WO2020003739A1 - 発酵ビール様発泡性飲料の製造方法及びオフフレーバー低減方法 - Google Patents

発酵ビール様発泡性飲料の製造方法及びオフフレーバー低減方法 Download PDF

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WO2020003739A1
WO2020003739A1 PCT/JP2019/018228 JP2019018228W WO2020003739A1 WO 2020003739 A1 WO2020003739 A1 WO 2020003739A1 JP 2019018228 W JP2019018228 W JP 2019018228W WO 2020003739 A1 WO2020003739 A1 WO 2020003739A1
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fermentation
yeast
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fermentation raw
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PCT/JP2019/018228
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拓 入江
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アサヒグループホールディングス株式会社
アサヒビール株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
    • C12C11/00—Fermentation processes for beer
    • C12C11/003—Fermentation of beerwort
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
    • C12C11/00—Fermentation processes for beer
    • C12C11/02—Pitching yeast

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a fermentable beer-like effervescent beverage in which generation of an onion-like odor, which is one type of off-flavor, is reduced, and a method for reducing the off-flavor.
  • This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2018-124460 for which it applied to Japan on June 29, 2018, and uses the content here.
  • off-flavors such as kogane odor, sun odor-like odor, and onion-like odor may be observed. Control of these off-flavors is important.
  • 2-mercapto-3-methyl-1-butanol (hereinafter sometimes abbreviated as “2M3MB”), which is considered to be a substance causing onion-like odor, which is one of the off-flavors, is a precursor substance.
  • a certain 2,3-epoxy-3-methylbutanal (hereinafter sometimes abbreviated as "EMBal”) was identified, and a quantitative technique in wort, fermented broth and beer was established. 2M3MB is produced from EMBal by yeast in the presence of oxygen during the fermentation process. EMBal is produced from its precursor in the presence of oxygen. (For example, see Patent Document 1).
  • Non-Patent Document 1 in a “multiple filling” process in which the number of fillings is three, the addition of yeast is concentrated in the first wort, and only the aeration treatment is performed in the second and third worts. It is disclosed that by carrying out, a beer containing a high concentration of alcohol can be brewed. According to Non-Patent Document 2, in the “multiple filling” process, the shorter the time interval of filling wort prepared from the charging into the fermenter, the higher the amount of SO 2 generated and the higher the antioxidant activity of beer. It has been disclosed.
  • Non-Patent Document 3 discusses the effect on the flavor and antioxidant activity of beer by changing the timing of the addition and aeration of yeast in a “multiple-filling” process in which the number of fillings is four. It is disclosed that beer excellent in flavor and antioxidant activity can be obtained by concentrating the addition and aeration of wort to the first wort.
  • Non-Patent Documents 1 to 3 do not mention the control of 2M3MB production.
  • the value of the precursor EMBal at the start of fermentation can be reduced, and thus the amount of 2M3MB in the beer-like sparkling beverage can be reduced.
  • yeast fermentation requires oxygen, and a decrease in the amount of oxygen supplied to yeast may cause a delay in the consumption of extracts, which is the primary purpose of fermentation, and may cause the production of other unpleasant odor substances.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and has a reduced fermented beer-like sparkling beverage in which the content of 2M3MB, which is a main causative substance of onion-like odor, is reduced while maintaining a good fermentation rate by yeast. And a method for reducing off-flavors.
  • the present inventors have conducted intensive studies to achieve the above object, and as a result, in the "multiple filling" process, increase the yeast concentration in the initial stage of fermentation and promote the consumption of oxygen in the fermentation raw material solution by the yeast. And, by performing aeration on all the fermentation raw material liquids filled in the fermenter, the content of 2M3MB, which is the main causative substance of the onion-like odor, is reduced while maintaining the fermentation rate by the yeast at a good level. It has been found that a fermented beer-like sparkling beverage can be obtained, and the present invention has been completed.
  • the present invention includes the following aspects [1] to [11].
  • [1] A method for producing a fermentable beer-like effervescent beverage in which a fermentation raw material liquid to which yeast is added is fermented in a fermenter, The fermentation raw material liquid that has been aerated after the cooling tube has been removed in the flotation tank is divided into n times (n is an integer of 2 or more) and injected into the fermentation tank.
  • a method for producing a fermentable beer-like effervescent beverage wherein the yeast is added to the fermentation raw material liquid to be injected into the fermenter from the first to the (n-1) th time.
  • the fermentation raw material liquid to be injected into the fermenter from the first time to the (n-1) th time is injected into the flotation tank after adding the yeast, and before the addition of the yeast, simultaneously with the addition of the yeast, or The method for producing a fermentable beer-like effervescent beverage according to [1], wherein aeration treatment is performed after addition of the yeast and before injection into the flotation tank.
  • [4] The method for producing a fermentable beer-like effervescent beverage according to any one of [1] to [3], wherein n is an integer of 3 or more.
  • [5] The fermentable beer-like effervescent beverage according to any one of [1] to [4], wherein the amount of the fermentation raw material liquid to be injected into the fermenter in the first to n-th times is substantially equal.
  • Manufacturing method [6] The method according to any one of [1] to [5], wherein the amount of yeast added to the fermentation raw material liquid to be injected into the fermenter at the first to (n-1) th times is substantially equal.
  • the fermentation raw material liquid to be injected into the fermenter from the first time to the (n-1) th time is injected into the flotation tank after adding the yeast, and before the addition of the yeast, simultaneously with the addition of the yeast, or
  • the fermentation-derived off-flavor substance content is maintained while maintaining a good fermentation rate by yeast.
  • a fermentable beer-like effervescent beverage having a reduced content of 2M3MB, which is a main cause of onion-like odor, can be obtained.
  • DO Dissolved @Oxygen
  • fermented beer-like effervescent beverage is a beverage produced through a fermentation process, regardless of the use of alcohol content or malt, and has a flavor similar or similar to that of beer. ⁇ It means a sparkling beverage having taste and texture, high thirst and drinkability. That is, the fermented beer-like effervescent beverage may be an alcoholic beverage, or a so-called non-alcoholic beverage or a low alcoholic beverage having an alcohol content of less than 1% by volume. Further, the beverage may be a malt-based beverage, or may be a malt-free beverage.
  • the fermented beer-like sparkling beverage include beer, malt sparkling using malt as a raw material, sparkling alcoholic beverage not using malt, low alcohol sparkling beverage, non-alcoholic beer, and the like.
  • liqueurs obtained by mixing a beverage produced from malt through a fermentation step with an alcohol-containing distillate may be used.
  • the alcohol-containing distillate is a solution containing an alcohol obtained by a distillation operation, and may be, for example, a raw material alcohol, such as spirits, whiskey, brandy, vodka, rum, tequila, gin, and shochu. Sake or the like can be used.
  • the method for producing a fermented beer-like effervescent beverage of the present embodiment includes fermentation of yeast by fermentation raw material liquid prepared in a single preparation step. This is a method using a large fermenter capable of accommodating a plurality of batches.
  • the fermentation raw material liquid obtained in the preparation tank is filled into the fermentation tank each time it is prepared.
  • the fermentation raw material liquid to be injected into the fermenter at the Xth (X is an integer of 1 or more) times may be referred to as an “Xth batch”, for example, the first fermentation raw material liquid may be referred to as a “first batch”. is there.
  • the yeast required for one fermentation performed in a fermenter can be added to the fermentation raw material liquid at a time or can be added to all batches in equal amounts (hereinafter, referred to as “batch”). (Sometimes referred to as "yeast equivalent addition method”) (Non-patent Documents 1 to 3).
  • yeast in the “multiple filling” process of filling the fermenter with the fermentation raw material liquid n times, yeast is added in the first to (n ⁇ 1) th batches. In the nth batch, no yeast is added. Thereby, the amount of yeast in the fermenter at the initial stage of fermentation can be increased, and the consumption of oxygen by the yeast is promoted, thereby reducing the dissolved oxygen in the fermentation raw material liquid, compared to the yeast equivalent addition method. Can be. Therefore, the oxygen used for the generation of EMBal is reduced, and the generation of 2M3MB can be finally suppressed.
  • aeration treatment is performed on all the first to n-th batches.
  • dissolved oxygen required for yeast to maintain good fermentation can be secured in the fermentation raw material liquid in the fermenter.
  • the fermentation rate can be kept good.
  • the yeast extract is consumed during fermentation by adding the whole amount of yeast in the first to (n-1) th batches and performing aeration only in the nth batch. It is possible to reduce the dissolved oxygen in the fermentation raw material liquid in the initial stage of fermentation and suppress the production of EMBal and 2M3MB while maintaining the activity and maintaining the fermentation rate in a good condition.
  • 2M3MB is a substance causing off-flavored onion odor, and the onion-like odor increases depending on the content of 2M3MB. That is, according to the production method of the present embodiment, it is possible to produce a fermentable beer-like effervescent beverage in which the content of 2M3MB is small and the onion-like odor is suppressed.
  • the production method of the present embodiment the generation of off-flavor unpleasant odor substances caused by poor fermentation is also suppressed.
  • a fermentable beer-like effervescent beverage with reduced off-flavor is obtained. That is, the production method of the present embodiment can be rephrased as a method for reducing the off-flavor of the fermented beer-like sparkling beverage.
  • the 2M3MB content of the fermented beer-like effervescent beverage finally obtained by the production method of the present embodiment is preferably 0.5 ppb or less, more preferably 0.4 ppb or less, based on the total mass of the fermented beer-like effervescent beverage. Preferably, it is 0.1 ppb or less, more preferably 0 ppb (less than the detection limit). In the present specification, “ppb” means “ ⁇ g / L”.
  • the 2M3MB concentration of the fermented beer-like sparkling beverage can be measured according to the method of Iijima et al. (See Non-Patent Document 4). Specifically, it is measured by the following method.
  • the eluate is subjected to solvent extraction using a solution of ethyl acetate and dichloromethane, and the obtained organic solvent layer is dehydrated with anhydrous sodium sulfate. After dehydration, the organic solvent layer is concentrated at room temperature under a nitrogen stream, and the sulfur-containing compound contained in the organic solvent layer is quantified by GC / MS.
  • the details of the manufacturing method of the present embodiment will be described below.
  • the production method of the present embodiment is a general fermented beer-like process except that the addition and aeration of yeast when transferring the fermentation raw material liquid from the preparation tank to the fermentation tank are performed under specific conditions in the “multiple filling” process. It can be manufactured in the same manner as the sparkling beverage. Therefore, the manufacturing method of the present embodiment will be described together with a general method of manufacturing a fermented beer-like sparkling beverage.
  • a typical fermented beer-like effervescent beverage can be produced by the steps of preparation (preparation of fermentation raw material liquid), fermentation, storage, and filtration.
  • a fermentation raw material liquid is prepared from at least one selected from the group consisting of cereal raw materials and saccharide raw materials. Specifically, first, a mixture containing at least one of the cereal raw material and the saccharide raw material and the raw water is prepared and heated to saccharify the starch such as the cereal raw material.
  • a raw material of the sugar liquid only a cereal raw material may be used, only a saccharide raw material may be used, or both may be mixed and used.
  • the cereal raw material examples include barley and wheat, barley such as malt, rice, corn, beans such as soybean, potatoes, and the like.
