WO2020013027A1 - ８－プレニルナリンゲニンの製造方法 - Google Patents

８－プレニルナリンゲニンの製造方法 Download PDF

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blautia
isoxanthohumol
microorganisms
microorganism
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俊典 石輪
賢則 中島
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株式会社ダイセル
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing 8-prenylnaringenin.
  • Hop (Humulus lupulus L.) is a perennial herbaceous and dioecious vine.
  • the female plant cone contains a raw material that imparts bitterness to beer, and further contains effective components such as prenylated flavonoids such as xanthohumol, isoxanthohumol, and 8-prenylnaringenin. It has been reported that these prenylated flavonoids have various physiological activities, and are attracting attention as pharmaceuticals and food materials. In particular, it has been reported that 8-prenylnaringenin exhibits physiological activities such as estrogen activity (Non-Patent Document 1), inhibition of angiogenesis (Patent Document 1), and suppression of disuse muscle atrophy (Patent Document 2).
  • Non-Patent Document 2 8-prenylnaringenin is present in hop cones in very small amounts (Non-Patent Document 2), and it is difficult to recover 8-prenylnaringenin with natural extracts. Therefore, synthetic strategies have been developed to produce 8-prenylnaringenin by prenylation of naringenin. For example, a synthesis method for directly C-prenylation of naringenin and a synthesis method starting from fluoroacetophenone have been reported. However, in each case, the selectivity of the reaction is low and the yield is low. Also, a production method by Claisen rearrangement using a europium (III) catalyst has been reported.
  • Non-Patent Document 3 It is also known that 8-prenyltransferase derived from Clara (Sophora flavescens) has an activity of specifically prenylating to the 8-position of naringenin (Non-patent Document 4).
  • Clara Sophora flavescens
  • 8-prenyltransferase derived from Clara Sophora flavescens
  • Clara Sophora flavescens
  • the reaction requires the supply of a prenyl group
  • the production of 8-prenylnaringenin requires the supply of an equivalent amount of a prenyl group.
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and it is an object of the present invention to provide a novel method for producing 8-prenylnaringenin.
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above problems, and as a result, a microorganism belonging to Blautia coccoides, a microorganism belonging to Blautia schinkii, and a microorganism belonging to Blautia hominis
  • the present inventors have found that a microorganism belonging to the category (1) has the ability to produce 8-prenylnaringenin from isoxanthohumol, and have completed the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • the microorganism is one selected from the group consisting of a microorganism belonging to Blautia coccoides, a microorganism belonging to Blautia schinkii, and a microorganism belonging to Blautia hominis. Or more microorganisms.
  • 8-Prenylnaringenin obtained by the present invention is used in cosmetics, quasi-drugs, medical supplies, hygiene articles, pharmaceuticals, foods and drinks (including supplements), etc., and is used or ingested by subjects including humans. As a result, a known effect of 8-prenylnaringenin can be easily obtained.
  • the method for producing 8-prenylnaringenin according to the present invention includes: a microorganism belonging to Blautia coccoides, which has the ability to produce 8-prenylnaringenin from isoxanthohumol in a solution containing isoxanthohumol; A step of producing 8-prenylnaringenin from isoxanthohumol by one or more microorganisms selected from the group consisting of microorganisms belonging to Blautia schinkii and microorganisms belonging to Blautia shominis including.
  • the solution containing isoxanthohumol refers to a microorganism belonging to Brautia coccoides, Blautia schinkii, which has the ability to produce 8-prenylnaringenin from isoxanthohumol in the solution.
  • the microorganism is particularly limited as long as it is capable of producing 8-prenylnaringenin from isoxanthohumol by one or more microorganisms selected from the group consisting of microorganisms belonging to the group and microorganisms belonging to Blautia hominis. Not done.
  • the medium is preferably a medium, and more preferably the medium described in the section “Medium and Production of 8-Prenylnaringenin by Culture” described below.
  • isoxanthohumol When isoxanthohumol is added to the solution, it may be added before or during the production of 8-prenylnaringenin, or may be added all at once, sequentially or continuously.
  • the content of isoxanthohumol in the solution is usually 5 mg / L or more.
