WO2019156453A1 - 고통 및 부작용이 없는 국소지방 감소용 포스파티딜콜린 비포함 주사제 조성물 - Google Patents

고통 및 부작용이 없는 국소지방 감소용 포스파티딜콜린 비포함 주사제 조성물 Download PDF

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WO2019156453A1
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pain
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이기택
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses

Definitions

  • the present invention relates to a phosphatidylcholine-free injectable composition for topical fat reduction and a method for preparing the same, and more particularly, to a phosphatidylcholine-containing topical fat-injectable composition for reducing fat, glycocholine acid or a salt thereof. It relates to a topical fat reducing injection composition and a method for preparing the same, which are characterized by including 1 (w / v)% to 6 (w / v)%.
  • Injection for localized fat reduction is a cosmetic surgery to inject drugs into patients for the purpose of lipolysis, apoptosis and necrosis of fat cells.
  • Locally deposited fats are of particular interest to many. People with unwanted, convex or plump locally deposited fats may appear unattractive and old. These causes may be due to aging, lifestyle or genetic predisposition, and try to improve with exercise therapy and diet to overcome this, but the effect is limited.
  • the current treatment methods for local fat reduction are surgical methods such as liposuction, lipoplasty, liposuction, and non-surgical methods such as medical devices, mesotherapy and off-label lipolysis injection.
  • Surgical methods take weeks or months to heal, and certain people, such as smokers and diabetics, can significantly delay healing, with fatal side effects of 20 deaths per 100,000 people, risk of general anesthesia, excessive bleeding, internal Potential complications and risks include organ damage, bacterial infections, scars, bruising, edema and pain.
  • Non-surgical methods which are attempted to address this, have potential safety risks due to the lack of safety and effectiveness due to the absence of large-scale clinical trials under the supervision of health authorities.
  • the development of new clinically beneficial drugs is necessary. against this backdrop, non-surgical topical injections for local fat reduction have been studied steadily and a representative case is PPC injection.
  • PPC phosphatidylcholine
  • DCA Deoxycholic acid
  • lipostabil® N iv developed for the prevention and treatment of fat embolism
  • off-label PPC injection, Lipodissolve, injection-lipolysis, fat-away-injection
  • lipobin® strain developed as an adjuvant therapy for cirrhosis due to cirrhosis, is administered as a topical fat reducing injection.
  • PPC has been regarded as a single active ingredient of lipolysis in DCA-incorporated PPC injections.However, in 2004, DCA formulated as a solubilizer dissolves cell membranes and induces cell lysis by inducing a inflammatory response. It has been shown to necrosis the necrosis, and in fact DCA has also been found to be the active ingredient of topical fat reduction (Rotunda AM, Suzuki H, Moy RL, Kolodney M., Detergent effects of sodium deoxycholate are a major feature of an injectable phosphatidylcholine formulation used for localized fat dissolution.Dermatol Surg 30 (7): 1001-8 (2004).
  • necrosis is the active death caused by the regulation and expression of several genes and proteins in response to a programmed signal inside the cell.
  • the apoptosomes produced by the process are the cells or macrophages that surround them. It is eliminated by phagocytosis such as macrophage and does not cause inflammation.
  • necrosis is a passive death caused by changes in the external environment and undergoes the process of irregular clumping and swelling of cytoplasm, and finally the degradation of cells. Cell debris are produced and are known to cause inflammation (Earnshaw, WC, Curr. Opin. Cell Biol., 7, pp 337-343, 1995).
  • topical lipolytic agent acts in the manner of cell necrosis, inflammatory action also affects the surrounding area other than the target site to which the drug is administered, thus affecting the cells that should function normally and die.
  • pain, hematoma, swelling, numbness, erythema, swelling, sclerosis, pruritus, and nodule which are present in existing topical liposomal injections, only lipolysis and apoptosis in cells where the drug is acting. It is important to induce high efficiency.
  • the present inventors have been researching to develop injections having excellent local fat reduction ability without side effects such as pain and hematoma, swelling, numbness, erythema, swelling, sclerosis, pruritus and nodules, and are widely used in conventional topical lipolytic injections.
  • deoxycholic acid acts in a way that induces necrosis of adipocytes
  • glycocholic acid and its salts reduce adipocytes by pharmacological mechanisms of lipolysis and apoptosis of adipocytes, and thus
  • the present invention was completed by confirming that it has excellent lipolysis and fat cell removal effects without pain and side effects.
  • an object of the present invention in the phosphatidylcholine-containing topical fat reducing injection composition, the composition is characterized in that it comprises 1 (w / v) to 6 (w / v)% glycocholic acid or salts thereof And to provide an injection composition for topical fat reduction without side effects.
  • the composition is composed of 1 (w / v)% to 6 (w / v)% of glycocholine acid or a salt thereof, and has no pain and no side effect. It is to provide an injection composition for fat reduction.
  • the composition is composed of 1% (w / v)% to 6% (w / v)% of glycocholine acid or a salt thereof. It is to provide an injection composition for topical fat reduction.
  • the composition is 1 (w / v)% to 6 (Glycocholic acid (GCA) or salts thereof) It includes w / v)% but does not include phosphatidylcholine, to provide a method for producing a topical fat reducing injection composition without pain and side effects.
  • Another object of the present invention is to provide a composition comprising 1 (w / v) to 6 (w / v)% of glycocholine acid or a salt thereof for the preparation of a phosphatidylcholine-free topical fat injectable without pain and side effects. It is to provide a use.
  • Another object of the invention comprises administering to a subject in need thereof an effective amount of a composition comprising no phosphatidylcholine comprising 1 (w / v)% to 6 (w / v)% glycocholine acid or a salt thereof It is to provide a method for reducing local fat without pain and side effects.
  • the present invention is a composition for injection of a topical fat reduction containing phosphatidylcholine, wherein the composition comprises 1 (w / v)% to 6 (w / v)% of glycocholine acid or a salt thereof It provides a topical fat reducing injection composition without pain and side effects.
  • the present invention is a phosphatidylcholine-containing topical fat reducing injectable composition wherein the composition is characterized in that the glycocholine acid or salt thereof is composed of 1 (w / v)% to 6 (w / v)% Provided is an injection composition for topical fat reduction.
  • the present invention is a phosphatidylcholine-containing topical fat reducing injectable composition, wherein the composition is characterized in that the glycocholine acid or salt thereof is composed essentially of 1 (w / v) to 6 (w / v)% And it provides an injection composition for topical fat reduction without side effects.
  • the present invention provides a method for producing a topical fat reducing injection composition without pain and side effects, the composition is glycocholic acid (Glycocholic acid, GCA) or salts thereof (w / v)% to 6 (w / v)%, but does not contain phosphatidylcholine, it provides a method for producing a topical fat reducing injection composition without pain and side effects.
  • glycocholic acid Glycocholic acid, GCA
  • salts thereof w / v)% to 6 (w / v)%
  • phosphatidylcholine it provides a method for producing a topical fat reducing injection composition without pain and side effects.
  • an effective amount of a phosphatidylcholine-free composition comprising 1 (w / v)% to 6 (w / v)% of glycocholine acid or a salt thereof is administered to a subject in need thereof.
  • a method of reducing topical fat is provided without the pain and side effects comprising the step.
  • the disease or disorder is "alleviated” if the severity of the symptoms of the disease or disorder, the frequency of such symptoms experienced by the patient, or both are reduced.
  • phosphatidylcholine refers to a compound represented by IUPAC name 1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphocholine as phospholipid and is described herein as PPC.
  • bile acid includes steroid acids (and / or carboxylic acid anions thereof), and salts thereof, which are found in bile of animals (eg, humans).
  • 'Deoxycholic acid' is a type of bile salt, IUPAC Name (4R) -4-[(3R, 5R, 8R, 9S, 10S, 12S, 13R, 14S, 17R) -3,12 dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta [a] phenanthren-17-yl ] means a compound represented by pentanoic acid. Described as DCA in the context of the present invention.
  • 'Gycocholic acid' is a type of bile salt, IUPAC Name 2-[[(4R) -4-[(3R, 5S, 7R, 8R, 9S, 10S, 12S, 13R, 14S, 17R)- 3,7,12-trihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta [a] phenanthren-17-yl] pentanoyl] amino] acetic acid. Described herein as GCA.
  • 'Taurocholic acid' is a type of bile salt.
  • 'Cholic acid' is a type of bile salt, IUPAC Name (4R) -4-[(3R, 5S, 7R, 8R, 9S, 10S, 12S, 13R, 14S, 17R) -3,7,12 -trihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta [a] phenanthren-17-yl ] means a compound labeled with pentanoic acid. Described herein as CA.
  • 'Chenodeoxycholic acid' is a type of bile salt, IUPAC Name ((4R) -4-[(3R, 5S, 7R, 8R, 9S, 10S, 13R, 14S, 17R) -3,7 -dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta [a] phenanthren-17-yl ] pentanoic acid, referred to herein as CDCA.
  • 'Ursodeoxycholic acid' is a type of bile salt, IUPAC Name (4R) -4-[(3R, 5S, 7S, 8R, 9S, 10S, 13R, 14S, 17R) -3,7 -dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta [a] phenanthren-17-yl ] means a compound labeled with pentanoic acid. Described herein as UDCA.
  • 'Glycodeoxycholic acid' is a type of bile salt, IUPAC Name 2-[[(4R) -4-[(3R, 8R, 9S, 10S, 12S, 13R, 14S, 17R) -3, 12-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta [a] phenanthren-17- yl] pentanoyl] amino] acetic acid. Described herein as GDCA.
  • Taurodeoxycholic acid is a type of bile salt, IUPAC Name 2-[[(4R) -4-[(3R, 5R, 9S, 10S, 12S, 13R, 14S, 17R) -3 , 12-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta [a] phenanthren-17 -yl] pentanoyl] amino] ethanesulfonic acid. Described herein as TDCA.
  • 'Hyodeoxycholic acid' is a type of bile salt, IUPAC Name (4R) -4-[(3R, 5R, 6S, 8S, 9S, 10R, 13R, 14S, 17R) -3,6- dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta [a] phenanthren-17-yl] Means a compound labeled with pentanoic acid. Described herein as HDCA.
  • 'Lithocholic acid' is a type of bile salt, IUPAC Name (4R) -4-[(3R, 5R, 8R, 9S, 10S, 13R, 14S, 17R) -3-hydroxy-10,13- dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta [a] phenanthren-17-yl] pentanoic acid it means. Described herein as LCA.
  • Taurorsodeoxycholic acid is a type of bile salt, and IUPAC Name 2-[[(4R) -4-[(3R, 5S, 7S, 8R, 9S, 10S, 13R, 14S, 17R ) -3,7-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta [a] phenanthren-17-yl] pentanoyl] amino] ethanesulfonic acid. Described herein as TUDCA.
  • 'Dehydrocholic acid' is a type of bile salt, IUPAC Name (4R) -4-[(5S, 8R, 9S, 10S, 13R, 14S, 17R) -10,13-dimethyl-3,7 , 12-trioxo-1,2,4,5,6,8,9,11,14,15,16,17-dodecahydrocyclopenta [a] phenanthren-17-yl] pentanoic acid. Described herein as DHCA.
  • patient refers to any animal, or cell thereof.
  • patient, subject or individual is a human.
  • composition refers to at least one compound of the invention and carriers, stabilizers, diluents, dispersants, suspending agents, thickening agents. A mixture of other chemical components, such as thickening agents, and / or excipients.
  • the pharmaceutical composition facilitates administration of the compound to an organism.
  • the terms "effective amount”, “pharmaceutically effective amount” and “therapeutically effective amount” are non-toxic but do not produce the desired biological outcome. Indicates an amount sufficient to provide. The result can be a reduction and / or alleviation of the signs, symptoms, or cause of the disease, or any other desired alteration of the biological system. Appropriate therapeutic amounts in any individual case can be determined by one of skill in the art using routine experimentation.
  • the term “efficacy” refers to the maximum effect (Emax) achieved within the assay.
  • the indicator material delivers the utility of a compound, composition, vector, or delivery system of the invention in a kit for alleviating the various diseases or disorders referred to herein. Publications, recordings, diagrams, or any other presentation medium that may be used to do so.
  • the indicator material may describe one or more methods for alleviating a disease or disorder in mammalian cells or tissues.
  • the indicator material of the kit of the present invention may be attached to, for example, a container comprising the identified compound, composition, vector, or delivery system of the present invention, or the identified compound, composition, vector, Or with a container containing a delivery system.
  • the indicator material may be shipped separately from the container with the intention that the indicator material and the compound will be used cooperatively by the recipient.
  • Topical administration means administration of a pharmaceutical component to, or around, a muscle or subdermal location of a patient by non-systemic routes. Thus, topical administration excludes administration via systemic routes such as intravenous or oral administration.
  • “Pharmaceutically acceptable” means a property that is acceptable to a pharmacologist who manufactures from a pharmacological / toxicological point of view and a physical / chemical point of view regarding composition, formulation, stability, patient acceptability and bioavailability. And / or material. “Pharmaceutically acceptable carrier” refers to a medium that does not interfere with the host administered without interfering with the effectiveness of the biological activity of the active ingredient (s).
  • a “therapeutic” treatment is a treatment administered to a subject who exhibits the pathological signs or symptoms for the purpose of reducing or eliminating the signs or symptoms.
  • treatment means a condition contemplated herein, the symptoms of a condition contemplated herein or the potential to progress to a condition contemplated herein.
  • the application or administration of a therapeutic agent eg, for diagnostic or in vivo application
  • the treatment may be specifically tailored or modified based on knowledge obtained from the field of pharmacology.
  • a “therapeutically effective amount” is an amount of a compound of the invention that, when administered to a patient, ameliorates the symptoms of the disease.
  • the amount of the compound of the present invention which constitutes a "therapeutically effective amount” may vary depending on the compound, the disease state and its severity, the age of the patient being treated, and the like.
  • a therapeutically effective amount can be routinely determined by one of ordinary skill in the art in view of his knowledge and the present disclosure.
  • range format various aspects of the invention may be proposed in a range format. It is to be understood that the description in range format is merely for convenience and simplicity and should not be construed as an inflexible limitation on the scope of the invention. Accordingly, the description of a range should be considered to specifically disclose all possible subranges as well as individual numerical values within that range. For example, descriptions in the range 1-6 may include individual values within the range, for example 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3, and 6, as well as 1-3, 1-4. And subranges such as 1 to 5, 2 to 4, 2 to 6, 3 to 6, and the like, should be considered as having specifically disclosed. This applies regardless of the width of the range.
  • the term '%' means a content of w / v% unless otherwise specified.
  • glycocholine acid is 1 (w / v)% to 6 (w / v)%
  • the contribution of lipolysis and apoptosis-specific effects at concentrations has been newly identified.
  • the topical fat reducing injection composition of the present invention containing glycocholine acid or a salt thereof in a specific concentration has excellent lipolysis effect, and only apoptosis is applied only to the cells of the topical site to which the drug is administered.
  • composition is Glycocholine acid Or 1 (w / v)% to 6 (w / v)% of salts thereof, and provides an injection composition for reducing local fat without pain and side effects.
  • phosphatidylcholine-containing topical fat reducing injectable composition wherein the composition is characterized in that the glycocholine acid or salt thereof is composed of 1 (w / v)% to 6 (w / v)%
  • an injection composition for reducing local fat without pain and side effects is provided.
  • phosphatidylcholine-containing topical fat reducing injectable composition the composition is characterized in that consisting essentially of 1 (w / v) to 6 (w / v)% glycocholine acid or salts thereof It provides a topical fat reducing injection composition without the pain and side effects.