  • the cereal raw material can be used as a cereal syrup, a cereal extract, or the like, but is preferably used as a crushed cereal obtained by crushing.
  • the crushing of the cereals can be performed by a conventional method.
  • the crushed cereal product may be one that has been subjected to a process usually performed before and after the crushing process, such as a crushed malt product, corn starch, and corn grits.
  • the crushed grain used is preferably a crushed malt.
  • the pulverized malt may be one obtained by germinating barley, for example, double-row barley by a conventional method, drying this, and then pulverizing the barley to a predetermined particle size.
  • the cereal raw material used in the present invention may be one kind of cereal raw material or a mixture of plural kinds of cereal raw materials.
  • crushed malt may be used as a main material, and crushed rice or corn may be used as a sub-material.
  • the saccharide raw material include saccharides such as liquid sugar.
  • the production method of the present embodiment may be applied to a method for producing a fermentable beer-like sparkling beverage having a malt use ratio (ratio of malt used in the entire fermentation raw material) of 100% by mass.
  • the ratio may be applied to a method for producing a fermented beer-like sparkling beverage having a ratio of more than 0% by mass and less than 100% by mass, or may be applied to a method for producing a fermented beer-like sparkling beverage that does not use malt as a fermentation raw material.
  • auxiliary raw materials may be added to the mixture containing the fermentation raw materials and the raw water.
  • auxiliary material include hops, dietary fiber, yeast extract, fruit juice, bittering agents, coloring agents, herbs, and fragrances.
  • saccharifying enzymes such as ⁇ -amylase, glucoamylase and pullulanase, and enzyme agents such as proteases can be added.
  • the saccharification treatment is performed using enzymes derived from cereal raw materials or the like, or enzymes added separately.
  • the temperature and time during the saccharification treatment depend on the type of the cereal raw material used, the ratio of the cereal raw material to the total fermentation raw material, the type of the added enzyme and the amount of the mixture, the quality of the intended fermented beer-like effervescent beverage, and the like. It is adjusted appropriately in consideration of the above.
  • the saccharification treatment can be performed by a conventional method such as holding a mixture containing a cereal raw material or the like at 35 ° C. or more and 70 ° C. or less for 20 minutes or more and 90 minutes or less.
  • a fermentable beer-like effervescent beverage having a desired flavor can be produced by appropriately adding a herb or the like before or during the boiling treatment.
  • hops are preferably added before or during the boiling treatment.
  • the amount of hops, the mode of addition (for example, addition in several portions), and the boiling conditions can be determined as appropriate.
  • one fermentation step is performed using a fermentation raw material liquid prepared in a plurality of charging steps using a fermentation tank having a capacity twice or more the capacity of the charging tank. That is, the fermentation raw material liquid prepared in the charging step is transferred to the fermenter.
  • a large fermenter for example, 280 to 500 kL.
  • the number of times (n) of filling the fermentation raw material liquid into the fermentation tank may be two or more, and is determined by the difference between the capacities of the fermentation tank and the charging tank. For example, it can be three or more times, three or more and six or less, and three or more and five or less.
  • the amount of the fermentation raw material liquid to be injected into the first to n-th fermenters may be different from each other. From the viewpoint of fermentation, it is preferable that the amounts are substantially equal.
  • “the volumes of the first to n-th batches are substantially equivalent” means that the volumes of the first to n-th batches are equal or the volumes of the first to n-th batches are equal. Is within an extremely small error range of about ⁇ 5% by volume.
  • the removal of lees such as proteins generated by precipitation from the broth (fermentation raw material liquid) prepared in the charging step may be performed by any solid-liquid separation treatment, but is generally called a whirlpool.
  • the sediment (hot tube) is removed using a bath.
  • the temperature of the broth is generally from about 50 ° C. to about 95 ° C.
  • the fermentation raw material liquid after removing the heat tube is cooled to an appropriate fermentation temperature by a heat exchanger such as a plate cooler.
  • lees (cold trove) generated by cooling is also removed from the fermentation raw material liquid.
  • the removal of the cold tube can be performed using, for example, a flotation tank.
  • the fermentation raw material liquid from which the cold tube has been removed may be directly injected into the fermenter, or may be adjusted into a desired extract concentration and then injected into the fermenter.
  • Air (air) used in the aeration process performed during the transfer process is a source of oxygen for yeast.
  • the composition of the air only needs to contain oxygen, and for example, the composition of the standard atmosphere (about 80% of nitrogen, about 20% of oxygen and other gas components) can be exemplified.
  • the aeration treatment is performed on the fermentation raw material liquid from which the cold tube has been removed before filling the fermentation tank.
  • the “multiple filling” process when the fermentation raw material liquid is directly charged into the fermenter, the fermentation raw material liquid does not mix uniformly in the fermenter, and the fermentation state becomes uneven in the fermenter.
  • the aeration process may be performed before the removal of the cold probe.
  • the yeast is added not during addition to the fermenter but during the transfer step to the fermenter in order to mix the yeast with the fermentation raw material liquid as uniformly as possible.
  • the timing of adding the yeast to the fermentation raw material liquid may be any point before the fermentation raw material liquid is reduced to a temperature range in which the yeast can survive and before the fermentation liquid is injected into the fermenter.
  • yeast requires a certain amount of oxygen for preferable alcoholic fermentation.
  • yeast can be added before and after aeration before injection into a fermentation tank or before and after aeration before injection into a flotation tank.
  • the primary aeration device 4, the flotation tank 5, and the secondary aeration device 6 are provided downstream of the heat exchanger 3 and upstream of the fermenter 7. It can be performed using the part 10 of the beer brewing apparatus connected in this order.
  • the primary aeration device 4, the flotation tank 5, and the secondary aeration device 6, which are connected to the downstream side of the heat exchanger 3 and the upstream side of the fermenter 7, and the piping connecting them. May be collectively referred to as a “fermentation material liquid transfer system”.
  • the fermentation raw material liquid is cooled to an appropriate fermentation temperature.
  • the primary aeration apparatus 4 air is injected into the fermentation raw material liquid.
  • the coagulated matter (cold trove) in the fermentation raw material liquid cooled by the heat exchanger can be efficiently floated. Further, oxygen can be dissolved in the fermentation raw material liquid.
  • the primary aeration process may or may not be performed.
  • the coagulated matter (cold trove) in the cooled fermentation raw material liquid is separated. Further, for example, when yeast is added before the flotation tank 5, the yeast in the flotation tank 5 consumes dissolved oxygen in the fermentation raw material liquid by the air injected by the primary aeration device 4 and is activated. Is done.
  • the secondary aeration apparatus 6 air is injected into the fermentation raw material liquid after the removal of the cold tube.
  • the fermentation material liquid from which the cold tube has been removed to be filled in the fermentation tank 7 and the fermentation material liquid already filled in the fermentation tank 7 can be sufficiently stirred, so that the fermentation tank can be uniformly mixed. It can be fermented.
  • a sufficient amount of oxygen can be dissolved in the fermentation raw material liquid. For example, when yeast is added before the flotation tank 5, the dissolved oxygen in the fermentation raw material liquid due to the air injected by the primary aeration device 4 is consumed by the yeast in the flotation tank 5 and decreases.
  • oxygen can be sufficiently supplied to the yeast.
  • alcohol fermentation by yeast is performed using the fermentation raw material liquid as a substrate.
  • the beer brewing apparatus used in the production method of the present embodiment has a boiler (not shown) for boiling the fermentation raw material liquid upstream of the heat exchanger 3 and a coagulate ( A whirlpool 1 for separating the heat trove may be further provided in this order.
  • the beer brewing apparatus used in the production method of the present embodiment includes a pipe between the boiling pot and the whirlpool 1, a pipe between the whirlpool 1 and the heat exchanger 3, a pipe between the flotation tank 5 and the fermenter 7. And a pump for pumping the fermentation raw material liquid.
  • the beer brewing apparatus used in the production method of the present embodiment assists dissolution by stirring the injected air and the fermentation raw material liquid downstream of the primary aeration apparatus 4 and upstream of the flotation tank 5.
  • a static mixer may be further provided. Further, a static mixer may be further provided downstream of the secondary aeration apparatus 6 and upstream of the fermenter 7.
  • FIG. 1 illustrates an example in which the fermenter 7 is connected to a one-line fermentation material liquid transfer system, but the fermenter 7 may be connected to two or more fermentation material liquid transfer systems. When two or more fermentation material liquid transfer systems are connected, the fermentation tank 7 can be more efficiently filled with the fermentation material liquid.
  • a method for filling the fermentation raw material liquid into the fermenter 7 using the apparatus shown in FIG. 1 will be described below.
  • the fermentation raw material liquid cooled by the heat exchanger 3 is sent to the primary aeration apparatus 4 via the pipe 2b, and air is injected.
  • the standing time can be, for example, 0 minutes or more and 5 hours or less, and can be 30 minutes or more and 3 hours or less.
  • the fermentation raw material liquid from which the cold tube has been removed is sent to the secondary aeration apparatus 6 via the pipe 2d, and air is injected.
  • the secondary aeration treatment it is possible to sufficiently agitate the fermentation raw material liquid from which the cold tube has been removed to be filled into the fermentation tank 7 and the fermentation raw material liquid already filled in the fermentation tank 7, It can be fermented uniformly. Further, oxygen can be dissolved in the fermentation raw material liquid, and this oxygen is consumed by the yeast in the fermenter 7.
  • the fermentation raw material liquid into which air has been injected is filled into the fermenter 7 via the pipe 2e.
  • the amount of primary aeration and the amount of secondary aeration are not particularly limited.
  • the amount of aeration may be 4% by volume or more and 10% by volume or less of the flow rate of the fermentation raw material liquid flowing through each aeration apparatus, and is preferably 5% by volume or more and 9% by volume or less.
  • the dissolved oxygen of the fermentation raw material liquid after the aeration treatment can be adjusted to 0.6 ppm or more and 6.0 ppm or less.
  • the dissolved oxygen can be measured using a dissolved oxygen meter.
  • "ppm" indicates "mg / L".
  • the interval at which the fermentation raw material liquid of each batch is filled into the fermenter is preferably within 5 hours, more preferably within 3 hours, and more preferably within 2 hours. Is more preferred.
  • the filling interval is equal to or less than the upper limit, in addition to shortening the time required for the production of fermented beer-like sparkling beverage, the fermentation raw material liquid containing a sufficient amount of oxygen by aeration at short intervals
  • oxygen is supplied to the yeast at an appropriate timing at an early stage of fermentation and activated. Since the yeast activated at an appropriate timing consumes oxygen in a shorter cycle, the effect of the production method of the present embodiment can be sufficiently exhibited.
  • yeast is added to the fermentation raw material liquid of each batch.
  • the timing for adding the yeast can be any timing before injection into the fermenter, and may be any of the timings (A) to (F) shown in FIG. Above all, it is preferable to add the yeast to the fermentation raw material liquid before injecting into the flotation tank, since the contact of the yeast with oxygen can be maximized and the yeast can be more effectively activated.
  • the timing of adding yeast is the timing of (A), (B) or (C), that is, before adding yeast, simultaneously with adding yeast, or adding yeast.
  • the primary aeration treatment is performed after the addition of the yeast and before the injection into the flotation tank, and the timing of adding the yeast is the timing of (C), that is, the primary aeration treatment is performed before the addition of the yeast. More preferably.
