CN117924428A - 一种来源于小马岛猬的抗菌肽及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种来源于小马岛猬(Echinops telfairi)的抗菌肽及其制备方法和应用。本发明抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，其对革兰氏阴性的细菌具有良好的抗菌活性，对幽门螺杆菌感染的小鼠具有较好的治疗作用。同时该抗菌肽具有良好的胃蛋白酶稳定性、低溶血活性和低细胞毒性，可用于口服给药途径。因此，本发明抗菌肽能够用于制备抗细菌感染药物，用于制备治疗幽门螺杆菌感染引起的胃肠道疾病的药物。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种来源于小马岛猬(Echinopstelfairi)的抗菌肽及其制备方法和应用。
背景技术
幽门螺杆菌是一种呈螺旋形的革兰氏阴性细菌，存在于胃的黏膜层或者粘附于胃的上皮细胞，其传播性很强，感染与慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌和粘膜相关淋巴组织淋巴瘤密切相关。世界上50％的人感染了幽门螺杆菌(Tshibangu-Kabamba E,YamaokaY.Helicobacter pyloriinfection and antibiotic resistance-from biology toclinical implications.Nat Rev Gastroenterol Hepatol.2021；18(9):613-629)，我国的平均感染率为44％。根除治疗可以减少传播，并预防胃癌的发展，降低其他相关疾病发生的风险。然而由于抗生素耐药问题严重，导致根除治疗的失败率变高。因此，抗生素耐药性问题已成为成功根除幽门螺杆菌的关键。
抗菌肽作为一种几乎可以由所有生物体产生的小分子多肽，有特异性好、生物活性高、不良反应少等优点，并且促使膜解体，这样独特的作用机制决定了抗菌肽不易产生耐药性。但是多肽类药物的缺点也是显而易见的，其中对胃蛋白酶的稳定性差，口服生物利用度低，是影响其发挥有效抗菌活性的主要原因。
近些年来，多肽自组装、肽链修饰及非天然氨基酸替换等众多方法被用于提高抗菌肽对蛋白酶的稳定性，但是这些化学修饰方法通常会引发多肽毒性和合成成本的提升，制约了抗菌肽的广泛应用。
发明内容
发明目的：本发明目的在于针对现有技术的不足，提供一种来源于小马岛猬的抗菌肽及其制备方法和应用。本发明抗菌肽尤其对幽门螺杆菌具有强效的抑制作用和杀菌作用，对红细胞几乎没有溶血，且在模拟胃液中有很强的抗胃蛋白酶酶解能力。因此，本发明抗菌肽能够用于制备抗细菌感染药物，可为幽门螺杆菌的清除增加一种多肽类药物。
技术方案：本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明提供了一种来源于小马岛猬的抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示：
SEQ ID No.3：LKKIWKKIKRWVKKLL。
本发明还提供了所述抗菌肽的制备方法，以多肽ET-16为模板，将其中的甘氨酸和苏氨酸突变成色氨酸，天冬氨酸突变成精氨酸，采用固相化学合成法体外合成后，得到所述抗菌肽，所述多肽ET-16的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示：
SEQ ID No.2：LKKIGKKIKDTVKKLL。
本发明还提供了一种具体地所述抗菌肽的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、以人来源Cathelicidin家族抗菌肽前体序列LL-37(Accession:NP_004336)为模板，在NCBI网站上使用在线工具“BLAST”对小马岛猬的蛋白组数据库进行检索，得到来自该物种的Cathelicidin家族抗菌肽前体序列。与其他已知的Cathelicidin家族抗菌肽前体序列共同导入MEGA 11软件进行多序列比对，验证cathlin区域的保守序列，同时预测弹性蛋白酶的氨基酸残基切割位点，确定成熟肽序列，得到多肽Et-cath，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示：
