)およびＤＩＥＡ(２２２μL)を攪拌することが含まれる。該溶媒を、真空で除去し、該環状ペプチドをｒｐＨＰＬＣによって精製した(３１mg)。Ｒt=１６.７分(勾配:７０％Ａ／３０％Ｂから０％Ａ／１００％Ｂ、３０分にわたって)。ＭＳ:[Ｍ＋Ｈ]⁺(計算値)=８９０.５，[Ｍ＋Ｈ]⁺(実測値)=８９０.５．

環状ＡｃＦ−[ＯＰｄＣｈａＦＲ](６０)の合成
直鎖ペプチドＡｃ−Ｐｈｅ−Ｏｒｎ−ＰｒｏＤ-Ｃha−Ｐｈｅ−Ａｒｇを、Ｂｏｃ−Ｌ-Ａｒｇ(Ｔｏｓ）-ＰＡＭ樹脂上で、ＨＢＴＵ／ＤＩＥＡ活性化およびイン・シチュでの中和を用いて、Ｂｏｃ化学によって合成した。樹脂の開裂および脱保護を、ＨＦ(１０ml)およびｐ−クレゾール(１ml)で該樹脂を−５〜０℃で１〜２時間処理することによって達成し、粗製ペプチドを得た。環状化には、ＤＭＦ(1 mL)中で１５時間、粗製ペプチド(１０４mg)、ＢＯＰ(５７mg)およびＤＩＥＡ(１０３μL)を攪拌することが含まれる。該溶媒を真空で除去し、環状ペプチドをｒｐＨＰＬＣ(５２mg)によって精製した。
Ｒt=１１.３７分(勾配:７０％Ａ／３０％Ｂ〜０％Ａ／１００％Ｂ、１５分にわたって) ＭＳ：[Ｍ＋Ｈ]⁺(計算値)=８５７.５， [Ｍ＋Ｈ]⁺(実測値)=８５７.４

環状ＡｃＦ−[ＯｐｄＣｈａ(Ｎ−Ｍｅ−Ｐｈｅ)Ｒ](６４)の合成
直鎖状ペプチドＡｃ−Ｐｈｅ−Ｏｒｎ−ｐｒｏ-ｄＣha−(Ｎ−Ｍｅ−Ｐｈｅ)-Ａｒｇ−ＯＨを、メチル-Ｌ-Ｐhe(２８１mg, ２等量)、Ｆｍｏｃ−ｄＣha（２７５mg, ２等量）、Ｆmoc-Ｐro(４７２mg, ４等量)、Ｆmoc-Ｏrn (Ｂoc)(４７７mg, ３等量)、Ｆmoc-Ｐhe(５４２mg, ４等量)およびＡc２Ｏ(４等量)を用いるNovabiochemのＦｍｏｃ−Ｌ-Ａｒｇ(ｐｂｆ)-樹脂(０.３５ mmol/g)上で、ＨＢＴＵ／ＤＩＥＡ活性化およびイン・シチュでの中和を用いるＦｍｏｃ化学によって合成した。樹脂の開裂および脱保護を、９５％ＴＦＡで(15 mL)１時間該樹脂を処理することによって達成し、ジエチルエーテルによる沈殿後、粗製ペプチド(１５０mg)を得る。環状化には、ＤＭＦ(２mL)中で、ｒｐＨＰＬＣ精製ペプチド(１００mg)、ＢＯＰ(２００mg)およびＤＩＥＡ(２２２μL)を４時間攪拌することが含まれる。該溶媒を真空で除去し、環状ペプチドをｒｐＨＰＬＣによって精製した(５０mg) Ｒt=３３分間 (勾配:７０％Ａ／３０％Ｂから０％Ａ／１００％Ｂ、３０分にわたって)ＭＳ:[Ｍ＋Ｈ]⁺(計算値)=８７１.５， [Ｍ＋Ｈ]⁺(実測値)８７１.５．

環状ＡｃＦ−[{Ｏｒｎ−(δＮ−Ｍｅ)}ＰｄＣｈａＷＲ](６６)の合成
Ｂｏｃ−(δＮ−Ｍｅ−Ｏｒｎ)-ＯＨを、論文(Pol. J. Chem. 1988, 62,257-261) のとおりに合成した。直鎖状ペプチドＡｃ−Ｐｈｅ−[Ｏｒｎ−(δＮ−ＭｅＣｂｚ)]-Ｐｒｏ-ｄＣha−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−ＯＨを、NovabiochemのＢｏｃ−Ｌ-Ａｒｇ(tosyl)Ｐａｍ樹脂(０.４１ mmol/g)上で、ＨＢＴＵ／ＤＩＥＡ活性化およびイン・シチュでの中和を用いるＢｏｃ化学によって合成した。該樹脂の開裂および脱保護を、ＨＦ／ｐクレゾールで２時間該樹脂を処理することによって達成し、ジエチルエーテルによる沈殿後、粗製ペプチドを得た。環状化には、ＤＭＦ(２mL)中で、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製ペプチド(１００mg)、ＢＯＰ(２００mg)およびＤＩＥＡ(２２２μL)を４時間攪拌することが含まれる。該溶媒を真空で除去し、該環状ペプチドを、ｒｐＨＰＬＣによって精製した。Ｒt=１１.５分(３５％Ｂ). ＭＳ：[Ｍ＋Ｈ]⁺(計算値)＝９１０.５， [Ｍ＋Ｈ]⁺ (実測値)=９１０.５.

精製および特徴分析
粗製ペプチドを、Vydac C18 逆相カラム(２.２ x ２５cm)を用いる分取ｒｐＨＰＬＣを用いて精製した。溶媒Ａから溶媒Ｂの勾配（ｌｍＬ／分）を用い、２１４nmで追跡した。フラクションを回収し、正確な分子量についてイオンスプレイ質量分光法(ＩＳＭＳ)によって試験し、精製度をDelta-Pak PrepPak CIS 逆相カラム(０.８x１０ｃｍ)(勾配を変えて、例えば：０から７５％Ｂまで、６０分間以上)での分析用ｒｐ−ＨＰＬＣによってチェックした。アセトニトリルは、ＨＰＬＣグレード(ＢＤＨ Laboratories)であり、ＴＦＡは合成グレード(Auspep)であった。

表１は、環状化合物１-７０を製造するために用いた反応の例、特定の溶出条件下での電子スプレー質量分光法(Mass Spec Found)によるそれらの特徴分析および逆相ＨＰＬＣ(ｒｐ−ＨＰＬＣ)保持時間(Ｒt分間)を示す。

表２は、各々の化合物の構造を表し、ミエロペルオキシダーゼアッセイで測定し、ヒト多形核白血球(好中球)上のＣ５ａ受容体に対する各々の受容体結合親和性およびアンタゴニスト効力を列挙する。

表１：表２に記載した環状化合物の合成および特徴分析のまとめ

＊Ｔｙｒ−Ｏ−ベンジルは使用されたアミノ酸であったが、この産物は、ベンジル置換基を持つメタ−Ｃ−置換チロシン（参照：化合物７０の構造）への転位を包含した。

実施例２：環状化合物のアンタゴニスト活性
表２は、実施例１で合成した化合物の構造、さらにミエロペルオキシダーゼアッセイによって測定した場合、ヒト多形核白血球(好中球)上のＣ５ａ受容体についての各々の受容体結合親和性およびアンタゴニスト効力を示す。

化合物１−９、１６-１８、２０、２１、２３、２４、２７−３２、３６、３８、４４、５１および５９は、我々の先の特許出願ＰＣＴ／ＡＵ９８／００４９０に記載した一般構造の広い範囲内に存在する。しかし、表２は、実際、これらの化合物のうち、１−６、１７、２０、２８、３０、３６および４４のみが、ヒト好中球上のＣ５ａ受容体に対して、かなりアンタゴニスト効力(ＩＣ５０＜１μＭ)を持つということを示す。他の化合物７−９、１６、１８、２１、２３、２４、２７、２９、３２、３８、５１および５９は、全ての場合において、ＩＣ５０＞１μＭで、評価できるほどのアンタゴニスト効力および／または受容体親和性を示さない。

一方、化合物１０-１５、１９、２２、２５、２６、３３-３５、３７、３９−４３、４５，４７-５０、５２-５８および６０-７０は、ＰＣＴ／ＡＵ９８／００４９０の範囲には含まれないが、それらは、その明細書中に開示されているものと同一または類似の環状骨格（scaffold）を含む。表２は、これら新規化合物１０-１２、１４、１５、２５、３３、３５、４０、４５、４８、５２、５８、６０、６６および６８-７０は、相当なアンタゴニスト効力(ＩＣ５０＜１μＭ)を持つことを示す。しかし、他の化合物（１３、１９、２２、２６、３４、３７、３９、４１-４３、４７、４９、５０、５３-５７、６１−６５および６７)は、これら全ての場合において、ＩＣ５０＞１μＭで、評価できるほどのアンタゴニスト効力/または受容体親和性を示さない。

表２に示した結果から、我々は、サブマイクロモルのアンタゴニスト効力を得るため、または予想するために、Ｃ５ａ受容体アンタゴニスト活性について活性な薬種に対する制限をさらに明確にし、改良することが可能となった。

表２：ヒト多形核白血球に対するＣ５ａ受容体の環状アンタゴニスト７０の例についての構造および活性
Ｃ５ａＲアンタゴニストの例

「Ｃ５ａ結合ＩＣ５０」とは、ヒトＰＭＮに対して最大結合の５０％を達成するのに必要な化合物の濃度を言う。

「Ｃ５ａアンタゴニストＩＣ５０」とは、Ｃ５ａに刺激されたヒトＰＭＮから放出されるミエロペルオキシダーゼの５０％の拮抗を達成するのに必要な化合物濃度をいう。

枠内の領域が、構造間で相対的な変化の位置を示す。化合物Ｉは、我々の先の出願ＰＣＴ／ＡＵ９８／００４９０からのリード化合物であり、比較の目的のために含める。

実施例３:Ｃ５ａの環状アンタゴニスト
これらの環状アンタゴニストおよびそれら明白な受容体結合親和性およびアンタゴニスト効力のうちのいくつかの例を表３に示す。表３中、アミノ酸について１文字コードを使用する。「ｄ」は、アミノ酸の右旋性（dexto）（Ｄ）形態を示す。「ＮＤ」は、「測定されない（not determined）」を示す。

表３．Ｃ５ａアンタゴニストとしての新規化合物

Ｍｓ＝メシル、Ｔｓ＝トシル、ＭｅＳｕｃ＝メチルサクシネート、Ｓｕｃ＝サクシネート、Ａｈｘ＝６-アミノヘキサノエート、ＨＰｈｅ＝ホモフェニルアラニン、Ｐｈｇ＝フェニルグリシン、ＨＣ＝ヒドロシンナメート、ＮＤ＝実施せず

