WO2019059606A1 - 양춘사 추출물을 함유하는 비만 예방, 개선 또는 치료 조성물 - Google Patents

양춘사 추출물을 함유하는 비만 예방, 개선 또는 치료 조성물 Download PDF

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fat diet
high fat
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권강범
김하림
조성강
이금산
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주식회사 일원바이오
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Definitions

  • the present invention relates to a preventive, ameliorative, or therapeutic composition containing a biennial extract.
  • the present invention is characterized in that the Yangchunsaek extract is extracted with water and inhibits the hepatic lipogenesis, inhibition of fat cell size, inhibition of triglyceride production, suppression of mRNA expression related to adipocyte differentiation, and suppression of mRNA expression of fatty liver
  • obesity in childhood shows an increase in the size and number of adipocytes, which decreases the size of adipocytes, but is dangerous because the number of cells does not decrease over a lifetime.
  • the number of patients with fatty liver has increased as the nutritional status has improved and adult diseases have increased recently. It is a disease that the liver accumulates in the liver due to excessive intake of fat and does not produce synthetic and normal fat metabolism.
  • the applicant of the present invention has found that the present invention has no side effects by using the extract of Amomum villosum Loureiro, has no toxicity even when taken for a long time, and is effective for improving obesity.
  • Sane refers to ripe berries or lumps of ginseng ( Amomum villosum Loureiro var. Xanthioides TLWu et Senjen) or zingiberaceae ( Amomum villosum Loureiro) associated with ginger and Zingiberaceae
  • the fruit of Yangchun is used as a material.
  • Yangchun is mainly produced in Fujian, Guangdong, Guangxi and Yunnan, and is mainly produced in Indochina Peninsula regions such as Cambodia, India, Laos, Sri, Thailand and Vietnam, and Guangxi and Yunnan in China. China, v24: 347-356, 2000). The place of production is different. In ancient times, the name of the temple was called 'the house'.
  • the present invention relates to a method for preventing and improving the obesity-induced obesity-induced hyperlipidemia in an in vivo animal model using an inducible obesity model to inhibit hepatic lipogenesis, inhibit fat cell size, inhibit triglyceride production, mRNA and lipid-induced mRNA expression of the extracts of obtusa, obesity, and obesity.
  • Korean Patent Registration No. 10-1431610 discloses a pharmaceutical composition for preventing or treating obesity, abnormal fat fat, fatty liver,
  • Korean Patent Publication No. 10-1206543 discloses that a composition for prevention or treatment of fatty liver including uri extract is effective.
  • the object of the present invention is to provide an anti-obesity composition containing an extract of Yangtze broth by confirming the obesity effect of the Yangtze broth extract using a high-fat dietary induction model.
  • the in vivo high-fat diet induction-induced obesity model is used to inhibit the production of hepatic fat, inhibit fat cell size, inhibit triglyceride production
  • the present invention provides a composition for preventing, ameliorating or treating obesity, which comprises the extract of Yangtze broth by confirming the prevention and improvement effect of the obesity of the Yangtze broth extract by inhibiting the mRNA expression of differentiation-related mRNA and fatty acid expression.
  • the present invention aims at solving the technical problem by providing a composition for preventing, ameliorating or treating obesity containing both Chunsan extracts.
  • the present invention aims to solve the technical problem by providing a composition for preventing and improving obesity, which comprises 100 to 500 mg / kg of the extract of Yangchunsha on a mouse oral administration basis.
  • the present invention aims at solving the technical problem by providing a composition for preventing and improving obesity, which comprises extracting the above-mentioned bilberry extract with water.
  • the present invention relates to a method for suppressing the content of triglyceride in an induction obesity mouse induced by a high fat diet and suppressing the production of PPAR? (Peroxisome proliferator-activated receptor?), C / EBP? (CCAAT / enhancer binding protein? , SREBP1 (sterol regulatory element-binding protein 1), TNF ⁇ (tumor necrosis factor ⁇ ) and Adiponectin mRNA.
  • PPAR? Peroxisome proliferator-activated receptor?
  • C / EBP? CCAAT / enhancer binding protein?
  • SREBP1 sterol regulatory element-binding protein 1
  • TNF ⁇ tumor necrosis factor ⁇
  • Adiponectin mRNA Adiponectin mRNA.
  • the present invention aims at solving the technical problem by providing a composition for preventing and improving obesity through inhibition of triglyceride production against induction obesity induced by high fat diet.