  • the microorganism in the present invention is not particularly limited as long as it has an ability to produce 8-prenylnaringenin from isoxanthohumol.
  • Specific examples include microorganisms belonging to the genus Blautia. Among them, microorganisms belonging to Blautia coccoides, microorganisms belonging to Blautia schinkii, microorganisms belonging to Blautia hominis, and the like are preferable. Among them, more preferred are Blautia coccoides JCM 1395 strain, Blautia schinkii JCM 14657 strain, and Brautia hominis JCM 32276 strain. In the present invention, one or two or more microorganisms may be used, and one or two or more microorganisms may be used.
  • the bacteria to which the JCM number is assigned are from Japan Collection of Microorganisms (National Institute for Physical and Chemical Research, BioResource Center, Microbial Material Development Office, postal code: 305-0074, address: 3-1-1 Takanodai, Tsukuba, Ibaraki Prefecture) Can be obtained.
  • the solution is preferably a medium.
  • the medium is not particularly limited.
  • a GAM medium manufactured by Nissui Pharmaceutical Co. a modified GAM medium, a brain heart infusion medium, an Anabeo Basal Broth (ABB) medium manufactured by Oxoid, or the like can be used.
  • ABB Anabeo Basal Broth
  • the concentration of the organic substance as a carbon source added to the medium can be appropriately adjusted in order to efficiently grow the anaerobic microorganisms in the medium. Generally, by selecting the addition amount from the range of 0.1 to 10 wt / vol%, excess or deficiency can be avoided.
  • a nitrogen source can be added to the medium.
  • various nitrogen compounds that can be used for ordinary fermentation can be used as the nitrogen source.
  • Preferred inorganic nitrogen sources are, for example, ammonium salts and nitrates.
  • Preferred organic nitrogen sources are, for example, amino acids, yeast extract, peptones, meat extract, liver extract, digested serum powder and the like. More preferred inorganic nitrogen sources are ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium hydrogen phosphate, potassium nitrate and sodium nitrate. More preferred nitrogen sources are yeast extracts and peptones.
  • organic or inorganic substances suitable for culturing anaerobic microorganisms can be added to the medium.
  • the growth and activity of anaerobic microorganisms can sometimes be enhanced by adding inorganic compounds such as cofactors such as vitamins and various salts to the medium.
  • inorganic compounds, vitamins, and animal and plant-derived microbial growth co-factors include the following.
  • the gas phase and the aqueous phase during the culturing do not contain air or oxygen.
  • a gas phase or an aqueous phase containing hydrogen is not particularly limited.
  • a method such as supplying to the gas phase or bubbling the aqueous phase with the above gas before culturing can be employed.
  • the culturing temperature is from 20 ° C to 45 ° C, more preferably from 25 ° C to 40 ° C, even more preferably from 30 ° C to 37 ° C.
  • the pressurizing condition of the incubator is not particularly limited as long as it can grow, but may be in the range of 0.001 to 1 MPa, preferably 0.01 to 0.5 MPa.
  • the culturing time is usually 8 to 336 hours, preferably 24 to 168 hours.
  • a microorganism belonging to Blautia coccoides, a microorganism belonging to Blautia sinkii, and a microorganism belonging to Blautia hominis can be cultured according to a known microorganism culture method.
  • a continuous culture system capable of continuously supplying a medium or gas and having a mechanism for collecting a culture is suitable.
  • anaerobic culture jar can be a bioreactor for culturing the microorganism.
  • the anaerobic culture jar is formed of an airtight container made of metal, glass, or synthetic resin, and can shield the inside from oxygen in the atmosphere.
  • the present invention may include the following steps.
  • the present invention may include, for example, a step of quantifying the obtained 8-prenylnaringenin.
  • the quantification method can follow a conventional method. For example, a part of the culture solution is collected, appropriately diluted, stirred well, and then filtered using a membrane such as a polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane to remove insolubles, and then subjected to high-performance liquid chromatography quantification. And so on.
  • PTFE polytetrafluoroethylene
  • the present invention may include a step of collecting 8-prenylnaringenin obtained in the above step.
  • the recovery step may be a purification step, a concentration step, or the like.
