WO2018173816A1 - 美白剤 - Google Patents

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WO2018173816A1
WO2018173816A1 PCT/JP2018/009351 JP2018009351W WO2018173816A1 WO 2018173816 A1 WO2018173816 A1 WO 2018173816A1 JP 2018009351 W JP2018009351 W JP 2018009351W WO 2018173816 A1 WO2018173816 A1 WO 2018173816A1
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amino acid
skin
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PCT/JP2018/009351
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瀧野　嘉延
幸聖 唐川
冬美恵 大倉
絵梨 池上
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味の素株式会社
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    • A61Q5/02—Preparations for cleaning the hair

Definitions

  • the present invention relates to a whitening agent.
  • TRP-1 tyrosinase-related protein 1
  • Patent Document 2 It is a kind of carotenoid pigment for the purpose of preventing or reducing UV-induced skin irritation and accompanying skin deterioration by single ingestion using an edible plant-derived extract.
  • An oral skin protective agent using crocetin has been proposed (Patent Document 2).
  • D-alanine and D-hydroxyproline have been reported as D-amino acids that affect proteins present in large amounts in the basement membrane that separates the epidermis and dermis (Patent Document 3).
  • One or more whitening agents selected from hydroquinone glycosides, alkoxysalicylic acid and / or salts thereof, and ⁇ -glycosyl-L-ascorbic acid for the purpose of significantly improving the whitening effect and improving rough skin Skin external preparations containing the above-mentioned betaine derivatives, higher fatty acids, and one or more selected from L-serine, D-serine, DL-serine, alanine, and aminomethylpropanediol. (Patent Document 4).
  • the physiologically active substance having an inhibitory effect on tyrosinase disclosed in Patent Document 1 is obtained by alcohol extraction of Yorca masou and / or Inudouna.
  • the melanin pigment is suppressed by a tyrosinase inhibitory component and an antioxidant component in addition to the MITF inhibitory action. That is, it is recognized that the physiologically active substance having the inhibitory action of tyrosinase disclosed in Patent Document 1 is insufficient in the inhibitory action of tyrosinase gene expression.
  • crocetin disclosed in Patent Document 2 is effective in erythema strength (ie, inflammation due to ultraviolet rays). However, it has not been proved that the effect can be obtained even in a state where melanin such as stains and freckles is deposited.
  • Patent Document 3 discloses that when a D-amino acid compound such as D-aspartic acid is used, the production promoting effect of laminin 332 is not expressed. Moreover, the production promotion of laminin 332 in skin is disclosed, and there is no description or suggestion of a technique for suppressing the production of proteins other than laminin 332.
  • Patent Document 4 uses a specific whitening agent different from D-Ser as an essential component, and neither D-Ser itself has a description or suggestion that it has a whitening effect.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to provide a whitening agent capable of sufficiently suppressing the production of melanin production-related proteins and exhibiting a sufficient whitening effect.
  • the inventors of the present invention have made extensive studies to achieve the above object. As a result, it was found that there is a correlation between the skin condition (for example, melanin index) of the subject and a specific D-amino acid contained in the stratum corneum. Based on such findings, the inventors have considered that specific D-amino acids can suppress the production of melanin production-related proteins such as tyrosinase, tyrosinase-related protein 1, and melanocortin 1 receptor, and reached the present invention. That is, the present invention is as follows.
  • At least one of at least one D-amino acid selected from the group consisting of D-Gln, D-His, and D-Trp, and D-amino acid that is D-Tyr and / or D-Lys The whitening agent according to the above [1] or [2], wherein [4]
  • the active ingredient is at least one D-amino acid selected from the group consisting of D-Leu, D-Phe, D-Ser, and D-Tyr, or D-His and D-Gln,
  • Tyrosinase, tyrosinase-related protein 1, and melanocortin 1 receptor comprising at least one D-amino acid selected from the group consisting of D-Asn, D-Phe, D-Trp, and D-His as an active ingredient
  • a production inhibitor of at least one melanin production-related protein selected from the group consisting of: [6] A skin cosmetic or an external preparation for skin containing the whitening agent according to any one of [1] to [4] above or the production inhibitor of melanin production-related protein according to [5] above.
  • the above further comprising at least one base selected from the group consisting of polyol compounds, surfactants, higher alcohols, thickeners, UV absorbers, UV scattering agents, chelating agents, preservatives, and silicones.
  • the skin cosmetic or external preparation for skin [8] The skin cosmetic or external preparation for skin according to [6] or [7] above, wherein the dosage form is an emulsion, cream, lotion, or gel.
  • the D-amino acid may be D-Asn, D-Val, D-allo-Thr, D-Lys, D-Gln, D-His, D-Leu, D-Phe, D-Pro, D-Ser.
  • the subject is a woman in their 20s or 30s, and the D-amino acid is from D-Lys, D-Gln, D-His, D-Pro, D-Trp, and D-Tyr.
  • the evaluation method according to [13] above which is at least one selected from the group consisting of: [15]
  • the subject is a woman in their 40s or 50s, and the D-amino acid is D-Asn, D-Val, D-allo-Thr, D-Lys, D-Gln, D-His
  • the evaluation method according to [13] above which is at least one selected from the group consisting of D-Leu, D-Phe, D-Ser, D-Trp, and D-Tyr.
  • [17] Selected by the evaluation method according to [16], which is included in the stratum corneum of the skin pigmentation site of the subject before and after the administration of the skin cosmetic, the external preparation for skin, or the active ingredient candidate substances thereof Measuring the amount of D-amino acid constituting the correlation; and A method for evaluating a skin cosmetic or an external preparation for skin, comprising identifying and comparing the appearance of skin before and after administration based on the correlation from the amount of D-amino acid.
  • amino acids are prefixed with a conventional three-letter code (for example, “Asn”, “Gln”) with a configuration such as “L-”, “D-”, “D, L-”. May be expressed.
  • the whitening agent of the present invention has a sufficient whitening effect.
  • FIG. 1 is a graph showing the correlation between the amount of D-Pro in the stratum corneum and the skin melanin index in women in their 20s or 30s.
  • FIG. 2 is a diagram showing the correlation between the amount of D-His in the stratum corneum and the skin melanin index in women in their 40s or 50s.
  • FIG. 3 is a diagram showing the correlation between the amount of D-Lys in the stratum corneum and the L * value of skin in women in their 20s or 30s.
  • FIG. 4 is a diagram showing the correlation between the amount of D-Tyr in the stratum corneum and the skin L * value in women in their 40s or 50s.
  • FIG. 1 is a graph showing the correlation between the amount of D-Pro in the stratum corneum and the skin melanin index in women in their 20s or 30s.
  • FIG. 2 is a diagram showing the correlation between the amount of D-His in the stratum corneum and the skin melanin index in women in
  • FIG. 5 is a graph showing the amount of amplification of melanin production-related protein gene (tyrosinase) of D-Asn (Example 2) (relative to the amount of control amplification).
  • FIG. 6 is a graph showing the amount of amplification of melanin production-related protein gene (tyrosinase-related protein 1) of D-Asn (Example 2) (relative to the amount of control amplification).
  • FIG. 7 is a graph showing the amount of amplification of melanin production-related protein gene (melanocortin 1 receptor) of D-Asn (Example 1) (relative to the amount of control amplification).
  • FIG. 8 is a graph showing the amount of amplification of melanin production-related protein gene (tyrosinase) of D-Phe (Example 3) (relative to the amount of control amplification).
  • FIG. 9 is a graph showing the amount of amplification of melanin production-related protein gene (tyrosinase-related protein 1) of D-Phe (Example 3) (relative value to the amount of control amplification).
  • FIG. 10 is a graph showing the amount of amplification of melanin production-related protein gene (tyrosinase-related protein 1) of D-Trp (Example 4) (relative to the amount of control amplification).
  • FIG. 11 is a graph showing cell viability when D-Asn, D-Phe and D-Trp are added in normal human pigment cells.
  • FIG. 12 is a graph showing the black melanin production rate when D-Asp is added in B16 melanoma cells.
  • FIG. 13 is a graph showing the black melanin production rate when D-Glu is added in B16 melanoma cells.
  • FIG. 14 is a graph showing the black melanin production rate when D-Cys is added in B16 melanoma cells.
  • FIG. 15 is a graph showing the black melanin production rate when D-Trp is added in B16 melanoma cells.
  • FIG. 16 is a graph showing the cell viability of B16 melanoma cells upon addition of D-Asp.
  • FIG. 17 is a graph showing the cell viability when D-Glu is added to B16 melanoma cells.
  • FIG. 18 is a graph showing the cell survival rate when D-Cys is added in B16 melanoma cells.
  • FIG. 19 is a graph showing the cell viability when D-Trp is added in B16 melanoma cells.
  • FIG. 20 is a graph showing the rate of melanin production when D-Cys is added in normal human pigment cells.
  • FIG. 21 is a graph showing the rate of melanin production when D-Asp is added in normal human pigment cells.
  • FIG. 22 is a graph showing the rate of melanin production when D-His is added in normal human pigment cells.
  • FIG. 23 is a graph showing the rate of melanin production when D-Phe is added in normal human pigment cells.
  • FIG. 24 is a graph showing the rate of melanin production when D-Trp is added in normal human pigment cells.
  • FIG. 25 is a graph showing the relative ratio of the amount of protein when D-Cys is added in normal human pigment cells.
  • FIG. 26 is a graph showing the relative ratio of the amount of protein when D-Asp is added in normal human pigment cells.
  • FIG. 27 is a graph showing the relative ratio of the amount of protein when D-His is added in normal human pigment cells.
  • FIG. 28 is a graph showing the relative ratio of the amount of protein when D-Phe is added in normal human pigment cells.
  • FIG. 29 is a graph showing the relative ratio of the amount of protein when D-Trp is added in normal human pigment cells.
  • the whitening agent of the present invention includes D-Asn, D-Val, D-allo-Thr, D-Lys, D-Gln, D-His, D-Leu, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D -At least one D-amino acid selected from the group consisting of -Trp, D-Tyr, D-Asp, D-Glu, and D-Cys is used as an active ingredient.
  • the active ingredients are D-Asn, D-Val, D-allo-Thr, D-Lys, D-Gln, D-His, D-Leu, D-Phe, D-Ser, D-Trp, and D-Tyr.
  • D-amino acid selected from the group consisting of D-Cys may have low stability (Japanese Patent Laid-Open No. 2009-227660).
  • D-Asp and D-Glu may need to be adjusted to a higher pH in order to improve solubility.
  • the present inventors have found that there is a correlation between the content of D-amino acid contained in a very small amount in the living body and the melanin index and L * value of the skin. Then, using the D-amino acid found as a correlation, the gene expression level of a protein related to melanin production was examined. As a result, a gene gene expression level significantly decreased was found.
  • D-amino acids which are contained only in trace amounts in the living body, are proteins related to skin melanin index and L * value.
  • the novel finding that it strongly suppresses the production of and acts as an active ingredient was found.
  • the whitening agent of the present invention utilizes the remarkable effect possessed by D-amino acids that are contained in a very small amount in the living body based on such novel findings.
  • “whitening” means to suppress the occurrence of excessive melanin in the skin, and to improve spots, freckles and dullness.
  • D-form and L-form exist as optical isomers.
  • natural proteins are composed of peptide bonds of L-amino acids.
  • limonene is known to have optical isomers having different physiological activities.
  • D-amino acids are currently at the research stage, and no systematic understanding has been made.
  • D-amino acids may be their salts.
  • the salt may be any pharmaceutically acceptable salt.
  • alkali metal salts such as potassium salt and sodium salt
  • alkaline earth metal salts such as calcium salt, barium salt and magnesium salt
  • ammonium salts such as ammonium salt and tricyclohexylammonium salt
  • monoethanolamine salt, diethanolamine salt examples thereof include alkanolamine salts such as ethanolamine salt, monoisopropyl alcoholamine salt, diisopropyl alcoholamine salt, and triisopropyl alcoholamine salt.
  • the method for producing D-amino acid is not particularly limited.
  • a synthesis method, an extraction method, an enzyme method, and a fermentation method can be mentioned.
  • a method of optically resolving a racemic mixture of D, L-amino acids is also included.
  • the optical resolution is not particularly limited, and may be performed by a conventionally known method (for example, a diastereomeric salt is prepared using an optical resolution agent such as camphorsulfonic acid, and is resolved using a difference in solubility).
  • the whitening agent of the present invention may contain a whitening component other than the above-mentioned D-amino acid, if necessary, to form a whitening agent composition.
  • the whitening agent of the present invention is at least one D-amino acid selected from the group consisting of D-Gln, D-His, D-Pro, and D-Trp, and D-Tyr and / or D-Lys.
  • the active ingredient is at least one of D-amino acids, and at least one D-amino acid selected from the group consisting of D-Gln, D-His, and D-Trp, and D- More preferably, the active ingredient is at least one of D-amino acids which are Tyr and / or D-Lys. These D-amino acids were found to correlate with at least one of the melanin index and L * value of young women in the evaluation method of the present invention described later.
  • the whitening agent of the present invention comprises at least one D-amino acid selected from the group consisting of D-Leu, D-Phe, D-Ser, and D-Tyr as an active ingredient, or D-His, At least one of at least one D-amino acid selected from the group consisting of D-Gln, D-Trp, D-Asn, D-Val, D-allo-Thr, and D-Lys, as an active ingredient It is also preferable that These D-amino acids were found to correlate with at least one of the melanin index and L * value of elderly women in the evaluation method of the present invention described later.
  • the efficacy of the whitening agent of the present invention is described in, for example, Journal of Japanese Cosmetic Society, Vol. 30, no. 4, pp. It can be judged by the method described in the quasi-drug whitening function evaluation test guideline for obtaining a new effect described in 333-337 (2006). More specifically, a method for confirming that pigmentation is suppressed in visual or photographic pigmentation evaluation, or confirming that the melanin index calculated from the spectrocolorimeter measurement value is lowered or that the L * value is increased. It can be judged by the method. Among them, a method of lowering the melanin index calculated from the measured value of the spectrocolorimeter or increasing the L * value is preferable.
  • the melanin production-related protein production inhibitor of the present invention is at least one selected from the group consisting of D-Asn, D-Phe, D-Trp, D-Asp, D-Glu, D-Cys and D-His As an active ingredient.
  • the active ingredient is preferably at least one D-amino acid selected from the group consisting of D-Asn, D-Phe, D-Trp, and D-His.
  • the melanin production-related protein is at least one selected from the group consisting of tyrosinase, tyrosinase-related protein 1, and melanocortin 1 receptor.
  • the production of at least one melanin production-related protein selected from the group consisting of tyrosinase, tyrosinase-related protein 1, and melanocortin 1 receptor is suppressed, so that spots, freckles, and dullness can be improved or suppressed.
  • the D-amino acid may be a salt thereof, as described above for the whitening agent.
  • the protein whose production is suppressed by the production inhibitor of melanin production-related protein of the present invention is at least one selected from the group consisting of tyrosinase, tyrosinase-related protein 1, and melanocortin 1 receptor.
