WO2017204365A1 - ラメラ構造改善剤、水分保持改善剤 - Google Patents

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WO2017204365A1
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peak
intercellular lipid
hydroxyproline
drug
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宏樹 大成
匡俊 関谷
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株式会社コーセー
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    • A61Q19/08—Anti-ageing preparations

Definitions

  • the present invention contains as an active ingredient at least one selected from N-acetyl-L-hydroxyproline, L-proline, N-acetyl-L-tyrosine, L-threonine, L-methionine, and N-acetyl-L-glucosamine.
  • the present invention relates to a lamellar structure improving agent and a moisture retention improving agent.
  • the intercellular lipid on the surface of the living body builds a lipid barrier by linking cells together.
  • the stratum corneum lipid in the stratum corneum on the skin surface plays a role of preventing moisture from entering from the outside and maintaining moisture in the skin due to its barrier ability.
  • the fine structure of the intercellular lipid is disturbed by drying, aging, etc., and the barrier ability inherent in the intercellular lipid may decline or be lost.
  • the decline or loss of barrier ability leads to bacterial infection and skin breakdown, which in turn leads to loss of skin beauty.
  • Non-Patent Document 1 development of cosmetics such as lotion, emulsion, cream, etc. that can improve / modify the microstructure of intercellular lipids is desired (see Non-Patent Document 1).
  • the object of the present invention is to improve the lamellar structure in the microstructure of the intercellular lipid and / or to modify the filling structure.
  • the gist of the present invention is as follows. [1] Contains at least one selected from N-acetyl-L-hydroxyproline, L-proline, N-acetyl-L-tyrosine, L-threonine, L-methionine, and N-acetyl-L-glucosamine as an active ingredient. Lamellar structure improving agent in the microstructure of intercellular lipids. [2] At least one selected from N-acetyl-L-hydroxyproline, L-proline, N-acetyl-L-tyrosine, L-threonine, L-methionine, and N-acetyl-L-glucosamine is contained as an active ingredient.
  • Packing structure modifier in the microstructure of intercellular lipids At least one selected from N-acetyl-L-hydroxyproline, L-proline, N-acetyl-L-tyrosine, L-threonine, L-methionine, and N-acetyl-L-glucosamine is contained as an active ingredient. Tetragonal ratio maintenance / improving agent in the microstructure of intercellular lipids. [4] Contains at least one selected from N-acetyl-L-hydroxyproline, L-proline, N-acetyl-L-tyrosine, L-threonine, L-methionine and N-acetyl-L-glucosamine as an active ingredient.
  • An agent for improving moisture retention in the skin [5] Contains as an active ingredient at least one selected from N-acetyl-L-hydroxyproline, L-proline, N-acetyl-L-tyrosine, L-threonine, L-methionine, N-acetyl-L-glucosamine Barrier ability improving agent for skin. [6] Contains at least one selected from N-acetyl-L-hydroxyproline, L-proline, N-acetyl-L-tyrosine, L-threonine, L-methionine, and N-acetyl-L-glucosamine as an active ingredient. Anti-aging agent in the skin.
  • An active ingredient is at least one selected from N-acetyl-L-hydroxyproline, L-proline, N-acetyl-L-tyrosine, L-threonine, L-methionine, and N-acetyl-L-glucosamine.
  • Anti-wrinkle agent on the skin [8] N-acetyl-L-hydroxyproline, L-proline, N-acetyl-L-tyrosine, L-threonine, L-methionine, N- for production of a lamellar structure improving agent in the microstructure of intercellular lipids At least use selected from acetyl-L-glucosamine.
  • N-acetyl-L-hydroxyproline, L-proline, N-acetyl-L-tyrosine, L-threonine, L-methionine, N-acetyl-L-glucosamine for production of a moisture retention improving agent in skin At least use selected from.
  • At least one selected from N-acetyl-L-hydroxyproline, L-proline, N-acetyl-L-tyrosine, L-threonine, L-methionine, and N-acetyl-L-glucosamine is an active ingredient.
  • FIG. 3 is a diagram schematically showing three small peaks (A) to (C).
  • “x” indicates the peak tops of the small peaks (A) to (C), and the temperatures at the positions of the respective peak tops are indicated by S1 to S3.
  • (A) is a figure which shows the result of the small angle X-ray-scattering measurement of a certain object
  • (b) is a figure which shows the result of the wide-angle X-ray scattering measurement of a certain object.
  • ⁇ is the peak position (respectively, 0.27nm -1, 0.23nm -1, 0.22nm -1) peaks (X) ⁇ (Z) indicates the temperature at each position T1 ⁇ T3 represents a phase transition temperature.
  • B in, " ⁇ ” indicates at 25 ° C., a peak (V), the peak position of (W) (respectively, 2.4nm -1, 2.7nm -1). It is the schematic which shows the method of evaluating the fine structure of the intercellular lipid of embodiment. It is the schematic which shows the method of evaluating the fine structure of the intercellular lipid of 1st embodiment.
  • intercellular lipid sample intercellular lipid model
  • intercellular lipid control each drug added to intercellular lipid model
  • a peak of an intercellular lipid sample (intercellular lipid model) and / or a plurality of small peaks, and an intercellular lipid control (in which each drug is added to the intercellular lipid model)
  • an intercellular lipid control in which each drug is added to the intercellular lipid model
  • Wide-angle X-ray scattering measurement for making details of fine structure known about intercellular lipid control (added each drug to intercellular lipid model) in the method of the example which is an example of the method of the first embodiment It is a figure which shows the result.
  • the wide-angle X-ray scattering measurement is not performed about the intercellular lipid sample.
  • the peak of the intercellular lipid sample (intercellular lipid model) and / or a plurality of small peaks and the intercellular lipid control (added each drug to the intercellular lipid model) ) And / or a plurality of small peaks are compared with respect to the area of the DSC peak and the three small peaks (first peak, intermediate peak, and second peak) obtained by dividing the DSC peak. is there. It is a figure which shows the outline of the result obtained by the more suitable form of the method of 1st embodiment.
  • an intercellular lipid subject after addition of a drug (each drug added to an intercellular lipid model) and an intercellular lipid subject to which no drug is added ( It is a figure which shows the result of the differential scanning calorimetry of an intercellular lipid model) regarding the area of a DSC peak and three small peaks (a 1st peak, an intermediate peak, and a 2nd peak) obtained by dividing
  • the peak and / or a plurality of small peaks of the intercellular lipid subject after addition of the drug each drug added to the intercellular lipid model), and cells to which no drug is added
  • a peak of an interlipid subject (intercellular lipid model) and / or a plurality of small peaks, a DSC peak, and three small peaks obtained by dividing it (first peak, intermediate peak, second peak) It is a figure which shows the result compared about the area.
  • N-acetyl-L-hydroxyproline, L-proline, N-acetyl-L-tyrosine, L-threonine, L-methionine, N-acetyl-L in the example method which is an example of the method of the second embodiment -It is a figure which shows the result of the wide-angle X-ray-scattering measurement for confirming the detail of a fine structure about the intercellular lipid subject (intercellular lipid model) after addition of amino acids other than glucosamine.
  • At least one selected from N-acetyl-L-hydroxyproline, L-proline, N-acetyl-L-tyrosine, L-threonine, L-methionine and N-acetyl-L-glucosamine of the present invention is an active ingredient.
  • the embodiments of the lamellar structure improving agent, the filling structure modifying agent, the tetragonal ratio maintaining / improving agent in the fine structure of the intercellular lipid, and the moisture retention improving agent and barrier ability improving agent in the skin of the present invention are described in detail. An example will be described. In addition, about the evaluation etc.
  • tetragonal crystal is also sometimes referred to as orthorhombic crystal.
  • N-acetyl-L-hydroxyproline, N-acetyl-L-tyrosine and N-acetyl-L-glucosamine mentioned as active ingredients in the present invention are natural L-hydroxyproline, L-tyrosine and L-glucosamine.
  • the amino group is modified with an acetyl group, and may be organically synthesized.
  • N-acetyl-L-hydroxyproline L-proline
  • N-acetyl-L-tyrosine L-threonine
  • L-methionine N-acetyl-L-glucosamine
  • Lipids and skin may be derived from humans or non-human animals (eg, pigs, cows, birds, sheep, goats, rabbits, dogs, cats, etc.), and intercellular lipid models prepared in vitro. It is good.