Ｈｙｐ＝trans−ヒドロキシプロリン、Ｔｈｐ＝cis−チオプロリン

Ａｉｃ−アミノインダンカルボン酸
Ｔｉｃ−テトラヒドロイソキノリン
ｄｈＣｈａ−Ｄ-ホモヘキシルアラニン

ｈＰｈｅ＝ホモフェニルアラニン、２Ｎａｌ＝２-ナフチルアラニン、１Ｎａ１＝１-ナフチルアラニン、Ｂｔａ＝ベンゾチエニルアラニン、Ｆｌｕ＝フルオレニルアラニン、Ｔｙｒ−Ｏ−アルキル＝チロシンのＯ-アルキル化アナログ、Ｔｉｃ＝テトラヒドロイソキノリン

Ｃａｎ＝Ｌ-カナバニン、Ｃｉｔ＝シトルリン、ｈＡｒｇ＝ホモアルギニン

ｌＮａｌ＝Ｌ-ナフチルアラニン、Ｄａｐ＝２’３-ジアミノプロピオン酸Ｄ-Ｐhe＝Ｄ-フェニルアラニン

実施例４：薬種の精製
表２の結果を基にして、我々は、下記のように、ヒト多形核白血球上のＣ５ａ受容体にの活性なアンタゴニズムのための、精巧な薬物を開発することができる:
位置「Ａ」は、活性に対する悪影響がなく、Ｈ（例えば、化合物１７、１８)、アルキル、アリール、ＮＨ２、ＮＨアルキル、Ｎ(アルキル)２、ＮＨアリール、ＮＨアシル(例えば、化合物１、３、４、５、６)、ＮＨベンゾイル(例えば、化合物２)、ＯＨ、Ｏアルキル、Ｏアリール、ＮＨＳＯ２アルキル(例えば、化合物１０)、ＮＨＳＯ２アリール(例えば、化合物１１)を含む非常に多くの基を許容できる。

「Ａ」位置での置換に対する広い許容は、環状ペプチド骨格への付加物に対する受容体中に十分なスペースが存在することを示す。そのため、この位置は、アンタゴニストの水および脂質溶解性を変えるために置換基を付加し、それによりアンタゴニストの経口または経皮吸収を増強するために使用し得る。また、この位置は、標識、例えば蛍光タグ、アゴニストまたは標的細胞に対して高い親和性を示すポリペプチド配列、例えばＣ５ａのアミノ酸１−６９と類似する配列への結合を可能にする。

位置「Ｂ」は、アルキル、アリール、フェニル、ベンジル、ナフチルまたはインドール、またはＤ-またはＬ-アミノ酸の側鎖、例えば、Ｌ-フェニルアラニン(化合物１)またはＬ-フェニルグリシン(化合物１２)であり得る。それは、Ｄ-フェニルアラニン(化合物８)、Ｌ-ホモフェニルアラニン(化合物７)、Ｌ-チロシン(化合物９)、Ｌ-ホモチロシン、グリシン(化合物１３)、Ｌ-トリプトファン(化合物１６)またはＬ-ホモトリプトファンの側鎖でない。

位置「Ｂ」は、置換基に関して広い範囲を許容しない。Ｌ-フェニルアラニンのベンジル基が、多くの置換を許容できず、かさ高くせしめ得ないことがわかった。この位置は、ＩＣ５０により測定されるように、修飾に対する最も高い効果が受容体親和性に対するものであるため、アンタゴニズム自体に対して重要であるというよりもむしろ受容体結合のために必要であると思われる。

位置「Ｃ」は、小さな置換基、例えば、Ｄ-またはＬ-アミノ酸、例えばプロリン(化合物１)、Ｌ-バリン(化合物２０)、アラニン、trans-ヒドロキシプロリン(化合物２５)またはcis-チオプロリン(化合物２６)の側鎖などである。かさ高い置換基、例えば、Ｌ-イソロイシン(化合物２１)、Ｄ-またはＬ-フェニルアラニン（化合物２２、２３)、Ｌ-シクロヘキシルアラニン(化合物２４)の側鎖などでない。

位置「Ｄ」は、かさ高い置換基、例えば、Ｄ-ロイシン(化合物３１)、Ｄ-ホモロイシン、Ｄ-シクロヘキシルアラニン(化合物１)、Ｄ-ホモシクロヘキシルアラニン（化合物２８）、バリン(化合物２９)、Ｄ-ノルロイシン(化合物３６)、Ｄ-ホモロイシン、Ｄ-フェニルアラニン(化合物３３)、Ｄ-テトラヒドロイソキノリン(化合物３５)、Ｄ-グルタミン(化合物３７)、Ｄ-グルタメート(化合物３８)またはＤ-チロシン(化合物４０)などのＤアミノ酸の側鎖である。小さな置換基は、グリシン、Ｄ-アラニン(化合物３０)などの側鎖、Ｄ-トリプトファン(化合物３２)の様なかさ高い平面の側鎖、Ｄ-アルギニン(化合物３９)またはＤ-リジン(化合物４３)の様なかさ高い荷電側鎖、またはＬ-シクロヘキシルアラニン(化合物２７)の様のＬ-アミノ酸の側鎖でない。骨格上の位置「Ｄ」で小さなＤ-アミノ酸、および小さなまたは大きなＬ-アミノ酸は、Ｃ５ａ受容体に対する親和性を大きく低下させる。

位置「Ｅ」は、Ｄ-トリプトファン(化合物５９)またはＬ-Ｎ−メチルトリプトファン(化合物４７)以外の、Ｌ-トリプトファン(化合物１)およびＬ-ホモトリプトファン；Ｌ-ホモフェニルアラニン(化合物６１)以外のＬ-フェニルアラニン（化合物６０)；Ｌ-２-ナフチル(化合物５３)以外のＬ-ナフチル(化合物５２)；Ｌ-３-ベンゾチエニルアラニン(化合物５８)、のかさ高い側鎖の中から選択される。Ｌ-シクロヘキシルアラニン(化合物５０)、Ｄ-ロイシン(化合物５１)、Ｌ-フルオレニルアラニン(化合物５４)、グリシン(化合物５５)、Ｌ-テトラヒドロイソキノリン(化合物５６)またはＬ-ヒスチジン(化合物５７)の側鎖である。

環状ペプチド骨格上の位置「Ｅ」での置換基は、Ｃ５ａ受容体のアンタゴニズムにとって非常に重要である。この位置での置換基は、通常、アゴニスト応答と関連した配座の変化を制限し得る。これは、受容体中のアンタゴニストを固定し、アンタゴニズムに必要な、受容体中の配座再編成を防ぐ「ブロッキング」残基でもある。

位置「Ｆ」は、Ｌ-アルギニン(化合物１)、Ｌ-ホモアルギニン(化合物４４)、Ｌ−シトルリン(化合物４５)；またはＬ-カナビニン(化合物４８)の側鎖であり得る。Ｄ-またはＬ-リジン(化合物４７)、Ｄ-またはＬ-ホモリジン、またはグリシン(化合物４９)でない。この位置での置換基のサイズは、高い受容体親和性を与えるのに重要である。シトルリン化合物は、荷電側鎖を持たないが、この位置でのアルギニンと比べて、評価できるアンタゴニスト効力を持つ。

位置「Ｘ」は、−（ＣＨ_２）ｎＮＨ−または−(ＣＨ_２)ｎ−Ｓ−（式中、ｎは、１〜４の整数であって、好ましくは２または３である）、−（ＣＨ_２）_２Ｏ−、（ＣＨ_２）_３Ｏ−、−(ＣＨ_２)_３−、−（ＣＨ_２）_４−、−ＣＨ_２ＣＯＣＨＲＮＨ−または−ＣＨ_２-ＮＨＣＯＣＨＲＮＨ−（式中、Ｒは、全ての普通のまたは稀なＬ-またはＤ-アミノ酸の側鎖である）であり得る。この群は、例えば、化合物１のＡｒｇとＰｈｅ残基間の環状化リンクを与え、環状骨格の構造に影響する。さらに、置換基、例えば、このリンカー上のＲなどは、場合により受容体残基と相互作用し、アンタゴニストの親和性を増強し得る。

オルニチンのδ窒素のＮ−メチル化は、アンタゴニストの効力に対して事実上全く影響はないが、その環のアミノ酸化合物の成分のＮ−メチル化は、化合物(例えば、６４、６５)の受容体結合親和性およびアンタゴニスト効力を低下させる傾向がある。

骨格に対する多重変化は、化合物１と比較してアンタゴニスト効力の増加を得るためには不利益であり得る。すなわち、Ｌ-Ｐheは、アンタゴニスト効力において変化はほとんどなく、化合物１においてＬ-Ｔrpに対する適切な置換(例えば、６０)であったが、化合物１への変化の組み合わせ、例えばＴｒｐの代わりにＬ-Ｐhe、Ａｒｇの代わりにＬ-ホモＰｈｅ(例えば、６７)、またはＡｒｇの代わりにｐ−クロロ-フェニルアラニン(例えば、６８)は、受容体に対する親和性の低下およびアンタゴニスト効力の低下を導いた。同様に、化合物１において、Ｌ-ＴrpをＬ-Ｐheに置換し、またＤ-ＣhaもＤ-Ｐheに置換した場合、該化合物は、実質的な効力(例えば、６２)を失った。化合物１におけるＤ-ＣhaからＤ-Ｐheへの変化は、アンタゴニスト効力(例えば、３３)を維持させる一方で、この変化は、Ｌ-Ｐhe(６２)によるＬ-Ｔrpへの置換と対になった場合に不利益である。

いずれか１つの変化（例えば、３３、６０）は、変化が一緒になされた場合(例えば、６２)よりも、実質的に高い効力が生じるため、これらの残基の受容体への結合の際に共同性が存在するのは明白である。Ａｒｇを、荷電したアミンを含んだままである芳香族基に置換した場合(６９)、６０のＰｈｅを置換したチロシン(７０）に置換した場合にみられるように、活性の顕著な低下がおきた。

このような変化は、全て、ヒトＰＭＮＣ５ａ受容体に対する親和性とアンタゴニスト効力を発生させるために、使用した環状骨格に対して何が許容となり得るか、なり得ないかについて示すものである。他のタイプの細胞上のＣ５ａ受容体は、側鎖について異なった許容を持つかもしれないが、環状骨格は活性化合物の基本構造をとったままであることが判った。

実施例５：ラットにおける逆受動アルサス反応
逆受動腹膜アルサス反応を、先に記載したように (Strachan et al., 2000) 誘導し、一群のラットを、抗体の腹膜への沈着（注入）前に経口胃管栄養法(10 mgkg^-1は、200Lの最終体積に対して１０％エタノール/９０％食塩溶液中で溶解される)によってＡｃＦ-[ＯＰｄＣｈａＷＲ]（１）で前処理するか、または抗体注入の３０分前に適当な経口ビヒクル対照で前処理した。雌ウィスターラット(１５０-２５０g)を、ケタミン(８０mg kg^-1 i.p.)およびキシラジン(12mg kg^-1 i.p.)で麻酔した。