SEQ ID No.1:PRGLRKTLKKIGKKIKDTVKKLLPKKPIMIGYSKRF。
步骤二、通过阳离子抗菌肽的净电荷、疏水性和疏水力矩三个关键理化参数为标准，运用HeliQuest在线分析工具(https://heliquest.ipmc.cnrs.fr/cgi-bin/ComputParams.py)，以16个氨基酸为一个单元，筛选整体疏水性大于0.1，疏水力矩大于0.5，净电荷大于5的单元序列，从而截取到Et-cath第8位氨基酸到第23位氨基酸之间的序列得到多肽ET-16；
步骤三、以多肽ET-16为模板，将其中的甘氨酸和苏氨酸突变成色氨酸，天冬氨酸突变成精氨酸，得到所述抗菌肽，即多肽ET-R2W；
突变后的疏水性氨基酸选择色氨酸，其优势在于色氨酸相比于其他疏水性氨基酸疏水性更强，更有助于抗菌肽抗菌活性的提升；
将天冬氨酸突变成精氨酸的目的在于防止胃蛋白酶对未替换的天冬氨酸的C端肽键进行切割，同时提供更多的净正电荷，增强抗菌肽与细菌膜表面负电荷的静电相互作用；
步骤四、采用固相化学合成法体外合成，完成多肽ET-R2W的制备。
本发明还提供了所述的抗菌肽在制备抗细菌感染药物中的应用。
所述细菌包括革兰氏阴性细菌。
其中，所述革兰氏阴性细菌包括幽门螺杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌或鲍曼不动杆菌中的一种或多种。
进一步地，所述幽门螺杆菌包括克拉霉素和阿莫西林耐药的幽门螺杆菌、克拉霉素耐药的猫螺杆菌或临床驯化的幽门螺杆菌中的一种或多种。
本发明还提供了所述的抗菌肽在制备治疗幽门螺杆菌感染引起的胃肠道疾病的药物中的应用。
本发明还提供了一种抗细菌感染药物，所述抗细菌感染药物的有效成分包括所述的抗菌肽。
所述药物可以为口服制剂。这突破了抗菌肽的给药方式的限制，用于口服给药，在治疗幽门螺杆菌的感染方面具有潜在意义。
所述抗菌肽的MIC和MBC值均在2～8μg/mL。
有益效果：
本发明未进行复杂的化学修饰或非天然氨基酸取代，产生了对胃蛋白酶的抗性；对制备的抗菌肽(即多肽ET-R2W)进行抗幽门螺杆菌活性、溶血活性、抗胃蛋白酶酶解能力测定，发现抗菌肽ET-R2W对克拉霉素和阿莫西林耐药的幽门螺杆菌、克拉霉素耐药的猫螺杆菌以及临床驯化的幽门螺杆菌等多株幽门螺杆菌都有强效的抑制作用和杀菌作用，对红细胞几乎没有溶血，且在模拟胃液中有很强的抗胃蛋白酶酶解能力，具有极大的应用潜力。因此，本发明抗菌肽能够用于制备抗细菌感染药物，用于制备治疗幽门螺杆菌感染引起的胃肠道疾病的药物。
附图说明
图1为抗菌肽ET-R2W的HPLC图谱；
图2为抗菌肽ET-R2W的质谱图；
图3为抗菌肽ET-R2W对耐药幽门螺杆菌的杀菌曲线；
图4为抗菌肽ET-R2W对绵羊红细胞的溶血活性；
图5为抗菌肽ET-R2W对人胃上皮细胞的细胞毒性；
图6为抗菌肽ET-R2W对胃蛋白酶的稳定性测定；
图7为抗菌肽ET-R2W对幽门螺杆菌感染小鼠胃组织中细菌载量的影响；
图8为抗菌肽ET-R2W治疗的幽门螺杆菌感染小鼠的HE染色结果。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明技术方案进行详细说明，但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。
本发明中设计的多肽由吉尔生化(上海)有限公司直接进行合成。
实施例1多肽ET-R2W的设计与合成
以人来源Cathelicidin家族抗菌肽前体序列LL-37(Accession:NP_004336)为模板，在NCBI网站上使用在线工具“BLAST”，对小马岛猬的蛋白组数据库进行检索，得到来自该物种的Cathelicidin家族抗菌肽前体序列。与其他已知的Cathelicidin家族抗菌肽前体序列共同导入MEGA11软件进行多序列比对，验证cathlin区域的保守序列，同时预测弹性蛋白酶的氨基酸残基切割位点，确定成熟肽序列，得到多肽Et-cath，其氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示：PRGLRKTLKKIGKKIKDTVKKLLPKKPIMIGYSKRF。