  • Tyrosinase is a protein that is strongly associated with stains and catalyzes the initial reaction of melanin production.
  • Tyrosinase-related protein 1 is a protein strongly related to blots, and catalyzes the next stage of tyrosinase in melanin production.
  • the melanocortin 1 receptor is a protein strongly associated with staining and is an ⁇ -MSH (melanocyte stimulating hormone) receptor.
  • the production inhibitor of melanin production-related protein of the present invention is a melanin production-related protein other than D-Asn, D-Phe, D-Trp, D-Asp, D-Glu, D-Cys and D-His as necessary
  • the production inhibitory composition of a melanin production related protein may be formed.
  • the skin cosmetic and skin external preparation of the present invention contain the above-described whitening agent or production inhibitor of melanin production-related protein. What is necessary is just to adjust suitably content of said whitening agent or the production inhibitor of a melanin production related protein according to the kind of skin cosmetics and a skin external preparation.
  • the lower limit of the preferable content when converted in terms of the total amount of D-amino acids is usually 0.01% by mass or more, preferably 0.1% by mass or more, and more preferably 1% by mass or more. .
  • the upper limit is usually 30% by mass or less, preferably 10% by mass or less.
  • the skin cosmetic and skin external preparation of the present invention are at least one selected from the group consisting of polyol compounds, surfactants, higher alcohols, thickeners, UV absorbers, UV scattering agents, chelating agents, preservatives, and silicones. It may further contain a seed base, and preferably contains it.
  • polyol compound examples include ethylene glycol, butylene glycol, polyethylene glycol, butylethylpropane diol, polypropylene glycol copolymer, propylene glycol, dipropylene glycol, 1,3-butylene glycol, glycerin, diglycerin, and sorbitol. .
  • at least one selected from the group consisting of butylene glycol, glycerin, polyethylene glycol, dipropylene glycol, and sorbitol is preferable.
  • surfactant examples include polyoxyethylene sorbitan oleate, higher fatty acid soap, alkyl sulfate ester salt, polyoxyethylene alkyl ether sulfate salt, alkyl ether phosphate ester salt, N-acyl amino acid salt, acyl N-methyl Anionic surfactants such as taurine salts; cationic surfactants such as alkyltrimethylammonium chloride and dialkyldimethylammonium chloride; cocamidopropyl betaine, alkyldimethylaminoacetic acid betaine, alkylamidodimethylaminoacetic acid betaine, 2-alkyl-N-carboxyl -Amphoteric surfactants such as N-hydroxyimidazolinium betaine; glycerin fatty acid ester, polyglycerin fatty acid ester, lecithin derivative (lysolecithin), polyoxyethylene type (poly Nonionic surfactants such as xy
  • glycerin fatty acid ester polyglycerin fatty acid ester, lecithin derivative, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene polyoxypropylene alkyl ether, and polyoxyethylene glycerin fatty acid ester are selected. At least one is preferred.
  • Higher alcohol examples of the higher alcohol include cetanol, behenyl alcohol, and isohexadecyl alcohol. Among these, behenyl alcohol is preferable.
  • Thickeners include, for example, polyacrylic acid, carrageenan, xanthan gum, sodium carboxymethylcellulose, carboxyvinyl polymer, polyoxyethylene glycol distearate, acrylic acid polymer, cellulose natural polymer, ethanol, neopentyl glycol dicaprate, myristic Examples include potassium acid. Among these, at least one selected from the group consisting of acrylic acid polymers, xanthan gum, and cellulose natural polymers is preferable.
  • UV absorber examples of the ultraviolet absorber include cinnamate derivatives such as butylmethoxybenzoylmethane, octyl paradimethylaminobenzoate, 2-ethylhexyl paramethoxycinnamate, and ethylhexyl dimethoxybenzylidenedioxoimidazolidinepropionate. Of these, cinnamic acid derivatives are preferred.
  • At least one of titanium oxide and zinc oxide is preferable.
  • chelating agent examples include ethylenediaminetetraacetic acid (or a derivative thereof) such as etidronic acid and trisodium edetate. Of these, ethylenediaminetetraacetic acid is preferred.
  • Preservative As the preservative, at least one of paraben and phenoxyethanol is preferable.
  • parabens include methyl paraben, propyl paraben, and butyl paraben.
  • silicone examples include methylpolysiloxane, dimethylpolysiloxane, methylphenylpolysiloxane, decamethylcyclopentasiloxane, cyclohexasiloxane, cyclopentasiloxane, trimethylsiloxysilicic acid, polyoxyethylene / methylpolysiloxane copolymer, silicon Examples include fluid, silicone rubber, and silicone oil.
  • the skin cosmetic or external preparation for skin of the present invention may contain one or more other bases other than those described above.
  • Other bases may be bases used for normal skin cosmetics or skin external preparations, such as oil bases, water-soluble bases, emulsifiers, stabilizers, pH adjusters, preservatives, etc.
  • Functional ingredients bioactive ingredients
  • fragrances such as triethylhexanoin, pigments, solvents, natural product extracts, and amino acids (derivatives) other than the above-mentioned D-amino acids.
  • oily bases examples include vegetable oils such as castor oil, cottonseed oil, sesame oil, jojoba oil, olive oil, cacao butter; waxes such as owl, liquid lanolin, waxes such as candelilla wax, beeswax, carnauba wax; petrolatum, liquid paraffin , Higher hydrocarbons such as paraffin such as solid paraffin, squalane, olefin oligomer and plastibase; fatty acids such as lauric acid, myristic acid, stearic acid and palmitic acid and esters thereof; base wax such as white kerosene; natural polymer, water Examples thereof include polyisobutene.
  • vegetable oils such as castor oil, cottonseed oil, sesame oil, jojoba oil, olive oil, cacao butter
  • waxes such as owl, liquid lanolin, waxes such as candelilla wax, beeswax, carnauba wax
  • petrolatum liquid paraffin , Higher hydro
  • water-soluble base examples include polyvinyl alcohol, cellulose derivatives (for example, methyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, cationized cellulose), carboxyvinyl polymers, esters (for example, isopropyl myristate, isopropyl palmitate, stearyl stearate). Octyldodecyl myristate, octyldodecyl oleate, 2-ethylhexanoic acid triglyceride).
  • emulsifier examples include stearyl alcohol, glyceryl monostearate, sorbitan monopalmitate, polyoxyethylene cetyl ether, polyoxyethylene sorbitan monolaurate, polyoxyethylene sorbitan monooleate, diglycerin monostearate, polysorbate 60. And myristoylmethyl- ⁇ -alanine (phytosteryl / decyltetradecyl).
  • Examples of the stabilizer include spherical alkyl acrylate powder, dimethyl distearyl ammonium hectorite, ascorbic acid, sodium pyrosulfite, gellan gum, and pectin.
  • Examples of the pH adjuster include phosphate buffer, sodium hydroxide, potassium hydroxide, and triethanolamine.
  • Examples of the preservative include ethyl paraoxybenzoate, sodium benzoate, salicylic acid, sorbic acid, sodium bisulfite, and phenoxyethanol.
  • Examples of the solvent include an arginine aqueous solution and purified water.
  • Examples of the dye include red 202, yellow 4, blue 1, bengara, yellow iron oxide, and black iron oxide.
  • Other functional components include, for example, kojic acid, trioleyl phosphate, squalane, cetyl ethylhexanoate, tocopherol, mica, bis (N-lauroyl-L-glutamic acid / N-lauroyl-sarcosine) dimer linoleyl, Tocopherol acetate, thiotaurine, honey, lauroyl sarcosine isopropyl, lauroyl lysine, talc, dibutyl ethyl hexanoyl glutamide, dibutyl lauroyl glutamide, bentonite, taurine, arbutin, panthenol, niacinamide, pyridoxine hydrochloride, retinol, carotene, riboflavin, Ubiquinone, sodium hyaluronate, water-soluble collagen, sodium chondroitin sulfate, lactobacilli, fermente
  • Examples of the natural product extract include lavender extract, peppermint extract, sage extract, anise extract, rose extract, cypress water, rooibos extract, lavender extract, and clara extract.
  • Examples of amino acids (derivatives) include L-leucine, L-isoleucine, L-valine, L-phenylalanine, L-tryptophan, L-aspartic acid, sodium L-glutamate, L-lysine (hydrochloride), L-arginine.
  • L-threonine L-alanine, L-proline, L-serine, glycine, acetylglutamine, L-histidine, pyridoxylserine, carnosine, acetylmethionine, acetylcysteine, sodium polyaspartate, citrulline, ornithine, betaine, L -Tyrosine, L-asparagine, L-methionine.
  • the content of the other base may be set as appropriate and is not particularly limited.
  • the dosage form of the skin cosmetic or skin external preparation of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include liquids, lotions, ointments, creams, plasters, tape preparations, powders, lotions, and gels. Among these, emulsions, creams, lotions, and gels are mentioned, and any of these is preferable. *
  • the use site of the skin cosmetic or external preparation of the present invention is not particularly limited, and is usually applied to the skin and mucous membrane. Among them, it is preferably used for the skin. Therefore, examples of usage forms of the skin cosmetic or external preparation for skin of the present invention include aqueous solutions, emulsions, powder dispersions, and emulsions (oil-in-water type, water-in-oil type, etc.). More specifically, liquids, oils, lotions, gels, sols, emulsions, suspensions, creams, ointments, patches, sticks and the like can be mentioned.
  • Examples of so-called cosmetics include lotions such as lotions and beauty lotions; emulsions such as emollient emulsions, milky lotions, nourishing emulsions, and cleansing emulsions; creams such as emollient creams, massage creams, cleansing creams, and makeup creams; sprays;
  • Examples include cosmetics for makeup such as packs, foundations, lipsticks, lipsticks, eye shadows, cheeks, funny, color powders, and cosmetics for skin cleaning such as facial cleansers, makeup removers, body shampoos, and soaps.
  • they may be used as quasi-drugs, pharmaceuticals, and foods (including supplements and beverages).
  • composition of the skin cosmetic or skin external preparation of the present invention as an emulsion or cream includes, for example, the agent of the present invention and a polyol group (at least selected from the group consisting of butylene glycol, glycerin, polyethylene glycol, and dipropylene glycol).
  • a polyol group at least selected from the group consisting of butylene glycol, glycerin, polyethylene glycol, and dipropylene glycol.
  • surfactant group at least one selected from the group consisting of glycerin fatty acid ester, polyglycerin fatty acid ester, and lecithin derivative), higher alcohol group (behenyl alcohol), and thickener group (acrylic acid)
  • a polymer and xanthan gum At least one of a polymer and xanthan gum
  • an ultraviolet absorber group cenamic acid derivative
  • an ultraviolet scattering agent group at least one of titanium oxide and zinc oxide
  • a chelating agent group ethylenediaminetetraacetic acid
  • antiseptics Group of drugs small amount of paraben and phenoxyethanol And one also include structural containing, and silicone.
  • composition of the skin cosmetic or skin external preparation of the present invention as a lotion is, for example, the agent of the present invention and a polyol group (at least one selected from the group consisting of butylene glycol, glycerin, polyethylene glycol, and sorbitol).
  • a polyol group at least one selected from the group consisting of butylene glycol, glycerin, polyethylene glycol, and sorbitol.
  • a surfactant group at least one selected from the group consisting of polyoxyethylene hydrogenated castor oil, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene polyoxypropylene alkyl ether, and polyoxyethylene glycerin fatty acid ester
  • a sticky group at least one selected from the group consisting of acrylic polymer, xanthan gum, and cellulose natural polymer
  • an ultraviolet absorber group cephalol
  • a chelating agent group ethylenediaminetetraacetic acid
  • Preservatives group paraben and phenoxy At least one) of ethanol, and a configuration that contains a silicone.
  • the gel composition of the skin cosmetic or skin external preparation of the present invention includes, for example, the agent of the present invention, a polyol group (at least one selected from the group consisting of butylene glycol, glycerin, and polyethylene glycol), and an interface.
  • a polyol group at least one selected from the group consisting of butylene glycol, glycerin, and polyethylene glycol
  • Activator group at least one selected from the group consisting of polyoxyethylene hydrogenated castor oil, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene polyoxypropylene alkyl ether, and polyoxyethylene glycerin fatty acid ester
  • thickener group At least one selected from the group consisting of acrylic acid-based polymers, xanthan gum, and cellulose-based natural polymers
  • an ultraviolet absorber group cenamic acid derivative
  • a chelating agent group ethylenediaminetetraacetic acid
  • preservative group Low in parabens and phenoxyethanol And one also include structural containing, and silicone.
  • the whitening agent and the production inhibitor of melanin production-related protein of the present invention can exert excellent effects on the prevention, suppression, and treatment of stains, freckles, and dullness caused by aging, ultraviolet rays, inflammation, etc. through whitening action. it can.
  • the evaluation method of the present invention is to confirm the appearance of the subject's skin by measuring at least one of the melanin index and L * value of the subject's skin, from the pigmentation site of the subject's skin Collecting the stratum corneum, identifying the amount of at least one D-amino acid contained in the stratum corneum, and comparing the relationship between the appearance of the skin and the amount of D-amino acid among the results of the subject.
  • the evaluation method of the present invention is roughly classified into the following two embodiments.
  • the relationship between the appearance of the skin and each component is compared between the results of the subject (preliminary subject) (comparison between a plurality of results of the same subject, It is also possible to compare between the results of subjects with different), and whether or not there is a correlation, and if a correlation is confirmed, the correlation between the appearance of the skin and the amount of D-amino acid Is selected as an index for evaluating the skin of the subject (which may be the same as or different from the preliminary subject).
  • Another embodiment is obtained by identifying the amount of D-amino acid in the stratum corneum before and after administering a sample of skin cosmetics, topical skin preparations, and these candidate substances to a subject, and in light of the above correlation. This is an embodiment in which the evaluation of the sample or the effectiveness of the subject on the skin is evaluated by comparing the evaluation of the skin before and after administration.
  • the subject may be either male or female. However, women are preferable because they are sensitive to whitening, and women in their twenties or thirties who begin to be interested in age-related spots or dullness, or often take care of age-related spots or dullness 40 More preferred are women in their teens or 50s.
  • the appearance of the skin may be confirmed by at least one of the melanin index and the L * value.
  • People with stains or dullness have decreased cell function, especially cell function (cell differentiation and proliferation) due to increased melanin production of melanocytes by external stimuli such as UV exposure, followed by excessive transport and accumulation of melanin to keratinocytes.
  • the melanin amount in keratinocytes is likely to increase due to the decrease in function. Therefore, the melanin index is used as an index for evaluating the absence of spots and dullness, that is, whitening of the skin.
  • the L * value is an index representing the lightness of the color, and is used as an index evaluated with a numerical value of 0 to 100. 0 indicates black and 100 indicates white diffused color. The higher the value, the better the whitening effect.
  • the measurement of the melanin index and the L * value may be performed by a conventionally known method.