ラットの側部表面を、注意深く剃り、各々側部表面上で５つの異なる部分を明確に線で区分けした。逆受動アルサス反応を、抗体注射１０分前に、経口静脈に、エバンスブルー(１５mg kg^-１ i.v.)、トリオボアルブミン(２０mg kg^-1 i.v.)を注射することによって、各皮膚部位に誘導した。ウサギ抗-トリオボアルブミン(生理食塩水単独、最注射容量３０μLで、１００、２００、３００または４００μｇ抗体)を、ラットの各側表面上の２つの別々の皮膚部分に２回注射し、ラットあたり全１０注射部を与えた。ラットを、加熱パッド上におき、血液試料を定期的に採取し、麻酔を４時間処理中維持した。血液を氷上で自然凝固させ、血清試料を採取し、−２０℃で保存した。皮膚アルサス反応の誘導４時間後、麻酔したラットを安楽死させ、１０mm^２面積の皮膚を、アルサス反応の各部位から採取した。皮膚試料を、ヘマトキシリンおよびエオシン染色を用いて組織分析の少なくとも１０日間前に１０％の緩衝ホルマリン中で保存した。さらに、皮膚試料の第２番目のセットを、ホルムアミド（１mL）中に一晩おき、皮膚中への血清の滲出の指標として、エバンスブルー抽出物の吸収を６５０nmで測定した。図１は、皮膚パンチ抽出物、次いで部位あたり０−４００μｇでのウサギ抗チキンオボアルブミンの皮膚内注射、次いでＡｃＦ-[ＯＰｄＣｈａＷＲ]による静脈的、経口的または局所的な前処理を示す。データは、血漿吸収の６５０nmでの吸収％を、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３−６）として示す。＊は平均値±ＳＥＭ(ｎ＝３-６)としてアルサス反応対照の値と比較した時、Ｐ値＜０.０５を示す。

ラットを、静脈的に（１０％エタノールを含有する生理食塩水(２００Ｌ)中０.３-１mg kg^-1、皮膚アルサス反応の開始１０分前）、経口的に（経口胃管栄養(法)により１０％エタノールを含有する生理食塩水(２００μL)中０.３-１０mg kg^-1、開始３０分前）、または局所的に(部位あたり２００-４００μg、皮膚アルサス反応の開始１０分前)のいずれかにより、Ｃ５ａＲアンタゴニスト、ＴＦＡ塩としてＡｃＦ-[ＯＰｄＣｈａＷＲ]（１）、または適当なビヒクルを用いて前処理した。アンタゴニストの局所適用には、１０％ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)中の１０-２０mg mＬ^-1溶液（２０μｌ）の適用、すなわちアルサス反応の誘導１０分前に各部位の皮膚上に直接塗布することを含む。

エバンスブルー単独で処理したラットからの生理食塩水単独の注射部位を抗原対照として扱い、エバンスブルー＋局所ＤＭＳＯ単独で処理したラットからの生理食塩水注射部位をビヒクル対照として扱い、エバンスブルー＋、静脈、経口または局所的なアンタゴニスト単独で処理したラットからの生理食塩水単独の注射部位をアンタゴニスト対照として扱い、エバンスブルー＋皮膚のラビット抗チキンオボアルブミンを抗体対照として扱う。単離したヒトＰＭＮにおいて＞１ｍＭのＩＣ_５０結合親和性を持つ以外、ＡｃＦ-[ＯＰｄＣｈａＷＲ]（１）の組成と類似した化学組成および溶解性を持つペプチドＡｃＦ−[ＯＰＧＷＲ]の局所適用を、不活性ペプチド対照として扱う。ＡｃＦ−[ＯＰＧＷＲ]を、１０％のＤＭＳＯに溶解し、アルサス反応の開始１０分前に部位あたり４００μgを局所的に適用した。

ＴＮＦα測定
血清ＴＮＦα濃度を、酵素結合免疫吸着剤アッセイ(ＥＬＩＳＡ)キットを用いて測定した。使用した抗体対は、ビオチン化したネズミ抗ラットＴＮＦα抗体と対にしたウサギ抗ラットＴＮＦα抗体であった。図２は、静脈的に、経口的にまたは局所的に、ＡｃＦ-[ＯＰｄＣｈａＷＲ]で前処理したラット群を用いて、皮膚アルサス反応の開始後の規則的な時間間隔での血清ＴＮＦα濃度を示す。データを、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３−６）として示す。＊はアルサス反応の対照値と比較した時、＜０.０５のＰ値を示す。

インターロキン-６の測定
前記のＥＬＩＳＡ方法を用いて、血清および腹膜洗浄液のインターロイキン６(ＩＬ−６)濃度を測定するのに使用した(Strachan et al., 2000)。

病理学評価
ラット皮膚試料を、少なくとも１０日間、１０％緩衝ホルマリンで固定し、標準的な組織技術を用いてヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。皮膚試料を、病理学に関する証拠として盲検法で分析し、ラットＰＭＮ浸潤の程度を０−４のスケールで評価した。皮膚アルサス反応の開始により、間質性好中球を増加させ、下記の方法で定量した。異常性を検出しなかった場合には、断片に０のスコアーをつけた。１のスコアーは、管腔外の炎症細胞の移動は示さないが、血管中で増加したＰＭＮの出現を示した。２および３のスコアーは、間質性組織中のＰＭＮ数の増加および血管周辺の炎症細胞のより顕著な蓄積の様相を示した。最大スコアーの４は重篤な病理学的異常を示すが、皮膚断片中に存在し、組織中へのＰＭＮの過剰な浸潤および血管から離れるこれらの細胞の移動を示した。図３は、抗体の量の増加させつつ皮膚内注射をすると、皮膚試料(Ａ)によって数値化された病理指標における用量応答性の増加を導くことを示す。ＡｃＦ-[ＯＰｄＣｈａＷＲ]で、静脈的(Ｂ)(ｎ＝３)、経口的(Ｃ)(ｎ＝３)および局所的(Ｄ)(ｎ＝３)に前処理したラットにおいて、生理食塩水または部位あたり４００μg抗体(ｎ＝５）を用いて皮内注射した皮膚試料についてのデータを示す。データを、平均値ＳＥＭ±ＳＥＭとして示した。＊は、非パラメーターｔ試験を用いるアルサス反応値と比較した時、Ｐ＜０.０５である。

実施例６：ラットにおける腸管の虚血再潅流損傷モデルに対するＣ５αアンタゴニストの効果
雌ウィスターラット(２５０-３００g, ｎ＝１３２)を飢餓状態にし、全ての実験１２時間前から水のみを与える。動物をケタミン(８０mg/kg)およびキシラジン(１０mg/kg)を腹膜内注射により麻酔し、ラットを加熱パッド上におき、通常の体温を維持した。腹部を、中線の切開部から開腹し、上部腸間膜動脈(ＳＭＡ)を暴露した。動脈に対する非外傷性の閉塞装置を、ポリエチレンチューブの長さが通るループ状の絹の縫合線からつくった。ＳＭＡを、ループの末端へ引張り閉塞した。ポリエチレンカテーテルを、大腿部血管に挿入し、５％エタノールＡｃＦ-[ＯＰｄＣｈａＷＲ](１)１mg/kgまたは無菌の発熱物質を含まない生理食塩水を、０.２ml容量で点滴を行った。点滴を、２分間にわたって行なった。ＡｃＦ-[ＯＰｄＣｈａＷＲ](１)(０.３、１、ｌ０mg/kg)の経口用量を、ＳＭＡ閉塞６０分前に、胃管栄養(法)(２５％エタノール中、０.２mlの生理食塩水)によって達成した。腸の虚血を、３０分間ＳＭＡをクランプによって誘導し、その後に閉塞縫糸を除去し、次いで再灌流を、さらに１２０分間追跡した。シャム手術したラットを、血管閉塞を省略して同じ様式で処理し、無菌、発熱物質を含まない生理食塩水(０.２ml)を用いて注入するか、または２５％エタノール中生理食塩水（０.２ml）を用いて胃管栄養法を行った。血液試料(５０μｌ)を、ＰＭＮ数の推計のための実験の１８０分にわたって、規則的な時間間隔でヘパリン化したエッペンドルフチューブに採取した。種々一連の同一実験において、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、ハプトグロビン(Ｈｐ)およびアスパルテート・アミノトランスフェラーゼ(ＡＳＴ)濃度を後の測定のために、全血液を１８０分間にわたって規則的な時間間隔で採取し、氷上で凝固させ、血清または血清試料を採取し、−２０℃で保存した。１２０分の再灌流の終点で、この動物を、ペントバルビタールの過量を用いて安楽死させた。閉塞した回腸の断片を取出し、管腔を生理食塩水で洗浄し、腸を拭いて乾かして秤量した。試験片を、オーブン内で２４時間、８０℃で乾燥させ、組織の乾燥重量を得た。腸浮腫を、湿潤および乾燥組織重量の比を評価することにより測定した。さらに、虚血および正常の腸の両切片を採取し、生理食塩水で洗浄し、すぐに組織試験のために１０％緩衝ホルムアルデヒド生理食塩水で固定した。

図４は、小腸の湿潤対乾燥重量の比が、シャム手術した動物に比べて虚血-再潅流後に有意に増加することを示す。Ｃ５ａ受容体アンタゴニストＡｃＦ-[ＯＰｄＣｈａＷＲ]，１mg/kg i.v.および１０mg/kg p.o.の処理により、非処理の虚血-再潅流(Ｉ／Ｒ)動物と比べて有意に組織浮腫が低下した。データは、平均値±ＳＥＭ(各グループでｎ＝４-６)として示す。＊、Ｐ＜０.０５、対シャム手術した動物。＋、Ｐ＜０.０５、対Ｉ／Ｒ動物。

好中球アッセイ
ＰＭＷ計測のために血液(５０μｌ）を、ヘパリン処理チューブ中に入れ、次いで等量のhistopaque 1083 (Sia, U. S. A.)を重層し、ＰＮＦαを単離し、細胞数をヘマトメーター上で計測した。ＰＭＮ値の濃度は、ＳＭＡ閉塞の直前に得られた値の平均％±ＳＥＭ値として示す。

図５は、消化管の虚血-再潅流により、シャム手術した動物(Ａ、Ｂ)と比較して循環ＰＭＮ濃度において顕著な低下することを示す。

Ｃ５ａ受容体アンタゴニストＡｃＦ-[ＯＰｄＣｈａＷＲ]１mg/kgのi.v.（Ａ）および１０mg/kgのp.o.（Ｂ）を用いるラットの前処理は、虚血-再潅流により誘導される好中球を有意に阻害することを示す。１mg/kg p.o（Ｂ）の処理動物は、好中球の阻害を示さなかった。データは、平均±ＳＥＭ（各グループ、ｎ＝６)として示す。＊は、Ｐ＜０.０５ 対対照動物である。棒線は虚血の３０分間を示す。

腫瘍壊死因子α測定
血清ＴＮＦ−α濃度を、酵素標識免疫吸着測定法(OptEIA, Pharmingen, USA)を用いて、製造業者の指示書に従い測定した。血清試料中のＴＮＦ−αの濃度を、標準曲線からの線形回帰分析によって測定した。

