CN116018151A

CN116018151A - 新的普氏粪杆菌eb-fpdk9菌株及其用途

Info

Publication number: CN116018151A
Application number: CN202080102399.8A
Authority: CN
Inventors: 徐在久; 申周玹; 李道卿
Original assignee: Aetna Microbial Technology Co ltd
Current assignee: Aetna Microbial Technology Co ltd
Priority date: 2020-06-24
Filing date: 2020-06-26
Publication date: 2023-04-25
Also published as: WO2021261631A1; KR102169795B1; WO2021261631A8; EP4174166A1; AU2020455122A1; JP7479521B2; CA3181032A1; US20230279341A1; JP2023529702A

Abstract

本发明涉及新的普氏粪杆菌

菌株EB‑FPDK9及其用途，其中当摄入包含选自以下的一种或更多种的组合物时具有预防、减轻和治疗炎性疾病、肝病或代谢性疾病的作用：普氏粪杆菌(F.prausnitzii)EB‑FPDK9、所述菌株的培养液、裂解物或提取物。

Description

新的普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株及其用途

技术领域

本公开内容涉及新的普氏粪杆菌

(Faecalibacterium prausnitzii)菌株EB-FPDK9及其用途。

背景技术

益生菌是指在体内表现出有益作用的所有细菌，包括乳酸菌，并且参与针对肠病和免疫疾病的多种身体功能。一时间，当作为益生菌的食物的膳食纤维(即益生元)与益生菌一起服用时效果更好的研究引起了关注。近来，作为由益生菌释放的代谢物的后生元(postbiotics)作为治疗剂或用于诊断疾病是有效的主张引起了关注，并且药用益生菌(pharmabiotics)也引起了关注。“药用益生菌”是“药用”意义的药物和“益生菌”意义的活菌的复合词，是指可用于疾病护理医学目的的人微生物组，并且包括益生菌和后生元二者。

同时，粪杆菌属(Faecalibacterium)细菌为常存在于肠黏液层中的专性厌氧杆菌，并且其在人中的保留率和数目均很高。另外，这些细菌是肠菌群的主要成分。

在此背景下，本发明人努力开发能够使用对人体无害的菌株来治愈疾病的技术，并且作为结果，鉴定了表现出优异的抗炎作用和脂质积聚抑制作用的普氏粪杆菌菌株，并且发现所鉴定菌株适合于治疗肝病和结肠炎，从而完成了本公开内容。

发明内容

技术问题

本公开内容的一个目的是提供普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株(登记号：KCCM12620P)。

本公开内容的另一个目的是提供用于预防或治疗炎性疾病、肝病或代谢性疾病的药物组合物，该药物组合物包含选自以下的至少一种：普氏粪杆菌(F.prausnitzii)EB-FPDK9菌株、普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株的培养物、该菌株的裂解物和该菌株的提取物。

本公开内容的又一个目的是提供用于预防或减轻炎性疾病、肝病或代谢性疾病的食品组合物，该食品组合物包含选自以下的至少一种：普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株、普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株的培养物、该菌株的裂解物和该菌株的提取物。

技术方案

本公开内容的一个方面提供了普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株(登记号：KCCM12620P)。

在本公开内容的一个实施方案中，普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株具有SEQ ID NO:1的16S rRNA序列。

本公开内容的另一个方面提供了用于预防或治疗炎性疾病的药物组合物，该药物组合物包含选自以下的至少一种：普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株、普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株的培养物、该菌株的裂解物和该菌株的提取物。

本公开内容的又一个方面提供了用于预防或治疗肝病的药物组合物，该药物组合物包含选自以下的至少一种：普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株、普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株的培养物、该菌株的裂解物和该菌株的提取物。

本公开内容的又一个方面提供了用于预防或治疗代谢性疾病的药物组合物，该药物组合物包含选自以下的至少一种：普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株、普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株的培养物、该菌株的裂解物和该菌株的提取物。

本公开内容的又一个方面提供了用于预防或减轻炎性疾病的食品组合物，该食品组合物包含选自以下的至少一种：普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株、普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株的培养物、该菌株的裂解物和该菌株的提取物。

本公开内容的另一个方面提供了用于预防或减轻肝病的食品组合物，该食品组合物包含选自以下的至少一种：普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株、普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株的培养物、该菌株的裂解物和该菌株的提取物。

本公开内容的又一个方面提供了用于预防或减轻代谢性疾病的食品组合物，该食品组合物包含选自以下的至少一种：普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株、普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株的培养物、该菌株的裂解物和该菌株的提取物。

根据本公开内容的一个实施方案，食品组合物可以以健康功能性食品的形式制备。

根据本公开内容的一个实施方案，食品组合物可以以益生菌制剂的形式制备。

有益效果

施用包含选自以下的至少一种的组合物具有预防、减轻或治疗炎性疾病、肝病或代谢性疾病的作用：普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株、普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株的培养物、该菌株的裂解物和该菌株的提取物。