  • intercellular lipid and the part of the skin in the living body are not particularly limited, and may be skin, hair, or the like.
  • N-acetyl-L-hydroxyproline L-proline, N-acetyl-L-tyrosine, L-threonine, L-methionine, and N-acetyl-L-glucosamine
  • at least one active ingredient selected from these N-acetyl-L-hydroxyproline, L-proline, N-acetyl-L-tyrosine, L-threonine, L-methionine, and N-acetyl-L-glucosamine. May be expressed as “the active ingredient”.
  • N-acetyl-L-hydroxyproline is particularly preferable as the active ingredient.
  • At least one selected from the above-mentioned N-acetyl-L-hydroxyproline, L-proline, N-acetyl-L-tyrosine, L-threonine, L-methionine, N-acetyl-L-glucosamine may contain other components.
  • the amount of amino acid in the formulation is preferably 0.01 to 2% by mass, and more preferably 0.1 to 1% by mass.
  • the specific combination of the above-mentioned amino acid may be sufficient.
  • the blending amount of each amino acid in all amino acids is preferably 0.01 to 2% by mass, and more preferably 0.1 to 1% by mass.
  • N-acetyl-L-hydroxyproline a combination of N-acetyl-L-hydroxyproline and serine may be suitably used as such a combination.
  • the blending ratio of serine to N-acetyl-L-hydroxyproline is preferably from 0.1 to 2, and more preferably from 0.15 to 1.5.
  • intercellular lipid for example, intercellular lipid of human skin
  • packing between molecules such as fatty acid, cholesterol, ceramide, etc. contained in intercellular lipid is improved, for example It is presumed that cholesterol is aligned along the sphingoid part of ceramide and fatty acid is oriented along the fatty acid part of ceramide, and thus an excellent crystal structure is obtained in the intercellular lipid.
  • Administration of the active ingredient to the intercellular lipid improves the lamellar structure (short-period lamellar structure, long-period lamellar structure) in the fine structure of the intercellular lipid or increases the lamellar structure.
  • the absolute amount of the lamellar structure of the intercellular lipid microstructure is To increase.
  • the filling structure in the microstructure of the intercellular lipid is modified, or the filling structure becomes denser.
  • SWAXS small-angle and wide-angle X-ray scattering
  • the water retention in the skin is improved or the water retention is improved by administering the active ingredient to the skin.
  • the barrier ability in the skin is improved, or the barrier ability is improved.
  • the anti-aging effect in skin is obtained by administering the active ingredient to the skin or the like.
  • the filling structure of stratum corneum intercellular lipids in the stratum corneum which is the outermost layer of the skin, tends to loosen with aging (see the IFSCC 2014 Paris Conference / Domestic Report Meeting Abstracts).
  • a healthy Japanese woman from the 20s to the 50s as a subject, and analyzing the cheek stratum corneum by Raman spectrum measurement, the packing index of the stratum corneum filling structure of the subject in the 50s It was found that it was as low as a dozen percent compared to the index of subjects in their 20s.
  • the effect of modifying the filling structure is obtained by administration of the active ingredient to the skin, by administering the active ingredient to the skin or the like, anti-aging in the skin (anti-aging) The effect of will be acquired.
  • transdermal administration for example, by directly taking out the lamellar structure improving agent or moisture retention improving agent containing the active ingredient with fingers or applying, adhering, depositing, etc. using a prop such as a spoon or spatula. You can go.
  • the dosage of the lamellar structure improving agent and the water retention improving agent is not particularly limited as long as an effect is obtained, and may be appropriately adjusted depending on the condition, weight, sex, age, etc. of the subject.
  • it when administered by application to the skin, it is preferably 0.1 to 100 mg / cm 2 , more preferably 1 to 100 mg / cm 2 , more preferably 10 to 100 mg. / Cm 2 .
  • the administration interval of the lamella structure improving agent and the moisture retention improving agent is not particularly limited as long as the effect is obtained, but is preferably 1 to 48 hours, and more preferably 1 to 48 hours. 24 hours, more preferably 1 to 12 hours.
  • Each agent of the present invention may contain additives as necessary in addition to the active ingredient.
  • additives include cell activators, antioxidants, humectants, UV inhibitors, solvents (water, alcohols, etc.), oils, surfactants, thickeners, powders, chelating agents, pH adjusters, Examples include emulsifiers, stabilizers, colorants, brighteners, flavoring agents, flavoring agents, excipients, binders, disintegrating agents, lubricants, diluents, osmotic pressure adjusting agents, and fragrances.
  • the lamellar structure improving agent and water retention improving agent of the present invention may be prepared in various forms such as liquid, emulsion, cream, solid, gel, and paste.
  • Each agent may be prepared in various dosage forms such as oil-based, water-in-oil emulsified system, oil-in-water emulsified system.
  • each agent is skin care cosmetics such as lotion, milky lotion, cream, beauty essence, cosmetic oil, lip balm, hand cream, face wash, cleansing agent; foundation, makeup base, cheek red, eye shadow , Mascara, eyeliner, eyebrow, overcoat agent, lipstick, lip gloss makeup cosmetics; hair tonic, hair cream, shampoo, rinse, conditioner, hair conditioner scalp or hair cosmetics; massage cosmetics It can be set as various cosmetics.
  • each agent of the present invention may be included in cosmetics, may be included in quasi-drugs, and may also be included in pharmaceuticals such as external preparations for skin.
  • each agent of the present invention is not particularly limited, and may be a normal method in the technical field.
  • the present invention includes the use of the active ingredient for producing a lamellar structure improving agent or a moisture retention improving agent.
  • XRD X-ray diffraction
  • SWAXS small-angle and wide-angle X-ray scattering
  • FIG. 1 (a) schematically shows the results of differential scanning calorimetry of a certain object
  • FIG. 1 (b) shows the differential scanning calorimetry peak shown in FIG. 1 (a) divided by curve fitting using a nonlinear least square method.
  • the three small peaks (A) to (C) are schematically shown.
  • “x” indicates the peak tops of the small peaks (A) to (C), and the temperatures at the positions of the respective peak tops are indicated by S1 to S3.
  • FIG. 2A shows the result of a small-angle X-ray scattering measurement of a certain object
  • FIG. 2B shows the result of a wide-angle X-ray scattering measurement of a certain object.
  • the " ⁇ " indicates, for each position Temperatures T1 to T3 in FIG.
  • the " ⁇ ” indicates at 25 ° C.
  • a peak (V) the peak position of (W) (respectively, 2.4nm -1, 2,7nm -1).
  • the peak (V) at 2.4 nm ⁇ 1 is derived from hexagonal crystals and tetragonal crystals
  • the peak (W) at 2.7 nm ⁇ 1 is derived from tetragonal crystals.
  • the ratio (%) to the total of the tetragonal tetragonal and hexagonal crystals is [Sw / ⁇ (Sv ⁇ 2 ⁇ Sw) / 3 + Sw ⁇ ] ⁇ 100.
  • the area of the differential scanning calorimetry peak and the integrated value of the diffraction peak intensity of the small-angle X-ray scattering measurement have a correlation. Specifically, as the former increases / decreases, the latter also increases / decreases. Based on this, it is known that the absolute amount of the lamellar structure (the absolute amount of the total of tetragonal and hexagonal crystals) can be evaluated from the area of the differential scanning calorimetry peak. (See FIG. 1 (a) and FIG. 2 (a)).
  • the inventors tried a new method of dividing the target differential scanning calorimetry peak into a plurality of small peaks by curve fitting by a non-linear least square method, and the divided small peaks (A) ⁇
  • Each temperature at the peak position of (C) (indicated by S1 to S3 in FIG. 1B) and the peak position of diffraction peaks (X) to (Z) by the target temperature scanning small angle X-ray scattering measurement. It has been found that there is a correlation with the temperature (indicated by T1 to T3 in FIG. 2A), specifically, the temperatures S1 to S3 are extremely close to T1 to T3, respectively. (See FIG. 1B and FIG. 2A).
  • the diffraction peak (Y) obtained by the temperature scanning small-angle X-ray scattering measurement is estimated to be derived from a lamellar structure composed of fatty acid, cholesterol, and ceramides. It became so.
  • the inventors have information on the microstructure of the intercellular lipid (for example, the ratio of the tetragonal crystal and the hexagonal crystal), which is information obtained from the differential scanning calorimetry peak, for example, from wide-angle X-ray scattering measurement. (See Fig. 1 (b) and Fig. 2 (b)).