図６は、消化管虚血-再潅流により、シャム手術した動物と比較すると血清ＴＮＦ−αにおいて顕著な増加をすることを示す。Ｃ５ａ受容体アンタゴニストＡｃＦ-[ＯＰｄＣｈａＷＲ] １mg/kg i.v.および１-１０mg/kg p.o.により、ラットを前処理すると、血清のＴＮＦαレベルの変化を完全に阻害した。データは、平均±ＳＥＭ(各グループ、ｎ＝６）として示す。＊、Ｐ＜０.０５ 対シャム手術した動物。直線は、虚血３０分間を示す。

ハプトグロビンアッセイ
血清Ｈｐを、Ｈｐアッセイキット(Tridelta. Development Ltd. U. K)を用いて、製造業者の指示書に従い、測定した。血清試料中のＨｐ濃度を、標準曲線からの線形回帰分析によって測定した。

図７は、消化管虚血-再潅流により、シャム手術した動物に比べて血清ハプトグロビンが有意に増加することを示す。Ｃ５ａ受容体アンタゴニストＡｃＦ-[ＯＰｄＣｈａＷＲ] １mg/kg i.v.および１、１０mg/kg p.o.により前処理したラットは、血清ハプトグロビンレベルにおける増加を有意に阻害した。データは、平均値±ＳＥＭ(各グループ、ｎ＝４−６）を示す。＊、Ｐ＜０.０５ 対シャム手術した動物。＋、Ｐ＜０.０５ 対Ｉ／Ｒ動物。

アスパルテート・アミノトランスフェラーゼ アッセイ
血漿ＡＳＴ(ＡＳＴ／ＧＯＴ;Sigma, USA)濃度を、血清を採取して、製造業者の指示書に従い、４８時間以内に測定した。血漿ＡＳＴ濃度を、較正曲線から導いた。結果を、Sigma-Franke(SF) units/mlで表現する。

図８は、消化管虚血-再潅流により、シャム手術した動物と比べて、血漿アスパルテート・アミノトランスフェラーゼが有意に増加することを示す。Ｃ５ａ受容体アンタゴニストＡｃＦ-[ＯＰｄＣｈａＷＲ] １mg/kg i.v.および１、１０mg/kgによる処理により、非処理Ｉ／Ｒ 動物と比べて、消化管虚血-再潅流誘導性アスパルテート・アミノトランスフェラーゼが有意に低下した。データは、平均±ＳＥＭ（各グループ、ｎ＝６)として示す。＊、Ｐ＜０.０５ 対シャム手術した動物。＋、Ｐ＜０.０５ 対Ｉ／Ｒ 動物。

組織病理学
試験片を、１０％ホルムアルデヒド-生理食塩水で固定し、パラフィンワックス中に埋込み、連続切断し（薄切片にする）、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。組織を、盲検法に経験豊富な観察者が、判断し、記録した。腸組織損傷の程度を、前記等級の０−８からのスケール範囲を用いて定量した(Chiu et al., 1970)。

図９により、消化管虚血-再潅流が、シャム手術した動物と比べて腸への顕著なダメージを生ずることを示す。Ｃ５ａ受容体アンタゴニストＡｃＦ-[ＯＰｄＣｈａＷＲ]の１mg/kg i.vおよび１、１０mg/kgによる処理により、非処理Ｉ／Ｒ動物と比べて、消化管虚血-再潅流誘導組織損傷が有意に低下した。データは、平均±ＳＥＭ(各グループ、ｎ＝６)として示す。＊、Ｐ＜０.０５ 対Ｉ／Ｒ動物。

実施例７：ラットの一関節(Monoarticular)抗原で誘導された関節炎
雌ウィスターラット(１５０-２５０g)を、the Central Animal Breeding House, University of Queenslandから得た。メチル化したウシ血清アルブミン(ｍＢＳＡ)(０-５mg)を、フロイントの完全アジュバンド（０.５mg)に溶解し、超音波処理し、均質な懸濁液を生成した。各ラットに、１日目と７日目に、この懸濁液(０.５mL)の皮下注射で投与した。１２-２８日間、ラットを別々のケージに分け、体重および食事および水の接種を毎日追跡した。ラットは、通常水道水またはＡｃＦ-[ＯＰｄＣｈａＷＲ](１)を含有する飲料水のいずれかを投与した。体重と水の摂取を、毎日追跡し、ラットにＣ５ａＲアンタゴニストＡｃＦ-[ＯＰｄＣｈａＷＲ](１)（１mg/kg/day）の１日用量を、試験の１２−２８日間投与した。１４日目に、ラットを麻酔し、後肢の毛を刈った。各ラットは、左ひざにはｍＢＳＡ(Ｏ.５mg)、右ひざには生理食塩水の関節内（intra-articular）注射(１００μl)を投与した。通常の飲料水を投与したラット由来の生理食塩水単独投与のひざを、生理食塩水対照として用い、飲料水中にＡｃＦ-[ＯＰｄＣｈａＷＲ](１)を投与したラット由来の生理食塩水単独投与のひざを、アンタゴニスト対照として用いる。

ラットを、２８日目に安楽死させ、全血を、エッペンドルフチューブ中に採取し、氷上で凝固させた。血液試料を遠心分離(１１,０００ rpmx３分間)し、血清を採取し、ＥＬＩＳＡを用いる血清サイトカインの分析まで−２０℃で保存した。各ひざの莢膜（capsule）を、生理食塩水(１００μｌ)で洗浄し、全細胞計測を、ヘマトメーターを用いて測定した。さらに、ひざの関節洗浄液のアリコートを、スライドガラス上に滴加し、空気乾燥に供した。乾燥させてから、細胞を、示差(diffrerntial)染色(Diff Quick)で染色し、示差細胞計測を、４０ｘ乾燥レンズの顕微鏡を用いて行った。残っている各関節からの洗浄液を、ＥＬＩＳＡを用いて関節内のサイトカインレベルに関する後の分析まで−２０℃で保存した。各ひざの関節を取出し、皮膚を外科用メスにより剥がし、固定した。ひざの試料を、１０％の緩衝ホルマリンで、１０日間保存した。次いで、ひざを、蒸留水で洗浄し、脱石灰化のためにＥＤＴＡ溶液の飽和溶液に２１日間おき、パラフィンワックス中に埋込んだ。

ひざ組織試料を、実施例６で上記のような標準的組織学的技術を用いて作成し、ヘマトキシリンとエオシン染色により染色した。組織スライドを、盲検法で分析した。組織断片を、滑液の細胞増殖、炎症細胞浸潤、軟骨破壊および出血の発生増加に伴ってスコアーを増加させて、異常なしのスコアー０を持つスコアー０から４で評価した。試料中には、どの試料においても、顕著な骨腐食の兆候はなかった。血清および滑液の試料を、ＴＮＦαおよびＩＬ−６レベルについてＥＬＩＳＡ分析日に解凍した。濃度は、前記実施例６で記載したようにＥＬＩＳＡを用いて標準曲線から測定した。

図１０が、−２から＋１４日目に経口的投与したＡｃＦ-[ＯＰｄＣｈａＷＲ]により関節炎右ひざ関節の膨れを阻害を示す一方、図１１は、関節洗浄液中の右ひざ関節ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６レベルの阻害を示す。非処理とは、ＡｃＦ-[ＯＰｄＣｈａＷＲ]で処理していないが、抗原感作により攻撃をうけた右ひざを持つ動物を示す。

実施例８：Ｃ５ａアンタゴニストの局所皮膚投与
本発明は、Ｃ５ａのアンタゴニストの局所投与が、補体システムの活性化を包含する局所炎症疾患の処置に用い得ることを教示する。本実施例において、我々は、Ｃ５ａアンタゴニストの局所適用により、全身性薬理作用、および循環中に薬理的な適切濃度のＣ５ａアンタゴニストの出現が生ずることを立証する。

環状アンタゴニストのin vivoの薬理特性を、下記局所皮膚投与を試験した。エンドトキシンのモデルを使用し、ここで、１mg/kg Escherichiacoli liposaccharide (LPS ;serotype 55:BS, Sigma, USA, stored at 100 mg/mL in dH₂O, 4℃)をラットにi.v注射して、循環中のＰＭＮレベルおよび血圧の急性変化を発生させる。

これらパラメーターを、Ｃ５ａＲアンタゴニスト(１mg/kg i.v または50mg/kg/ラット局所的)の存在下および非存在下で測定した。この研究は、全身性薬理活性が観察されたため、Ｃ５ａ受容体アンタゴニストの局所投与がこれら化合物の送達に関する有効な方法であることを示す。

２００-２５０g重量の雌ウィスターラットを、全てのＣ５ａ受容体アンタゴニストのin vivo試験に使用した。ラットを、上記方法を用いて麻酔し、加熱パッドに移し、体温が実験中維持するようにした。カテーテルを、大腿部静脈に挿入し、縫合して固定し、ヘパリン化した生理食塩水（１００μL）で洗浄した。アンタゴニストまたはビヒクルのいずれかをラットに投与した。静脈注射(１０％エタノールを含有する生理食塩水２００μL中１mg/kg、ＬＰＳ攻撃の１０分前)または局所的に(５０％ジメチルスルホキシド/Ｈ_２Ｏ中、部位あたりｌ０mg、攻撃の完了６０分前)で、ラットを、ＬＰＳ(生理食塩水(１００μL)中 ２μg kg^-1 i.v)、組換え体ヒトＣ５ａ(１００μL中２μgkg^-1)、ビヒクル対照のいずれかを用いて、アンタゴニストまたはビヒクル対照の、i.v 投与１０分後または局所投与の６０分後に、大腿部のカテーテルからi.v注入した。全ての薬剤を、２分間にわたってi.vで注射し、その後生理食塩水（１００μL）の注入により、薬物の送達を完全にした。

全血液試料(０.１mL)を、薬物およびＬＰＳまたはＣ５ａ投与時に尾静脈から採取した。試料を、ＬＰＳ(０時)の注射に対して-１５、０、５、１０、１５、３０、６０、９０、１２０および１５０分で採取し、ヘパリン含有チューブ中に(５００Units/mL)入れた。ＰＭＮを単離し、血液(１００μL)をHistopaque 1077 (Sigma U. S. A.)溶液(２００μL)上に重層し、４００xg、室温(２５℃)、３０分間で遠心分離した。血小板を多く含む血漿の上清層、単核白血球およびリンパ球の境界面およびHistopaqueの分離層を除去し、廃棄し、ＰＭＮおよび赤血球細胞を多く含む層を残す。冷蒸留水(４℃)（９mL)を、残存ペレットに残し、４０秒間振とうし、赤血液細胞を溶解させた。ダルベッコ・リン酸緩衝食塩水(１０x濃度)を添加し、等張に戻した。次いで、細胞を、４００xg、１５分間、１０℃で遠心分離した。得られる上清を廃棄し、ＰＭＮのペレットを残した。ＰＭＮを、さらに生理食塩水(９mL)で洗浄し、再度４００xg、１０分間、１０℃で遠心分離した。得られる上清をもう一度廃棄し、残存ペレットを、生理食塩水と混合ウェル(１００μL)に再懸濁した。ＰＭＮの数を、血球計上で計測した。各時点での細胞数を、攻撃完了前またはＬＰＳの前の０時点での全細胞数の％として計測した。