  • Purification in the purification process includes sterilization of microorganisms by heat, etc .; eradication by microfiltration (MF) and ultrafiltration (UF); removal of solids and polymer substances; extraction with organic solvents and ionic liquids. Treatments such as adsorption and decoloration using a hydrophobic adsorbent, an ion exchange resin, an activated carbon column or the like can be performed.
  • Examples of the concentration treatment in the concentration step include concentration using an evaporator, a reverse osmosis membrane, or the like.
  • solution containing 8-prenylnaringenin can be powdered by freeze-drying, spray-drying or the like.
  • excipients such as lactose, dextrin, corn starch and the like can be added.
  • Example 1 After adding isoxanthohumol (manufactured by Nacalai Tesque) to an ABB medium (manufactured by Oxoid), the mixture is sterilized by heating, and the gas phase is N 2 : CO 2 : H 2 (80% / 10% / 10%) gas. The medium replaced with was used as a basal medium. In a medium containing a final concentration of 5 mg / L of isoxanthohumol, plant Blautia coccoides JCM 1395, Blautia schinkii JCM 14657, or Blautia hominis JCM 32276. The cells were inoculated and cultured anaerobically at 37 ° C.
  • prenylflavonoids were extracted with an equal amount of ethyl acetate (1.5% formic acid) with respect to 5 mL of the culture solution, and the obtained ethyl acetate phase was collected and dried. The dried product thus obtained was redissolved in 0.5 mL of methanol, and quantitative analysis of prenylflavonoids was performed by HPLC. HPLC was performed under the conditions described below. Prenylflavonoids manufactured by LKT Laboratories were used as standards and dissolved in DMSO.
  • microorganisms belonging to Blautia coccoides having the ability to produce 8-prenylnaringenin from isoxanthohumol.
  • 8-prenylnaringenin can be efficiently produced.
  • 8-Prenylnaringenin obtained by the present invention is used in cosmetics, quasi-drugs, medical supplies, hygiene articles, pharmaceuticals, foods and drinks (including supplements), etc., and is used or ingested by subjects including humans. As a result, a known effect of 8-prenylnaringenin can be easily obtained.