  • the method for evaluating the microstructure of the intercellular lipid of the embodiment is based on differential scanning calorimetry (hereinafter also referred to as “DSC measurement”).
  • the microstructure of the intercellular lipid can be evaluated, and as a result, the microstructure of the intercellular lipid can be easily evaluated for many objects of interest. Enable.
  • the method of the embodiment it is possible to evaluate the details of the fine structure of the intercellular lipid. Furthermore, according to the method of the embodiment, it becomes possible to evaluate the change in the microstructure of the intercellular lipid before and after the addition of the drug. This makes it possible to screen for cosmetics and drugs that affect the filling structure of intercellular lipids, and evaluate whether they are components that loosen the packing structure of intercellular lipids or components that make the filling structure dense. be able to. Eventually, it becomes possible to control the barrier of the stratum corneum and enhance the percutaneous absorption of the active ingredient blended in the cosmetic.
  • Examples of the intercellular lipid to which the method of the embodiment can be applied include the skin corneum, the cell membrane complex (CMC (Cell Membrane Complex)) part in the hair, and more specifically, the cuticle CMC (CU-CU), Examples include cuticle-cortex CMC (CU-CO), cortex-cortex CMC (CO-CO), and these model systems (described later).
  • CMC Cell Membrane Complex
  • CU-CU cuticle CMC
  • Examples include cuticle-cortex CMC (CU-CO), cortex-cortex CMC (CO-CO), and these model systems (described later).
  • differential scanning calorimetry is performed in a high lipid concentration state.
  • a model system is preferred because it can be performed and peak detection is easy.
  • the method of the embodiment it is preferable to perform differential scanning calorimetry for a plurality of objects.
  • the results of differential scanning calorimetry can be compared between the objects, and detailed knowledge about the fine structure of the intercellular lipid can be obtained.
  • the plurality of objects refers to two or more objects, and it is preferable that there are three or more objects.
  • FIG. 3 shows a schematic diagram of a method for evaluating the fine structure of the intercellular lipid of the embodiment.
  • the method of the embodiment performs differential scanning calorimetry for a plurality of objects (object A and object B in FIG. 3) (DSC measurement process).
  • the differential scanning calorimetry peaks of a plurality of objects are then divided into a plurality of small peaks, respectively, by a nonlinear least square method (peak dividing step).
  • the plurality of small peaks refers to two or more small peaks, and the number of small peaks is preferably three or more.
  • This step may be performed using a computing device such as a computer, for example.
  • functions used for curve fitting for peak shapes include a Gaussian function, a Lorentz function, a Forked function obtained by convolving these two, and particularly, a Gaussian function and a Lorentz function. Is preferred.
  • Examples of the peak analysis software include Origin and the like. Examples of algorithms installed in the analysis software include Levenberg-Marquardt (LMA).
  • the method of the embodiment continues with the differential scanning calorimetry peak and / or the plurality of small peaks of one of the plurality of objects and the differential scanning calorie of the other of the plurality of objects corresponding to these peaks.
  • a measurement peak and / or a plurality of small peaks are compared (comparison step). In this step, the area and peak position of peaks and / or a plurality of small peaks may be compared.
  • the above-mentioned plurality of subjects are not particularly limited, but those that can be comparatively studied are preferable, for example, an intercellular lipid sample and an intercellular lipid control, an intercellular lipid subject after addition of a drug, and an unadded drug
  • examples include intercellular lipid subjects, stratum corneum collected from beautiful skin, stratum corneum collected from rough skin, healthy hair, damaged hair, and the like.
  • the drug refers to a substance that can change the fine structure (lamella structure, filling structure) of intercellular lipids, and is not particularly limited as long as it is a component that is usually blended into cosmetics, for example.
  • Active ingredients such as whitening ingredients, anti-skin roughening ingredients, and moisturizing ingredients.
  • FIG. 4 the schematic of the method of evaluating the fine structure of the intercellular lipid of 1st embodiment is shown.
  • the method for evaluating the microstructure of the intercellular lipid of the first embodiment uses the aforementioned plurality of subjects as an intercellular lipid sample and an intercellular lipid control, The details of the microstructure of the intercellular lipid in the intercellular lipid sample are evaluated.
  • the intercellular lipid sample refers to the intercellular lipid to be evaluated for details of the fine structure
  • the intercellular lipid control refers to the intercellular lipid to be compared with the intercellular lipid sample.
  • the details of the fine structure of the intercellular lipid are the ratio of the tetragonal crystal and the hexagonal crystal in the packed structure of the intercellular lipid.
  • an intercellular lipid sample is used as an intercellular lipid model
  • an intercellular lipid control is used as an agent (ethanol, glycerin, 1,3-butylene glycol (1,3-BG). , And a mixture thereof).
  • first, differential scanning calorimetry is performed on an intercellular lipid sample and an intercellular lipid control (DSC measurement step).
  • the differential scanning calorimetry peaks of the intercellular lipid sample and the intercellular lipid control are each divided into a plurality of small peaks by a nonlinear least square method (peak division step).
  • peak division step the DSC peak of the intercellular lipid model and the intercellular lipid model added with the drug is divided into three small peaks, a first peak, an intermediate peak, and a second peak (see FIG. 4). .
  • FIG. 5 shows an intercellular lipid sample (intercellular lipid model) and intercellular lipid control (in which each drug is added to the intercellular lipid model) in the method of the example which is an example of the method of the first embodiment.
  • the results of differential scanning calorimetry are shown with respect to the area of the DSC peak and three small peaks (first peak, intermediate peak, and second peak) obtained by dividing it.
  • a differential scanning calorimetry peak and / or a plurality of small peaks of the intercellular lipid sample, a differential scanning calorimetry peak and / or a plurality of small peaks of the intercellular lipid control are compared (sample-control comparison process).
  • the DSC peak of the intercellular lipid model, the first peak, the intermediate peak, and the second peak obtained by dividing the DSC peak, and the DSC peak of the intercellular lipid model with each drug added and Each of the first peak, intermediate peak, and second peak obtained by dividing it is compared (see FIGS. 6 and 8).
  • the following may be performed in the sample-control comparison step described above.
  • FIG. 6 shows a peak of an intercellular lipid sample (intercellular lipid model) and / or a plurality of small peaks and an intercellular lipid control (each drug is added to the intercellular lipid model) in a preferred embodiment of the method of the first embodiment.
  • a differential scanning calorimetry peak and / or a plurality of differential scanning calorimetry peaks and / or areas of a plurality of small peaks compared to the intercellular lipid sample are used.
  • Select one with a small peak area In the example shown here, the areas of all DSC peaks of the intercellular lipid model obtained by adding a drug (ethanol, glycerin, 1,3-butylene glycol (1,3-BG), or a mixture thereof) to the intercellular lipid model are shown. This is smaller than the DSC peak area of the intercellular lipid model (see FIG. 6). Based on this, all of the intercellular lipid models to which the above-mentioned drugs are added are selected as intercellular lipid controls.
  • the differential scanning calorimetry peak of the intercellular lipid sample and / or the area of the plurality of small peaks are obtained from the differential scanning calorimetry peak of the intercellular lipid control and / or the area of the plurality of small peaks. Is regarded as the area of the peak and / or the plurality of small peaks derived from the hexagonal crystal in the intercellular lipid sample. In the example shown here, from the areas of the first peak, the intermediate peak, and the second peak of the intercellular lipid model, the first peak, the intermediate peak, the first peak of the intercellular lipid model obtained by adding each drug to the intercellular lipid model.
  • the area of the small peak obtained by subtracting the area of each of the two peaks that is, the area of the peak related to the portion indicated by the broken line in FIG. 6 is regarded as the area of the peak derived from the hexagonal crystal in the intercellular lipid model. ing.
  • the hexagonal crystal is lost in preference to the tetragonal crystal, that is, the absolute amount of the tetragonal crystal varies greatly.
  • the absolute amount of hexagonal crystals decreases while being maintained in some cases.
  • the above findings show that when an object has less lamellar structure compared to another object, there is less hexagonal crystal than tetragonal crystal in that object, that is, the absolute amount of tetragonal crystal is This also means that the absolute amount of tetragonal crystals is small compared to the other target, although it is almost the same as that of the other target.
  • the ratio of the tetragonal crystal to the hexagonal crystal in the packed structure is known. May be preferred.