  • the present invention aims at solving the technical problem by providing a composition for improving obesity-containing health functional foods containing an extract of Chunjunja as an active ingredient.
  • the mice of the high-fat diet induction model showed inhibition of hepatic lipogenesis, inhibition of fat cell size, inhibition of triglyceride production, inhibition of adipocyte differentiation-related mRNA and fatty liver-induced mRNA expression
  • the present invention has been accomplished by developing a composition for preventing, ameliorating or treating an anti-obesity drug containing an extract of Yangchunjae through the prevention and improvement of obesity of Yangchunsaek extract.
  • FIG. 1 is a diagram showing the weight change of an animal according to a dose of a bilberry extract of a high fat diet-induced obesity model.
  • FIG. 2 is a graph showing changes in liver and total fat masses according to the dose of a bilberry extract of a high fat diet-induced obesity model.
  • FIG. 3 is a chart showing the intrahepatic fat tissue according to the dose of a bilberry extract of a high fat diet-induced obesity model.
  • FIG. 4 is a diagram showing the tissue changes of fat according to the dose of a bilberry extract of a high fat diet-induced obesity model.
  • FIG. 5 is a graph showing an analysis of the content of triglycerides according to the dose of the extract of Yangchunsae in a high fat diet-induced obesity model.
  • FIG. 6 is a graph showing the expression levels of PPAR ⁇ and C / EBP ⁇ according to the dose of a bilberry extract of a high fat diet-induced obesity model.
  • FIG. 7 is a graph showing the expression levels of FAS and SREBP1 mRNA according to the dose of the billy broth extract of the high fat diet-induced obesity model.
  • FIG. 8 is a graph showing the amount of TNF? And adiponectin expression in the high fat diet induced obesity model according to the dose of the extract of Yangchunsaek.
  • Amomum villosum was confirmed as authentic in Wonkwang University School of Oriental Medicine herbal medicine class.
  • Extractable solvents include water, ethanol, methanol, fatty oils, glycerin, mayo, ethyl acetate, acetone, butanol and isopropanol.
  • both spring flowers are extracted with water.
  • 100 g of the extract was refluxed with 900 ml of distilled water for 3 hours and filtered.
  • the filtrate was concentrated under reduced pressure and lyophilized to obtain 9.25 g of a water extract of Chunchunjae. Therefore, it is possible to develop a composition for the prevention and improvement of obesity characterized by extracting with water.
  • mice purchased from 6-week-old C57BL / 6J male mice (Orientbio, Seongnam, Korea) and adapted to the breeding environment for 1 week.
  • High fat diet + AVE 100 mg / kg was administered to control mice (control), high fat diet, high fat diet, kg), high fat diet + AVE (200 mg / kg) and 500 mg / kg (high fat diet + 500 mg / kg)
  • the temperature of the breeding room was maintained at 18-24 ° C relative humidity at 50-60% and the darkness was adjusted to 12 hours (8:00 - 20:00).
  • the high fat diet used in this experiment was supplemented with 15% lard in addition to the basic diet so that about 60% of the total calories were fed to the fat. Body weight was measured once a week. Animal experiments were approved by the Wonkwang University Animal Experiment Ethics Committee, and the use and management of laboratory animals followed institutional guidelines.
  • the body weight of the experimental animals after the purifying period was measured.
  • the control group, high fat diet, high fat diets + 100 mg / kg extract group ( Amomum villosum extract, AVE 100 mg / kg group), high fat diet + Yangchunsa extract 200 ( Amomum villosum extract, AVE 200 mg / kg group), high fat diets + 500 mg / kg extract of Yangchunsaek ( Amomum villosum extract, AVE 500 mg / kg group) were used for the experiment.
  • the extracts of Yangchunsae were administered for 7 weeks using the mouse for daily administration at a predetermined concentration.
  • FIG. 1 is a diagram showing the weight change of an animal according to a dose of a bilberry extract of a high fat diet-induced obesity model.
  • the extract of Yangchunsaek can be prepared as a composition for preventing, ameliorating or treating obesity which is characterized in that 100 to 500 mg / kg of the extract is contained on a mouse oral administration basis.
  • Body weights were measured weekly after the start of the experiment. Autopsy was performed by blood sampling from the abdominal vein after ether anesthesia, and liver and fat (epididymal fat) tissues were extracted and weighed.
  • FIG. 2 is a graph showing changes in liver and total fat masses according to the dose of a bilberry extract of a high fat diet-induced obesity model.