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Abstract

本発明の課題は、８－プレニルナリンゲニンの新規製造方法の提供であり、該課題を、イソキサントフモールを含有する溶液において、イソキサントフモールから８－プレニルナリンゲニンを産生する能力を有する、ブラウティア・コッコイデス（Blautia coccoides）に属する微生物、ブラウティア・シンキ（Blautia schinkii）に属する微生物及びブラウティア・ホミニス（Blautia hominis）に属する微生物からなる群から選択される一又はそれ以上の微生物に、イソキサントフモールから８－プレニルナリンゲニンを産生させる工程を含む、８－プレニルナリンゲニンの製造方法で解決する。

Description

８－プレニルナリンゲニンの製造方法
　本発明は、８－プレニルナリンゲニンの製造方法に関する。
　ホップ（Humulus lupulus L.）は、アサ科の多年草で、雌雄異株の蔓性植物である。雌株の毬花は、ビールに苦みなどを付与する原料を含み、さらに、キサントフモール、イソキサントフモール、８－プレニルナリンゲニンなどのプレニル化フラボノイドなどの有効な成分を含んでいる。これらプレニル化フラボノイドは様々な生理活性をもつことが報告されており、医薬や食品素材として注目されている。特に８－プレニルナリンゲニンは、エストロゲン活性（非特許文献１）、血管新生抑制（特許文献１）、廃用性筋萎縮抑制（特許文献２）といった生理活性を示すことが報告されている。
　しかし、８－プレニルナリンゲニンはホップ毬花には極微量で存在する（非特許文献２）ため、天然抽出物での回収は困難である。したがって、ナリンゲニンのプレニル化により８－プレニルナリンゲニンを生産する合成戦略が開発されている。
　例えば、ナリンゲニンを直接Ｃ－プレニル化する合成法、フロロアセトフェノンから出発する合成法が報告されている。しかし、いずれも反応の選択性が低く、低収率である。
　また、ユウロピウム（ＩＩＩ）触媒を使ったクライゼン転移による製造方法も報告されている。該方法は効率的であるものの、小規模の製造方法としてしか報告されていない（非特許文献３）。
　また、クララ（Sophora flavescens）由来の８－プレニルトランスフェラーゼがナリンゲニンの８位に特異的にプレニル化する活性を有することが知られている（非特許文献４）。しかし、該反応にはプレニル基の供給が必要であり、８－プレニルナリンゲニンの生産には当量のプレニル基を供給しなければならない。
　一方、イソキサントフモールを出発物質とした脱メチル化反応による８－プレニルナリンゲニンの生産に関しても報告があり、微生物変換による製法として、ユーバクテリウム・リモスム（Eubacterium limosum）ＡＴＣＣ　８４８６株又はペプトストレプトコッカス・プロダクタス（Peptostreptococcus productus）ＡＴＣＣ　２７３４０株によって、イソキサントフモールを脱メチル化して８－プレニルナリンゲニンを産生する製造方法が報告されている（特許文献３）。
特表２００５－５２６１２２号公報 特開２０１６－１３６９５２号公報 特表２００８－５３２５５８号公報
S. Milligan, et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 84, 2249-2252 (1999) H. Rong, et al., Chromatographia, 51, 545-552 (2000) S. Gester, et al., Tetrahedron, 57, 1015-1018 (2001) K. Sasaki, et al., Plant Physiol., 146, 1075-1084 (2008)
　本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、８－プレニルナリンゲニンの新規製造方法の提供を課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ブラウティア・コッコイデス（Blautia coccoides）に属する微生物と、ブラウティア・シンキ（Blautia schinkii）に属する微生物と、ブラウティア・ホミニス（Blautia hominis）に属する微生物とが、イソキサントフモールから８－プレニルナリンゲニンを産生する能力を有することを見出し、本発明を完成させた。本発明は以下のとおりである。
〔１〕イソキサントフモールを含有する溶液において、イソキサントフモールから８－プレニルナリンゲニンを産生する能力を有する、ブラウティア・コッコイデス（Blautia coccoides）に属する微生物、ブラウティア・シンキ（Blautia schinkii）に属する微生物、及びブラウティア・ホミニス（Blautia hominis）に属する微生物からなる群から選択される一又はそれ以上の微生物に、イソキサントフモールから８－プレニルナリンゲニンを産生させる工程を含む、８－プレニルナリンゲニンの製造方法。