  • the ratio of the tetragonal crystal to the hexagonal crystal in the packed structure can be made known by a known method such as the small-angle / wide-angle X-ray scattering (SWAXS) measurement described above.
  • FIG. 7 shows a wide angle for making the details of the fine structure known about the intercellular lipid control (added each drug to the intercellular lipid model) in the method of the example which is an example of the method of the first embodiment. The result of a X-ray scattering measurement is shown. In addition, the wide-angle X-ray scattering measurement is not performed about the intercellular lipid sample.
  • the following method may be used in the preferable embodiment of the method of the first embodiment.
  • FIG. 8 shows a more preferred form of the method of the first embodiment, in which a peak of an intercellular lipid sample (intercellular lipid model) and / or a plurality of small peaks, and an intercellular lipid control (each drug in an intercellular lipid model).
  • a peak of an intercellular lipid sample intercellular lipid model
  • an intercellular lipid control each drug in an intercellular lipid model.
  • a cell having a ratio of tetragonal to hexagonal of 80:20 to 100: 0 is selected as an intercellular lipid control.
  • an intercellular lipid model in which glycerol is added to an intercellular lipid model having a ratio of tetragonal crystal to hexagonal crystal of 90:10 is selected as the intercellular lipid control.
  • the differential scanning calorimetry peak of the intercellular lipid control and / or the area of the plurality of small peaks are (substantially) peaks and / or derived from tetragonal crystals in the intercellular lipid sample.
  • the ratio of tetragonal to hexagonal crystals in the intercellular lipid sample is based on the differential scanning calorimetry peak of the intercellular lipid control and / or the area of the multiple small peaks, based on what can be considered as the area of multiple small peaks.
  • the area of a peak derived from hexagonal crystals and / or a plurality of small peaks in an intercellular lipid sample are (substantially) peaks and / or derived from tetragonal crystals in the intercellular lipid sample.
  • the ratio of tetragonal to hexagonal crystals in the intercellular lipid sample is based on the differential scanning calorimetry peak of the intercellular lipid control and / or the area of the multiple small peaks, based on what can be considered
  • the area of the DSC peak of the intercellular lipid model to which glycerin has been added can be regarded as the area of the peak derived from the tetragonal crystal in the intercellular lipid model.
  • To hexagonal crystal is the area of the DSC peak of the intercellular lipid model to which glycerin was added, that is, the area of the peak related to the part shown in black in FIG. 8 and the area of the DSC peak of the intercellular lipid model From this, the area of the small peak obtained by subtracting the area of the DSC peak of the intercellular lipid model to which glycerin was added, that is, the ratio to the area of the peak related to the portion indicated by the broken line in FIG. Yes.
  • the ratio of the tetragonal crystal and the hexagonal crystal is similarly obtained as the intercellular lipid sample. (See FIG. 8).
  • a more preferable embodiment of the method of the first embodiment is characterized in that, as an intercellular lipid control, one having substantially all tetragonal packing structures is selected.
  • FIG. 9 shows an outline of the results obtained by a more preferable form of the method of the first embodiment.
  • the ratio of the tetragonal crystal and the hexagonal crystal in the intercellular lipid model can be obtained as indicated by the box in FIG.
  • FIG. 11 the schematic of the method of evaluating the fine structure of the intercellular lipid of 2nd embodiment is shown.
  • the method for evaluating the fine structure of the intercellular lipid of the second embodiment (hereinafter also referred to as “method of the second embodiment”) is based on a plurality of subjects, intercellular lipid subjects after drug addition, and no drug added.
  • the change in the microstructure of the intercellular lipid between the intercellular lipid subject after addition of the drug and the intercellular lipid subject without addition of the drug before and after the addition of the drug is evaluated.
  • the intercellular lipid subject refers to an intercellular lipid to be evaluated for changes in microstructure before and after drug addition.
  • ethanol, glycerin, 1,3-butylene glycol (1,3) used in the method of the first embodiment described above is used as a drug.
  • -BG mixtures thereof, and N-acetyl-L-hydroxyproline, L-proline, N-acetyl-L-tyrosine, L-threonine, L-methionine, N-acetyl-L-glucosamine.
  • differential scanning calorimetry is performed on the intercellular lipid subject after addition of the drug and the intercellular lipid subject without addition of the drug (DSC measurement step).
  • the differential scanning calorimetry peaks of the intercellular lipid subject after the addition of the drug and the intercellular lipid subject without the addition of the drug are each converted into a plurality of small peaks by the nonlinear least square method. Divide (peak dividing step).
  • the DSC peaks of the intercellular lipid subject after addition of the drug and the intercellular lipid subject without addition of the drug are divided into a first peak, an intermediate peak, and a second peak (see FIG. 11). .
  • FIG. 12 shows an intercellular lipid subject after addition of a drug (in which each drug is added to an intercellular lipid model) and a cell between which no drug is added in the method of the example which is an example of the method of the second embodiment.
  • the results of differential scanning calorimetry of a lipid subject are shown with respect to the area of the DSC peak and three small peaks (first peak, intermediate peak, and second peak) obtained by dividing it.
  • a differential scanning calorimetry peak and / or a plurality of small peaks of the intercellular lipid subject after addition of the drug and a differential scanning calorimetry of the intercellular lipid subject to which no drug is added.
  • / or a plurality of small peaks (comparison step before and after adding a drug).
  • the DSC peak of an intercellular lipid subject to which no drug is added and the first peak, intermediate peak, and second peak obtained by dividing the subject, and the DSC of the intercellular lipid subject after the addition of the drug are shown.
  • the peak and each of the first peak, intermediate peak, and second peak obtained by dividing the peak are compared (see FIG. 13).
  • the barrier ability of the intercellular lipid subject is improved by the drug.
  • A The area of the differential scanning calorimetry peak of the intercellular lipid subject after addition of the drug is larger than the area of the differential scanning calorimetry peak of the intercellular lipid subject to which no drug is added.
  • B Among the plurality of small peaks of differential scanning calorimetry of the intercellular lipid subject, the first largest proportion of the tetragonal crystal portion and the hexagonal crystal portion are the first.
  • the differential scanning calorimetry of the intercellular lipid subject to which no drug is added is the area of the first tetragonal subject small peak in the differential scanning calorimetry of the intercellular lipid subject after addition of the drug when the tetragonal main small peak is used. It is larger than the area of the first tetragonal-dominant small peak.
  • the point (A) is based on a known fact that there is a correlation between the area of the DSC peak and the absolute amount of the lamellar structure (see, for example, Neto Sukutei 34 (4) 159-166). is there.
  • the above condition (A) it means that the absolute amount of the lamellar structure in the intercellular lipid subject has increased after the addition of the drug.
  • the point (B) is the ratio of the tetragonal and hexagonal crystals in the entire differential scanning calorimetry peak, and the tetragonal and hexagonal crystals in each small peak obtained by dividing the differential scanning calorimetry peak.
  • the ratios of are not necessarily the same, small peaks having a large ratio compared to the ratio of tetragonal and hexagonal crystals in the entire peak, and small compared to the ratio of tetragonal and hexagonal crystals in the entire peak This is based on the inventors' new finding that there is a small peak having a ratio.
  • the first tetragonal main small peak in the above point (B) may be determined by using a known method for the intercellular lipid subject to which no drug is added.
  • the body can be an intercellular lipid sample, and the intercellular lipid subject to which glycerin has been added can be used as an intercellular lipid control. That is, first, as shown in FIG. 13, the ratio of the tetragonal part and the hexagonal part in the plurality of small peaks of the intercellular lipid subject to which no drug is added is determined as the intercellular lipid subject after addition of the drug, respectively.
  • the ratios of the tetragonal part and the hexagonal part in the first peak, the intermediate peak, and the second peak of the intercellular lipid model to which no drug is added are respectively expressed as intercellular lipid models to which glycerin is added.
  • first peak, intermediate peak, and second peak of tetragonal crystal shown in black in FIG.
  • the first tetragonal mainly small peak is the first largest proportion of the tetragonal part in the sum of the tetragonal part and the hexagonal part. It is determined.
  • the intermediate peak having the first largest proportion of the tetragonal crystal portion in the total of the tetragonal crystal and the hexagonal crystal is a tetragonal mainly small peak
  • N ⁇ Intermediate peak of differential scanning calorimetry of intercellular lipid subjects after addition of acetyl-L-hydroxyproline, L-proline, N-acetyl-L-tyrosine, L-threonine, L-methionine, N-acetyl-L-glucosamine Is larger than the area of the intermediate peak of differential scanning calorimetry of the intercellular lipid subject to which no drug was added.
