CN1847261B - 作为g蛋白-偶联受体拮抗剂的环肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有调节G蛋白-偶联受体活性能力的新型环状化合物。所述化合物优选地作为拮抗剂。在优选的实施方案中，本发明提供了环状的肽和类肽C5a受体拮抗剂，其具有拮抗分叶核白细胞和巨噬细胞C5a受体上的活性。本发明的化合物有效且具有选择性，可用于治疗多种炎性疾病。

Description

作为G蛋白-偶联受体拮抗剂的环肽
本申请是中国发明申请(发明名称：作为G蛋白-偶联受体拮抗剂的环肽；申请日：2002年10月17日；申请号：02825257.8)的分案申请。
发明领域
本发明涉及新型环状的化合物，其具有调节G蛋白-偶联受体活性的能力。这些化合物优选地作为拮抗剂。在优选的实施方案中，本发明提供了环状的肽类和肽类似物C5a受体拮抗剂，其对多形核白细胞和巨噬细胞上的C5a受体具有活性。本发明的化合物为强活性的且具有选择性，并可用于多种炎性疾病的治疗。
发明背景
所有的参考文献，包括在本说明书中引用的任何专利或专利申请，这里都引入作为参考。但并不表示任何参考构成了现有技术。参考文献的讨论表述的是其作者声称的内容，但本申请者保留审查所引用文献的正确性以及相关性的权利。应该清楚地理解，尽管这里参考料许多现有技术公开，但是这种参考并不表示这些文献中的任何一种在澳大利亚或在任何其它的国家形成了本技术领域的通用知识。
G蛋白-偶联受体在人体中广泛分布，包括约60％的已知的细胞受体类型，并调节针对很宽范围内源性配体的细胞跨膜的信号转导。它们参与一系列生理和病理生理过程，包括但不限于与心血管、中枢及外周神经系统、生殖、代谢、消化、免疫炎性、以及生长失调以及其它细胞调节性和增殖性失调相关的过程。选择性调节G蛋白-偶联受体的药物具有重要的治疗应用。这些受体逐渐被认作重要的药物靶标，由于其在信号转导中的至关重要的作用(G protein-coupled Receptors，IBC Biomedical Library Series，1996)。
研究最为集中的G蛋白-偶联受体之一为C5a受体。C5a为已知的最强活性的趋化剂之一，并将嗜中性粒细胞和巨噬细胞征集至损伤部位，改变其形态；诱导脱粒作用；增加钙转移、血管渗透性(水肿)以及嗜中性粒细胞粘附性；收缩平滑肌；刺激炎性介质的释放，包括组胺、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、全列腺素以及白三烯以及溶酶体酶系的释放；促进氧自由基的形成；并增加抗体的产生(Gerard和Gerard，1994).
C5a的过表达或下调参与免疫系统介导的炎性疾病的发病机理，例如在类风湿性关节炎、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、全身性红斑狼疮、组织移植排斥、缺血性心脏病、再灌注损伤、脓毒性休克、牛皮癣、齿龈炎、动脉粥样硬化、阿耳茨海默(氏)病、肺损伤和体外透析后综合征以及多种其他的疾病中(Whaley1987；Sim1993)。
限制C5a的促炎性作用的试剂具有抑制慢性炎症以及其伴随的疼痛和组织损伤的潜能。由于这些原因，防止C5a与其受体结合的分子可用于治疗补体激活驱动的慢性炎性疾病。这些化合物也为补体介导免疫性机理的研究提供来了有价值的新的信息。
在我们的前述申请No.PCT/AU98/00490中，其所有公开这里引入作为参考，我们描述了一些人C5a碳-端类似物的三维结构，并利用这种信息设计了与人C5a受体(C5aR)结合的新化合物，作为C5a激动剂或拮抗剂。以前认为推定的拮抗剂可能同时需要C端精氨酸和C-端羧酸酯以满足受体结合和拮抗剂活性(Konteatis等，1994)。在PCT/AU98/00490中，我们证实事实上对与C5aR的高亲和力结合或对拮抗剂活性而言，末端羧酸酯一般并不是必须的。但我们发现目前还没有意识到的结构特征，一种扭转(turn)构型，是嗜中性粒细胞上人C5a受体高亲和力结合的关键性识别特征。我们利用这种发现涉及了受限的结构模板，所述模板能使疏水基团聚集成疏水排列以与C5a受体相互作用。
通过考察在我们前述申请中活性最强的化合物中的每一个氨基酸残基位置结构变化的效果，我们现在已经开发出人嗜中性粒细胞C5a受体环拮抗剂的其他实例，并鉴定出具有许多强C5aR拮抗剂活性的化合物。这些化合物各包括环状骨架(scaffold)，其满足在稍早PCT/AU98/00490申请中显示的一般性三维结构需求，但我们已经发现某些取代基与环相连可以导致令人惊奇的最出乎意料的结果，产生高和低的拮抗剂活性，而这种情形不能由前述申请PCT/AU98/00490准确预测。这些令人惊奇的新发现使得我们提炼并更好地定义C5a受体拮抗活性地必须药效团。这里描述的出乎意料的结构-活性关系有助于定义人多形核白细胞(嗜中性粒细胞)上的C5a受体拮抗活性的精细药效团结构。该药效团预期也适于人和哺乳动物其他细胞上的C5a受体。
发明概述
本发明一方面提供了式I的环状肽或类肽，其为G蛋白-偶联受体拮抗剂的化合物，基本上没有激动剂活性：
Figure S06106795220060217D000031
其中A为H、烷基、芳基、NH2、NH-烷基、N(烷基)2、NH-芳基、NH-酰基、NH-苯甲酰基、NHSO3、NHSO2-烷基、NHSO2-芳基、OH、O-烷基或O-芳基；
B为烷基、芳基、苯基、苄基、萘基或吲哚基，或D-或L-氨基酸例如L-苯基丙氨酸或L-苯基甘氨酸的侧链，但不为甘氨酸、D-苯基丙氨酸、L-高苯基丙氨酸、L-色氨酸、L-高色氨酸、L-酪氨酸或L-高酪氨酸的侧链；
C为小的取代基，例如D-，L-或高-氨基酸例如甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、羟基脯氨酸、或硫代脯氨酸的侧链，但优选地不为体积大的取代基例如异亮氨酸、苯基丙氨酸，或环己基丙氨酸；
D为中性D-氨基酸例如D-亮氨酸、D-高亮氨酸、D-环己基丙氨酸、D-高环己基丙氨酸、D-缬氨酸、D-正亮氨酸、D-高-正亮氨酸、D-苯基丙氨酸、D-四氢异喹啉、D-谷氨酰胺、D-谷氨酸、或D-酪氨酸的侧链，但优选地不为小的取代基例如甘氨酸或D-丙氨酸的侧链、大体积的平面侧链例如D-色氨酸，或体积大的带电侧链例如D-精氨酸或D-赖氨酸；
E为体积大的取代基，例如选自L-苯基丙氨酸、L-色氨酸和L-高色氨酸的氨基酸的侧链，或为L-1-萘基(napthyl)或L-3-苯并噻吩基丙氨酸，但不为D-色氨酸、L-N-甲基色氨酸、L-高苯基丙氨酸、L-2-萘基L-四氢异喹啉、L-环己基丙氨酸、D-亮氨酸、L-芴丙氨酸，或L-组氨酸的侧链；
F为L-精氨酸、L-高精氨酸、L-瓜氨酸，或L-刀豆氨酸的侧链，或生物电子等排体，即，侧链其中末端胍或脲基受限制，但是碳骨架被不同结构的替换，但是侧链以整体的形式与靶蛋白的反应与母体基团的方式一样；
X为-(CH2)nNH-或(CH2)n-S-，其中n为1～4的整数，优选地2或3；-(CH2)2O-；-(CH2)3O-；-(CH2)3-；-(CH2)4-；-CH2COCHRNH-；或CH2CHCOCHRNH-，且其中R为任何常用或不常用的氨基酸的侧链，
条件是化合物不是下述的化合物1。
在C中，顺式和反式形式的羟基脯氨酸和硫代脯氨酸都可以使用。
优选地A为乙酰胺基、氨基甲基或取代的或未取代的磺酰胺基。
优选地其中A为取代的磺酰胺，取代基为1～6，优选地1～4碳原子烷基链，或苯基或甲苯甲酰基基。
优选地G蛋白-偶联受体为C5a受体。但是，我们发现我们早期申请的先导化合物对抗利尿激素和神经激肽受体也具有明显的结合亲和力，因此这些受体也包括在本发明的范围之内。
在特别优选的技术方案中，化合物具有C5aR拮抗剂活性，并且没有C5a激动剂活性。
本发明的环状化合物优选地为拮抗剂人、哺乳动物细胞包括但不限于，人分叶核白细胞和人巨噬细胞上的C5a受体。本发明的化合物优选地强烈地且选择性地与C5a受体结合，并更优选地在亚微摩尔浓度(sub-micromolar浓度)具有强拮抗剂活性。更优选地化合物地受体亲和力IC50<25μM，并且拮抗剂活性IC50<1μM。
更优选地，化合物选自这里描述的2～6、10～15、17、19、20、22、25、26、28、30、31、33～37、39～45、47～50、52～58和60～70化合物。更优选的化合物为化合物33、化合物60或化合物45。
在本说明书中，术语“烷基”为直链、支链、或环状、取代的或未取代的1～6，优选地1～4个碳原子的烷基链。更优选地，烷基为甲基。术语“酰基”为取代的或未取代的1～6，优选地1～4个碳原子酰基。更优选地酰基为乙酰基。术语“芳基”应理解为取代的或未取代的碳环或杂环芳基，其中所述环优选地为5或6员。
“常见”氨基酸为L-氨基酸，选自甘氨酸、亮氨酸、异高氨酸、缬氨酸、丙氨酸、苯基丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、蛋氨酸、精氨酸、赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸和组氨酸。
“非常见”氨基酸包括但不限于，D-氨基酸、高-氨基酸、N-烷基氨基酸、脱氢氨基酸、除苯基丙氨酸、酪氨酸和色氨酸以外的芳香氨基酸、邻-，间-或对-氨基苯甲酸、鸟氨酸、瓜氨酸、刀豆氨酸、正亮氨酸、δ-谷氨酸、氨基丁酸、L-芴基丙氨酸、L-3-苯并噻吩基丙氨酸以及α，α-二取代的氨基酸。
根据第二方面，本发明提供了一种包括本发明化合物以及可药用载体或赋性剂的组合物。
本发明的组合物可配制成适于口服、肠胃外、吸入、鼻内、透皮或其他局部应用，但优选口服或局部应用。对于局部应用，可使用溶媒例如二甲基亚砜(sulphonate)或丙二醇。取决于处理的组织表面，可优选其他溶剂。
可以预期绝大多数如果不是所有的本发明化合物在代谢酶的存在下稳定，例如消化刀、血液、肺的那些酶或细胞内酶。所述稳定性可用本技术领域普通技术人员公知的常规方法很方便地进行测定。
通过任何期望的途径给药的合适制剂可用标准的方法制备得到，例如参考公知的教材例如Remington：The Science and Practice ofPharmacy，Vol.II，2000(20th edition)，A.R.Gennaro(ed)，Williams&Wilkins，Pennsylvania。
第三方面，本发明提供了一种治疗G蛋白-偶联受体介导病理疾病的方法，包括对需要这种治疗的哺乳动物或脊椎动物施用有效量的本发明的化合物。
优选地G蛋白-偶联受体介导的疾病为C5a受体介导的疾病，并更优选地涉及C5a的过表达或表达下调。这些疾病包括但不限于类风湿性关节炎、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、全身性红斑狼疮、组织移植排斥、缺血性心脏病、再灌注损伤、脓毒性休克、齿龈炎、纤维症、动脉粥样硬化、多发性硬化症、阿耳茨海默(氏)病、哮喘、痴呆、中枢神经系统疾病、肺损伤、体外透析后综合征、以及皮肤炎性疾病例如牛皮癣、湿疹和接触性皮炎。
在优选的实施方案中，疾病为类风湿性关节炎。
在第二优选的实施方案中，所述疾病为再灌注损伤。在第二实施方案中，应该很清楚地理解，不适用式I的限制性条件。