  • the adipose tissue was trimmed with 10% formalin solution and then fixed with 10% formalin solution. After embedding in paraffin, the sections were cut to a thickness of 5 ⁇ m and stained with hematoxylin-eosin. The liver and adipose tissues were observed and photographed using an optical microscope, Olympus BX50 F4 (Olympus, Japan).
  • FIG. 3 is a chart showing the intrahepatic fat tissue according to the dose of a bilberry extract of a high fat diet-induced obesity model.
  • FIG. 4 is a diagram showing the tissue changes of fat according to the dose of a bilberry extract of a high fat diet-induced obesity model.
  • the liver fat decreased and the size of adipose tissue decreased as the dose of Yangchunsaek extract increased.
  • RNA isolation of total RNA from liver and adipose tissue was performed according to the manufacturer's method using Trizol reagent (Life Technologies, UK).
  • the reverse transcription reaction was performed using 2 ⁇ g total RNA and PrimeScript TM reagent kit (perfect realtime) (TaKaRa BIOINC.) According to the manufacturer's method.
  • the reverse transcriptase reaction was carried out with a reaction solution containing total RNA (2 ⁇ g), oligo d (T) primer (25 pmol), PrimeScript RT enzyme Mix I and 5 ⁇ primeScript Buffer for 15 minutes at 37 ° C and 5 hours at 85 ° C, Were synthesized.
  • FIG. 6 is a graph showing the expression levels of PPAR ⁇ and C / EBP ⁇ according to the dose of a bilberry extract of a high fat diet-induced obesity model.
  • FIG. 7 is a graph showing the expression levels of FAS and SREBP1 mRNA according to the dose of the billy broth extract of the high fat diet-induced obesity model.
  • FIG. 8 is a graph showing the amount of TNF? And adiponectin expression in the high fat diet induced obesity model according to the dose of the extract of Yangchunsaek.
  • the extracts of both sexes were treated with PPAR ⁇ (peroxisome proliferators-activated receptor ⁇ ), C / EBP ⁇ (CCAAT / enhancer binding protein ⁇ ), FAS (fatty acid synthase), SREBP1 regulatory element-binding protein 1), TNF ⁇ (tumor necrosis factor ⁇ ) and Adiponectin mRNA expression, which are expected to inhibit adipocyte differentiation and expression and fatty liver expression.
  • PPAR ⁇ peroxisome proliferators-activated receptor ⁇
  • C / EBP ⁇ CCAAT / enhancer binding protein ⁇
  • FAS fatty acid synthase
  • SREBP1 regulatory element-binding protein 1 SREBP1 regulatory element-binding protein 1
  • TNF ⁇ tumor necrosis factor ⁇
  • Adiponectin mRNA expression which are expected to inhibit adipocyte differentiation and expression and fatty liver expression.
  • CCAAT / enhancer binding protein a FAS (fatty acid synthase), and SREBP1 (sterol) in mouse, and inhibit the content of triglyceride in induced obese mice induced by high- regulatory element-binding protein 1), TNF ⁇ (tumor necrosis factor ⁇ ), and Adiponectin mRNA expression.
  • Liver triglyceride content was measured as follows. Liver tissues were homogenized in a chloroform-methanol solution (2: 1, v / v), reacted at room temperature for 1 hour, centrifuged and dried for 24 hours. After dissolving in ethanol, the triglyceride content of the liver was investigated using TG kit (AM 157S-K and AM 202-K, Asan Pharmaceutical, Korea) and normalized to protein concentration.
  • TG kit AM 157S-K and AM 202-K, Asan Pharmaceutical, Korea
  • the extract of Yangchunsha was inhibited by triglycerides against induced obesity induced by high fat diet, thereby developing a composition for the prevention, improvement or treatment of obesity.

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Abstract

본 발명은 양춘사 추출물 유효성분을 함유하는 항비만 예방 및 개선 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 상기 양춘사 추출물은 물로 추출하는 것을 특징으로 하며, 마우스 경구 투여 기준으로 100 ~ 500mg/kg 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 비만 예방 및 개선 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 양춘사 추출물의 간 내 지방세포 증가 억제, 지방세포의 크기 억제, 중성지방의 생성억제 효능 및 그 기전을 in vivo에서 mRNA 발현 억제 함으로써 항비만 효능을 가진 양춘사 추출물을 함유한 비만 예방 및 개선 조성물을 제공하는 것이다.