  • the fermentation raw material liquid cooled in the heat exchanger 3 is filled into the flotation tank 5 via the pipes 2b and 2c, and left still.
  • the primary aeration process may or may not be performed. Above all, it is preferable not to perform the primary aeration treatment from the viewpoint of reducing the dissolved oxygen in the fermentation raw material liquid.
  • the fermentation raw material liquid from which the cold tube has been removed is sent to the secondary aeration apparatus 6 via the pipe 2d, and air is injected.
  • the secondary aeration treatment it is possible to sufficiently agitate the fermentation raw material liquid from which the cold tube has been removed to be filled into the fermentation tank 7 and the fermentation raw material liquid already filled in the fermentation tank 7, It can be fermented uniformly.
  • the fermentation raw material liquid into which air has been injected is filled into the fermenter 7 via the pipe 2e.
  • yeast is not added in the n-th batch, and the entire amount of yeast necessary for fermentation is added in the first to (n-1) -th batches.
  • the yeast concentration in the fermenter at the beginning of fermentation specifically, immediately before the n-th batch is injected into the fermenter, can be made higher than the yeast uniform addition method.
  • the dissolved oxygen in the fermenter is efficiently consumed by the high-concentration yeast, and the dissolved oxygen provided for the production of EMBal decreases. Thereby, the concentration of EMBal generated in the fermenter is reduced, and the concentration of 2M3MB contained in the final fermented beer-like sparkling beverage can be reduced.
  • the amount of yeast added to the first to (n-1) th batches may be different, but is preferably substantially equal. This allows the yeast to be evenly in contact with oxygen and is more efficiently activated, so that the fermentation can proceed uniformly.
  • the amount of yeast is substantially equivalent means that the amount of yeast (yeast concentration) is equal (equal concentration) or the amount of yeast (yeast concentration) is about ⁇ 5% by mass. Means that the amount (density) is within a very small error range.
  • fermentation process is performed using a fermentation raw material liquid that has been injected into a fermenter and to which yeast has been added.
  • the yeast used for fermentation is not particularly limited, and can be appropriately selected from yeasts usually used for producing alcoholic beverages.
  • the fermentation yeast may be a top fermentation yeast or a bottom fermentation yeast, but is preferably a bottom fermentation yeast because it is easily applied to a large-scale brewing facility.
  • the fermentation temperature is not particularly limited.
  • the fermentation can be performed at 0 ° C or higher and 15 ° C or lower, and preferably at 4 ° C or higher and 12 ° C or lower.
  • the obtained fermented liquid is aged in a liquor storage tank as a liquor storage step, and is stored and stabilized at a low temperature condition of about 0 ° C.
  • the fermented liquid after aging is filtered to remove yeasts, insoluble proteins and the like in the temperature range, and obtain an intended fermented beer-like effervescent beverage.
  • the filtration treatment may be any method capable of removing yeast by filtration, and examples thereof include diatomaceous earth filtration and filter filtration with a filter having an average pore size of about 0.4 ⁇ m or more and 0.6 ⁇ m or less.
  • the sulfur-containing compound was eluted from the resin with 100 mL of 0.1 M sodium acetate buffer (pH 6) containing 10 mg / mL L-cysteine hydrochloride.
  • the obtained eluate was subjected to solvent extraction twice using 0.5 mL of ethyl acetate and 5 mL of a dichloromethane solution, and the obtained organic solvent layer was dehydrated with anhydrous sodium sulfate.
  • the sulfur-containing compound contained in the organic solvent layer was quantified by GC / MS.
  • the liquid passed through the solid phase extraction column was collected, extracted with 3 mL of dichloromethane, and the solvent layer was recovered. This solvent extraction operation was repeated three times, and 5 g of anhydrous sodium sulfate was added to a mixture of all the collected solvent layers, followed by dehydration for 30 minutes or more. Thereafter, the mixture was concentrated to about 500 ⁇ L with a nitrogen purge. Next, the quantification was performed by GC / MS under the same conditions as in the above 2M3MB except that the quantification was performed by comparing the peak area area of the EMBal with the peak area area of the internal standard product.
  • Appearance extract refers to an extract of a fermentable beer-like sparkling beverage expressed as the sucrose concentration (usually mass%) of an aqueous sucrose solution having the same specific gravity at 20 ° C.
  • sucrose concentration usually mass%
  • sucrose concentration usually mass% of the sucrose aqueous solution having the same specific gravity at 20 ° C. It was calculated as an appearance extract (% P).
  • P means a value calculated based on a conversion table of Plateo.
  • the concentration of ethyl acetate and the concentration of isoamyl acetate were measured as follows. First, 6.0 g of ammonium sulfate was measured in a 50 mL centrifuge tube, 30 g of an ice-cooled fermentation broth was added, and the mixture was immediately cooled with ice. Next, an internal standard substance was added to the centrifuge tube, and 3.0 mL of a carbon disulfide solution was added. Thereafter, the centrifugal tube was shaken at 200 rpm for 10 minutes, and then centrifuged to collect a carbon disulfide layer. 0.5 mL of the recovered carbon disulfide solution was subjected to gas chromatography, and the concentrations of ethyl acetate and isoamyl acetate were detected and quantified.
  • the centrifugal tube was shaken at 200 rotations (rpm) for 10 minutes, and then centrifuged to collect a carbon disulfide layer.
  • 0.5 mL of the recovered carbon disulfide solution was subjected to gas chromatography to detect and quantify isoamyl alcohol.
  • the apparatus shown in FIG. 1 was used to transfer the prepared fermentation raw material liquid.
  • a heat trove such as hop cake was separated from the fermentation raw material liquid and passed through the heat exchanger 3 to cool the fermentation raw material liquid to 5 ° C.
  • the cooled fermentation raw material liquid was transferred to a fermenter (capacity: 280 kL) under the conditions shown in Table 1 below, and a beer brewing test was performed.
  • the yeast was added at the timing shown in FIG. Since 70 kL of the fermentation raw material liquid was prepared per charge and charging was performed four times, the total amount of the fermentation raw material liquid used in each test was 280 kL. The interval of the charging time was 1 hour and 20 minutes.
  • the concentration of the yeast used was about 25 ⁇ 10 6 cells / mL.
  • a test using the same yeast was performed twice for each condition.
  • Example 1 DO at the fourth filling was higher than Comparative Example 1-1. This was presumed to be because the primary aeration and the secondary aeration were injected in the fourth fermentation raw material liquid but yeast was not added, and the fermenter was filled without consuming oxygen. . On the other hand, also in Example 2, although DO increased in the fourth filling than in the third filling, the increase was small. This was presumed to be because only the secondary aeration was injected, the injection of the primary aeration and the addition of the yeast were not performed, and the DO increased only for the secondary aeration. From the above results, in Example 2, it was confirmed that DO at the time of completion of the fourth filling, that is, at the time of completion of filling, was almost equivalent to Comparative Example 1-2.
  • Table 3 (EMBal) and Table 4 (2M3MB) show the measurement results of the EMBal concentration (ppb) and the 2M3MB concentration (ppb), respectively.
  • first time and second time are the measurement results of each of the same tests performed twice, and “average” is the value of “first time” and “second time”. It is an average value.
  • Example 2 From Tables 3 and 4, the EMBal concentration at the end of the filling of the fermentation raw material liquid into the fermenter was almost equal in Example 1 as compared with Comparative Example 1-1. On the other hand, in Example 2, a decrease of 20% was observed as compared with Comparative Example 1-2. Further, the 2M3MB concentration at the end of fermentation was confirmed to be lower in both Example 1 and Example 2 than in Comparative Example 1-1 and Comparative Example 1-2, respectively, but about 10% in Example 1. Whereas in Example 2, the drop was about 30%.
  • isoamyl alcohol a higher alcohol used as a substrate for isoamyl acetate
  • SO 2 concentration similar to the concentration of the acetic acid esters, are believed to have the oxygen consumption and negative correlation of the yeast. The SO 2 concentration was reduced in Example 1, indicating that the oxygen consumption of the yeast was higher than in Comparative Example 1-1.
  • Example 2 the fermentation rate was improved as compared with the test conditions of Comparative Example 1-1 and Comparative Example 1-2, and the content of 2M3MB was reduced. It was confirmed that a fermented beer-like sparkling beverage could be obtained. In addition, it was confirmed that the generation of the fragrance component was equivalent to the test conditions of Comparative Example 1-2 under the test conditions of Example 2.
  • Test Example 2 (1) Preparation and transfer of fermentation raw material liquid Wort was prepared using the same method as in Test Example 1. The apparatus shown in FIG. 1 was used to transfer the prepared fermentation raw material liquid. First, in the whirlpool 1, a heat trove such as hop cake was separated from the fermentation raw material liquid and passed through the heat exchanger 3 to cool the fermentation raw material liquid to 5 ° C. Further, under the conditions shown in Table 6 below, the cooled fermentation raw material liquid was transferred to a fermentation tank (capacity: 500 kL), and a beer brewing test was performed. The yeast was added at the timing shown in FIG. 1C, that is, after the primary aeration process and before the injection into the flotation tank.
  • Example 3 Since 125 kL of the fermentation raw material liquid was prepared per charge and charging was performed four times, the total amount of the fermentation raw material liquid used in each test was 500 kL. The interval of the charging time was 1 hour and 50 minutes. The concentration of the yeast used was about 17 ⁇ 10 6 cells / mL. About Example 3 and Comparative Example 3, the test using the same yeast was performed twice. For Comparative Example 2, the conditions are described for reference.
  • Comparative Example 3 showed a delay in fermentation in Comparative Example 3 with respect to Example 3 regarding “Appearance extract at lowering” and “Extract 2% P arrival time” indicating the state of extract consumption during fermentation. This is because, in Comparative Example 3, the supply of oxygen to the yeast was insufficient due to not performing the secondary aeration at the fourth charging, and the fermentation raw material liquid in the fermenter was sufficiently stirred when the fermentation raw material liquid expired. It was presumed that fermentation was not uniform and fermentation was delayed. Both the ethyl acetate concentration and the isoamyl acetate concentration were reduced in Example 3 compared to Comparative Example 3. On the other hand, the isoamyl alcohol concentration was higher in Example 3 than in Comparative Example 3.
  • Example 3 The SO 2 concentration was reduced in Example 3 as in the case of the acetates. These results show that the oxygen in the fermentation raw material liquid was reduced. Under the test conditions of Example 3, the yeast in the fermentation raw material liquid efficiently consumed oxygen, and the fermentation progressed favorably. Conceivable. Therefore, according to the test conditions of Example 3, it was confirmed that fermentation proceeded favorably and a fermentable beer-like effervescent beverage having a reduced content of 2M3MB was obtained.
  • the content of 2M3MB which is the main causative substance of the onion-like odor, while maintaining the fermentation rate by yeast at a good level.
  • a reduced fermented beer-like sparkling beverage can be obtained.
  • SYMBOLS 1 Whirlpool (settling tank), 2a, 2b, 2c, 2e ... Piping, 3 ... Heat exchanger, 4 ... Primary aeration apparatus, 5 ... Flotation tank, 6 ... Secondary aeration apparatus, 7 ... Fermentation tank, 10 ... A part of beer brewing equipment.