この研究のために選択した雌ウィスターラットを、下記処理群に分割する：
（ａ）ＬＰＳ単独、この１００μｌ中、５％エタノール（−１５分）＋１mg/kgＬＰＳ（０分）を入れた；
（ｂ）エタノール対照、この１００μL中、５％エタノール（−１５分）を入れ、ラットで測定したパラメーターに対するエタノールの影響を試験した；
（ｃ）アンタゴニスト対照、環状アンタゴニスト（１mg/kg）を−１５分時でi.vにより入れた；
（ｄ）i.v アンタゴニスト＋ＬＰＳ、環状アンタゴニスト(-１５分) (１mg/kg)およびＬＰＳ(０分)(１mg/kg)を入れる；そして、
（ｅ）局所適用したアンタゴニスト＋ＬＰＳ、アンタゴニスト(１０mg／ラット)を、ラットの腹部上に塗布し、次いで０分時でのＬＰＳをi.v.注入した。

ラットの皮膚に適用用量(５０mg/kg)でＣ５ａアンタゴニスト、例えば３Ｄ５３(ＰＭＸ５３)の投与により、循環中の血漿において薬理的に顕著なレベルの薬物が検出された。種々の溶媒、例えば、ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)、プロピレングリコール(ＰＧ)および水中に溶解して薬物を適用すると、様々な組み合わせにおいて、図１２に示したように薬学的に適切な循環中の薬物濃度の出現を導く。これは、ＤＭＳＯ／蒸留Ｈ_２Ｏまたはプロピレングリコール(ＰＧ)/Ｈ_２Ｏ中３Ｄ５３を皮膚適用することにより、１５分以内で循環している血漿中にＣ５ａアンタゴニストが出現し、有意なレベルが少なくとも４時間持続することを示す。

実施例９：Ｃ５ａアンタゴニストの皮膚適用後の全身効果
実施例８に記載のように、動物の皮膚へのＣ５ａアンタゴニストの局所適用は、循環中の薬物の薬理的に適切なレベルを生む。これらのレベルが全身性活性を持つことを示すために、i.v. 投与したＣ５ａの中性親和性効果を阻害するＣ５ａアンタゴニストのこれらの循環レベルの能力を測定した。

５０％プロピレングリコールおよび５０％蒸留Ｈ_２Ｏ中、Ｃ５ａ受容体アンタゴニスト３Ｄ５３(１０mg/per rat)を投与した。組成物を、３０分間腹部皮膚（４x８cm²）上に均一に塗布し、次いで、Ｃ５ａを、生理食塩水溶液中(２００μL)、２μg/kg用量で、i.v.投与した。血液試料を、各時点：−３０(薬物投与前)、０(Ｃ５ａの注射前)および５、１５、３０、６０および１２０分、循環しているＰＭＮを測定するために取り出した。
図１３に示したように、化合物３Ｄ５３の局所投与は、実際のＣ５aの中性親和性効果を防げた。

実施例１０：ＬＰＳの全身性効果を阻害するＣ５ａアンタゴニストの局所投与
Ｃ５ａアンタゴニスト、３Ｄ５３(化合物１)、さらに化合物１７および化合物４５を、５０％ＤＭＳＯ／５０％Ｈ_２Ｏ中で１０mg/ラット用量で、上記と同様に局所適用した。
ＬＰＳを、アンタゴニストの皮膚適用６０分後、１mg/kgでi.v.注射した。循環するＰＭＮレベルを、ＬＰＳ注射後１５０分間追跡し、ＬＰＳを注射した時の０時間からのＰＭＮレベルの％変化を計算した。この結果は、図１４に示したが、局所的に適用した各Ｃ５ａアンタゴニストがi.v.ＬＰＳに対する好中球の反応を阻害し、その阻害はこの薬物のi.v.投与後に観察される阻害に匹敵し得るということを示す。

実施例１１：虚血-再潅流損傷に対するＣ５ａアンタゴニストの効果
下肢虚血-再潅流(Ｉ／Ｒ)損傷は、腹部動脈瘤の外科修復の後、さらに外傷圧縮損傷(korrigan and Stotland, 1993)後の深刻な問題である。骨格筋肉組織の虚血および続く再潅流は、作用を受けた筋肉における炎症応答、さらに他の組織における損傷誘導を刺激する(Gute et al,1998)。肢虚血の重篤な症例において、発生する再潅流は、高い死亡率と関連し、多機能臓器不全を起こす(Defraigne andPincemail, 1997)。ラットでの、下肢虚血-再潅流(Ｉ／Ｒ)の後の、局所的で離れた臓器損傷の様々なパラメーターを阻害する強力なＣ５ａ受容体アンタゴニストの能力を調査するために、ラット後肢を、２時間虚血に供し、４時間再潅流した。この止血帯ショックモデルは、下肢Ｉ／Ｒ損傷のモデルとして広く用いられている。

ラットを、２時間両側後肢の虚血および４時間の再潅流に供した。薬物処理ラットに、i.v.で虚血１０分前または再潅流の１０分前に、または経口で(１０mg/kg)虚血３０分前にＡｃＦ-[ＯＰｄＣｈａＷＲ](１mg/kg)を与えた。循環クレアチンキナーゼ(ＣＫ)、ラクテートデヒドロゲナーゼ(ＬＤＨ)、アラニンおよびアスパルテート・アミノトランスフェラーゼ(ＡＬＴ／ＡＳＴ)、クレアチニン、血液尿素窒素(ＢＵＮ)、多形核白血球(ＰＭＮ)およびカルシウム(Ｃａ^＋＋)およびカリウム(Ｋ^＋)イオンのレベルを測定した。この生物学的指標は、Ｉ／Ｒ事象の後に組織または臓器損傷を反映することが知られている。

測定したその他のパラメーターには、尿タンパク質レベル、肺、肝臓および筋肉における筋肉浮腫およびミエロペルオキシダーゼ(ＭＰＯ）濃度、肝臓懸濁液のＴＮＦ−α濃度も含まれる。シャム手術した動物と比べてこれらマーカーのいずれにおいても顕著な変化は、全く観察されず、薬物単独では、これらマーカーにおける変化によって判定されるような悪影響がないことを示す。肢Ｉ／Ｒ損傷は、ＣＫ、ＬＤＨ、ＡＬＴ、ＡＳＴ、クレアチニン、ＢＵＮ、タンパク尿、ＰＭＮ、血清Ｋ^＋、筋肉浮腫、臓器ＭＰＯおよび肝臓懸濁液のＴＮＦ−α濃度が有意に増加するが、血清Ｃａ^＋＋濃度が有意に低下することによって特徴づけられる。ラットをＡｃＦ-[ＯＰｄＣｈａＷＲ]で処理した場合、これら全てのパラメーターが有意に改善した。

この試験を、the National Health & Medical Research Council of Australiaのガイドライン、およびthe University of Queensland Animal Ethics Committee承認の実験プロトコールに従って行った。２５０-３００gの体重の雌ウィスターラットを、一晩絶食させ、i.p.注射で、キシラジン（６mg/kg）およびケタミン（１２０mg/kg）を用いて麻酔した。麻酔を、ケタミンの追加注射により試験中維持した。ラットを、加熱パッド上におき、通常の体温を維持し、ポリエチレンカテーテルを、Ｃ５ａアンタゴニストまたは７％エタノール/生理食塩水を注入するために右側の頚静脈に挿入した。次いで、両側の後肢虚血を、各後肢の大きな転子の上部にラテックスのＯリング(marking rings; Hayes Veterinary Supplies, Brisbane, Australia)を適用することにより誘導した。虚血２時間後、ラテックスリングを、切断し、除去し、肢体を４時間の再潅流に供した。６つの実験群を用いた：(ａ）シャム手術したもの、(ｂ）虚血単独、（ｃ）Ｉ／Ｒ単独、(ｄ）虚血１０分前に投与したＩ／Ｒ＋Ｃ５ａアンタゴニスト(１mg/kg, i.v.)、（ｅ）虚血３０分前に投与したＩ／Ｒ＋Ｃ５ａアンタゴニスト(１０mg/kg, p.o.)および（ｆ）再潅流１０分前に投与したＩ／Ｒ＋Ｃ５ａアンタゴニスト(１mg/kg, i.v.)。

シャム手術した動物は、虚血または再潅流のいずれも進行しなかった、そして虚血単独の動物を、その後の再潅流をせずに２時間止血帯を適用させた。その他の全ての群には、２時間の虚血、４時間の再潅流を行った。シャム手術処理群、虚血単独群およびＩ／Ｒ群を、虚血１０分前に薬物の代わりに７％エタノール/生理食塩水を注入した。試験中、血液を、尾静脈から採取し、血清または血漿を、後の生物学的アッセイのために４℃または２０℃のいずれかで保存した。尿タンパク質レベルを測定するために、尿を、この試験の最後まで採取した。実験の終了時に、ラットを安楽死させ、肺の断片、肝臓および腓(ひ)腹筋を除去し、浮腫を秤量し、好中球の蓄積よび肝臓ＴＮＦαを試験する。

全ての実験結果を平均±標準誤差（ＳＥＭ）として表現する。

データ分析は、Graphpad Prism 3.0 software (GraphPad Software, Inc.USA)を用いて行った。統計学的比較を、シャム手術群、およびＩ／Ｒ単独群に対して、分散に関する１元配置分散分析、次いでDunnett comparison post-test分析を用いて行った。統計学的有意差を、Ｐ＜０.０５で評価した。

（ａ）阻害クレアチンキナーゼおよびラクテートデヒドロゲナーゼの阻害
クレアチンキナーゼ（ＣＫ)の循環レベルを、製造業者の指示書に従って、ＣＫキット(Sigma, St. Louis, USA)を用いて、虚血直後、次いで１、２、３時間の再潅流および試験完了時に採取した血清試料において測定した。血清を、Ｉ／Ｒ単独動物において、ＣＫ測定のために止血帯解放１０分後に採取した。再潅流２時間後に採取した試料には１：５希釈を用いた。

ラクテートデヒドロゲナーゼ(ＬＤＨ)の循環レベルを、虚血直後、次いで１、２、３時間の再潅流および試験完了時に採取した血清試料で測定した。血清を、Ｉ／Ｒ単独の動物において、ＬＤＨ測定のために止血帯解放１０分後に採取した。ＬＤＨ濃度を、再潅流２時間後に採取した１：４希釈の試料を用いて、ＬＤＨキット(Sigma)で、製造業者の指示書に従って測定した。両酵素について、全試料を、４℃で保存し、採取２４時間以内で分析した。結果を、Sigma-Franke (SF)units/mLとして表現した。