  • an intercellular lipid model to which N-acetyl-L-hydroxyproline, L-proline, N-acetyl-L-tyrosine, L-threonine, L-methionine, N-acetyl-L-glucosamine is added is ( In order to satisfy the conditions of A) and (B), cells were treated with N-acetyl-L-hydroxyproline, L-proline, N-acetyl-L-tyrosine, L-threonine, L-methionine, N-acetyl-L-glucosamine. It is evaluated that the barrier ability of intercellular lipid subjects has improved.
  • N-acetyl-L-hydroxyproline, L-proline, N-acetyl-L-tyrosine, L-threonine, L-methionine, N-acetyl-L-glucosamine improves the barrier ability of intercellular lipid subjects. Therefore, it can be evaluated as a suitable drug.
  • the area of the differential scanning calorimetry peak of the intercellular lipid model to which glycerin was added is smaller than the area of the differential scanning calorimetry peak of the intercellular lipid subject to which no drug was added. A) is not satisfied. Therefore, it is evaluated that the barrier ability of intercellular lipid subjects is not improved by glycerin. Then, glycerin can be evaluated as a drug that is not suitable for improving the barrier ability of an intercellular lipid subject. Similarly to the case of glycerin, ethanol, 1,3-butylene glycol (1,3-BG), and a mixture of these and glycerin do not satisfy the above-mentioned (A), and these drugs are not expressed in cells. It can be evaluated as a drug that is not suitable for improving the barrier ability of interlipid subjects.
  • the area of the tetragonal main small peak in the scanning calorimetry is larger than the area of the tetragonal main small peak in the differential scanning calorimetry of the intercellular lipid subject to which no drug is added.
  • the tetragonal main small peak may be one or plural.
  • the ratio of the tetragonal portion in the total of the tetragonal portion and the hexagonal portion in the tetragonal main small peak is determined depending on the intercellular lipid subject used.
  • the above-mentioned ratio in the whole peak is 28% and the above-mentioned ratio in the three small peaks is 45%, 30%, 25%, it has a small peak having a ratio of 45% and a ratio of 30%.
  • the small peak may be a tetragonal main small peak.
  • the ratio may be, for example, 0: 100 to 50:50, 50:50 to 100: 0, or 70:30 to 100: 0.
  • the method of the second embodiment can be used to screen for drugs that are suitable or unsuitable for improving the barrier ability of intercellular lipid subjects. That is, a drug screening method using the method of the second embodiment can also be provided.
  • the intercellular lipid model suitably used in the method for evaluating the microstructure of the intercellular lipid according to the embodiment, from the viewpoint of forming a tetragonal crystal and a hexagonal crystal, a model containing a mixture of fatty acid, cholesterol, and ceramides is preferable. More preferably, the mixture consists of the mixture.
  • the fatty acid used for the intercellular lipid model is preferably a saturated or unsaturated fatty acid having 14 to 22 carbon atoms, more preferably 16 to 18 carbon atoms. More specifically, the fatty acid is preferably palmitic acid, stearic acid, linoleic acid, or linolenic acid. These salts may be used as the fatty acid.
  • the ceramides used for the intercellular lipid model are a compound having a structure in which a sphingoid and a fatty acid are amide-bonded as a basic structure (hereinafter also referred to as “basic ceramide”), a derivative of the above basic ceramide (hereinafter referred to as “ceramide”).
  • Derivatives analogs synthesized by mimicking the above basic ceramide and derivatives thereof (hereinafter also referred to as“ ceramide analogs ”), and sphingoids.
  • the ceramides in the present invention may be derived from a synthetic product, a natural product (for example, a plant extract) or the like.
  • ceramide 1 to ceramide 10 are ceramides (skin ceramides) contained in the human stratum corneum.
  • ceramides skin ceramides
  • the basic ceramide includes compounds having the same skeleton as the compound shown in the formula (S1) except for the alkyl chain length.
  • a natural type (D ( ⁇ ) form) optically active substance or a non-natural type (L (+) form) optically active form may be used.
  • a mixture with a non-natural type may be used.
  • the relative configuration of a plurality of asymmetric carbons in the basic ceramide structure may be a natural configuration, a non-natural configuration other than that, or a mixture thereof. Good.
  • Examples of the sphingoid moiety contained in ceramides include natural sphingosine and its analogs.
  • Specific examples of the natural sphingosine include sphingosine, sphidihydrosphingosine, phytosphingosine, 6-hydroxysphingosine (shown in the above formula (S1)), sphingadienin, dehydrosphingosine, dehydrophytosphingosine, and these Derivatives of N-alkylated products (for example, N-methylated products) and acetylated products, and the like, and sphingosine is preferable.
  • fatty acid moiety contained in the ceramides examples include saturated or unsaturated fatty acids having 14 to 34 carbon atoms and having no hydroxyl group, ⁇ -hydroxy fatty acids, ⁇ -hydroxy fatty acids, and derivatives thereof. ⁇ 34 ⁇ -hydroxy fatty acids are preferred.
  • the sphingoid part and the fatty acid part contained in the ceramides may be derived from a synthetic product, a natural product (for example, a plant extract) or the like.
  • ceramide derivative examples include a ceramide compound modified in the molecule with a saccharide (hereinafter also referred to as “sugar ceramide”).
  • saccharide used in the sugar ceramide include monosaccharides such as glucose and galactose; disaccharides such as lactose and maltose; oligosaccharides and polysaccharides in which these monosaccharides and disaccharides are polymerized by glucoside bonds Is mentioned.
  • ceramide derivative a ceramide compound (hereinafter referred to as “sugar ceramide”) modified in the molecule with a saccharide analog in which the hydroxyl group contained in the saccharide unit of the saccharide is substituted with another functional group in the saccharide ceramide.
  • saccharide analog used for the sugar ceramide analog include glucosamine, glucuronic acid, N-acetylglucosamine and the like.
  • the number of sugar units in sugar ceramide and sugar ceramide analogues is preferably 1 to 5 from the viewpoint of dispersion stability in the composition, and 1 or 2 (in the case of sugar ceramide, the sugar is glucose or lactose, respectively) ) Is more preferable, and 1 is particularly preferable.
  • Sugar ceramide and sugar ceramide analogs may be obtained by chemical synthesis or by purchase of commercially available products. Examples of commercially available sugar ceramides include (trade name) “plant sphingo liquor FR1” manufactured by Okayasu Shoten.
  • ceramide analogs-- examples include a ceramide compound represented by the following formula (S2).
  • the ceramides in the present invention include sphingoids.
  • the sphingoids include those used for the sphingoids part contained in the aforementioned ceramides.
  • Specific examples of the phytosphingosine preferably used in the present invention include “Phytosphingosine” (trade name) manufactured by Evonik Goldschmidt GmbH.
  • ceramides may be used singly or in combination of two or more.
  • ceramide AS ceramide 5
  • ceramide NS ceramide 2
  • ceramide EOS ceramide 1
  • ceramide AS ceramide 5
  • ceramide NS ceramide 2
  • ceramide EOS ceramide 1
  • ceramide AS ceramide 5
  • ceramide NS Ceramide 2
  • the mixing ratio of each component is preferably 45 to 75: 0 to 25:10 to 50 in this order, and 55 to 65: More preferably, it is 10-15: 20-40.
  • the mixing ratio of each component is particularly preferably 59.6: 13.9: 26.5. .
  • the object in a present Example was prepared as follows.