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Abstract

発酵ビール様発泡性飲料の製造方法は、酵母を添加した発酵原料液を発酵槽内で発酵させる発酵ビール様発泡性飲料の製造方法であって、フローテーションタンク中で冷トルーブが除去された後にエアレーション処理された発酵原料液を、ｎ回（ｎは２以上の整数）に分けて発酵槽へ注入し、酵母は、１回目～ｎ－１回目に発酵槽に注入される発酵原料液に添加される方法が提供される。

Description

発酵ビール様発泡性飲料の製造方法及びオフフレーバー低減方法
　本発明は、オフフレーバーの１種であるタマネギ様臭の発生が低減された発酵ビール様発泡性飲料の製造方法及びオフフレーバー低減方法に関する。
　本願は、２０１８年６月２９日に日本に出願された特願２０１８－１２４４６０号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　ビールや発泡酒等の発酵ビール様発泡性飲料においては、コゲ臭・日光臭様臭やタマネギ様臭等のオフフレーバーが認められる場合があり、発酵ビール様発泡性飲料の品質向上のためには、これらのオフフレーバーの制御が重要である。オフフレーバーの１種であるタマネギ様臭の原因物質であるとされている２－メルカプト－３－メチル－１－ブタノール（以下、「２Ｍ３ＭＢ」と略記する場合がある）について、その前駆体物質である２，３－エポキシ－３－メチルブタナール（以下、「ＥＭＢａｌ」と略記する場合がある）が同定され、麦汁、発酵液及びビール中における定量技術が確立された。２Ｍ３ＭＢは、発酵工程において、酸素存在下で酵母によりＥＭＢａｌから産生される。ＥＭＢａｌは、その前駆体から、酸素存在下で産生される。（例えば、特許文献１参照）。
　一方、現在の大型醸造場でのビール醸造においては、仕込複数回分の麦汁を収容できる大型発酵タンクにて発酵を行うことが一般的である。麦汁は、仕込より調製される都度、発酵槽に移し替えられる。このような「複数回充填仕込」プロセスでは、発酵の初期条件は、各麦汁における酵母の添加（ピッチング）、通気（エアレーション）及び充填の条件の影響を受け、非常に多様である。この多様性は、その後の発酵プロセスの過程及び得られるビールの品質に影響を及ぼす可能性がある。特に、麦汁への酵母の添加や、これに合わせて実施される麦汁へのエアレーションのタイミング及び量を変化させることで、発酵における酵母の代謝生産物の生成が変化し、その結果、製品の香味特性が変化する。このため、この「複数回充填」プロセスの最適化は、多くの醸造業者にとって大きな問題であり、多くの研究が報告されている。
　例えば、非特許文献１では、充填回数が３回である「複数回充填」プロセスにおいて、酵母の添加を仕込１回目の麦汁に集約し、２回目及び３回目の麦汁にはエアレーション処理のみを行うことで、高濃度のアルコールを含有するビールが醸造できることが開示されている。
　非特許文献２では、「複数回充填」プロセスにおいて、仕込より調製される麦汁を発酵槽に充填する時間間隔が短いほど、ＳＯ２の発生量が高まり、ビールの抗酸化活性が高まることが開示されている。
　非特許文献３では、充填回数が４回である「複数回充填」プロセスにおいて、酵母の添加及びエアレーションのタイミングを変化させることによるビールの香味及び抗酸化活性に及ぼす影響について検討しており、酵母の添加及びエアレーションを仕込１回目の麦汁に集約することで、香味及び抗酸化活性に優れたビールが得られることが開示されている。
国際公開第２０１８／００８１７５号
Yokoyama A et al., "The effect of filling procedures on multi-fill fermentations.", MBAA TQ, Vol. 34, No. 1, p320-327, 1997. Forster C et al., "Pitching and filling procedures of cylindro-conical fermentation tanks and its influence on the anti-oxidant activity of beer.", MBAA TQ, Vol. 37, No. 1, p59-64, 2000. Tenge C et al., "Effects of different aeration techniques in pitching technology.", Brauwelt international, Vol. 25, No. 2, p86-89, 2007. Iijima et al.，"Construction and evaluation of self-cloning bottom-fermenting yeast with high SSU1 expression.", Journal of Applied Microbiology，Vol.109, p.1906-1913, 2010.
　しかしながら、非特許文献１～３は、２Ｍ３ＭＢの産生制御については言及していない。
　麦汁への酸素付与を極力低減させることで、前駆体であるＥＭＢａｌの発酵開始時の値を低減することができ、ひいてはビール様発泡性飲料中の２Ｍ３ＭＢ量を低減させることができる。しかしながら、酵母の発酵には酸素が必要であり、酵母への酸素供給量が減少すると、発酵の本来の目的であるエキス消費の遅延や、それに伴う他の不快臭物質の生成を引き起こす虞があった。
　本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、酵母による発酵速度を良好に保ちながら、タマネギ様臭の主な原因物質である２Ｍ３ＭＢの含有量が低減された発酵ビール様発泡性飲料の製造方法及びオフフレーバー低減方法を提供する。
　本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、「複数回充填」プロセスにおいて、発酵初期の酵母濃度を増大させて、発酵原料液中の酸素の酵母による消費を促進させ、かつ、発酵槽に充填される全ての発酵原料液に対してエアレーションを行うことにより、酵母による発酵速度を良好に保ちながら、タマネギ様臭の主な原因物質である２Ｍ３ＭＢの含有量が低減された発酵ビール様発泡性飲料が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、以下の［１］～［１１］に示す態様を含む。
［１］酵母を添加した発酵原料液を発酵槽内で発酵させる発酵ビール様発泡性飲料の製造方法であって、
　フローテーションタンク中で冷トルーブが除去された後にエアレーション処理された発酵原料液を、ｎ回（ｎは２以上の整数）に分けて発酵槽へ注入し、
　酵母は、１回目～ｎ－１回目に発酵槽に注入される発酵原料液に添加される、発酵ビール様発泡性飲料の製造方法。
［２］１回目～ｎ－１回目に発酵槽に注入される発酵原料液は、酵母を添加された後にフローテーションタンクに注入され、かつ酵母の添加の前に、酵母の添加と同時に、又は酵母の添加後であってフローテーションタンク注入の前に、エアレーション処理される、［１］に記載の発酵ビール様発泡性飲料の製造方法。
［３］冷トルーブ除去後、発酵槽注入前の発酵原料液に対してなされるエアレーション処理によって、前記発酵原料液の流量の５体積％以上９体積％以下の空気を注入する、［１］又は［２］に記載の発酵ビール様発泡性飲料の製造方法。
［４］ｎが３以上の整数である、［１］～［３］のいずれか一つに記載の発酵ビール様発泡性飲料の製造方法。
［５］１回目～ｎ回目に発酵槽に注入される発酵原料液の量は実質的に等量である、［１］～［４］のいずれか一つに記載の発酵ビール様発泡性飲料の製造方法。
［６］１回目～ｎ－１回目に発酵槽に注入される発酵原料液に添加される酵母の量は実質的に等量である、［１］～［５］のいずれか一つに記載の発酵ビール様発泡性飲料の製造方法。
［７］発酵槽に発酵原料液を注入する時間間隔が５時間以内である、［１］～［６］のいずれか一つに記載の発酵ビール様発泡性飲料の製造方法。
［８］フローテーションタンク中で冷トルーブが除去された後にエアレーション処理された発酵原料液を、ｎ回（ｎは２以上の整数）に分けて発酵槽へ注入し、酵母は、１回目～ｎ－１回目に発酵槽に注入される発酵原料液に添加される、発酵ビール様発泡性飲料のオフフレーバー低減方法。
［９］１回目～ｎ－１回目に発酵槽に注入される発酵原料液は、酵母を添加された後にフローテーションタンクに注入され、かつ酵母の添加の前に、酵母の添加と同時に、又は酵母の添加後であってフローテーションタンク注入の前に、エアレーション処理される、［８］に記載の発酵ビール様発泡性飲料のオフフレーバー低減方法。
［１０］オフフレーバーの原因物質が２－メルカプト－３－メチル－１－ブタノールである、［８］又は［９］に記載の発酵ビール様発泡性飲料のオフフレーバー低減方法。
［１１］前記発酵ビール様発泡性飲料の前記２－メルカプト－３－メチル－１－ブタノールの含有量を、発酵ビール様発泡性飲料の総質量に対して、０．４ｐｐｂ以下に低減する、［１０］に記載の発酵ビール様発泡性飲料のオフフレーバー低減方法。
　上記態様の発酵ビール様発泡性飲料の製造方法及び上記態様の発酵ビール様発泡性飲料のオフフレーバー低減方法によれば、酵母による発酵速度を良好に保ちながら、発酵由来のオフフレーバー物質含有量を低減でき、タマネギ様臭の主な原因物質である２Ｍ３ＭＢの含有量が低減された発酵ビール様発泡性飲料が得られる。
本実施形態の発酵ビール様発泡性飲料の製造方法に用いられるビール醸造装置の一態様の一部を示す概略構成図である。 試験例１における実施例１及び比較例１－１の各仕込発酵原料液の充填完了毎に測定された発酵槽内の発酵原料液中の溶存酸素（Ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ　Ｏｘｙｇｅｎ；ＤＯ）（ｐｐｍ）を示すグラフである。 試験例１における実施例２及び比較例１－２の各仕込発酵原料液の充填完了毎に測定された発酵槽内の発酵原料液中のＤＯ（ｐｐｍ）を示すグラフである。
　本明細書において、「発酵ビール様発泡性飲料」とは、発酵工程を経て製造された飲料であって、アルコール含有量や麦芽の使用の有無に関わらず、ビールと同等の又はそれと似た風味・味覚及びテクスチャーを有し、高い止渇感・ドリンカビリティーを有する発泡性飲料を意味する。すなわち、発酵ビール様発泡性飲料は、アルコール飲料であってもよく、アルコール含量が１体積％未満であるいわゆるノンアルコール飲料又はローアルコール飲料であってもよい。また、麦芽を原料とする飲料であってもよく、麦芽を原料としない飲料であってもよい。発酵ビール様発泡性飲料としては、具体的には、ビール、麦芽を原料とする発泡酒、麦芽を使用しない発泡性アルコール飲料、ローアルコール発泡性飲料、ノンアルコールビール等が挙げられる。その他、麦芽を原料とし、発酵工程を経て製造された飲料を、アルコール含有蒸留液と混和して得られたリキュール類であってもよい。