附图说明

图1示出了普氏粪杆菌标准菌株和EB-FPDK9的显微观察。

图2示出了在用FP特异性引物对普氏粪杆菌标准菌株和EB-FPDK9进行PCR之后进行的电泳的结果。

图3示出了在用ERIC-1、ERIC-2和(GTG)₅引物对普氏粪杆菌标准菌株和EB-FPDK9进行PCR之后进行的电泳的结果。

图4是使用普氏粪杆菌EB-FPDK9的16rRNA核苷酸序列制备的系统发育树。

图5示出了检查普氏粪杆菌标准菌株和EB-FPDK9是否引起溶血的结果。

图6是示出了在普氏粪杆菌标准菌株和EB-FPDK9中分析短链脂肪酸的结果的图。

图7是示出了在普氏粪杆菌标准菌株和EB-FPDK9各自中分析炎性细胞因子IL-8的mRNA表达的结果的图。

图8是示出了在普氏粪杆菌标准菌株和EB-FPDK9各自中分析炎性细胞因子IL-10的浓度的结果的图。

图9示出了显示检查普氏粪杆菌标准菌株和EB-FPDK9各自对脂质积聚的抑制程度的结果的照片和图。

图10示出了显示检查普氏粪杆菌标准菌株和EB-FPDK9各自的培养物对脂质积聚的抑制程度的结果的照片和图。

图11示出了显示在用普氏粪杆菌标准菌株和EB-FPDK9各自处理之后在诱导脂肪生成之后比较和分析参与脂肪细胞分化的基因的表达水平的结果的图。

图12示出了在非酒精性脂肪性肝炎诱导小鼠中比较普氏粪杆菌标准菌株施用小鼠与EB-FPDK9菌株施用小鼠之间的体重和饮食摄入的图。

图13示出了在非酒精性脂肪性肝炎诱导小鼠中比较普氏粪杆菌标准菌株施用小鼠与EB-FPDK9菌株施用小鼠之间的葡萄糖耐量的图。

图14是在非酒精性脂肪性肝炎诱导小鼠中比较普氏粪杆菌标准菌株施用小鼠与EB-FPDK9菌株施用小鼠之间的肝重量和形状的图。

图15是在非酒精性脂肪性肝炎诱导小鼠中比较普氏粪杆菌标准菌株施用小鼠与EB-FPDK9菌株施用小鼠之间的脾重量和形状的图。

图16示出了在非酒精性脂肪性肝炎诱导小鼠中分析和比较普氏粪杆菌标准菌株施用小鼠和EB-FPDK9菌株施用小鼠的血脂生化指标的结果。

图17示出了在非酒精性脂肪性肝炎诱导小鼠中通过对普氏粪杆菌标准菌株施用小鼠和EB-FPDK9菌株施用小鼠的肝进行H&E染色来确定脂肪滴形成的结果。

图18示出了在非酒精性脂肪性肝炎诱导小鼠中比较普氏粪杆菌标准菌株施用小鼠与EB-FPDK9菌株施用小鼠之间的胶原沉积的结果。

图19示出了在非酒精性脂肪性肝炎诱导小鼠中通过观察肝中α-SMA表达来比较普氏粪杆菌标准菌株施用小鼠与EB-FPDK9菌株施用小鼠之间的肝损伤程度的结果。

图20示出了在非酒精性脂肪性肝炎诱导小鼠中比较普氏粪杆菌标准菌株施用小鼠与EB-FPDK9菌株施用小鼠之间的肝甘油三酯和总胆固醇水平的结果。

具体实施方式

为了实现上述目的，本公开内容的一个方面提供了普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株(登记号：KCCM12620P)。

普氏粪杆菌是在构成人肠道菌群的细菌中最丰富的细菌之一，并且是非运动性厚壁菌(Firmicute)。普氏粪杆菌的特征在于其对氧极其敏感，并因此即使在存在极少量氧的情况下也不生长。

本文中使用的术语“培养物”可指在培养完成之后获得的组合物。更具体地，培养基可以包含或可以不包含细胞。因此，培养物可包括培养物上清液、从中去除培养物上清液的组合物或通过将其浓缩而获得的组合物。除了培养普氏粪杆菌必需的常规组分之外，培养物组合物还可包含协同作用于普氏粪杆菌生长的组分，并且本领域技术人员可容易地选择包含这些组分的组合物。

另外，菌株可以为液体状态或干燥状态，并且用于菌株的干燥方法的一些实例包括但不限于风干、自然干燥、喷雾干燥和冷冻干燥。

本文中使用的术语“炎性疾病”是具有炎症作为主要病变的疾病的通用术语。例如，炎性疾病可以是选自以下的任一种：炎性皮肤病、炎性肠病例如克罗恩病(Crohn’sdisease)和溃疡性结肠炎、肝炎、腹膜炎、骨髓炎、蜂窝织炎、脑膜炎、脑炎、胰腺炎、囊性纤维化、卒中、急性支气管炎、支气管炎、关节炎、关节细胞动脉炎、血色素沉着病、镰状细胞贫血症和其他血红蛋白病，以及脓毒症，并且可优选地是炎性皮肤病、结肠炎、慢性支气管炎、肝炎或骨关节炎，但不限于此。

肝病可以是肝纤维化或肝硬化、急性或慢性肝炎、脂肪肝或肝癌，并且可优选地是脂肪肝或肝炎，更优选地是非酒精性脂肪性肝炎，但不限于此。

在本公开内容中，预防或治疗肝病可指抑制肝重量异常提高，以及可指抑制脾长度和重量异常提高。另外，其可指控制甘油三酯、胆固醇、GOT或GPT的浓度或者抑制该浓度异常提高，以及抑制肝细胞中脂肪滴形成、肝纤维化以及α-SMA表达。然而，药物组合物的预防性和治疗性作用不限于此。

代谢性疾病可以是高脂血症、糖尿病、痛风、痴呆、肥胖、高血压、低血糖症、高胆固醇血症、血色素沉着病、淀粉样变性或卟啉症。糖尿病可包括1型糖尿病和2型糖尿病。优选地，代谢性疾病可以是肥胖，但不限于此。

本公开内容中使用的药物组合物应以药物有效量使用。本文中使用的术语“药物有效量”是指足以以适用于任何医学治疗的合理的益处/风险比治疗疾病的量。药物组合物的有效剂量水平可基于包括以下的因素来确定：对象类型、疾病严重程度、年龄和性别、所感染病毒的类型、药物活性、对药物的敏感性、施用时间、施用途径、排泄率、治疗持续时间和与组合物组合使用的药物，以及医学领域中公知的其他因素。如本领域技术人员所理解的，有效量可基于治疗途径、赋形剂使用和与其他药物一起使用的潜能而变化。

本公开内容的药物组合物可使用本领域公知的方法制备成药物剂型，以便在施用于哺乳动物之后提供对活性成分的快速、持续或延迟的释放。在剂型的制备中，将活性成分优选地与载体混合或用载体稀释或者包封到容器形式的载体中。

因此，本公开内容的药物组合物可根据常规方法配制成用于经口剂型，例如散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂或气雾剂，或外用制剂和贴剂的形式，并且还可包含通常用于制备组合物的合适的载体、赋形剂或稀释剂。

可包含在本公开内容的药物组合物中的载体、赋形剂和稀释剂的一些实例包括但不限于乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。可使用通常使用的稀释剂或赋形剂，例如填充剂、增量剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂和表面活性剂来制备制剂。

在本公开内容中，食品组合物可以以多种形式使用，包括丸剂、散剂、颗粒剂、针剂(needle)、片剂、胶囊剂或液体剂和溶液剂，并且本公开内容的食品组合物可添加至例如多种食品，例如饮料、口香糖、茶、维生素复合物和健康补充食品。