尽管本发明没有以任何方式限制到治疗任何具体的动物或种属，特别地预期本发明化合物可用于人的医学治疗，并也可用于兽医治疗，特别是相伴动物例如猫和狗，家畜例如牛、马和羊，以及动物园动物，包括非人灵长类、大的牛科动物、猫科动物、碲类动物和犬科动物。可以治疗的其他物种包括爬行类、鱼类或两栖类动物。
本发明化合物可以任何合适的剂量和任何适合的途径进行给药。口服、局部、透皮或鼻内给药为优选的给药方式，因为这些途径具有更强的便利性以及可接受性。局部应用也可包括制剂例如子宫托或阴道或直肠栓给药或水性滴剂用于对耳或眼睛局部给药。有效剂量将取决于治疗疾病的特性、以及治疗个体的年龄、体重以及潜在的健康状况。这可由医师或兽医进行判断。利用本领域公知的方法很容易通过反复试验进行确定合适的剂量水平。
在本发明中，应该清楚地理解术语“包括”意思为“包括但不限于”，并且术语“包括”具有相应的含义。
附图简述
图1显示静脉内(A)、口服(B)和局部(C)AcF-[OPdChaWR]以及适当对照(D)施用对皮肤阿蒂斯反应相关联的脉管渗漏的抑制。
图2显示了静脉内(A)、口服(B)和局部(C)AcF-[OPdChaWR]以及适当的局部对照(D)施用对皮肤阿蒂斯反应关联的循环TNFα升高的抑制情况。
图3显示静脉内、口服和局部AcF-[OPdChaWR]应用后皮肤阿蒂斯反应相关联的病理指数的下降。
图4显示C5a拮抗剂对消化道缺血-再灌注诱导的肠水肿的效果。
图5显示C5a拮抗剂对消化道缺血-再灌注诱导的嗜中性白血球减少的效果。
图6显示C5a拮抗剂对消化道缺血-再灌注诱导的血清TNFα上升的效果。
图7显示C5a拮抗剂对消化道缺血-再灌注诱导的血清触珠蛋白升高的效果。
图8显示C5a拮抗剂对消化道缺血-再灌注诱导的天冬氨酸转氨酶的效果。
图9显示C5a拮抗剂对消化道缺血-再灌注的组织病理的效果。
图10显示在第2天到+14天经口施用AcF-[OPdChaWR]对关节炎性右膝关节肿胀的抑制。
图11显示对右膝关节关节灌洗液中TNF-α和IL-6水平的抑制。“未处理”表示动物未用AcF-[OPdChaWR]处理，但是右膝在致敏后用抗原刺激。
图12显示皮肤应用3D53的DMSO/蒸馏H2O或PG/H2O溶液在15分钟之内在循环血浆中出现C5a拮抗剂，并且明显的水平持续至少4小时。点代表每组中(n＝6-8)的平均值±SEM。
图13显示局部应用C5a拮抗剂对C5a-诱导的嗜中性白血球减少的抑制。结果以时间0点基线的百分变化进行表述。
图14显示局部应用C5a拮抗剂抑制大鼠中静脉内注射LPS的全身作用。数据标明施用多种C5a拮抗剂，或者通过i.v.(1mg/kg)，或皮肤局部应用(50mg/kg总应用剂量：溶剂载体50％DMSO/50％H2O)，抑制i.v.LPS(1mg/kg)引起的嗜中性白血球减少。(a)3D53(化合物1)；(b)化合物45；(c)化合物17。
图15显示C5a拮抗剂AcF-[OPdChaWR]在大鼠再灌注过程中对下列指标血清水平增加的影响(A)肌酸激酶(CK)和(B)乳酸脱氢酶(LDH)。数据为平均值±SEM(n＝6-10)。*P<0.05所有的药物处理组vs.缺血/再灌注(I/R)-只有；
Figure S06106795220060217D00007100649QIETU
P<0.05所有的药物处理组vs.假手术。
图16显示C5a拮抗剂，AcF-[OPdChaWR]在再灌注后2、3和4小时对大鼠中下列指标血清水平增加的影响：(A)丙氨酸转氨酶(ALT)和(B)天冬氨酸转氨酶(AST)。数据为平均值±SEM(n＝6-10)。*P<0.05所有的药物处理组vs.缺血/再灌注(I/R)-只有；P<0.05所有的药物处理组vs.假手术。
图17显示大鼠中下列指标的水平：(A)循环PMNs、(B)肌肉髓过氧化物酶(MPO)、(C)肺MPO和(D)肝脏MPO。水平为试验完成后在大鼠上测得。数据为平均值±SEM(n＝4-10)。*P<0.05vs.缺血/再灌注(I/R)-只有；+P<0.05vs.假手术。
图18显示在试验结束时取得的大鼠肝脏匀浆样品中的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平。数据为平均值±SEM(n＝4-10)。*P<0.05vs.缺血/再灌注(I/R)-只有；+P<0.05vs.假手术。
图19显示试验结束时大鼠后肢肌肉的水肿(湿重-干重比)量。数据为平均值±SEM(n＝4-10)。*P<0.05vs.缺血/再灌注(I/R)-只有；+P<0.05vs.假手术。
发明详述
通常，术语″治疗″等这里用来指影响研究对象、组织或细胞得到需要的药理和/或生理效果。效果可为预防性的，全部或部分地预防疾病或征兆或症状，以及和/或为治疗性地，部分或全部治愈疾病。这里所用的″治疗″包含脊椎动物、哺乳动物，特别是人中的任何的疾病的治疗或预防，并包括：预防倾向于患病并且诊断还没有患病的研究对象中疾病的发生；抑制疾病，即，终止其发展；或疾病的减轻或改善作用，即引起疾病作用的转归。
本发明包括用于改善疾病的多种药物组合物。根据本发明的一种实施方案的药物组合物通过将式I化合物、类似物、衍生物或其盐以及一种或多种药物活性物质式I化合物与一种或多种药物活性物质的组合用载体、赋性剂和添加剂或佐剂一起制备成适合对研究对象给药的形式而进行制备。
经常施用的载体或佐剂包括碳酸镁、二氧化钛、乳糖、甘露醇以及其他糖类、滑石粉、乳蛋白、明胶、淀粉、维生素、纤维素及其衍生物、动植物油、聚乙二醇以及溶剂，例如无菌水、乙醇、甘油以及多羟基醇类。静脉内溶媒包括液体和营养补充剂。防腐剂包括抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂以及惰性气体。其他的可药用载体包括水性溶剂、无毒性赋性剂，包括盐类、防腐剂、缓冲剂等，如例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，20th ed.Williams& Wilkins(2000)和The British National Formulary 43rd ed.(British MedicalAssociation and Royal Pharmaceutical Society of Great Britain，2002；http：//bnf.rhn.net)中所描述的，其内容这里引入作为参考。可药用组合物的pH以及各种成分的确切浓度根据本领域普通技术常规进行调节。参见Goodmanand Gilman′s The Pharmacological Basis for Therapeutics(7th ed.，1985)。
可药用组合物优选地以单位剂量进行制备和给药。固体单位剂量包括片剂、胶囊以及栓剂。对研究对象进行治疗的时候，依据化合物的活性、给药方式、疾病的性质以及严重程度、对象的年龄以及体重，可以使用不同的剂量。在某些情况下，更高或更低的日剂量是合适的。日剂量的给药可下述方式实现：通过单个单位剂量的单次给药或数个更小剂量单位给药，以及也可以通过在特定的时间间隔多次施用细分剂量。
本发明的药物组合物可以治疗有效量进行局部或全身给药。用于这种用途的有效量当然地取决于疾病的严重程度以及研究对象的体重以及一般状况。典型地，体外使用的剂量将为原位施用组合物的量有用的指导，并且动物模型可用来判断治疗细胞毒性副作用的有效剂量。在Langer，Science，249：1527，(1990)中描述了多种需要考虑的因素。口服应用的制剂可为硬明胶胶囊的形式，其中所述活性成分与惰性固体稀释剂，例如，碳酸钙、磷酸钙或高岭土进行混合。其也可为软明胶胶囊的形式，其中所述活性成分与水或油介质例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。
水性悬浮剂通常包含活性物质以及适于制备水性悬浮剂的赋性剂。这些赋性剂可为助悬剂例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶以及阿拉伯树胶；分散或润湿剂，其可为天然存在的磷脂例如卵磷脂；(b)亚烷基氧化物与脂肪酸的缩合物，例如，硬脂酸聚氧乙烯酯；(c)环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物，例如heptadecaethylenoxy十六烷醇；(d)环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的部分酯的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯，或(e)环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的部分酯的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯。
药物组合物可为无菌注射水性或油性悬浮液的形式。所述悬浮剂可依照已知的方法进行配制，利用合适的分散或润湿剂以及助悬剂例如上面述及的那些。无菌注射制剂也可为在无毒性肠胃外可接受的稀释剂或溶剂无菌注射溶液或悬浮液，例如，1，3-丁二醇溶液。在可用的可接受的溶媒和溶剂中，有水、Ringer氏溶液以及等张氯化钠溶液。此外，无菌、固化油通常用作溶剂或悬浮介质。为了这种目的，可使用任何温和的固化油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸例如油酸可用于注射制剂。
式I化合物可以脂质体给药系统进行给药，例如小单层脂质体、大单层脂质体以及多层脂质体。脂质体可由多种磷脂例如胆固醇、十八烷酰胺或磷脂酰胆碱形成。
本发明式I化合物的剂量水平一般为约0.5mg～20mg千克体重的水平，优选的剂量水平为约0.5mg～约10mg千克体重每天(为约0.5g～约3g每人每天)。可与载体物质混合制备单一剂量的活性成分的量将根据要处理的宿主以及具体的给药途径而变化。例如，人口服制剂可包含约约5mg～1g的活性化合物以及适当量方便量的载体物质，后者可在约5～95％总组合物的范围内变化。单位剂量形式通常包含约5mg～500mg活性成分。
但是，应该理解为具体的剂量水平将取决于多种因素包括具体使用化合物的活性、年龄、体重、健康状况、性别、饮食、给药时间、给药途径、排除速率、药物组合以及进行治疗的具体疾病严重程度。
此外，一些本发明化合物将与水或常见的有机溶剂形成溶剂合物。这些溶剂合物包括在本发明范围之内。
本发明的化合物还可与其他化合物组合以提供有效的组合。因此包括药物活性成分与本发明式I化合物的任何化学兼容的组合。
应该清楚地理解为前述有关药物制剂、给药途径、剂量水平等论述同等地适用于化合物1。
这里使用的缩写如下：
 
BOP 六氟磷酸苯并三唑-1-基氧基-三-(二甲胺基)-鏻盐
C5cR C5a受体
dH<sub>2</sub>O 蒸馏水
D-Cha D-环己基胺
DIPEA 二异丙基乙基胺
DMF N，N-二甲基甲酰胺
DMSO 二甲基亚砜
HBTUO 苯并三唑N′，N′，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐；
HEPES N-[2-羟基乙基]哌嗪-N’-[2-乙磺酸]
HPLC 高效液相色谱
RP-HPLC 反相高效液相色谱
i.v. 静脉内
LPS 脂多糖
PMN 分叶核粒细胞
Po 口服
RMSD 平均平方根偏差(root mean square deviation)