  • a spectrocolorimeter CM-700d manufactured by Konica Minolta Co., Ltd.
  • CM-SA skin analysis software
  • the appearance of the skin may be evaluated based on the intensity of melanin that can be measured from the reflected light when the skin is irradiated with light having a wavelength of 660 nm or 880 nm, using Mexeter MX18 manufactured by Course + Khazaka.
  • the measurement site part of the external appearance of skin is not specifically limited. However, from the viewpoint of evaluating stains, freckles, and dullness caused by excessive melanin production due to external stimuli such as ultraviolet rays, the site is preferably exposed to the outside in daily life. For example, cheeks and arms. There may be one measurement location or two or more measurement locations.
  • the stratum corneum may be collected from a pigmentation site of the skin appearance by a conventionally known method such as a tape stripping method.
  • the tape stripping method is a method of collecting a stratum corneum adhering to an adhesive surface by applying an adhesive tape to the skin and peeling off the adhesive tape.
  • Examples of the method of collecting the stratum corneum include a method of collecting the stratum corneum attached to the adhesive tape when a commercially available adhesive tape is pressed against the measurement site and peeled off.
  • Examples of commercially available adhesive tapes include Asahi Biomed's horny checker, Moritex's horny layer seal, PROMOTOOL's horny checker (disc type W, disc type G, PRO type), Integral's Corneofix, 3M's Examples thereof include transparent tape, 3M transparent double-sided tape, and Nichiban cello tape (registered trademark).
  • the method for specifying the amount of D-amino acid is not particularly limited.
  • a direct method a method of precolumn derivatization followed by separation by chromatography using a chiral stationary phase column
  • an indirect method with a chiral derivatization reagent
  • a method of separating by a chromatography using a reverse phase column after derivatization to a diastereomer includes, for example, a method in which precolumn fluorescence derivatization is performed with NBD-F, followed by separation with a chiral column and fluorescence detection.
  • Indirect methods include, for example, a method of derivatizing with OPA and chiral thiol and separating with a reverse phase column and detecting fluorescence, and a method of derivatizing with DBD-PyNCS and separating with a reverse phase column and detecting with a mass spectrometer.
  • a method of derivatizing with OPA and chiral thiol and separating with a reverse phase column and detecting fluorescence and a method of derivatizing with DBD-PyNCS and separating with a reverse phase column and detecting with a mass spectrometer.
  • D-amino acids are D-Asn, D-Val, D-allo-Thr, D-Lys, D-Gln, D-His, D-Leu, D-Phe, D-Pro, D-Ser. , D-Trp, and D-Tyr, and preferably at least one selected from the group consisting of D-Tyr.
  • the above-mentioned more preferable D-amino acid is a component having a correlation with at least one of the melanin index and L * value of the skin of women in their ages of 20s to 30s and 40s to 50s However, it can be confirmed from the evaluation method of the present invention.
  • One embodiment of the method for evaluating skin with D-amino acids of the present invention provides new knowledge about the correlation between specific D-amino acids and the appearance of the skin. Therefore, the evaluation method of the present invention can be applied to the development of skin cosmetics such as whitening agents derived from natural products, or skin external preparations.
  • the D-amino acid is selected from the group consisting of D-Lys, D-Gln, D-His, D-Pro, D-Trp, and D-Tyr. It is preferable that it is at least one kind.
  • the D-amino acid is D-Asn, D-Val, D-Allo-Thr, D-Lys, D-Gln, D-His, D-Leu. , D-Phe, D-Ser, D-Trp, and D-Tyr, and preferably at least one selected from the group consisting of:
  • the method for specifying the amount of D-amino acid is not particularly limited.
  • mass spectrometry using liquid chromatography (LC) or gas chromatography (GC), enzyme method using quantitative enzyme, and bioassay method can be mentioned.
  • LC liquid chromatography
  • GC gas chromatography
  • enzyme method using quantitative enzyme enzyme used by quantitative enzyme
  • bioassay method bioassay method
  • a liquid chromatograph-tandem mass spectrometer is preferable because it can simultaneously specify the D-amino acid and measure the content thereof.
  • the amount of D-amino acid is preferably the content of D-amino acid per amount of protein contained in the stratum corneum. Thereby, the experimental error derived from the stratum corneum sampling method can be reduced.
  • the method for measuring the protein amount is not particularly limited, and examples thereof include a measurement method using a spectrophotometer such as an ultraviolet absorption method, a BCA method, a Bradford method, a Raleigh method, and a burette method, and a measurement method by electrophoresis. . Among these, the BCA method is preferable.
  • a relationship between at least one of the melanin index and L * value of skin and the amount of D-amino acid is obtained from a plurality of subjects, By comparison, D-amino acids that correlate with skin appearance can be identified.
  • the skin appearance can be evaluated based on the D-amino acid content. Therefore, by comparing the content of D-amino acid with a correlation between before and after the administration of a sample such as skin cosmetic or topical skin preparation for the same subject, the sample to the subject was compared. The effectiveness can be confirmed. Therefore, it can be used as a method for confirming whether or not the subject is a skin cosmetic or an external preparation suitable for the subject.
  • the melanin index is decreased or the L * value is increased before and after the skin cosmetic or topical skin preparation is administered, as in the conventional measurement method.
  • CM-700d manufactured by Konica Minolta
  • CM-SA skin analysis software
  • the collected stratum corneum was subjected to ultrasonic treatment twice using a 95% aqueous methyl alcohol solution to extract water-soluble components.
  • An internal standard solution (containing plural kinds of D, L-amino acid stable isotopes such as D-Arg) was added to the extract.
  • the obtained aqueous methyl alcohol solution was dried with a centrifugal evaporator to prepare a sample for D-amino acid analysis.
  • Micro BCA method was performed using Micro BCA Protein Assay Reagent (Thermo Fisher Scientific). The same amount of sample solution and MicroBCA solution were added, and the mixture was heated and shaken (1100 rpm) at 50 ° C. for 1 hour. The protein was quantified by measuring the absorbance (562 nm) with a spectroscope.
  • Table 3 shows D-Asn, D-Val, D-allo-Thr, D-Lys, D-Gln, D-His, D-Leu, D-Phe, D-Pro, The correlation between the content of D-Ser, D-Trp, and D-Tyr in the stratum corneum, and the skin melanin index and L * value is shown. An absolute value of the correlation coefficient of 0.3 or higher was evaluated as “A” as “medium correlation”, and 0.2 or higher was evaluated as “B” as “weak correlation”.
  • D-amino acid content of D-Gln, D-His, D-Leu, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Trp, and D-Tyr in the stratum corneum was correlated with the skin melanin index with at least one of younger and older women.
  • D-amino acid corners of D-Gln, D-Leu, D-Phe, D-Ser, D-Trp, D-Tyr, D-Asn, D-Val, D-allo-Thr, and D-Lys The content in the layer was correlated with the L * value of the skin with at least one of young women and elderly women.
  • FIGS. 1 and 2 Plots comparing the melanin index and the content of D-amino acid are shown in FIGS. 1 and 2, and plots comparing the L * value and the content of D-amino acid are shown in FIGS. 1 to 4, the amino acid content is a value obtained by dividing the amino acid content obtained by the above-mentioned “D-amino acid quantitative analysis” by the protein amount obtained by the “protein quantitative analysis”.
  • Examples 1 to 4 of whitening agents (Gene expression test for D-amino acid “whitening” using normal human epidermal pigment cells) Normal human epidermal pigment cells (Life Technologies) were cultured in Medium 254 (Life Technologies) (containing HMGS custom growth additive set (Kurabo)) at 37 ° C., 5% CO 2 and saturated steam. The cells in a confluent state were seeded in a 6-well plate at a seeding density of 3.0 ⁇ 10 5 (cells / well).
  • the gene expression level of at least one of tyrosinase and tyrosinase-related protein 1 was evaluated. The results are shown in Table 4.
  • Table 4 TYR indicates tyrosinase, TRP1 indicates tyrosinase-related protein 1, and MC1R indicates melanocortin 1 receptor.
  • FIG. 5 is a graph showing the amount of amplification of melanin production-related protein gene (tyrosinase) of D-Asn (Example 2) (relative to the amount of control amplification).
  • FIG. 6 is a graph showing the amount of amplification of melanin production-related protein gene (tyrosinase-related protein 1) of D-Asn (Example 2) (relative to the amount of control amplification).
  • FIG. 7 is a graph showing the amount of amplification of melanin production-related protein gene (melanocortin 1 receptor) of D-Asn (Example 1) (relative to the amount of control amplification).
  • FIG. 5 is a graph showing the amount of amplification of melanin production-related protein gene (tyrosinase) of D-Asn (Example 2) (relative to the amount of control amplification).
  • FIG. 6 is a graph showing the amount of amplification of melanin
  • FIG. 8 is a graph showing the amount of amplification of melanin production-related protein gene (tyrosinase) of D-Phe (Example 3) (relative to the amount of control amplification).
  • FIG. 9 is a graph showing the amount of amplification of melanin production-related protein gene (tyrosinase-related protein 1) of D-Phe (Example 3) (relative value to the amount of control amplification).
  • FIG. 10 is a graph showing the amount of amplification of melanin production-related protein gene (tyrosinase-related protein 1) of D-Trp (Example 4) (relative to the amount of control amplification).
  • D-amino acid suppresses the production of melanin production-related protein and is useful as an active ingredient for whitening agents.
  • Example 5 (Cytotoxicity test: neutral red method) Normal human epidermal pigment cells were seeded in a 6-well plate, and the following day, a sample prepared by adjusting D-amino acid (500 ⁇ M) in a cell culture medium was added. After 24 hours, the evaluation sample solution was removed from the plate and each well was rinsed with 2 ml of cell culture medium. A medium containing NR (neutral red (Kurabo)) was added dropwise at 2 ml / well and allowed to stand for 2 hours at 37 ° C., 5% CO 2 and saturated steam.
  • NR neutral red
  • the medium (with neutral red) was discarded, and a washing fixative (2 wt% calcium chloride solution and 2 wt% formalin solution mixed in equal amounts) was added at 2 ml / well, and allowed to stand for 1 minute, and then the wash fixative was removed.
  • 2 ml / well of NR extract (50% by volume ethyl alcohol, 1% by volume acetic acid) was added and shaken for 15 minutes with a plate shaker. Incorporation of NR into living cells was examined by measuring the absorbance at 540 nm of the NR extract with a microplate reader (manufactured by Thermo Fisher Scientific).
  • the absorbance of the NR extract of each sample-added cell at a predetermined concentration is set to a relative percentage, whereby the cells of each sample Toxicity was calculated.
  • the evaluation results are shown in FIG.
  • FIG. 11 shows that at a concentration of 500 ⁇ M, each D-amino acid component is not cytotoxic. Therefore, it has been found that D-amino acids can reduce the gene expression levels of various melanin production-related proteins at concentrations that are not cytotoxic.
  • Example 6 Black melanin production inhibition test 1
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • Confluent cells were detached with trypsin and seeded in a 96-well plate.
  • each evaluation sample control (no sample added), D-amino acid (D-Asp, D-Glu, D-Cys, or D-Trp)
  • D-Asp, D-Glu, D-Cys, or D-Trp D-amino acid
  • the medium was replaced with DMEM (high glucose, containing 10% serum, no phenol red) supplemented with 5 mM), and cultured for 3 days.
  • the 96-well plate was shaken for 5 minutes with a plate shaker, and the absorbance at 450 nm was measured with a microplate reader (Multiskan FC, manufactured by Thermo Fisher Scientific).
  • the measured value (absorbance) of the control (no sample added) is defined as 100%, and the amount of black melanin in the control is set to 100% by making the absorbance 3 days after the addition of each sample's predetermined concentration.
  • the black melanin production rate of each sample was calculated. The results are shown in FIGS.
  • Example 7 (Cytotoxicity test (neutral red method)) After measuring the absorbance in Example 6, the evaluation sample solution was removed from the plate, and each well was rinsed with 200 ⁇ l of DMEM (high glucose, containing 10% serum). A medium containing NR (neutral red) (0.5%) was added dropwise at 200 ⁇ l / well, and allowed to stand for 2 hours at 37 ° C., 5% CO 2 and saturated steam. The medium was discarded, and a washing and fixing solution (2 wt% calcium chloride solution and 2 wt% formalin solution were mixed in equal amounts) was added at 200 ⁇ l / well, allowed to stand for 1 min, and then the washing and fixing solution was removed.
  • DMEM high glucose, containing 10% serum
  • NR extract (acetic acid ethanol) 200 ⁇ l / well was added and shaken with a plate shaker for 15 min. Incorporation of NR into living cells was examined by measuring the absorbance at 540 nm of the NR extract with a microplate reader (Multiskan FC, manufactured by Thermo Fisher Scientific). When the measured value (absorbance) of the control (no sample) NR extract is defined as 100%, the cell viability of each sample is obtained by setting the absorbance of the NR extract of each sample-added cell at a predetermined concentration to be a relative%. The rate was calculated. The results are shown in FIGS.
  • FIGS. 16 to 19 show that the cytotoxicity of each sample is low at an evaluation concentration of 1 mM or 5 mM.
  • the result of Example 6 and 7 has shown that each sample shows melanin production inhibitory activity and its cytotoxicity is low.
  • Example 8 (Tyrosinase activity inhibition test) Normal human pigment cells were cultured in a medium in which Medium 254 (manufactured by Thermo Fisher Scientific) was added with a HMGS custom-made growth additive set (manufactured by Kurashiki Boseki Co., Ltd.). Confluent cells were detached with trypsin and seeded in 6-well plates. The next day, after the cells adhered to the plate, the medium was replaced with a medium obtained by removing phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) from the above-mentioned medium.
  • PMA phorbol 12-myristate 13-acetate
  • each evaluation sample (control (no sample added), D-amino acid) was replaced with a medium excluding PMA added at a predetermined concentration (1 mM or 5 mM), and cultured for 3 days.
  • the medium was removed and rinsed with 1/15 diluted PBS.
  • the remaining lysate was centrifuged (9100 g, 4 ° C., 5 min), and 40 ⁇ l of the supernatant was added to a 96-well plate.
  • L-DOPA solution (2 mg / ml, PBS diluted to 1/15) was added to the 96-well plate at 100 ⁇ l / well, and the absorbance at 490 nm was measured every 1 min while heating at 37 ° C.
  • the 96-well plate was periodically stirred by a plate reader. From the measured absorbance, the maximum melanin production rate (change in absorbance per unit time) is calculated, and the maximum melanin production rate of the control (no sample) is defined as 100%.
  • the melanin production rate of each D-amino acid was calculated by setting the maximum melanin production rate to relative%. The results are shown in FIGS.
  • Example 9 Provided below (Protein quantification) MilliQ water (80 ⁇ l) was added to the cell lysate (20 ⁇ l) dispensed in the tyrosinase activity inhibition test of Example 8 to make 100 ⁇ l.