以阳离子抗菌肽的净电荷、疏水性和疏水力矩三个关键理化参数为标准，运用HeliQuest在线分析工具(https://heliquest.ipmc.cnrs.fr/cgi-bin/ComputParams.py)，以16个氨基酸为一个单元，筛选整体疏水性大于0.1，疏水力矩大于0.5，净电荷大于5的单元序列，从而截取到Et-cath第8位氨基酸到第23位氨基酸之间的序列得到多肽ET-16，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示：LKKIGKKIKDTVKKLL。
以多肽ET-16为模板，将其中的甘氨酸和苏氨酸突变成色氨酸，天冬氨酸突变成精氨酸，得到抗菌肽ET-R2W，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示：LKKIWKKIKRWVKKLL。
委托吉尔生化(上海)有限公司采用固相化学合成法合成多肽ET-R2W。
通过反向高效液相色谱和质谱对多肽成品进行鉴定，即完成抗菌肽ET-R2W的制备，纯度大于96％，HPLC图谱如图1所示，质谱图如图2所示。
实施例2抗菌肽的体外生物活性测定
1、抗菌肽ET-R2W对细菌的最小抑菌浓度(MIC)测定：
按照标准倍比稀释法，用相应液体培养基(幽门螺杆菌用幽门螺杆菌液体培养基(青岛海博生物)，其他细菌用LB液体培养基)将多肽配制成系列浓度梯度(128、64、32、16、8、4、2、1μg/mL)，与同样用相应液体培养基调整菌浓度为2×105CFU/ml的待测菌液等体积混合，37℃(幽门螺杆菌在微需氧条件下)培养24h，肉眼观察未有菌生长的最低药物浓度为MIC，结果见表1。
表1抗菌肽ET-R2W对幽门螺杆菌及几种革兰氏阴性菌的MIC
2、抗菌肽ET-R2W对细菌的最小杀菌浓度(MBC)测定：
取上述MIC测定中96孔板里未见细菌生长的培养物置于无菌培养皿中，并向其中倒入50℃左右的幽门螺旋杆菌固体培养基(青岛海博生物)或营养琼脂培养基充分混匀，凝固后，置于37℃恒温培养箱倒置培养48h，将未见菌落生长的培养皿所对应的最低药物浓度记为MBC值，结果见表2。
表2抗菌肽ET-R2W对幽门螺杆菌及几种革兰氏阴性菌的MBC
由表1和表2结果可知，多肽ET-R2W对于幽门螺杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌均表现出很强的抑菌活性和杀菌活性，对这几种革兰氏阴性菌的MIC和MBC值均在2～8μg/mL的范围内。
3、抗菌肽ET-R2W对耐药幽门螺杆菌的杀菌曲线测定：
用幽门螺杆菌液体培养基将菌液重悬，并调整菌浓度为105CFU/ml，取2mL于无菌玻璃试管中，分别加入一定体积的各药物(ET-R2W、克拉霉素和阿莫西林)，并用空白培养基调平体积，得到药物终浓度为4×MIC的体系3mL。并且设置不加药物的空白对照体系。
由于克拉霉素不易溶于水，实验中先用DMSO助溶，配制成64mg/ml的高浓度母液，再用幽门螺杆菌液体培养基稀释成实验所需浓度。
ET-R2W、阿莫西林直接用幽门螺杆菌液体培养基稀释成实验所需浓度。
将各实验组置于37℃培养箱中培养，分别于培养后0h、0.5h、1h、2h、4h、8h、12h和24h定时取出混合培养物100μL，用无菌生理盐水梯度稀释后，取所需梯度200μL于无菌平皿中，加入约10mL 50℃左右的幽门螺旋杆菌固体培养基，摇晃均匀，冷凝后37℃、微需氧条件下恒温培养72h。最后活菌计数，以药物作用时间为横坐标，菌落对数值为纵坐标绘制杀菌曲线，结果如图3所示。
本实验选取菌落数在30-300个之间的平板计数，各实验组梯度设置如下：