　アルコール含有蒸留液とは、蒸留操作により得られたアルコールを含有する溶液であり、例えば、原料用アルコールであってもよく、スピリッツ、ウィスキー、ブランデー、ウオッカ、ラム、テキーラ、ジン、焼酎等の蒸留酒等を用いることができる。
≪発酵ビール様発泡性飲料の製造方法≫
　本実施形態の発酵ビール様発泡性飲料の製造方法（以下、「本実施形態の製造方法」と称する場合がある）は、酵母による発酵を、１回の仕込工程で調製される発酵原料液の複数回分を収容できる大型発酵槽を用いて行う方法である。
　仕込槽で得られた発酵原料液は調製都度、発酵槽に充填される。以下において、Ｘ（Ｘは１以上の整数）回目に発酵槽に注入される発酵原料液を「Ｘ回目のバッチ」、例えば、１回目の発酵原料液を「１回目のバッチ」と称する場合がある。
　「複数回充填」プロセスにおいては、発酵槽で行われる１回の発酵に必要な酵母は、全量を一度に発酵原料液に添加することや、全てのバッチに均等量ずつ分けて添加する（以下、「酵母均等添加法」と称する場合がある）ことが知られている（非特許文献１～３）。
　これに対して、本実施形態の製造方法では、ｎ回発酵原料液を発酵槽へ充填する「複数回充填」プロセスにおいて、１回目～ｎ－１回目のバッチでは、酵母の添加を行うが、ｎ回目のバッチでは、酵母を添加しない。これにより、酵母均等添加法よりも、発酵初期での発酵槽内の酵母量を増加させることができ、酵母による酸素の消費が促進されることで、発酵原料液中の溶存酸素を低減させることができる。そのため、ＥＭＢａｌの生成に使用される酸素が低減され、最終的に２Ｍ３ＭＢの生成を抑制することができる。
　さらに、本実施形態の製造方法では、１回目～ｎ回目の全てのバッチに対して、エアレーション処理を行う。酵母を添加しないｎ回目のバッチに対してもエアレーション処理を行うことにより、発酵槽内の発酵原料液中に、良好な発酵を維持するために酵母に必要な溶存酸素を確保することができる。発酵中の酵母に十分な酸素が供給されることにより、発酵速度を良好に保つことができる。また、酵母への酸素供給量の減少に起因する酢酸エステル等の過剰な増加及び不快臭物質の生成等、香気成分の生成の変化を抑制することができる。
　このように、本実施形態の製造方法では、１回目～ｎ－１回目のバッチで酵母全量を添加してエアレーションし、ｎ回目のバッチではエアレーションのみを行うことにより、発酵中の酵母のエキス消費活性を維持して発酵速度を良好に保ちつつ、発酵初期における発酵原料液中の溶存酸素を低減させてＥＭＢａｌ及び２Ｍ３ＭＢの生成を抑制できる。２Ｍ３ＭＢはオフフレーバーであるネギ臭の原因物質であり、２Ｍ３ＭＢの含有量依存的にタマネギ様臭が強くなる。すなわち、本実施形態の製造方法によれば、２Ｍ３ＭＢの含有量が少なく、タマネギ様臭が抑えられた発酵ビール様発泡性飲料を製造できる。さらに、本実施形態の製造方法では、発酵不良により生じるオフフレーバーである不快臭物質の生成も抑制される。このように、本実施形態の製造方法により、オフフレーバーが低減された発酵ビール様発泡性飲料が得られる。すなわち、本実施形態の製造方法は、発酵ビール様発泡性飲料のオフフレーバー低減方法と言い換えることができる。
　本実施形態の製造方法により最終的に得られる発酵ビール様発泡性飲料の２Ｍ３ＭＢ含有量は、発酵ビール様発泡性飲料の総質量に対して、０．５ｐｐｂ以下が好ましく、０．４ｐｐｂ以下がより好ましく、０．１ｐｐｂ以下がさらに好ましく、０ｐｐｂ（検出限界値未満）が特に好ましい。本願明細書において、「ｐｐｂ」は「μｇ／Ｌ」を意味する。なお、発酵ビール様発泡性飲料の２Ｍ３ＭＢ濃度は、Iijimaらの方法（非特許文献４参照）に準じて測定することができる。具体的には以下の方法で測定される。試料に、ｐ－ヒドロキシ水銀安息香酸と、トリスバッファーに溶解させたｔｅｒｔ－ブチル－４－メトキシフェノールと、４－メトキシ－２－メチル－２－メルカプトブタン溶液とを加えて密封し、室温で攪拌し、試料中の含硫化合物をｐ－ヒドロキシ水銀安息香酸に結合させる。４－メトキシ－２－メチル－２－メルカプトブタン溶液は内部標準物質として添加される。次いで、Ｌ－システイン塩酸塩を含む酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６）により、含硫化合物を溶出させる。溶出液に対して、酢酸エチルとジクロロメタン溶液を用いて溶媒抽出を行い、得られた有機溶媒層を無水硫酸ナトリウムにより脱水する。脱水後、有機溶媒層を室温、窒素気流下で濃縮後、有機溶媒層に含まれている含硫化合物をＧＣ／ＭＳにて定量する。
　本実施形態の製造方法の詳細について、以下に説明する。
　本実施形態の製造方法は、「複数回充填」プロセスにおいて、仕込槽から発酵槽へ発酵原料液を移送する際の酵母の添加及びエアレーションを特定の条件で行う以外は、一般的な発酵ビール様発泡性飲料と同様にして製造できる。そこで、一般的な発酵ビール様発泡性飲料の製造方法と共に本実施形態の製造方法を説明する。一般的な発酵ビール様発泡性飲料は、仕込（発酵原料液調製）、発酵、貯酒、濾過の工程で製造することができる。
［仕込工程］
　まず、仕込工程（発酵原料液調製工程）として、穀物原料及び糖質原料からなる群より選択される１種以上から発酵原料液を調製する。具体的には、まず、穀物原料と糖質原料の少なくともいずれかと原料水とを含む混合物を調製して加温し、穀物原料等の澱粉質を糖化させる。糖液の原料としては、穀物原料のみを用いてもよく、糖質原料のみを用いてもよく、両者を混合して用いてもよい。
　穀物原料としては、例えば、大麦や小麦、これらの麦芽等の麦類、米、トウモロコシ、大豆等の豆類、イモ類等が挙げられる。穀物原料は、穀物シロップ、穀物エキス等として用いることもできるが、粉砕処理して得られる穀物粉砕物として用いることが好ましい。
　穀物類の粉砕処理は、常法により行うことができる。穀物粉砕物としては、麦芽粉砕物、コーンスターチ、コーングリッツ等のように、粉砕処理の前後において通常なされる処理を施したものであってもよい。本発明においては、用いられる穀物粉砕物は、麦芽粉砕物であることが好ましい。麦芽粉砕物を用いることにより、ビールらしさがよりはっきりとした発酵ビール様発泡性飲料を製造することができる。麦芽粉砕物は、大麦、例えば二条大麦を、常法により発芽させ、これを乾燥後、所定の粒度に粉砕したものであればよい。
　また、本発明において用いられる穀物原料としては、１種類の穀物原料であってもよく、複数種類の穀物原料を混合したものであってもよい。例えば、主原料として麦芽粉砕物を、副原料として米やトウモロコシの粉砕物を用いてもよい。糖質原料としては、例えば、液糖等の糖類が挙げられる。
　発酵原料の種類や組成にかかわらず、発酵原料液を発酵槽へ輸送する際に、酵母の添加及びエアの注入を制御することにより、得られる発酵ビール様発泡性飲料の２Ｍ３ＭＢ含有量を低減させることができる。このため、本実施形態の製造方法は、麦芽使用比率（発酵原料全体に占める麦芽の使用量の割合）が１００質量％の発酵ビール様発泡性飲料の製造方法に適用してもよく、麦芽使用比率が０質量％超１００質量％未満の発酵ビール様発泡性飲料の製造方法に適用してもよく、発酵原料として麦芽を使用しない発酵ビール様発泡性飲料の製造方法に適用してもよい。
　発酵原料と原料水とを含む混合物には、その他の副原料を加えてもよい。当該副原料としては、例えば、ホップ、食物繊維、酵母エキス、果汁、苦味料、着色料、香草、香料等が挙げられる。また、必要に応じて、α－アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ等の糖化酵素やプロテアーゼ等の酵素剤を添加することができる。
　糖化処理は、穀物原料等由来の酵素や、別途添加した酵素を利用して行う。糖化処理時の温度や時間は、用いた穀物原料等の種類、発酵原料全体に占める穀物原料の割合、添加した酵素の種類や混合物の量、目的とする発酵ビール様発泡性飲料の品質等を考慮して、適宜調整される。例えば、糖化処理は、穀物原料等を含む混合物を３５℃以上７０℃以下で２０分間以上９０分間以下保持する等、常法により行うことができる。
　煮沸処理前又は煮沸処理中に、香草等を適宜添加することにより、所望の香味を有する発酵ビール様発泡性飲料を製造することができる。特にホップは、煮沸処理前又は煮沸処理中に添加することが好ましい。ホップの存在下で煮沸処理することにより、ホップの風味・香気成分を効率よく煮出することができる。ホップの添加量、添加態様（例えば数回に分けて添加するなど）及び煮沸条件は、適宜決定することができる。
［発酵原料液の移送工程］
　本実施形態の製造方法においては、仕込槽の容量の２倍以上の容量からなる発酵槽を用いて、複数回の仕込工程で調製された発酵原料液を用いて１度の発酵工程を行う。すなわち、仕込工程で調製された発酵原料液は、発酵槽まで移送される。本実施形態の製造方法においては、大型発酵槽（例えば、２８０～５００ｋＬ容）を用いることが好ましい。
　本実施形態の製造方法において、発酵原料液を発酵槽へ充填する回数（ｎ）は、２回以上であればよく、発酵槽と仕込槽の容量の差によって決定される。例えば３回以上とすることができ、３回以上６回以下とすることができ、３回以上５回以下とすることができる。
　本実施形態の製造方法において、１回目～ｎ回目の発酵槽に注入される発酵原料液の量、すなわち、１回目～ｎ回目のバッチの量は、異なる量であってもよいが、均一な発酵を行う観点から、実質的に等量であることが好ましい。なお、「１回目～ｎ回目のバッチの量が実質的に等量である」とは、１回目～ｎ回目のバッチの容量が等量である、又は、１回目～ｎ回目のバッチの容量が±５容量％程度の極僅かな誤差範囲内の量である状態を意味する。
　本実施形態の製造方法においては、移送工程において、発酵原料液から粕（凝固物）の除去と、酵母の生育に必要な酸素を発酵原料液に供給するためのエアレーション処理と、酵母の添加と、を行う。
　仕込工程で調製された煮汁（発酵原料液）から、沈殿により生じたタンパク質等の粕の除去は、いずれの固液分離処理で行ってもよいが、一般的には、まず、ワールプールと呼ばれる槽を用いて沈殿物（熱トルーブ）を除去する。この際の煮汁の温度は、一般的には５０℃以上９５℃以下程度で行われる。熱トルーブを除去した後の発酵原料液は、プレートクーラー等の熱交換器により適切な発酵温度まで冷却する。
　本実施形態の製造方法においては、冷却により生じた粕（冷トルーブ）も発酵原料液から除去される。冷トルーブの除去は、例えば、フローテーションタンクを用いて行うことができる。冷トルーブを除去した後の発酵原料液は、そのまま発酵槽へ注入してもよく、所望のエキス濃度に調整した後に発酵槽へ注入してもよい。