  • the amount of protein in this solution was quantified using a DC protein assay (Bio-Rad). The measurement was performed by mixing 100 ⁇ l of sample solution and 100 ⁇ l of solution A and 800 ⁇ l of solution B. When the protein amount of the control (no sample) was defined as 100%, the relative% of the protein amount with each D-amino acid addition at a predetermined concentration was calculated. The results are shown in FIGS.
  • each sample was 95% or more.
  • the results of Examples 8 and 9 indicate that each sample has a tyrosinase activity inhibitory effect and has low cytotoxicity.

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Abstract

本発明は、しみ、そばかす、くすみといったメラニン色素沈着の予防、抑制に有効な美白剤を提供することを目的とする。すなわち、本発明は、Ｄ－アスパラギン、Ｄ－バリン、Ｄ－アロスレオニン、Ｄ－リシン、Ｄ－グルタミン、Ｄ－ヒスチジン、Ｄ－ロイシン、Ｄ－フェニルアラニン、Ｄ－セリン、Ｄ－トリプトファン、及びＤ－チロシンからなる群から選択される少なくとも１種のＤ－アミノ酸を含有する美白剤、及び、Ｄ－アミノ酸による肌の評価方法を提供する。

Description

美白剤
　本発明は、美白剤に関する。
　肌のしみ、そばかす、くすみは、紫外線の照射等の原因により色素細胞（メラノサイト）から黒色のメラニン色素が産生及び沈着することで発生する。メラニン色素は、アミノ酸物質であるチロシンを出発物質としてチロシナーゼ及びチロシナーゼ関連タンパク質により生成することが知られている。そのため、メラニンの沈着を抑制するために、チロシナーゼ及びチロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＲＰ－１）の阻害作用を有する技術が提案されている（特許文献１）。
　可食経験のある植物由来の抽出物を用いて、単回摂取により、紫外線により誘発される皮膚の炎症とそれに伴う皮膚の劣化を予防又は軽減することを目的として、カロテノイド色素の１種であるクロセチンを用いる経口皮膚保護剤が提案されている（特許文献２）。
　表皮と真皮とを隔てる基底膜に多量に存在するタンパク質へ影響を与えるＤ－アミノ酸として、Ｄ－アラニン及びＤ－ヒドロキシプロリンが報告されている（特許文献３）。
　美白効果を著しく改善し、かつ肌荒れ改善作用を目的とした、ハイドロキノン配糖体、アルコキシサリチル酸及び／又はその塩、α－グリコシル－Ｌ－アスコルビン酸から選ばれる美白薬剤と、１種又は２種以上のベタイン誘導体と、高級脂肪酸と、Ｌ－セリン、Ｄ－セリン、ＤＬ－セリン、アラニン、及びアミノメチルプロパンジオールから選ばれる１種又は２種以上と、を含有する皮膚外用剤が開示されている（特許文献４）。
国際公開第２０１３／１１８８８７号 特開２０１３－６７５９２号公報 国際公開第２０１１／０４００８２号 特開２００２－０６０３１３号公報
　特許文献１に開示されたチロシナーゼの抑制作用を有する生理活性物質は、ヨブスマソウ及び／又はイヌドウナをアルコール抽出して得られるものである。しかしながら、メラニン色素は、ＭＩＴＦ抑制作用に加えて、チロシナーゼ阻害成分及び抗酸化成分により抑制されていることが開示されている。即ち、特許文献１に開示されたチロシナーゼの抑制作用を有する生理活性物質は、それ単独ではチロシナーゼの遺伝子発現抑制作用が不十分であることが認められる。
　特許文献２に開示されたクロセチンは、紅班強度（即ち、紫外線による炎症）に効果があることは実施例で開示されている。しかしながら、しみ及びそばかす等のメラニンが沈着した状態に対しても効果が得られることは実証されていない。
　特許文献３には、Ｄ－アスパラギン酸等のＤ－アミノ酸化合物を用いた場合、ラミニン３３２の産生促進効果は発現しないことが開示されている。また、皮膚におけるラミニン３３２の産生促進を開示するものであり、ラミニン３３２以外のタンパク質の産生を抑制する技術については記載も示唆もされていない。
　特許文献４に記載の皮膚外用剤は、Ｄ－Ｓｅｒとは異なる特定の美白薬剤を必須成分として使用しており、Ｄ－Ｓｅｒ自体に美白作用があることは記載も示唆もされていない。
　本発明は、上記問題点に鑑みてなされたもので、メラニン産生関連タンパク質の産生を十分に抑制し、十分な美白効果を発揮することができる美白剤を提供することを目的とする。
　本発明者らは上記目的を達成すべく鋭意検討を重ねた。その結果、被検者の肌状態（例えば、メラニンインデックス）と、角層内に含まれる特定のＤ－アミノ酸に相関関係があることを見出した。斯かる知見に基づき、特定のＤ－アミノ酸が、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１、メラノコルチン１レセプター等のメラニン産生関連タンパク質の産生を抑制し得ると考え、本発明に到達した。
　すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕Ｄ－アスパラギン、Ｄ－バリン、Ｄ－アロスレオニン、Ｄ－リシン、Ｄ－グルタミン、Ｄ－ヒスチジン、Ｄ－ロイシン、Ｄ－フェニルアラニン、、Ｄ－セリン、Ｄ－トリプトファン、及びＤ－チロシン（以下、本明細書中、それぞれ「Ｄ－Ａｓｎ」、「Ｄ－Ｖａｌ」、「Ｄ－ａｌｌｏ－Ｔｈｒ」、「Ｄ－Ｌｙｓ」、「Ｄ－Ｇｌｎ」、「Ｄ－Ｈｉｓ」、「Ｄ－Ｌｅｕ」、「Ｄ－Ｐｈｅ」、「Ｄ－Ｓｅｒ」、「Ｄ－Ｔｒｐ」、及び「Ｄ－Ｔｙｒ」と略記する）からなる群から選択される少なくとも１種のＤ－アミノ酸を有効成分とする美白剤。
〔２〕分光測色計測定値より算出したメラニンインデックスを下げる又はＬ＊値を上げる上記〔１〕に記載の美白剤。
〔３〕Ｄ－Ｇｌｎ、Ｄ－Ｈｉｓ、及びＤ－Ｔｒｐからなる群から選択される少なくとも１種のＤ－アミノ酸、並びにＤ－Ｔｙｒ及び／又はＤ－ＬｙｓであるＤ－アミノ酸、の少なくともいずれかを有効成分とする上記〔１〕又は〔２〕に記載の美白剤。
〔４〕Ｄ－Ｌｅｕ、Ｄ－Ｐｈｅ、Ｄ－Ｓｅｒ、及びＤ－Ｔｙｒからなる群から選択される少なくとも１種のＤ－アミノ酸を有効成分とするか、或いはＤ－Ｈｉｓと、Ｄ－Ｇｌｎ、Ｄ－Ｔｒｐ、Ｄ－Ａｓｎ、Ｄ－Ｖａｌ、Ｄ－ａｌｌｏ―Ｔｈｒ、及びＤ－Ｌｙｓからなる群から選択される少なくとも１種のＤ－アミノ酸と、の少なくともいずれかを有効成分とする上記〔１〕又は〔２〕に記載の美白剤。
〔５〕Ｄ－Ａｓｎ、Ｄ－Ｐｈｅ、Ｄ－Ｔｒｐ、及びＤ－Ｈｉｓからなる群から選択される少なくとも１種のＤ－アミノ酸を有効成分とする、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１、及びメラノコルチン１レセプターからなる群から選択される少なくとも１種のメラニン産生関連タンパク質の産生抑制剤。
〔６〕上記〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の美白剤、又は上記〔５〕に記載のメラニン産生関連タンパク質の産生抑制剤を含む皮膚化粧料又は皮膚外用剤。
〔７〕ポリオール化合物、界面活性剤、高級アルコール、増粘剤、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、キレート剤、防腐剤及びシリコーンからなる群より選択される少なくとも１種の基剤を更に含む上記〔６〕に記載の皮膚化粧料又は皮膚外用剤。
〔８〕剤形が、乳液、クリーム、化粧水、又はジェルである上記〔６〕又は〔７〕に記載の皮膚化粧料又は皮膚外用剤。
〔９〕被検者の肌のメラニンインデックス及びＬ＊値の少なくともいずれかを測定して前記被検者の肌の外観を確認すること、前記被検者の肌の色素沈着部位から角層を採取すること、前記角層に含まれる少なくとも１種のＤ－アミノ酸量を特定すること、前記肌の外観と前記Ｄ－アミノ酸量との関係を、被検者の結果の間で比較すること、を含む、Ｄ－アミノ酸による肌の評価方法。
〔１０〕前記Ｄ－アミノ酸量の特定が、前記角層に含まれるタンパク質量あたりのＤ－アミノ酸含有量の測定である上記〔９〕に記載の評価方法。
〔１１〕前記Ｄ－アミノ酸の含有量の測定を、液体クロマトグラフ－タンデム型質量分析計により行う上記〔９〕又は〔１０〕に記載の評価方法。
〔１２〕前記タンパク質量の測定をＢＣＡ法により行う上記〔１０〕又は〔１１〕に記載の評価方法。
〔１３〕前記Ｄ－アミノ酸が、Ｄ－Ａｓｎ、Ｄ－Ｖａｌ、Ｄ－ａｌｌｏ－Ｔｈｒ、Ｄ－Ｌｙｓ、Ｄ－Ｇｌｎ、Ｄ－Ｈｉｓ、Ｄ－Ｌｅｕ、Ｄ－Ｐｈｅ、Ｄ－Ｐｒｏ、Ｄ－Ｓｅｒ、Ｄ－Ｔｒｐ、及びＤ－Ｔｙｒからなる群から選択される少なくとも１種を含む上記〔９〕～〔１２〕のいずれかに記載の評価方法。
〔１４〕前記被検者が、２０代又は３０代の女性であり、前記Ｄ－アミノ酸が、Ｄ－Ｌｙｓ、Ｄ－Ｇｌｎ、Ｄ－Ｈｉｓ、Ｄ－Ｐｒｏ、Ｄ－Ｔｒｐ、及びＤ－Ｔｙｒからなる群から選択される少なくとも１種である上記〔１３〕に記載の評価方法。
〔１５〕前記被検者が、４０代又は５０代の女性であり、前記Ｄ－アミノ酸が、Ｄ－Ａｓｎ、Ｄ－Ｖａｌ、Ｄ－ａｌｌｏ－Ｔｈｒ、Ｄ－Ｌｙｓ、Ｄ－Ｇｌｎ、Ｄ－Ｈｉｓ、Ｄ－Ｌｅｕ、Ｄ－Ｐｈｅ、Ｄ－Ｓｅｒ、Ｄ－Ｔｒｐ、及びＤ－Ｔｙｒからなる群から選択される少なくとも１種である上記〔１３〕に記載の評価方法。
〔１６〕前記比較の結果、肌の外観とＤ－アミノ酸量との間に相関関係が確認された場合に、肌の外観とそのＤ－アミノ酸との相関関係を被検者の肌の評価の指標として選抜することを更に含む、〔９〕～〔１５〕のいずれかに記載の評価方法。
〔１７〕皮膚化粧料、皮膚外用剤、又はそれらの有効成分候補物質の投与前後の被検者の肌の色素沈着部位の角層に含まれる、〔１６〕に記載の評価方法で選抜された相関関係を構成するＤ－アミノ酸量を測定すること、及び、
　前記Ｄ－アミノ酸量から前記相関関係に基づき投与前後の肌の外観を特定し、比較すること
を含む、皮膚化粧料又は皮膚外用剤の評価方法。
〔１８〕皮膚化粧料又は皮膚外用剤の投与前後の被検者の肌の色素沈着部位の角層に含まれる、〔１６〕に記載の評価方法で選抜された相関関係を構成するＤ－アミノ酸量を測定すること、及び、
　前記Ｄ－アミノ酸量から前記相関関係に基づき投与前後の肌の外観を特定し、比較すること
を含む、被検者への皮膚化粧料又は皮膚外用剤の有効性の評価方法。
　本明細書中、アミノ酸を、慣用の３文字表記（例えば、「Ａｓｎ」、「Ｇｌｎ」）に「Ｌ－」、「Ｄ－」、「Ｄ，Ｌ－」等の立体配置の接頭詞を付けて表すことがある。
　本発明の美白剤は、十分な美白効果を有する。
図１は、２０代又は３０代の女性において、角層中のＤ－Ｐｒｏ量と肌のメラニンインデックスとの相関を示す図である。 図２は、４０代又は５０代の女性において、角層中のＤ－Ｈｉｓ量と肌のメラニンインデックスとの相関を示す図である。 図３は、２０代又は３０代の女性において、角層中のＤ－Ｌｙｓ量と肌のＬ＊値との相関を示す図である。 図４は、４０代又は５０代の女性において、角層中のＤ－Ｔｙｒ量と肌のＬ＊値との相関を示す図である。 図５は、Ｄ－Ａｓｎ（実施例２）のメラニン産生関連タンパク質遺伝子（チロシナーゼ）の増幅量（コントロールの増幅量に対する相対値）を示すグラフである。 図６は、Ｄ－Ａｓｎ（実施例２）のメラニン産生関連タンパク質遺伝子（チロシナーゼ関連タンパク質１）の増幅量（コントロールの増幅量に対する相対値）を示すグラフである。 図７は、Ｄ－Ａｓｎ（実施例１）のメラニン産生関連タンパク質遺伝子（メラノコルチン１レセプター）の増幅量（コントロールの増幅量に対する相対値）を示すグラフである。 図８は、Ｄ－Ｐｈｅ（実施例３）のメラニン産生関連タンパク質遺伝子（チロシナーゼ）の増幅量（コントロールの増幅量に対する相対値）を示すグラフである。 図９は、Ｄ－Ｐｈｅ（実施例３）のメラニン産生関連タンパク質遺伝子（チロシナーゼ関連タンパク質１）の増幅量（コントロールの増幅量に対する相対値）を示すグラフである。 図１０は、Ｄ－Ｔｒｐ（実施例４）のメラニン産生関連タンパク質遺伝子（チロシナーゼ関連タンパク質１）の増幅量（コントロールの増幅量に対する相対値）を示すグラフである。 図１１は、正常ヒト色素細胞におけるＤ－Ａｓｎ、Ｄ－Ｐｈｅ及びＤ－Ｔｒｐ添加時の細胞生存率を示すグラフである。 図１２は、Ｂ１６メラノーマ細胞におけるＤ－Ａｓｐ添加時の黒色メラニン産生率を示すグラフである。 図１３は、Ｂ１６メラノーマ細胞におけるＤ－Ｇｌｕ添加時の黒色メラニン産生率を示すグラフである。 図１４は、Ｂ１６メラノーマ細胞におけるＤ－Ｃｙｓ添加時の黒色メラニン産生率を示すグラフである。 図１５は、Ｂ１６メラノーマ細胞におけるＤ－Ｔｒｐ添加時の黒色メラニン産生率を示すグラフである。 図１６は、Ｂ１６メラノーマ細胞におけるＤ－Ａｓｐ添加時の細胞生存率を示すグラフである。 図１７は、Ｂ１６メラノーマ細胞におけるＤ－Ｇｌｕ添加時の細胞生存率を示すグラフである。 図１８は、Ｂ１６メラノーマ細胞におけるＤ－Ｃｙｓ添加時の細胞生存率を示すグラフである。 図１９は、Ｂ１６メラノーマ細胞におけるＤ－Ｔｒｐ添加時の細胞生存率を示すグラフである。 図２０は、正常ヒト色素細胞におけるＤ－Ｃｙｓ添加時のメラニン産生速度率を示すグラフである。 図２１は、正常ヒト色素細胞におけるＤ－Ａｓｐ添加時のメラニン産生速度率を示すグラフである。 図２２は、正常ヒト色素細胞におけるＤ－Ｈｉｓ添加時のメラニン産生速度率を示すグラフである。 図２３は、正常ヒト色素細胞におけるＤ－Ｐｈｅ添加時のメラニン産生速度率を示すグラフである。 図２４は、正常ヒト色素細胞におけるＤ－Ｔｒｐ添加時のメラニン産生速度率を示すグラフである。 図２５は、正常ヒト色素細胞におけるＤ－Ｃｙｓ添加時のタンパク質量の相対比を示すグラフである。 図２６は、正常ヒト色素細胞におけるＤ－Ａｓｐ添加時のタンパク質量の相対比を示すグラフである。 図２７は、正常ヒト色素細胞におけるＤ－Ｈｉｓ添加時のタンパク質量の相対比を示すグラフである。 図２８は、正常ヒト色素細胞におけるＤ－Ｐｈｅ添加時のタンパク質量の相対比を示すグラフである。 図２９は、正常ヒト色素細胞におけるＤ－Ｔｒｐ添加時のタンパク質量の相対比を示すグラフである。