  • the present invention relates to a non-surgical method, ie, an injection for topical fat reduction that is used alone, without accompanying surgery (eg liposuction, etc.). That is, the composition of the present invention is used for the purpose of reducing subcutaneous fat accumulation in mammals without performing surgical (surgical) treatment.
  • the composition of the present invention relates to a phospholipid-free composition such as phosphatidyl. That is, the composition of the present invention relates to a composition that does not contain phosphatidylcholine as well as a phosphatidyl component.
  • composition of the present invention may be a composition that does not include a lipase or a lipase.
  • composition of the present invention comprises 1 (w / v)%, 1.5 (w / v)%, 2 (w / v)%, 2.5 (w / v)%, 3 ( w / v)%, 3.5 (w / v)%, 4 (w / v)%, 4.5 (w / v)%, 5 (w / v)%, 5.5 (w / v)% or 6 (w / v)%.
  • the injectable composition of the present invention may be applied to a topical site, and the site is not limited thereto, but is preferably deposited on the abdomen, submandibular, forearm, thigh, waist, hip, under eyes, and brasere line. It can be applied to the fat or lipoma site.
  • the topical fat reducing injection composition of the present invention is a pharmaceutical composition for the treatment of adipose tissue hyperproliferation or hyperaccumulation disorder (disease), the disorder being of the kind if it is known in the art that the adipose tissue is hyperproliferation or hyperaccumulation.
  • adipose tissue hyperproliferation or hyperaccumulation disorder disease
  • the method of administering the injectable composition of the present invention is not limited, but may be administered by a method suitable for the patient in view of the severity of the disease, the age, sex and other conditions of the patient, and the like.
  • the route is not particularly limited in the method, but subcutaneous injection, intradermal injection, and the like are preferable.
  • the pain includes both pain during injection and / or pain after administration.
  • the present invention suffers from conventionally available phosphatidylcholine-deoxycholine acid combinations (PPC-DCA such as lipostavill) or deoxycholineic acid (DCA) single agents (eg Kybella). Contrary to its involvement, it is characterized by significantly reduced pain (substantial painlessness).
  • PPC-DCA phosphatidylcholine-deoxycholine acid combinations
  • DCA deoxycholineic acid
  • Such analgesic topical fat reducing injections are disclosed for the first time in the present invention, and in particular, pains caused by adverse reactions (side effects) such as inflammation and stiffness secondary to secondary injections, as well as conventional injections during and immediately after injection. It is characterized by painlessness in the primary pain that is manifested in their own nature.
  • the term side effect refers to a phosphatidylcholine-deoxycholine acid combination (PPC-DCA, for example, lipostabil) or deoxycholine acid (DCA), which is a known topical or commercially available topical fat reducing injection.
  • a side effect of the formulation for example, Kybella
  • the topical fat reducing injectable composition of the present invention is reduced to an extent that local adverse reactions are alleviated and the side effects are substantially absent.
  • Injectables are those dissolved in glycocholine acid or its salts and other additives, if necessary, in water for injection, filtered through a bacterial filter and aseptically filled and filled in vials, ampoules, or pre-filled syringes in a sterile state.
  • water for injection may be used in addition to water to fill the remaining amount.
  • the water for injection is not particularly limited as long as it is distilled water for injection or buffer for injection prepared for dissolving a solid injection or diluting a water-soluble injection, but for example, phosphate buffer solution or sodium dihydrogen phosphate (pH 3.5 to 7.5). NaH 2 PO 4 ) -citric acid buffer solution and the like can be used.
  • the phosphate used herein may be in the form of sodium or potassium salts or in the form of anhydrides or hydrates, or in the form of citric acid or anhydrides or hydrates.
  • water for injection include glucose injection, xylitol injection, D-mannitol injection, fructose injection, physiological saline, dextran 40 injection, dextran 70 injection, amino acid injection, Ringer's solution, lactic acid-ringer's solution, and the like. It is not limited.
  • the water for injection includes all the usual aqueous vehicles used in the field of injection preparation in addition to the above, and the kind of water for injection is not particularly limited, and an excipient component (for example, used in a conventional injection) It also includes an aqueous vehicle that additionally includes sorbitol.
  • the composition for reducing local fat of the present invention is characterized in that it comprises 'glycocholic acid or salt thereof'.
  • the glycocholine acid is a bile acid having a structure of ⁇ Formula 1>, and has a molecular weight of about 465.63 g / mol and may be described as GCA or GC herein.
  • the glycocholine acid may be used in the form of a pharmaceutically acceptable salt.
  • pharmaceutically acceptable means a physiologically acceptable and typically does not cause an allergic or similar reaction when administered to a human, but may be, for example, sodium salt, potassium salt or ammonium salt. have.
  • the glycocholine salt of the present invention may be sodium glycocholate (GCNa) represented by the following ⁇ Formula 2>.
  • glycocholic acid or a salt thereof may be extracted and used in the intestine of an animal according to methods known in the art, and may be used commercially or prepared by chemical synthesis known in the art. have.
  • the glycocholine acid is characterized in that it comprises 1.0% to 6.0% (w / v) based on the total composition. If the concentration of glycocholic acid is less than 1.0% (w / v), there is no lipolytic effect, and when it exceeds 7.0% (w / v), side effects such as pain, edema and inflammation may occur severely.
  • Injectable composition for local fat decomposition of the present invention is characterized in that having a pH 6.0 to pH 8.0, preferably may be adjusted to pH 7.0 to pH 7.8. If it is less than pH 7.0, it is not good in pain, and if it is above pH 7.8, it is not good in pain.
  • the fat reducing injection composition of the present invention comprising the glycocholic acid (GCA) or salts thereof is excellent in formulation stability at pH 7.0 to pH 7.8 as described above, and the adipocyte lysis injection containing deoxycholine acid is GCA is highly efficient at concentrations of 1.0% to 6.0% (w / v), unlike necrosis, which cause pain in the body and cause side effects such as hematoma, edema, numbness, erythema, swelling, hardening, pruritus and nodules.
  • GCA glycocholic acid
  • composition of the present invention may be characterized in that it does not contain anti-inflammatory agents and analgesics.
  • composition of the present invention based on the total composition of 0.1 (w / v)% to 5 (w / v)% preservative, 0.1 (w / v)% to 10 (w / v)% isotonic agent and It may further comprise one or more substances selected from the group consisting of 0.1 (w / v)% to 5 (w / v)% pH adjusting agent.
  • the preservative is not limited thereto, but is selected from the group consisting of benzyl alcohol, thimerosal, benzalkonium chloride, phenyl mercury nitrate, and chlorobutanol. It may be one or more. More preferably benzyl alcohol. Benzyl alcohol is a colorless and transparent liquid as one of aromatic alcohols. The concentration of benzyl alcohol included in the injectable composition of the present invention may be preferably 0.1 (w / v)% to 2 (w / v)%.
  • the isotonic agent serves to properly maintain (modulate) the osmotic pressure when administering the composition of the present invention to the body, and may also exhibit the side effect of further stabilizing GCA in solution.
  • Isotonic agents can be pharmaceutically acceptable sugars, salts, or any combination or mixture thereof, such as glucose as sugar, or sodium chloride, calcium chloride, sodium sulfate, glycerine, propylene glycol, molecular weight as a water-soluble inorganic salt.
  • the polyethylene glycol may be 1000 or less, and more preferably sodium chloride. They can be used in the form of one or two or more combinations.
  • the concentration of the tonicity agent is preferably 0.1 (w / v)% to 5 (w / v)%, and a solution formulation including all of the mixtures according to the type, amount, etc. of the components included in the composition of the present invention. It may be adjusted to an appropriate amount so that the isotonic solution.
  • the pH adjusting agent of the present invention serves to adjust the pH of the injection, and includes both acidic and basic substances.
  • the acidic materials include, but are not limited to, hydrochloric acid, acetic acid, adipic acid, ascorbic acid, sodium ascorbic acid, sodium ether, malic acid, succinic acid, tartaric acid, fumaric acid, citric acid (citric acid), and the like.
  • the basic materials include inorganic bases (e.g.
  • the pH adjusting agent of the present invention may be sodium hydroxide or hydrochloric acid.
  • the amount of the pH adjusting agent to be added may vary depending on the type and amount of components constituting the composition of the present invention, preferably 0.1 (w / v)%) to 3 (w / v)%.
  • the composition of the present invention may be preferably provided in the range of pH 7.0 to pH 7.8, and the type and amount of the pH adjuster according to this may be changed by those skilled in the art according to the specific composition of the solution.
  • topical fat reducing injectable composition of the present invention in a preferred embodiment, is a topical fat reducing injectable composition of the present invention
  • the total effective amount of the injectable composition of the present invention may be administered to a patient in a single dose and may be administered by a fractionated treatment protocol which is administered in multiple doses for a long time.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may vary in dosage depending on the amount of fat at the target site, the location of the target site, the type of fat composition and the desired result. For example, it is administered subcutaneously or subcutaneously via subcutaneous injection using a syringe to the target site.
  • the target site can be, for example, from 0.1 cm x 0.1 cm to 5 cm x 5 cm wide.
  • the preferred total dose of the composition of the invention may be from 0.1 ml to 1.0 ml per cm 2 , most preferably from 0.2 ml to 0.5 ml per cm 2 .
  • the dosage of the injectable composition is determined in consideration of various factors such as the age, weight, health condition, sex, severity of the disease, diet and excretion rate, as well as the route of administration and the number of treatments of the composition, In view of this, one of ordinary skill in the art will be able to determine the appropriate effective dosage for the particular use of the composition as a therapeutic agent.
  • the present invention provides a method for producing a topical fat reducing injection composition without pain and side effects
  • the composition is Glycocholine acid ( Glycocholic acid, GCA ) Or salts thereof 1 (w / v)% to 6 (w / v)%, but does not contain phosphatidylcholine, it provides a method for producing an injection composition for reducing local fat without pain and side effects .
  • Glycocholine acid Glycocholic acid, GCA
  • salts thereof 1 (w / v)% to 6 (w / v)%, but does not contain phosphatidylcholine, it provides a method for producing an injection composition for reducing local fat without pain and side effects .
  • the manufacturing method may be prepared according to the method of mixing, stirring and filtration commonly used in the art, according to the composition of the topical fat reducing injection composition without the pain and side effects of the present invention described above.
  • the kind and composition ratio of the specific component of the said composition are referred to the above-mentioned bar.
  • Glycocholine acid Glycocholic acid
  • a salt thereof is added to the water for injection so as to be 1 (w / v)% to 6 (w / v)% and stirred until it is transparently dissolved;
  • step (b) in step (a) Stirred In the mixture Tonicity And adding 0.1 (w / v)% to 15 (w / v)% preservative and stirring; And
  • step (a) glycolic acid (Glycocholic acid) or a salt thereof is added to the water for injection, and the solution is stirred until the solution becomes substantially transparent.
  • glycocholine acid or a salt thereof is characterized by including 1.0% to 6.0% (w / v) based on the total composition.
  • Stirring or mixing in the present invention may be by a known stirring means (stirrer), depending on the type or nature of the material to be added to those skilled in the art to improve the working efficiency conditions such as temperature, pressure, time or / and rotation speed It can be different.
  • stirrer a known stirring means
  • step (a) administration of the pH adjusting agent may be additionally performed, and may preferably be preceded by glycocholic acid or salts thereof.
  • the adjustment of pH may be performed by adding and stirring one or two or more pH adjusting agents at 0.1 (w / v)% to 5 (w / v)%.
  • Specific types of pH adjusting agents that can be used in the present invention and their inclusion amounts are as described above.
  • step (b) 0.1 (w / v)% to 5 (w / v)% of a preservative and 0.1 (w / v)% to 10 (w / v)% of an isotonic agent are added and stirred based on the total composition. .
  • Specific components and concentrations of the preservatives and tonicity agents are as described above in the description of the composition.
  • step (c) after adjusting the pH, adjust the total volume with water and mix homogeneously.
  • the adjustment of the pH may be performed by further adding and stirring one or more mixtures of pH regulators at 0.1 (w / v)% to 5 (w / v)%.
  • pH adjusting agents that can be used in the present invention and their inclusion amounts are as described above.
  • the water may be replaced with water for injection, as described above.
  • a buffer solution such as hydrochloric acid and phosphate that can be used as an injection Can be.
  • the present invention also provides the use of a composition comprising 1 (w / v)% to 6 (w / v)% of glycocholine acid or a salt thereof for the preparation of a phosphatidylcholine-free topical fat injectable without pain and side effects. do.
  • the present invention provides a method for treating pain and side effects comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of a phosphatidylcholine-free composition comprising 1 (w / v)% to 6 (w / v)% of glycocholine acid or a salt thereof It provides a method of reducing topical fat without.
  • the term 'effective amount' of the present invention when administered to an individual, refers to an amount which shows an effect of improving, preventing, detecting, diagnosing, or inhibiting or reducing local fat accumulation in the local fat accumulation, and the 'individual' refers to an animal, preferably It may be a mammal, especially an animal including a human, and may be cells, tissues, organs, etc. derived from the animal. The subject may be a patient in need of the effect.
  • the present invention relates to a preparation for topical fat reduction, which is designed to act in a specific manner of inducing fat cell apoptosis, and includes DCA alone and DCA alone, such as Kibela.
  • the specific effects of lipolysis and apoptosis on adipocytes are excellent without adipocyte necrosis caused by PPC preparations. Accordingly, it is excellent in reducing fat cells without side effects such as pain, hematoma, edema, numbness, erythema, swelling, hardening, pruritus, nodules.
  • Figure 2 shows apoptosis (apoptosis) for DCA 1.0% alone and PPC 5.0% formulation solubilized with DCA 2.2% and GCA concentration alone (GCA 1.0%, GCA 3.0%, GCA 6.0%, GCA 9.0%). ) Induced specificity is shown through the Caspase 3 activity assay.
  • FIG. 3 shows lipolysis of DCA 1.0% alone and PPC 5.0% solubilized with DCA 2.2% and GCA concentration alone (GCA 1.0%, GCA 3.0%, GCA 6.0%, GCA 9.0%). Induced specificity is shown through the comparison of Glycerol release.
  • Figure 4 shows the degree of inflammation induction for the DCA 1.0% alone formulation and PPC 5.0% formulation solubilized with DCA 2.2% and GCA concentration alone (GCA 1.0%, GCA 3.0%, GCA 6.0%, GCA 9.0%) The result measured by ELISA method is shown.
  • FIG. 5 shows fibroblast viability for DCA 1.0% alone and PPC 5.0% formulation solubilized with DCA 2.2% and GCA concentration alone (GCA 1.0%, GCA 3.0%, GCA 6.0%, GCA 9.0%). The comparison result is shown.
  • Figure 6 compares muscle cell viability for DCA 1.0% alone and PPC 5.0% formulation solubilized with DCA 2.2% and GCA concentration alone (GCA 1.0%, GCA 3.0%, GCA 6.0%, GCA 9.0%) One result is shown.
  • FIG. 7 shows vascular endothelial cell viability for DCA 1.0% alone and PPC 5.0% solubilized with DCA 2.2% and GCA concentration alone (GCA 1.0%, GCA 3.0%, GCA 6.0%, GCA 9.0%). The comparison result is shown.
  • 8A to 8K show the result of comparing the degree of edema over time by measuring the thickness of the foot by injecting bile acid at each concentration into the rat foot.