对照组和阿莫西林组前4h、2h、1h、0.5h、0h取1：100，1：1000、1：10000三个梯度倒板，4h以后取1：1000、1：10000、1：100000倒板；克拉霉素组全部设置1：100，1：1000、1：10000三个梯度；多肽ET-R2W组1h、0.5h、0h设置1：100，1：1000、1：10000三个梯度，4h、8h、12h和24h取不经过稀释的原液200μL以及1：10、1：100倒板。
杀菌曲线结果表明，与0h相比，ET-R2W在1h和2h显著降低了耐药幽门螺杆菌SS1，分别为1.6-log10CFU单位和3.4-log10CFU单位，并且在4h内能完全清除耐药幽门螺杆SS1，而克拉霉素和阿莫西林对其只有很弱的抑制作用，无杀菌作用。
4、抗菌肽ET-R2W对绵羊红细胞的溶血活性测定：
取新鲜的无菌脱纤维的绵羊血(南京森贝伽生物科技)3ml于无菌的EP管中，3000rpm离心10min，小心吸弃上清，用PBS重悬洗三次。向下面的沉淀中加入PBS配成3％的红细胞悬液，并加入到96孔板中，50μl/孔，之后再向每孔中加入等体积的多肽溶液，使每孔中多肽的终浓度为128、64、32、16、8、4μg/ml，1％ TritonX-100处理的红细胞悬液作为阳性对照，PBS处理的红细胞悬液作为阴性对照，并且与相同浓度梯度的蜂毒肽(Mellittin)进行比较，每组设置3个复孔。置于37℃培养箱中培养1h。3000rpm离心10min，取上清置于另一块无菌的96孔板中，于450nm波长处测吸光值。阳性对照设为100％的溶血率，阴性对照设为0％的溶血率，按照以下公式计算多肽对红细胞的溶血率：
结果如图4所示。
溶血活性的结果表明，当抗菌肽ET-R2W的浓度达到32×MIC时，对绵羊红细胞的溶血率仍然低于5％，具有很低微的溶血活性。
5、抗菌肽ET-R2W对人胃上皮细胞的细胞毒性测定：
人胃上皮细胞(人胃正常黏膜上皮细胞GES-1，来自中国药科大学微生物学教研室)细胞密度在长到约80％-90％，消化离心收集，将上清去掉，用DMEM完全培养基重悬稀释细胞至浓度5-10×104个/ml。每孔加入100μl，将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养24h以内。待细胞贴壁后，吸去孔板中的培养上清，再加入100μl含不同浓度药物的培养基，5％ CO2，37℃孵育24小时。孵育结束后，每孔加入10μl MTT溶液(5mg/ml)，继续培养4h后，1000rpm离心10min，小心吸掉上清，每孔加入100μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪OD490 nm测量各孔的吸光值，按照以下公式计算细胞存活率：
其中，空白组是指不加药物的等体积的DMEM完全培养基。
结果如图5所示。
MTT的结果表明，抗菌肽ET-R2W对人胃上皮细胞的毒性较低，其对细胞的半数致死浓度远低于其有效发挥抗菌活性的浓度。
实施例3抗菌肽ET-R2W对胃蛋白酶的稳定性测定
模拟胃液的配制：按照中国药典，取稀盐酸16.4ml，加水800ml与胃蛋白酶10g，摇匀后，加水稀释成1000ml即得，pH＝1.5。
1、经模拟胃液(SGF)处理后抗菌肽ET-R2W对幽门螺杆菌的MIC测定：
取生理盐水配制的多肽母液(2048μg/mL)与模拟胃液在37℃下等体积孵育2h后，90℃加热10min使胃蛋白酶灭活，然后按照实施例2的方法测定多肽ET-R2W对幽门螺杆菌的MIC值，并设置不经SGF处理的空白对照组，根据MIC值的变化，判断多肽对胃蛋白酶的稳定性结果如表3所示。
表3经模拟胃液处理后抗菌肽ET-R2W对幽门螺杆菌的MIC
结果表明，抗菌肽ET-R2W对胃蛋白酶的稳定性良好，经模拟胃液处理2h后其对幽门螺杆菌的MIC值保持不变，或仅提升2倍，仍保持较低的MIC值。
2、RP-HPLC测定经SGF处理后上清液中剩余肽的相对含量：
取多肽母液与模拟胃液在37℃下等体积孵育2h、4h后，加入240μL乙腈，13000rpm离心10min，用RP-HPLC测定上清液中剩余肽的相对含量，结果如图6所示，其中，图6A为原始液相的出峰图谱，图6B为液相结果的量化图。
HPLC的结果表明，抗菌肽ET-R2W对胃蛋白酶的稳定性良好，经模拟胃液处理2h后仍然含有80％左右的多肽保留，与活性测定的结果一致。