rp-HPLC 反相-高效液相
TFA 三氟乙酸；
在说明书中，常规的单字母和三字母代码用来表示氨基酸。
术语“3D53”和“PMX53”是同义词，并表示化合物Ac-Phe-[Orn-Pro-dCha-Trp-Arg]；
术语“LP-10”和“PMX-201”是同义词，并表示化合物Ac-Phe-[Orn-Pro-dCha-Trp-Cit]；以及
术语“LP-16”和“PMX-205”是同义词，并表示化合物HC-[Orn-Pro-dCha-Trp-Arg]，其中“HC”表示氢化肉桂酰基(hydrocinnamate)。
本发明现在只参考下述一般性方法以及实验例进行描述。
我们发现目前已经测试的所有式I化合物具有广泛的类似的药理活性，与化合物1(这里也指为3D53或PMX53)的活性类似，尽管单个具体化合物的物理化学性质、活性以及生物利用度随具体的取代基有一定程度的变化。因此，我们预期化合物1得到的体外或体内结果可以适当地预测在相应分析中式I化合物的活性。
一般方法
保护的氨基酸和树脂得自Novabiochem。TFA、DIPEA和DMF(肽合成级)购自Auspep。所有其他的物质为试剂级，除非另有说明。制备级别的反相HPLC制备在Vydac C18反相柱(2.2x25cm)上进行，并且分析性反相HPLC分离在Waters Delta□Pak PrepPak C18反相柱(0.8x10cm)上进行，利用溶剂A＝水/0.1％TFA和溶剂B＝水10％/乙腈90％，0.09％TFA的梯度混合物。肽的分子量用电喷雾质谱测定，在三重四极质谱仪(PE SCIEX APIIII)上记录，如(Haviland等，1995)中所述。1H-NMR谱在Bruker ARX500MHz或Varian Unity400谱仪上记录。质子归属利用2D NMR实验(DFCOSY。TOCSY，NOESY)进行判断。
化合物通过质谱和反相分析性HPLC进行分析。
化合物合成
线性肽序列通过本技术领域人员公知的手工逐步标准的固相肽合成(SPPS)技术进行制备。氨基酸或肽端HBTU用DIEA进行原位中和。偶联用标准的定量茚三酮测定进行监控。利用Boc化学进行氨基酸的临时的Nα-保护，用TFA处理2次1分钟去除Boc基团。肽在NovabiochemBoc-D-Arg(Tos)-PAM或Boc-L-Arg(Tos)-PAM树脂上进行合成，取代值为约0.2-0.5mmol/g。用液体HF(10mL)、对甲酚(1mL)在-5℃处理1-2小时将肽完全脱保护丙裂解。肽用反相HPLC(例如梯度：0％B～75％B，60分钟)纯化并经电喷雾质谱经分析。
或者，线性肽可用Fmoc化学进行合成，利用HBTU/DIEA活化Fmoc-D-Arg(Mtr)-Wang树脂。Fmoc基团的去除利用50％哌啶/DMF处理2个1分钟。裂解和脱保护使用95％TFA/2.5％TIPS/2.5％H2O得到Mtr-保护的肽，可用RP-HPLC纯化。
环化线性肽的一般步骤涉及：将肽(1当量)和BOP(5当量)溶解在DMF(10mM肽浓度)中，并剧烈搅拌，然后加入DIEA(15当量)。尽管在绝大多数情况下反应在2小时内完成，一般将溶液室温搅拌过夜。在高真空30℃下在旋转蒸发仪上除去DMF，然后经RP-HPLC纯化。对于包含游离N端的环状肽，将Fmoc基团用作环化步骤中临时的N-端保护基。在高真空30℃下在旋转蒸发仪上除去DMF，并且然后将肽用30％哌啶/DMF室温处理1小时以除去Fmoc基团。然后高真空除去溶剂，并经RP-HPLC纯化。下面描述了代表性的环肽的合成。
NMR结构测定
在Varian Unity400谱仪在24℃参照溶剂测定测试化合物(3mg的750μl d6-DMSO溶液，δ2.50)的1H-NMR谱。二维1H□NMR NOESY(驰豫接力2.0s，混合时间50-300ms)，DFQ□COSY和TOCSY(混合时间75ms)实验以相灵敏的模式获得并记录。对所有实验，获得时间＝0.186s，谱宽＝5500Hz，复合点数(t1维)＝1024。数据及进行零填充并且在二维方向傅立叶转换成1024实点。
化合物1的NMR数据利用TRIAD软件(Tripos Assoc.)在SiliconGraphics Indy工作站上进行处理。将2DNOE交叉峰进行积分并表征为强(1.8-2.5
Figure S06106795220060217D00013101143QIETU
)、中(2.3-3.5
Figure S06106795220060217D00013101151QIETU
)以及弱(3.3-5.0
Figure S06106795220060217D00013101158QIETU
)。从上和下距离限制编目利用Diana2.8(69距离限制，包括对相邻残基27以及更远6)利用剩余二面角限制(REDAC)策略计算初步的三维结构。利用MARDIGRAS精确地计算上和下距离限制。在本阶段，检查肽可能存在的氢键，并将其添加为距离限制。将50个最低能量Diana结构进行有限分子动力学(RMD)以及能量最小化(REM)。最初，REM由50步最速下降组成，然后100步成对梯度最小化。RMD通过将结构加热至300K刺激1ps，然后500K刺激1ps进行。用2ps将温度逐渐降至300K最后在200K保持2ps。用50步最速下降，200步成对梯度然后300步Powell最小化执行REM。检查最后的结构以得到相对于骨架重原子(N、Cα和C)具有平均成对rms差异。50个结构的20个对所有骨架原子(O，N，C)具有平均rmsd<0.5
Figure S06106795220060217D00013101230QIETU
。
受体-结合分析
分析按照下述方法进行，用新鲜的人PMNs，如以前所述(Sanderson等，1995)的方法分离得到，利用缓冲液50mM HEPES、1mM CaCl2，5mMMgCl2、0.5％牛血清白蛋白、0.1％杆菌肽以及100μM苯基甲基磺酰氯(PMSF)进行。在4℃分析中，将缓冲液、未标记的重组人C5a(Sigma)或肽、Hunter/Bolton标记的125I-C5a(～20pM)(New England Nuclear，MA)以及PMNs(0.2x106)依次加入到Millipore Multiscreen分析板(HV0.45)中，终体积为200μL/孔。4℃孵育60分钟后，过滤样品并将板用缓冲液洗涤1次。将滤器干燥，冲压并在LKBγ计数器终计数。非特异性结合通过包含1mM肽或100nM C5a进行评价，一般为总结合的10-15％。
利用非线性回归和用Dunnett post-test统计进行数据分析。
利用髓过氧化物酶释放分析评价拮抗剂活性
细胞的分离如以前所述(Sanderson等，1995)并与细胞松弛素B孵育(5μg/mL，15分钟，37℃)。将包含0.15％明胶和肽的Hank′s平衡盐溶液加到96孔板(总体积100μL/孔)中，然后加入25μL细胞(4x106/mL)。为了评价各肽拮抗C5a的能力，将细胞与各肽在37℃孵育5分钟，然后加入C5a(100nM)并继续孵育5分钟。然后将50μL磷酸钠(0.1M，pH6.8)加到各孔中，将板冷却到室温，并将25μL等体积的二甲氧基对二氨基联苯(5.7mg/mL)和H2O2(0.51％)的新鲜混合物加入到各孔中。在10分钟的时候加入2％叠氮钠终止反应。在Bioscan450板读取器上测定450nm处的吸光度，相对于对照值(无肽)进行校正，并通过非线性回归进行分析。
消炎活性的体内分析
下述公知的体内分析体系用来评价本发明化合物的消炎活性。用非线性回归分析和Student’s t-检验、变量分析方法分析所有的分析数据，p<0.05作为具有显着意义的临界水平。
(a)角叉(菜)胶爪水肿
对麻醉的(腹腔注射氯胺酮和甲苯噻嗪)Wistar大鼠(150-200g)或小鼠注射无菌空气(第1天20ml，第4天10ml)进入背部的皮下组织。6天后可以使用形成的腔，将角叉(菜)胶(2ml，1％w/w的0.9％盐水溶液)注射到空气袋中，10小时后收集流出液。第6天后每天施用测试化合物，并通过空气袋流出液中的细胞差分计数分析它们的消炎效果。注射后的合适的时间处死动物，并用2ml的0.9％盐水灌洗空腔；灌洗液转移到肝素化的管中并用血细胞计数器和Diff-Quik染色细胞离心制剂对细胞进行计数。
或者，通过足部注射注射角叉(菜)胶在Wistar大鼠中发展的常规的角叉(菜)胶爪水肿可用来引起水肿，后者在2小时内可见，在4小时发展到极限。测试化合物在炎性原(inflammagen)前40分钟施用，并通过2和4小时后的爪的微弯脚器测定评价其效果。参见Fairlie，D.P.等(1987)。还参见Walker和Whitehouse(1978).
(b)佐剂诱发的关节炎.
在大鼠(3系)中诱导佐剂诱发的关节炎，通过免疫(注射热灭活的结核分支杆菌Mycobacterium tuberculosis)或化学(用avridine)方法，通过与油性溶媒一起在尾部接种佐剂，例如Freund氏佐剂(参见Whitehouse，M.W.，Handbook of Animal Modelsfor the Rheumatic Diseases，Eds.Greenwald，R.A.；Diamond，H.S.；Vol.1，pp.3-16，CRC Press)。
在13天内，佐剂诱发的关节炎显示为尾部的局部炎症以及溃疡、所有四爪的总体肿胀、爪和耳朵的炎性损伤、体重下降以及发热。这些症状，与人体中的那些炎性疾病类似(Winter和Nuss，1966)，可用药物例如消炎痛或环孢霉素减轻，在人中也显示处有益的效果(例如Ward和Cloud，1966)。在第14天不用药物处理，关节炎大鼠将出现爪肥大、白蛋白减少以及血清中上升的急性阶段反应蛋白，以及外源性物质的肝代谢下降，显示为延长的巴比妥-诱导的睡眠时间。
为了评价化合物的活性，在用关节炎原接种(第0天)后的第10～13天，将化合物经口(≤10mg/kg/天)或腹膜内(腹腔注射)给药4天。如果化合物具有活性，或者炎症不可见，或尾部或前爪的炎症显著减轻，用微卡钳测量爪厚度以及尾部体积进行评估，以及炎性损伤的总体检查。在第18天，将动物通过颈部错位处死，除非没有关节炎症状，在这期间在得到伦理委员会允许的基础上继续观察。实验交错排列以使通量最大化，在进行化合物之间的早期比较。这种常规分析被认同为确证用于人体的抗炎剂的方法。
药代动力学
雌性和雄性Wistar大鼠(200-250g)用1mL的zoletil(50mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg；Lyppard，Australia)进行麻醉，经腹膜内注射。在大鼠的下腹部区域剃出5x10cm的区域并作记号，在该区域应用药物剂量。包含10mg/ml的C5a拮抗剂储存液以各种浓度的水溶解在溶剂丙二醇或二甲基亚
Figure S06106795220060217D00016101459QIETU
中，并用抹刀均匀地涂抹在大鼠的剃毛的腹部区域。用加热垫来保持大鼠的体温，并在第1小时每隔15分钟采集血液样品，之后每1小时采集1次共3小时。
立即将血样品加入到包含肝素(500单位/μL)管中并离心(11000xg)。取出各样品的血浆层并在-20℃储存。加入氘代的内标2H3CO-F-[OPdChaWR]50μL，5μg/mL的50％乙腈/水溶液)并涡旋。将样品进一步用高效液相色谱(HPLC)级的乙腈进行1∶3稀释并快速涡旋(20sec)，然后离心(11000xg)。该方法导致样品中大血浆蛋白沉淀，并将药物从血浆中完全萃取出来。样品的液体部分放置在1mL Eppendorf管中并储存待分析。