  • a 200 mL intercellular lipid model solution (lipid concentration: 10 mmol / L) was prepared (hereinafter, the target in this case is also referred to as “Blank”). Further, the drug solution was added so that the intercellular lipid model solution was 200 mL, and the temperature was higher than the phase transition temperature. This was subjected to ultrasonic treatment, and then stored in a thermostatic bath at 35 ° C. for 24 hours. And the thin film of the intercellular lipid model which added the chemical
  • ethanol ethanol 10% aqueous solution
  • glycerol 20 g of glycerol 10% aqueous solution
  • 1,3-butylene glycol 10% aqueous solution 20 g (hereinafter the subject in this case is also referred to as “1,3-BG”), ethanol 5% aqueous solution 12.56 mL, glycerin 10% aqueous solution 25.12 mL, 1, A mixed solution of 20 mL of 3-butylene glycol 10% aqueous solution (hereinafter, the subject in this case is also referred to as “mixed”), 20 g of 2% aqueous solution of N-acetyl-L-hydroxyproline (hereinafter, “N- Acetyl-L-hydroxyproline "), 20 g of L-proline 2% aqueous solution (hereinafter referred to as” L-proline "in this case) 20 g of N-acetyl-L-tyrosine 2% aqueous solution (hereinafter also referred to as “N-acetyl-L-tyrosine”), 20 g of L-threonine
  • N-acetyl-L-hydroxyproline hereinafter sometimes referred to as “AHYP”
  • serine when used in combination, N-acetyl-L-hydroxyproline 2% and L-serine 3 20 g of a 20% aqueous solution was used (hereinafter, the target in this case is also referred to as “AHYP + L-serine”).
  • Differential scanning calorimetry Measurement was performed using a differential scanning calorimeter (DSC6200, manufactured by Seiko Instruments Inc.) under conditions of a temperature range of 5 to 95 ° C. and a heating rate of 3 ° C./min.
  • DSC6200 differential scanning calorimeter
  • As a software for analyzing the peak of differential scanning calorimetry Lightstone manufactured by Origin was used.
  • a method for evaluating the microstructure of the intercellular lipid of the present invention was performed according to the following procedure. -Differential scanning calorimetry was performed in accordance with (1) for the five subjects "Blank”, “ethanol”, “glycerin”, “1,3-BG”, and “mixed” prepared above (see FIG. 5). .
  • the five target DSC peaks were each divided into small peaks according to (1), they were divided into three small peaks, a first peak, an intermediate peak, and a second peak (see FIG. 5).
  • wide-angle X-ray scattering measurement was performed according to (2) for four subjects except “Blank” among the five subjects (see FIG. 7).
  • the ratios of tetragonal and hexagonal crystals in “ethanol”, “glycerin”, “1,3-BG”, and “mixed” were 65:35, 90:10, and 70, respectively. : 30, 90:10.
  • “glycerin” having a smaller DSC peak area than the “Blank” DSC peak area and having a ratio of tetragonal to hexagonal of 80:20 to 100: 0 is expressed in cells. Selected as an interlipid control. Then, the area of the peak obtained by subtracting the area of the DSC peak of “glycerin” from the area of the DSC peak of “Blank” (shown by a broken line in FIG. 8) is a peak derived from the hexagonal crystal in “Blank”. The ratio of the tetragonal crystal to the hexagonal crystal in “Blank” is the area of the DSC peak of “glycerin” (shown in black in FIG.
  • the ratio was the ratio of the area of the DSC peak of “glycerin” to the peak area obtained.
  • the ratio of the tetragonal crystal to the hexagonal crystal in “Blank” was evaluated to be 35:65 (indicated by a box in FIG. 9).
  • the ratios of tetragonal and hexagonal crystals in “ethanol”, “1,3-BG”, and “mixed” were similarly evaluated as 65:35, 70:30, and 100: 0.
  • FIG. 10 shows the results of wide-angle X-ray scattering measurement for confirming the details of the fine structure of the intercellular lipid sample (intercellular lipid model) in the method of the example which is an example of the method of the first embodiment. .
  • the ratio of the tetragonal crystal to the hexagonal crystal in “Blank” was 31:69.
  • “Blank” is an intercellular lipid subject to which no drug is added, and five subjects other than “Blank” are intercellular lipid subjects after the addition of the drug. Attempted to assess changes in
  • N-acetyl-L-hydroxyproline When the DSC peak of “AHYP + L-serine” was divided into small peaks according to (1), it was divided into three small peaks, a first peak, an intermediate peak, and a second peak (see FIG. 12).
  • the ratios of the tetragonal and hexagonal portions in the first, intermediate, and second peaks of “Blank” are 26:74, 50 as shown in FIG. 8 as described above. : 50, 22:78. From this result, in this system, the intermediate peak was the first tetragonal main small peak.
  • N-acetyl-L-hydroxyproline “L-proline”, “N-acetyl-L-tyrosine”, “L-threonine”, “L-methionine”, “N-acetyl-L-”
  • the area of the DSC peak of “glucosamine” and “AHYP + L-serine” is larger than the area of the DSC peak of “Blank”
  • “N-acetyl-L-hydroxyproline”, “L-proline” “ The area of the intermediate peak of “N-acetyl-L-tyrosine”, “L-threonine”, “L-methionine”, “N-acetyl-L-glucosamine”, “AHYP + L-serine” is It was found that it was larger than the area.
  • N-acetyl-L-hydroxyproline “L-proline”, “N-acetyl-L-tyrosine”, “L-threonine”, “L-methionine”, “N-acetyl-L-glucosamine”
  • AHYP + L-serine was evaluated to improve the barrier ability of the intercellular lipid model (see FIG. 13).
  • FIG. 14 shows an intercellular lipid subject (cell) after addition of a drug (N-acetyl-L-hydroxyproline) suitable for improving the barrier ability in the method of the example which is an example of the method of the second embodiment.
  • the results of wide-angle X-ray scattering measurement for confirming the details of the fine structure of the intercellular lipid model) are shown.
  • the ratio of the tetragonal crystal to the hexagonal crystal in “N-acetyl-L-hydroxyproline” is 34:66, compared with that in “Blank” (31:69). I found it getting bigger.
  • the present inventors paid attention to the DSC peak area of “Blank” and “N-acetyl-L-hydroxyproline” shown in FIG. 14 and the ratio of tetragonal to hexagonal crystals, and lamellar structure in intercellular lipids. As the number of (tetragonal and hexagonal) increases, a new finding has been obtained that there is a tendency to maintain at least the ratio of tetragonal to hexagonal (sometimes to increase the ratio of tetragonal).
  • the wood inventors have used the stratum corneum instead of the intercellular lipid model.
  • the sheet wide-angle X-ray scattering measurement was performed on the horny layer sheet before and after the addition of the drug.
  • the stratum corneum sheet a stratum corneum sheet (manufactured by BIOPREDIC International (France)) obtained by trypsinizing the skin peeled from the skin of the human breast was used.
  • the drug the aforementioned N-acetyl-L-hydroxyproline and water as its control were used.
  • wide-angle X-ray scattering measurement was performed on the stratum corneum sheet before addition of N-acetyl-L-hydroxyproline and the stratum corneum sheet after addition of N-acetyl-L-hydroxyproline). Similarly, wide-angle X-ray scattering measurement was performed for water.
  • a stratum corneum sheet (manufactured by BIOPREDIC International (France)) (hereinafter also referred to simply as “corneal stratum sheet”) was prepared by trypsinizing the skin peeled off from the skin of the human breast. Five sheets having a size of 3 ⁇ 3 mm 2 were cut out from the horny layer sheet and laminated to obtain a sample for wide-angle X-ray scattering measurement.
  • a 20% aqueous solution of N-acetyl-L-hydroxyproline (hereinafter sometimes referred to as “NHYP”) was used as a drug solution, and purified water was used as a control solution.
  • the prepared sample of the stratum corneum sheet was sandwiched between washers for SWAXS measurement.
  • small-angle and wide-angle X-ray scattering (SWAXS) measurement was performed (hereinafter the same); measuring apparatus: SPring-8 beam line BL19B2, exposure time: 120 seconds / time, measurement temperature: 23 ° C., single Double irradiation, X-ray wavelength: 0.083 nm (25 keV), camera length: 539.281 (mm), detector: PILATUS.
  • the annular average was calculated to obtain one-dimensional scattering profile data. Analysis was performed by fitting the obtained diffraction peak to a Gaussian function.
  • FIG. 15 shows the results of wide-angle X-ray scattering measurement for the stratum corneum sheet before and after the addition of a drug (N-acetyl-L-hydroxyproline) that can be used to improve the barrier ability, with respect to the ratio of tetragonal to hexagonal crystals. .
  • a drug N-acetyl-L-hydroxyproline
  • N-acetyl-L-hydroxyproline increases the tetragonal ratio in the lamellar structure in the stratum corneum sheet.
  • the ratio of the tetragonal crystal to the hexagonal crystal in the stratum corneum sheet before the addition of N-acetyl-L-hydroxyproline is 45:55, and 2 hours after the addition of N-acetyl-L-hydroxyproline.