除了本公开内容的食品组合物包含作为必需成分的普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株、普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株的培养物、该菌株的裂解物、或该菌株的提取物、或其活性成分或其生理学上可接受的盐之外，对其他成分没有特别限制。类似于普通食品，食品组合物可包含多种草本提取物、食品补充添加剂或天然碳水化合物作为另外的成分。

另外，食品组合物还可包含如上提及的食品补充添加剂，并且食品补充添加剂可以是本领域已知的常规食品补充添加剂，并且其实例包括矫味剂、着色剂、填充剂和稳定剂。

天然碳水化合物的一些实例包括单糖例如葡萄糖和果糖、二糖例如麦芽糖和蔗糖、多糖例如糊精和环糊精、以及糖醇例如木糖醇、山梨糖醇和赤藓糖醇。除了上述成分之外，天然矫味剂(例如，莱鲍迪苷A、甘草皂苷等)或合成矫味剂(糖精、阿斯巴甜等)也可适当地用作矫味剂。

除了上述成分之外，本公开内容的食品组合物还可包含多种营养素、维生素、矿物质(电解质)、矫味剂例如合成矫味剂和天然矫味剂、着色剂和填充剂(例如奶酪或巧克力)、果胶酸及其盐、藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇、碳酸饮料中使用的碳化剂等。另外，食品组合物可包含用于产生果汁饮料和蔬菜饮料的天然果汁和果肉。这些成分可单独地或组合使用。

根据本公开内容的一个实施方案，食品组合物可以以健康功能性食品的形式制备。本文中使用的术语“健康功能性食品”与“用于特殊健康用途的食品(food for specialhealth use，FoSHU)”具有相同含义，并且意指具有高药学和医学作用的食品，其经加工以有效地除营养供应之外还发挥生物调节功能。在此，“功能性食品”意指获得可用于健康应用的效果，例如对人体的结构和功能的营养控制或生理作用。本公开内容的食品可通过本领域常用的方法来制备，并且可通过添加本领域常用的原料和成分来制备。另外，还可以不受限制地制备该食品的任何制剂，只要其是作为食品可接受的即可。可将本公开内容的食品组合物制备成多种类型的制剂，并且由于其不同于一般药物包含食品作为原料，因此具有免于发生在长期施用药物时可能发生的副作用的优点。另外，由于其优异的可携性，本公开内容的食品组合物可作为补充剂携带以用于增强预防或减轻炎性疾病、肝病或代谢性疾病的作用。

益生菌制剂可根据本领域已知的多种方法以多种剂型来制备和施用。例如，本公开内容的普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株、其培养物或培养物的浓缩物或干燥产物可通过与药物领域中常用的载体混合以散剂、液体剂和溶液剂、片剂、胶囊剂、糖浆剂、混悬剂或颗粒剂的形式来制备和施用。载体的一些实例包括但不限于黏合剂、润滑剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、助悬剂、着色剂和矫味剂。另外，益生菌制剂的施用剂量可基于活性成分的体内吸收率、失活率和排泄率、对象的年龄、性别、类型、病症和疾病严重程度等适当地选择。

实施例

在下文中，将参考实施例更详细地描述一个或更多个实施方案。然而，这些实施例用于举例说明一个或更多个实施方案，并且本公开内容的范围不限于这些实施例。

实施例1：普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株的分离和鉴定

1.1.普氏粪杆菌样品的获得和分离

为了从健康韩国人(女性，9岁，BMI 15.5)的粪便中分离出普氏粪杆菌，根据Martin方法，使用YBHI培养基[补充有0.5％w/v酵母提取物(Difco)、0.1％w/v D-纤维二糖和0.1％w/v D-麦芽糖的脑心浸液培养基]培养粪便，并随后选择极端氧敏感(extremelyoxygen sensitive，EOS)菌株并将其分离。

1.2.显微观察

为了确定分离的菌株是否是普氏粪杆菌菌株，在显微镜下观察分离的菌株。作为结果，如图1中所示，确定了在1,000x放大率下观察到的作为标准菌株的普氏粪杆菌DSM17677^T菌株(图1A)和普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株(图1B)二者均具有直或弯曲的杆状细胞形状，并因此显示出相似的形状。

1.3.PCR分析

为了确定分离的菌株是否是普氏粪杆菌菌株，使用下表1中所示的FP特异性引物(SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3)对分离的菌株进行PCR分析。作为结果，如图2中所示，可确定分离的菌株显示出类似于作为阳性对照菌株的普氏粪杆菌DSM17677^T的条带。

[表1]

1.4.随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)分析

为了检查如上所述分离的菌株是否与同一物种的先前报道的标准菌株不同，进行了随机扩增多态性DNA(RAPD)分析(一种分子分型)。为此，使用下表2中所示的通用引物(SEQ ID NO:4至SEQ ID NO:6)扩增从细胞中提取的基因组DNA(genomic DNA，gDNA)，并随后在1％琼脂糖凝胶上电泳90分钟。然后，如图3中所示，使用UV透照器比较DNA片段图案。

[表2]

SEQ ID NO	名称	方向	序列(5’→3’)
				SEQ ID NO:4	ERIC-1	正向	ATG TAA GCT CCT GGG GAT TCA C
SEQ ID NO:5	ERIC-2	反向	AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G
				SEQ ID NO:6	<![CDATA[(GTG)<sub>5</sub>]]>	正向/反向	GTG GTG GTG GTG GTG

如图3中所示，作为比较DNA片段图案的结果，可确定普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株显示出部分类似于但不同于标准菌株普氏粪杆菌DSM17677^T的条带图案。因此确定了该分离的菌株与已报道的标准菌株普氏粪杆菌DSM 17677^T属于同一物种，但是是与其不同的菌株。

1.5.16S rRNA BLAST

为了确定分离的菌株是否为普氏粪杆菌菌株，对分离的菌株进行16SrRNA测序，并随后通过BLAST进行分析。作为结果，分离的菌株与普氏粪杆菌物种具有99％或更高的同一性。基于这些结果，将分离的菌株命名为普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株，并以登记号KCCM12620P保藏在韩国微生物保藏中心(Korean Culture Center of Microorganisms，KCCM)。