  • Figure 8a is a DCA alone composition injection (1.0-7.5%) by concentration
  • Figure 8b is a CA-only composition injection (1.0-7.5%) by concentration
  • Figure 8c is a TCA alone composition injection (1.0-7.5%) by concentration
  • Figure 8d Is the concentration of CDCA alone composition injection (1.0-7.5%) by concentration
  • Figure 8e is the concentration of UDCA alone composition injection (1.0-7.5%) by concentration
  • Figure 8f is the concentration of GDCA composition injection (1.0-7.5%) by concentration
  • FIG. 8H shows HDCA alone composition injection (1.0-7.5%) by concentration
  • FIG. 8I shows TUDCA single composition injection (1.0-7.5%) by concentration
  • FIG. 8J shows DHCA concentration Single composition injection (1.0-7.5%)
  • FIG. 8K is a graph comparing injections containing 2.5% of various bile acids (BA) alone to the rat foot, and measuring edema after 3 hours (control group). Using PBS).
  • 10A to 10F show a DCA 1.0% (FIG. 10A), GCA 1.0% (FIG. 10B), GCA 2.5% (FIG. 10C), GCA 5.0% (FIG. 10D), GCA 10.0% (FIG. 10E) in the rat's foot. 3 hours after each injection of the formulation, H & E staining of plantar tissue The results of histological comparison of the states of inflammation and edema are shown. 10F shows the results of comprehensive comparison of each experimental group (three replicate experiments).
  • Figure 11 is administered once each test substance (DCA alone preparations and GCA alone preparations) to a high fat diet-induced obesity fat pad pad, and after 8 days H & E staining subcutaneous fat tissue to reduce the degree of fat cells The histological comparison is shown.
  • Figure 12 shows the results of comparing the adipocyte viability for the concentration of DHCA, TUDCA, GCA, TCA by edema, inflammation and tissue lesions or low depressive inflammation of the experimental drug.
  • composition Preparation Example
  • comparative compositions Comparative Example
  • Glycocholine acid (GCA) alone preparations were 5 mg (0.5%, Comparative Preparation Example), 10 mg (1%, Preparation Example 1), 15 mg (1.5%, Preparation Example 2), 30 mg (3.0%), respectively, in 1 mL glycocholine acid.
  • Preparation Example 3 45mg (4.5%, Preparation Example 4), 60mg (6.0%, Preparation Example 5), 75mg (7.5%, Preparation Example 6) or 90mg (9.0%, Preparation Example 7)
  • the experimental group was prepared, and the remaining material composition was prepared using 9 mg of benzyl alcohol, 2.2 mg of sodium chloride, and the balance of water. Specific manufacturing process is as follows.
  • the final mixture was filtered through a 0.2 ⁇ m filter and then filled and sealed in a vial.
  • Substances used in the preparation include glycocholic acid (New zealand pharm) or sodium glycochocholate (New zealand pharm), benzyl alcohol (Sigma-Aldrich), sodium chloride (Sigma-Aldrich), sodium hydroxide (Sigma-Aldrich). Aldrich) and hydrochloric acid (Sigma-Aldrich).
  • the bile salt alone formulation was prepared in 10 mL (1%), 25 mg (2.5%), 50 mg (5.0%), 75 mg (7.5%) of each of the bile salts in 1 mL to prepare a test group, the remaining composition of the benzyl alcohol 9 mg, sodium chloride 2.2 mg and the remaining amount of water were prepared as a composition.
  • Specific manufacturing process is as follows. 1 liter of water for injection (Korea Pharmaceutical Industry Co., Ltd.) was transferred to a sterilized preparation tank, and 500 mL was transferred to a sealed SUS reservoir, and sodium hydroxide solution was added and stirred to 500 mL of water for injection, and each bile salt was added and stirred. Sodium chloride and benzyl alcohol were added and stirred.
  • Substances used in the preparation include glycocholic acid (CA, New zealand pharm), deoxycholic acid (DCA, Sigma-Aldrich), sodium deoxycholate (DCNa, New zealand phram), glyco Glycocholic acid (GCA, New zealand phram), Sodium Glycocholate (GCNa, New zealand phram), Taurocholic acid (TCA, Sigma-Aldrich), Sodium taurocholine acid (Sodium Taurocholate, TCNa, New zealand phram), Kenodeoxycholic acid (CDCA, Sigma-Aldrich), Ursodeoxycholic acid (UDCA, Sigma-Aldrich), Glycodeoxycholic acid , GDCA, Sigma-Aldrich), Taurodeoxycholic acid (TDCA, Sigma-Aldrich), Hideoxycholic acid (HDCA, Sigma-Aldrich), Lithocholic acid (Lithocholic acid, LCA, Sigma-Aldrich
  • the adipocyte death effect of the preparation composition and the comparative composition of the present invention was compared.
  • GCA 0.5%, GCA 1.0%, GCA 1.5%, GCA 3.0%, GCA 4.5%, GCA 6.0%, GCA 7.5%, GCA 9.0% and the like were used as the GCA alone preparation of the present invention, and DCA 1.0% alone and Experiments were performed with 5.0% PPC solubilized with 2.2% DCA (see FIG. 1).
  • TUDCA 2.5%, TUDCA 5.0%, TUDCA 7.5%, TCA 2.5%, TCA 5.0%, TCA 7.5% was compared in the same way (see Fig. 12).
  • the specific experimental method is as follows.
  • 3T3-L1 adipocytes were cultured at 70-75% cell confluence.
  • the cells were treated with 100 ⁇ l of the experimental material of Preparation Example and Comparative Example, and incubated at 37 ° C. for 0 to 48 hours.
  • the cells were washed twice with PBS, treated with MTT reagent (50 ul), and left at 37 ° C. for 2 hours. After removing the supernatant, the MTT formazan crystals were dissolved by treatment with DMSO, and the absorbance was measured at 540 nm using a microplate reader.
  • adipocyte lysis was observed in GCA alone, DCA alone, and DCA solubilized PPC groups, except for 0.5% GCA. But TUDCA TCA group and the experimental group in 12 was confirmed not affect the dissolved fat cells.
  • a Caspase 3 activity assay was performed on the preparation composition and the comparative composition of the present invention. Caspase 3 specifically increases when apoptosis occurs.
  • GCA preparations of the present invention 'GCA 1.0%, GCA 3%, GCA 6.0%, GCA 9.0%' and PPC 5.0% solubilized with control DCA 1.0% and DCA 2.2% were representatively tested.
  • test method was briefly as follows: Dispense 1X10 5 3T3-L1 adipocytes into each well, Each 100 ⁇ l of the test material was treated, and incubated at 37 ° C. for 0 to 48 hours. Thereafter, 50 ul of cell lysis buffer (10 mm Tris-HCl, 10 mm NaH 2 PO 4 / NaHPO 4, pH 7.5, 130 mm NaCl, 1% Triton X-100, and 10 mm sodium pyrophosphate) was treated and left at 4 ° C. for 10 minutes. .
  • reaction buffer 4 mM HEPES, pH 7.5, 10% glycerol, 2 mm dithiothreitol
  • reaction buffer 4 mM HEPES, pH 7.5, 10% glycerol, 2 mm dithiothreitol
  • 0.5 ul of 4 mM DEVD-p-NA were added to each sample, followed by reaction at 37 ° C for 1 hour. It was then measured at 405 nm wavelength by spectrofluorometry.
  • Lipolysis Assay Buffer (137 mM NaCl, 5 mM KCl, 4.2 mM NaHCO 3 , 1.3 mM CaCl 2 , 0.5 mM KH 2 PO 4 , 0.5 mM MgCl 2 , 0.5 mM MgSO 4 , 5 mM Glucose, 20 mM Hepes (pH 7.4), 1% BSA, 1 ⁇ M Isoproterenol) was added and incubated for 20 minutes to a total of 50 ul. After mixing the Glycerol Assay complex (50 ul), it was left for 30 minutes at room temperature and the absorbance was measured at OD570 (using a standard curve for absolute quantification).
  • glycerol release was increased more than 2 times in all groups except DCA alone treatment group. Lipolysis was also induced in the DCA alone treatment group, but the lipolysis effect of DCA was very low even when compared with the same concentrations of DCA 1% and GCA 1%. In the GCA treatment group, glycerol release was increased depending on GCA content.
  • the inflammatory effect of the composition of the above-described preparation of the present invention and the comparative composition was compared.
  • the experiments were representative of 'GCA 1.0%, GCA 3.0%, GCA 6.0%, GCA 9.0%', and PPC 5.0% solubilized with control DCA 1.0% alone and DCA 2.2%.
  • the experiment was conducted according to the manufacturer's manual. The test method was as follows: Dispense 1X10 5 3T3-L1 adipocytes into each well, and experiment with the preparation and comparative examples.
  • the experimental results are shown in FIG. 4 .
  • the TNF alpha was significantly increased in comparison with the other experimental groups.
  • the DCA 1% treatment group showed higher TNF- compared to the GCA 9% treatment group. ⁇ secretion was observed.
  • Fibroblasts CCD-986sk; human fibroblast
  • the fibroblast viability effect of the preparation composition and the comparative example composition of the present invention was compared.
  • GCA alone preparations of the present invention 'GCA 1.0%, GCA 3.0%, GCA 6.0%, GCA 9.0%', and control DCA 1.0% alone and DCA 5.0% solubilized with 2.2% DCA were representatively tested.
  • Specific experimental methods are as follows: After culturing fibroblasts (CCD-986sk; human fibroblast) to 85% cell confluence, the culture medium (IMDM, 10% FBS, 1% anitibiotics mix) is removed. 100 ⁇ l of each of the experimental materials of Preparation Example and Comparative Example were mixed and treated in a new culture medium, the culture medium was removed at a predetermined treatment time, and MTT assay (measured at 570 nm) was performed.
  • IMDM 10% FBS, 1% anitibiotics mix
  • vascular endothelial cells (HUVEC; human endothelium)
  • the effect of muscle cell viability of the preparation composition and the comparative composition of the present invention was compared.
  • GCA alone preparations of the present invention 'GCA 1.0%, GCA 3.0%, GCA 6.0%, GCA 9.0%', and control DCA 1.0% alone and PPC 5.0% solubilized with DCA 2.2% were representatively tested.
  • Specific test methods are as follows: 1% gelatin is applied to the culture dish and left to stand at room temperature for 1 day. After culturing up to 80% of the cell fullness in the coated culture dish remove the culture medium (EGM-Plus, 10% FBS, 1% antibiotics mix). 100 ⁇ l of each of the experimental materials of Preparation Example and Comparative Example were mixed and treated in a new culture medium, the culture medium was removed at a predetermined treatment time, and MTT assay (measured at 570 nm) was performed.
  • inflammatory cells were significantly reduced in the GCA 5.0% or less administration group of the present invention compared to the DCA administration group.
  • the side effects due to adipocyte necrosis occurs in the existing DCA-use preparations, whereas the GCA 6% or less of the present invention has an adipocyte-specific apoptosis-specific inflammatory response It was confirmed that fat was reduced almost without this.
  • C57BL / 6 rats (4 weeks old) were fed a high-fat diet (Research diet, 60% kcal lipid) for 12 weeks, resulting in high obesity.
  • saline negative control
  • DCA alone DCA 1%, positive control
  • GCA 1.0%
  • GCA 2.5% GCA 5.0%
  • GCA 10.0% Administration was once.
  • Each test substance was performed in a subcutaneous injection of 0.2 mL into the abdomen. Eight days after the first infusion was completed, mice were sacrificed. The abdomen of the sacrificed mice was excised and subcutaneous fat was quickly removed and soaked in 4% formaldehyde solution and fixed.
  • the present invention relates to a phosphatidylcholine-free injectable composition for topical fat reduction and a method for preparing the same, which has no pain and no side effects, and more particularly, to a phosphatidylcholine-containing topical fat injectable composition. It relates to a topical fat reducing injection composition and a method for producing the same, characterized in that it comprises 1 (w / v)% to 6 (w / v)% of glycocholine acid or a salt thereof.
  • Fat loss caused by adipocyte necrosis in conventional deoxycholine acid (DCA) single agents or phosphatidylcholine-deoxycholine acid combinations known as topical topical fat injections can cause pain, edema, inflammation, fibrosis, erythema, Local adverse reactions such as hematoma and nerve injury have been reported.
  • DCA deoxycholine acid
  • the injection composition for topical lipolysis provided by the present invention induces lipolysis and fat cell death (apoptosis) to reduce local fat, not only the effect of fat cell removal is remarkable, but also for the conventional local lipolysis.

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Abstract

본 발명은 고통 및 부작용이 없는, 국소지방 감소용 포스파티딜콜린 비포함 주사제 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 포스파티딜콜린 비포함 국소지방 감소용 주사제 조성물에 있어서, 상기 조성물은 글리코콜린산 또는 이의 염을 1(w/v)% 내지 6(w/v)% 포함하는 것을 특징으로 하는 고통 및 부작용이 없는 국소지방 감소용 주사제 조성물 및 이의 제조방법에 대한 것이다.

Description

고통 및 부작용이 없는 국소지방 감소용 포스파티딜콜린 비포함 주사제 조성물
본 출원은 2018년 2월 7일에 출원된 대한민국 특허출원 제10-2018-0015309호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
본 발명은 고통 및 부작용이 없는 국소지방 감소용 포스파티딜콜린 비포함 주사제 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 포스파티딜콜린 비포함 국소지방 감소용 주사제 조성물에 있어서 상기 조성물은 글리코콜린산 또는 이의 염을 1(w/v)% 내지 6(w/v)% 포함하는 것을 특징으로 하는 고통 및 부작용이 없는 국소지방 감소용 주사제 조성물 및 이의 제조방법에 대한 것이다.
국소 지방 감소용 주사(injection for localized fat reduction)는 지방 세포를 분해(lipolysis), 자멸(apoptosis), 괴사(necrosis) 하기 위한 목적으로 약물을 환자에 주사하는 미용성형 시술이다. 국소적으로 침착된 지방은 많은 사람들에게 특별한 관심사이다. 원치 않게 볼록하거나 통통하게 국소적으로 침착된 지방이 있는 사람은 외모적으로 매력이 떨어지고 늙어 보일 수 있다. 이와 같은 원인은 노화, 생활습관 또는 유전적 소인으로 인해 발생할 수 있으며 이를 극복하기 위해 운동요법과 식이요법으로 개선하고자 하지만 효과는 제한적이다. 이에 국소 지방감소를 위한 현재의 치료 방법은 수술적 방법으로서 지방흡입술, 지방성형술, 지방조각 흡입 절제술이 있으며, 비수술적 방법으로서 의료기기, 메조테라피 그리고 오프라벨인 지방용해 주사법이 있다. 그러나 수술적 방법은 치유에 몇 주 혹은 몇 달이 소요되며, 흡연자 및 당뇨병 환자와 같은 특정인은 치유가 상당히 지연 될 수 있으며, 십만명 당 20명이 사망하는 치명적인 부작용, 전신마취의 위험성, 과도한 출혈, 내부 장기 손상, 세균 감염, 흉터, 멍, 부종, 통증과 같은 잠재적 합병증과 위험성을 내포하고 있다. 이를 해결하고자 시술되는 비수술적 방법의 경우, 보건당국의 관리감독 하에 승인 받아 실시한 대규모 임상시험의 부재로 인하여 안전성과 유효성이 확보되지 않아 이 또한 잠재적 위해성을 내포하고 있다. 이와 같은 수술적 방법의 위험성과 비수술적 방법의 위해성을 극복하기 위하여, 임상적으로 유익성이 있는 새로운 의약품의 개발이 필요하다. 이와 같은 배경에서 비수술적 방법인 국소 지방 감소용 주사는 꾸준히 연구되고 있으며 대표적인 사례가 PPC주사이다. 기존 PPC주사의 주성분은 포스파티딜콜린(3-sn-Phosphatidylcholine, PPC)과 가용화제 데옥시콜린산(Deoxycholic acid, DCA) 조성으로, 독일 A Nattermann GmbH사에서 간질환 치료용으로 개발한 Essentiale ® N i.v.와 지방색전증의 예방과 치료로 개발한 Lipostabil® N i.v. 그리고 간경변에 의한 간성혼수 보조치료제로 개발한 리포빈®주를 국소 지방 감소용 주사제 용도로 투여한 오프라벨(PPC주사, Lipodissolve, injection-lipolysis, fat-away-injection)사례가 있다.