［１．美白剤］
　本発明の美白剤は、Ｄ－Ａｓｎ、Ｄ－Ｖａｌ、Ｄ－ａｌｌｏ－Ｔｈｒ、Ｄ－Ｌｙｓ、Ｄ－Ｇｌｎ、Ｄ－Ｈｉｓ、Ｄ－Ｌｅｕ、Ｄ－Ｐｈｅ、Ｄ－Ｐｒｏ、Ｄ－Ｓｅｒ、Ｄ－Ｔｒｐ、Ｄ－Ｔｙｒ、Ｄ－Ａｓｐ、Ｄ－Ｇｌｕ、及びＤ－Ｃｙｓからなる群から選択される少なくとも１種のＤ－アミノ酸を有効成分とする。有効成分は、Ｄ－Ａｓｎ、Ｄ－Ｖａｌ、Ｄ－ａｌｌｏ－Ｔｈｒ、Ｄ－Ｌｙｓ、Ｄ－Ｇｌｎ、Ｄ－Ｈｉｓ、Ｄ－Ｌｅｕ、Ｄ－Ｐｈｅ、Ｄ－Ｓｅｒ、Ｄ－Ｔｒｐ、及びＤ－Ｔｙｒからなる群から選択される少なくとも１種のＤ－アミノ酸であることが好ましい。Ｄ－Ｃｙｓは、Ｌ－Ｃｙｓと同様に安定性が低い場合がある（特開２００９－２２７６６０号公報）。また、Ｄ－Ａｓｐ及びＤ－Ｇｌｕは、溶解性を向上させるためにｐＨを高めに調整する必要が生じる場合がある。
　本発明者らは、生体中にごく微量にしか含まれていないＤ－アミノ酸の含有量と肌のメラニンインデックス及びＬ＊値に相関関係があることを見出した。そして、相関関係を見出したＤ－アミノ酸を用いて、メラニン産生に関連するタンパク質の遺伝子発現量を検討したところ、タンパク質の遺伝子発現量に有意な減少がみられるものを見出した。
　従って、従来、ラセミ体としてのアミノ酸そのものが有効成分とみなされていたアミノ酸のうち、生体中にごく微量にしか含まれていないＤ－アミノ酸が、肌のメラニンインデックス及びＬ＊値に関連するタンパク質の産生を強く抑制し、有効成分として作用するという新規な知見を見出した。本発明の美白剤は、このような新規な知見に基づき、生体中にごく微量にしか含まれていないＤ－アミノ酸が有する顕著な効果を利用するものである。
　本明細書中、「美白」とは、肌の過剰なメラニンの発生を抑制し、しみ、そばかす、くすみを改善することを意味する。
　アミノ酸には、光学異性体としてＤ体及びＬ体が存在する。このうち、天然のタンパク質は、Ｌ－アミノ酸がペプチド結合して構成されている。例えば、リモネンは、光学異性体で生理活性が異なるものが存在することが知られている。しかし、Ｄ－アミノ酸がＬ－アミノ酸で構成されるタンパク質に及ぼす影響について、現在のところ研究段階であり、体系的な理解はなされていない。
　Ｄ－アミノ酸は、それらの塩であってもよい。塩としては薬学上許容される塩であればよい。例えば、カリウム塩、ナトリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、バリウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩、トリシクロヘキシルアンモニウム塩等のアンモニウム塩；モノエタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、モノイソプロピルアルコールアミン塩、ジイソプロピルアルコールアミン塩、トリイソプロピルアルコールアミン塩等のアルカノールアミン塩が挙げられる。
　Ｄ－アミノ酸の製法は特に限定されない。例えば、合成法、抽出法、酵素法、発酵法が挙げられる。Ｄ，Ｌ―アミノ酸のラセミ混合物を光学分割して製造する方法も挙げられる。光学分割は特に限定されなく、従来公知の方法（例えば、カンファースルホン酸等の光学分割剤を用いてジアステレオマー塩を調製し、溶解性の差を利用して分割する）で行えばよい。
　本発明の美白剤は、必要に応じて上記のＤ－アミノ酸以外の美白成分を含有し、美白剤組成物を形成していてもよい。
　本発明の美白剤は、Ｄ－Ｇｌｎ、Ｄ－Ｈｉｓ、Ｄ－Ｐｒｏ、及びＤ－Ｔｒｐからなる群から選択される少なくとも１種のＤ－アミノ酸、並びにＤ－Ｔｙｒ及び／又はＤ－ＬｙｓであるＤ－アミノ酸、の少なくともいずれかを有効成分とするものであることが好ましく、Ｄ－Ｇｌｎ、Ｄ－Ｈｉｓ、及びＤ－Ｔｒｐからなる群から選択される少なくとも１種のＤ－アミノ酸、並びにＤ－Ｔｙｒ及び／又はＤ－ＬｙｓであるＤ－アミノ酸、の少なくともいずれかを有効成分とするものであることがより好ましい。これらのＤ－アミノ酸は後述する本発明の評価方法において、若い年代の女性のメラニンインデックス及びＬ＊値の少なくともいずれかと相関が認められたものである。
　本発明の美白剤は、Ｄ－Ｌｅｕ、Ｄ－Ｐｈｅ、Ｄ－Ｓｅｒ、及びＤ－Ｔｙｒからなる群から選択される少なくとも１種のＤ－アミノ酸を有効成分とするか、或いはＤ－Ｈｉｓと、Ｄ－Ｇｌｎ、Ｄ－Ｔｒｐ、Ｄ－Ａｓｎ、Ｄ－Ｖａｌ、Ｄ－ａｌｌｏ－Ｔｈｒ、及びＤ－Ｌｙｓからなる群から選択される少なくとも１種のＤ－アミノ酸と、の少なくともいずれかを有効成分とするものであることも好ましい。これらのＤ－アミノ酸は後述する本発明の評価方法において、年配の女性のメラニンインデックス及びＬ＊値の少なくともいずれかと相関が認められたものである。
　本発明の美白剤の効能は、例えば、日本香粧品学会誌，Ｖｏｌ．３０，Ｎｏ．４，ｐｐ．３３３－３３７（２００６）に記載の新規効能取得のための医薬部外品美白機能評価試験ガイドラインに記載の方法で判断し得る。より詳細には、目視又は写真による色素沈着評価において色素沈着が抑制されることを確認する方法、若しくは、分光測色計測定値より算出したメラニンインデックスを下げる、又はＬ＊値を上げることを確認する方法で判断し得る。中でも、分光測色計測定値より算出したメラニンインデックスを下げる、又はＬ＊値を上げる方法が好ましい。
［１－１．メラニン産生関連タンパク質の産生抑制剤］
　本発明のメラニン産生関連タンパク質の産生抑制剤は、Ｄ－Ａｓｎ、Ｄ－Ｐｈｅ、Ｄ－Ｔｒｐ、Ｄ－Ａｓｐ、Ｄ－Ｇｌｕ、Ｄ－Ｃｙｓ及びＤ－Ｈｉｓからなる群から選択される少なくとも１種のＤ－アミノ酸を有効成分とする。有効成分は、Ｄ－Ａｓｎ、Ｄ－Ｐｈｅ、Ｄ－Ｔｒｐ、及びＤ－Ｈｉｓからなる群から選択される少なくとも１種のＤ－アミノ酸であることが好ましい。メラニン産生関連タンパク質は、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１、及びメラノコルチン１レセプターからなる群から選択される少なくとも１種である。そのため、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１、及びメラノコルチン１レセプターからなる群から選択される少なくとも１種のメラニン産生関連タンパク質の産生を抑制するので、しみ、そばかす、くすみを改善又は抑制することができる。上記Ｄ－アミノ酸は、それらの塩であってもよく、美白剤に関して上述したとおりである。
　本発明のメラニン産生関連タンパク質の産生抑制剤により産生が抑制されるタンパク質は、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１、及びメラノコルチン１レセプターからなる群から選択される少なくとも１種である。
　チロシナーゼは、しみに強く関連するタンパク質であり、メラニン産生の最初の反応を触媒する。
　チロシナーゼ関連タンパク質１は、しみに強く関連するタンパク質であり、メラニン産生のなかで、チロシナーゼの次の段階を触媒する。
　メラノコルチン１レセプターは、しみに強く関連するタンパク質であり、α－ＭＳＨ（メラノサイト刺激ホルモン）受容体である。
　本発明のメラニン産生関連タンパク質の産生抑制剤は、必要に応じてＤ－Ａｓｎ、Ｄ－Ｐｈｅ、Ｄ－Ｔｒｐ、Ｄ－Ａｓｐ、Ｄ－Ｇｌｕ、Ｄ－Ｃｙｓ及びＤ－Ｈｉｓ以外のメラニン産生関連タンパク質の産生抑制剤を含有し、メラニン産生関連タンパク質の産生抑制組成物を形成していてもよい。
［２．皮膚化粧料及び皮膚外用剤（皮膚化粧料組成物及び皮膚外用剤組成物）］
　本発明の皮膚化粧料及び皮膚外用剤は、上記の美白剤又はメラニン産生関連タンパク質の産生抑制剤を含む。上記の美白剤又はメラニン産生関連タンパク質の産生抑制剤の含有量は、皮膚化粧料及び皮膚外用剤の種類に応じて適宜調整すればよい。Ｄ－アミノ酸の合計量で換算した場合の好適な含有量の下限は、通常、０．０１質量％以上であり、好ましくは０．１質量％以上であり、さらに好ましくは１質量％以上である。上限は、通常、３０質量％以下であり、好ましくは１０質量％以下である。
　本発明の皮膚化粧料及び皮膚外用剤は、ポリオール化合物、界面活性剤、高級アルコール、増粘剤、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、キレート剤、防腐剤及びシリコーンからなる群より選択される少なくとも１種の基剤を更に含んでもよく、含むことが好ましい。
　（ポリオール化合物）
　ポリオール化合物としては、例えば、エチレングリコール、ブチレングリコール、ポリエチレングリコール、ブチルエチルプロパンジオール、ポリプロピレングリコール共重合体、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、グリセリン、ジグリセリン、ソルビトールが挙げられる。中でも、ブチレングリコール、グリセリン、ポリエチレングリコール、ジプロピレングリコール、及びソルビトールからなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。
　（界面活性剤）
　界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンオレイン酸エステル、高級脂肪酸石けん、アルキル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、アルキルエーテルリン酸エステル塩、Ｎ－アシルアミノ酸塩、アシルＮ－メチルタウリン塩等のアニオン界面活性剤；塩化アルキルトリメチルアンモニウム、塩化ジアルキルジメチルアンモニウム等のカチオン界面活性剤；コカミドプロピルベタイン、アルキルジメチルアミノ酢酸ベタイン、アルキルアミドジメチルアミノ酢酸ベタイン、２－アルキル－Ｎ－カルボキシ－Ｎ－ヒドロキシイミダゾリニウムベタイン等の両性界面活性剤；グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、レシチン誘導体（リゾレシチン）、ポリオキシエチレン型（ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル等）、多価アルコールエステル型、エチレンオキシド・プロピレンオキシドブロック共重合体等の非イオン界面活性剤が挙げられる。中でも、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、レシチン誘導体、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、及びポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステルからなる群より選択される少なくとも１種が好ましい。
　（高級アルコール）
　高級アルコールとしては、例えば、セタノール、ベヘニルアルコール、イソヘキサデシルアルコールが挙げられる。中でも、ベヘニルアルコールが好ましい。
　（増粘剤）
　増粘剤は、例えば、ポリアクリル酸、カラギーナン、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシビニルポリマー、ポリオキシエチレングリコールジステアリン酸エステル、アクリル酸系ポリマー、セルロース系天然ポリマー、エタノール、ジカプリン酸ネオペンチルグリコール、ミリスチン酸カリウムが挙げられる。中でも、アクリル酸系ポリマー、キサンタンガム、及びセルロース系天然ポリマーからなる群より選択される少なくとも１種が好ましい。
　（紫外線吸収剤）
　紫外線吸収剤としては、例えば、ブチルメトキシベンゾイルメタン、パラジメチルアミノ安息香酸オクチル、パラメトキシ桂皮酸２－エチルヘキシル等の桂皮酸誘導体、ジメトキシベンジリデンジオキソイミダゾリジンプロピオン酸エチルヘキシルが挙げられる。中でも、桂皮酸誘導体が好ましい。
　（紫外線散乱剤）
　紫外線散乱剤としては、酸化チタン及び酸化亜鉛の少なくともいずれかが好ましい。
　（キレート剤）
　キレート剤としては、例えば、エチドロン酸、エデト酸三ナトリウム等のエチレンジアミン四酢酸（又はその誘導体）が挙げられる。中でも、エチレンジアミン四酢酸が好ましい。
　（防腐剤）
　防腐剤としては、パラベン及びフェノキシエタノールの少なくともいずれかが好ましい。パラベンとしては例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン等が挙げられる。
　（シリコーン）
　シリコーンとしては、例えば、メチルポリシロキサン、ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、デカメチルシクロペンタシロキサン、シクロヘキサシロキサン、シクロペンタシロキサン、トリメチルシロキシケイ酸、ポリオキシエチレン・メチルポリシロキサン共重合体、シリコンフルイド、シリコーンゴム、シリコーン油が挙げられる。
　本発明の皮膚化粧料又は皮膚外用剤は、上記以外の１又は２以上の他の基剤を含んでもよい。他の基剤は、通常の皮膚化粧料又は皮膚外用剤に用いられる基剤であればよく、例えば、油性基剤、水溶性基剤、乳化剤、安定化剤、ｐＨ調整剤、保存剤、他の機能性成分（生理活性成分）、トリエチルヘキサノイン等の香料、色素、溶剤、天然物抽出物、上記のＤ－アミノ酸以外のアミノ酸（誘導体）が挙げられる。
　油性基剤としては、例えば、ヒマシ油、綿実油、胡麻油、ホホバ油、オリーブ油、カカオ脂等の植物油脂；モクロウ、液状ラノリン等のラノリン、キャンデリラロウ、ミツロウ、カルナウバロウ等のロウ；ワセリン、流動パラフィン、固形パラフィン等のパラフィン、スクワラン、オレフィンオリゴマー、プラスチベース等の高級炭化水素；ラウリン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、パルミチン酸等の脂肪酸及びそれらのエステル；白灯油等のベースワックス；天然高分子、水添ポリイソブテンが挙げられる。
　水溶性基剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、セルロース誘導体（例えば、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カチオン化セルロース）、カルボキシビニルポリマー、エステル（例えば、イソプロピルミリステート、イソプロピルパルミテート、ステアリルステアレート、ミリスチン酸オクチルドデシル、オレイン酸オクチルドデシル、２－エチルヘキサン酸トリグリセリド）が挙げられる。