这些样品转移至96孔板中并用GeneVac离心蒸发器蒸发至干，然后用流动相重建于孔(20μL)中。样品的分析用液相色谱(LCMS)进行，利用装配有多孔板自动进样器和PE Sciex Qstar Pulsar ESI-TOF质谱仪的Agilent1100series HPLC。从药物：内标标准峰面积比的标准曲线确定浓度。标准的制备通过将适当量的药物以及内标加入到未处理的大鼠血浆中，并用与实验样品同样的方法进行提取和制备。
实施例1：
环状化合物的合成
环肽AcF-[OPdChaWR](1)的合成。线性肽Ac-Phe-Orn-Pro-dCha-Trp-Arg以0.20mmole规模用Boc化学方法进行合成，利用HBTU/DIEA活化并在Boc-L-Arg(Tos)-PAM树脂(338mg，SV＝0.591mmol/g)进行原位中和。树脂(457mg)的裂解和脱保护通过将树脂用HF(10ml)和对甲酚(1ml)在-5～0℃处理1-2小时而实现，得到粗肽(160mg，90％)。环化涉及将粗肽(41mg，45μmol)、BOP(126mg，0.28mmol)和DIEA(158μL，0.9mmol)在DMF(57mL)中搅拌15小时。真空去除溶剂并将环状肽经rpHPLC纯化(18.8mg，47％)Rt＝10.8分钟(梯度：70％A/30％B～0％A/100％B，30分钟)。MS：[M+H]+(计算值)＝896.5，[M+H]+(实验值)＝896.5。
环状AcF-[OPdPheWR](33)的合成。线性肽Ac-Phe-Orn-Pro-dPhe-Trp-Arg用Boc化学方法利用HBTU/DIEA活化以及原位中和在Boc-L-Arg(Tos)-PAM树脂上进行合成。树脂的裂解和脱保护通过将树脂用HF(10ml)和对甲酚(1ml)在-5～0℃处理1-2小时而实现，得到粗肽。环化涉及将粗肽(85mg)、BOP(200mg)和DIEA(222μL)在DMF(10mL)中搅拌15小时。真空去除溶剂并将环状肽经rpHPLC纯化(31mg)Rt＝16.7分钟(梯度：70％A/30％B～0％A/100％B，30分钟)。MS：[M+H]+(计算值)＝890.5，[M+H]+(实验值)＝890.5。
环状AcF-[OPdChaFR](60)的合成。线性肽Ac-Phe-Orn-Pro-dCha-Phe-Arg用Boc化学方法利用HBTU/DIEA活化以及原位中和在Boc-L-Arg(Tos)-PAM树脂上进行合成。树脂的裂解和脱保护通过将树脂用HF(10ml)和对甲酚(1ml)在-5～0℃处理1-2小时而实现，得到粗肽。环化涉及将粗肽(104mg)、BOP(57mg)和DIEA(103μL)在DMF(1mL)中搅拌15小时。真空去除溶剂并将环状肽经rpHPLC纯化(52mg)。Rt＝11.37分钟(梯度：70％A/30％B～0％A/100％B，15分钟)。MS：[M+H]+(计算值)＝857.5，[M+H]+(实验值)＝857.4。
环肽AcF-[OPdCha(N-Me-Phe)R](64)的合成。线性肽Ac-Phe-Orn-Pro-dCha-(N-Me-Phe)-Arg-OH用Fmoc化学进行合成，利用HBTU/DIEA活化以及原位中和在Novabiochem的Fmoc-L-Arg(pbf)-Wang树脂(0.35mmol/g)上进行，利用甲基-L-Phe(281mg，2当量)、Fmoc-dCha(275mg，2当量)、Fmoc-Pro(472mg，4当量)、Fmoc-Orn(Boc)(477mg，3当量)、Fmoc-Phe(542mg，4当量)和Ac2O(4当量)。树脂的裂解和脱保护通过用95％TFA(15mL)处理树脂1小时而实现，乙醚沉淀后得到粗肽(150mg)。环化涉及将rpHPLC纯化的肽(100mg)、BOP(200mg)和DIEA(222μL)在DMF(2mL)中搅拌4小时。真空去除溶剂并将环状肽经rpHPLC纯化(50mg)Rt＝33分钟(梯度：70％A/30％B～0％A/100％B，30分钟)。MS：[M+H]+(计算值)＝871.5，[M+H]+(实验值)＝871.5。
环肽AcF-[{Orn-(δN-Me)}PdChaWR](66)的合成。Boc-(δN-Me-Orn)-OH按照报道的方法(Pol.J.Chem.1988，62，257-261)进行合成。线性肽Ac-Phe-[Orn-(δN-MeCbz)]-Pro-dCha-Trp-Arg-OH利用Boc化学进行合成，用HBTU/DIEA活化以及原位中和在Novabiochem Boc-L-Arg(tosyl)Pam树脂(0.41mmol/g)上进行。将树脂用HF/对甲苯酚处理2小时实现树脂的裂解和脱保护，用乙醚沉淀后得到粗肽。环化涉及将RP-HPLC纯化的肽(100mg)、BOP(200mg)和DIEA(222μL)在DMF(2mL)中搅拌4小时。真空去除溶剂，并将环状肽经rpHPLC纯化。Rt＝11.5分钟(35％B)。MS：[M+H]+(计算值)＝910.5，[M+H]+(实验值)＝910.5。
纯化及表征
粗肽用制备性rp-HPLC利用Vydac C18反相柱(2.2x25cm)纯化。使用1mL/分钟的溶剂A～溶剂B梯度并在214nm检测。收集级分并用离子喷雾质谱(ISMS)测定正确的分子量，用分析性rp-HPLC检测纯度，在WatersDelta-Pak PrepPak C18反相柱(0.8x10cm)(变化梯度例如：0～75％B，60分钟)上进行。乙腈为HPLC级(BDH Laboratories)且TFA为合成级(Auspep)。
表1显示了用来制备环状化合物1-70的反应实例，以及它们用电喷雾质谱(Mass Spec Found)以及在指定洗脱条件下反相HPLC(rp-HPLC)保留时间(Rt分钟)的表征。
表2描述了各个化合物的结构，并列出了它们用髓过氧化物酶分析测量各自的对人分叶核白细胞(嗜中性粒细胞)上C5a受体的受体结合亲和力以及拮抗剂活性。
Figure S06106795220060217D000191
Figure S06106795220060217D000211
Figure S06106795220060217D000231
实施例2
环状化合物的拮抗剂活性
表2显示了实施例1中合成的化合物的结构，以及它们各自用髓过氧化物酶分析测定的对人分叶核白细胞(嗜中性粒细胞)C5a受体的受体结合亲和力和拮抗剂活性。
化合物1-9、16-18、20、21、23、24、27-32、36、38、44、51和59包括在我们较早专利申请PCT/AU98/00490公开的结构通式的宽范围内。但是，表2证实事实上，在这些化合物中，只有1-6、17、20、28、30、31、36和44对人嗜中性粒细胞C5a受体具有可观的拮抗剂活性(IC50<1μM)。其他化合物，7-9、16、18、21、23、24、27、29、32、38、51以及59没有显示可观的拮抗剂活性和/或受体亲和力，在所有的情况下IC50>1μM。
另一方面，化合物10-15、19、22、25、26、33-35、37、39-43、45、47-50、52-58以及60-70没有包括在PCT/AU98/00490范围内，尽管它们的确涉及与所述申请中公开的相同或类似的环状骨架。表2显示了这些新化合物中，10-12、14、15、25、33、35、40、45、48、52、58、60、66和68-70具有可观的拮抗剂活性(IC50<1μM)。然而，其他的化合物(13、19、22、26、34、37、39、41-43、47、49、50、53-57、61-65和67)没有显示可观的拮抗剂活性和/或受体亲和力，在这些情况下，IC50>1μM。
表2中的这些结果使我们能够进一步定义并提炼C5a受体拮抗剂活性所需要的活性药效团的限制条件，以得到或预测亚微摩尔活性的拮抗剂。
表2：70个C5a受体环状拮抗剂的实例的结构以及对人分叶核白细胞的活性
Figure S06106795220060217D000251
Figure S06106795220060217D000261
Figure S06106795220060217D000271
Figure S06106795220060217D000281
Figure S06106795220060217D000291
Figure S06106795220060217D000301
“C5a结合IC50”指与人PMNs实现50％最大结合所需要的化合物浓度。“C5a拮抗剂IC50”指实现50％拮抗从C5a-刺激的人PMNs髓过氧化物酶释放所需要的化合物浓度。框中的区域表示结构之间相对变化的位置。化合物1为从我们前述申请PCT/AU98/00490中得到的先导化合物，这里也包括用于比较。
实施例3：
环状C5a拮抗剂
这些环状拮抗剂以及它们明显的受体-结合亲和力和拮抗剂活性的一些实例显示在3中，其中使用了单字母来表示氨基酸。“d”表示氨基酸的右旋(D)形式。“ND”表示没有测定。
表3
作为C5a拮抗剂的新化合物
 
AcPhe置换 化合物编号   n 结合IC50(μM) 拮抗剂IC50(nM)
MsF[OP-dCha-WR] 10 3 0.47 34
TsF[OP-dCha-WR] 11 3 0.96 291
AcPhg[Opd-Cha-WR] 12 3 0.76 151
AcG[OP-dCha-WR] 13 3 37.2 ND
Ac(o-fluoro)F[OP-dCha-WR] 14 3 0.52 38
Ac(m-fluoro)F[OP-dCha-WR] 15 1 0.39 ND
HC[OP-dCha-WR] 17 3 0.22 31
Hydrogen[OP-dCha-WR] 19 3 >1000 ND
Ms＝甲磺酰基，Ts＝甲苯磺酰基，MeSuc＝甲基琥珀酸酯，Suc＝琥珀酸酯，Ahx＝6-氨基己酸酯，HPhe＝高苯基丙氨酸，Phg＝苯基甘氨酸，HC＝氢化肉桂酰胺基(Hydrocinnamate)
ND＝未测定
 
Pro置换 化合物编号   n 结合(μM) 拮抗剂(nM)  
AcF[O-Hyp-dCha-WR] 25 3 0.27 ND
AcF[O-Thp-dCha-WR] 26 1 75.5 ND
AcF[O-Phe-dCha-WR] 22 3 2.43 ND
Hyp＝反式-羟基脯氨酸，Thp＝顺式-硫代脯氨酸
 
D-Cha置换 实验室编号   n 结合(μM) 拮抗剂(nM)  
AcF[OP-dCha-WR] 3D53，1 13 0.45 28
AcF[OP-dLeu-WR] 31 3 1.13 35
AcF[OPGWR] 42 3 1082 ND
AcF[OP-dVal-WR] 29 3 13.0 ND
AcF[OP-dNle-WR] 36 3 0.53 30
AcF[OP-dTic-WR] 35 3 9.18 15,000
AcF[OP-aic-WR] 34 3 22.71 ND
AcF[OP-dTyr-WR] 40 3 2.16 300
AcF[OP-dArg-WR] 41 3 >100 ND
AcF[OP-dPhe-WR] 33 3 0.26 22
AcF[OP-dhCha-WR] 28 3 0.39 40.5