기존에 DCA가 배합된 PPC주사제에서 PPC가 지방용해의 단일 활성성분으로 간주되어 왔으나, 2004년에 가용화제로 배합된 DCA가 계면활성제 효과로 세포막을 용해시키고 세포 용해를 야기하여 염증반응을 유발시키며 지방세포를 괴사(necrosis) 시키는 것으로 확인되어, 실제로 DCA도 국소 지방 감소의 활성 성분인 것으로 밝혀졌다 (Rotunda AM, Suzuki H, Moy RL, Kolodney M., Detergent effects of sodium deoxycholate are a major feature of an injectable phosphatidylcholine formulation used for localized fat dissolution. Dermatol Surg 30(7):1001-8(2004).
그러나 PPC와 DCA가 배합된 조성은 피하지방 투여 시 고통(78.4%), 혈종(83.8%), 홍반(100%), 작열감(100%), 부종(100%), 경화(66.7%)의 이상반응이 보고 되었으며 DCA 단독제는 고통(100%), 멍(91.9%), 홍반(100%), 작열감(100%), 부종(100%), 경화(89.2%)가 보고되었을 뿐만 아니라(Giovanni Salti, Phosphatidylcholine and sodum deoxycholate in the treatment of localized fat: A doube-blind, randomized study, Dermatol Surg 34:60-66, 2007), 대규모 임상시험 결과 고통(73.6%), 혈종(72.9%), 부종(67.8%), 무감각증(65.5%), 홍반(35.3%), 종창(29.1%), 경화(28.3%), 소양감(16.3%), 결절(14.3%)의 이상반응이 보고되었다(Humphrey et al, ATX-101 for reduction of submental fat: A Phase Ⅲ randomized controlled trial, J AM ACAD DERMATOL Vol75, No.4, 788-797, 2016). 이와 같은 부작용들은 DCA 피하주사 후 세포에 산소공급을 차단하여 즉각적인 세포팽창 후 세포막에 수포와 손상을 야기시켜 급격한 염증반응으로 지방세포가 괴사(necrosis)되는 작용기전에 기인한다(Duncan, Injectable therapies for localized fat loss: state of the art, Clin Plastic Surg, 1-13, 2011). 또한 DCA는 지방세포 뿐만 아니라 근골격 세포도 손상시킨다(Dong-Seok Kim, Phosphatidylcholine induces apoptosis of 3T3-L1 adipocytes, Journal of biomedical science,18:91,1-7, 2011).
위에 언급된 부작용으로 인하여 국소 지방감소 주사제를 원하는 모든 환자들은 고통, 불편함 그리고 불안감을 호소하고 있기에, 현재 임상적 유효성은 검증 되었음에도 불구하고 복약 순응도가 낮은 실정이다.
생체 내에서 세포가 죽을(death) 때, 괴사(necrosis)되는 것과 사멸(자멸사, apoptosis)되는 것에는 현격한 차이가 있다. 아포토시스(apoptosis)는 세포 내부에서 프로그램화된 신호를 따라 여러 유전자 및 단백질들의 발현과 활성이 조절되어 일어나는 능동적인 죽음을 말하며, 그 과정을 통해 생성된 아폽토좀(apoptosome)들은 주변의 세포들이나 대식세포(macrophage)등의 식세포 작용에 의해 제거됨으로서, 염증을 유발하지 않는다. 반면, 세포괴사(necrosis)는 외부적 환경의 변화에 의해 급격히 일어나는 수동적 죽음으로 염색사의 다형태적 덩어리(irregular clumping) 및 세포질의 팽창(swelling of cytoplasm) 과정을 거치게 되고, 최종적으로 세포들의 분해를 통해 세포파편(cell debris)이 생성되며 이들은 염증을 유발하는 것으로 알려져 있다 (Earnshaw, W.C., Curr. Opin. Cell Biol., 7, pp 337-343, 1995).
따라서 국소 지방분해제제가 세포 괴사의 방식으로 작용하면, 해당 약물을 투여한 목적부위 이외의 주변 영역에도 염증작용이 영향을 미치기 때문에 정상적으로 기능하여야할 세포들에도 영향을 주어 죽게 된다. 이러한 사실을 종합하건데, 기존 국소 지방감소 주사제에서 나타나는 고통, 혈종, 부종, 무감각증, 홍반, 종창, 경화, 소양감, 결절 없이 투여 약물이 작용하는 부위에서의 세포들에만 지방분해와 세포자멸사(apoptosis)를 고효율로 유발시키는 것이 중요하다.
이에 본 발명자는 고통 및 혈종, 부종, 무감각증, 홍반, 종창, 경화, 소양감, 결절 등의 부작용이 없으면서도 국소 지방 감소능이 우수한 주사제를 개발하고자 연구하던 중, 기존의 국소지방분해 주사제에서 널리 사용되고 있는 데옥시콜린산이 지방세포의 괴사(necrosis)를 유발하는 방식으로 작용하는 것과는 달리 글리코콜린산 및 이의 염은 지방세포의 분해(lipolysis)와 사멸(apoptosis) 약리기전으로 지방세포를 감소시키며, 이에 따라 고통 및 부작용이 없이 뛰어난 지방분해 및 지방세포제거 효과를 가짐을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은, 포스파티딜콜린 비포함 국소지방 감소용 주사제 조성물에 있어서 상기 조성물은 글리코콜린산 또는 이의 염을 1(w/v)% 내지 6(w/v)% 포함하는 것을 특징으로 하는 고통 및 부작용이 없는 국소지방 감소용 주사제 조성물을 제공하는 것이다.
또한 포스파티딜콜린 비포함 국소지방 감소용 주사제 조성물에 있어서 상기 조성물은 글리코콜린산 또는 이의 염을 1(w/v)% 내지 6(w/v)% 로 구성되는 것을 특징으로 하는 고통 및 부작용이 없는 국소지방 감소용 주사제 조성물을 제공하는 것이다.
또한 포스파티딜콜린 비포함 국소지방 감소용 주사제 조성물에 있어서 상기 조성물은 글리코콜린산 또는 이의 염을 1(w/v)% 내지 6(w/v)%로 필수적으로 구성되는 것을 특징으로 하는 고통 및 부작용이 없는 국소지방 감소용 주사제 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 고통 및 부작용이 없는 국소지방 감소용 주사제 조성물을 제조하는 방법에 있어서 상기 조성물은 글리코콜린산(Glycocholic acid, GCA) 또는 이의 염을 1(w/v)% 내지 6(w/v)% 포함하되 포스파티딜콜린은 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 고통 및 부작용이 없는 국소지방 감소용 주사제 조성물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 고통 및 부작용이 없는 포스파티딜콜린 비포함 국소지방 감소용 주사제를 제조하기 위한 글리코콜린산 또는 이의 염을 1(w/v)% 내지 6(w/v)% 포함하는 조성물의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 글리코콜린산 또는 이의 염을 1(w/v)% 내지 6(w/v)% 포함하는 포스파티딜콜린 비포함 조성물의 유효량을 이를 필요로하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 고통 및 부작용이 없이 국소지방을 감소시키는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 포스파티딜콜린 비포함 국소지방 감소용 주사제 조성물에 있어서 상기 조성물은 글리코콜린산 또는 이의 염을 1(w/v)% 내지 6(w/v)% 포함하는 것을 특징으로 하는 고통 및 부작용이 없는 국소지방 감소용 주사제 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 포스파티딜콜린 비포함 국소지방 감소용 주사제 조성물에 있어서 상기 조성물은 글리코콜린산 또는 이의 염을 1(w/v)% 내지 6(w/v)% 로 구성되는 것을 특징으로 하는 고통 및 부작용이 없는 국소지방 감소용 주사제 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 포스파티딜콜린 비포함 국소지방 감소용 주사제 조성물에 있어서 상기 조성물은 글리코콜린산 또는 이의 염을 1(w/v)% 내지 6(w/v)% 로 필수적으로 구성되는 것을 특징으로 하는 고통 및 부작용이 없는 국소지방 감소용 주사제 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 고통 및 부작용이 없는 국소지방 감소용 주사제 조성물을 제조하는 방법에 있어서 상기 조성물은 글리코콜린산(Glycocholic acid, GCA) 또는 이의 염을 1(w/v)% 내지 6(w/v)% 포함하되, 포스파티딜콜린은 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 고통 및 부작용이 없는 국소지방 감소용 주사제 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 고통 및 부작용이 없는 포스파티딜콜린 비포함 국소지방 감소용 주사제를 제조하기 위한 글리코콜린산 또는 이의 염을 1(w/v)% 내지 6(w/v)% 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 글리코콜린산 또는 이의 염을 1(w/v)% 내지 6(w/v)% 포함하는 포스파티딜콜린 비포함 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 고통 및 부작용이 없이 국소지방을 감소시키는 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
용어
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해서 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 비록 본 명세서에 서술된 것과 유사하거나 또는 균등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 서술되어 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은, 하기 용어들 각각은 본 섹션에서 그와 관련된 의미를 갖는다.
관사 "a" 및 "an"은 상기 관사의 문법적 대상 중 하나 이상 (즉, 적어도 하나)을 나타내기 위해서 본 명세서에서 사용된다. 예를 들어, "요소 (an element)"는 하나의 요소 또는 그 이상의 요소를 의미한다.
양, 시간적 길이 등과 같은 측정 가능한 수치를 지칭하는 경우 본 명세서에서 사용된 바와 같은 "약 (about)"은, 하기 변이가 개시된 방법을 수행하기에 적절하기 때문에, 명시된 수치로부터 ± 20%, ± 10%, ± 5%, ± 1%, 또는 ± 0.1%의 변이를 포함하는 것을 의미한다.
질병 또는 장애의 증상의 심각도, 환자가 경험하는 그러한 증상의 빈도, 또는 양자 모두가 감소되는 경우, 질병 또는 장애는 "경감되어 (alleviated)" 있다.
본 발명에서 용어‘포스파티딜콜린(Phosphatidylcholine)’은 인지질로 IUPAC Name 1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphocholine으로 표시되는 화합물을 의미하며 본 명세서에서 PPC로 기재되다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "담즙산 (bile acid)"은 스테로이드산 (및/또는 그 카르복실산 음이온), 및 그 염을 포함하며, 동물 (예를 들어, 인간)의 담즙에서 발견되는 것으로서, ‘데옥시콜린산(Deoxycholic acid)’은 담즙염의 일종으로서, IUPAC Name (4R)-4-[(3R,5R,8R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-3,12- dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoic acid로 표시되는 화합물을 의미한다. 본 발명의 명세서에서 DCA로 기재된다.
‘글리코콜린산(Gycocholic acid)’는 담즙염의 일종으로서, IUPAC Name 2-[[(4R)-4-[(3R,5S,7R,8R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-3,7,12-trihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoyl]amino]acetic acid로 표시된 화합물을 의미한다. 본 명세서에서 GCA로 기재된다.
‘타우로콜린산(Taurocholic acid)’는 담즙염의 일종으로서, IUPAC Name 2-[[(4R)-4-[(3R,5S,7R,8R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-3,7,12-trihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoyl]amino]ethanesulfonic acid로 표시된 화합물을 의미한다. 본 명세서에서 TCA로 기재된다.
‘콜린산(Cholic acid)’는 담즙염의 일종으로서, IUPAC Name (4R)-4-[(3R,5S,7R,8R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-3,7,12-trihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoic acid로 표시된 화합물을 의미한다. 본 명세서에서 CA로 기재된다.
‘케노데옥시콜린산(Chenodeoxycholic acid)’는 담즙염의 일종으로서,IUPAC Name((4R)-4-[(3R,5S,7R,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-3,7-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoic acid로 표시된 화합물을 의미한다. 본 명세서에서 CDCA로 기재된다.
‘우루소데옥시콜린산(Ursodeoxycholic acid)’는 담즙염의 일종으로서,IUPAC Name (4R)-4-[(3R,5S,7S,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-3,7-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoic acid로 표시된 화합물을 의미한다. 본 명세서에서 UDCA로 기재된다.
‘글리코데옥시콜린산(Glycodeoxycholic acid)’는 담즙염의 일종으로서,IUPAC Name 2-[[(4R)-4-[(3R,8R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-3,12-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoyl]amino]acetic acid로 표시된 화합물을 의미한다. 본 명세서에서 GDCA로 기재된다.
‘타우로데옥시콜린산(Taurodeoxycholic acid)’는 담즙염의 일종으로서,IUPAC Name 2-[[(4R)-4-[(3R,5R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-3,12-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoyl]amino]ethanesulfonic acid로 표시된 화합물을 의미한다. 본 명세서에서 TDCA로 기재된다.
‘히오데옥시콜린산(Hyodeoxycholic acid)’는 담즙염의 일종으로서,IUPAC Name (4R)-4-[(3R,5R,6S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-3,6-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoic acid로 표시된 화합물을 의미한다. 본 명세서에서 HDCA로 기재된다.
‘리토콜린산(Lithocholic acid)’는 담즙염의 일종으로서,IUPAC Name (4R)-4-[(3R,5R,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-3-hydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoic acid로 표시된 화합물을 의미한다. 본 명세서에서 LCA로 기재된다.
‘타우로우루소데옥시콜린산(Tauroursodeoxycholic acid)’는 담즙염의 일종으로서,IUPAC Name 2-[[(4R)-4-[(3R,5S,7S,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-3,7-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoyl]amino]ethanesulfonic acid로 표시된 화합물을 의미한다. 본 명세서에서 TUDCA로 기재된다.
‘디히드로콜린산(Dehydrocholic acid)’는 담즙염의 일종으로서,IUPAC Name (4R)-4-[(5S,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-10,13-dimethyl-3,7,12-trioxo-1,2,4,5,6,8,9,11,14,15,16,17-dodecahydrocyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoic acid로 표시된 화합물을 의미한다. 본 명세서에서 DHCA로 기재된다.
용어 "환자 (patient)", "대상 (subject)", "개체 (individual)" 등은 본 명세서에서 서로 교환가능하게 사용 되며, 본 명세서에 기술된 방법에 순응할 수 있는 인 비트로 또는 인 시투든 임의의 동물, 또는 그 세포를 지칭 한다. 특정 비-제한적인 구현예들에서, 상기 환자, 대상 또는 개체는 인간이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "조성물 (composition)" 또는 "약제학적 조성물 (pharmaceutical composition)"은 본 발명의 적어도 하나의 화합물과 담체 (carriers), 안정화제, 희석제, 분산제, 현탁제, 농후제 (thickening agents), 및/또는 부형제 (excipients)와 같은 다른 화학 성분의 혼합물을 의미한다. 상기 약제학적 조성물은 상기 화합물의 유기체로의 투여를 촉진한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "유효량 (effective amount)", "약제학적으로 유효한 양 (pharmaceutically effective amount)" 및 "치료학적으로 유효한 양 (therapeutically effective amount)"은 비독성이지만 원하는 생물학적 결과를 제공하기에 충분한 양을 나타낸다. 상기 결과는 징후, 증상, 또는 질병의 원인의 감소 및/또는 경감, 또는 생물학적 시스템의 임의의 다른 원하는 변화 (alteration)일 수 있다. 임의의 개별적 사안에서 적당한 치료학적 양은 통상의 실험을 사용하여 통상의 기술자에 의해서 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "효능 (efficacy)"은 분석방법 내에서 달성되는 최대 효과 (Emax)를 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은, "지시적 물질 (instructional material)"은 본 명세서에 언급된 다양한 질병 또는 장애의 경감을 발휘하기 위한 키트 중에서 본 발명의 화합물, 조성물, 벡터, 또는 전달 시스템의 유용성을 전달하는데 사용될 수 있는 간행물, 기록 (recording), 다이어그램, 또는 임의의 다른 표현 매체를 포함한다. 선택적으로, 또는 대안으로서, 상기 지시적 물질은 포유류의 세포 또는 조직 내에서 질병 또는 장애의 경감에 대한 하나 이상의 방법을 서술할 수 있다. 본 발명의 상기 키트의 상기 지시적 물질은, 예를 들어, 본 발명의 상기 확인된 화합물, 조성물, 벡터, 또는 전달 시스템을 포함하는 용기에 부착될 수 있거나, 또는 상기 확인된 화합물, 조성물, 벡터, 또는 전달 시스템을 포함하는 용기와 함께 출하 (ship)될 수 있다.