図１５に示したように、両側後肢Ｉ／Ｒにより、再潅流の１、２、３および４時間後、ＣＫおよびＬＤＨ両方の循環レベルの上昇が生じ、４時間後に両酵素はピークに到達した。虚血単独のラットは、シャム手術したラットと比べて、ＣＫまたはＬＤＨレベル(ＣＫ、５８.３±２３.５ units/mL ; ＬＤＨ、２６９.５±７２.８ units/mL；Ｐ＞０.０５；ｎ＝４)のどちらも顕著な上昇は示さなかった。Ｉ／Ｒ単独ラットにおいて、止血帯解放１０分後(ＣＫ、７３.９±２８.１units/ｍL；ＬＤＨ、３９５.３±１２３.２ units/mL；Ｐ＞０.０５；ｎ＝４)、シャム手術したラットと比較して、これらの酵素レベルにおいて顕著な増加はなく、４時間にわたって再潅流に依存した上昇を示す。再潅流は、ＣＫおよびＬＤＨ（Ｐ＜０.０５)の両方の血漿レベルを有意に上昇させた。虚血前に、Ｃ５ａアンタゴニストによって、i.v.(１mg/kg)または経口(１０mg/kg)のいずれかで処理したラットは、Ｉ／Ｒ単独ラット(Ｐ＜０.０５)と比較して、ＣＫおよびＬＤＨ両方に類似した有意に低いレベルを示した。さらに、再潅流直前にＣ５ａアンタゴニスト(１mg/kg)をi.v.処理したラットは、虚血前処理ラット(Ｐ＜０.０５)と類似した程度のＣＫおよびＬＤＨレベルの顕著な阻害を示した。全ての薬物処理ラットにおける再潅流中のこれら酵素レベルは、シャム手術したラットよりも非常に高く、Ｃ５ａアンタゴニスト(Ｐ＜０.０５)による部分的な阻害を示す。

（ｂ）アラニントランスミナーゼおよびアスパルテート・アミノトランスフェラーゼの阻害
アラニンアミノトランスフェラーゼ(ＡＬＴ)およびアスパルテート・アミノトランスフェラーゼ(ＡＳＴ)の循環レベルを、試験完了時、続く２および３時間の再潅流時に採取した血漿試料で測定した。止血帯解放１０分後に、Ｉ／Ｒ単独動物におけるＡＬＴおよびＡＳＴの測定のために、血清を採取した。ＡＬＴおよびＡＳＴの濃度を、４℃で保存した採取血漿を２４時間以内に、ＡＬＴ／ＡＳＴキット(GPT/GOT;Sigma)で、製造業者の指示書に従って測定した。
結果を、ＳＦunits/mLとして表現した。

図１６に示したように、肢体Ｉ／Ｒにより、再潅流の２、３または４時間後の血漿中、ＡＬＴおよびＡＳＴの上昇がおき、両酵素のピークが４時間後に達成した。虚血２時間単独のラットは、シャム手術したラットと比べて、ＡＬＴまたはＡＳＴレベル(ＡＬＴ、１２.９±４.６ unit/mL；ＡＳＴ，９１.４±１０.４ units/mL；Ｐ＞０.０５；ｎ＝４)いずれも顕著な増加を示さなかった。Ｉ／Ｒ単独のラットにおいて、シャム手術したラットと比べて、止血帯解放１０分後、これら酵素レベル(ＡＬＴ，１８.１±４.４ units/mL；ＡＳＴ、１０５.９±２１.３ units/mＬ；Ｐ＞０.０５；ｎ＝４)における顕著な増加を示さなかったが、それはまた再潅流に依存した上昇であることを示す。３群全てにおいて、Ｃ５ａアンタゴニスト処理ラットは、Ｉ／Ｒ単独ラットと比較して、ＡＬＴおよびＡＳＴレベルにおいて類似した顕著な低下を示すことがわかった(Ｐ＜０.０５)。２または３時間ではなく再潅流の４時間後、薬物処理ラットは、シャム手術したラットと比較して、ＡＬＴのレベルを有意に上昇した(Ｐ＜０.０５；図１６Ａ)。対照的に、これら薬物処理ラットは、シャム手術したラットと比較して、測定した全ての時点でＡＳＴレベルが増加し、ＡＬＴおよびＡＳＴに対してＣ５ａアンタゴニストの分化抑制を示す(Ｐ＜０.０５；図１６Ｂ)。
（ｃ）カリウムおよびカルシウムイオンの血清レベルにおける変化の阻害
カリウムイオン（Ｋ^＋)の血清レベルを、各実験の完了時およびＩ／Ｒ単独動物に対して止血帯解放１０分後、flame photometer(Corning 435;Corning, U.S.A.)で測定した。血清カルシウムイオン(Ｃａ^＋＋)濃度を、試験完了時およびＩ／Ｒ単独動物について止血帯解放１０分後に、カルシウムキット(Sigma)を用いて測定した。試料を、−２０℃で保存し、Ｋ^＋およびＣａ^＋＋レベルを、採取２週間以内に測定した。結果を、mmol/Lとして表現し、表１にまとめた。

表１：ラットにおける虚血後および４時間の再灌流後の血清カチオンレベルの変化

データは平均±ＳＥＭを表現する。
ラット数
虚血/再潅流
＊Ｐ＜０.０５ vs Ｉ／Ｒ単独
†Ｐ＜０.０５ vs シャム手術したもの

血液尿素の窒素、クレアチニンおよび尿タンパク質の阻害
血液尿素窒素(ＢＵＮ)の循環レベルを、尿素窒素キット(Sigma)を用いて、製造業者の指示書に従って、試験の完了時に採取した血清試料中で測定した。試料を、−２０℃で保存し、採取２週間以内に分析した。クレアチニンの循環レベルを、クレアチニンキット(Sigma)を用いて、製造業者の指示書に従って試験完了時に血清試料中で測定した。試験完了１時間前に採取した尿試料中のタンパク質濃度を、タンパク質キット(Sigma)により、製造業者の指示書に従って測定した。試料を、４℃で保存し、採取２４時間以内に分析した。mg/dLとして表現した３つ全てのパラメーターについての結果を、表２に示した。
ラットにおける虚血および４時間の再灌後の腎臓損傷マーカーにおける変化

表２：ラットおける虚血および４時間再灌流後の肝臓損傷マーカーにおける変化

データは平均±ＳＥＭを表す
^ａラット数
^ｂ血液尿素の窒素
^Ｃ虚血／再灌流
^ｄ検出できない
^＊Ｐ＜０.０５ vs Ｉ／Ｒ単独
†Ｐ＜０.０５ vs シャム手術したもの

高カリウム血症を、再潅流４時間後シャム手術したラットと比べて、Ｉ／Ｒ単独ラットで観察した(Ｐ＜０.０５)。再潅流の直前に処理したラットは、ほぼ通常レベルを示すが、３つの薬物処理群の全てのラットは、Ｉ／Ｒ単独ラットよりもＫ^＋レベルが有意に低かった(Ｐ＜０.０５)。虚血および再潅流４時間後、Ｉ／Ｒ単独ラットは、シャム手術した動物と比べて、Ｃａ^＋の血清濃度が有意に低かった(Ｐ＜０.０５)。３つの薬物処理群の全てのラットは、Ｉ／Ｒで誘導されたＣａ^＋＋レベルの減少と同様の阻害を示した(Ｐ＜０.０５)。薬物処理したＩ／Ｒラット、さらに虚血単独のラットにおけるＫ^＋およびＣａ^＋＋の両方のレベルは、シャム手術したラットのレベルと有意差はなかった(Ｐ＞０.０５)。Ｉ／Ｒ単独ラット(Ｋ^＋、５.２７± ０.４９ mmol/L ; Ｃａ^＋＋、２.５０±０.１７ mmol/L ; Ｐ＞０.０５；ｎ＝４)における止血帯解放１０分後のこのようなイオンのレベルは、シャム手術したラットにおけるレベルと有意差はなかった。

虚血および４時間の再潅流後、Ｉ／Ｒ単独ラットは、シャム手術したラットと比べて、有意に血清ＢＵＮおよびクレアチニンレベルが上昇し、さらに尿タンパク質濃度も上昇した(Ｐ＜０.０５)。これらのパラメーターのいずれにおいても、２時間の虚血単独は、シャム手術したラットと比べて、これらのパラメーターのいずれにおいても上昇しなかった(Ｐ＞０.０５)。

全３群においてＣ５ａアンタゴニストで処理したラットは、Ｉ／Ｒ単独ラットと比べて、これらのパラメーターのレベルが有意に低下し(Ｐ＜０.０５)、これらのレベルは、シャム手術したラットのレベルと有意差はなかった(Ｐ＞０.０５)。

多形核白血球数および好中球の蓄積に関する阻害
虚血前および試験完了時に採取したヘパリン化血液試料を、Strachan et al.,(2000)に記載のように循環ＰＭＮの数を測定した。最終試料中のＰＭＮの数を、虚血前の数の平均％±ＳＥＭとして表現した。

図１７Ａに示したように、循環ＰＭＮの数は、シャム手術したラットと比べて、再潅流４時間後のＩ／Ｒ単独ラットにおいて有意に上昇することが判った(Ｐ＜０.０５)。虚血単独ラットは、シャム手術したラットと比べて、ＰＭＮの有意な上昇を示さなかった(Ｐ＞０.０５)。薬物処理群全てのラットにおいて、ＰＭＮ数は、シャム手術したラットの数と有意差はなく(Ｐ＞０.０５)、Ｉ／Ｒ単独ラットと比べて有意に低下しており(Ｐ＜０.０５)、虚血前のi.v.(1m/kg)処理したラットが最大の阻害効果を提示した。

ラットの肝臓、肺および筋肉中の好中球浸潤を、ミエロペルオキシダーゼ(ＭＰＯ）活性のレベルを測定することによって決定した。試験完了時に得た、肺(〜０.５g)、肝臓(〜ｌｇ)および左下肢筋肉(〜１g)の断片を秤量し、次いでリン酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)（１mL）を用いて懸濁した。次いで、試料を、肝臓および肺の試料には２０秒間、または筋肉試料には６０秒間、超音波処理した。遠心分離(１４,０００xg、１０分間、２２℃)の後、得られる上清を、ＭＰＯレベルについて直ぐに試験した。アッセイ混合物は、Ｏ-ジアナシジン(２.８５ mg/mL ; signa)、水素ペルオキシダーゼ(０.８５％)およびＰＢＳ中で１：４０希釈した試料を含む。吸光度を、基質添加５分後に４５０nＭで読み取り、結果を吸光度units/組織gとして表現した。