1.6.使用16s rRNA核苷酸序列进行的系统发育树分析

作为菌株鉴定的结果，存在类似于目前已知菌株的菌株，但未获得完全一致的结果。因此，进行了系统发育树分析。对于分离的普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株的全长16S rRNA基因测序，使用下表3中所示的引物27F(SEQ ID NO:7)和1492R(SEQ ID NO:8)扩增了16SrRNA基因，并随后使用3730xl DNA分析仪(Thermo Fisher Scientific，USA)确定了其核苷酸序列。使用EB-FPDK9菌株和标准菌株的所获得的16S rRNA基因序列，以及同一物种的另外菌株的先前公开的16S rRNA基因序列，根据最大似然法制作了图4中所示的系统发育树。

[表3]

实施例2：普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株的表征

2.1.抗微生物敏感性检查

为了检查普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株的抗微生物敏感性，根据临床和实验室标准协会(Clinical&Laboratory Standard Institute，CLSI)指南的液体培养基微稀释法，检查用于厌氧微生物的抗微生物剂哌拉西林-他唑巴坦(piperacillin-tazobactam)、头孢唑肟(ceftizoxime)、氯霉素(chloramphenicol)、克林霉素(clindamycin)、美罗培南(meropenem)、莫西沙星(moxifloxacin)、甲硝唑(metronidazole)和环丙沙星(ciprofloxacin)各自针对普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株的最低抑制浓度(minimuminhibitory concentration，MIC)。

[表4]

作为结果，从上表4中可以看出，本公开内容的普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株显示出对头孢唑肟(CTZ)、氯霉素(CHL)、美罗培南(MEM)和基于氟喹诺酮的抗生素莫西沙星(MXF)和环丙沙星(CIP)的抗性，并对哌拉西林-他唑巴坦(PTZ)、克林霉素(CLI)和甲硝唑(MTZ)显示出敏感性。对于抗生素哌拉西林-他唑巴坦(PTZ)，普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株显示出与标准菌株(DSM 17677^T)的显著差异。

2.2.溶血活性的评价

为了验证普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株的安全性，对该菌株是否具有溶血活性进行评价。为此，使用通过向YBHI培养基[补充有0.5％w/v酵母提取物(Difco)、0.1％w/v D-纤维二糖和0.1％w/v D-麦芽糖的脑心浸液培养基)添加1.5％w/v细菌-琼脂(bacto-agar)和5％w/v去纤维蛋白绵羊血液制备的血液琼脂培养基来培养该菌株，并随后对菌落周围是否会发生溶血进行观察。作为阳性对照，使用引起β-溶血的酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)ATCC 19615用于比较。

作为结果，如图5中所示，本公开内容的普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株和标准菌株DSM17677^T二者在菌落周围均未显示出透明区，表明这些菌株不引起与致病性相关的β-溶血。

2.3.功能性代谢物(短链脂肪酸)分析

为了分析分离的普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株中的功能性代谢物，通过气相色谱来分析该菌株的培养物中短链脂肪酸(short chain fatty acid，SCFA)的含量。为此，将该菌株在YBHI培养基[补充有0.5％w/v酵母提取物(Difco)、0.1％w/v D-纤维二糖和0.1％w/v D-麦芽糖的脑心浸液培养基)中培养24小时，并随后以12,000xg离心5分钟。收集上清液，通过0.2μm注射器式滤器进行过滤，并随后用于分析。使用配备有FFAP柱(30m×0.320mm，0.25μm相)的气相色谱(Agilent 7890N)在下表5中所示的条件下进行分析。

[表5]

作为分析功能性短链脂肪酸的结果，如从图6中的图看出的，确定了普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株消耗乙酸并产生丁酸。

实施例3：普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株的抗炎作用的评价

3.1.HT-29肠上皮细胞中抗炎作用的评价

由于细胞因子参与炎性肠病中炎性应答的调节，因此施用普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株并检查细胞因子基因表达的变化。为了通过体外实验来评价抗炎作用，培养作为人结肠上皮细胞的HT-29细胞(

HTB-38^TM，USA)。使用补充有10％FBS(胎牛血清，Hyclone，USA)和10μg/ml庆大霉素的McCoy’s 5A改良培养基(Gibco，USA)作为基础培养基，将细胞在培养箱(NUAIRE，USA)中在37℃下在5％CO₂下培养。为了确定普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株在HT-29细胞中是否抑制LPS诱导的炎性细胞因子IL-8基因表达，使用下表6中所示的引物(SEQ ID NO:9至12)进行实时PCR。

[表6]

SEQ ID NO	靶标	引物序列
			SEQ ID NO:9	GAPDH	F:5'-GAC ATC AAG AAG GTG GTG AAG CAG-3'
SEQ ID NO:10	GAPDH	R:5'-ATA CCA GGA AAT GAG CTT GAC AAA-3'
			SEQ ID NO:11	IL-8	F:5'-TTT TGC CAA GGA GTG CTA AAG A-3'
SEQ ID NO:12	IL-8	R:5'-AAC CCT CTG CAC CCA GTT TTC-3'

使用TRI试剂(Sigma，USA)提取总RNA，并且对于cDNA合成，通过M-MLV cDNA合成试剂盒(Enzynomics，Korea)将1μg RNA合成为cDNA。使用Quant Studio 3实时PCR系统(Applied Biosystems，USA)进行实时PCR。

使用SYBR Green TOPrealTM qPCR 2X PreMIX(Enzynomics，Korea)分析炎性细胞因子基因的表达，并使用GAPDH作为内标。在以下条件下进行PCR：在50℃下预孵育4分钟和在95℃下预孵育10分钟，以及40个循环，每个循环由95℃持续15秒和60℃持续1分钟组成。通过ΔCT方法使用QuantStudio Design&Analysis Software v1.4.3中内置的程序分析数据。

使用统计学程序GraphPad Prism 7(GraphPad software Inc.，USA)将所有实验中获得的结果作为每个实验组的平均值和标准偏差计算，并使用单因素ANOVA、图基检验(Tukey’s test)分析组间差异。p值≤0.05被认为是显著的。在一些结果中，计算了AUC(曲线下面积(area under curve))。