대안적으로, 상기 지시적 물질은, 상기 지시적 물질 및 상기 화합물이 수용자에 의해서 협동적으로 사용되는 것을 의도로 상기 용기와는 별도로 출하될 수도 있다.
"국소적 투여 (local administration)"는 약제학적 성분을 비전신적 경로에 의해서 환자의 근육 또는 피하 위치 (subdermal location)에, 또는 그 주변에 투여하는 것을 의미한다. 따라서, 국소적 투여는 정맥 또는 구강 투여와 같은 전신적 경로를 통한 투여는 배제한다.
"약제학적으로 허용가능한 (pharmaceutically acceptable)"은, 조성, 제제, 안정성, 환자 수용성 및 생물이용가능성에 관하여 약리학적/독성학적 관점에서 및 물리적/화학적 관점에서 제조하는 약제학적 화학자에게 수용가능 한 특성 및/또는 물질을 나타낸다. "약제학적으로 허용가능한 담체"는 활성 성분(들)의 생물학적 활성의 유효성 (effectiveness)을 방해하지 않고 투여되는 호스트에 독성을 나타내지 않는 매체를 나타낸다.
"치료학적 (therapeutic)" 치료 (treatment)는 징후 또는 증상을 감소 또는 제거하기 위한 목적으로, 병리 징후 또는 증상을 나타내는 대상에게 투여되는 치료이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "치료 (treatment)" 또는 "치료하는 (treating)"은 본 명세서에서 고려 된 상태, 본 명세서에서 고려된 상태의 증상 또는 본 명세서에서 고려된 상태로 진전될 잠재성을 치료 (cure), 치유 (heal), 경감 (alleviate), 완화 (relieve), 변화 (alter), 구제 (remedy), 개선 (ameliorate), 향상 (improve) 또는 영향을 주기 위하여, 치료학적 작용제, 즉 본 발명의 화합물 (단독 또는 다른 약제학적 작용제와 조합으로)을 환자에게 적용 또는 투여하는 것으로 정의되거나, 또는 (예를 들어, 진단 또는 인비보 적용을 위해서) 환자로부터 분리된 조직 또는 세포주에 치료학적 작용제를 적용 또는 투여하는 것 (예를 들어, 진단 또는 인비보 적용을 위해서)으로 정의되고, 상기 본 명세서에서 고려된 상태, 본 명세서에서 고려된 상태의 증상(symptoms) 또는 본 명세서에서 고려된 상태로 진전될 잠재성을 갖고 있다. 상기 치료는 약리학 분야로부터 얻어진 지식에 기초하여 구체적으로 맞추어지거나 또는 변형될 수 있다.
"치료학적으로 유효한 양 (therapeutically effective amount)"은 환자에게 투여되는 경우, 질병의 증상을 개선하는 본 발명의 화합물의 양이다. "치료학적으로 유효한 양"을 구성하는 본 발명의 화합물의 양은 상기 화합 물, 질병 상태 및 그 심각성, 치료되는 환자의 연령 등에 따라서 변화될 수 있다. 치료학적으로 유효한 양은 자신의 지식 및 본 개시를 고려하여 당 분야에서 통상의 기술을 지닌 자에 의하여 통상적으로 결정될 수 있다.
범위: 본 개시 전반에 걸쳐서, 본 발명의 다양한 양상들이 범위 형식으로 제안될 수 있다. 범위 형식의 서술은 단순히 편의성 및 간략성을 위한 것이며, 본 발명의 범위에 대한 융통성 없는 제한 (inflexible limitation)으로서 해석되지 않아야 하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 범위의 서술은 상기 범위 내의 개별적인 수치값들뿐만 아니라 모든 가능한 하부범위 (subrange)를 구체적으로 개시한 것으로 고려되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 서술은 상기 범위 내의 개별적 수치들, 예를 들어, 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3, 및 6뿐만 아니라, 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같은 하부범위들을 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 이는 범위의 폭과 무관하게 적용된다.
본 발명에서 용어‘%’는 특별한 언급이 없는 한 w/v%의 함량을 의미한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 발명자는 DCA와 같은 기존 담즙산염 가용화제들이 지방세포와 섬유아 세포에 괴사(necrosis)를 일으키는 것으로 알려진 것과는 달리, 글리코콜린산은 1(w/v)% 내지 6(w/v)% 농도에서 지방분해(lipolysis)와 세포 사멸(apoptosis) 특이적 효과에 기여하는 것을 신규하게 규명하였다. 즉, 기존 DCA 포함 PPC 제제(PPC-DC 제제) 또는 DCA 단독 제제가 지방세포 및 주변의 다른 세포에 괴사(necrosis)를 야기하는 것과는 달리, 본 발명자들은 지방세포 괴사(necrosis) 없이 지방세포 분해(lipolysis)와 지방세포 사멸(apoptosis, 아포토시스)의 약리기전을 통해 안전하고 부작용 없이 고효율로 지방이 감소되는 신규한 GCA 단독 제제를 제작하였다. 이에 따라 글리코콜린산 또는 이의 염을 특정 농도로 포함하는 본원 발명의 국소지방 감소용 주사제 조성물은 지방분해(lipolysis) 효과가 우수하고, 약물이 투여된 해당 국소부위의 세포들에만 아포토시스(apoptosis)를 고효율로 유발하여 지방세포 제거 효과가 현저할 뿐만 아니라, 기존 국소 감소용 주사제 조성물에서 나타나는 혈종, 부종, 무감각증, 홍반, 종창, 경화, 소양감, 결절 등의 부작용과 고통을 현저히 경감하는 효과가 뛰어나다. 이는 환자의 고통, 불편함 그리고 불안감을 개선하여, 복약 순응도를 높이는 획기적인 발명이다.
구체적으로 본 발명은,
포스파티딜콜린 비포함 국소지방 감소용 주사제 조성물에 있어서 , 상기 조성물은 글리코콜린산 또는 이의 염을 1(w/v)% 내지 6(w/v)% 포함하는 것을 특징으로 하는 고통 및 부작용이 없는 국소지방 감소용 주사제 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은, 포스파티딜콜린 비포함 국소지방 감소용 주사제 조성물에 있어서, 상기 조성물은 글리코콜린산 또는 이의 염을 1(w/v)% 내지 6(w/v)% 로 구성되는 것을 특징으로 하는 고통 및 부작용이 없는 국소지방 감소용 주사제 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은, 포스파티딜콜린 비포함 국소지방 감소용 주사제 조성물에 있어서, 상기 조성물은 글리코콜린산 또는 이의 염을 1(w/v)% 내지 6(w/v)%로 필수적으로 구성되는 것을 특징으로 하는 고통 및 부작용이 없는 국소지방 감소용 주사제 조성물을 제공한다.
본 발명은 비수술적 방법, 즉 수술(예를 들어, 지방 흡입술 등)이 동반되지 않고 단독으로 사용되는 국소지방 감소용 주사제에 관한 것이다. 즉, 본 발명의 조성물은 외과적(수술) 처치를 수행하지 않고 포유동물에서 피하 지방 축적을 감소시키기 위한 목적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 조성물은 포스파티딜과 같은 인지질 비포함 조성물에 관한 것이다. 즉, 본 발명의 조성물은 포스파티딜콜린 뿐만 아니라, 인지절 성분을 포함하지 않는 조성물에 관한 것이다.
또한 본 발명의 조성물은 지질분해효소(lipase) 또는 지질분해보조효소(colipase)를 포함하지 않는 조성물일 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명의 조성물은 글리코콜리산 또는 이의 염을 1(w/v)%, 1.5(w/v)%, 2(w/v)%, 2.5(w/v)%, 3(w/v)%, 3.5(w/v)%, 4(w/v)%, 4.5(w/v)%, 5(w/v)%, 5.5(w/v)% 또는 6(w/v)%로 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 주사제 조성물은 국소적 부위에 적용할 수 있고, 그 부위가 이에 한정되지는 않지만, 바람직하게는 복부, 턱밑, 팔뚝, 허벅지, 허리, 엉덩이, 눈밑, 브라라인(brassiere line)에 침착된 지방 또는 지방종 부위 등에 적용할 수 있다.
본 발명의 국소지방 감소용 주사제 조성물은 지방조직 과증식 또는 과축적 장애(질환)의 치료용 약학적 조성물로서, 상기 장애는 당업계에 병리적으로 지방조직이 과증식 또는 과축적되는 것으로 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 비만(복부 비만 등), 하부 눈꺼풀 탈출, 지방종, 지방이영양증, 또는 셀룰라이트와 관련된 지방 축적증 등을 포함한다.
본 발명의 주사제 조성물의 투여 방법은 제한되지는 않지만, 질환의 심각도, 환자의 연령, 성별 및 기타 조건 등의 관점에서 환자에게 적합한 방법에 의해 투여될 수 있다. 이러한 경로로는 그 방법에 있어 특별히 제한되지는 않지만 피하주사, 피내주사 등이 바람직하다.
본 발명에서 상기 고통은 주사제 투여 시의 고통 또는/및 투여 후의 고통을 모두 포함한다. 본 발명은 기존에 시판되고 있는 포스파티딜콜린-데옥시콜린산 복합제제(PPC-DCA, 예를 들어 리포스타빌) 또는 데옥시콜린산(DCA) 단일제제(예를 들어 키벨라(Kybella))가 고통을 수반하는 것과는 달리, 상당히 고통이 경감된 것(실질적 무통)을 특징으로 한다. 이러한 무통증 국소지방감소용 주사제는 본원 발명에서 최초로 공개하는 것으로서, 특히 주사제 투여 후에 2차적으로 나타나는 염증, 경화 등의 이상반응(부작용)에 기인하는 고통뿐만 아니라 주사제 투여 시 및 투여 직후에 기존 주사제들의 자체 특성으로 나타나는 1차적인 고통에 대해서도 무통을 나타내는 것이 특징이다.
본 발명에서 상기 용어 부작용은 기존에 공지 또는 시판되어오고 있는 국소 지방 감소용 주사제인 포스파티딜콜린-데옥시콜린산 복합제제(PPC-DCA, 예를 들어 리포스타빌) 또는 데옥시콜린산(DCA) 단일제제(예를 들어 키벨라(Kybella))가 가지고 있는 부작용을 의미하는 것으로서, 약물이 치료효과를 기대하는 주작용( 본 발명에서는 목적하는 지방감소효과) 이외의 인체에 유해한 작용을 의미한다. 이에 제한되지 않으나 구체적으로 혈종, 부종, 무감각증, 홍반, 종창, 경화, 소양감, 결절 등으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 의미한다. 본 발명의 국소지방 감소용 주사제 조성물은 국소 이상반응이 경감된 것으로서 상기 부작용이 실질적으로 없다고 할 수 있을 정도로 경감된 것을 특징으로 한다.
주사제는 글리코콜린산 또는 이의 염과 필요한 경우 기타 첨가제를 주사용수에 용해하고 이 용액을 세균여과기로 여과하여 무균처리한 후 무균상태에서 바이알, 앰플, 또는 프리필드시린지에 충전한 후 밀봉하는 것으로, 주사제를 제조할 때에는 잔량을 채우기 위해, 물 이외에 주사용수를 사용할 수 있다. 주사용수는 고형주사제의 용해나 수용성 주사제를 희석하기 위하여 만들어진 주사용 증류수 또는 주사용 완충용액이라면 특별히 그 종류가 제한되지 않으나, 예를 들어 pH 3.5 내지 7.5 범위의 인산염 완충용액 또는 인산이수소나트륨(NaH 2PO 4)-구연산 완충용액 등을 사용할 수 있다. 이때 사용되는 인산염은 나트륨염 또는 칼륨염 형태이거나 무수물 또는 수화물 형태이어도 무방하고, 구연산 또는 무수물 또는 수화물 형태이어도 무방하다. 또한 주사용수의 일례로서, 글루코오스 주사액, 자일리톨 주사액, D-만니톨 주사액, 프룩토스 주사액, 생리식염수, 덱스트란 40 주사액, 덱스트란 70 주사액, 아미노산 주사액, 링거액, 락트산-링거액 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서 주사용수는 전술한 것이외 에도 주사제 제조분야에서 사용되는 통상의 수성 비히클(vehicle)을 모두 포함하는 의미로서 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 통상의 주사제에 사용되는 부형제 성분(예를 들어 소르비톨(sorbitol))을 추가적으로 포함하고 있는 수성 비히클도 포함하는 의미이다.
구체적으로 본 발명의 국소지방 감소용 조성물은‘글리코콜린산(Glycocholic acid) 또는 이의 염’을 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 글리코콜린산은 하기 <화학식 1> 의 구조를 지니는 담즙산으로서, 분자량 약 465.63g/mol이며 본 명세서에서 GCA 또는 GC로 기재될 수 있다. 상기 글리코콜린산은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기에서‘약학적으로 허용 가능한'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때 통상적으로 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말하며, 이에 한정되지 않으나 예를 들어 나트륨염, 칼륨염 또는 암모늄염일 수 있다. 바람직하게 본 발명의 글리코콜린산염은 하기 <화학식 2>로 표시되는 글리코콜린산 나트륨(Sodium glycocholate, GCNa)일 수 있다.
상기 글리코콜린산(Glycocholic acid) 또는 이의 염은 당업계에 공지된 방법에 따라 동물의 장에서 추출하여 사용할 수 있으며, 상업적으로 구입하여 사용하거나 또는 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조한 것을 사용할 수 있다.
<화학식 1>
Figure PCTKR2019001457-appb-img-000001
<화학식 2>
Figure PCTKR2019001457-appb-img-000002
본 발명의 국소지방 분해용 주사제 조성물에 있어서 상기 글리코콜린산은 전체 조성물을 기준으로 1.0% 내지 6.0%(w/v)를 포함하는 것을 특징으로 한다. 글리코콜린산의 농도가 1.0%(w/v) 미만이면, 지방 분해 효과가 없고, 7.0%(w/v)를 초과할 때는 고통, 부종 및 염증 등의 부작용이 심하게 발생할 수 있다.
본 발명의 국소지방 분해용 주사제 조성물은 pH 6.0 내지 pH 8.0를 갖는 것을 특징으로 하는 것으로, 바람직하게는 pH 7.0 내지 pH 7.8로 조절되는 것일 수 있다. pH 7.0 미만인 경우에는 통증면에서 좋지 못하고, pH 7.8 을 초과하는 경우에는 통증에서 좋지 못하다.