　移送工程中に行うエアレーション処理において用いられるエア（空気）は、酵母の酸素供給源である。このため、空気の組成は、酸素を含んでいればよく、例えば、標準大気の組成（約８０％の窒素、約２０％の酸素及びその他気体成分含有）が例示できる。
　本実施形態の製造方法においては、冷トルーブが除去された発酵原料液に対して、発酵槽へ充填される前にエアレーション処理を行う。「複数回充填」プロセスにおいて、発酵原料液をそのまま発酵槽へ充填すると、発酵槽内で発酵原料液が均一に混じらず、発酵状態が発酵槽内で不均一となる。エアレーションにより注入された空気を含んだ状態で発酵槽へ充填することにより、既に発酵槽内に充填されている発酵原料液と混ざりやすくなる。エアレーション処理は、冷トルーブ除去の前にも行ってもよい。
　本実施形態の製造方法においては、発酵原料液にできるだけ均一に酵母を混合するために、酵母は、発酵槽内へ添加するのではなく、発酵槽への移送工程中に添加される。酵母を発酵原料液へ添加するタイミングとしては、発酵原料液が、酵母が生存可能な温度域にまで低下した時点から発酵槽へ注入される以前のいずれの時点であってもよい。
　発酵ビール様発泡性飲料の香味設計上、好ましいアルコール発酵のために、酵母にはある程度の酸素が必要である。発酵原料液中で酵母を酸素に十分に接触させるために、酵母の添加の前、酵母の添加の後、又は酵母の添加と同時に、エアレーションを行うことが好ましい。例えば、発酵槽注入前のエアレーションや、フローテーションタンク注入前のエアレーションの前後に酵母を添加することができる。また、酵母１個当たりが接する酸素量が充分となるように、１回の発酵に要する酵母全量を一度に発酵原料液に添加するよりも、複数回に分けて添加することが好ましい。このため、本実施形態の製造方法においては、ｎ回目のバッチを除く全てのバッチの発酵原料液に対して、発酵槽へ注入する前に酵母を添加する。
　当該移送工程は、例えば、図１に示すように、熱交換器３の下流側であって、発酵槽７の上流側に、１次エアレーション装置４、フローテーションタンク５及び２次エアレーション装置６をこの順に接続されているビール醸造装置の一部１０を用いて、行うことができる。なお、以下において、熱交換器３の下流側であって、発酵槽７の上流側に接続されている１次エアレーション装置４、フローテーションタンク５及び２次エアレーション装置６と、それらを接続する配管とを総じて「発酵原料液移送システム」と称する場合がある。
　熱交換器３では、発酵原料液を適切な発酵温度まで冷却する。
　１次エアレーション装置４では、発酵原料液に空気（エア）を注入する。１次エアレーション処理により、熱交換器により冷却された発酵原料液中の凝固物（冷トルーブ）を効率よく浮かせることができる。また、発酵原料液中に酸素を溶解することができる。１次エアレーション処理は、行ってもよく、行わなくてもよい。
　フローテーションタンク５では、冷却された発酵原料液中の凝固物（冷トルーブ）を分離する。また、例えば、フローテーションタンク５以前に酵母を添加する場合には、フローテーションタンク５において酵母は、１次エアレーション装置４で注入されたエアによる発酵原料液中の溶存酸素を消費し、活性化される。
　２次エアレーション装置６では、冷トルーブ除去後の発酵原料液にエアを注入する。これにより、発酵槽７内にこれから充填する冷トルーブ除去後の発酵原料液と、発酵槽７内にすでに充填されている発酵原料液とを十分に攪拌することができ、発酵槽内で均一に発酵させることができる。また、発酵原料液中に十分量の酸素を溶解させることができる。
　例えば、フローテーションタンク５以前に酵母を添加する場合には、１次エアレーション装置４で注入したエアによる発酵原料液中の溶存酸素は、フローテーションタンク５において酵母に消費されて減少する。２次エアレーション装置６を用いて、発酵原料液に追加的にエアを注入することで、酵母に十分に酸素を供給することができる。
　発酵槽７では、発酵原料液を基質として酵母によるアルコール発酵を行う。
　本実施形態の製造方法に用いられるビール醸造装置は、熱交換器３の上流側に、発酵原料液を煮沸する煮沸釜（図示せず）及び加熱により発酵原料液中に生成される凝固物（熱トルーブ）を分離するワールプール１をこの順に更に備えていてもよい。
　本実施形態の製造方法に用いられるビール醸造装置は、煮沸釜及びワールプール１の間の配管、ワールプール１及び熱交換器３の間の配管、フローテーションタンク５及び発酵槽７の間の配管に、それぞれ発酵原料液を圧送するポンプを更に備えてもよい。
　本実施形態の製造方法に用いられるビール醸造装置は、１次エアレーション装置４の下流側であってフローテーションタンク５の上流側に、注入されたエアと発酵原料液とを撹拌して溶解を補助するスタティックミキサーを更に備えてもよい。また、２次エアレーション装置６の下流側であって発酵槽７の上流側に、スタティックミキサーを更に備えてもよい。
　図１では、発酵槽７に１ラインの発酵原料液移送システムが接続している場合を例示しているが、発酵槽７に２ライン以上の発酵原料液移送システムが接続していてもよい。２ライン以上の発酵原料液移送システムが接続している場合、より効率的に発酵槽７に発酵原料液を充填することができる。
　図１に示す装置を用いた発酵原料液の発酵槽７への充填方法を以下に説明する。
　まず、熱交換器３で冷却された発酵原料液を、配管２ｂを介して１次エアレーション装置４まで送液し、空気を注入する。
　次いで、１次エアレーション処理後の発酵原料液を、配管２ｃを介してフローテーションタンク５に充填し、静置する。静置する時間としては、例えば０分以上５時間以下とすることができ、３０分以上３時間以下とすることができる。静置する時間が上記範囲内であることにより、冷トルーブを発酵原料液面に浮かび上がらせ、フローテーションタンクの底面部から発酵原料液を引き抜くことで、冷トルーブが除去された発酵原料液を得ることができる。
　次いで、配管２ｄを介して、２次エアレーション装置６まで冷トルーブが除去された発酵原料液を送液し、空気を注入する。２次エアレーション処理を行うことにより、発酵槽７内にこれから充填する冷トルーブ除去後の発酵原料液と、発酵槽７内にすでに充填されている発酵原料液とを十分に攪拌することができ、均一に発酵させることができる。また、発酵原料液中に酸素を溶解することができ、この酸素は発酵槽７内において酵母によって消費される。
　次いで、空気が注入された発酵原料液を、配管２ｅを介して、発酵槽７へ充填する。
　１次エアレーションの量及び２次エアレーションの量は、特別な限定はない。例えば、エアレーションの量は、各エアレーション装置を流れる発酵原料液の流量の４体積％以上１０体積％以下とすることができ、５体積％以上９体積％以下が好ましい。当該流量比となるように空気を注入することで、エアレーション処理後の発酵原料液の溶存酸素を０．６ｐｐｍ以上６．０ｐｐｍ以下に調整することができる。なお、溶存酸素は、溶存酸素計を用いて測定することができる。本願明細書において「ｐｐｍ」は「ｍｇ／Ｌ」を示す。
　１回目からｎ回目のバッチにおいて、各バッチの発酵原料液が発酵槽へ充填される間隔は、５時間以内であることが好ましく、３時間以内であることがより好ましく、２時間以内であることがさらに好ましい。充填される間隔が上記上限値以下であることにより、発酵ビール様発泡性飲料の製造に要する時間を短くすることができることに加えて、エアレーションにより十分量の酸素を含む発酵原料液が短い間隔で供給されることにより、発酵初期の酵母に適切なタイミングで酸素が供給され、活性化される。適切なタイミングで活性化された酵母はより短いサイクルで酸素を消費するため、本実施形態の製造方法による効果を十分に発揮することができる。
　１回目からｎ－１回目のバッチにおいては、各バッチの発酵原料液に酵母を添加する。
　酵母を添加するタイミングとしては、発酵槽注入以前のいずれかのタイミングとすることができ、図１に示す（Ａ）～（Ｆ）のいずれのタイミングであってもよい。中でも、酵母の酸素への接触を最大化し、より効果的に酵母を活性化できることから、フローテーションタンク注入前に酵母を発酵原料液に添加することが好ましい。このとき、１次エアレーション処理を行う場合には、酵母を添加するタイミングが（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のタイミング、すなわち、酵母の添加の前に、酵母の添加と同時に、又は酵母の添加後であってフローテーションタンク注入の前に、１次エアレーション処理されることが好ましく、酵母を添加するタイミングが（Ｃ）のタイミング、すなわち、酵母の添加の前に、１次エアレーション処理されることがより好ましい。
　一方、ｎ回目のバッチでは、熱交換器３で冷却された発酵原料液を、配管２ｂ及び配管２ｃを介してフローテーションタンク５に充填し、静置する。このとき、１次エアレーション処理を行ってもよく、行わなくてもよい。中でも、発酵原料液中の溶存酸素を低減させる観点から、１次エアレーション処理を行わないことが好ましい。
　次いで、配管２ｄを介して、２次エアレーション装置６まで冷トルーブが除去された発酵原料液を送液し、空気を注入する。２次エアレーション処理を行うことにより、発酵槽７内にこれから充填する冷トルーブ除去後の発酵原料液と、発酵槽７内にすでに充填されている発酵原料液とを十分に攪拌することができ、均一に発酵させることができる。また、発酵槽内で待機している酵母に必要な量の酸素を補うことができ、発酵初期における発酵原料液中の溶存酸素を低減させながらも、発酵槽内に全てのバッチの発酵原料液が充填された時点における溶存酸素を十分量とすることができ、酵母による発酵速度を良好に保つことができる。また、酵母への酸素供給量の減少に起因する酢酸エステル等の過剰な増加及び不快臭物質の生成等、香気成分の生成の変化を抑制することができる。
　次いで、空気が注入された発酵原料液を、配管２ｅを介して、発酵槽７へ充填する。
　本実施形態の製造方法では、ｎ回目のバッチでは酵母を添加せず、発酵に必要な量の酵母は、１回目～ｎ－１回目のバッチで全量を添加する。これにより、発酵初期、具体的には、ｎ回目のバッチが発酵槽へ注入される直前までの間の発酵槽内の酵母濃度を、酵母均等添加法よりも高濃度にすることができる。発酵槽内の溶存酸素は高濃度の酵母により効率的に消費され、ＥＭＢａｌの生成に供される溶存酸素が少なくなる。これにより、発酵槽内で生成されるＥＭＢａｌ濃度が低減され、最終的な発酵ビール様発泡性飲料に含まれる２Ｍ３ＭＢ濃度を低減することができる。
　１回目～ｎ－１回目のバッチに添加される酵母の量は、それぞれ異なっていてもよいが、実質的に等量であることが好ましい。これにより、酵母がまんべんなく酸素と接することができ、より効率的に活性化されるため、発酵を均一に進めることができる。なお、「酵母の量が実質的に等量である」とは、酵母の量（酵母濃度）が等量（等濃度）である、又は、酵母の量（酵母濃度）が±５質量％程度の極僅かな誤差範囲内の量（濃度）である状態を意味する。
［発酵工程］