〔２〕前記ブラウティア・コッコイデス（Blautia coccoides）に属する微生物が、ブラウティア・コッコイデス（Blautia coccoides）ＪＣＭ　１３９５株である、〔１〕に記載の製造方法。
〔３〕前記ブラウティア・シンキ（Blautia schinkii）に属する微生物が、ブラウティア・シンキ（Blautia schinkii）ＪＣＭ　１４６５７株である、〔１〕又は〔２〕に記載の製造方法。
〔４〕前記ブラウティア・ホミニス（Blautia hominis）に属する微生物が、ブラウティア・ホミニス（Blautia hominis）ＪＣＭ　３２２７６株である、請求項１～３のいずれか一項に記載の製造方法。
　本発明によれば、イソキサントフモールから８－プレニルナリンゲニンを産生する能力を有する微生物を用いた、８－プレニルナリンゲニンの効率的な製造方法が提供できる。該微生物は、具体的には、ブラウティア・コッコイデス（Blautia coccoides）に属する微生物、ブラウティア・シンキ（Blautia schinkii）に属する微生物、及びブラウティア・ホミニス（Blautia hominis）に属する微生物からなる群から選択される一又はそれ以上の微生物である。
　本発明により得られる８－プレニルナリンゲニンを、化粧品、医薬部外品、医療用品、衛生用品、医薬品、飲食品（サプリメントを含む。）等に用い、ヒトを含む対象がそれを使用又は摂取等することにより、８－プレニルナリンゲニンによる公知の効果を簡便に得ることができる。
　本発明に係る８－プレニルナリンゲニンの製造方法は、イソキサントフモールを含有する溶液において、イソキサントフモールから８－プレニルナリンゲニンを産生する能力を有する、ブラウティア・コッコイデス（Blautia coccoides）に属する微生物、ブラウティア・シンキ（Blautia schinkii）に属する微生物、及びブラウティア・ホミニス（Blautia hominis）に属する微生物からなる群から選択される一又はそれ以上の微生物に、イソキサントフモールから８－プレニルナリンゲニンを産生させる工程を含む。
（イソキサントフモールを含有する溶液）
　イソキサントフモールを含有する溶液とは、該溶液において、イソキサントフモールから８－プレニルナリンゲニンを産生する能力を有する、ブラウティア・コッコイデス（Blautia coccoides）に属する微生物、ブラウティア・シンキ（Blautia schinkii）に属する微生物、及びブラウティア・ホミニス（Blautia hominis）に属する微生物からなる群から選択される一又はそれ以上の微生物に、イソキサントフモールから８－プレニルナリンゲニンを産生させることができるものであれば特に制限されない。好ましくは培地であり、より好ましくは後述する「培地、及び培養による８－プレニルナリンゲニンの産生」欄に記載した培地である。
　該溶液へイソキサントフモールを添加する場合には、８－プレニルナリンゲニンの産生前に添加しても、その途中で添加してもよく、また、一括添加、逐次添加、連続添加でもよい。溶液中のイソキサントフモールの含有量は、通常５ｍｇ／Ｌ以上である。
（微生物）
　本発明における微生物は、イソキサントフモールから８－プレニルナリンゲニンを産生する能力を有する限り、特に限定されない。
　具体的には、ブラウティア（Blautia）属に属する微生物が挙げられる。
　その中でも、ブラウティア・コッコイデス（Blautia coccoides）に属する微生物、ブラウティア・シンキ（Blautia schinkii）に属する微生物、ブラウティア・ホミニス（Blautia hominis）に属する微生物等が好ましい。
　また、その中でも、ブラウティア・コッコイデス（Blautia coccoides）JCM 1395株やブラウティア・シンキ（Blautia schinkii）JCM 14657株、ブラウティア・ホミニス（Blautia hominis）JCM 32276株等がより好ましい。
　本発明において、微生物は１種でも２種以上を用いてもよく、１株でも２株以上を用いてもよい。
　ＪＣＭ番号が付与された細菌は、Japan Collection of Microorganisms（国立研究開発法人理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室、郵便番号：305-0074、住所：茨城県つくば市高野台3-1-1）から入手することができる。
（培地、及び培養による８－プレニルナリンゲニンの産生）
　本工程では、前記溶液が培地であることが好ましい。該培地は特に限定されないが、たとえば日水製薬社製のＧＡＭ培地、変法ＧＡＭ培地、ブレインハートインフュージョン培地、Ｏｘｏｉｄ社製Ａｎａｅｒｏｂｅ　Ｂａｓａｌ　Ｂｒｏｔｈ（ＡＢＢ）培地などを使用することができる。
　培地に加える炭素源としての有機物の濃度は、効率的に培地中の嫌気性微生物を発育させるために適宜調節することができる。一般的には、０．１～１０ｗｔ／ｖｏｌ％の範囲から添加量を選択することによって、過不足を避けることができる。