상기 글리코콜리산(GCA) 또는 이의 염을 포함하는 본 발명의 지방감소 주사제 조성물은 전술한 바와 같이 pH 7.0 내지 pH 7.8에서 제형안정성이 뛰어날 뿐만 아니라, 데옥시콜린산을 포함한 지방세포 용해 주사제가 세포의 괴사(necrosis)를 일으켜 체내 고통을 수반하고 혈종, 부종, 무감각증, 홍반, 종창, 경화, 소양감, 결절 등 부작용을 일으키는 것과는 달리, 1.0% 내지 6.0%(w/v) 농도에서 GCA는 고효율의 지방분해(lipolysis)와 지방세포 사멸(apoptosis, 아포토시스)의 상승작용을 유도하여 고통 및 상기 부작용이 실질적으로 없다고 할 정도로 경감시키고 지방감소에 있어서는 뛰어난 시너지 효과를 보이는 것이 특징이며(고통과 부종은 80% 이상 경감), 이에 따라 별도의 항-염증제 또는/및 진통제 성분이 조성물 내에 필수적으로 포함되거나 병용될 필요성이 없는 것 또한 특장점이다. 따라서 본 발명의 조성물은 항-염증제 및 진통제가 포함되지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.
한편 상기 본 발명의 조성물은, 전체 조성물을 기준으로 0.1(w/v)% 내지 5(w/v)%의 보존제, 0.1(w/v)% 내지 10(w/v)%의 등장화제 및 0.1(w/v)% 내지 5(w/v)%의 pH조절제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 물질을 추가로 포함할 수 있다.
상기 보존제는 이에 한정하지는 않지만, 벤질알코올(benzyl alcohol), 티메로살(Thimerosal), 염화벤잘코늄(Benzalkonium chloride), 페닐질산수은(phenyl mercury nitrate) 및 클로로부탄올(Chlorobutanol)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 것일 수 있다. 더욱 바람직하게는 벤질알코올 일 수 있다. 상기 벤질알코올은 방향족 알코올류 중의 하나로 무색투명한 액체이다. 본 발명의 주사제 조성물에 포함되는 벤질알코올의 농도는 바람직하게는 0.1(w/v)% 내지 2(w/v)%일 수 있다.
상기 등장화제는 본 발명의 조성물을 체내에 투여할 때에 삼투압을 적절하게 유지(조절)하는 역할을 하며, GCA를 용액상에서 더욱 안정화시키는 부수적인 효과도 나타낼 수 있다. 등장화제는 약학적으로 허용되는 당, 염 또는 이의 임의의 조합 또는 혼합물 일 수 있으며, 그 예로는 당으로 글루코오스, 또는 수용성 무기염으로 염화나트륨, 염화칼슘, 황산나트륨, 글리세린, 프로필렌글리콜(propylene glycol), 분자량 1000 이하의 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol) 등 일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 염화나트륨일 수 있다. 이들은 하나 또는 둘 이상의 조합 형태로 사용될 수 있다. 상기 등장화제의 농도는 바람직하게는 0.1(w/v)% 내지 5(w/v)%이며, 본 발명의 조성물에 포함된 성분들의 종류, 량 등에 따라 각각의 혼합물이 모두 포함된 용액 제형이 등장액이 되도록 적절한 함량으로 조절될 수 있다.
본 발명의 pH 조절제는 주사제의 pH를 조절하는 역할을 하며, 산성 물질, 염기성 물질을 모두 포함한다. 상기 산성 물질에는 염산, 초산, 아디프산, 아스코르빈산, 아스코르빈산 나트륨, 에테르산 나트륨, 사과산, 숙신산, 주석산, 푸마르산, 구연산(시트르산) 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 상기 염기성 물질에는 무기 염기(예를 들어, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 탄산나트륨, 탄산수소나트륨, 탄산마그네슘, 탄산칼슘, 산화마그네슘, 암모니아, 합성 히드로탈사이트), 유기 염기 (예를 들어, 염기성 아미노산(예컨대, 리신, 아르기닌 등, 메글루민 등)) 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 더욱 바람직하게는 본 발명의 pH 조절제는 수산화나트륨 또는 염산일 수 있다. 첨가되는 pH 조절제의 양은 본 발명 조성물을 구성하는 성분들의 종류 및 양에 따라 달라질 수 있으며, 바람직하게는 0.1(w/v)%) 내지 3(w/v)%일 수 있다. 전술한 바와 같이 본 발명의 조성물은 바람직하게 pH 7.0 내지 pH 7.8의 범위로 제공되는 것일 수 있으며, 이에 따른 pH 조절제의 종류 및 첨가량은 용액의 구체적 조성에 따라 당업자가 조건을 변경할 수 있다.
바람직한 양태로서, 본 발명의 국소지방 감소용 주사제 조성물은
글리코콜린산 또는 이의 염 1(w/v)% 내지 6(w/v)%;
보존제, 등장화제 및 pH 조절제로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 것 0.1(w/v)% 내지 20(w/v)%; 및
잔량의 주사용수(물)로 이루어지는 것일 수 있으며, 상기 조성물의 구체적 성분의 종류 및 조성 비율에 대해서는 전술한 바를 참조할 수 있다.
본 발명 주사제 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 표적부위의 지방의 양, 표적부위의 위치, 지방 조성의 형태 및 원하는 결과 등에 따라 투여량을 달리할 수 있다. 예를 들면, 표적부위에 주사기를 사용하는 피하 주사를 통하여 경피적으로 또는 피하적으로 투여된다. 표적 부위는 예를 들면 0.1 cm x 0.1 cm 내지 5 cm x 5 cm의 넓이가 될 수 있다. 바람직하게 본 발명의 조성물의 바람직한 전체 용량은 1 cm 2당 0.1ml 내지 1.0 ml, 가장 바람직하게는 1 cm 2 당 0.2ml 내지 0.5ml일 수 있다. 그러나 상기 주사제 조성물의 용량은 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 조성물을 치료제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다.
또한 본 발명은 고통 및 부작용이 없는 국소지방 감소용 주사제 조성물을 제조하는 방법에 있어서,
상기 조성물은 글리코콜린산 ( Glycocholic acid, GCA ) 또는 이의 염을 1(w/v)% 내지 6(w/v)% 포함하되 포스파티딜콜린은 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 고통 및 부작용이 없는 국소지방 감소용 주사제 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 제조방법은 전술한 본 발명의 고통 및 부작용이 없는 국소지방 감소용 주사제 조성물의 조성에 따라, 당업계에서 통상적으로 사용되는 혼합, 교반 및 여과 등의 방법에 따라 제조되는 것일 수 있다. 상기 조성물의 구체적 성분의 종류 및 조성 비율에 대해서는 전술한 바를 참조로 한다.
바람직한 양태로서, 본 발명은
(a) 전체 조성물을 기준으로 글리코콜린산 ( Glycocholic acid) 또는 이의 염이 1(w/v)% 내지 6(w/v)%가 되도록 주사용수에 넣고 투명하게 용해 될 때까지 교반하는 단계;
(b) 상기 (a)단계에서 교반한 혼합물에 등장화제 및 보존제 0.1(w/v)% 내지 15(w/v)%를 투입하고 교반하는 단계; 및
(c) pH 조절 후 물(주사용수)로 총 부피를 맞추고 교반하는 단계를 포함하되, 포스파티딜콜린은 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 고통 및 부작용이 없는 국소지방 감소용 주사제 조성물의 제조방법을 제공한다.
상기 본 발명의 국소지방 감소용 주사제 조성물의 제조방법을 이하에서 단계별로 설명한다.
(a) 단계에서는 주사용수에 글리코콜린산(Glycocholic acid) 또는 이의 염을 투입하여 용액이 실질적으로 투명한 상태가 될 때까지 교반한다. 이때 글리코콜린산 또는 이의 염은 전체 조성물을 기준으로 1.0% 내지 6.0 %(w/v)를 포함되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 교반 또는 혼합은 공지의 교반 수단(교반기)에 의한 것일 수 있으며, 투입되는 물질의 종류 또는 특성에 따라 당업자가 작업 효율을 높이기 위해 온도, 압력, 시간 또는/ 및 회전 속도 등의 조건을 달리할 수 있다.
상기 (a) 단계에서는 추가적으로 pH 조절제의 투여가 수행될 수 있으며, 바람직하게 글리코콜린산 또는 이의 염 투입 전에 선행되는 것일 수 있다. pH의 조절은 0.1(w/v)% 내지 5(w/v)%로 pH조절제 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 넣고 교반하는 것에 의하여 수행될 수 있다. 본 발명에서 이용될 수 있는 구체적 pH 조절제의 종류 및 이들의 포함량 등에 대해서는 전술한 바와 같다.
(b)단계에서는 전체 조성물을 기준으로 0.1(w/v)% 내지 5(w/v)%의 보존제 및 0.1(w/v)% 내지 10(w/v)%의 등장화제를 넣고 교반한다. 상기 보존제 및 등장화제의 구체적 성분 및 농도는 상기 조성물에 관한 설명에서 전술한 바와 같다.
(c) 단계에서는 pH 조절 후 물로 총 부피를 맞추고 균질하게 혼합한다.
pH의 조절은 0.1(w/v)% 내지 5(w/v)%로 pH조절제 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 추가로 넣고 교반하는 것에 의하여 수행될 수 있다. 본 발명에서 이용될 수 있는 구체적 pH 조절제의 종류 및 이들의 포함량 등에 대해서는 전술한 바와 같다.
상기 물은 주사용수로 대체될 수 있으며, 이에 대해서는 전술한 바와 같다. 또한 본 단계에서 주사제 처방의 유통에 따른 제품 안정성을 확보하기 위하여 주사제로 사용 가능한 산수용액 또는 염산 및 인산염 등의 완충용액(pH 조절제)을 사용하여 pH를 조절함으로써 물리적으로나 화학적으로 매우 안정한 주사제로 제조될 수 있다.
또한 본 발명은 고통 및 부작용이 없는 포스파티딜콜린 비포함 국소지방 감소용 주사제를 제조하기 위한 글리코콜린산 또는 이의 염을 1(w/v)% 내지 6(w/v)% 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명은 글리코콜린산 또는 이의 염을 1(w/v)% 내지 6(w/v)% 포함하는 포스파티딜콜린 비포함 조성물의 유효량을 이를 필요로하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 고통 및 부작용이 없이 국소지방을 감소시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 ‘유효량’이란 개체에게 투여하였을 때, 국소 지방 축적의 개선, 예방, 검출, 진단 또는 국소 지방 축적의 억제 또는 감소 효과를 나타내는 양을 말하며, 상기 ‘개체’란 동물, 바람직하게는 포유동물, 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며, 동물에서 유래한 세포, 조직, 기관 등일 수도 있다. 상기 개체는 상기 효과가 필요한 환자(patient) 일 수 있다.
본 발명의 용어 ‘~을 포함하는(comprising)’이란 ‘함유하는’ 또는 ‘특징으로 하는’과 동일하게 사용되며, 조성물 또는 방법에 있어서, 언급되지 않은 추가적인 성분 요소 또는 방법 단계 등을 배제하지 않는다. 용어 ‘~로 구성되는(consisting of)’이란 별도로 기재되지 않은 추가적인 요소, 단계 또는 성분 등을 제외하는 것을 의미한다. 용어 ‘필수적으로 구성되는(consisting essentially of)’이란 조성물 또는 방법의 범위에 있어서, 기재된 성분 요소 또는 단계와 더불어 이의 기본적인 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 성분 요소 또는 단계 등을 포함하는 것을 의미한다.
본 발명은 지방세포 세포사멸(apoptosis) 유도의 특이적 방식으로 작용하도록 제작된 국소지방감소용 제제에 관한 것으로서, DCA를 단독으로 포함하는 키벨라와 같은 제제 및 리포스타빌과 같이 기존에 DCA를 포함하고 있는 PPC 제제들에서 야기되는 지방세포 괴사(necrosis) 없이 지방세포의 지방분해(lipolysis)와 지방세포 사멸(apoptosis) 특이적 효과가 우수하다. 이에 따라 고통, 혈종, 부종, 무감각증, 홍반, 종창, 경화, 소양감, 결절 등의 부작용이 없이 지방세포가 감소되는 효과가 우수하다.
도 1은 DCA 1.0% 단독 제제 및 DCA 2.2%로 가용화한 PPC 5.0%제제와, GCA 농도별 단독 제제(GCA 0.5%, GCA 1.0%, GCA 3.0%, GCA 4.5% GCA 6.0%, GCA 7.5%, GCA 9.0%)에 대한 지방세포 생존도를 비교한 결과를 나타낸다.
도 2는 DCA 1.0% 단독 제제 및 DCA 2.2%로 가용화한 PPC 5.0% 제제와, GCA 농도별 단독 제제(GCA 1.0%, GCA 3.0%, GCA 6.0%, GCA 9.0%)에 대한 지방세포 사멸(apoptosis) 유발 특이성을 Caspase 3 activity assay를 통해 비교한 결과를 나타낸다.
도 3은 DCA 1.0% 단독 제제 및 DCA 2.2%로 가용화한 PPC 5.0% 제제와, GCA 농도별 단독 제제(GCA 1.0%, GCA 3.0%, GCA 6.0%, GCA 9.0%)에 대한 지방분해(lipolysis) 유발 특이성을 Glycerol release를 통해 비교한 결과를 나타낸다.
도 4는 DCA 1.0% 단독 제제 및 DCA 2.2%로 가용화한 PPC 5.0% 제제와, GCA 농도별 단독 제제(GCA 1.0%, GCA 3.0%, GCA 6.0%, GCA 9.0%)에 대한 염증 유발 정도를 TNF ELISA 방법으로 측정한 결과를 나타낸다.
도 5는 DCA 1.0% 단독 제제 및 DCA 2.2%로 가용화한 PPC 5.0% 제제와, GCA 농도별 단독 제제(GCA 1.0%, GCA 3.0%, GCA 6.0%, GCA 9.0%)에 대한 섬유아세포 생존도를 비교한 결과를 나타낸다.
도 6은 DCA 1.0% 단독 제제 및 DCA 2.2%로 가용화한 PPC 5.0% 제제와 GCA 농도별 단독 제제(GCA 1.0%, GCA 3.0%, GCA 6.0%, GCA 9.0%)에 대한 근육세포 생존도를 비교한 결과를 나타낸다.
도 7은 DCA 1.0% 단독 제제 및 DCA 2.2%로 가용화한 PPC 5.0% 제제와, GCA 농도별 단독 제제(GCA 1.0%, GCA 3.0%, GCA 6.0%, GCA 9.0%)에 대한 혈관내피세포 생존도을 비교한 결과를 나타낸다.
도 8a 내지 도 8k는 랫트 족부에 각각의 농도별 담즙산을 주사하여 시간 경과에 따른 부종의 정도를 발바닥 두께 측정을 통해 비교한 결과를 나타낸다.
도 8a는 농도별 DCA 단독 조성 주사제(1.0~7.5%), 도 8b는 농도별 CA 단독 조성 주사제(1.0~7.5%), 도 8c는 농도별 TCA 단독 조성 주사제(1.0~7.5%), 도 8d는 농도별 CDCA 단독 조성 주사제(1.0~7.5%), 도 8e는 농도별 UDCA 단독 조성 주사제(1.0~7.5%), 도 8f는 농도별 GDCA 단독 조성 주사제(1.0~7.5%), 도 8g는 농도별 TDCA 단독 조성 주사제(1.0~7.5%), 도 8h는 농도별 HDCA 단독 조성 주사제(1.0~7.5%), 도 8i는 농도별 TUDCA 단독 조성 주사제(1.0~7.5%), 도 8j는 농도별 DHCA 단독 조성 주사제(1.0~7.5%), 도 8k는 여러 종류의 담즙산(BA)들을 단독으로 각각 2.5%씩 함유하는 주사제들을 랫트 족부에 투여하고, 3시간 후에 부종을 측정하여 비교한 그래프이다(대조군으로 PBS를 사용).