  • the ratio of the tetragonal crystal to the hexagonal crystal in the square layer sheet was 55:45 (see the lower diagram in FIG. 15).
  • the ratio of tetragonal crystals to hexagonal crystals was 44:56 before the addition and 45:55 two hours after the addition (see the upper diagram of FIG. 15). From this result, it was confirmed that the ratio of the tetragonal crystal and the hexagonal crystal in the stratum corneum sheet increased by the addition of N-acetyl-L-hydroxyproline.
  • amino acids other than N-acetyl-L-hydroxyproline, L-proline, N-acetyl-L-tyrosine, L-threonine, L-methionine, N-acetyl-L-glucosamine are used, An attempt was also made to evaluate changes in lipid microstructure before and after drug addition.
  • the intercellular lipid model solution (lipid concentration 10 mmol / L) and the 2% aqueous solution of N-acetyl-L-hydroxyproline used for preparing the intercellular lipid test subject after addition of the drug were as described above.
  • amino acids other than N-acetyl-L-hydroxyproline L-proline, N-acetyl-L-tyrosine, L-threonine, L-methionine, N-acetyl-L-glucosamine, L-phenylalanine (manufactured by Junsei Co., Ltd.) ), L-tyrosine (manufactured by Junsei Chemical Co., Ltd.), L-tryptophan (manufactured by Junsei Chemical Co., Ltd.), N-acetyl-L-glutamic acid (manufactured by Nippon Protein Co., Ltd.), glycine (manufactured by Junsei Chemical Co., Ltd.), L-
  • the highest possible concentration is set in consideration of the solubility of each amino acid, and L-phenylalanine 1% aqueous solution, L-tyrosine 0.01% aqueous solution, L-tryptophan 1% aqueous solution, N-acetyl- 20 mL each of L-glutamic acid 2% aqueous solution, glycine 15% aqueous solution, L-glutamine 4% aqueous solution, L-aspartic acid 0.1% aqueous solution, and L-serine 20% aqueous solution were prepared (hereinafter, subjects in each case) "L-phenylalanine”, “L-tyrosine”, “L-tryptophan”, "N-acetyl-L-glutamic acid”, “glycine”, "L-glutamine”, “L-aspartic acid”, “L- Also referred to as serine).
  • the ratio of the tetragonal portion and the hexagonal portion in the first peak, intermediate peak, and second peak of “Blank” is 26:74, 50 as shown in FIG. : 50, 22:78. From this result, in this system, the intermediate peak was the first tetragonal main small peak.
  • N-acetyl-L-hydroxyproline found as a useful drug candidate as described above, its water retention and anti-aging effects were evaluated.
  • the moisture retention effect test was conducted as follows. Test period: 12 weeks Subject: 24 healthy females (36-51 years old) Experimental procedure: Sample (test sample) and placebo (placebo) were applied in appropriate amounts to the fine wrinkles of the corners of the eyes twice a day. At two time points as the measurement time point, before application start and after 12 weeks of application, the application site was measured using a Corneometer (CM825 Courage & Khazaka, Germany) after acclimatization to room temperature. Statistical analysis (corresponding t test) was performed on the results. Sample properties: Transparent gel active ingredient in sample: N-acetyl-L-hydroxyproline 1.0 mass%, L-serine 0.3 mass%
  • FIG. 17 shows the results of a water retention effect test on a subject for a drug (mixture of N-acetyl-L-hydroxyproline and serine) that can be used to improve water retention and a placebo.
  • the vertical axis represents the retention rate (%), and the horizontal axis represents time (weeks).
  • the significant difference between the sample (test sample) and the placebo (placebo) at each measurement time point is P value: 0.2169 (at 4 weeks), P value: 0.0005 (at 8 weeks), P value: It was 0.0007 (at 12 weeks), and the P value was less than 0.05 at 8 and 12 weeks, confirming that the test sample had a significantly higher water retention effect than placebo.
  • the wrinkle improvement effect test was conducted as follows. Test period: 12 weeks Subject: 24 healthy females (36-51 years old) Experimental procedure: Sample (test sample) and placebo (placebo) were applied in appropriate amounts to the fine wrinkles of the corners of the eyes twice a day. At two measurement points, before the start of application and after 12 weeks of application, after acclimation to room temperature, the following visual evaluation and evaluation of the wrinkle improvement effect by Viscometer measurement of replicas were performed on the fine lines of the corner of the eye as the application site . Statistical analysis (corresponding t test) was performed on the results. Sample properties: Transparent gel active ingredient in sample: N-acetyl-L-hydroxyproline 1.0 mass%, L-serine 0.3 mass%
  • Test method The test was performed according to the protocol and regulation of functional cosmetics (2004-80). The study was conducted by a randomized, double-blind method. Moreover, the following global photo damage score was given with respect to the test subject before and after application of the sample and the placebo by two specialized panels, and the average score was calculated.
  • the global photo damage score was determined as follows according to the degree of damage. 0: None None 1: None / mild None / Slow 2: Mild Moderate 3: Mild / Moderate Slow / Medium 4: Moderate Moderate 5: Moderate / severe Moderate / Intense 6: Severe Intense 7: Very severe
  • the test subjects were those who had a global photo damage score (see Arch Dermatol 137 (8): 1043-1051 (2001)) of 2-6.
  • FIG. 18 shows the breakdown of the global photo damage score of the subjects in the visual evaluation of the wrinkle improvement effect test in terms of the number of persons (%).
  • FIG. 19 shows the results of visual evaluation of a wrinkle improvement effect test for a subject regarding a drug (mixture of N-acetyl-L-hydroxyproline and serine) that can be suitable for anti-aging and a placebo.
  • the vertical axis represents the global photo damage score (-), and the horizontal axis represents time (weeks).
  • R1 The value of the difference between the highest and lowest wrinkle contour lines
  • R2 After arbitrarily dividing five wrinkle contour lines
  • R3 After arbitrarily dividing five wrinkle contour lines
  • R4 area surrounded by the baseline of the wrinkle contour line and the highest value line of the wrinkle contour line
  • R5 equivalent to the area surrounded by the baseline of the wrinkle contour line and the center line
  • the significant difference between the sample (test sample) and the placebo (placebo) at each measurement time point is P value: 0.328 (at 4 weeks), P value: 0.022 (at 8 weeks), and P value: The P value was less than 0.05 at 8 weeks and 12 weeks, indicating that the test sample had a significantly higher wrinkle improvement effect than placebo.
  • FIG. 20 shows the results of replica evaluation of a wrinkle improvement effect test on subjects for a drug (mixture of N-acetyl-L-hydroxyproline and serine) that can be suitable for anti-aging and a placebo.
  • the significant difference between the sample (test sample) and the placebo (placebo) at 12 weeks is P value: 0.125 (R1), P value: 0.041 (R2), P value: 0.036 ( R3), P value: 0.517 (R4), P value: 0.373 (R5), P value is less than 0.05 in R2 and R3, and the test sample has significant wrinkle improvement effect with respect to placebo It was shown to be high.
  • N-acetyl-L-hydroxyproline, L-proline, N-acetyl-L-tyrosine, L-threonine, L-methionine, N-acetyl-L-glucosamine as an active ingredient,
  • the lamellar structure in the intercellular lipid microstructure can be improved and / or the packing structure can be modified.
  • N-acetyl-L-hydroxyproline, L-proline, N-acetyl-L-tyrosine, L-threonine, L-methionine, and N-acetyl-L-glucosamine are used as active ingredients.
  • Lamellar structure improving agent packing structure modifying agent, tetragonal ratio maintaining / improving agent in lipid fine structure; N-acetyl-L-hydroxyproline, L-proline, N-acetyl-L-tyrosine, L-threonine, It is possible to provide a moisture retention improving agent, a barrier ability improving agent, an anti-aging agent, and an anti-wrinkle agent, which contain L-methionine and N-acetyl-L-glucosamine as active ingredients.