ラットの後下肢筋肉、肺および肝臓中のＭＰＯ活性のレベルを、組織中への好中球滞留の指標とした(Kyriakides et al., 2000)。図１７Ｂ、ＣおよびＤに示したように、Ｉ／Ｒ単独ラットの後下肢筋肉、肺および肝臓において、シャム手術したラットのレベルと比べて、ＭＰＯ活性が有意に上昇したが(Ｐ＜０.０５)、一方で、シャム手術したラット、虚血単独ラットは、これらの組織のいずれにおいてもＭＰＯ活性の有意な上昇を示さなかった(Ｐ＞０.０５）。全て３つの群において薬物処理ラットは、Ｉ／Ｒ単独ラットに匹敵した全ての組織においてＭＰＯ活性において有意な減少を示し（Ｐ＜０.０５）、このレベルは、シャム手術したラットにおけるレベルと有意差を示さなかった(Ｐ＞０.０５)。

肝臓懸濁液ＴＮＦαの阻害
ＴＮＦαのレベルを、前記のように、酵素結合免疫吸着剤アッセイ(OptElA, Pharmingen, USA)を用いて、肝臓懸濁液の上清試料において測定した(Strachan et al, 2000)。肝臓懸濁液試料の１：１０希釈の上清を、アッセイに用いた。上清を、−２０℃で保存し、採取試料を２週間以内に分析した。結果を、ng/g組織として表現した。図１８に示したように、Ｉ／Ｒ単独ラットからの肝臓懸濁液試料は、シャム手術したラットからのレベルと比べて、ＴＮＦ−α濃度が有意に増加した(Ｐ＜０.０５)。虚血単独ラットにおけるＴＮＦα抗体のレベルは、シャム手術したラットレベルと有意な差はなかった(Ｐ＞０.０５)の。薬物処理ラットにおいて、３群全ては、Ｉ／Ｒ単独ラットと比べて、ＴＮＦα濃度において同様に低下し(Ｐ＜０.０５)、シャム手術した動物のレベルとは有意差はなかった(Ｐ＞０.０５)。

筋肉浮腫の阻害
試験完了時に得られる右下肢筋肉(〜１g)の断片を秤量し、２４時間８０℃でオーブン内に静置して再度秤量した。湿重量対乾燥重量比を測定し、筋肉浮腫の指標とした。図１９に示したように、Ｉ／Ｒ単独ラットにおける後下肢筋肉の湿重量対乾燥重量比は、シャム手術した動物と比べて、有意に増加した(Ｐ＜０.０５)。虚血単独動物における比は、シャム手術した動物と有意差はなかった(Ｐ＞０.０５)。薬物処理ラットの３群全てにおいて、Ｉ／Ｒ単独ラットと比べて、湿重量対乾燥重量比は同様の低下を示し(Ｐ＜０.０５)、これらの値は、シャム手術した動物では有意差はなかった（Ｐ＞０.０５)。

この結果は、組織ストレスの様々な指標によって測定したように、２時間の止血帯により誘導した両側後下肢虚血および４時間の再潅流に供したラットが、局所損傷および、肺、肝臓および腎臓に対する損傷の両方をこうむったことを示すものである。虚血単独に供したラットは、シャム手術した動物に比べて、疾患マーカーにおける変化は顕著ではなかった。また、再潅流１０分間後にＩ／Ｒ単独の動物から採取した血液も、シャム手術した動物と比べて、ＣＫ、ＬＤＨ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、Ｋ^＋またはＣａ^＋＋ の血漿または血清レベルにおける顕著な変化はなかった。局所骨格筋肉損傷の重症度を、再灌流４時間後の筋肉浮腫の増加および好中球の蓄積、さらに再潅流期間中の血清ＣＫおよびＬＤＨを測定することによって評価した。サイトゾルの酵素であるＣＫは、筋肉において優勢であり、筋肉組織損傷に関する信頼性のあるマーカーである(Tay et al. , 2000)。ラクテートデヒドロゲナーゼは、筋肉で見いだされたサイトゾル酵素でもあるが、数多くの他の組織にも存在する(Carter et al., 1998)。結果として、ＬＤＨは、筋肉損傷に関するあまり特異的な尺度ではないが、依然一般的な組織損傷の尺度を提供するものであった。

離れた臓器損傷の指標を、虚血および再灌流に供した動物の肺、肝臓および腎臓で検出した。肺損傷の強度を、肺柔組織中の好中球の蓄積増加を測定することによって評価した。また、肝臓の損傷を、肝臓のＴＮＦ−αおよび好中球の蓄積における増加を測定することによって、そしてＡＬＴおよびＡＳＴの血漿レベルの増加を測定することによって定量した。ＡＬＴおよびＡＳＴの血漿レベルの増加は、肝臓病理学的なマーカーとして使用されてきたが、これら両酵素は筋肉中でも見いだされ、従って、これらのいかなる増加も、肝臓損傷よりもむしろ一部は筋肉に関与している(Tay et al., 2000)かもしれない。骨格筋Ｉ／Ｒ後の腎臓機能不全は一般的である(Tanaka et al., 1995)。我々は、Ｉ／Ｒラットにおいて、血清ＢＵＮおよび血清クレアチニンの増加を見いだした。

しかしながら、クレアチニン、特にＢＵＮは筋肉から誘導され、この観察される増加は、筋肉損傷に関与し得る(Carter et al.,1998)。我々は、Ｉ／Ｒラットにおいて尿タンパク質中でかなり増加することを見出したが、それはある程度の腎臓損傷を示す。

Ｃ５ａアンタゴニストＡｃＦ-[ＯＰｄＣｈａＷＲ]は、このモデルにおいて局所組織および隔離した内臓損傷の多数の疾患マーカーを阻害することがわかった。これらの結果は、骨格筋肉Ｉ／Ｒ損傷の病態生理学においてＣ５ａに対する重要な役割を示唆する。ヒトにおいて下肢虚血および再灌流の後の合併症の高い発病率を示すので、本発明のＣ５ａ受容体アンタゴニストは、これら合併症、特にＩ／Ｒ損傷が予測される場合に、例えば手術上の処理の際に、これら合併症の起こりうる将来的治療を提示するものである。前炎症性サイトカインの産生および好中球の密集の両方を阻害するＣ５ａアンタゴニストの能力は、疾患改変特性における重要な因子でありうる。ここに示された経口活性は、臨床的環境において、その広範な使用に対して有用な薬物特性である。

議論
本発明は、ヒトＣ５ａにも結合する細胞に結合するように予め組織された、一連の配座的に拘束された回転を含む環状分子を記述するものである。本発明の化合物の主な特徴は、環状骨格によって提示された予め組織された回転配座であり、その構造が少なくとも３つの疎水性基を隣接するスペース中に集め、それが疎水性表面「パッチ」を作り出す。

アンタゴニストのこの回転配座は、環状ペプチドが、Ｃ５ａ受容体の膜貫通領域中で、ヒトＣ５ａのＣ末端によって結合される位置でまたは近傍で結合するのを可能にする。

本明細書に記載の結果は、非常に強く配座的に拘束された小分子のＣ５ａのアンタゴニストの設計と開発を可能にした。原則として、これら環状アンタゴニストの主な特徴は、本明細書に記載の環状ペプチド骨格に結合するものと同等または類似した置換基を受容体に結合したときに、これらＣ５ａ受容体アンタゴニストによって占領されるものと類似した３次元空間へ、同じように投影する関連のない非ペプチドテンプレートを設計するのに有用なものでもある。

環状ペプチドは、薬物候補として非環状ペプチドを超えるいくつかの重要な利点がある(Fairlie et al 1995, Fairlie et al, 1998, Tyndall and Fairlie, 2001)。本明細書中に記載の環状化合物は、少なくとも数時間、３７℃で、ヒト血液または血漿中、ヒトまたはラットの胃液、または消化酵素、例えば、ペプシン、トリプシンおよびキモトリプシンの存在下、タンパク質分解に対して安定である。対照的に、Ｌ-アミノ酸からなる短い直鎖ペプチドは、その状況下で数分以内に、急速にアミノ酸成分に分解される。第２の利点は、非環状または直鎖ペプチドと対照的に、環状および非ペプチド分子によってとられる拘束された単一配座にあり、それは受容体の結合に必要なもののほかに溶液中の多様な構造をとるための十分な柔軟性がある。第３には、本発明に記載のような環状化合物は、通常、まれに経口的に投与され得ない非環状ペプチドよりも、薬剤として、脂溶性が高く、薬理的生物利用性が高い。第４には、環状分子の血漿中の半減期が、ペプチドよりも通常長い。

当業者には明らかなように、本発明は、明確および理解の目的で、いくらか詳細に説明してきたが、明細書中で開示された本発明の概念の範囲を逸脱せずに、本明細書に記載の態様および方法に対して様々な修飾および改変をなし得る。次頁に記載する本明細書中で引用された文献を、出典明示により本明細書の一部とする。