Aic-氨基茚满羧酸
Tic-四氢异喹啉
dhCha-D-高环己基丙氨酸
 
Trp置换 实验室编号   n 结合(μM) 拮抗剂(nM)  
AcF[OP-dCha-HR] 57 3 23.5 ND
AcF[OP-dCha-FR] 60 3 0.25 32
AcF[OP-dCha-LR] 51 3 18.9 3,000
AcF[OP-dCha-Cha-R] 50 3 11.9 4,500
AcF[OP-dCha-hPhe-R] 61 3 11.5 ND
AcF[OP-dCha-2Nal-R] 53 3 15.8 ND
AcF[OP-dCha-Bta-R] 58 3 0.28 172
AcF[OP-dCha-Flu-R 54 3 28.9 ND
AcF[OP-dCha-1Nal-R] 52 3 0.71 46.6
AcF[OPdCha-Tic-R] 56 3 3.73 10,900
AcF[OP-dCha-G-R] 55 3 >1000 ND
AcF[OPdCha-dTrp-R] 59 3 30.4 ND
hPhe＝高苯基丙氨酸，2Nal＝2-萘基丙氨酸，1Nal＝1-萘基丙氨酸，Bta＝苯并噻吩基丙氨酸，Flu＝芴基丙氨酸，Tyr-O-烷基＝酪氨酸的O-烷基化类似物。Tic＝四氢异喹啉
 
Arg置换 实验室编号   n 结合(μM) 拮抗剂(nM)  
AcF[OPdChaW-Cit] 45 3 6.00 690
AcF[OpdChaW-K] 47 3 24.15 ND
AcF[OpdChaW-hArg] 44 3 1.36 ND
Can＝L-刀豆氨酸，Cit＝瓜氨酸，hArg＝高精氨酸
 
多重置换 实验室编号   n 结合(μM) 拮抗剂(nM)  
AcF[OP-dPhe-dleu-Nal-R] 105 3 3.1 ND
AcF[OP-dPhe-FR] 62 3 5.2 5,210
AcF[DapOPdChaWRC] 151 3 1.84 100
AcF[OP-dPhe-1Nal-R] 63 3 3.1 ND
AcF[OP-dPhe-Y-R] 150 3 69.2 ND
1Nal＝1-萘基丙氨酸，Dap＝2，3-二氨基丙酸，dPhe＝D-苯基丙氨酸
实施例4：
药效团提炼
在表2结果的基础上，我们发展了人分叶核白细胞上C5a受体拮抗活性需要的提炼的药效团，如下所述：
位置“A”能容忍大量基团，包括H(例如化合物17、18)、烷基、芳基、NH2、NH烷基、N(烷基)2、NH芳基、NH酰基(例如化合物1、3、4、5、6)、NH苯甲酰基(例如化合物2)、OH、O烷基、O芳基、NHSO2烷基(例如化合物10)、NHSO2芳基(例如化合物11)，对活性没有不利的作用。
位置“A”取代基的宽容忍性表示在环状肽骨架的附加基团方面受体中有相当的空间。该位置因此可用来添加取代基以改变拮抗剂的水和脂质溶解性，从而提高拮抗剂的口服或透皮吸收。该位置也可连接标记例如荧光标记，对靶细胞有高度亲和力的拮抗剂或多肽序列，例如与C5a氨基酸1-69类似的序列。
位置“B”可为烷基、芳基、苯基、苄基、萘基或吲哚、或D-或L-氨基酸的侧链，例如L-苯基丙氨酸(化合物1)、或L-苯基甘氨酸(化合物12)。不应为D-苯基丙氨酸(化合物8)、L-高苯基丙氨酸(化合物7)、L-酪氨酸(化合物9)、L-高酪氨酸、甘氨酸(化合物13)、L-色氨酸(化合物16)、或L-高色氨酸的侧链。
位置“B”不能容忍宽范围的取代基。似乎L-苯基丙氨酸的苄基不能容忍许多取代，并且不能变得更大。该位置看起来是受体结合所需要的，而不是对拮抗活性本身重要，因为修饰的最大效果是在受体亲和力方面，如IC50测定所示。
位置“C”应该为小取代基，例如D-或L-氨基酸的侧链例如脯氨酸(化合物1)、L-缬氨酸(化合物20)、丙氨酸、反式-羟基脯氨酸(化合物25)，或顺式-硫代脯氨酸(化合物26)。不应该为大的取代基例如L-异高氨酸(化合物21)、D-或L-苯基丙氨酸(化合物22、23)、L-环己基丙氨酸(化合物24)的侧链。
“D”位置应该为大体积的取代基，例如D-氨基酸如D-亮氨酸(化合物31)、D-高亮氨酸、D-环己基丙氨酸(化合物1)、D-高环己基丙氨酸(化合物28)、D-缬氨酸(化合物29)、D-正亮氨酸(化合物36)、D-高-正亮氨酸、D-苯基丙氨酸(化合物33)、D-四氢异喹啉(化合物35)、D-谷氨酰胺(化合物37)、D-谷氨酸(化合物38)、或D-酪氨酸(化合物40)的侧链。不应该为更小的取代基，例如甘氨酸、D-丙氨酸(化合物30)的侧链，体积大的平面侧链如D-色氨酸(化合物32)、大的带电侧链如D-精氨酸(化合物39)或D-赖氨酸(化合物43)，或L-氨基酸如L-环己基丙氨酸(化合物27)。骨架上位置“D”处小的D-氨基酸以及小的或大的L-氨基酸将导致C5a受体亲和力的极大下降。
位置“E”选自L-色氨酸(化合物1)和L-高色氨酸，而不是D-色氨酸(化合物59)或L-N-甲基色氨酸(化合物47)的大侧链；L-苯基丙氨酸(化合物60)而不是L-高苯基丙氨酸(化合物61)；L-萘基(化合物52)而不是L-2-萘基(化合物53)；L-3-苯并噻吩基丙氨酸(化合物58)。不应该是L-环己基丙氨酸(化合物50)、D-亮氨酸(化合物51)、L-芴基丙氨酸(化合物54)、甘氨酸(化合物55)、L-四氢异喹啉(化合物56)，或L-组氨酸(化合物57)的侧链。
环状肽骨架位置“E”的取代基对C5a受体的拮抗活性至关重要。该位置的取代基可限制构象变化，后者通常与拮抗剂反应相关联。这可能是“阻滞”残基，其将拮抗剂固定在受体中并防止受体的构象重组，而构象重组这一点是激动活性必须的。
位置“F”可为下列基团的侧链：L-精氨酸(化合物1)、L-高精氨酸(化合物44)、L-瓜氨酸(化合物45)；或L-刀豆氨酸(化合物48)。而不应该是D-或L-赖氨酸(化合物47)、D-或L-高赖氨酸、或甘氨酸(化合物49)。该位置的取代基大小对得到高受体亲和力很重要。瓜氨酸化合物具有未带电的侧链，但是与该位置的精氨酸相比，仍然具有可观的拮抗剂活性。
位置“X”可为-(CH2)nNH-或-(CH2)n-S-，其中n为1～4的整数，优选地2或3，-(CH2)2O-、-(CH2)3O-、-(CH2)3-，-(CH2)4-、-CH2COCHRNH-、或-CH2-NHCOCHRNH-其中R为任何常见的或不常见的L-或D-氨基酸的侧链。该基团提供了环化连接，例如在化合物1的Arg和Phe残基之间，从而影响环状骨架的结构。此外，该连接基上的取代基例如R能潜在地与受体残基相互作用以增加拮抗剂地亲和力。
环上氨基酸成分的N-甲基化倾向于降低化合物的受体结合亲和力和拮抗剂活性(例如64，65)，尽管鸟氨酸的δ氮的N-甲基化事实上对拮抗剂活性无影响。
骨架上的多重变化对得到相对于1的活性增加的拮抗剂是不利的。因此尽管L-Phe对1中的L-Trp是一种合适的置换(例如60)，拮抗剂活性改变很小，1的组合改变，例如L-Phe代替Trp以及或者L-高Phe代替Arg(例如67)或对氯-苯基丙氨酸代替Arg(例如68)，导致下降的受体亲和力以及下降的拮抗剂活性。类似地，当1中的L-Trp用L-Phe代替且D-Cha用D-Phe代替，化合物失去了根本的活性(例如62)。尽管1中的D-Cha改变为D-Phe仍然导致拮抗剂活性的保持(例如33)，当与L-Phe代替L-Trp的置换一起时候(62)，这种变化就是有害的。
明显地，这些残基在与受体结合中存在协调性，由于单一变化的一种(例如33，60)产生的活性高于两种变化一起进行(例如62)的情形。当Arg被仍然含带电氨基的芳香基团替代的时候(69)，活性显著下降，如当60中的Phe被取代的酪氨酸所替换(70)得到的结果那样。
所有这些变化指出了环状骨架上什么能或什么不能用来得到人PMNC5a受体亲和力和拮抗剂活性。已经公认在其他细胞类型上的C5a受体对侧链具有不同的容忍性，但是环状骨架仍然构成活性化合物的基础。
实施例5
大鼠中逆向被动阿蒂斯反应
逆向被动腹膜阿蒂斯反应按照以前公开的方法进行诱导(Strachan等，2000)，一组大鼠在腹膜抗体沉积之前用AcF-[OPdChaWR](1)经口强饲(10mgkg-1的10％乙醇/90％盐水溶液至终体积200μl)或抗体沉淀30分钟之前适当地口服溶媒对照进行处理。雌性Wistar大鼠(150-250g)用氯胺酮(80mg kg-1腹腔注射)和甲苯噻嗪(12mg kg-1腹腔注射)进行麻醉。
将大鼠的侧面小心地剃毛并在每侧清楚地描绘5个不同的位置。注射抗体10分钟之前，将埃文斯蓝(15mg kg-1i.v.)、鸡卵清蛋白(20mgkg-1i.v.)注射到股静脉诱导在各个皮肤位置逆向被动阿蒂斯反应。在大鼠每侧2个分开的皮肤位置以双份注射兔抗鸡卵清蛋白(只有盐水、100、200、300或400μg抗体，终注射体积30μL)，每只大鼠有10个注射位置。将大鼠放置在加热垫上，并在4小时的处理期间保持麻醉状态，定期采集血液样品。血液在冰上自发地凝结，并且收集血清样品并保存在-20℃。皮肤阿蒂斯反应诱导4小时后，将麻醉的大鼠安乐死，并从各阿蒂斯反应位点采集10mm2面积的皮肤。将皮肤样品在10％缓冲的福尔马林中至少保存10天，然后利用苏木精和曙红染色进行组织学分析。此外，另一组皮肤样品放置在1mL甲酰胺中过夜，在650nm处测定埃文斯蓝萃取液的吸光度，作为血清渗漏到皮肤中的指标。图1显示了用AcF-[OPdChaWR]静脉内、口服或局部前处理后皮内注射0-400μg位置-1的兔抗鸡卵清蛋白后皮肤冲压提取液的光密度。数据显示为650nm处吸光度与血浆吸光度的百分比的平均值±SEM(n＝3-6)。*表示当与阿蒂斯对照值相比P值<0.05的情况。
将大鼠用C5aR拮抗剂，AcF-[OPdChaWR](1)的TFA盐进行处理，或者静脉内(0.3-1mgkg-1的包含10％乙醇的200μL盐水，皮肤阿蒂斯开始之前10min)、经口(0.3-10mgkg-1的200μL盐水，包含10％乙醇，经口强饲，在处理之前18小时断食的大鼠的皮肤阿蒂斯之前30分钟)或局部(200-400μg位置-1，皮肤阿蒂斯反应开始之前10分钟)，或用适当的溶媒对照。拮抗剂局部应用涉及应用20μl的10-20mgmL-1溶液，溶解在10％二甲基亚碸(DMSO)中，在阿蒂斯反应开始之前10分钟将其直接涂抹在各侧皮肤上，。
从用埃文斯蓝处理的大鼠盐水-只有注射位置只作为抗原对照，从用埃文斯蓝加上局部只有DMSO处理大鼠的盐水-单用注射位置用作溶媒对照，用埃文斯蓝加上或者静脉内、口服或局部拮抗剂处理大鼠的盐水-单用注射位置作为拮抗剂对照，并且埃文斯蓝加上皮肤兔抗鸡卵清蛋白作为抗体对照。局部应用肽AcF-[OPGWR]作为无活性肽对照，其具有与AcF-[OPdChaWR](1)类似的化学组成以及溶解性，但是在分离的人PMNs中IC50结合亲和力>1mM。AcF-[OPGWR]也溶解在10％DMSO中，并阿蒂斯反应开始之前10分钟以400μg位置-1的剂量进行局部应用。
TNFα测定
血清TNFα浓度用酶联免疫吸附分析(ELISA)试剂盒进行测量。所用的抗体对为兔抗大鼠TNFα抗体偶联生物素化的鼠抗-大鼠TNFα抗体。图2显示用AcF-[OPdChaWR]静脉内、口服或局部预处理大鼠组的皮肤阿蒂斯反应开始后定期的时间间隔的血清TNFα浓度。数据显示为平均值±SEM(n＝3-6)。*表示与阿蒂斯对照值相比，P值<0.05。
白介素-6测定