　乳化剤としては、例えば、ステアリルアルコール、グリセリルモノステアレート、ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ジグリセリンモノステアリン酸エステル、ポリソルベート６０、ミリストイルメチル－β－アラニン（フィトステリル／デシルテトラデシル）が挙げられる。
　安定化剤としては、例えば、球状ポリアクリル酸アルキル粉末、ジメチルジステアリルアンモニウムヘクトライト、アスコルビン酸、ピロ亜硫酸ナトリウム、ジェランガム、ペクチンが挙げられる。
　ｐＨ調整剤としては、例えば、リン酸塩緩衝剤、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエタノールアミンが挙げられる。
　保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸エチル、安息香酸ナトリウム、サリチル酸、ソルビン酸、亜硫酸水素ナトリウム、フェノキシエタノールが挙げられる。
　溶剤としては、例えば、アルギニン水溶液、精製水が挙げられる。
　色素としては、例えば、赤２０２、黄色４、青色１、ベンガラ、黄酸化鉄、黒酸化鉄が挙げられる。
　他の機能性成分としては、例えば、コウジ酸、リン酸トリオレイル、スクワラン、エチルヘキサン酸セチル、トコフェロール、マイカ、ビス（Ｎ－ラウロイル－Ｌ－グルタミン酸・Ｎ－ラウロイル－サルコシン）ダイマージリノレイル、酢酸トコフェロール、チオタウリン、ハチミツ、ラウロイルサルコシンイソプロピル、ラウロイルリシン、タルク、ジブチルエチルヘキサノイルグルタミド、ジブチルラウロイルグルタミド、ベントナイト、タウリン、アルブチン、パンテノール、ナイアシンアミド、ピリドキシン塩酸塩、レチノール、カロチン、リボフラビン、ユビキノン、ヒアルロン酸ナトリウム、水溶性コラーゲン、コンドロイチン硫酸ナトリウム、乳酸稈菌、乳発酵液、ホエイ、ヨーグルトエキス、加水分解カゼインナトリウム、ダイズ発酵エキス、塩化ベンザルコニウム、トリクロサン、サリチル酸、クエン酸、ビサボロール、塩化カルシウム、カプリル酸グリセリル、ミネラルオイル、ラウロイルグルタミン酸ナトリウム、コカミドＭＥＡ、コカミドメチルＭＥＡ、ポリビニルピロリドン、ココアンホ酢酸ナトリウム、ポリクオタニウム、グアーヒドロキシプロピルトリモニウムクロリドが挙げられる。
　天然物抽出物としては、例えば、ラベンダーエキス、ペパーミントエキス、セージエキス、アニスエキス、バラエキス、ヒノキ水、ルイボスエキス、ラベンダー抽出物、クララエキスが挙げられる。
　アミノ酸（誘導体）としては、例えば、Ｌ－ロイシン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－バリン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸ナトリウム、Ｌ－リシン（塩酸塩）、Ｌ－アルギニン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－アラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、グリシン、アセチルグルタミン、Ｌ－ヒスチジン、ピリドキシルセリン、カルノシン、アセチルメチオニン、アセチルシステイン、ポリアスパラギン酸ナトリウム、シトルリン、オルニチン、ベタイン、Ｌ－チロシン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－メチオニンが挙げられる。
　上記の他の基剤の含有量は、適宣設定すればよく、特に限定されるものではない。
　本発明の皮膚化粧料又は皮膚外用剤の剤形は特に限定されないが、例えば、液体、ローション剤、軟膏剤、クリーム剤、プラスター、テープ製剤、粉末、化粧水、ジェルが挙げられる。中でも、乳液、クリーム、化粧水、又はジェルが挙げられ、これらのいずれかであることが好ましい。　
　本発明の皮膚化粧料又は皮膚外用剤の使用部位は特に限定されなく、通常、皮膚、粘膜に適用される。中でも、好ましくは皮膚に使用される。そのため、本発明の皮膚化粧料又は皮膚外用剤の使用形態としては、例えば、水溶液、乳化物、粉末分散体、エマルジョン（水中油型、油中水型等）が挙げられる。より詳細には、液剤、油剤、ローション、ゲル、ゾル、乳液、懸濁液、クリーム、軟膏、貼付剤、スティック等が挙げられる。いわゆる化粧料としては、例えば、ローション、美容液等の化粧水；エモリエント乳液、ミルキーローション、ナリシング乳液、クレンジング乳液等の乳液；エモリエントクリーム、マッサージクリーム、クレンジングクリーム、メイクアップクリーム等のクリーム；スプレー；パック、ファンデーション、口紅、リップスティック、アイシャドウ、チーク、おしろい、カラーパウダー等のメイクアップ用化粧料、洗顔料、メイク落とし、ボディシャンプー、石鹸等の皮膚洗浄用化粧料が挙げられる。化粧料の他、医薬部外品、医薬品、食品（サプリメント、及び飲料を含む）として使用してもよい。
　本発明の皮膚化粧料又は皮膚外用剤の乳液又はクリームとしての構成は、例えば、本発明の剤と、ポリオール群（ブチレングリコール、グリセリン、ポリエチレングリコール、及びジプロピレングリコールからなる群から選択される少なくとも１種）と、界面活性剤群（グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、及びレシチン誘導体からなる群から選択される少なくとも１種）と、高級アルコール群（ベヘニルアルコール）と、増粘剤群（アクリル酸系ポリマー及びキサンタンガムの少なくともいずれか）と、紫外線吸収剤群（桂皮酸誘導体）と、紫外線散乱剤群（酸化チタン及び酸化亜鉛の少なくともいずれか）と、キレート剤群（エチレンジアミン四酢酸）と、防腐剤群（パラベン及びフェノキシエタノールの少なくともいずれか）と、シリコーンと、を含有する構成が挙げられる。
　本発明の皮膚化粧料又は皮膚外用剤の化粧水としての構成は、例えば、本発明の剤と、ポリオール群（ブチレングリコール、グリセリン、ポリエチレングリコール、及びソルビトールからなる群から選択される少なくとも１種）と、界面活性剤群（ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、及びポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステルからなる群から選択される少なくとも１種）と、増粘剤群（アクリル酸系ポリマー、キサンタンガム、及びセルロース系天然ポリマーからなる群から選択される少なくとも１種）と、紫外線吸収剤群（桂皮酸誘導体）と、キレート剤群（エチレンジアミン四酢酸）と、防腐剤群（パラベン及びフェノキシエタノールの少なくともいずれか）と、シリコーンと、を含有する構成が挙げられる。
　本発明の皮膚化粧料又は皮膚外用剤のジェルとしての構成は、例えば、本発明の剤と、ポリオール群（ブチレングリコール、グリセリン、及びポリエチレングリコールからなる群から選択される少なくとも１種）と、界面活性剤群（ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、及びポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステルからなる群から選択される少なくとも１種）、増粘剤群（アクリル酸系ポリマー、キサンタンガム、及びセルロース系天然ポリマーからなる群から選択される少なくとも１種）と、紫外線吸収剤群（桂皮酸誘導体）と、キレート剤群（エチレンジアミン四酢酸）と、防腐剤群（パラベン及びフェノキシエタノールの少なくともいずれか）と、シリコーンと、を含有する構成が挙げられる。
　本発明の美白剤及びメラニン産生関連タンパク質の産生抑制剤は、美白作用を通じて、加齢、紫外線、炎症等の原因によるしみ、そばかす、くすみの予防、抑制、治療に優れた効果を発揮することができる。
［３．評価方法］
　本発明の評価方法は、被検者の肌のメラニンインデックス及びＬ＊値の少なくともいずれかを測定して被検者の肌の外観を確認すること、前記被検者の肌の色素沈着部位から角層を採取すること、角層に含まれる少なくとも１種のＤ－アミノ酸量を特定すること、前記肌の外観と前記Ｄ－アミノ酸量との関係を、被検者の結果の間で比較することを含む、Ｄ－アミノ酸による肌の評価方法である。
　本発明の評価方法は、大別すると、次の２つの実施態様がある。一実施態様は、肌の外観と各成分との関係を、被検者（予備被検者）の結果の間で比較（同じ被検者の複数の結果の間での比較でもよいし、複数の異なる被検者の結果の間での比較でもよい）し、相関関係があるか否かを確認し、相関関係が確認された場合に、肌の外観とそのＤ－アミノ酸量との相関関係を被検者（予備被検者と同一でもよいし別でもよい）の肌の評価の指標として選抜する実施態様である。他の実施態様は、被検者に皮膚化粧料、皮膚外用剤、これらの候補物質等のサンプルを投与した前後の角質中のＤ－アミノ酸量を特定し、上記の相関関係に照らして得られた投与前後の肌の評価を比較して、サンプルの評価、又は、被検者の肌に対する有効性の評価を行う実施態様である。
　被検者は、男性及び女性のいずれであってもよい。但し、美白に敏感であることから女性であることが好ましく、加齢によるしみ又はくすみに関心を持ちはじめる２０代若しくは３０代の女性、又は加齢によるしみ又はくすみのケアを行うことが多い４０代若しくは５０代の女性が更に好ましい。
　本発明の評価方法において、肌の外観は、メラニンインデックス及びＬ＊値の少なくともいずれかで確認してもよい。
　しみ又はくすみのある人は、皮膚細胞の機能低下、中でも、紫外線暴露等の外部刺激によるメラノサイトのメラニン産生亢進、それに続くケラチノサイトへのメラニンの過剰輸送、蓄積を原因とする細胞機能（細胞分化増殖機能）の低下により、ケラチノサイトにおけるメラニン量が増加し易い。そのため、メラニンインデックスは、しみ及びくすみの無さ、すなわち肌の美白を評価する指標として用いられている。
　Ｌ＊値は、色の明度を表す指標であり、０～１００の数値で評価される指標として用いられている。０は黒色、１００は白の拡散色を示し、数値が高いほど美白効果に優れると言える。
　メラニンインデックス及びＬ＊値の測定は、従来公知の方法で行えばよい。例えば、パルスキセノンランプを光源に用い４００～７００ｎｍの範囲において反射光を測定できる分光測色計ＣＭ－７００ｄ（コニカミノルタ社製）及びデータ解析に肌解析ソフトウェアＣＭ－ＳＡの組み合わせを用いる測定が挙げられる。メラニンインデックスは少ない方が美白効果に優れているといえる。肌の外観は、Ｃｏｕｒａｇｅ＋Ｋｈａｚａｋａ社のＭｅｘａｍｅｔｅｒＭＸ１８を用いて、肌に６６０ｎｍ又は８８０ｎｍの波長の光を照射した際の反射された光から測定できるメラニンの濃さで評価してもよい。
　肌の外観の測定部位は特に限定されるものではない。但し、紫外線等の外部刺激による過剰なメラニン産生を原因とするしみ、そばかす、くすみを評価する観点から、日常生活で外部にさらされる部位であることが好ましい。例えば、頬や腕が挙げられる。
　測定箇所は、１か所であってもよく、２か所以上であってもよい。
　角層は、肌の外観の色素沈着部位から、テープストリッピング法等の従来公知の方法で採取すればよい。テープストリッピング法とは皮膚に粘着テープを貼り付けて、粘着テープを剥がすことにより、粘着面に付着した角層を採取する方法である。
　角層の採取方法としては、例えば、測定部位に市販の粘着テープを押し付けてはがした際に、粘着テープに付着した角層を採取する方法が挙げられる。市販の粘着テープとしては、例えば、アサヒバイオメッド社製角質チェッカー、モリテックス社製角層シール、ＰＲＯＭＯＴＯＯＬ社製角質チェッカー（ディスクタイプＷ、ディスクタイプＧ、ＰＲＯタイプ）、Ｉｎｔｅｇｒａｌ社製Ｃｏｒｎｅｏｆｉｘ、３Ｍ社製透明テープ、３Ｍ社製透明両面テープ、ニチバン社製セロテープ（登録商標）が挙げられる。
　Ｄ－アミノ酸量を特定する方法は、特に限定されず、例えば、直接法（プレカラム誘導体化した後、キラル固定相カラムを用いるクロマトグラフィーで分離する方法）、又は間接法（キラルな誘導体化試薬でジアステレオマーに誘導体化した後、逆相カラムを用いるクロマトグラフィーで分離する方法）が挙げられる。
　直接法としては、例えば、ＮＢＤ－Ｆでプレカラム蛍光誘導体化をした後、キラルカラムで分離して蛍光検出する方法が挙げられる。詳細には、“Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｂｒａｎｃｈｅｄ　ａｌｉｐｈａｔｉｃ　Ｄ－ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ｉｎ　ｍａｍｍａｌｓ　ｕｓｉｎｇ　ａｎ　ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ｍｕｌｔｉ－ｌｏｏｐ　ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　ｃｏｌｕｍｎ－ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ　ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ　ｓｙｓｔｅｍ　ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ　ｒｅｖｅｒｓｅｄ－ｐｈａｓｅ　ａｎｄ　ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｃｏｌｕｍｎｓ．”　Ｊ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ　Ａ．　２００７　Ｍａｒ　２；１１４３（１－２）：１０５－１１．　Ｈａｍａｓｅ　Ｋ，　Ｍｏｒｉｋａｗａ　Ａ，　Ｏｈｇｕｓｕ　Ｔ，　Ｌｉｎｄｎｅｒ　Ｗ，　Ｚａｉｔｓｕ　Ｋ．を参照し得る。