도 9는 랫트 발바닥에 DCA 1.0% 단독 제제 및 DCA 2.2%로 가용화한 PPC 5.0% 제제와, GCA 농도별 단독 제제 (GCA 1.0%, GCA 3.0%, GCA 6.0%, GCA 9.0%)를 주사하여, 시간에 따른 조직병변의 정도를 비교한 이미지를 나타낸다(3회 반복 실험).
도 10a 내지 도 10f는 쥐의 발바닥에 DCA 1.0%(도 10a)제제와 GCA 1.0%(도 10b), GCA 2.5%(도 10c), GCA 5.0%(도 10d), GCA 10.0%(도 10e)제제를 각각 주사하고 3시간 후, 발바닥 조직을 H&E staining하여 염증 및 부종의 상태를 조직학적으로 비교한 결과를 보여준다. 도 10f는 각 실험군을 종합적으로 비교한 결과를 나타낸다(3회 반복 실험).
도 11은 고지방식이로 유도된 비만 마우스 서혜부 지방 패드에 각 시험물질(DCA 단독 제제 및 GCA 단독 제제들)을 1회 투여하고, 8일 후에 피하지방조직을 H&E 염색하여 지방세포의 감소 정도를 조직학적으로 비교한 결과를 나타낸다.
도 12는 실험약물 중 부종과 염증 그리고 조직병변이 없거나 낮은 답습염인 농도별 DHCA, TUDCA, GCA, TCA에 대한 지방세포 생존도를 비교한 결과를 나타낸다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
하기와 같이 본원 발명의 조성물(제조예)과 비교 조성물들(비교예)을 제조하였다.
제조예 : GCA 단독 제제
글리코콜린산(GCA) 단독 제제는 1mL 중 글리코콜린산을 각각 5mg(0.5%, 비교제조예), 10mg(1%, 제조예 1), 15mg(1.5%, 제조예 2), 30mg(3.0%, 제조예 3), 45mg(4.5%, 제조예 4), 60mg(6.0%, 제조예 5), 75mg(7.5%, 제조예 6) 또는 90mg(9.0%, 제조예 7)를 투입하여 여러 가지 실험군을 제조하였고, 나머지 물질 조성은 벤질알코올 9mg, 염화나트륨 2.2mg, 잔량의 물을 조성으로 하여 제조하였다. 구체적인 제조과정은 다음과 같다. 멸균된 조제탱크에 주사용수(대한약품공업주식회사) 1리터를 질소치환 후, 500mL을 밀봉된 SUS 저장통에 이송하고, 500mL의 주사용수에 수산화나트륨 용액을 투입 및 교반, 글리코콜린산을 투입 및 교반, 염화나트륨과 벤질알코올 투입 및 교반하였다. 교반 후 저장통의 나머지 주사용수를 투입하여 총 1리터로 부피를 맞추고, 염산과 수산화나트륨을 투입하여 pH 7.2로 조절했다. 상기 교반과정은 차광, 밀폐, 섭씨 25도의 조건에서, 200 RPM의 교반속도로 총 3시간 동안 교반되었다. 최종 혼합물은 0.2 μm필터로 여과 후, 바이알(vial)에 충진 및 밀봉하였다. 제조에 투입된 물질은 글리코콜린산(Glycocholic acid, New zealand pharm) 또는 글리코콜린산 나트륨 (Sodium Glycocholate, New zealand pharm), 벤질알코올(Sigma-Aldrich), 염화나트륨(Sigma-Aldrich), 수산화나트륨(Sigma-Aldrich), 염산(Sigma-Aldrich)이다.
비교예: 답즙산(BA) 단독 제제
답즙염 단독 제제는 1mL 중 각각의 답즙염 10mg(1%), 25mg(2.5%), 50mg(5.0%), 75mg(7.5%) 투입하여 실험군을 제조하였고, 나머지 물질 조성은 벤질알코올 9mg, 염화나트륨 2.2mg, 잔량의 물을 조성으로 하여 제조하였다. 구체적인 제조과정은 다음과 같다. 멸균된 조제탱크에 주사용수(대한약품공업주식회사) 1리터를 질소치환 후 500mL을 밀봉된 SUS 저장통에 이송하고, 500mL의 주사용수에 수산화나트륨 용액을 투입 및 교반, 각각의 담즙염을 투입 및 교반, 염화나트륨과 벤질알코올 투입 및 교반하였다. 교반 후 저장통의 나머지 주사용수를 투입하여 1리터로 부피를 맞추고, 염산과 수산화나트륨을 투입하여 pH 8.4로 조절했다. 상기 교반과정은 차광, 밀폐, 섭씨 25도의 조건에서, 200 RPM의 교반속도로 총 3시간 동안 교반되었다. 최종 혼합물은 0.2μm필터로 여과 후 바이알에 충진 및 밀봉하였다. 제조에 투입된 물질은 콜린산(Glycocholic acid, CA, New zealand pharm), 데옥시콜린산(Deoxycholic acid, DCA, Sigma-Aldrich), 소디움 데옥시콜린산(Sodium Deoxycholate, DCNa, New zealand phram), 글리코콜린산(Glycocholic acid, GCA, New zealand phram), 소디움 글리코콜린산 (Sodium Glycocholate, GCNa, New zealand phram), 타우로콜린산(Taurocholic acid, TCA, Sigma-Aldrich), 소디움 타우로콜린산(Sodium Taurocholate, TCNa, New zealand phram), 케노데옥시콜린산(Chenodeoxycholic acid, CDCA, Sigma-Aldrich), 우르소데속시콜린산(Ursodeoxycholic acid, UDCA, Sigma-Aldrich), 글리코데옥시콜린산(Glycodeoxycholic acid, GDCA, Sigma-Aldrich), 타우로데옥시콜린산(Taurodeoxycholic acid, TDCA, Sigma-Aldrich), 히오데옥시콜린산(Hyodeoxycholic acid, HDCA, Sigma-Aldrich), 리토콜린산(Lithocholic acid, LCA, Sigma-Aldrich), 디하이드로콜린산(Dehydrocholic acid, DHCA, Sigma-Aldrich), 타우로우루소데속시콜린산(Tauroursodeoxycholic acid, TUDCA, Tokyo Chemical Industry),벤질알코올(Sigma-Aldrich), 염화나트륨(Sigma-Aldrich), 수산화나트륨(Sigma-Aldrich), 염산(Sigma-Aldrich), 주사용수(대한약품공업주식회사)이다.
실험예 1. GCA 단독 제제 in vitro 지방세포용해 효과 및 사멸과 분해 비교
실험예 1-1. 지방세포에 대한 아포토시스 ( apoptosis ) 유발 효과 및 지방분해( lipolysis ) 효과 비교
1) MTT assay
MTT assay를 통하여, 본 발명의 제조예 조성물과 비교예 조성물의 adipocyte death 효과를 비교하였다. 본 발명의 GCA 단독 제제로서 GCA 0.5%, GCA 1.0%, GCA 1.5%, GCA 3.0%, GCA 4.5%, GCA 6.0%, GCA 7.5%, GCA 9.0% 등을 사용하였으며, 대조군으로서 DCA 1.0% 단독 및 DCA 2.2%로 가용화한 PPC 5.0%를 대표로 하여 실험하였다(도 1 참조). 또한 TUDCA 2.5%, TUDCA 5.0%, TUDCA 7.5%, TCA 2.5%, TCA 5.0%, TCA 7.5%에 대해서도 같은 방법으로 비교 실험을 진행하였다(도 12 참조). 구체적인 실험방법은 다음과 같다. 3T3-L1 지방세포를 세포 충만도(confluence) 70~75%로 배양하였다. 상기 세포에 제조예 및 비교예의 실험물질을 각각 100μl 처리하여, 섭씨 37도에서 0~48시간 동안 배양하였다. 상기 세포를 PBS로 2회 세척 후 MTT reagent(50 ul) 처리 후, 37℃에서 2시간 동안 방치하였다. 상층액을 제거한 후, DMSO를 처리하여 MTT formazan crystal들을 녹인 후, microplate reader를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 1에서 보는 바와 같이, GCA 0.5%를 제외한 GCA 단독 제제와 DCA 단독 제제, 그리고 DCA로 가용화한 PPC 실험군에서 각 실험물질 농도 의존적으로 지방세포 용해가 관찰되었다. 그러나 도 12에서 TUDCA 실험군 및 TCA 실험군은 지방세포 용해에 영향을 미치지 않음을 확인하였다.
2) Caspase 3 activity assay
상기 MTT assay에서 나타난 세포의 죽음이 세포괴사(necrosis)에 의한 것인지 아포토시스(apoptosis)에 의한 것인지 확인하기 위하여, 본 발명의 제조예 조성물과 비교예 조성물을 대상으로 Caspase 3 activity assay를 수행하였다. Caspase 3은 세포사멸(Apoptosis)이 발생되었을 때 특이적으로 증가한다. 본 발명의 GCA 제제 중‘GCA 1.0%, GCA 3%, GCA 6.0%, GCA 9.0%’와 대조군 DCA 1.0% 및 DCA 2.2%로 가용화한 PPC 5.0%를 대표로 하여 실험하였다. Abcam의 Caspase 3 Assay Kit (Colorimetric) Kit를 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 실험하였으며, 간략하게 실험방법은 다음과 같다: 각 well에 3T3-L1 지방세포를 1X10 5개씩 분주하고, 제조예 및 비교예의 실험물질을 각각 100μl 처리하여, 섭씨 37도씨에서 0~48시간 동안 배양하였다. 그 후 50 ul의 cell lysis buffer (10mm Tris-HCl, 10 mm NaH2PO4/NaHPO4, pH 7.5, 130 mm NaCl, 1% Triton X-100, and 10 mm sodium pyrophosphate)를 처리하여 4℃에서 10분간 방치하였다. 1분간 1000 X rpm으로 원심분리하여 상층액을 모은 후, BCA 방법으로 단백질 정량을 실시하였다. 각 샘플에 50ul의 reaction buffer(4 mM HEPES, pH 7.5, 10% glycerol, 2 mm dithiothreitol) 및 0.5 ul의 4 mM DEVD-p-NA를 첨가한 후, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 Spectrofluorometry으로 405nm 파장에서 측정하였다.
실험 결과 도 2에서 보는 바와 같이, DCA 단독 제제 처리군을 제외한 모든 군에서 Caspase 3 activity가 증가되었다. 이로서 DCA 단독 제제를 제외한 다른 약물 들은 각 약물의 농도 의존적으로 Apoptosis를 유발시킨 것을 확인하였다. DCA 단독 제제 처리군에서는 GCA 단독 제제 처리군과 비교하여, 48시간 후부터 Caspase 3 activity가 급격히 감소하는 양상을 나타내었다. 이러한 것으로 보아 DCA 단독 제제에 의한 세포 죽음은 괴사(necrosis)에 의한 것임을 알 수 있었으며(도 2), 이는 기존에 보고된 것과 일치하였다. 이러한 결과는 또한 DCA+PPC 제제에서 나타나는 Apoptosis효과가 DCA가 아닌 PPC에 의한 효과임을 시사하는 것이다.
3) Lipolysis assay
Lipolysis assay를 통하여, 본 발명의 상기 제조예의 조성물과 비교예 조성물의 지방분해 효과를 비교하였다. 본 발명의 GCA 단독 제제 중‘GCA 1.0%, GCA 3.0%, GCA 6.0%, GCA 9.0%’와 대조군 DCA 1.0% 단독 및 DCA 2.2%로 가용화한 PPC 5.0%를 대표로 하여 실험하였다. Abcam 의 Lipolysis Assay Kit (Colorimetric)를 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 실험하였으며, 간략하게 실험방법은 다음과 같다: 각 well에 3T3-L1 지방세포를 1X10 5개씩 분주하고, 제조예 및 비교예의 실험물질을 각각 100μl처리하여, 섭씨 37도에서 0~48시간 동안 배양하여 Lipolysis를 유도하였다. 상기 배양액 30 ul에 Lipolysis Assay Buffer(137 mM NaCl, 5 mM KCl, 4.2 mM NaHCO 3, 1.3 mM CaCl 2, 0.5 mM KH 2PO 4, 0.5 mM MgCl 2, 0.5 mM MgSO 4, 5 mM Glucose, 20 mM Hepes (pH 7.4), 1％ BSA, 1 μM Isoproterenol)를 첨가하여 총 50 ul로 맞추어 20분 동안 인큐베이션하였다. 여기에 Glycerol Assay complex (50 ul)를 혼합한 후, 상온에서 30분간 방치 후 OD570에서 흡광도를 측정하였다(절대 정량 시 standard curve 활용).
실험결과 도 3에서 보는 바와 같이, DCA 단독 제제 처리군을 제외한 모든 군에서 glycerol release가 2배 이상으로 증가되었다. DCA 단독 제제 처리군에서도 Lipolysis가 유발되었으나, 동일 농도인 DCA 1% 및 GCA 1% 처리군만 비교하여 보아도 DCA의 지방분해 효과는 매우 저조하였다. GCA 처리군의 경우 GCA 함량 의존적으로 glycerol release가 증가되는 양상을 보였다. 이러한 결과는 또한 DCA+PPC 제제에서 나타나는 지방분해효과가 DCA 보다는 PPC에 의존하는 효과임을 시사하는 것이다.
실험예 1-2. 염증반응 평가
TNF ELISA 방법을 이용하여, 본 발명의 상기 제조예의 조성물과 비교예 조성물의 염증효과를 비교하였다. 본 발명의 GCA 단독 제제 중‘GCA 1.0%, GCA 3.0%, GCA 6.0%, GCA 9.0%’와, 대조군 DCA 1.0% 단독 및 DCA 2.2%로 가용화한 PPC 5.0%를 대표로 하여 실험하였다. R&D systems 의 Mouse TNF-alpha Quantikine ELISA Kit를 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 실험하였으며, 간략하게 실험방법은 다음과 같다: 각 well에 3T3-L1 지방세포를 1X10 5개씩 분주하고 제조예 및 비교예의 실험물질을 각각 100μl처리하여, 0~48시간, 37도 동안 배양하였다. 상기 세포배양액 30 ul를 kit에 포함된 TNF alpha antibody pre-bound culture plate와 4℃에서 밤새 반응시켰다. Washing buffer로 3차례 세척한 후 2차 항체(1:500)로 상온에서 1시간 반응시켰다. 다시 washing buffer로 3차례 세척한 후 발색(substrate 반응)반응을 시켰다. 반응을 정지시킨 후 빠르게 OD570에서 측정하였다(절대 정량 시 standard curve 활용).
상기 실험결과를 도 4에서 보여준다. DCA 1% 단독 제제 처리군과 DCA로 가용화한 PPC군은 다른 실험군과 비교하여 TNF alpha가 매우 강하게 증가하는 것을 확인하였으며, 특히 GCA 9% 처리군과 비교하여도 DCA 1% 처리군은 높은 TNF-α 분비가 관찰되었다.
실험예1-3. 섬유아세포, 근육세포, 혈관내피세포 용해 효과 비교
1) 섬유아세포(CCD-986sk; human fibroblast)
MTT assay를 통하여, 본 발명의 제조예 조성물과 비교예 조성물의 섬유아세포 생존도 효과를 비교하였다. 본 발명의 GCA 단독 제제 중‘GCA 1.0%, GCA 3.0%, GCA 6.0%, GCA 9.0%’와, 대조군 DCA 1.0% 단독 및 DCA 2.2%로 가용화한 PPC 5.0%를 대표로 하여 실험하였다. 구체적인 실험방법은 다음과 같다: 섬유아세포(CCD-986sk; human fibroblast)를 세포 충만도(confluence) 85%로 배양 후 배양배지(IMDM, 10%FBS, 1% anitibiotics mix)를 제거한다. 상기 세포에 제조예 및 비교예의 실험물질을 각각 100μl을 새로운 배양배지에 혼합 및 처리하여, 정해진 처리시간에 맞추어 배양배지를 제거하고 MTT assay(570nm에서 측정)를 시행한다.