作为结果，如图7中所示，当将HT-29细胞用单独的LPS(100μg/ml)处理6小时时，细胞中代表性炎性细胞因子IL-8的表达与正常组中的IL-8表达相比显著提高。然而，显示在用LPS和普氏粪杆菌A2-165标准菌株的培养物(10％，v/v)一起处理的组中的IL-8表达与经LPS处理组中的IL-8表达相比降低，并且在用LPS和普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株的培养物一起处理的组中的IL-8表达与用LPS和A2-165标准菌株处理的组中的IL-8表达相比进一步显著降低。因此，确定了普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株的培养物显著降低了炎性细胞因子IL-8。

3.2.小鼠骨髓来源树突细胞中抗炎作用的评价

为了观察抗炎应答，分析了来自树突细胞(Dendritic Cells,DC)的细胞因子分泌。为了使用小鼠骨髓来源树突细胞(bone marrow-derived dendritic cell，BMDC)评价菌株的抗炎作用，分离BMDC。在使用18G针刺穿0.5ml微管之后，分离6周龄C57BL/6小鼠的股骨和胫骨，并将其置于1.5ml沉淀管中，并随后以10,000xg离心15秒。将1.5ml沉淀管中的沉淀用PBS洗涤3次，并随后将沉淀添加至RPMI-1640(10％ FBS、1％P/S、培养基、1X巯基乙醇、20μg GM-CSF)培养基并且在150mm培养皿中培养。第二天，将BMDC转移到100ml培养皿中并在其中培养，并且在第5天，将10ml培养物转移到15ml锥形管中，并随后以1,000xg离心15分钟。去除上清液，并向BMDC添加10ml BMDC培养基并将其置于培养皿中。在第6天或第7天，将BMDC用于实验。为了评价普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株的抗炎作用，通过mIL-10ELISA(Invitrogen，USA)分析了代表性抗炎细胞因子IL-10的分泌。

将BMDC用LPS(100μg/ml)、大肠杆菌、普氏粪杆菌A2-165标准菌株和EB-FPDK9菌株(10⁷cfu/ml，10％v/v)中的每一种在无抗生素培养基中处理1小时，并随后将培养基更换为包含青霉素/链霉素抗生素的培养基。接下来，将细胞培养24小时，并以1,000xg离心培养基。使用上清液通过ELISA测量IL-10的分泌。

如图8中所示，来自用LPS和大肠杆菌中每一种处理的细胞的IL-10分泌类似于来自正常组的IL-10分泌，没有差异。然而，与正常组相比，用普氏粪杆菌A2-165标准菌株处理的组显示出IL-10分泌显著提高。用普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株处理的组中的IL-10表达与用A2-165标准菌株处理的组中的IL-10表达相比进一步提高至显著水平。因此，确定了普氏粪杆菌菌株提高了抗炎细胞因子IL-10以及普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株进一步提高了抗炎细胞因子IL-10。

实施例4：脂质积聚抑制作用的评价

对脂质积聚-和肥胖-相关生物标志物的表达是否受到施用本公开内容菌株的影响进行了检查。

4.1.分化脂肪细胞的油红-O染色

为了检查本公开内容的普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株对来自3T3-L1细胞的脂肪细胞分化和脂肪生成的作用，进行了油红-O(Oil Red-O，ORO)染色实验。首先，为了使3T3-L1前脂肪细胞分化为脂肪细胞，将细胞以2×10⁴/孔的密度分配在24孔板中。将细胞在含10％FBS的DMEM培养基中培养4天。当细胞在板中达到饱和状态时，将培养基更换为分化培养基[DMEM、10％FBS、0.5mM IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，Sigma I5879)、1μM地塞米松(dexamethasone)(Sigma D4902，FW392.5)、10mg/ml胰岛素]，将细胞用50μl(1×10⁷个细胞/孔)的样品(普氏粪杆菌菌株或其培养物)进行处理，并随后在37℃下在5％CO₂下培养2天。此后，每两天将培养基更换为胰岛素培养基(10％FBS，10mg/ml胰岛素)，并将细胞在相同条件下培养8天。每当更换培养基时，同时用普氏粪杆菌菌株及其培养物处理细胞。用浓度为10％v/v的菌株及其培养物(10⁷cfu/ml)处理细胞。

油红-O染色法是用油红-O试剂对分化的3T3-L1细胞进行染色以测量细胞中产生的脂肪的方法。培养作为小鼠前脂肪细胞的3T3-L1细胞(Korea Cell Line Bank，Korea)。使用补充有10％FBS(胎牛血清，Hyclone，USA)和1％青霉素/链霉素的DMEM(Dulbecco改良Eagle培养基，Welgene，Korea)作为基础培养基，将细胞在5％CO₂培养箱(NUAIRE，USA)中在37℃下进行培养。在通过胰岛素(1μg/ml)、IBMX(0.5mM)和地塞米松(1μM)将自前脂肪细胞3T3-L1的脂肪细胞分化诱导10天之后，通过用PBS洗涤3次去除培养基，并向细胞添加10％福尔马林(Sigma，USA)，然后使所述细胞与油红-O(Oil red O，Sigma，USA)溶液反应1小时，并用蒸馏水洗涤，从而染色脂肪滴。

在完成细胞染色之后，将细胞用40％异丙醇(Duksan，Korea)洗涤3次，并干燥，并用光学显微镜观察细胞中脂肪滴的尺寸。通过向其中添加异丙醇来熔化用油红-O溶液染色的脂肪滴样品，并使用分光光度计(Epoch，BioTek，USA)测量500nm处的吸光度，结果示于图9和10中。

如图9中所示，作为在细胞分化期间用本公开内容的普氏粪杆菌A2-165标准菌株处理3T3-L1细胞的结果，经处理细胞中的脂质积聚与对照组中的脂质积聚相比受到抑制。确定了用普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株处理与用普氏粪杆菌A2-165标准菌株处理的组中相比更显著地抑制了脂质积聚。

类似地，如图10中所示，作为在细胞分化期间用普氏粪杆菌A2-165标准菌株的培养物处理3T3-L1细胞的结果，经处理细胞中的脂质积聚与对照组中的脂质积聚相比被显著抑制。用普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株的培养物处理与用普氏粪杆菌A2-165标准菌株的培养物处理的组中相比更显著地抑制了脂质积聚。

确定了与普氏粪杆菌A2-165标准菌株及其培养物相比，普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株及其培养物对抑制3T3-L1细胞的成脂分化具有更好的作用。