引用文献
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図１は、静脈内（Ａ）、経口（Ｂ）、局所（Ｃ）、ＡｃＦ-[ＯＰｄＣｈａＷＲ] および適当な対照（Ｄ）による皮膚アルサス(Arthus)反応に関連する血管滲出の阻害を示す。 図２は、静脈内（Ａ）、経口（Ｂ）、局所（Ｃ）の ＡｃＦ-[ＯＰｄＣｈａＷＲ] および適当な対照（Ｄ）による皮膚アルサス反応に関連する循環ＴＮＦ-α上昇の阻害を示す。 図３は、静脈内、経口、局所の ＡｃＦ-[ＯＰｄＣｈａＷＲ] による皮膚アルサス反応に関連する病因指標の低下を示す。 図４は、消化器虚血−再灌流誘発の腸浮腫に対するＣ５ａアンタゴニストの作用を示す。 図５は、消化器虚血−再灌流誘発の好中球減少症に対するＣ５ａアンタゴニストの作用を示す。 図６は、消化器虚血−再灌流誘発の血漿ＴＮＦ-α上昇に対するＣ５ａアンタゴニストの作用を示す。 図７は、消化器虚血−再灌流誘発の血漿ハプトグロビン上昇に対するＣ５ａアンタゴニストの作用を示す。 図８は、消化器虚血−再灌流誘発のアスパルテート・アミノトランスフェラーゼに対するＣ５ａアンタゴニストの作用を示す。 図９は、消化器虚血−再灌流の組織病理に対するＣ５ａアンタゴニストの作用を示す。 図１０は、２〜１４日に経口投与されたＡｃＦ-[ＯＰｄＣｈａＷＲ]による関節炎右膝関節肥厚の阻害を示す。 図１１は、関節洗浄における右膝関節ＴＮＦ-αおよびＩＬ-６レベルの阻害を示す。「非処置」は、ＡｃＦ-[ＯＰｄＣｈａＷＲ]で処置されていない動物を意味する。ただし、右膝は抗原後に感作を受けた。 図１２は、３Ｄ５３のＤＭＳＯ／蒸留水またはＰＧ・Ｈ_２Ｏ液の皮膚適用が１５分以内に循環血漿中にＣ５ａアンタゴニストの出現をもたらすこと、および有意のレベルが少なくとも４時間持続することを示す。ポイントは各群（ｎ＝６〜８）で平均±ＳＥＭを表示する。 図１３は、Ｃ５ａアンタゴニストの局所投与によるＣ５ａ誘発の好中球減少症の阻害を示す。結果を０時間ベースラインからの％変化で表す。 図１４は、ラットにおいてＣ５ａアンタゴニストの局所投与が静注のＬＰＳの全身的作用を阻害することを示す。データによると、静脈（１ｍｇ／ｋｇ）または皮膚適用による局所（５０ｍｇ／ｋｇ全適用量：溶媒ビヒクル５０％ＤＭＳＯ／５０％Ｈ_２Ｏ）での種々のＣ５ａアンタゴニストの投与が静注ＬＰＳ（１ｍｇ／ｋｇ）による好中球減少症を阻害する。（ａ）３Ｄ５３（化合物１）、（ｂ）化合物４５、（ｃ）化合物１７。 図１５は、ラットでの灌流時における（Ａ）クレアチニン・キナーゼ（ＣＫ）および（Ｂ）乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の血漿レベルの増加に対するＣ５ａアンタゴニストＡｃＦ-[ＯＰｄＣｈａＷＲ]の作用を示す。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝６〜１０）を表示する。^＊Ｐ＜０.０５、全薬物処置群対虚血／灌流（Ｉ／Ｒ）単独群；^＋Ｐ＜０.０５、全薬物処置群対シャム手術群。 図１６は、ラットでの灌流２、３、４時間後における（Ａ）アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）および（Ｂ）アスパラテートアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の血漿レベルの増加に対するＣ５ａアンタゴニストＡｃＦ-[ＯＰｄＣｈａＷＲ]の作用を示す。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝６〜１０）を表示する。^＊Ｐ＜０.０５、全薬物処置群対虚血／灌流（Ｉ／Ｒ）単独群；^＋Ｐ＜０.０５、全薬物処置群対シャム手術群。 図１７Ａは、ラットにおける（Ａ）循環ＰＭＮレベルを示す。レベルはラットにおける試験完了時に測定した。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝４〜１０）を表示する。^＊Ｐ＜０.０５、対虚血／灌流（Ｉ／Ｒ）単独群；^＋Ｐ＜０.０５、対シャム手術群。 図１７Ｂは、ラットにおける（Ｂ）筋肉ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）を示す。レベルはラットにおける試験完了時に測定した。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝４〜１０）を表示する。^＊Ｐ＜０.０５、対虚血／灌流（Ｉ／Ｒ）単独群；^＋Ｐ＜０.０５、対シャム手術群。 図１７Ｃは、ラットにおける（Ｃ）肺ＭＰＯレベルを示す。レベルはラットにおける試験完了時に測定した。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝４〜１０）を表示する。^＊Ｐ＜０.０５、対虚血／灌流（Ｉ／Ｒ）単独群；^＋Ｐ＜０.０５、対シャム手術群。 図１７Ｄは、ラットにおける（Ｄ）肝ＭＰＯレベルを示す。レベルはラットにおける試験完了時に測定した。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝４〜１０）を表示する。^＊Ｐ＜０.０５、対虚血／灌流（Ｉ／Ｒ）単独群；^＋Ｐ＜０.０５、対シャム手術群。 図１８は、試験完了時に採取されたラット肝ホモゲネートサンプル中のＴＮＦ-αレベルを示す。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝４〜１０）を表示する。^＊Ｐ＜０.０５、対虚血／灌流（Ｉ／Ｒ）単独群；^＋Ｐ＜０.０５、対シャム手術群。 図１９は、試験完了時のラット後足筋肉の浮腫量（ウエット・ツー・ドライ比率）を示す。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝４〜１０）を表示する。^＊Ｐ＜０.０５、対虚血／灌流（Ｉ／Ｒ）単独群；^＋Ｐ＜０.０５、対シャム手術群。

Claims (24)

1. Ｇタンパク質結合受容体のアンタゴニストであり、アゴニスト活性を実質的に有さない化合物であって、下記の一般式：
   

   

   ［式中、Ａは、Ｈ、アルキル、アリール、ＮＨ_２、ＮＨ−アルキル、Ｎ（アルキル）_２、ＮＨ−アリール、ＮＨ−アシル、ＮＨ−ベンゾイル、ＮＨＳＯ_３、ＮＨＳＯ_２−アルキル、ＮＨＳＯ_２−アリール、ＯＨ、Ｏ−アルキルまたはＯ−アリールであり；
   Ｂは、アルキル、アリール、フェニル、ベンジル、ナフチルもしくはインドール基、またはＬ−フェニルアラニンやＬ−フェニルグリシンなどのＤ−もしくはＬ−アミノ酸の側鎖であり、しかし、グリシン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−ホモフェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−ホモトリプトファン、ＬーチロシンまたはＬ−ホモチロシンの側鎖でなく；
   Ｃは、小さい置換基であり、しかし、イソロイシン、フェニルアラニンまたはシクロヘキシルアラニンなどのかさ高い置換基でなく；
   Ｄは、中性Ｄ−アミノ酸の側鎖であり、しかし、グリシンやＤ−アラニンの側鎖などの小さい側鎖、Ｄ−トリプトファンなどのかさ高い平面側鎖、またはＤ−アルギニンやＤ−リシンなどのかさ高い電荷側鎖でなく；
   Ｅは、かさ高い置換基であり、またはＬ−１−ナフチルもしくはＬ−３−ベンゾチエニルアラニンであり、しかし、Ｄ−トリプトファン、Ｌ−Ｎ−メチルトリプトファン、Ｌ−ホモフェニルアラニン、Ｌ−２−ナフチル−Ｌ−テトラヒドロイソキノリン、Ｌ−シクロヘキシルアラニン、Ｄ−ロイシン、Ｌ−フルオレニルアラニンまたはＬ−ヒスチジンの側鎖でなく；
   Ｆは、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ホモアルギニン、Ｌ−シトルリンまたはＬ−カナバニンの側鎖、あるいはこれらのバイオ同配体であり；
   Ｘは、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨ−または−（ＣＨ_２）_ｎＳ−、ｎが１〜４の整数；−（ＣＨ_２）_２Ｏ−；−（ＣＨ_２）_３Ｏ−；−（ＣＨ_２）_３−；−（ＣＨ_２）_４−；−ＣＨ_２ＣＯＣＨＲＮＨ−；あるいは−ＣＨ_２ＣＨＣＯＣＨＲＮＨ−、Ｒが普通のまたは稀なアミノ酸の側鎖である］
   を有する環状ペプチドまたはペプチド様化合物（ただし、この化合物は AcF-[OPdChaWR]（化合物１）ではない）である化合物。
2. Ｃが、Ｄ−、Ｌ−またはホモ−アミノ酸であるが、イソロイシン、フェニルアラニンまたはシクロヘキシルアラニンでない、請求項１の化合物。
3. Ｃが、グリシン、アラニン、ロイシン、バリン、プロリン、ヒドロキシプロリンまたはチオプロリンの側鎖である、請求項１の化合物。
4. Ｄが、中性Ｄ−アミノ酸の側鎖であるが、グリシン、Ｄ−アラニン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−アルギニンまたはＤ−リシンの側鎖でない、請求項１−３のいずれかの化合物。
5. Ｄが、Ｄ−ロイシン、Ｄ−ホモロイシン、Ｄ−シクロヘキシルアラニン、Ｄ−ホモシクロヘキシルアラニン、Ｄ−バリン、Ｄ−ノルロイシン、Ｄ−ホモノルロイシン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−テトラヒドロイソキノリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−グルタメートまたはＤ−チロシンの側鎖である、請求項４の化合物。
6. Ｅが、かさ高い置換基であり、またはＬ−１−ナフチルもしくはＬ−３−ベンゾチエニルアラニンであるが、Ｄ−トリプトファン、Ｌ−Ｎ−メチルトリプトファン、Ｌ−ホモフェニルアラニン、Ｌ−２−ナフチル−Ｌ−テトラヒドロイソキノリン、Ｌ−シクロヘキシルアラニン、Ｄ−ロイシン、Ｌ−フルオレニルアラニンまたはＬ−ヒスチジンの側鎖でない、請求項１−５のいずれかの化合物。
7. Ｅが、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファンおよびＬ−ホモトリプトファンよりなる群から選ばれるアミノ酸の側鎖である、請求項６の化合物。
8. Ｆが、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ホモアルギニン、Ｌ−シトルリンまたはＬ−カナバニンの側鎖、あるいはこれらのバイオ同配体である、請求項１−７のいずれかの化合物。
9. ｎが２または３である、請求項１−８のいずれかの化合物。
10. Ａが、アセタミド基、アミノメチル基または置換もしくは非置換スルホナミド基である、請求項１−９のいずれかの化合物。
11. 置換スルホナミド上の置換基が、１〜６炭素原子のアルキル鎖またはフェニルもしくはトルイル基である、請求項１０の化合物。
12. アルキル鎖が１〜４炭素原子を有する、請求項１１の化合物。
13. 化合物が、Ｃ５ａ受容体、バソプレシン受容体またはニューロキニン受容体に対するアンタゴニスト活性を有する、請求項１−１２のいずれかの化合物。
14. 化合物が、Ｃ５ａＲに対するアンタゴニスト活性を有するが、Ｃ５ａアゴニスト活性を有さない、請求項１３の化合物。
15. 化合物が、アンタゴニスト活性をサブマイクロモル濃度で有する、請求項１−１４のいずれかの化合物。
16. 化合物が、受容体親和性ＩＣ５０＜２５μＭおよびアンタゴニスト強度ＩＣ５０＜１μＭを有する、請求項１５の化合物。
17. 化合物が、化合物２〜６、１０〜１５、１７、１９、２０、２２、２５、２６、２８、３０、３１、３３〜３７、３９〜４５、４７〜５０、５２〜５８および６０〜７０よりなる群から選ばれる、請求項１６の化合物。
18. 化合物が、化合物３３、化合物６０または化合物４５である、請求項１７の化合物。
19. 請求項１−１８のいずれかの化合物を、薬学的に許容される担体または賦形剤とともに含む組成物。
20. Ｇタンパク質結合受容体により調整される病的状態の処置方法であって、請求項１−１８のいずれかの化合物の有効量を、該処置を必要とする哺乳動物に投与する工程を含む方法。
21. Ｇタンパク質結合受容体により調整される状態が、Ｃ５ａ受容体により調整される状態である、請求項２０の方法。
22. 状態が、Ｃ５ａの過剰発現または過小調節を含む、請求項２１の方法。
23. 状態が、関節リューマチ、成人呼吸切迫症候群（ＡＲＤＳ）、全身性エリテマトーデス、組織拒絶反応症、虚血性心疾患、再灌流障害、敗血症ショック、歯肉炎、腺維症、粥状動脈硬化症、多発性硬化症、アルツハイマー病、喘息、痴呆、中枢神経系障害、肺創傷疾患、体外透析後症候群、および乾癬、湿疹、接触性皮膚炎などの皮膚炎症性障害よりなる群から選ばれる、請求項２２の方法。
24. 再灌流障害の処置方法であって、請求項１−１８のいずれかの化合物または化合物１の有効量を、該処置を必要とする哺乳動物に投与する工程を含む方法。
    

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