　次いで、発酵工程として、発酵槽に注入され、酵母が添加された発酵原料液を用いて、発酵を行う。発酵に用いる酵母は特に限定されるものではなく、通常、酒類の製造に用いられる酵母の中から適宜選択して用いることができる。上面発酵酵母であってもよく、下面発酵酵母であってもよいが、大型醸造設備への適用が容易であることから、下面発酵酵母であることが好ましい。発酵温度は特に限定されるものではなく、例えば、０℃以上１５℃以下で行うことができ、４℃以上１２℃以下で行うことが好ましい。
［貯酒工程］
　発酵工程後、貯酒工程として、得られた発酵液を、貯酒タンク中で熟成させ、０℃程度の低温条件下で貯蔵し安定化させる。
［濾過工程］
　貯酒工程後、濾過工程として、熟成後の発酵液を濾過することにより、酵母及び当該温度域で不溶なタンパク質等を除去して、目的の発酵ビール様発泡性飲料を得ることができる。当該濾過処理は、酵母を濾過除去可能な手法であればよく、例えば、珪藻土濾過、平均孔径が０．４μｍ以上０．６μｍ以下程度のフィルターによるフィルター濾過等が挙げられる。
　以下、実施例及び比較例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例等に限定されるものではない。
＜各種測定方法＞
［発酵ビール様発泡性飲料の２Ｍ３ＭＢ濃度の測定方法］
　以降の実施例等において、発酵ビール様発泡性飲料の２Ｍ３ＭＢ濃度は、Iijimaらの方法（非特許文献４）に準じて測定した。
　具体的には、まず、５００ｍＬの発酵液に、２５ｍＬの２ｍＭ　ｐ－ヒドロキシ水銀安息香酸（ｐ－ＨＭＢ）と、５００μＬのトリスバッファー（０．１Ｍ　トリス）へ溶解させた２０ｍＭ　tert－ブチル－４－メトキシフェノール（ＢＨＡ）と、１００μＬの５００ｍｇ／ｍＬの４－メトキシ－２－メチル－２－メルカプト－ブタン（４Ｍ２Ｍ２ＭＢ）溶液と、を加えて、密封し、室温で、攪拌子で激しく攪拌し、発酵液中の含硫化合物をｐ－ＨＭＢに結合させた。４Ｍ２Ｍ２ＭＢは、内部標準物質として添加した。結合した反応物を、Ｄｏｗｅｘ－１（強アニオン交換樹脂）に吸着させた後、０．２ｍＭ　ＢＨＡを含む１００ｍＬの０．１Ｍ　酢酸バッファー（ｐＨ６）を用いて当該樹脂を洗浄した。
　次いで、１０ｍｇ／ｍＬのＬ－システイン塩酸塩を含む１００ｍＬの０．１Ｍ　酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６）により、当該樹脂から含硫化合物を溶出させた。得られた溶出液に対して、０．５ｍＬの酢酸エチルと５ｍＬのジクロロメタン溶液を用いて２回溶媒抽出を行い、得られた有機溶媒層を無水硫酸ナトリウムにより脱水した。脱水後の有機溶媒層を室温、窒素気流下で１００μＬまで濃縮した後、当該有機溶媒層に含まれている含硫化合物をＧＣ／ＭＳにて定量した。
（ＧＣ／ＭＳ条件）
ガスクロマトグラフ：「Ａｇｉｌｅｎｔ　６８９０ ガスクロマトグラフ」（Agilent Technologies社製）
検出器：「ＭＳＤ５９７５」（Agilent Technologies社製）
カラム：「ＤＢ－ＷＡＸ ｃａｐｉｌｌａｒｙ　ｃｏｌｕｍｎ」（長さ：６０ｍ、内径：０．２５ｍｍ、膜厚：０．２５μｍ、Agilent Technologies社製）
注入口温度：２５０℃ 
注入モード：パルス化スプリットレスインジェクションモード（pulsed splitless injection mode）
注入量：１μＬ
キャリアガス：ヘリウム（１ｍＬ／分）
カラム温度設定：４０℃（５分間保持）－（５℃／分）－１６０℃（５分間）
イオン化条件：７０ｅＶ
測定モード：シングルイオン－モニタリングモード(single ion-monitoring(SIM) mode)
定量：２Ｍ３ＭＢのピークエリア面積と内部標準品のピークエリア面積との比較にて実施。
［発酵原料液の２，３－エポキシ－３－メチルブタナール（ＥＭＢａｌ）（２Ｍ３ＭＢ前駆体）濃度の測定方法］
　以降の実施例等において、発酵原料液の２，３－エポキシ－３－メチルブタナール（ＥＭＢａｌ）濃度は次のようにして測定した。
　まず、内部標準物質としてＥＭＢａｌの安定同位体（D6-2,3-epoxy-3-methylbutanal）を１００ｐｐｂとなるように添加した発酵原料液２０ｇを、メタノール及び水でコンディショニングした固相抽出カラム（陰イオン交換カラム「ＩｎｅｒｔＳｅｐ　ＭＡ－１」（ジーエルサイエンス株式会社製））へと負荷した。当該固相抽出カラムの素通り液を採取し、ジクロロメタン３ｍＬを加えて抽出し、溶媒層を回収した。この溶媒抽出操作を３回繰り返し、回収した溶媒層を全て混合したものに無水硫酸ナトリウムを５ｇ加え、３０分間以上脱水した。その後、窒素パージにて約５００μＬまで濃縮した。次いで、定量をＥＭＢａｌのピークエリア面積と内部標準品のピークエリア面積との比較にて実施した以外は、上記２Ｍ３ＭＢにおける条件と同じ条件でＧＣ／ＭＳにて測定した。
［下し時外観エキスの測定方法］
　「外観エキス」とは、発酵ビール様発泡性飲料のエキスを、２０℃において同じ比重をもったショ糖水溶液のショ糖濃度（通常は質量％）として表わしたものをいう。
　下し時（発酵終了時）に発酵液から酵母を除した液の比重を測定し、２０℃において同じ比重をもったショ糖水溶液のショ糖濃度（通常は質量％）に置き換えることで、下し時外観エキス（％Ｐ）として算出した。ここで「Ｐ」はＰｌａｔｏ（プラトー）の換算表に基づき算出された値であること意味する。
［エキス２％Ｐ到達時間の測定方法］
　上記「下し時外観エキスの測定方法」に記載の外観エキスの算出方法を用いて、発酵液の外観エキスを経時的に算出し、外観エキスが２％Ｐに到達した時間を測定した。
［酢酸エチル濃度及び酢酸イソアミル濃度の測定方法］
　以降の実施例等において、酢酸エチル濃度及び酢酸イソアミル濃度は次のようにして測定した。
　まず、５０ｍＬ容遠心管に硫酸アンモニウム６．０ｇを測り取り、氷冷した発酵液３０ｇを加え、直ちに氷冷した。次いで、当該遠心管に内部標準物質を加え、二硫化炭素溶液３．０ｍＬを加えた。その後、当該遠心管を２００ｒｐｍで１０分間振とうした後、遠心分離処理し、二硫化炭素層を回収した。回収された二硫化炭素溶液０．５ｍＬを、ガスクロマトグラフィーに供試し、酢酸エチル濃度及び酢酸イソアミル濃度をそれぞれ検出し定量した。
［イソアミルアルコール濃度の測定方法］
　以降の実施例等において、イソアミルアルコールの濃度は、参考文献１（「ＡＳＢＣ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ａｎａｌｙｓｉｓ」（American Society of Brewing Chemists.  Method of Analysis, 8th edition.  Stastical Analysis-4 Youden unit block collaborative testing procedure. The society, St. Paul. MN. (1992)））で規定されている分析方法と同様にして実施した。具体的には、５０ｍＬの遠心管に硫酸アンモニウム６．０ｇを測り取り、氷冷したサンプルビール３０ｇを加え、ただちに氷冷した。次いで、当該遠心管に内部標準物質（ｎ－ブチルアルコール）を加え、二硫化炭素溶液３．０ｍＬを加えた。その後、当該遠心管を２００回転（ｒｐｍ）で１０分間振とうした後、遠心分離処理し、二硫化炭素層を回収した。回収された二硫化炭素溶液０．５ｍＬをガスクロマトグラフィーに供し、イソアミルアルコールを検出し定量した。
［ＳＯ２濃度の測定方法］
　以降の実施例等において、ＳＯ２の濃度は、「Ｆキット」（株式会社ＪＫインターナショナル製）を使用し、当該測定キットの使用指示書に従って測定した。
＜発酵ビール様発泡性飲料の製造試験＞
［試験例１］
（１）発酵原料液の調製及び移送
　麦芽１４，６００ｋｇ、副原料４，８００ｋｇ、及び７７ｋＬの水を混合し、得られた混合物を５０℃、３０分間保持してタンパク質分解処理を行った後、当該混合物を６５℃、７０分間保持することにより、麦芽由来成分を糖化させた。得られた麦汁を濾過し、得られた濾過液にホップを添加して９０分間煮沸した。煮沸処理後、濃度調整湯を添加して、発酵原料液の濃度を調整した。
　調製された発酵原料液の移送には、図１に示す装置を用いた。まず、ワールプール１において発酵原料液からホップ粕等の熱トルーブを分離し、熱交換器３を通すことで発酵原料液を５℃に冷却した。さらに、以下の表１に示す条件で、冷却された発酵原料液を発酵槽（容量：２８０ｋＬ）へ移送し、ビール醸造試験を行った。なお、酵母の添加タイミングは、図１の（Ｃ）のタイミングで行った。仕込１回あたり７０ｋＬの発酵原料液を調製し、仕込を４回行ったため、各試験に用いた発酵原料液の合計量は２８０ｋＬであった。仕込時間の間隔は１時間２０分であった。
　また、使用した酵母の濃度は、約２５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬであった。また、各条件について、同一酵母を用いた試験を２回ずつ実施した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（２）各仕込発酵原料液の充填完了毎の発酵槽内の発酵原料液中の溶存酸素の測定
　次いで、各仕込発酵原料液の充填完了毎に、発酵槽内の発酵原料液中の溶存酸素（Ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ　Ｏｘｙｇｅｎ；ＤＯ）（ｐｐｍ）を、溶存酸素計（メトラー・トレド社製）を用いて測定した。結果を以下の表２、図２Ａ及び図２Ｂに示す。なお、比較例１－１及び実施例１と、比較例１－２及び実施例２と、をそれぞれ比較するために、比較例１－１及び比較例１－２を実施例１及び実施例２それぞれと並行して実施した。また、同一試験を２回ずつ実施し、溶存酸素をそれぞれ測定し、その平均値を算出して、以下の表２、図２Ａ及び図２Ｂの値とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２、図２Ａ及び図２Ｂから、比較例１－１及び比較例１－２では、溶存酸素（ＤＯ）は、各仕込発酵原料液の充填完了毎に、低下した。これに対し、実施例１及び実施例２では、充填１～３回目までは、各々比較例１－１及び比較例１－２よりも、ＤＯが低かった。これは、充填１～３回目までは、発酵槽内の酵母濃度が高く（比較例１－１及び比較例１－２の４／３倍量）、酸素消費が速いためであると推察された。
　また、実施例１では、充填４回目でのＤＯが比較例１－１よりも高かった。これは、充填４回目の発酵原料液では、１次エアレーション及び２次エアレーションが注入されたが酵母が添加されず、酸素が消費されることなく発酵槽に充填されるためであると推察された。
　一方、実施例２においても、充填３回目よりも充填４回目でのＤＯが増加したが、増加幅が小さかった。これは、２次エアレーションのみ注入され、１次エアレーションの注入及び酵母の添加は実施されず、ＤＯが２次エアレーション分しか上がらなかったためであると推察された。