如前所述地ELISA方法用来测量血清和腹膜洗液白介素-6(IL-6)浓度(Strachan等，2000)。
病理学评价
将大鼠皮肤样品在10％缓冲的福尔马林中固定至少10天，并用苏木精和曙红利用标准的组织学技术进行染色。皮肤样品以盲检的方式分析病例证据，大鼠PMN浸润程度以0-4级进行评分。皮肤阿蒂斯反应开始产生间质嗜中性粒细胞的增加，按照下述方式进行定量。切片评分为0，如果没有检测到异常。评分为1表示血管中出现增加的PMNs，但是炎性细胞没有迁移出内腔。评分2和3表示在组织间隙中出现增加数目的PMNs，并且在血管的周围出现更明显的炎性细胞聚集。表示严重病理异常的最大评分4存在于下述特征的皮肤切片中，伴随PMNs过量浸润到组织中并且这些细胞迁移出血管。图3显示皮内注射增加量的抗体导致皮肤样品病理指数评分的剂量响应增加(A)。显示了用AcF-[OPdChaWR]静脉内(B)(n＝3)、经口(C)(n＝3)和局部(D)(n＝3)预处理的大鼠中皮肤样品进行皮内注射盐水或400μg位置-1抗体(n＝5)的试验数据。数据显示为平均值±SEM。*当与阿蒂斯值相比，用无参数的t-检验P≤0.05。
实施例6
C5a拮抗剂对大鼠中肠缺血-再灌注损伤模型的影响
所有实验之前12小时，将雌性Wistar大鼠(250-300g，n＝132)禁食并且只给予水。将动物经腹膜内注射80mgkg-1氯胺酮和10mgkg-1甲苯噻嗪进行麻醉，并在整个过程中，将大鼠放置在加热垫上以保持正常的体温。通过中线切开打开腹部以暴露肠系膜上动脉(SMA)。从通过一定长度的聚乙烯管打环的缝合丝形成一种非-创伤性闭合动脉装置。通过牵引至环的末端闭合SMA。将聚乙烯导管插入股静脉以输入1mgkg-1AcF-[OPdChaWR](1)的5％乙醇溶液或无菌无热源盐水，体积0.2ml。用2分钟完成输液。经口施用AcF-[OPdChaWR](1)(0.3、1、10mgkg-1)在闭合之前60分钟通过强饲(0.2ml盐水的25％乙醇溶液)而实现。肠缺血通过将SMA夹住30分钟进行诱导，之后移去闭合缝合，然后监控再灌注120分钟。假手术大鼠按照同样的方式进行处理，除了省略脉管闭合，并且输注0.2ml无菌、无热源盐水或强饲0.2ml盐水的25％乙醇溶液。在估计PMN数目的时间期间180分钟内以定期的时间间隔将血样品(50μL)收集到肝素化的Eppendorf管中。在不同系列的同样实验中，在180分钟的定期时间间隔点采集全血并在冰上凝结，并且收集血清或血浆样品并在-20°℃保存以进行后续的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、触珠蛋白(Hp)和天冬氨酸转氨酶(AST)浓度的测定。在120分钟再灌注期间结束的时候，将动物用过量的戊巴比妥进行安乐死。取出闭合的回肠部分，将内腔用盐水洗涤，并将肠吸干然后称重。将样本在烤箱中在80℃干燥24小时得到组织的干重。通过评价湿和干组织重量比判断肠水肿。此外，富集缺血和正常肠样本，并用盐水洗涤并立即在10％缓冲的甲醛-盐水固定以进行组织学研究。
图4显示与假手术动物相比，缺血-再灌注后小肠的湿干重之比显著地升高。与未处理的缺血-再灌注(I/R)动物相比，用C5a受体拮抗剂AcF-[OPdChaWR]1mg/kg i.v.和10mg/kg p.o.处理显著地减少组织水肿。数据显示为平均值±SEM(每组中，n＝4-6)。*，P<0.05vs.假手术动物。+，P<0.05vs.I/R动物。
嗜中性白血球减少分析
将用于PMN计数的血(50μL)放置在肝素化的管中并在等体积的Histopaque1083(Sigma，U.S.A.)上分层，分离PMNs并在血细胞计数器上进行细胞计数。PMN的浓度值表示为SMA闭合之前即刻得到的值的平均百分数±SEM。
图5显示与假手术动物(A，B)相比，消化道缺血-再灌注引起显著的循环PMN浓度下降。用C5a受体拮抗剂AcF-[OPdChaWR]1mg/kg i.v.(A)和10mg/kg p.o.(B)进行前处理的大鼠显著地抑制缺血-再灌注诱导的嗜中性白血球减少。1mg/kg p.o.(B)处理的动物显示没有抑制嗜中性白血球减少。数据显示为平均值±SEM(每组n＝6)。*等于P<0.05vs.对照动物。线显示30分钟缺血期。
肿瘤坏死因子-α测定
血清TNF-α浓度用酶联免疫吸附分析(OptEIA，Pharmingen，USA)，按照生产者的说明。血清样品中TNF-α的浓度从标准曲线通过线性回归分析进行测定。
图6显示与假手术动物相比，消化道缺血-再灌注产生显著的血清TNF-α升高。用C5a受体拮抗剂AcF-[OPdChaWR]1mg/kg i.v.和1-10mg/kg p.o.前处理的大鼠完全抑制血清TNF-α水平的变化。数据显示为平均值±SEM(每组n＝6)。*，P<0.05vs.假手术动物。线显示30分钟缺血期。
触珠蛋白分析
血清Hp利用Hp分析试剂盒(Tridelta Development Ltd.U.K)进行测量，根据生产者的说明。血清样品中的Hp浓度利用线性回归从标准曲线中测定。
图7显示与假手术动物相比，消化道缺血-再灌注产生显著增加的血清触珠蛋白。用C5a受体拮抗剂AcF-[OPdChaWR]1mg/kg i.v.和1，10mg/kg p.o.进行大鼠前处理显著地抑制血清触珠蛋白水平的增加。数据显示为平均值±SEM(每组n＝4-6)。*，P<0.05vs.假手术动物。+，P<0.05vs.I/R动物。
天冬氨酸转氨酶分析
血浆AST(AST/GOT；Sigma，USA)浓度在收集血浆48小时内根据生产者的说明进行测量。血浆AST浓度从校准曲线得到。结果以Sigma-Franke(SF)单位/ml进行表述。
图8显示与假手术动物相比，消化道缺血-再灌注导致显著增加的血浆天冬氨酸转氨酶。与未处理的I/R动物相比，用C5a受体拮抗剂AcF-[OPdChaWR]1mg/kg i.v.和1，10mg/kg处理显著地降低消化道缺血-再灌注诱导的天冬氨酸转氨酶。数据显示为平均值±SEM(每组n＝6)。*，P<0.05vs.假手术动物。+，P<0.05vs.I/R动物。
组织病理学
将样本在10％甲醛-盐水中固定，包埋在石蜡中，连续切片，并用苏木精和曙红染色。以盲检的方式，让一位训练的观察者读片并评分。肠组织损伤的程度利用前述0～8级分级评分进行判断(Chiu等，1970)。
图9显示与假手术动物相比，消化道缺血-再灌注导致显著的肠损伤。与未处理的I/R动物相比，用C5a受体拮抗剂AcF-[OPdChaWR]1mg/kg i.v.和1，10mg/kg处理显著地降低消化道缺血-再灌注诱导的组织损伤。数据显示为平均值±SEM(每组n＝6)。*，P<0.05vs.I/R动物。
实施例7
大鼠单关节抗原-诱导的关节炎
雌性Wistar大鼠(150-250g)从Central Animal Breeding House，Universityof Queensland获得。将甲基化的牛血清白蛋白(mBSA)(0.5mg)溶解在Freund全佐剂(0.5mg)中并超声以产生均匀的悬浮液。在第1天和第7天每只大鼠接受皮下注射这种悬浮液(0.5mL)。在第12-28天，将大鼠隔离到分离的笼子中，每天监测体重以及进食和进水情况。大鼠接受包含AcF-[OPdChaWR](1)或者普通自来水龙头水或饮用水。每天监测体重和进水情况，并且大鼠在试验的12-28天接受日剂量为1mg/kg/天的C5aR拮抗剂AcF-[OPdChaWR](1)。在第14天，将大鼠麻醉并将其后肢剃光。每只大鼠接受通过关节内(100μl)注射在左膝注射mBSA(0.5mg)，右膝接受盐水。膝盖只接受盐水处理的大鼠接受正常的饮水并作为盐水对照，大鼠接受AcF-[OPdChaWR](1)饮用水溶液的大鼠的盐水处理膝盖作为拮抗剂对照。
在第28天将大鼠安乐死，并将全血收集到Eppendorf管中并在冰上凝结。将血样品离心(11,000rpm x3分钟)并收集血清并在-20℃储存直至用ELISA进行血清细胞因子分析。将各膝盖荚膜用100μL盐水灌洗，并用血细胞计数器进行总细胞计数。此外，将部分膝关节洗液滴到玻璃载波片上，并使之空气干燥。一旦干燥，将细胞用不同的染料(Diff Quick)进行染色，并用40x镜头显微镜进行差示细胞计数。将各关节的其余洗液在-20℃储存直至后续用ELISA进行关节内细胞因子水平分析。去除各膝关节，并用解剖刀将皮肤分离并进行固定。将膝关节样品在10％缓冲的福尔马林储存≥10天。然后将膝关节用蒸馏水洗涤并在饱和的EDTA溶液中放置21天进行脱钙并包埋在石蜡中。
膝组织样品利用上述实施例6中描述的标准组织学技术进行制备并用苏木精和曙红染色。以盲检的方式分析组织载波片。组织切片用0-4级评分，0分表示无异常，随着滑液细胞增殖、炎性细胞浸润、软骨破坏以及出血的出现，评分升高。没有样品中出现明显的骨侵蚀。在进行TNFα和IL-6水平ELISA分析时候将血清和滑液样品解冻。从标准曲线测定浓度，利用前述实施例6中描述的ELISA方法。
图10显示在第-2～+14天经口施用AcF-[OPdChaWR]对关节炎右膝关节肿胀的抑制，而图11显示在右膝关节关节洗液中TNF-α和IL-6水平的抑制。未处理指动物未用AcF-[OPdChaWR]处理但是在敏化后右膝用抗原刺激。
实施例8
C5a拮抗剂局部皮肤应用
本发明教导了局部应用C5a拮抗剂可用来治疗涉及补体系统激活的局部炎性疾病。在该实施例中，我们证实局部应用C5a拮抗剂也可产生全身药理作用，并在循环系统出现相应浓度的C5a拮抗剂。
在局部皮肤应用后，考察了环状拮抗剂的体内药理性质。使用了内血毒症模型，其中1mg/kg Escherichia coli脂多糖(LPS；血清型55：B5，Sigma，USA，以100mg ml-1的水溶液4℃储存)，经i.v注射到大鼠中，产生循环PMN水平和血压的急性变化。这些参数在有和无C5aR拮抗剂(1mg/kg i.v或50mg/kg/大鼠局部)条件下测定。该研究显示局部应用C5a受体拮抗剂是一种有效的转运化合物的方法，观察到全身性药理活性。
将重200-250g的雌性Wistar大鼠用来进行体内测试所有的C5a受体拮抗剂。将大鼠按照前述方法进行麻醉，并转移到加热垫上以保证在整个试验过程中保持体温。将导管插入到股静脉中，用缝合线进行保护，并充满100μL肝素化盐水。对大鼠施用拮抗剂或溶媒，静脉内(1mg kg-1的200μL盐水，包含10％乙醇，LPS刺激之前10分钟)或局部(10mg位置-1的50％二甲基亚砜/H2O，补体刺激之前60分钟)。在拮抗剂或溶媒对照的iv用药10分钟之后或局部用药60分钟之后，对大鼠经股导管i.v输注LPS(1mg kg-1i.v的100μL盐水溶液)、重组人C5a(2μgkg-1的100μL溶液)，或溶媒对照。所有i.v输注试剂在2分钟时间注射完毕，然后注射100μL盐水以保证药物的完全输送。