　上記の炭素源に加えて、培地には、窒素源が加えることができる。本発明において、窒素源としては通常の発酵に用いうる各種の窒素化合物を用いることができる。好ましい無機窒素源は、たとえば、アンモニウム塩、及び硝酸塩である。好ましい有機窒素源は、たとえば、アミノ酸類、酵母エキス、ペプトン類、肉エキス、肝臓エキス、消化血清末などである。より好ましい無機窒素源は、硫安、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、リン酸水素アンモニウム、硝酸カリウム及び硝酸ソーダである。より好ましい窒素源は酵母エキス、ペプトン類である。
　さらに、炭素源や窒素源に加えて、嫌気性微生物の培養に適した他の有機物あるいは無機物を培地に加えることもできる。たとえば、ビタミンなどの補因子や各種の塩類等の無機化合物を培地に加えることによって、嫌気性微生物の増殖や活性を増強できる場合もある。たとえば無機化合物、ビタミン類、動植物由来の微生物増殖補助因子として以下のものを挙げることができる。
　　無機化合物　　　　　　　　　　　ビタミン類
　　リン酸二水素カリウム　　　　　　ビオチン
　　硫酸マグネシウム　　　　　　　　葉酸
　　硫酸マンガン　　　　　　　　　　ピリドキシン
　　塩化ナトリウム　　　　　　　　　チアミン
　　塩化コバルト　　　　　　　　　　リボフラビン
　　塩化カルシウム　　　　　　　　　ニコチン酸
　　硫酸亜鉛　　　　　　　　　　　　パントテン酸
　　硫酸銅　　　　　　　　　　　　　ビタミンB12
　　明ばん　　　　　　　　　　　　　チオオクト酸
　　モリブデン酸ソーダ　　　　　　　ｐ－アミノ安息香酸
　　塩化カリウム
　　ホウ酸等
　　塩化ニッケル
　　タングステン酸ナトリウム
　　セレン酸ナトリウム
　　硫酸第一鉄アンモニウム
　培養中の気相、水相としては、空気又は酸素を含まないことが好ましく、たとえば、窒素及び又は水素を任意の比率で含むことや、窒素及び／又は二酸化炭素を任意の比率で含むことが挙げられ、水素を含む気相や水相であることが好ましい。
　培地中の気相や水相をこのような環境にする方法は特に制限されないが、たとえば、培養前に上記ガスで気相を置換する、培養中も培養器の底部から供給する、培養器の気相部に供給する、培養前に上記ガスで水相をバブリングするなどの方法をとることが出来る。
　培養温度は、２０℃～４５℃、より好ましくは２５℃～４０℃、さらに好ましくは３０℃～３７℃である。
　培養器の加圧条件は、生育できる条件であれば特に制限されるものではないが、０．００１～１ＭＰａの範囲、好ましくは０．０１～０．５ＭＰａを挙げることができる。
　培養時間としては、通常８～３３６時間、好ましくは２４～１６８時間を挙げることが出来る。
　本発明におけるブラウティア・コッコイデス（Blautia coccoides）に属する微生物、ブラウティア・シンキ（Blautia schinkii）に属する微生物、ブラウティア・ホミニス（Blautia hominis）に属する微生物は、公知の微生物培養方法に従って培養することが出来る。工業的な製造には、培地やガスを連続的に供給することができ、かつ培養物を回収するための機構を備えた連続培養システムが好適である。
　微生物の培養においては、培養システム内への酸素の混入を防ぐことが必要である。そのための培養器は、通常の嫌気的培養に持ちられる培養槽がそのまま利用できる。微生物の培養にも利用することができる培養タンクは市販されている。培養槽内に混入する酸素を、窒素などの不活性気体などで置換することにより、嫌気的な雰囲気を作ることができる。
　たとえば、嫌気培養ジャーを、上記微生物を培養するためのバイオリアクターとすることができる。嫌気培養ジャーは、金属、ガラス、あるいは合成樹脂製の気密容器で構成され、内部を大気中の酸素から遮断することができる。
（その他の工程）
　本発明は、以下の工程を含んでもよい。
　本発明は、例えば、得られた８－プレニルナリンゲニンを定量する工程を含んでもよい。定量方法は常法に従うことができる。たとえば、培養液の一部を採取して適宜希釈し、よく撹拌した後、ポリテロラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）膜などの膜を使用して濾過し、不溶物を除去したものを高速液体クロマトグラフィー定量することなどが挙げられる。
　また、本発明は、上記工程で得られた８－プレニルナリンゲニンを回収する工程を含んでもよい。当該回収工程は、精製工程、濃縮工程等であってよい。精製工程における精製処理としては、熱などによる微生物の殺菌；精密濾過（ＭＦ）、限外濾過（ＵＦ）などによる除菌；固形物、高分子物質の除去；有機溶媒やイオン性液体などによる抽出；疎水性吸着剤、イオン交換樹脂、活性炭カラム等を用いた吸着、脱色といった処理を行うことができる。また、濃縮工程における濃縮処理としては、エバポレーター、逆浸透膜等による濃縮が挙げられる。