Description

양춘사 추출물을 함유하는 비만 예방, 개선 또는 치료 조성물
본 발명은 양춘사 추출물을 함유하는 예방, 개선 또는 치료 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 상기 양춘사 추출물은 물로 추출하는 것을 특징으로 하며, 양춘사 추출물의 간 내 지방 생성 억제, 지방세포 크기 억제, 중성지방 생성 억제, 지방세포 분화 관련 mRNA 발형 억제 및 지방간 유발 mRNA 발현 억제를 통해 양춘사 추출물의 비만 예방 및 개선 효능을 통해 양춘사 추출물을 함유하는 항비만 예방, 개선 또는 치료 조성물을 제공하는 것이다.
현대인들의 과잉 영양으로 인해 섭취와 에너지소비 사이의 불균형으로 인하여 유발되는 대사 장애로 체내에 지방이 과잉 축적되어 비만이 증가하고 있는 상태이다.
이러한 비만인구는 점차 증가하고 있으며 2008년 전 세계 성인 인구 중 15억 명이 과체중 및 비만이고, 2030년에는 과체중 인구가 약 21억 명에 이를 것으로 추산되고 있다.
특히, 아동기에 형성되는 비만증으로서 지방세포의 크기와 세포수가 증가는 형태를 나타를 나타내며, 이는 체중을 감소시키면 지방세포의 크기는 줄어들지만 세포수는 일생동안 감소하지 않기 때문에 위험하다.
이와 달리, 성인은 지방세포의 비대는 있으나 증가는 없는 형태를 나타낸다. 비만의 분포 또한 복부를 중심으로 체간에 국한되는 경향이 있다.
즉 성인은 지방세포의 크기만 증가하지만, 소아기에 시작된 비만은 지방세포의 크기와 함께 지방세포의 수가 증가하게 되어, 성인기에 체중을 감량하더라도 일시적으로 지방세포의 크기만 감소하고 지방세포의 수는 여전히 많은 상태이므로 비만이 쉽게 재발할 수 있다.
또한 더불어 최근 영양상태가 좋아지고 성인병이 늘어감에 따라 지방간 환자가 증가하고 있다. 이는 지방의 과도한 섭취로 인한 간 내 지방 축적 및 합성 및 정상적 지방대사가 이루어 지지 못하고 발명하는 질환이다.
지방간질환 환자의 70~80%는 비만이고, 그 외에 상당수 환자는 과체중이다. 따라서 체중감소는 인슐린 감수성을 향상시켜서 지방간이 호전시키며, 최근에는 체중의 약 5% 정도만 감량해도 인슐린저항성이 개선되고 간 기능 수치가 호전된다는 보고가 있다. 이에 생활습관의 개선이 무엇보다 중요하다.
이에 따라 최근 비만의 심각성이 대두되면서 다이어트 보조제로서 다양한 제품이 출시 되고 있으나, 위염, 변비, 식욕부진 등의 부작용이 초래되고 있는 실정이다.
본 출원인은 양춘사( Amomum villosum Loureiro) 추출물을 이용하여 부작용이 없으며, 장기 복용하여도 독성이 없고, 비만 개선에 효과가 있는 본 발명을 안출하였다.
사인(砂仁)은 생강과(Zingiberaceae)에 딸린 녹각사(綠殼砂 Amomum villosum Loureiro var. xanthioides T.L.Wu et Senjen) 또는 양춘사(陽春砂. Amomum villosum Loureiro)의 잘 익은 열매 또는 씨의 덩어리를 의미하여, 본 발명에서는 양춘사의 열매를 재료로 이용하였다.
양춘사는 Fujian, Guangdong, Guangxi, Yunnan에서 주로 생산되고, 녹각사는 주로 Cambodia, India, Laos, Myanmar, Thailand, Vietnam 등의 인도차이나반도 지역과 중국의 Guangxi, Yunnan의 일부 지역에서 산출된다.(Flora of China, v24:347-356.2000). 생산지가 달라 고대(古代)에는 녹각사를 ‘축사인’이라는 이름으로 별도로 지칭하였다.