　間接法として、例えば、ＯＰＡとキラルチオールで誘導体化して逆相カラムで分離し、蛍光検出する方法、及びＤＢＤ－ＰｙＮＣＳで誘導体化して逆相カラムで分離して、質量分析計で検出する方法が挙げられる。詳細には、“Ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｎａｔｕｒａｌｌｙ　ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ　Ｄ－ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ｉｎ　ｓａｋｅ．”　Ｊ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ　Ｂ　Ａｎａｌｙｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌ　Ｂｉｏｍｅｄ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ．　２０１１　Ｎｏｖ　１；８７９（２９）：３２５９－６７．　Ｇｏｇａｍｉ　Ｙ，　Ｏｋａｄａ　Ｋ，　Ｏｉｋａｗａ　Ｔ．“Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＬ－ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ，　ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｒ（－）－４－（３－ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｏｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎ－１－ｙｌ）－７－（Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ）－２，１，３－ｂｅｎｚ　ｏｘａｄｉａｚｏｌｅ，　ｉｎ　ｎａｉｌ　ｏｆ　ｄｉａｂｅｔｉｃ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｂｙ　ＵＰＬＣ－ＥＳＩ－ＴＯＦ－ＭＳ”　Ｊ．　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．　Ｂ，　８７９，　３２２０－３２２８　（２０１１）．　Ｊ．Ｚ．　Ｍｉｎ，　Ｓ．　Ｈａｔａｎａｋａ，　Ｈ．Ｆ．　Ｙｕ，　Ｔ．　Ｈｉｇａｓｈｉ，　Ｓ．　Ｉｎａｇａｋｉ，　Ｔ．　Ｔｏｙｏ’ｏｋａを参照し得る。
　特定対象であるＤ－アミノ酸は、Ｄ－Ａｓｎ、Ｄ－Ｖａｌ、Ｄ－ａｌｌｏ－Ｔｈｒ、Ｄ－Ｌｙｓ、Ｄ－Ｇｌｎ、Ｄ－Ｈｉｓ、Ｄ－Ｌｅｕ、Ｄ－Ｐｈｅ、Ｄ－Ｐｒｏ、Ｄ－Ｓｅｒ、Ｄ－Ｔｒｐ、及びＤ－Ｔｙｒからなる群から選択される少なくとも１種を含むことが好ましい。
　上記のより好ましいＤ－アミノ酸は、２０代から３０代、及び４０代から５０代の少なくともいずれかの年代の女性の肌のメラニンインデックス及びＬ＊値の少なくともいずれかと相関関係を有する成分であることが、本発明の評価方法から確認し得る。
　本発明のＤ－アミノ酸による肌の評価方法の一実施態様により、特定のＤ－アミノ酸と肌の外観との相関について新たな知見がもたらされる。そのため本発明の評価方法は、天然物に由来する美白剤等の皮膚化粧料、又は皮膚外用剤の開発へ応用し得る。
　より詳細に、被検者の年代とＤ－アミノ酸の種類として以下のことが言える。被検者が、２０代又は３０代の女性である場合、Ｄ－アミノ酸は、Ｄ－Ｌｙｓ、Ｄ－Ｇｌｎ、Ｄ－Ｈｉｓ、Ｄ－Ｐｒｏ、Ｄ－Ｔｒｐ、及びＤ－Ｔｙｒからなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。
　被検者が、４０代又は５０代の女性である場合、Ｄ－アミノ酸は、Ｄ－Ａｓｎ、Ｄ－Ｖａｌ、Ｄ－Ａｌｌｏ－Ｔｈｒ、Ｄ－Ｌｙｓ、Ｄ－Ｇｌｎ、Ｄ－Ｈｉｓ、Ｄ－Ｌｅｕ、Ｄ－Ｐｈｅ、Ｄ－Ｓｅｒ、Ｄ－Ｔｒｐ、及びＤ－Ｔｙｒからなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。
　Ｄ－アミノ酸量の特定方法は、特に限定されない。例えば、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）又はガスクロマトグラフィー（ＧＣ）を用いる質量分析法、定量用酵素を用いる酵素法、バイオアッセイ法が挙げられる。
　上述した中でも、Ｄ－アミノ酸の特定と含有量の測定を同時に行うことができるので、液体クロマトグラフ－タンデム型質量分析計が好ましい。
　Ｄ－アミノ酸量は、角層に含まれるタンパク質量あたりのＤ－アミノ酸含有量であることが好ましい。これにより、角層の採取方法に由来する実験誤差を低減することができる。
　タンパク質量の測定方法は、特に限定されず、例えば、紫外吸収法、ＢＣＡ法、ブラッドフォード法、ローリー法、ビューレット法等の分光光度計を用いた測定方法、電気泳動による測定方法が挙げられる。中でも、ＢＣＡ法が好ましい。
　本発明のＤ－アミノ酸による肌の外観の評価方法によれば、肌のメラニンインデックス及びＬ＊値の少なくともいずれかと、Ｄ－アミノ酸量との関係が、複数の被検者から得られ、これらを比較することで、肌の外観と相関するＤ－アミノ酸を特定し得る。
　本発明のＤ－アミノ酸による肌の外観の評価方法を用いることで、Ｄ－アミノ酸の含有量により肌の外観を評価し得る。そのため、同一被検者を対象として、皮膚化粧料又は皮膚外用剤等のサンプルを投与した前後において、相関関係が認められたＤ－アミノ酸の含有量を比較することで、対象者へのサンプルの有効性を確認できる。そのため、対象者に適切な皮膚化粧料又は皮膚外用剤であるか否かを確認する方法としても利用し得る。
　本発明のＤ－アミノ酸による肌の外観の評価方法の他の実施態様により、皮膚化粧料又は皮膚外用剤を投与する前後で、従来の測定方法のようにメラニンインデックスの低下又はＬ＊値の増加による短期的な評価のみならず、投与直後にはメラニンインデックスの低下又はＬ＊値の増加が観測されなくても、Ｄ－アミノ酸の含有量により長期的にメラニンインデックスの低下又はＬ＊値の増加を予想し、美白効果の可能性があるか否かを評価することができる。
　以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本実施例により本発明が限定されるものではない。
　（メラニンインデックス及びＬ＊値の測定）
　被検者は洗顔した後、恒温恒湿室（湿度４０％、室温２０℃）にて２０分間馴化した。
　馴化後、分光測色計ＣＭ－７００ｄ（コニカミノルタ社製）及びデータ解析に肌解析ソフトウェアＣＭ－ＳＡを用いて、被検者の頬中央部を測定した。
　（テープストリッピング法による角層採取）
　上記測定終了後、被検者の頬中央部に３ｃｍ×３ｃｍにカットしたテープを貼付し、角層を採取した。１回目に採取した最表層の角層は分析には利用せず、２回目以降に採取した角層を分析に利用した。
　（Ｄ－アミノ酸抽出操作）
　被検者（全員女性、年齢構成：２０－３０代　３１名、４０－６０代　４０名：合計人数　７１名）の肌状態（メラニンインデックス及びＬ＊値）を測定した同じ部位の顔面頬部にテープ（３×３ｃｍ２）を貼り、テープストリッピング法により角層を採取した。採取した１層目の角層は分析には使用せず、分析は２あるいは３層目を利用した。採取したテープは、コニカルチューブ（５０ｍｌ）に入れて密閉し、－８０℃にて保存した。
　採取した角層を、９５％メチルアルコール水溶液を用いて超音波処理を２回繰り返し、水溶成分を抽出した。抽出液には内部標準液（Ｄ－Ａｒｇ等複数種のＤ，Ｌ－アミノ酸安定同位体を含む）を添加して行った。得られたメチルアルコール水溶液は、遠心エバポレーターで乾固し、Ｄ－アミノ酸分析用のサンプルとした。
　（Ｄ－アミノ酸の定量分析）
　濃縮乾固したサンプルに５０μＬの水を添加してボルテックスミキサーで撹拌して再溶解し、サンプル溶液とした。２０μＬのサンプル溶液に、濃度２００ｍＭのほう酸緩衝液（ｐＨ８．８）を１０μＬ加えて撹拌した後、５ｍｇ／ｍＬの（Ｒ）－Ｎ－（ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　ｃａｒｂａｍａｔｅ）－β－（３－ｐｙｒｉｄｙｌ）－ａｌａｎｉｎｅ　ｍｅｔｈｙｌ　ｅｓｔｅｒ／アセトニトリル溶液を２０μＬ加えて室温で１０分間反応させた。反応溶液に０．１Ｍ塩酸水溶液を６０μＬ添加して分析サンプルとした。分析にはＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用い、以下の条件で分析した。
　（ＨＰＬＣ条件）
　装置　　　　　：Ｎｅｘｅｒａ　Ｘ２（島津製作所製）
　ガードカラム　：Ｗａｔｅｒｓ　ＡＣＱＵＩＴＹ　ＢＥＨ　Ｃ１８　ＶａｎＧｕａｒｄ
（２．１×５０ｍｍ、１．７μｍ）
　カラム　　　　：Ｗａｔｅｒｓ　ＡＣＱＵＩＴＹ　ＵＰＬＣ　ＢＥＨ　Ｃ１８
（２．１×１００ｍｍ、１．７μｍ）
　移動相Ａ　　　：１０ｍＭ重炭酸アンモニウム水溶液（ｐＨ９．５）
　移動相Ｂ　　　：８０％メタノール／水
　流速　　　　　：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
　カラム温度　　：５０℃
　サンプル注入量：１μＬ
　グラジエント条件を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（質量分析計条件）
　装置　　　　　：Ｔｒｉｐｌｅ　Ｑｕａｄ　６５００（ＳＣＩＥＸ）
　イオン化法　　：ＥＳＩ、　Ｐｏｓｉｔｉｖｅモード
　スキャンタイプ：ＳＲＭ（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）
　トランジッションを表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　（タンパク質抽出）
　水溶成分を抽出した後の上記テープをマイクロチューブに入れ、ヘキサンを用いて不溶画分を溶出した。テープを除去した後、不溶画分をヘキサンにて洗浄し、タンパク質定量分析用サンプルとした。
　（タンパク質定量分析）
　上記「Ｄ－アミノ酸抽出操作」にて利用したチューブ等に、ＮａＯＨ（０．５ｍｏｌ／Ｌ）－ＳＬＳ（０．０５ｗｔ％）水溶液を加え、６０分間、９０℃で加熱した。これらの溶液に溶出されたタンパク質を定量した。
　タンパク質の定量には、Ｍｉｃｒｏ　ＢＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｒｅａｇｅｎｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を利用し、ＭｉｃｒｏＢＣＡ法を実施した。サンプル溶液とＭｉｃｒｏＢＣＡ溶液を同量加え、１時間、５０℃で加熱振とう（１１００ｒｐｍ）した。分光器にて、吸光度（５６２ｎｍ）を測定してタンパク質を定量した。
評価方法の実施例及び比較例
　表３に、Ｄ－Ａｓｎ、Ｄ－Ｖａｌ、Ｄ－ａｌｌｏ－Ｔｈｒ、Ｄ－Ｌｙｓ、Ｄ－Ｇｌｎ、Ｄ－Ｈｉｓ、Ｄ－Ｌｅｕ、Ｄ－Ｐｈｅ、Ｄ－Ｐｒｏ、Ｄ－Ｓｅｒ、Ｄ－Ｔｒｐ、Ｄ－Ｔｙｒの角層中の含有量と肌のメラニンインデックス及びＬ＊値の相関を示す。相関係数の絶対値が０．３以上を「中程度の相関」として「Ａ」と評価し、０．２以上を「弱い相関」として「Ｂ」と評価した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３からわかるように、Ｄ－Ｇｌｎ、Ｄ－Ｈｉｓ、Ｄ－Ｌｅｕ、Ｄ－Ｐｈｅ、Ｄ－Ｐｒｏ、Ｄ－Ｓｅｒ、Ｄ－Ｔｒｐ、及びＤ－ＴｙｒのＤ－アミノ酸の角層中の含有量は、若い女性及び年配女性の少なくともいずれかと肌のメラニンインデックスに相関が認められた。また、Ｄ－Ｇｌｎ、Ｄ－Ｌｅｕ、Ｄ－Ｐｈｅ、Ｄ－Ｓｅｒ、Ｄ－Ｔｒｐ、Ｄ－Ｔｙｒ、Ｄ－Ａｓｎ、Ｄ－Ｖａｌ、Ｄ－ａｌｌｏ－Ｔｈｒ、及びＤ－ＬｙｓのＤ－アミノ酸の角層中の含有量は、若い女性及び年配女性の少なくともいずれかと肌のＬ＊値に相関が認められた。
　メラニンインデックスと、Ｄ－アミノ酸の含有量と、を比較したプロットを図１及び２に示し、Ｌ＊値と、Ｄ－アミノ酸の含有量と、を比較したプロットを図３及び４に示す。図１～４において、アミノ酸含有量は、上記「Ｄ－アミノ酸の定量分析」にて求めたアミノ酸含有量を上記「タンパク質定量分析」にて求めたタンパク質量で除した値である。
美白剤の実施例１～４
（正常ヒト表皮色素細胞を用いた、Ｄ－アミノ酸の「美白」に関する遺伝子発現試験）
　正常ヒト表皮色素細胞（ライフテクノロジーズ社）を、Ｍｅｄｉｕｍ　２５４（ライフテクノロジーズ社）（ＨＭＧＳ特注増殖添加剤セット含有（クラボウ社））にて３７℃、５％ＣＯ２、飽和蒸気下で培養した。コンフルエント状態になった細胞を、６ウェルプレートに３．０×１０５（ｃｅｌｌｓ／ウェル）の播種密度で播種した。
　評価サンプルは、各Ｄ－アミノ酸を５００μＭになるように上記培地にて調整したものを利用した。播種翌日、各評価サンプルを５００μＭに調整し、各ウェル培地を交換した。２４時間培養し、ＲＮｅａｓｙ　ｍｉｎｉ　ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて細胞からＲＮＡを抽出し、Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ　ｃＤＮＡ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　ｗｉｔｈ　ＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（サーモフィッシャー社）を用いてｃＤＮＡに合成した。このｃＤＮＡを鋳型にしてＲＴ－ＰＣＲ法（７５００　ｆａｓｔ　ｓｙｓｔｅｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社））により、サンプル添加群とコントロール群とを比較し遺伝子発現量の増減を評価した。チロシナーゼ及びチロシナーゼ関連タンパク質１の少なくともいずれかの遺伝子発現量を評価した。結果を表４に示す。表４中、ＴＹＲはチロシナーゼを、ＴＲＰ１はチロシナーゼ関連タンパク質１を、ＭＣ１Ｒはメラノコルチン１レセプターを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４から、Ｄ－Ａｓｎを用いた場合、１００μＭの濃度で、メラノコルチン１レセプター遺伝子、５００μＭの濃度で、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１遺伝子の発現量の減少が認められた。また、Ｄ－Ｐｈｅを用いた場合、５００μＭの濃度で、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１遺伝子の発現量の減少が認められた。さらに、Ｄ－Ｔｒｐを用いた場合、５００μＭの濃度でチロシナーゼ関連タンパク質１遺伝子の発現量の減少が認められた。