　さらに、８－プレニルナリンゲニンを含む溶液は、凍結乾燥、噴霧乾燥などにより粉末化することができる。粉末化において、ラクトース、デキストリン、コーンスターチ等の賦形剤を添加することもできる。
　以下、具体的な実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
　ＡＢＢ培地（Ｏｘｏｉｄ社製）に、イソキサントフモール（ナカライテスク社製）を添加した後、加熱滅菌し、気相をＮ２：ＣＯ２：Ｈ２（８０％／１０％／１０％）ガスで置換したものを基本培地とした。最終濃度５ｍｇ／Ｌのイソキサントフモールを含む培地に、ブラウティア・コッコイデス（Blautia coccoides）JCM 1395株、ブラウティア・シンキ（Blautia schinkii）JCM 14657株、又はブラウティア・ホミニス（Blautia hominis）JCM 32276株を植菌し、３７℃で嫌気的に培養した。培養終了後、培養液５ｍＬに対して等量の酢酸エチル（１．５％ギ酸）でプレニルフラボノイド類を抽出し、得られた酢酸エチル相を回収後、乾固させた。このようにして得た乾固物をメタノール０．５ｍＬに再溶解し、ＨＰＬＣによりプレニルフラボノイド類の定量分析を行った。
　ＨＰＬＣは以下に記載の条件で行った。LKT Laboratories社製のプレニルフラボノイド類を標品として用い、DMSOに溶解して用いた。
ＨＰＬＣ条件：
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ　ＯＤＳ‐３（２５０×４．６ｍｍ）（ＧＬ　Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）
溶離液：Ａ液（水／ギ酸＝９９／１）、Ｂ液（アセトニトリル／ギ酸＝９９／１）、およびＢ液２０％～７０％のグラジェント
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出：２９０ｎｍ
　その結果、１週間の培養により、表１に示すとおりブラウティア・コッコイデス（Blautia coccoides）JCM 1395株を用いた場合は、添加したイソキサントフモールの９６．９％が８－プレニルナリンゲニンに変換され、ブラウティア・シンキ（Blautia schinkii）JCM 14657株を用いた場合には、添加したイソキサントフモールの７．９％が８－プレニルナリンゲニンに変換され、ブラウティア・ホミニス（Blautia hominis）JCM 32276株を用いた場合には、添加したイソキサントフモールの９８．８％が８－プレニルナリンゲニンに変換された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本発明によれば、イソキサントフモールから８－プレニルナリンゲニンを産生する能力を有する、ブラウティア・コッコイデス（Blautia coccoides）に属する微生物、ブラウティア・シンキ（Blautia schinkii）に属する微生物、及びブラウティア・ホミニス（Blautia hominis）に属する微生物からなる群から選択される一又はそれ以上の微生物を用いることによって、効率的に８－プレニルナリンゲニンを製造することができる。
　本発明により得られる８－プレニルナリンゲニンを、化粧品、医薬部外品、医療用品、衛生用品、医薬品、飲食品（サプリメントを含む。）等に用い、ヒトを含む対象がそれを使用又は摂取等することにより、８－プレニルナリンゲニンによる公知の効果を簡便に得ることができる。

Claims (4)

  1. 　イソキサントフモールを含有する溶液において、イソキサントフモールから８－プレニルナリンゲニンを産生する能力を有する、ブラウティア・コッコイデス（Blautia coccoides）に属する微生物、ブラウティア・シンキ（Blautia schinkii）に属する微生物、及びブラウティア・ホミニス（Blautia hominis）に属する微生物からなる群から選択される一又はそれ以上の微生物に、イソキサントフモールから８－プレニルナリンゲニンを産生させる工程を含む、８－プレニルナリンゲニンの製造方法。
  2. 　前記ブラウティア・コッコイデス（Blautia coccoides）に属する微生物が、ブラウティア・コッコイデス（Blautia coccoides）ＪＣＭ　１３９５株である、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　前記ブラウティア・シンキ（Blautia schinkii）に属する微生物が、ブラウティア・シンキ（Blautia schinkii）ＪＣＭ　１４６５７株である、請求項１又は２に記載の製造方法。
  4. 　前記ブラウティア・ホミニス（Blautia hominis）に属する微生物が、ブラウティア・ホミニス（Blautia hominis）ＪＣＭ　３２２７６株である、請求項１～３のいずれか一項に記載の製造方法。
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