한편, 중국은 정품으로 인정하나 국내에서는 위품으로 취급되는 해남사(海南砂 Amomum longiligulare T.L.Wu)의 열매도 대량 유통되고 있는 상황이다. 그러나 Shen 등(SHEN Li WANG Yang JIANG Ku et al. Comparison of HPLC Fingerprints of Amomum villosum Lour. ，Amomurn villosum Lour. var. xanthioides T.L.Wu et Senjen and Amomum longiligulare T.L.Wu. Chinese Pharmaceutical Journal. 2016: 51(12); 1039-1043.)은 ＲP-HPLC 연구결과 3종류의 사인이 성분상 높은 유사도를 보이기는 하나, 해남사와 양춘사는 화학성분이 비슷한 반면 녹각사는 앞의 둘과 분명한 차이가 있으므로 이에 대한 약리와 임상 효능의 비교가 구명되어야 한다고 하였다.
이에 본 발명은 양춘사 추출물의 비만 예방 및 개선 효능을 입증하기 위해, in vivo에서 고지방식이 유도 비만 모델을 이용하여 간 내 지방 생성 억제, 지방세포 크기 억제, 중성지방 생성 억제, 지방세포 분화 관련 mRNA, 지방간 유발 mRNA 발현 억제를 통해 양춘사 추출물의 비만 예방, 개선 및 치료 효능을 밝힘으로서 본 발명을 완성하였다.
한편, 선행기술 문헌을 살펴보면, 대한민국 등록특허공보 제10-1431610호에는 오매 및 자초 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만, 이상지방혈증, 지방간 또는 당뇨의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 대해 기재 되어 있고, 대한민국 등록특허공보 제10-1206543호에는 율피 추출물을 포함하는 지방간의 예방 또는 치료용 조성물이 효과 있음이 기재되어 있다.
그러나 상기 선행기술문헌들은 양춘사( Amomum vilosum)와는 다른 천연물을 사용하여 효능을 밝힌 것으로, 본 발명과는 구별된다고 하겠다.
본 발명의 기술적 과제는 고지방식이 유도 비만 모델을 이용한 양춘사 추출물의 비만 효능을 확인하여, 양춘사 추출물을 함유한 항비만 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 기술적 과제는 양춘사 추출물의 비만 예방 및 개선 효능을 입증하기 위해, in vivo에서 고지방식이 유도 비만 모델을 이용하여 간 내 지방 생성 억제, 지방세포 크기 억제, 중성지방 생성 억제, 지방세포 분화 관련 mRNA, 지방간 발현 mRNA 발현 억제를 통해 양춘사 추출물의 비만 예방 및 개선 효능을 확인함으로서, 양춘사 추출물 함유하는 비만 예방, 개선 또는 치료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은, 양춘사 추출물을 함유하는 비만 예방, 개선 또는 치료 조성물을 제공함으로써, 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명은, 상기 양춘사 추출물은 마우스 경구 투여 기준으로 100 ~ 500mg/kg 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 비만 예방 및 개선 조성물을 제공함으로써, 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명은, 상기 양춘사 추출물은 물로 추출하는 것을 특징으로 하는 비만 예방 및 개선 조성물을 제공함으로써, 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명은, 고지방식로 인한 유도 비만 마우스에서 중성지방의 함량을 억제하며, 마우스에서 PPARγ(peroxisome proliferators- activated receptror γ), C/EBPα(CCAAT/enhancer binding protein α),FAS(fatty acid synthase), SREBP1(sterol regulatory element-binding protein 1), TNFα(tumor necrosis factor α)와 Adiponectin mRNA 의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 비만 예방 및 개선 조성물을 제공함으로써, 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명은, 상기 양춘사 추출물은 고지방식로 인한 유도 비만에 대해 중성지방 생성 억제를 통한 비만 예방 및 개선 조성물을 제공함으로써, 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명은, 양춘사 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만 개선 건강기능식품 조성물을 제공함으로써, 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명의 실험예에 따라 고지방식이 유도 비만 모델을 이용한 양춘사 추출물의 항비만 효능을 확인하기 위해 in vivo에서 지방 축적 억제 효능에 대해 확인하였다.
본 발명의 실험예에 따라 고지방식 유도 비말 모델의 마우스에 양춘사 추출물을 투여한 결과 간 내 지방 생성 억제, 지방세포 크기 억제, 중성지방 생성 억제, 지방세포 분화 관련 mRNA, 지방간 유발 mRNA 발현 억제를 통해 양춘사 추출물의 비만 예방 및 개선 효능을 통해 양춘사 추출물 함유하는 항비만 예방, 개선 또는 치료 조성물을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
도 1은 고지방식 유도비만 모델의 양춘사 추출물을 투여량에 따른 동물의 몸무게 변화를 나타낸 도면이다.