4.2.针对生物标志物基因表达的作用的评价

为了评价菌株对抑制脂肪细胞分化的作用，通过使用下表7中所示的基因特异性引物(SEQ ID NO:13至26)进行实时PCR来分析在脂肪细胞分化阶段参与脂肪细胞分化和成熟的转录因子C/EBPα(CCAAT/增强子结合蛋白α)和SREBP1c(固醇调节元件结合蛋白1c)以及脂肪生成基因aP2(脂肪细胞蛋白2)、FAS(脂肪酸合酶(fatty acid synthase))、ACC1(乙酰辅酶A-羧化酶)和LPL(脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase))的mRNA表达水平。

[表7]

具体地，使用TRI试剂(Sigma，USA)根据制造商说明从细胞单层中提取总RNA，并使用M-MLV cDNA合成试剂盒(Enzynomics，Korea)由1μg总RNA合成cDNA。使用Quant Studio 3实时PCR系统(Applied Biosystems，USA)进行PCR反应。在以下条件下进行PCR：在50℃下预孵育4分钟和在95℃下预孵育10分钟，以及40个循环，每个循环由95℃持续15秒和60℃持续1分钟组成。通过ΔCT方法使用QuantStudio Design&Analysis Software v1.4.3中内置的程序分析数据。

如图11中所示，当将在诱导成脂分化之后作为参与脂肪细胞分化的基因的C/EBPa、SREBP1c、aP2、FAS、ACC1和LPL的提高的表达水平表达为100％时，用普氏粪杆菌A2-165标准菌株的培养物处理的组中C/EBPα、aP2、FAS、ACC1和LPL的表达水平降低，并且用普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株的培养物处理的组中C/EBPα、SREBP1c、aP2、FAS、ACC1和LPL的表达水平显著降低。与对照组相比，SREBP1c的表达水平仅在用普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株的培养物处理的组中降低，并且与普氏粪杆菌A2-165标准菌株相比，普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株进一步降低了所有上述基因的表达。确定了普氏粪杆菌A2-165标准菌株和普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株二者均具有在3T3-L1细胞中抑制成脂分化相关基因的表达的作用。

实施例5：针对非酒精性脂肪性肝炎的作用的评价

5.1.非酒精性脂肪性肝炎动物模型的构建

动物实验按照机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care andUse Committee，IACUC)的动物使用和护理方案进行。作为实验动物，购买8周龄雄性C57BL/6小鼠(9只小鼠/组)并使其适应1周。然后，将小鼠培育12周。对于培育环境，使小鼠在恒定温度(22℃)和相对湿度(40％至60％)以及12小时光亮/12小时黑暗周期下适应1周。

为了诱导非酒精性脂肪性肝炎，使小鼠消耗包含作为实验饮食(NASH)的高脂肪饲料(60kcal％脂肪；Research Diets Inc.，NJ，USA)和30％果糖的饮用水16周，并允许其随意获取饮用水。

将实验小鼠随机分成5组，如下表8中所示。

[表8]

在实验组III、IV和V的情况下，自通过实验饮食诱导非酒精性脂肪性肝炎之后8周起，每天经口施用水飞蓟素(30mg/kg)或浓度为1×10⁸CFU/150μl PBS(25％甘油和0.05％半胱氨酸/PBS)的普氏粪杆菌活细胞。

使正常饮食组的小鼠(正常(Normal))消耗10％脂肪饲料。作为阳性对照，施用可帮助减轻非酒精性脂肪肝的被称为功能性原料的水飞蓟素，或普氏粪杆菌A2-165标准菌株。此时，将正常饮食组和实验饮食组每天经口施用相同量的磷酸缓冲盐水(25％甘油和0.05％半胱氨酸/PBS)，以排除由施用引起的应激等影响。

5.2.体重和食物摄入的变化

在进行非酒精性脂肪性肝炎诱导实验之后16周，测量实验组的体重变化，结果示于图12中。

参考图12，患有由实验饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎的所有组动物的体重与正常饮食组的体重相比均提高。当在第8周(当施用水飞蓟素或普氏粪杆菌菌株时)至第16周期间的重量增加作为质量(g)和百分比(％)计算时，观察到与非酒精性脂肪性肝炎诱导组相比，在水飞蓟素施用组和普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株施用组中重量增加略微降低，但没有发现重量增加显著降低。与正常饮食组中相比，在普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株施用组中观察到百分比重量增加是最小的。食物摄入和卡路里摄入在患有由实验饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎的组之间没有显著差异。

5.3.葡萄糖耐量的变化(经口葡萄糖耐量测试(Oral Glucose Tolerance Test，OGTT))

为了评价施用普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株对葡萄糖耐量的作用，在开始实验之后16周，在其中小鼠被禁食18小时的状态下将葡萄糖(2g/kg)经口施用于小鼠。在葡萄糖施用之前立即和在葡萄糖施用之后30、60、90和120分钟从尾静脉收集血液，并用血糖仪测量血糖水平。测量结果示于图13中。

参考图13，在施用组中，在葡萄糖施用之前立即施用普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株的组显示出血糖水平最大降低。在葡萄糖施用之后30分钟，与正常饮食组相比，在所有施用组中血糖水平均提高，但作为计算120分钟内血糖水平的曲线下面积(AUC)的结果，随着时间增加至60分钟、90分钟和120分钟，与非酒精性脂肪性肝炎诱导组相比，在水飞蓟素施用组、普氏粪杆菌A2-165标准菌株施用组和EB-FPDK9菌株施用组中，血糖水平均显著降低。作为该研究的结果，确定了经口施用普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株可提高由非酒精性脂肪性肝炎诱导而降低的血糖控制能力，并且可提高葡萄糖耐量。

5.4.对脂肪性肝炎和组织重量变化的观察

在实验结束时，在用CO₂麻醉下取出肝和脾，用生理盐水洗涤，脱水，并随后称重，并且在视觉上观察其尺寸和颜色。

参考图14，观察到正常饮食组的肝组织显示出亮红色的健康肝形状，而患有由实验饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎的组的肝由于脂质积聚而变得颜色混浊，并失去了原始的亮红色。然而，水飞蓟素施用组、普氏粪杆菌A2-165标准菌株施用组和EB-FPDK9菌株施用组显示出接近于正常饮食组的亮红色肝形状。作为测量肝重量的结果，观察到与正常饮食组相比，非酒精性脂肪性肝炎诱导组和水飞蓟素施用组中每一组中的重量增加。然而，普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株施用组的肝组织重量最类似于正常饮食组的肝组织重量，而确实与非酒精性脂肪性肝炎诱导组的肝组织重量具有显著差异。通过图14中的结果，确定了普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株施用组表现出类似于正常饮食组的那些的肝形状和重量。因此，可得出结论，普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株可减轻非酒精性脂肪性肝炎。