　以上の結果から、実施例２では、充填４回目完了時点、すなわち、充填終了時点でのＤＯが、比較例１－２とほぼ同等であることが確かめられた。
（３）充填終了時点でのＥＭＢａｌ濃度及び発酵終了時点での２Ｍ３ＭＢ濃度の測定
　発酵槽への発酵原料液充填終了時に、発酵原料液の一部をサンプリングして、ＥＭＢａｌの濃度を上記測定方法により測定した。
　次いで、１２℃で７日間発酵させた後、発酵終了後の発酵液をサンプリングし、遠心分離処理（７０００ｒｐｍ×１５分間）して酵母を除去し、発酵終了時点でのネギ臭原因物質である２Ｍ３ＭＢ濃度を上記測定方法により測定した。
　ＥＭＢａｌ濃度（ｐｐｂ）及び２Ｍ３ＭＢ濃度（ｐｐｂ）の測定結果をそれぞれ表３（ＥＭＢａｌ）及び表４（２Ｍ３ＭＢ）に示す。なお、表３及び表４において、「１回目」及び「２回目」とは、２回実施した同一試験それぞれでの測定結果であり、「平均」とは「１回目」及び「２回目」の平均値である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表３及び表４から、発酵槽への発酵原料液充填終了時点でのＥＭＢａｌ濃度は、実施例１では、比較例１－１と比較して、ほぼ同等であった。これに対して、実施例２では、比較例１－２と比較して、２０％の低下が見られた。
　また、発酵終了時点での２Ｍ３ＭＢ濃度は、実施例１及び実施例２ともに、各々比較例１－１及び比較例１－２と比べて、低下が確認されたが、実施例１では１０％程度の低下であったのに対して、実施例２では約３０％の低下であった。
（４）発酵終了時点での２Ｍ３ＭＢ以外の物性値
　発酵終了時点での２Ｍ３ＭＢ以外の物性値として、下し時（発酵終了時）外観エキス（単位：％Ｐ）、２％エキス到達時間（単位：時間）、酢酸エチル濃度（ｐｐｍ）、酢酸イソアミル濃度（ｐｐｍ）、イソアミルアルコール濃度（ｐｐｍ）及びＳＯ２濃度（ｐｐｍ）を測定した。結果を表５に示す。なお、表５において、「１回目」及び「２回目」とは、２回実施した同一試験それぞれでの測定結果であり、「平均」とは「１回目」及び「２回目」の平均値である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５から、発酵時におけるエキス消費状況を示す「下し時外観エキス」及び「エキス２％Ｐ到達時間」は、実施例１及び実施例２ともに、エキス消費（発酵）の遅延を示す結果は確認されず、むしろ比較例１－１及び比較例１－２と比較して、改善されていた。
　酢酸エチル濃度及び酢酸イソアミル濃度ともに、実施例１と比較例１－１とにおける差異、並びに、実施例２と比較例１－２とにおける差異は、それぞれ試験間の誤差よりも小さく、実施例１及び実施例２の各試験条件は、酢酸エステル類の香気成分の生成への影響が少ないことが示唆された。また、酢酸イソアミルの基質となる、高級アルコールのイソアミルアルコールは、実施例１の試験条件による増加が確認されたものの、試験間の誤差よりも小さかった。
　ＳＯ２濃度は、酢酸エステル類の濃度と同様に、酵母の酸素消費と負の相関を持つと考えられている。ＳＯ２濃度は、実施例１において、低下が見られ、酵母の酸素消費量が比較例１－１よりも増大したことが示された。
　以上の結果から、実施例１及び実施例２の試験条件によれば、発酵速度が比較例１－１及び比較例１－２の試験条件よりも改善されており、２Ｍ３ＭＢの含有量が低減された発酵ビール様発泡性飲料が得られることが確かめられた。また、実施例２の試験条件では、比較例１－２の試験条件に対して、香気成分の生成が同等であることが確かめられた。
［試験例２］
（１）発酵原料液の調製及び移送
　試験例１と同様の方法を用いて麦汁を調製した。調製された発酵原料液の移送には、図１に示す装置を用いた。まず、ワールプール１において発酵原料液からホップ粕等の熱トルーブを分離し、熱交換器３を通すことで発酵原料液を５℃に冷却した。さらに、以下の表６に示す条件で、冷却された発酵原料液を発酵槽（容量：５００ｋＬ）へ移送し、ビール醸造試験を行った。なお、酵母の添加タイミングは、図１の（Ｃ）のタイミング、すなわち、１次エアレーション処理の後であって、フローテーションタンク注入前のタイミングで行った。仕込１回あたり１２５ｋＬの発酵原料液を調製し、仕込を４回行ったため、各試験に用いた発酵原料液の合計量は５００ｋＬであった。仕込時間の間隔は１時間５０分であった。
　また、使用した酵母の濃度は、約１７×１０６　ｃｅｌｌｓ／ｍＬであった。実施例３及び比較例３については、同一酵母を用いた試験を２回ずつ実施した。比較例２については、参考として条件を記載した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
（２）発酵終了時点での２Ｍ３ＭＢの発酵槽内の濃度の測定
　発酵槽に充填した発酵原料液を１２℃で７日間発酵させた後、発酵終了後の発酵液をサンプリングし、遠心分離処理（７０００ｒｐｍ×１５分間）して酵母を除去し、発酵終了時点での２Ｍ３ＭＢの濃度を上記測定方法により測定した。
　２Ｍ３ＭＢ濃度（ｐｐｂ）の測定結果をそれぞれ表７に示す。なお、表７において、「１回目」及び「２回目」とは、２回実施した同一試験それぞれでの測定結果であり、「平均」とは「１回目」及び「２回目」の平均値である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表７から、２Ｍ３ＭＢ濃度は、比較例３のほうが実施例３よりもさらに低下していた。これは、２次エアレーションをなくすことで、発酵原料液への酸素の接触の影響を低減できることが示唆された。
（３）発酵終了時点での２Ｍ３ＭＢ以外の物性値
　発酵終了時点での２Ｍ３ＭＢ以外の物性値として、下し時（発酵終了時）外観エキス（単位：％Ｐ）、２％Ｐエキス到達時間（単位：時間）、酢酸エチル濃度（ｐｐｍ）、酢酸イソアミル濃度（ｐｐｍ）、イソアミルアルコール濃度（ｐｐｍ）及びＳＯ２濃度（ｐｐｍ）を測定した。結果を表８に示す。なお、表８において、「１回目」及び「２回目」とは、２回実施した同一試験それぞれでの測定結果であり、「平均」とは「１回目」及び「２回目」の平均値である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　表８から、発酵時におけるエキス消費状況を示す「下し時外観エキス」及び「エキス２％Ｐ到達時間」について、実施例３に対して、比較例３では発酵の遅延が確認された。これは、比較例３では、仕込４回目での２次エアレーションを実施しないことで、酵母への酸素の供給不足となり、また、発酵原料液満了時において発酵槽内の発酵原料液が十分に攪拌されず、発酵が不均一となり、発酵が遅延したものと推察された。
　酢酸エチル濃度及び酢酸イソアミル濃度はともに、比較例３に対して、実施例３では減少が確認された。一方で、イソアミルアルコール濃度は、比較例３に対して、実施例３では増加していた。ＳＯ２濃度は、酢酸エステル類の濃度と同様に、実施例３において、減少が見られた。これらの結果は、発酵原料液中の酸素の低減を示しており、実施例３の試験条件では、発酵原料液中の酸素を酵母が効率よく消費することで、発酵が良好に進んだものと考えられる。
　よって、実施例３の試験条件によれば、発酵が良好に進み、２Ｍ３ＭＢの含有量が低減された発酵ビール様発泡性飲料が得られることが確かめられた。
　本実施形態の低減された発酵ビール様発泡性飲料の製造方法及びオフフレーバー低減方法によれば、酵母による発酵速度を良好に保ちながら、タマネギ様臭の主な原因物質である２Ｍ３ＭＢの含有量が低減された発酵ビール様発泡性飲料を得ることができる。
　１…ワールプール（沈殿槽）、２ａ，２ｂ，２ｃ，２ｅ…配管、３…熱交換器、４…１次エアレーション装置、５…フローテーションタンク、６…２次エアレーション装置、７…発酵槽、１０…ビール醸造装置の一部。

Claims (11)

  1. 　酵母を添加した発酵原料液を発酵槽内で発酵させる発酵ビール様発泡性飲料の製造方法であって、
    　フローテーションタンク中で冷トルーブが除去された後にエアレーション処理された発酵原料液を、ｎ回（ｎは２以上の整数）に分けて発酵槽へ注入し、
    　酵母は、１回目～ｎ－１回目に発酵槽に注入される発酵原料液に添加される、発酵ビール様発泡性飲料の製造方法。
  2. 　１回目～ｎ－１回目に発酵槽に注入される発酵原料液は、酵母を添加された後にフローテーションタンクに注入され、かつ酵母の添加の前に、酵母の添加と同時に、又は酵母の添加後であってフローテーションタンク注入の前に、エアレーション処理される、請求項１に記載の発酵ビール様発泡性飲料の製造方法。
  3. 　冷トルーブ除去後、発酵槽注入前の発酵原料液に対してなされるエアレーション処理によって、前記発酵原料液の流量の５体積％以上９体積％以下の空気を注入する、請求項１又は２に記載の発酵ビール様発泡性飲料の製造方法。
  4. 　ｎが３以上の整数である、請求項１～３のいずれか一項に記載の発酵ビール様発泡性飲料の製造方法。
  5. 　１回目～ｎ回目に発酵槽に注入される発酵原料液の量は実質的に等量である、請求項１～４のいずれか一項に記載の発酵ビール様発泡性飲料の製造方法。
  6. 　１回目～ｎ－１回目に発酵槽に注入される発酵原料液に添加される酵母の量は実質的に等量である、請求項１～５のいずれか一項に記載の発酵ビール様発泡性飲料の製造方法。
  7. 　発酵槽に発酵原料液を注入する時間間隔が５時間以内である、請求項１～６のいずれか一項に記載の発酵ビール様発泡性飲料の製造方法。
  8. 　フローテーションタンク中で冷トルーブが除去された後にエアレーション処理された発酵原料液を、ｎ回（ｎは２以上の整数）に分けて発酵槽へ注入し、
    　酵母は、１回目～ｎ－１回目に発酵槽に注入される発酵原料液に添加される、発酵ビール様発泡性飲料のオフフレーバー低減方法。
  9. 　１回目～ｎ－１回目に発酵槽に注入される発酵原料液は、
    　酵母を添加された後にフローテーションタンクに注入され、かつ
    　酵母の添加の前に、酵母の添加と同時に、又は酵母の添加後であってフローテーションタンク注入の前に、エアレーション処理される、請求項８に記載の発酵ビール様発泡性飲料のオフフレーバー低減方法。
  10. 　オフフレーバーの原因物質が２－メルカプト－３－メチル－１－ブタノールである、請求項８又は９に記載の発酵ビール様発泡性飲料のオフフレーバー低減方法。
  11. 　前記発酵ビール様発泡性飲料の前記２－メルカプト－３－メチル－１－ブタノールの含有量を、発酵ビール様発泡性飲料の総質量に対して、０．４ｐｐｂ以下に低減する、請求項１０に記載の発酵ビール様発泡性飲料のオフフレーバー低減方法。
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