도 2는 고지방식 유도비만 모델의 양춘사 추출물을 투여량에 따른 간과 총지방량의 변화를 나타낸 도면이다.
도 3은 고지방식 유도비만 모델의 양춘사 추출물을 투여량에 따른 간내 지방조직을 관찰한 도면이다.
도 4는 고지방식 유도비만 모델의 양춘사 추출물을 투여량에 따른 지방의 조직변화를 관찰한 도면이다.
도 5는 고지방식 유도비만 모델의 양춘사 추출물을 투여량에 따른 중성지방의 함량을 분석한 그래프이다.
도 6은 고지방식 유도비만 모델의 양춘사 추출물을 투여량에 따른 PPARγ와 C/EBPα 발현량을 확인한 그래프이다.
도 7은 고지방식 유도비만 모델의 양춘사 추출물을 투여량에 따른 FAS와 SREBP1 mRNA 발현량을 확인한 그래프이다.
도 8은 고지방식 유도비만 모델의 양춘사 추출물을 투여량에 따른 TNFα와 Adiponectin 발현량을 확인한 그래프이다.
본 명세서 및 청구 범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 안되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
따라서 본 명세서에 기재된 실시예, 참조예 및 도면에 기술된 사항은 본 발명의 가장 바람직한 일 예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
실험예 1. 고지방식이 유도 비만 모델을 이용한 양춘사 추출물의 항비만 효과
1) 양춘사 추출물의 제조
양춘사(Amomum villosum)는 원광대학교 한의과대학 본초학 교실에서 진품 여부를 확인받았으며, 물로 양춘사을 추출하여 추출물을 얻는 단계이다.
설계조건에 따라, 다른 용매가 사용될 수도 있으며, 추출 용매의 종류에 따라 추출 온도, 추출 시간, 용매의 양 및 잔류 성분 처리 방식 등이 다르게 설계될 수 있다. 추출 용매 또한 다양한 용매가 사용될 수 있는데, 추출 가능한 용매에는 물, 에탄올, 메탄올, 지방유, 글리세린, 마유, 에틸아세테이트, 아세톤, 부탄올 및 이소프로판올 등이 있다.
바람직하게는 본 발명에서 물로 양춘사을 추출하였다. 추출과정을 살펴보면 100 g을 3차 증류수 900 ml 로 3시간 가열 환류추출하고 여과한 다음 여액을 감압 농축 동결건조하여 양춘사 물 추출물 9.25 g을 얻은 후 냉장 보관하면서 실험에 사용하였다. 따라서 물로 추출하는 것을 특징으로 하는 비만 예방 및 개선 조성물을 개발할 수 있다.
2) 실험 동물의 사육 및 식이
실험동물은 6주령 된 C57BL/6J 수컷 마우스를 구입(Orientbio, Seongnam, Korea)하여 1주 동안 사육실 환경에 적응시켰다. 평균 체중이 약 20~22 g이 되는 마우스를 정상식이 대조군(Control), 고지방식이 대조군(High fat diet), 고지방식이에 양춘사 추출물 100 mg/kg 투여군(High fat diet+AVE(100mg/kg), 200 mg/kg(High fat diet+AVE(200mg/kg) 투여군, 500 mg/kg(High fat diet+AVE(500mg/kg) 투여군 5개 군으로 임의 배치하여 7주간 사육하였다.
사육실의 온도는 18～24°상대습도 50～60%로 유지하였으며 명암은 12시간 주기(8:00～20:00)로 조절하였다. 본 실험에 사용한 고지방 사료는 총 열량의 약 60%가 지방으로 공급되도록 15%의 lard를 기본식이에 추가로 첨가하였으며 체중은 일주일에 한 번씩 측정하였다. 동물 실험은 Wonkwang University Animal Experiment Ethics Committee에서 승인받았고, 실험실 동물의 사용과 관리는 institutional guideline을 따랐다.
3) 실험군 설정 및 시료 투여
순화기간이 끝난 실험동물은 체중을 측정하였다. 실험군은 정상군(Control group), 고지방식이 투여군(High fat diet), 고지방 사료+양춘사 추출물 100 mg/kg 투여군( Amomum villosum extract, AVE 100 mg/kg group), 고지방 사료+양춘사 추출물 200 mg/kg 투여군( Amomum villosum extract, AVE 200 mg/kg group), 고지방 사료+양춘사 추출물 500 mg/kg 투여군( Amomum villosum extract, AVE 500 mg/kg group) 구분하였으며 각 군당 10마리씩 실험에 사용하였으며 양춘사 추출물은 정해진 농도대로 매일 마우스 용 존대를 이용하여 7주간 투여하였다.