如图15中所示，与正常饮食组相比，在非酒精性脂肪性肝炎诱导组中脾的长度和重量均提高。与肝组织的情况一样，观察到用水飞蓟素和普氏粪杆菌A2-165标准菌株中每一种处理的组的脾长度与正常饮食组的脾长度相比也均提高，但普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株施用组中的脾长度的提高如此之低以至于不显著。确定了脾重量低于非酒精性脂肪性肝炎诱导组的脾重量。

5.5.血脂生化指标的分析

在禁食18小时之后，从每只实验动物收集血液，并随后测量从血液中分离的血清中的作为脂质含量指标的甘油三酯(triglyceride，TG)和总胆固醇(total cholesterol，TC)的浓度，以及作为肝功能指标的谷草转氨酶(glutamic oxaloacetic transaminase，GOT)和谷丙转氨酶(glutamic pyruvic transaminase，GPT)的浓度。测量结果示于图16中。作为脂质组成指标的TG、TC、GOT和GPT的浓度均使用购自Asan Pharmaceutical Co.,Ltd的单独测量试剂盒进行定量。

确定了在非酒精性脂肪性肝炎诱导组中甘油三酯浓度显著提高。然而，与非酒精性脂肪性肝炎诱导组相比，在水飞蓟素施用组和普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株施用组中甘油三酯浓度均显著降低。与正常组相比，在非酒精性脂肪性肝炎诱导组和经普氏粪杆菌A2-165标准菌株处理组中总胆固醇水平更高。然而，与非酒精性脂肪性肝炎诱导组和经普氏粪杆菌A2-165标准菌株处理组相比，在经普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株处理组中总胆固醇水平显著降低。观察到与非酒精性脂肪性肝炎诱导组相比，所有施用组中指示肝细胞损伤程度的GOT浓度均降低，并且仅在水飞蓟素施用组和普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株施用组中GPT浓度显著降低。通过对血脂生化指标的分析，确定了通过施用普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株降低了与非酒精性脂肪性肝炎密切相关的甘油三酯、总胆固醇、GOT和GPT的浓度。

5.6.肝组织中脂肪性肝炎的病理严重程度的分析

为了观察施用普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株对减轻非酒精性脂肪性肝炎的作用，进行了对肝组织切片的苏木精和伊红(hematoxylin&eosin，H&E)染色以及可测量肝纤维化的天狼星红染色(Sirius red staining)，并且通过染色来观察在肝损伤时发生的α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)的表达。将从每只小鼠分离的肝组织切成约5μm的厚度，并随后将其包埋在石蜡中，并通过每次染色来观察形态变化的差异。将通过每次染色观察到的肝损伤程度通过Image J程序表示为百分比阳性区域(％)。

如图17中所示，作为通过H&E染色分析小鼠肝组织的结果，观察到正常组的肝组织没有脂肪滴，因为其肝细胞结构通常是致密的。然而，在非酒精性脂肪性肝炎诱导小鼠的肝组织中，可清楚地观察到与正常组中相比大量脂肪滴形成。观察到与非酒精性脂肪性肝炎诱导组相比，在所有施用组中脂肪滴形成均降低，并且确定了水飞蓟素施用组和普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株施用组中的脂肪滴形成进一步降低。

如图18中所示，通过小鼠肝组织的天狼星红染色来分析沉积的胶原的量。沉积在肝中的胶原的量已知为反映纤维化程度的灵敏指标。在该实验中，与正常组相比，在所有的非酒精性脂肪性肝炎诱导组、水飞蓟素施用组和普氏粪杆菌A2-165标准菌株施用组中肝纤维化均提高。然而，确定了与非酒精性脂肪性肝炎诱导组和普氏粪杆菌A2-165标准菌株施用组相比，在普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株施用组中胶原产生被显著抑制，表明在普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株施用组中，由肝纤维化引起的肝损伤被显著抑制。

另外，作为通过染色观察小鼠肝组织中α-SMA的表达来观察肝损伤程度的结果，如图19中所示，观察到与非酒精性脂肪性肝炎诱导组相比，在所有施用组中α-SMA表达均降低，表明这些组中的肝损伤被抑制。另外，观察到与普氏粪杆菌A2-165标准菌株施用组相比，在水飞蓟素施用组和普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株施用组中α-SMA表达更显著地降低。

5.7.肝组织中甘油三酯和总胆固醇水平的分析

分析了小鼠肝组织中作为脂质提取物的甘油三酯以及总胆固醇。向30mg肝组织添加120μl PBS，并随后使用均质器将其切碎，并随后向其中添加320μl氯仿和160μl MeOH以获得混合物。将混合物在摇动培养箱中于室温下孵育一天，并随后以2,000rpm进行离心，并仅分离上清液并从中蒸发溶剂。此后，将从中已蒸发溶剂的上清液溶解在1ml异丙醇中，并随后使用TG/TC测量试剂盒(Asan Pharmaceutical Co.,Ltd.,Korea)相对于每只小鼠的总肝重量进行定量。

作为结果，如图20的图中所示，确定了在非酒精性脂肪性肝炎诱导组中肝组织中甘油三酯水平显著提高。然而，在水飞蓟素施用组、普氏粪杆菌A2-165标准菌株施用组和普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株施用组中，甘油三酯水平均显著降低。另外，肝组织中总胆固醇水平在非酒精性脂肪性肝炎诱导组中高于在正常组中。然而，与非酒精性脂肪性肝炎诱导组相比，在水飞蓟素施用组、普氏粪杆菌A2-165标准菌株施用组和普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株施用组中，肝组织中总胆固醇水平均显著降低。

作为分析肝组织中脂质积聚的结果，确定了将普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株与水飞蓟素一起施用最显著地抑制了甘油三酯和胆固醇的产生，并且具有减轻非酒精性脂肪性肝炎的作用。