在药物和LPS或C5a给药的时间点，从尾静脉采集全血样品(0.1mL)。并在相对于注射LPS(时间0点)的-15、0、5、10、15、30、60、90、120和150分钟采集样品，并放置在含肝素(500单位/mL)的管中。为了分离PMNs，将100μL血在200μL的Histopaque1077(Sigma U.S.A.)溶液上分层并在400xg室温(25℃)离心30分钟。分出富含血小板的血浆上清液层、单核细胞和淋巴细胞界面以及Histopaque的分离层并弃去，留下富含PMN和红细胞层。将9mL冷蒸馏水(4℃)加入到残留的沉淀中并振荡40秒以溶解红血细胞。将Dulbecco’s磷酸盐缓冲的盐水(10x浓度)加入以恢复等张性。然后将细胞在400xg在10℃离心15分钟。将得到的上清液弃去，剩下PMNs沉淀。将PMNs进一步用9mL盐水洗涤，并再在400xg在10℃离心10分钟。再将得到的上清液弃去，将得到的沉淀再悬浮于100μL盐水中并充分混合。在血细胞计数器上对PMNs计数。将各时间点的细胞数计算为补体刺激或LPS之前时间0点的细胞总数的百分比。
将用于本研究的雌性Wistar大鼠分成下述处理组：
(a)单用LPS，其中输注100μL5％乙醇(-15分钟)+1mg/kg LPS(0分钟)；
(b)乙醇对照，其中在-15分钟输注100μL5％乙醇以考察乙醇对大鼠中测定参数的影响；
(c)拮抗剂对照，其中在-15分钟经i.v.输注1mg/kg环状拮抗剂；
(d)i.v拮抗剂+LPS，其中输注1mg/kg环状拮抗剂(-15分钟)以及1mg/kgLPS(0分钟)；以及
(e)局部-应用拮抗剂+LPS，其中10mg/大鼠的拮抗剂涂抹在大鼠的腹部，然后在0分钟的时候iv输注LPS。
将C5a拮抗剂例如3D53(PMX53)以应用剂量50mg/kg对大鼠皮肤给药在循环血浆中产生药理显著水平的药物。药物在多种溶剂，例如二甲基亚砜(DMSO)、丙二醇(PG)以及水以及多种组合中的应用导致循环中出现药物的药理相关浓度，如图12中所示。这表明皮肤应用3D53的DMSO/蒸馏水或丙二醇(PG)/水溶液导致在15分钟内在循环血浆中出现C5a拮抗剂，并且显著的水平持续至少4小时。
实施例9
皮肤应用后C5a拮抗剂的全身性作用
如实施例8中所示，对动物皮肤局部应用C5a拮抗剂在循环中产生药理相关的药物水平。为了显示这些水平具有全身性活性，测定了这些循环水平的C5a拮抗剂抑制中性白细胞减少症的效果，后者为i.v.给药C5a时的作用。
将C5a受体拮抗剂3D53以(10mg/大鼠)的50％丙二醇和50％蒸馏水进行给药。将组合物均匀地涂抹在腹部皮肤(4x8cm2)上30分钟，然后将C5a经i.v.注射2μg/kg的200μl盐水溶液。在下列时间点采集血样：-30(药物给药前)、0(C5a注射前)以及5、15、30、60和120分钟以测定循环PMNs。如图13中所示，局部应用化合物3D53的确预防C5a的中性白细胞减少症作用。
实施例10
局部应用C5a拮抗剂抑制LPS的全身性效果
将C5a拮抗剂，3D53(化合物1)以及化合物17和化合物45以剂量10mg/大鼠在50％DMSO/50％H2O中进行局部应用，如上所述。皮肤应用拮抗剂60分钟后，将LPS以1mg/kg剂量经i.v.进行注射。在LPS注射后，监测循环PMN水平150分钟，并计算PMN水平相对于注射LPS时间0点的百分变化。得到的结果，如图14中所示，表明局部应用的每种C5a拮抗剂抑制响应i.v.LPS的嗜中性白血球减少，并且这种抑制可与i.v.注射药物后观察到的抑制相比。
实施例11
C5a拮抗剂对缺血-再灌注损伤的作用
在腹主动脉瘤手术后以及外伤性压伤后，下肢缺血-再灌注(I/R)损伤是一个严重的问题(Kerrigan和Stotland，1993)。骨骼肌肉组织的缺血和随后的再灌注刺激受影响肌肉的炎性反应，以及在其他组织中诱导损伤(Gute等，1998)。在严重的肢体缺血情况下，发生的再灌注与多全身性组织衰竭导致的高死亡率相关联(Defraigne和Pincemail，1997)。为了考察C5a受体拮抗剂对大鼠中下肢缺血-再灌注(I/R)后多种局部和远端损伤参数的抑制能力，将大鼠后肢进行缺血2小时和再灌注4小时。这种止血带刺激模型已经被惯犯地用作下肢I/R损伤的模型。
将大鼠进行双后肢缺血2小时和再灌注4小时。药物处理大鼠或在缺血前10分钟或再灌注之前10分钟接受AcF-[OPdChaWR](1mg/kg)i.v.，或缺血之前30分钟口服(10mg/kg)。测定循环中肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、丙氨酸和天冬氨酸转氨酶(ALT/AST)、肌酸酐、血尿氮(BUN)、分叶核白细胞(PMNs)和钙(Ca++)和钾(K+)的水平。这些生化指标公知可以反映I/R事件后的组织或器官损伤。其他测量的参数包括肺、肝脏和肌肉中的尿蛋白水平、肌肉水肿和髓过氧化物酶(MPO)浓度以及肝脏匀浆中的TNF-α浓度。与假手术动物相比，这些参数中没有观察到明显的变化，表明单用药物没有这些标志物变化所定义的副作用。肢体I/R损伤特征为CK、LDH、ALT、AST、肌酸酐、BUN、蛋白尿、PMNs、血清K+、肌肉水肿、器官MPO以及肝脏匀浆TNF-α浓度的显著升高，但是血清Ca++浓度的显著下降。当大鼠接受AcF-[OPdChaWR]处理的时候，这些参数均有显著改善。
本研究按照National Health&Medical Research Council of Australia的指导规则进行，并且实验方案得到University of Queensland Animal EthicsCommittee的批准。重250-300g的雌性Wistar大鼠禁食过夜，然后通过腹腔注射注射6mg/kg甲苯噻嗪和120mg/kg氯胺酮进行麻醉。通过另外注射氯胺酮维持实验过程中的麻醉。将大鼠放置在加热垫上以保持正常的体温，并将聚乙烯导管插入到右颈静脉以输入C5a拮抗剂或7％乙醇/盐水。双后肢缺血按照下述方式诱导：通过在每只后肢较大转节上应用乳胶o-环(市售环形物；Hayes Veterinary Supplies，Brisbane，Australia)。缺血2小时后，切开乳胶环并去除并将肢体再灌注4小时。使用了6个实验组：
(a)假手术，
(b)只有缺血，
(c)只有I/R-，
(d)I/R+C5a拮抗剂(1mg/kg，i.v.)，缺血前10分钟给药，
(e)I/R+C5a拮抗剂(10mg/kg，p.o.)，缺血前30分钟给药，以及
(f)I/R+C5a拮抗剂(1mg/kg，i.v.)，再灌注前10分钟给药。
假手术动物不进行任何缺血或再灌注，并且只有缺血的动物用止血带2小时没有后续的再灌注。其他所有实验组进行2小时缺血以及4小时的再灌注。假手术、只有缺血以及I/R组在缺血前10分钟输注7％乙醇/盐水之，而不是药物。在整个实验过程中，从尾静脉采血，并且血清或血浆在4℃或-20℃保存以进行后续的生化分析。在研究的最后阶段收集尿液以测定尿蛋白水平。在实验结束的时候，将大鼠实行安乐死，并取出肺、肝脏以及腓肠肌肌肉部分并评估水肿、嗜中性粒细胞集聚以及进行肝脏TNF-α研究。
所有的实验结果表示为平均值±平均值的标准误差(SEM)。数据分析利用GraphPad Prism3.0软件(GraphPad Software，Inc.USA)进行。假手术和只有I/R-组之间的统计学比较利用单变量(one-way)分析然后进行Dunnett比较后检验(post-test)分析。统计学显著判断标准为P<0.05。
(a)肌酸激酶和乳酸脱氢酶的抑制
利用CK试剂盒(Sigma，St.Louis，USA)根据生产厂家说明，测量缺血后即刻、以及再灌注1、2和3小时后以及在实验结束时采得的血清样品中的肌酸激酶(CK)的循环水平。在只接受I/R动物中，止血带放松后10分钟采集血清以进行CK测定。再灌注2小时后采集的样品进行1∶5稀释。
测量缺血即刻，再灌注1、2和3小时后以及实验结束时血清样品中的乳酸脱氢酶(LDH)循环水平。在只接受I/R动物中，止血带放松后10分钟采集血清以进行LDH测定。根据厂家说明利用LDH试剂盒(Sigma)LDH测定浓度，再灌注2小时后取得的样品进行1∶4稀释。对于这两种酶，将所有的样品在4℃保存并在收集后24小时内分析。结果用Sigma-Franke(SF)单位/mL表示。
如图15中所示，在再灌注1、2、3和4小时后，双后肢I/R产生CK和LDH循环水平升高，两种酶水平都在4小时后达到峰值。与假手术大鼠相比，只有缺血的大鼠没有显示出明显的CK或LDH水平升高(CK，58.3±23.5单位/mL；LDH，269.5±72.8单位/mL；P>0.05；n＝4)。与假手术大鼠相比，在只有I/R的大鼠中，止血带释放10分钟后，这些酶的水平没有显著的增加(CK，73.9±28.1单位/mL；LDH，395.3±123.2单位/mL；P>0.05；n＝4)，表明在4小时期间再灌注-依赖的升高。再灌注显著地升高CK和LDH的血浆水平(P<0.05)。缺血之前用C5a拮抗剂处理的大鼠，或者i.v.(1mg/kg)或口服(10mg/kg)，具有类似的显著地下降的CK和LDH水平，与只接受I/R大鼠相比(P<0.05)。此外，再灌注之前用C5a拮抗剂(1mg/kg)i.v.处理的大鼠也显示出显著的CK和LDH水平的抑制，具有与缺血前处理大鼠类似的幅度(P<0.05)。所有药物处理大鼠在再灌注期间的这些酶的水平显著地高于假手术大鼠组的水平，显示C5a拮抗剂的部分抑制作用(P<0.05)。
(b)丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶的抑制
测量实验结束以及再灌注后2和3小时取得的血浆样品中丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)的循环水平。只接受I/R的动物在止血带释放后10分钟采集血清以测定ALT和AST。用ALT/AST试剂盒(GPT/GOT；Sigma)，根据厂家说明测定ALT和AST的浓度，测定在收集血浆24小时之内进行，血浆分析前储存在4℃。结果以SF单位/mL表示。
如图16中所示，再灌注2、3或4小时后，肢体I/R导致血浆中ALT和AST的升高，两种酶4小时后达到浓度峰值。与假手术大鼠相比，只接受2小时缺血的大鼠的ALT或AST水平没有显著升高(ALT，12.9±4.6单位/mL；AST，91.4±10.4单位/mL；P>0.05；n＝4)。在只接受I/R大鼠中，止血带松开10分钟后，与假手术大鼠相比，两种酶的水平没有显著增加(ALT，18.1±4.4单位/mL；AST，105.9±21.3单位/mL；P>0.05；n＝4)，再次表明再灌注-依赖的升高。在所有3组用C5a拮抗剂处理的大鼠中发现具有类似的ALT和AST水平的显著下降，与只接受I/R大鼠相比(P<0.05)。再灌注4小时后，而不是在2或3小时，与假手术大鼠相比，药物处理大鼠具有显著地上升的ALT水平(P<0.05；图16A)。与此形成对比的是，与假手术大鼠相比，这些药物处理大鼠在所有测量时间点具有升高的AST水平，表明C5a拮抗剂对ALT和AST的不同抑制作用(P<0.05；图16B)。
(c)钾和钙离子血清水平变化的抑制
在各实验结束后以及对只接受I/R动物止血带释放10分钟后，用火焰光度计(Corning435；Corning，U.S.A.)测量钾离子(K+)的血清水平。在实验结束后以及对只接受I/R的动物在止血带释放10分钟后，利用钙试剂盒(Sigma)测量血清钙离子(Ca++)浓度。将样品储存在-20℃并在收集后2周内测量K+和Ca++水平。结果以mmol/L表示，并总结在表1中。
表1
缺血以及再灌注4小时后大鼠血清阳离子水平的改变
Figure S06106795220060217D000481
数据为平均值±SEM.