도 1은 고지방식 유도비만 모델의 양춘사 추출물을 투여량에 따른 동물의 몸무게 변화를 나타낸 도면이다.
그 결과 양춘사 추출물의 투여량이 증가함에 따라 몸무게가 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 즉 양춘사 추출물은 마우스 경구 투여 기준으로 100 ~ 500mg/kg 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 비만 예방, 개선 또는 치료 조성물로 제조할 수 있다.
4) 바이오마커 분석 및 부검
체중은 실험 시작 후 매주 측정하였으며 부검은 ether로 마취 후 복대정맥에서 채혈하여 혈액 분석에 사용하였으며, 간과 지방(부고환지방)조직을 적출하여 무게를 측정하였다.
도 2는 고지방식 유도비만 모델의 양춘사 추출물을 투여량에 따른 간과 총지방량의 변화를 나타낸 도면이다.
그 결과 양춘사 추출물의 투여량이 증가함에 따라 간과 지방조직의 무게가 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
5) 조직학적 분석
적출한 간은 지방조직은 10% formalin액에서 고정시킨 검체를 절취하여(trimming) 다시 10% formalin액으로 후 고정시켰다. 이 후 파라핀에 포매 후 5 μm의 두께로 절편하여 세절한 다음 hematoxylin-eosin으로 염색하였다. 염색한 간과 지방 조직은 광학현미경인 Olympus BX50 F4 (Olympus, Japan)를 이용하여 관찰 및 촬영하였다.
도 3은 고지방식 유도비만 모델의 양춘사 추출물을 투여량에 따른 간내 지방조직을 관찰한 도면이다.
도 4는 고지방식 유도비만 모델의 양춘사 추출물을 투여량에 따른 지방의 조직변화를 관찰한 도면이다.
그 결과 양춘사 추출물의 투여량이 증가함에 따라 간 내 지방이 감소하였으며, 지방조직의 크기가 감소하는 것을 확인 할 수 있었다.
6) Total RNA 분리
실험이 끝난 후 적출된 간과 지방조직으로부터 total RNA의 분리는 Trizol reagent (Life Technologies, UK)를 이용하여 제조회사가 제공하는 방법에 따라 수행하였다.
각각의 조직을 잘게 자른 후 1000 μl RNAzol B로 용해시킨 후 200 μl chloroform을 첨가하여 얼음 속 에서 5분 반응시켰다. 반응이 끝난 후 4℃에서 13,000 rpm으로 20분 원심분리하여 상층액 500 μl을 새로운 tube에 옮겼다.
위 상층액에 동량의 isopropanol을 첨가하여 섞은 후 얼음에서 30분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 4℃에서 13,000 rpm으로 20분 원심분리하고 침전물을 75% EtOH로 2번 세척하였다. 세척된 RNA를 건조시킨 후 DEPC water 20 μl로 녹이고 분광광도계에서 흡광도를 측정하여 정량하였다.
7) 실시간 역전사 효소 중합반응 (Real Time PCR)
역전사 반응 (reverse transcription reaction)은 2 μg total RNA와 Prime Script TM reagent kit (perfect realtime)(TaKaRa BIOINC.)를 이용하여 제조회사에서 제공하는 방법에 따라 수행하였다.
역전사 반응은 total RNA (2 μg), oligo d(T)primer (25pmol), PrimeScript RT enzyme Mix I, 5X primeScript Buffer가 함유된 반응액으로 37℃에서 15분, 85℃에서 5시간 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다.
실시간 역전사 효소 중합 반응은 10배 희석한 cDNA에 Power SYBY Green PCR Master Mix를 이용하여 수행하였다. 발현된 각각 유전자의 mRNA양은 LightCycler System software (Roche)를 이용하여 GAPDH에 대한 상대적인 양으로서 계산하였다. 사용된 primer의 sequence는 표 1에 나타내었다.
Sequences and Accession Numbers for Primer, Forward and Reverse, Used in Real-Time PCR.
Gene Sequence for Primers Accession no.