상기 시험결과를 도 5에서 보여준다. DCA로 가용화한 PPC 제제와 DCA 단독 제제 및 GCA 9.0% 단독 제제는 섬유아세포 용해효력이 높다. 반면, GCA 1% 내지 6%단독 제제 실험군은 섬유아세포 용해력이 상당히 낮아 지방세포만 선택적으로 감소시켜, 인체 적용 시 국소 이상반응이 급격히 낮아진다.
2) 근육세포(C2C12; mouse myocyte)
MTT assay를 통하여, 본 발명의 제조예 조성물과 비교예 조성물의 근육세포 생존도 효과를 비교하였다. 본 발명의 GCA 단독 제제 중‘GCA 1.0%, GCA 3.0%, GCA 6.0%, GCA 9.0%’와 대조군 DCA 1.0% 단독 제제 및 DCA 2.2%로 가용화한 PPC 5.0%를 대표로 하여 실험하였다. 구체적인 실험방법은 다음과 같다: 근육세포(C2C12; mouse myocyte)를 세포 충만도(confluence) 80%로 배양 후 배양배지(DMEM, 10%FBS, 1% anitibiotics mix)를 제거한다. 2%의 horse serum이 포함된 DMEM으로 4일간 배양한다. 80% 이상의 세포의 길쭉한 모양을 확인하고, 상기 세포에 제조예 및 비교예의 실험물질을 각각 100μl을 새로운 배양배지에 혼합 및 처리하여, 정해진 처리시간에 맞추어 배양배지를 제거하고 MTT assay(570nm에서 측정)를 시행한다.
상기 실험결과를 도 6에서 보여준다. DCA로 가용화한 PPC 제제와 DCA 단독 제제 및 GCA 9.0% 단독 제제는 근육세포 용해효력이 높은데 반면, GCA 1% 내지 6% 단독 제제 실험군은 근육세포 용해력이 상당히 낮아 지방세포만 선택적으로 감소시켜, 인체 적용 시 국소 이상반응이 급격히 낮아진다.
3) 혈관내피세포(HUVEC; human endothelium)
MTT assay를 통하여, 본 발명의 제조예 조성물과 비교예 조성물의 근육세포 생존도 효과를 비교하였다. 본 발명의 GCA 단독 제제 중‘GCA 1.0%, GCA 3.0%, GCA 6.0%, GCA 9.0%’와 대조군 DCA 1.0% 단독 및 DCA 2.2%로 가용화한 PPC 5.0%를 대표로 하여 실험하였다. 구체적인 실험방법은 다음과 같다: 1% gelatin을 배양접시에 도포한 후 상온에서 1일 방치한다. 도포된 배양접시에 세포충만도 80%까지 배양 후 배양배지(EGM-Plus, 10% FBS, 1% antibiotics mix)를 제거한다. 상기 세포에 제조예 및 비교예의 실험물질을 각각 100μl을 새로운 배양배지에 혼합 및 처리하여, 정해진 처리시간에 맞추어 배양배지를 제거하고 MTT assay(570nm에서 측정)를 시행한다.
상기 실험결과를 도 7에서 보여준다. DCA로 가용화한 PPC 제제와 DCA 단독 제제 및 GCA 9.0% 단독 제제는 근육세포 용해효력이 높은데 반면, GCA 1% 내지 6% 단독 제제 실험군은 혈관내피세포 용해력이 상당히 낮아 지방세포만 선택적으로 감소시켜, 인체 적용 시 국소 이상반응이 급격히 낮아진다.
실험예 2. GCA 단독 제제의 in vivo 지방감소 효과 및 부작용 대조 평가
실험예 2-1. 일반 마우스 대상 부작용(염증 및 부종) 평가
1) 발바닥 두께 측정
각각의 담즙산 1.0%, 2.5%, 5.0%, 7.5% 단독 제제와 대조군으로 DCA 1.0% 단독 제제의 각 실험약물을 0.1ml씩, 스프라그 돌리(쥐)의 6주령 수컷(체중: 170~200g)의 뒷발 발바닥에 피하주사하였다. 약물 주사한 후, 1, 2, 3 시간 후마다 발바닥의 두께를 캘리퍼로 측정하였으며, 측정자는 실험의 순서나 목적을 모르는 상태(맹검시험)로 시행했다. 각 실험군 별로 시간에 따른 발바닥 두께 측정결과는 도 8a 내지 도 8k에서 보여준다. 또한, 두께 측정 시 투여부위의 조직병변을 관찰하기 위해 발바닥 사진(4×4 cm 축적자 이용)을 촬영하였으며, 이를 도 9에서 보여준다.
도 8a 내지 도 8k에서 보는 바와 같이, 담즙산 중 TUDCA와 DHCA를 제외한 모든 답즘산은 농도 의존적으로 부종이 관찰되었으며, DCA 1%보다 부종 정도가 낮은 담즙산과 농도는 CA 1.0% 내지 2.5%, TCA 1.0% 내지 5.0%, GCA 1.0% 내지 6.0%, UDCA 1.0%, GDCA 1.0%, TDCA 1.0%, HDCA 1.0%로 관찰되었다. 또한 투여부위의 조직병변은 TUDCA와 DHCA를 제외하고 농도 의존적으로 중등증 내지 중증이 관찰되었으며 TCA 5.0%이하와 GCA 6.0%이하 농도에서 조직병변이 없거나 경증으로 관찰되었다. 또한 도 9에서 보는 바와 같이, 랫트 발바닥에 DCA 1.0% 단독 제제 및 DCA 2.2%로 가용화한 PPC 5.0%제제 투여군에서는, 심한 홍반과 염증의 부작용을 육안으로 확인할 수 있었으나, GCA 6.0% 이하 농도의 제제에서는 육안으로 조직병변이 거의 관찰되지 않았다.
2) H&E staining 조직학적 검사
GCA 1.0%, GCA 2.5%, GCA 5.0%, GCA 10.0% 단독 제제와 대조군 DCA 1.0% 단독 제제의 각 실험약물을 0.1ml씩, 스프라그돌리(쥐)의 6주령 수컷(체중: 170~200g)의 뒷발 발바닥에 피하주사하였다. 투약 3시간 후 희생시켜, 발바닥을 자른 후, 발바닥의 피부를 잘라내어 10% 포르말린 수용액으로 고정 시켰다. 이를 hematoxylin & eosin 용액에 염색시켜 형태학적 변화를 관찰하였다. 관찰결과는 도 10a, 도 10b, 도 10c, 도 10d, 도 10e 및 도 10f에 표시하였다.
도 10f에서 종합적으로 비교하고 있는 바와 같이, DCA 투여군 대비 본원 발명의 GCA 5.0% 이하 투여군에서 염증세포가 현저히 감소된 양상을 나타내었다. 전술한 실험결과들과 본 실험 결과를 통하여, 기존 DCA 사용제제에서는 지방세포 괴사(necrosis)로 인한 부작용이 일어나는 반면에, 본원 발명의 GCA 6% 이하 제제는 지방세포 apoptosis 특이적 효과를 가져 염증반응이 거의 없이 지방이 감소된다는 것을 확인하였다.
실험예 2-2. 고지방식이로 유도된 마우스 비만 모델에서 지방감소 효과 및 염증 평가
C57BL/6 흰쥐(4주령)에게 12주 동안 고지방식이(Research diet, 60% kcal lipid)를 섭취하도록 하여 고도 비만 상태로 만들었다. 이렇게 고지방식이로 유도된 비만 마우스 서혜부 지방 패드에 식염수(음성 대조군), DCA 단독 제제(DCA 1%, 양성 대조군) 또는 GCA 1.0%, GCA 2.5%, GCA 5.0%, GCA 10.0%의 시험물질을 1회 투여하였다. 각 시험물질은 0.2mL씩 복부에 피하주사하는 형식으로 수행되었다. 첫 번째 약물주입이 완료된지 8일 후에, 마우스를 희생시켰다. 희생된 마우스의 복부를 절개하여 신속하게 피하지방을 적출하여 4% 포름알데히드(formaldehyde) 용액에 담가 고정하였다. 고정한 다음 수세와 탈수과정을 거친 후 파라핀(paraffin) 용액으로 처리하여 파라핀 블락(paraffin block)을 만들고 4μm두께로 박절하여 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin)으로 염색한 뒤 광학현미경으로 관찰하였다. 결과는 도 11에 표시하였다.
도 11에서 보는 바와 같이, DCA 단독 제제(DCA 1%)투여군에서는 지방세포 괴사의 흔적과 더불어 과립구가 모여들어 염증 반응이 나타났다. 반면 본원 발명의 GCA 6% 이하 투여군에서는 대조군 대비 염증반응이 거의 일어나지 않았으며 지방세포가 사멸되고 있는 양상을 관찰할 수 있었다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 고통 및 부작용이 없는, 국소지방 감소용 포스파티딜콜린 비포함 주사제 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 포스파티딜콜린 비포함 국소지방 감소용 주사제 조성물에 있어서, 상기 조성물은 글리코콜린산 또는 이의 염을 1(w/v)% 내지 6(w/v)% 포함하는 것을 특징으로 하는 고통 및 부작용이 없는 국소지방 감소용 주사제 조성물 및 이의 제조방법에 대한 것이다.
기존의 국소 지방 감소용 주사제로서 알려진 데옥시콜린산(DCA) 단일제 또는 포스파티딜콜린-데옥시콜린산 복합제제들에서 나타나는 지방세포 괴사(necrosis)에 의한 지방 감소는 고통, 부종, 염증, 섬유화, 홍반, 혈종, 신경손상 등과 같은 국소 이상반응이 발생한다고 보고되고 있다. 하지만 본원 발명에서 제공하는 국소지방 분해용 주사제 조성물은 지방세포 분해(lipolysis)와 지방세포 사멸(apoptosis)을 유도하여 국소 지방을 감소시키는 것으로 지방세포 제거 효과가 현저할 뿐만 아니라, 상기 기존 국소지방분해용 주사제 조성물에서 나타나는 고통, 부종, 염증, 섬유화, 홍반, 혈종, 신경손상 등의 부작용이 현저히 경감되었으며 투여 시 및 투여 후의 고통과 부종으로 인한 환자들의 낮은 복약 순응도를 획기적으로 높여 산업상 이용가능성이 높다.

Claims (18)

  1. 포스파티딜콜린 비포함 국소지방 감소용 주사제 조성물에 있어서,
    상기 조성물은 글리코콜린산 또는 이의 염을 1(w/v)% 내지 6(w/v)% 포함하는 것을 특징으로 하는 고통 및 부작용이 없는 국소지방 감소용 주사제 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 국소지방 감소는 지방분해(lipolysis) 및 지방세포의 세포사멸(apoptosis) 방식에 의한 것을 특징으로 하는 고통 및 부작용이 없는 국소지방 감소용 주사제 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 부작용은 혈종, 부종, 무감각증, 홍반, 종창, 경화, 소양감 및 결절로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 고통 및 부작용이 없는 국소지방 감소용 주사제 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 pH 6.0 내지 pH 8.0 를 갖는 것을 특징으로 하는 고통 및 부작용이 없는 국소지방 감소용 주사제 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 염은 나트륨염, 칼륨염 또는 암모늄염인 것을 특징으로하는 고통 및 부작용이 없는 국소지방 감소용 주사제 조성물
  6. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 추가적으로 벤질 알콜을 포함하는 것을 특징으로 하는 고통 및 부작용이 없는 국소지방 감소용 주사제 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 국소적인 지방은 이의 축적이 포유동물의 복부, 눈 밑, 턱 밑, 팔 밑, 엉덩이, 허벅지, 종아리, 등, 넓적다리, 브라라인 및 지방종과 연관된 지방 축적으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 고통 및 부작용이 없는 국소지방 감소용 주사제 조성물.
  8. 고통 및 부작용이 없는 국소지방 감소용 주사제 조성물을 제조하는 방법에 있어서,
    상기 조성물은 글리코콜린산(Glycocholic acid, GCA) 또는 이의 염을 1(w/v)% 내지 6(w/v)% 포함하되 포스파티딜콜린은 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 고통 및 부작용이 없는 국소지방 감소용 주사제 조성물을 제조하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 국소지방 감소는 지방분해(lipolysis) 및 지방세포의 세포사멸(apoptosis) 방식에 의한 것을 특징으로 하는 고통 및 부작용이 없는 국소지방 감소용 주사제 조성물을 제조하는 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 부작용은 부종, 종창, 신경손상, 결절, 경화, 무감각증, 홍반 및 소양감으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 고통 및 부작용이 없는 국소지방 감소용 주사제 조성물을 제조하는 방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 조성물은 pH 6.0 내지 pH 8.0를 갖는 것을 특징으로 하는 고통 및 부작용이 없는 국소지방 감소용 주사제 조성물을 제조하는 방법.
  12. 제8항에 있어서, 상기 염은 나트륨염, 칼륨염 또는 암모늄염인 것을 특징으로 하는 고통 및 부작용이 없는 국소지방 감소용 주사제 조성물을 제조하는 방법.
  13. 제8항에 있어서, 상기 조성물은 추가적으로 벤질 알콜을 포함하는 것을 특징으로 하는 고통 및 부작용이 없는 국소지방 감소용 주사제 조성물을 제조하는 방법.
  14. 제8항에 있어서, 상기 국소적인 지방은 이의 축적이 포유동물의 복부, 눈 밑, 턱 밑, 팔 밑, 엉덩이, 허벅지, 종아리, 등, 넓적다리, 브라라인 및 지방종과 연관된 지방 축적으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 고통 및 부작용이 없는 국소지방 감소용 주사제 조성물을 제조하는 방법.
  15. 고통 및 부작용이 없는 포스파티딜콜린 비포함 국소지방 감소용 주사제를 제조하기 위한 글리코콜린산 또는 이의 염을 1(w/v)% 내지 6(w/v)% 포함하는 조성물의 용도.
  16. 글리코콜린산 또는 이의 염을 1(w/v)% 내지 6(w/v)% 포함하는 포스파티딜콜린 비포함 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 고통 및 부작용이 없이 국소지방을 감소시키는 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 국소지방 감소용 주사제 조성물은 글리코콜린산 또는 이의 염 1(w/v)% 내지 6(w/v)%;
    보존제, 등장화제 및 pH 조절제로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 것 0.1(w/v)% 내지 20(w/v)%; 및 잔량의 주사용수(물)로 이루어지는 것을 특징으로 하는 고통 및 부작용이 없는 국소지방 감소용 주사제 조성물.
  18. 제8항에 있어서, 상기 조성물을 제조하는 방법은
    (a) 전체 조성물을 기준으로 글리코콜린산(Glycocholic acid) 또는 이의 염이 1(w/v)% 내지 6(w/v)%가 되도록 주사용수에 넣고 투명하게 용해 될 때까지 교반하는 단계;
    (b) 상기 (a)단계에서 교반한 혼합물에 등장화제 및 보존제 0.1(w/v)% 내지 15(w/v)%를 투입하고 교반하는 단계; 및
    (c) pH 조절 후 물(주사용수)로 총 부피를 맞추고 교반하는 단계를 포함하되, 포스파티딜콜린은 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 고통 및 부작용이 없는 국소지방 감소용 주사제 조성물을 제조하는 방법.
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