a大鼠数
b缺血/再灌注
*P<0.05vs I/R-只有
+P<0.05vs假手术
血尿氮、肌酸酐以及尿蛋白的抑制
实验结束时采集的血清样品中血尿氮(BUN)循环水平的测量利用尿氮试剂盒(Sigma)根据厂家说明进行。将样品储存在-20℃并在收集后2周内分析。实验结束时采集的血清样品中肌酸酐的循环水平利用肌酸酐试剂盒(Sigma)根据厂家说明进行。在实验结束之前1小时收集的尿样品中的蛋白浓度利用蛋白试剂盒(Sigma)根据厂家说明进行。将样品储存在4℃并在收集后24小时内分析。所有这三种参数以mg/dL表示，如表2中所示。
表2
缺血以及再灌注4小时后大鼠肾脏损伤标志物的改变
Figure S06106795220060217D000491
数据为平均值±SEM.
a大鼠数
b血尿氮
c缺血/再灌注
d没有检测到
*P<0.05vs I/R-只有
+P<0.05vs假手术
与假手术大鼠相比，再灌注4小时后在只接受I/R-大鼠中观察到高钾血症(P<0.05)。与只接受I/R的大鼠相比，在所有3组药物处理组中的大鼠具有显著地下降的K+水平，再灌注之前处理的大鼠显示出接近正常的水平(P<0.05)。缺血以及再灌注4小时后，与假手术动物相比，只接受I/R的大鼠具有显著地下降的血清Ca++浓度(P<0.05)。在所有3组药物处理组中的大鼠显示出类似的I/R-诱导的Ca++水平下降的抑制作用(P<0.05)。药物处理I/R大鼠中以及只有缺血大鼠中K+和Ca++二者的水平与假手术大鼠中的二者水平没有显著的差别(P>0.05)。在只接受I/R-大鼠中止血带释放10分钟后这些离子的水平(K+，5.27±0.49mmol/L；Ca++，2.50±0.17mmol/L；P>0.05；n＝4)与假手术大鼠中的水平也没有显著的差别。
与假手术大鼠相比，缺血以及再灌注4小时后，只接受I/R大鼠具有显著升高的血清BUN和肌酸酐水平以及增加的尿蛋白浓度(P<0.05)。与假手术大鼠相比，单独缺血2小时没有引起这些参数中的任何一种上升(P>0.05)。与只接受I/R大鼠相比，在所有3组用C5a拮抗剂处理的大鼠具有显著地降低的这些参数水平(P<0.05)，并且与假手术大鼠相比，这些水平没有显著的不同(P>0.05)。
分叶核白细胞数目以嗜中性粒细胞聚集的抑制
测量缺血之前即刻采集以及在实验结束时采集的血样品中的循环PMNs，按照Strachan等，(2000)描述的方法。最终样品中的PMNs数表述被缺血前数目的平均百分比±SEM。
如图17A中所示，与假手术大鼠相比，再灌注4小时后只接受I/R大鼠中的循环PMNs显著地升高(P<0.05)。与假手术大鼠相比，只有缺血处理的大鼠没有显著的PMNs升高(P>0.05)。在所有的3组药物处理组中大鼠的PMN数与假手术大鼠中的数值没有显著的不同(P>0.05)，并且与只接受I/R大鼠相比，显著地下降(P<0.05)，缺血前用i.v.(1mg/kg)处理的大鼠显示出最大的抑制作用。
嗜中性粒细胞向大鼠中肝脏、肺和肌肉的浸润通过测量髓过氧化物酶(MPO)的活性水平来判断。在实验结束时，得到肺(～0.5g)、肝脏(～1g)以及左下肢肌肉(～1g)并称重然后用1mL磷酸盐缓冲的盐水(PBS)进行匀浆。然后将样品进行超声处理，肝脏和肺样品20秒，或肌肉样品60秒。离心后(14,000xg，10分钟，22℃)，将得到的上清夜立即用来测量MPO水平。分析混合物由o-dianasidine(2.85mg/mL；Sigma)、过氧化氢酶(0.85％)以及1∶40稀释的样品的PBS溶液组成。底物加入5分钟后，读取450nM处的吸光度，并将结果以吸光度单位/克组织表示。
将在大鼠后肢肌肉、肺以及肝脏MPO的活性水平作为进入组织组织的嗜中性粒细胞的测定(Kyriakides等，2000)。如图17B、C和D中所示，与假手术大鼠大鼠相比，只接受I/R大鼠的后肢肌肉、肺以及肝脏中的MPO活性有显著的升高(P<0.05)，而假手术大鼠、只有缺血大鼠在这些组织的任何一种中MPO的活性没有显著的增加(P>0.05)。与只接受I/R大鼠相比，所有3组药物处理大鼠在所有的组织中有显著下降的MPO活性(P<0.05)，与假手术大鼠相比，其水平没有显著的不同(P>0.05)。
对肝脏匀浆TNF-α的抑制
肝脏匀浆上清样品中TNF-α水平的测量，利用酶联免疫吸附分析试剂盒(OptEIA，Pharmingen，USA)，如以前所述(Strachan等，2000)方法进行。将来自肝脏匀浆样品上清液进行1∶10稀释然后用于分析。将上清储存在-20℃，并在收集后2周内分析样品。结果以ng/g组织表示。如图18中所示，与假手术大鼠的样品相比，来自只接受I/R大鼠的肝脏匀浆样品显著增加的TNF-α浓度(P<0.05)。只有缺血大鼠中的TNF-α水平与假手术大鼠没有显著的不同(P>0.05)。与只接受I/R的大鼠相比，在药物处理大鼠中，所有3组具有类似的下降的TNF-α浓度(P<0.05)，与假手术动物相比，没有显著的不同(P>0.05)。
肌肉水肿的抑制
将在实验结束时得到的右后肢肌肉(～1g)称重并在80℃烤箱放置24小时，然后再称重。测定湿干重比，并作为肌肉水肿的测定指标。如图19中所示，与假手术动物相比，只接受I/R大鼠后肢肌肉的湿干重比显著地增加(P<0.05)。只有缺血动物中的比例与假手术动物没有显著的不同(P>0.05)。与只接受I/R大鼠相比，在所有3组药物处理大鼠中，存在类似的下降的湿重-干重比(P<0.05)，并且这些值与假手术动物中的值没有显著的不同(P>0.05)。
结果表明接受2小时的止血带-诱导的双后肢缺血以及再灌注4小时的大鼠遭受局部损伤以及肺、肝脏以及肾脏损伤，如用多种组织压力指标测定。与假手术动物相比，只接受缺血的大鼠在疾病标志物方面没有显著的改变。与假手术动物相比，再灌注10分钟后从接受只有I/R处理的动物采集的血也没有显著的CK、LDH、AST、ALT、K+或Ca++血浆或血清水平改变。局部骨骼肌肉损伤的严重性通过再灌注后4小时肌肉水肿以及嗜中性粒细胞聚集以及再灌注期间血清CK和LDH的增加来评估。胞质CK发现主要在肌肉中，并且时可靠的肌肉组织损伤标志物(Tay等，2000)。乳酸脱氢酶也是一种见于肌肉的胞质酶，但是也存在于许多其他组织中(Carter等，1998)。因此，LDH是一种特异性稍差的肌肉损伤测量，但是仍然可作为一般组织损伤的测量。
在接受缺血以及再灌注处理的动物的肺、肝脏以及肾脏中检测远端器官损伤指标。通过测量肺软组织中嗜中性粒细胞聚集的增加来评价肺损伤。通过测量肝TNF-α以及嗜中性粒细胞聚集的增加，以及通过测量ALT和AST血浆水平来定量肝损伤。尽管ALT和AST血浆水平的增加典型地可用作肝脏病理学地标志物，但是这两种酶也见于肌肉中，因此部分增加任何地源于肌肉，而不是肝脏损伤(Tay等，2000)。骨骼肌肉I/R后肾机能障碍较为常见(Tanaka等，1995)。我们发现I/R大鼠中血清BUN和血浆肌酸酐增加。但是，肌酸酐，并且特别是BUN，也源自肌肉，并且观察到的增加也可源于肌肉损伤(Carter等，1998)。我们发现I/R大鼠中蛋白尿右相当大的增加，表明一定程度的肾损伤。
已经发现，在该模型中，C5a拮抗剂AcF-[OPdChaWR]抑制许多局部组织以及远端器官损伤的疾病标志物。这些结果表明C5a在骨骼肌肉I/R损伤病理生理中的关键作用。由于人中下肢缺血和再灌注较高的并发症发病率，本发明的C5a受体拮抗剂代表了的一种将来可能的这些并发症的治疗，特别是当I/R损伤可以预计的情况，例如在手术操作中。C5a拮抗剂阻滞促炎性细胞因子产生以及嗜中性粒细胞转运的能力可能是其疾病调节特性中的关键因素。这里的口服活性证实这种药物性质可广泛用于临床情况。
讨论
本发明描述了一系列包含构象限制的扭转环状分子，其具有结合细胞的预先构成，也可于人C5a结合。本发明化合物的主要特征在于环状骨架表现处的预先构成的扭转构型，其至少3各疏水基团聚集到相邻的空间，创造了疏水表面‘结构部分(patch)’。
拮抗剂的这种扭转构象将使环状肽与跨膜区域中在或邻近于人C5a的C-端也结合的C5a受体位置结合。
这里描述的结果能够设计和开发甚至更强活性的构象限制的小分子C5a拮抗剂。理论上这些环状拮抗剂的特征也可用来设计不相关的非-肽模板，其类似地取代基投射成与当这些C5a受体拮抗剂受体结合时候占据的类似的三维空间，取代基相应于或类似于这里描述的环状肽骨架相连的那些基团。
与非环状肽相比，环状肽作为候选药物具有数种重要的优点(Fairlie等1995，Fairlie等，1998，Tyndall和Fairlie，2001)。本说明书描述的环状化合物对蛋白水解降解稳定，在人血或血浆、在人或大鼠胃液，或在消化酶例如胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶存在下在37℃至少稳定7小时。与之相反，由L-氨基酸组成的短的线性肽在这些条件下数分钟内快速降解成其组成氨基酸。第二个优点在于环状和非肽分子采用的受限的单一构象，与非环状或线性肽相比，后者具有足够的灵活性在溶液中采取多种结构而不是受体-结合需要的一种结构。第三，环状化合物例如本发明描述的那些通常具有更大的脂溶性，作为药物与非环肽相比，具有更高的药物生物利用度，非环肽几乎不能经口给药。第四，环状分子的血浆半衰期通常比肽类长。
对本领域普通技术人员很明显的是，尽管本发明为了清楚和理解进行进行了一定程度的详细描述，在不偏离本发明说明书的发明概念的基础上，可以对这里描述的实施方案和方法进行多种修饰和改变。
这里引用的参考文献列在后页中，这里引入作为作为参考。
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Claims (12)

1.下式化合物
2.根据权利要求1的化合物，其为C5a G蛋白-偶联受体拮抗剂，且无C5a激动剂活性。
3.根据权利要求2的化合物，其中所述化合物具有C5a受体、抗利尿激素受体或神经激肽受体拮抗剂活性。
4.根据权利要求3的化合物，其中所述化合物具有亚微摩尔浓度的拮抗剂活性。
5.根据权利要求4的化合物，其中所述化合物的受体亲和力IC50＜25μM，且拮抗剂活性IC50＜1μM。
6.一种组合物，包括根据权利要求1的化合物以及可药用载体或赋性剂。
7.权利要求1～5中任一项的化合物在制备用于治疗G蛋白-偶联受体介导的病理疾病的药物中的用途。
8.根据权利要求7的用途，其中所述的G蛋白-偶联受体介导的疾病为C5a受体介导的疾病。
9.根据权利要求8的用途，其中所述疾病涉及C5a的过表达或表达下调。
10.根据权利要求9的用途，其中所述疾病选自类风湿性关节炎、成人呼吸窘迫综合征、全身性红斑狼疮、组织移植排斥、缺血性心脏病、再灌注损伤、脓毒性休克、齿龈炎、纤维症、动脉粥样硬化、多发性硬化症、阿耳茨海默氏病、哮喘、痴呆、中枢神经系统疾病、肺损伤、体外透析后综合征以及皮肤炎性疾病。
11.根据权利要求10的用途，其中皮肤炎性疾病为牛皮癣、湿疹和接触性皮炎。
12.根据权利要求1～5中任一项的化合物在制备用于治疗再灌注损伤的药物中的用途。
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