GAPDH Forward: CGTCCCGTAGACAAAATGGTReverse: TTGATGGCAACAATCTCCAC NM_008084
FAS Forward: GCG ATG AAG AGC ATG GTT TAG Reverse: GGC TCA AGG GTT CCA TGT T NM_007988
SREBP1 Forward: GGA GCC ATG GAT TGC ACA TTReverse: GGC CCG GGA AGT CAC TGT NM_011480
Adiponectin Forward: ACG TCA TCT TCG GCA TGA CTReverse: CTC TAA AGA TTG TCA GTG GAT CTG NM_009605
TNFα Forward: AGG GTC TGG GCC ATA GAA CT Reverse: CCA CCA CGC TCT TCT GTC TAC NM_013693
PPARγ Forward: GAAAGACAACGGACAAATCACCReverse: GGGGGTGATATGTTTGAACTTG NM_011146
C/EBPα Forward: TTGTTTGGCTTTATCTCGGCReverse: CCAAGAAGTCGGTGGACAAG NM_007678
도 6은 고지방식 유도비만 모델의 양춘사 추출물을 투여량에 따른 PPARγ와 C/EBPα 발현량을 확인한 그래프이다.
도 7은 고지방식 유도비만 모델의 양춘사 추출물을 투여량에 따른 FAS와 SREBP1 mRNA 발현량을 확인한 그래프이다.
도 8은 고지방식 유도비만 모델의 양춘사 추출물을 투여량에 따른 TNFα와 Adiponectin 발현량을 확인한 그래프이다.
그 결과 고지방식로 인한 유도 비만 마우스에서 양춘사 추출물을 투여량에 따라 PPARγ(peroxisome proliferators- activated receptror γ), C/EBPα(CCAAT/enhancer binding protein α),FAS(fatty acid synthase), SREBP1(sterol regulatory element-binding protein 1), TNFα(tumor necrosis factor α)와 Adiponectin mRNA 의 발현을 억제하는 것을 확인할 수 있으며, 이는 지방세포 분화 및 발현 및 지방간 발현을 억제 할 것으로 예측된다.
고지방식로 인한 유도 비만 마우스에서 중성지방의 함량을 억제하며, 마우스에서 PPARγ(peroxisome proliferators- activated receptror γ), C/EBPα(CCAAT/enhancer binding protein α),FAS(fatty acid synthase), SREBP1(sterol regulatory element-binding protein 1), TNFα(tumor necrosis factor α)와 Adiponectin mRNA 의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 비만 예방, 개선 또는 치료 조성물을 제조할 수 있다.
8) 간 중성지방(liver triglyceride) 분석
간 중성지방 함량은 다음과 같이 측정하였다. 간 조직을 chloroform-methanol solution(2:1, v/v)에서 균질화 하여 1시간 동안 상온에서 반응시킨 후 원심분리 한 후 유기용매층을 24시간 동안 건조하였다. Ethanol에서 용해한 후, 간의 중성지방 함량은 TG kit(AM 157S-K and AM 202-K, Asan Pharmaceutical, Korea)를 이용하여 조사하였고 단백질 농도로 표준화시켰다.
고지방식로 인한 유도 비만 마우스에서 양춘사 추출물을 투여량에 따라 중성지방의 생성을 억제되는 것을 확인할 수 있다.
양춘사 추출물은 고지방식로 인한 유도 비만에 대해 중성지방 억제하므로, 이를 통해 비만 예방, 개선 또는 치료 조성물을 개발하였다.
9) 통계분석
모든 실험 결과는 평균±표준오차(Mean±로 계산하였다. 각 군 간의 통계적 유의성 검정에 따른 통계분석은 ANOVA(one-way analysis of variance test) Duncan 사후검정 비교를 실시하여 p<0.05일 때 유의한 것으로 판정 하였다(SPSS V12., SPSS Inc, Chicago, IL, USA).

Claims (1)

  1. 양춘사 추출물을 유효성분으로 함유하는 고지방식로 인한 비만 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물로써,
    상기 양춘사 추출물은 물로 추출하고, 마우스 경구 투여 기준으로 100 ~ 500mg/kg 포함되며,
    상기 양춘사 추출물은 고지방식로 인한 유도 비만 마우스에서 중성지방의 함량을 억제하며, 마우스에서 PPARγ(peroxisome proliferators- activated receptror γ), C/EBPα(CCAAT/enhancer binding protein α),FAS(fatty acid synthase), SREBP1(sterol regulatory element-binding protein 1), TNFα(tumor necrosis factor α)와 Adiponectin mRNA 의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 고지방식로 인한 비만 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
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