作为分析肝组织的结果，确定了在施用组中，在普氏粪杆菌EB-FPDK9菌株施用组中，最显著地抑制了脂肪性肝炎的进展和由非酒精性脂肪性肝炎诱导的肝损伤。

<110> Enterobiome Co., Ltd

<120> 新的普氏粪杆菌EB-FPDK9及其用途

<130> PN200150

<160> 26

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 1433

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 普氏粪杆菌EB-RPDK9 16S rRNA

<400> 1

gacgaacgct ggcggcgcgc ctaacacatg caagtcgaac gagcgagaga gagcttgctt 60

tctcgagcga gtggcgaacg ggtgagtaac gcgtgaggaa cctgcctcaa agagggggac 120

aacagttgga aacgactgct aataccgcat aagcccacga ctcggcatcg ggtagaggga 180

aaaggagcaa tccgctttga gatggcctcg cgtccgatta gctagttggt gaggtaacgg 240

cccaccaagg cgacgatcgg tagccggact gagaggttga acggccacat tgggactgag 300

acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtggggaata ttgcacaatg ggggaaaccc 360

tgatgcagcg acgccgcgtg gaggaagaag gtcttcggat tgtaaactcc tgttgttgag 420

gaagataatg acggtactca acaaggaagt gacggctaac tacgtgccag cagccgcggt 480

aaaacgtagg tcacaagcgt tgtccggaat tactgggtgt aaagggagcg caggcgggaa 540

gacaagttgg aagtgaaatc catgggctca acccatgaac tgctttcaaa actgtttttc 600

ttgagtagtg cagaggtagg cggaattccc ggtgtagcgg tggaatgcgt agatatcggg 660

aggaacacca gtggcgaagg cggcctactg ggcaccaact gacgctgagg ctcgaaagtg 720

tgggtagcaa acaggattag ataccctggt agtccacact gtaaacgatg attactaggt 780

gttggaggat tgaccccttc agtgccgcag ttaacacaat aagtaatcca cctggggagt 840

acgaccgcaa ggttgaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagca gtggagtatg 900

tggtttaatt cgacgcaacg cgaagaacct taccaagtct tgacatcctg cgacgcacat 960

agaaatatgt gtttccttcg ggacgcagag acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt 1020

gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttatggtca gttactacgc 1080

aagaggactc tggccagact gccgttgaca aaacggagga aggtggggat gacgtcaaat 1140

catcatgccc tttatgactt gggctacaca cgtactacaa tggcgttaaa caaagagaag 1200

caagaccgcg aggtggagca aaactcagaa acaacgtccc agttcggact gcaggctgca 1260

actcgcctgc acgaagtcgg aattgctagt aatcgcagat cagcatgctg cggtgaatac 1320

gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccatgaga gccgggggga cccgaagtcg 1380

gtagtctaac cgcaaggagg acgccgccga aggtaaaact ggtgattggg gtg 1433

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FP1正向

<400> 2

actcaacaag gaagtga 17

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FP2反向

<400> 3

cagaggtagg cggaatt 17

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ERIC-1正向

<400> 4

atgtaagctc ctggggattc ac 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ERIC-2反向

<400> 5

aagtaagtga ctggggtgag cg 22

<210> 6

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> (GTG)5正向/反向

<400> 6

gtggtggtgg tggtg 15

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 27F正向

<400> 7

agagtttgat cmtggctcag 20

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1492R反向

<400> 8

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GAPDH正向

<400> 9

gacatcaaga aggtggtgaa gcag 24

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GAPDH反向

<400> 10

ataccaggaa atgagcttga caaa 24

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IL-8正向

<400> 11

ttttgccaag gagtgctaaa ga 22

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IL-8反向

<400> 12

aaccctctgc acccagtttt c 21

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GAPDH正向

<400> 13

gacatcaaga aggtggtgaa gcag 24

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GAPDH反向

<400> 14

ataccaggaa atgagcttga caaa 24

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> C/EBPa正向

<400> 15

agcaacgagt accgggtacg 20

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> C/EBPa反向

<400> 16

tgtttggctt tatctcggct c 21

<210> 17

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SREBP1c正向

<400> 17

gatgtgcgaa ctggaca 17

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SREBP1c反向

<400> 18

catagggggc gtcaaacag 19

<210> 19

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> aP2正向

<400> 19

agtgaaaact tcgatgatta catgaa 26

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> aP2反向

<400> 20

gcctgccact ttccttgtg 19

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAS正向

<400> 21

aggggtcgac ctggtcctca 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAS反向

<400> 22

gccatgccca gagggtggtt 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ACC1正向

<400> 23

cctccgtcag ctcagataca 20

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ACC1反向

<400> 24

tttactaggt gcaagccaga ca 22

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LPL正向

<400> 25

ttgccctaag gacccctgaa 20

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LPL反向

<400> 26

acagagtctg ctaatccagg aat 23

Claims

1.普氏粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)EB-FPDK9菌株(登记号：KCCM12620P)。

2.用于预防或治疗炎性疾病的药物组合物，所述药物组合物包含选自以下的至少一种：权利要求1所述的菌株、所述菌株的培养物、所述菌株的裂解物和所述菌株的提取物。

3.用于预防或治疗肝病的药物组合物，所述药物组合物包含选自以下的至少一种：权利要求1所述的菌株、所述菌株的培养物、所述菌株的裂解物和所述菌株的提取物。

4.用于预防或治疗代谢性疾病的药物组合物，所述药物组合物包含选自以下的至少一种：权利要求1所述的菌株、所述菌株的培养物、所述菌株的裂解物和所述菌株的提取物。

5.用于预防或减轻炎性疾病的食品组合物，所述食品组合物包含选自以下的至少一种：权利要求1所述的菌株、所述菌株的培养物、所述菌株的裂解物和所述菌株的提取物。

6.用于预防或减轻肝病的食品组合物，所述食品组合物包含选自以下的至少一种：权利要求1所述的菌株、所述菌株的培养物、所述菌株的裂解物和所述菌株的提取物。

7.用于预防或减轻代谢性疾病的食品组合物，所述食品组合物包含选自以下的至少一种：权利要求1所述的菌株、所述菌株的培养物、所述菌株的裂解物和所述菌株的提取物。