实施例4抗菌肽ET-R2W治疗体内幽门螺杆菌感染
1、幽门螺杆菌感染小鼠胃炎模型的建立：
每只C57BL/6雌性小鼠(6周龄，来源于扬州大学)每48h灌胃0.3mL 3×108CFU/mL幽门螺杆菌NSH57，重复3次，感染持续三周。
所有小鼠被随机分为5个治疗组(n＝8)，包括模型组(PBS)、ET-R2W(5、10和20mg/kg)和四联疗法组(其中包含2种抗生素：阿莫西林和克拉霉素，一种抑制胃酸分泌的质子泵抑制剂：奥美拉唑和一种铋剂：枸橼酸酸铋钾)。四联疗法小鼠首先给予奥美拉唑(138mg/kg)和枸橼酸铋钾(6.3mg/kg)，然后延迟给药30min再给予抗生素给药方案，克拉霉素剂量14.3mg/kg，阿莫西林剂量28.5mg/kg，每日灌胃1次，连续10天。
2、抗菌肽ET-R2W对幽门螺杆菌感染小鼠胃组织中细菌负荷的影响:
给药10天后，处死小鼠，使用灭菌的手术器械，取出胃组织，沿胃大弯剪开胃部，使用无菌的生理盐水冲洗胃部残渣，取一份胃组织，称重记录，剪碎后加入1ml生理盐水，电动匀浆机匀浆至乳白色悬液，用HP液体培养基按1：1000、1：10000、1：100000进行倍比稀释，取100μl均匀涂布在HP平板上，对鉴定为阳性的幽门螺杆菌(HP)菌落进行计数，按照公式：
计算幽门螺杆菌载量，结果如图7所示。
平板计数的结果表明，抗菌肽ET-R2W能有效清除小鼠体内的幽门螺杆菌，相对于模型组，抗菌肽中剂量组和高剂量组显著降低了约2个数量级的幽门螺杆菌负荷量。
3、抗菌肽ET-R2W治疗的幽门螺杆菌感染小鼠的HE染色
取新鲜的胃组织于4％的多聚甲醛中固定24h，经过脱水浸蜡、石蜡包埋、石蜡切片、冰冻切片、苏木素染色、伊红染色、脱水封片，最后用显微镜镜检，图像采集分析，结果如图8所示。
HE染色的结果表明，ET-R2W的治疗使幽门螺杆菌感染的小鼠恢复正常的胃组织形态。在炎症反复刺激下，模型组广泛可见黏膜固有层主细胞和壁细胞排列紊乱，异常增殖，导致胃黏膜增厚；局部可见黏膜上皮浅层腺体坏死脱落，黏膜肌层出现水肿，如黑色箭头所示。而经抗菌肽中剂量和高剂量治疗后，病理切片的结果与正常组的几乎一致。
如上所述，尽管参照特定的优选实施例已经表示和表述了本发明，但其不得解释为对本发明自身的限制。在不脱离所附权利要求定义的本发明的精神和范围前提下，可对其在形式上和细节上作出各种变化。
Claims (10)
1.一种来源于小马岛猬的抗菌肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
2.根据权利要求1所述的抗菌肽的制备方法，其特征在于，以多肽ET-16为模板，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，将其中的甘氨酸和苏氨酸突变成色氨酸，天冬氨酸突变成精氨酸，采用固相化学合成法体外合成后，得到所述抗菌肽。
3.权利要求1所述的抗菌肽在制备抗细菌感染药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述细菌包括革兰氏阴性细菌。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述革兰氏阴性细菌包括幽门螺杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌或鲍曼不动杆菌中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述幽门螺杆菌包括克拉霉素和阿莫西林耐药的幽门螺杆菌、克拉霉素耐药的猫螺杆菌或临床驯化的幽门螺杆菌中的一种或多种。
7.权利要求1所述的抗菌肽在制备治疗幽门螺杆菌感染引起的胃肠道疾病的药物中的应用。
8.一种抗细菌感染药物，其特征在于，所述抗细菌感染药物的有效成分包括权利要求1所述的抗菌肽。
9.根据权利要求8所述的抗细菌感染药物，其特征在于，所述药物为口服制剂。
10.根据权利要求8所述的抗细菌感染药物，其特征在于，所述抗菌肽的MIC和MBC值均在2～8μg/mL。
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