　図５は、Ｄ－Ａｓｎ（実施例２）のメラニン産生関連タンパク質遺伝子（チロシナーゼ）の増幅量（コントロールの増幅量に対する相対値）を示すグラフである。図６は、Ｄ－Ａｓｎ（実施例２）のメラニン産生関連タンパク質遺伝子（チロシナーゼ関連タンパク質１）の増幅量（コントロールの増幅量に対する相対値）を示すグラフである。図７は、Ｄ－Ａｓｎ（実施例１）のメラニン産生関連タンパク質遺伝子（メラノコルチン１レセプター）の増幅量（コントロールの増幅量に対する相対値）を示すグラフである。図８は、Ｄ－Ｐｈｅ（実施例３）のメラニン産生関連タンパク質遺伝子（チロシナーゼ）の増幅量（コントロールの増幅量に対する相対値）を示すグラフである。図９は、Ｄ－Ｐｈｅ（実施例３）のメラニン産生関連タンパク質遺伝子（チロシナーゼ関連タンパク質１）の増幅量（コントロールの増幅量に対する相対値）を示すグラフである。さらに、図１０は、Ｄ－Ｔｒｐ（実施例４）のメラニン産生関連タンパク質遺伝子（チロシナーゼ関連タンパク質１）の増幅量（コントロールの増幅量に対する相対値）を示すグラフである。
　これらの結果は、Ｄ－アミノ酸がメラニン産生関連タンパク質の産生を抑制し、美白剤の有効成分として有用であることを示している。
実施例５
（細胞毒性試験：ニュートラルレッド法）
　正常ヒト表皮色素細胞を６ウェルプレートに播種し、翌日、Ｄ－アミノ酸（５００μＭ）を、細胞の培養用培地にて調整したサンプルを添加した。２４時間後、プレートから評価サンプル溶液を取り除き、各ウェルを２ｍｌの細胞の培地を用いてリンスした。ＮＲ（ニュートラルレッド（クラボウ社））入り培地を２ｍｌ／ｗｅｌｌで滴下し、２時間、３７℃、５％ＣＯ２、飽和蒸気下で静置した。
　培地（ニュートラルレッド入り）を捨て、洗浄固定液（２ｗｔ％塩化カルシウム溶液及び２ｗｔ％ホルマリン溶液を等量で混合）を２ｍｌ／ｗｅｌｌ添加し、１分間静置後、洗浄固定液を取り除いた。ＮＲ抽出液（５０容量％エチルアルコール、１容量％酢酸）２ｍｌ／ｗｅｌｌを添加し、プレートシェイカーにて１５分間震蕩した。生細胞へのＮＲの取り込みは、マイクロプレートリーダー（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）でＮＲ抽出液の５４０ｎｍの吸光度を測定することにより調べた。コントロール（サンプル添加なし）のＮＲ抽出液の測定値（吸光度）を１００％と規定した場合の、所定濃度の各サンプル添加細胞のＮＲ抽出液の吸光度を相対％にすることにより、各サンプルの細胞毒性を算出した。評価結果を図１１に示す。
　図１１から、５００μＭの濃度では、各Ｄ－アミノ酸成分は、細胞毒性がないことがわかる。従って、細胞毒性の無い濃度において、Ｄ－アミノ酸が各種メラニン産生関連タンパク質の遺伝子発現量を低減し得ることを見出した。
実施例６
（黒色メラニン産生抑制試験１）
　Ｂ１６メラノーマ細胞をＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ）（高グルコース、血清１０％含有）にて培養した。コンフルエントになった細胞を、トリプシンにて剥がし、９６ウェルプレートに播種した。翌日、細胞がプレートに接着後、各評価サンプル（コントロール（サンプル添加なし）、Ｄ－アミノ酸（Ｄ－Ａｓｐ、Ｄ－Ｇｌｕ、Ｄ－Ｃｙｓ、Ｄ－Ｔｒｐのいずれか））を所定評価濃度（１ｍＭあるいは５ｍＭ）を添加したＤＭＥＭ（高グルコース、血清１０％含有、フェノールレッド不含）と培地交換し、３日間培養した。プレートシェーカーにて９６ウェルプレートを５分間震とうし、４５０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ　ＦＣ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にて測定した。コントロール（サンプル添加なし）の測定値（吸光度）を１００％と規定した場合の、各サンプル所定濃度添加３日後の吸光度を相対％にすることにより、コントロール中の黒色メラニン量を１００％とした場合の、各サンプルの黒色メラニン産生率を算出した。結果を図１２～１５に示す。
　図１２～１５から、各サンプルの１ｍＭ又は５ｍＭの評価濃度において添加により細胞の黒色メラニン産生率が低下することがわかる。
実施例７
（細胞毒性試験（ニュートラルレッド法））
　実施例６にて吸光度を測定した後、プレートから評価サンプル溶液を取り除き、各ウェルを２００μｌのＤＭＥＭ（高グルコース、血清１０％含有）を用いてリンスした。ＮＲ（ニュートラルレッド）（０．５％）入り培地を２００μｌ／ｗｅｌｌで滴下し、２時間、３７℃、５％ＣＯ２、飽和蒸気下で静置した。培地を捨て、洗浄固定液（２ｗｔ％塩化カルシウム溶液及び２ｗｔ％ホルマリン溶液を等量で混合）を２００μｌ／ｗｅｌｌ添加し、１ｍｉｎ静置後、洗浄固定液を取り除いた。ＮＲ抽出液（酢酸酸性エタノール）２００μｌ／ｗｅｌｌを添加し、プレートシェイカーにて１５ｍｉｎ震とうした。生細胞へのＮＲの取り込みは、マイクロプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ　ＦＣ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）でＮＲ抽出液の５４０ｎｍの吸光度を測定することにより調べた。コントロール（サンプルなし）のＮＲ抽出液の測定値（吸光度）を１００％と規定した場合の、所定濃度の各サンプル添加細胞のＮＲ抽出液の吸光度を相対％にすることにより、各サンプルの細胞生存率を算出した。結果を図１６～１９に示す。
　図１６～１９から、１ｍＭ又は５ｍＭの評価濃度において各サンプルの細胞毒性はいずれも低いことがわかる。実施例６及び７の結果は、各サンプルがメラニン産生抑制活性を示し、かつ細胞毒性が低いことを示している。
実施例８
（チロシナーゼ活性抑制試験）
　正常ヒト色素細胞をＭｅｄｉｕｍ２５４（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にＨＭＧＳ特注増殖添加剤セット（倉敷紡績株式会社製）を添加した培地にて培養した。コンフルエントになった細胞を、トリプシンにて剥がし、６ウェルプレートに播種した。翌日、細胞がプレートに接着後、前述の培地からホルボール１２－ミリスタート１３－アセタート（ＰＭＡ）を除いた培地で培地交換した。さらに４８時間後、各評価サンプル（コントロール（サンプル添加なし）、Ｄ－アミノ酸）を所定濃度（１ｍＭあるいは５ｍＭ）で添加したＰＭＡを除いた培地と交換し、３日間培養した。培地を除き、１／１５に希釈したＰＢＳでリンスした。溶解液（１ｗｔ％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００、１／１５に希釈したＰＢＳ）を２００μｌ／ｗｅｌｌ添加し、プレートシェイカーにて５ｍｉｎ震とうした。ピペッティングにより細胞を溶解、撹拌した溶解液をマイクロチューブに回収し、２０μｌをタンパク質定量用に分注した。残りの溶解液を遠心分離（９１００ｇ、４℃、５ｍｉｎ）し、上清４０μｌを９６ウェルプレートに添加した。この９６ウェルプレートにＬ－ＤＯＰＡ溶液（２ｍｇ／ｍｌ、１／１５に希釈したＰＢＳ）を１００μｌ／ｗｅｌｌで添加し、３７℃に加温しながら、１ｍｉｎ毎に４９０ｎｍの吸光度を測定した。測定中は定期的にプレートリーダーによって９６ウェルプレートを撹拌した。測定した吸光度から最大メラニン産生速度（単位時間当たりの吸光度の変化）を算出し、コントロール（サンプルなし）の最大メラニン産生速度を１００％と規定した場合の、所定濃度の各Ｄ－アミノ酸添加細胞の最大メラニン産生速度を相対％にすることにより、各Ｄ－アミノ酸のメラニン産生速度率を算出した。結果を図２０～２４に示す。
　図２０～２４から、各サンプルの添加により細胞のメラニン産生速度が低下することがわかる。
実施例９
（タンパク質定量）
　実施例８のチロシナーゼ活性抑制試験にて分注した細胞溶解液（２０μｌ）にＭｉｌｌｉＱ水（８０μｌ）を添加し、１００μｌとした。この溶液中のタンパク質量を、ＤＣプロテインアッセイ（バイオ・ラッド社製）を使用して定量した。測定は、サンプル溶液１００μｌに対して、Ａ液１００μｌ、Ｂ液８００μｌを混和して行った。コントロール（サンプルなし）のタンパク質量を１００％と規定した場合の、所定濃度の各Ｄ－アミノ酸添加でのタンパク質量の相対％を算出した。結果を図２５～２９に示す。
　図２５～２９から、各サンプルのタンパク質量はいずれも９５％以上であった。実施例８及び９の結果は、各サンプルがチロシナーゼ活性抑制効果を有し、かつ細胞毒性が低いことを示している。
　（処方例１；美容液）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　（処方例２；クリーム）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　（処方例３；乳液）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　（処方例４；口紅）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　（処方例５；軟膏）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　（処方例６；日焼け止め）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　（処方例７；化粧水）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　（処方例８；ジェリー状パック）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　表１２中のＤ－アミノ酸及びＬ－アミノ酸の詳細を表１３に記す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　（処方例９；ｏ／ｗ型ファンデーション）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　（処方例１０；メイククレンジング）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　（処方例１１；洗顔フォーム）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　（処方例１２；ボディシャンプー）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017

Claims (15)

  1. 　Ｄ－アスパラギン、Ｄ－バリン、Ｄ－アロスレオニン、Ｄ－リシン、Ｄ－グルタミン、Ｄ－ヒスチジン、Ｄ－ロイシン、Ｄ－フェニルアラニン、Ｄ－セリン、Ｄ－トリプトファン、及びＤ－チロシンからなる群から選択される少なくとも１種のＤ－アミノ酸を有効成分とする美白剤。
  2. 　分光測色計測定値より算出したメラニンインデックスを下げる又はＬ＊値を上げる請求項１に記載の美白剤。
  3. 　Ｄ－グルタミン、Ｄ－ヒスチジン、及びＤ－トリプトファンからなる群から選択される少なくとも１種のＤ－アミノ酸、並びに
    　Ｄ－チロシン及び／又はＤ－リシンであるＤ－アミノ酸、の少なくともいずれかを有効成分とする請求項１又は２に記載の美白剤。
  4. 　Ｄ－ロイシン、Ｄ－フェニルアラニン、Ｄ－セリン、及びＤ－チロシンからなる群から選択される少なくとも１種のＤ－アミノ酸を有効成分とするか、或いは
    　Ｄ－ヒスチジンと、Ｄ－グルタミン、Ｄ－トリプトファン、Ｄ－アスパラギン、Ｄ－バリン、Ｄ－アロスレオニン、及びＤ－リシンからなる群から選択される少なくとも１種のＤ－アミノ酸と、の少なくともいずれかを有効成分とする請求項１又は２に記載の美白剤。
  5. 　Ｄ－アスパラギン、Ｄ－フェニルアラニン、Ｄ－トリプトファン、及びＤ－ヒスチジンからなる群から選択される少なくとも１種のＤ－アミノ酸を有効成分とする、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１、及びメラノコルチン１レセプターからなる群から選択される少なくとも１種のメラニン産生関連タンパク質の産生抑制剤。
  6. 　請求項１～４のいずれか１項に記載の美白剤、又は請求項５に記載のメラニン産生関連タンパク質の産生抑制剤を含む皮膚化粧料又は皮膚外用剤。
  7. 　ポリオール化合物、界面活性剤、高級アルコール、増粘剤、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、キレート剤、防腐剤及びシリコーンからなる群より選択される少なくとも１種の基剤を更に含む請求項６に記載の皮膚化粧料又は皮膚外用剤。
  8. 　剤形が、乳液、クリーム、化粧水、又はジェルである請求項６又は７に記載の皮膚化粧料又は皮膚外用剤。
  9. 　被検者の肌のメラニンインデックス及びＬ＊値の少なくともいずれかを測定して前記被検者の肌の外観を確認すること、
    　前記被検者の肌の色素沈着部位から角層を採取すること、
    　前記角層に含まれる少なくとも１種のＤ－アミノ酸量を特定すること、
    　前記肌の外観と前記Ｄ－アミノ酸量との関係を、被検者の結果の間で比較すること
    を含む、Ｄ－アミノ酸による肌の評価方法。
  10. 　前記Ｄ－アミノ酸量の特定が、
    　前記角層に含まれるタンパク質量あたりのＤ－アミノ酸含有量の測定である請求項９に記載の評価方法。
  11. 　前記Ｄ－アミノ酸の含有量の測定を、液体クロマトグラフ－タンデム型質量分析計により行う請求項９又は１０に記載の評価方法。
  12. 　前記タンパク質量の測定をＢＣＡ法により行う請求項１０又は１１に記載の評価方法。
  13. 　前記Ｄ－アミノ酸が、Ｄ－アスパラギン、Ｄ－バリン、Ｄ－アロスレオニン、Ｄ－リシン、Ｄ－グルタミン、Ｄ－ヒスチジン、Ｄ－ロイシン、Ｄ－フェニルアラニン、Ｄ－プロリン、Ｄ－セリン、Ｄ－トリプトファン、及びＤ－チロシンからなる群から選択される少なくとも１種を含む請求項９～１２のいずれか１項に記載の評価方法。
  14. 　前記被検者が、２０代又は３０代の女性であり、
    　前記Ｄ－アミノ酸が、Ｄ－リシン、Ｄ－グルタミン、Ｄ－ヒスチジン、Ｄ－プロリン、Ｄ－トリプトファン、及びＤ－チロシンからなる群から選択される少なくとも１種である請求項１３に記載の評価方法。
  15. 　前記被検者が、４０代又は５０代の女性であり、
    　前記Ｄ－アミノ酸が、Ｄ－アスパラギン、Ｄ－バリン、Ｄ－アロスレオニン、Ｄ－リシン、Ｄ－グルタミン、Ｄ－ヒスチジン、Ｄ－ロイシン、Ｄ－フェニルアラニン、Ｄ－セリン、Ｄ－トリプトファン、及びＤ－チロシンからなる群から選択される少なくとも１種である請求項１３に記載の評価方法。
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