Abstract

ＮーアセチルーＬーヒドロキシプロリン、Ｌープロリン、ＮーアセチルーＬーチロシン、Ｌートレオニン、Ｌーメチオニン、ＮーアセチルーＬーグルコサミンから選ばれる少なくとも一種を有効成分とする、細胞間脂質の微細構造におけるラメラ構造改善剤、肌における水分保持改善剤。

Description

ラメラ構造改善剤、水分保持改善剤
　本発明は、Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミンから選ばれる少なくとも一種を有効成分として含有する、ラメラ構造改善剤、水分保持改善剤に関する。
　生体表面にある細胞間脂質は、細胞どうしを繋ぎとめることで、脂質バリアを構築している。例えば、皮膚表面の角層における角質細胞間脂質は、バリア能により、外部からの異物の侵入を防止すると共に、皮膚内部に水分を維持する役割を担っている。
　一方、乾燥や老化等により細胞間脂質の微細構造には乱れが生じ、細胞間脂質が本来備えるバリア能が衰退・喪失することがある。バリア能の衰退・喪失は、細菌の感染や皮膚の崩壊を招き、ひいては肌の美しさが失われることとなる。
　かかる事情から、細胞間脂質の微細構造を改善・改質することが可能な、化粧水、乳液、クリーム等の化粧料等の開発が望まれている（非特許文献１参照）。
油化学，４４，１０，７５１−７６６（１９９５）
　本発明は、細胞間脂質の微細構造におけるラメラ構造を改善する及び／又は充填構造を改質することを目的とする。
　本発明の要旨は以下の通りである。
［１］Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミンから選ばれる少なくとも一種を有効成分として含有する細胞間脂質の微細構造におけるラメラ構造改善剤。
［２］Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミンから選ばれる少なくとも一種を有効成分として含有する細胞間脂質の微細構造における充填構造改質剤。
［３］Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミンから選ばれる少なくとも一種を有効成分として含有する細胞間脂質の微細構造における直方晶比率維持・改善剤。
［４］Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミンから選ばれる少なくとも一種を有効成分として含有する肌における水分保持改善剤。
［５］Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミンから選ばれる少なくとも一種を有効成分として含有する肌におけるバリア能改善剤。
［６］Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミンから選ばれる少なくとも一種を有効成分として含有する肌における抗老化剤。
［７］Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミンから選ばれる少なくとも一種を有効成分とする、肌における抗シワ剤。
［８］細胞間脂質の微細構造におけるラメラ構造改善剤の製造のためのＮ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミンから選ばれる少なくともの使用。
［９］肌における水分保持改善剤の製造のためのＮ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミンから選ばれる少なくともの使用。
　本発明によれば、Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミンから選ばれる少なくとも一種を有効成分として用いることによって、細胞間脂質の微細構造におけるラメラ構造を改善する及び／又は充填構造を改質することができる。
（ａ）は、ある対象の示差走査熱量測定の結果を模式的に示す図であり、（ｂ）は、（ａ）に示す示差走査熱量測定のピークを非線形最小二乗法によるカーブフィッティングにより分割した３つの小ピーク（Ａ）~（Ｃ）を模式的に示す図である。図中、「×」は小ピーク（Ａ）~（Ｃ）のピークトップを示し、それぞれのピークトップの位置における温度をＳ１~Ｓ３で示す。 （ａ）は、ある対象の小角Ｘ線散乱測定の結果を示す図であり、（ｂ）は、ある対象の広角Ｘ線散乱測定の結果を示図である。（ａ）中、「×」はピーク（Ｘ）~（Ｚ）のピーク位置（それぞれ、０．２７ｎｍ−１、０．２３ｎｍ−１、０．２２ｎｍ−１）を示し、それぞれの位置における温度Ｔ１~Ｔ３は相転移温度を示す。（ｂ）中、「×」は、２５℃における、ピーク（Ｖ）、（Ｗ）のピーク位置（それぞれ、２．４ｎｍ−１、２．７ｎｍ−１）を示す。 実施形態の細胞間脂質の微細構造を評価する方法を示す概略図である。 第一実施形態の細胞間脂質の微細構造を評価する方法を示す概略図である。 第一実施形態の方法の一例である実施例の方法における、細胞間脂質サンプル（細胞間脂質モデル）、及び細胞間脂質コントロール（細胞間脂質モデルに各薬剤を添加したもの）の示差走査熱量測定の結果を、ＤＳＣピーク、及びそれを分割して得られる３つの小ピーク（第１ピーク、中間ピーク、第２ピーク）の面積に関して示す図である。 第一実施形態の方法の好適な形態において、細胞間脂質サンプル（細胞間脂質モデル）のピーク及び／又は複数の小ピークと、細胞間脂質コントロール（細胞間脂質モデルに各薬剤を添加したもの）のピーク及び／又は複数の小ピークとを、ＤＳＣピーク、及びそれを分割して得られる３つの小ピーク（第１ピーク、中間ピーク、第２ピーク）の面積に関して比較した結果を示す図である。 第一実施形態の方法の一例である実施例の方法における、細胞間脂質コントロール（細胞間脂質モデルに各薬剤を添加したもの）について、微細構造の詳細を既知とするための広角Ｘ線散乱測定の結果を示す図である。なお、細胞間脂質サンプルについては広角Ｘ線散乱測定を行っていない。 第一実施形態の方法のより好適な形態において、細胞間脂質サンプル（細胞間脂質モデル）のピーク及び／又は複数の小ピークと、細胞間脂質コントロール（細胞間脂質モデルに各薬剤を添加したもの）のピーク及び／又は複数の小ピークとを、ＤＳＣピーク、及びそれを分割して得られる３つ小ピーク（第１ピーク、中間ピーク、第２ピーク）の面積に関して比較した結果を示す図である。 第一実施形態の方法のより好適な形態により得られる結果の概略を示す図である。 第一実施形態の方法の一例である実施例の方法における、細胞間脂質サンプル（細胞間脂質モデル）について、微細構造の詳細を確認するための広角Ｘ線散乱測定の結果を示す図である。 第二実施形態の細胞間脂質の微細構造を評価する方法を示す概略図である。 第二実施形態の方法の一例である実施例の方法における、薬剤添加後の細胞間脂質被験体（細胞間脂質モデルに各薬剤を添加したもの）、及び薬剤未添加の細胞間脂質被験体（細胞間脂質モデル）の示差走査熱量測定の結果を、ＤＳＣピーク、及びそれを分割して得られる３つ小ピーク（第１ピーク、中間ピーク、第２ピーク）の面積に関して示す図である。 第二実施形態の方法の好適な形態において、薬剤添加後の細胞間脂質被験体（細胞間脂質モデルに各薬剤を添加したもの）のピーク及び／又は複数の小ピークと、薬剤未添加の細胞間脂質被験体（細胞間脂質モデル）のピーク及び／又は複数の小ピークとを、ＤＳＣピーク、及びそれを分割して得られる３つの小ピーク（第１ピーク、中間ピーク、第２ピーク）の面積に関して比較した結果を示す図である。 バリア能を向上させるのに適し得る薬剤（Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミン）添加後の細胞間脂質被験体（細胞間脂質モデル）について、微細構造の詳細を確認するための広角Ｘ線散乱測定の結果を示す図である。 バリア能を向上させるのに適した薬剤（Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン）添加前後の角層シートについての広角Ｘ線散乱測定の結果を直方晶と六方晶との比率について示す図である。 第二実施形態の方法の一例である実施例の方法における、Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミン以外のアミノ酸添加後の細胞間脂質被験体（細胞間脂質モデル）について、微細構造の詳細を確認するための広角Ｘ線散乱測定の結果を示す図である。 水分保持を向上させるのに適し得る薬剤（Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリンとセリンとの混合物）と偽薬とについての被験者に対する水分保持効果試験の結果を示す図である。 シワ改善効果試験の目視評価における被験者のグローバルフォトダメージスコアの内訳をその人数割合（％）にて示す図である。 抗老化に適し得る薬剤（Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリンとセリンとの混合物）と偽薬とについての被験者に対するシワ改善効果試験の目視評価の結果を示す図である。 抗老化に適し得る薬剤（Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリンとセリンとの混合物）と偽薬とについての被験者に対するシワ改善効果試験のレプリカ評価の結果を示す図である。
　以下、本発明の、Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミンから選ばれる少なくとも一種を有効成分とする、細胞間脂質の微細構造におけるラメラ構造改善剤、充填構造改質剤、直方晶比率維持・改善剤、及び、本発明の肌における水分保持改善剤、バリア能改善剤の実施形態について詳細に例示説明する。
　なお、本願に記載の評価等については、特に断らない限り、特開２０１６−２２４０３０号公報又は特開２０１６−２２２６４５号公報記載の細胞間脂質の微細構造を評価する方法を用いることも可能である。また、本願において直方晶とは従前に斜方晶とも称されることもあったものである。
　本発明における有効成分として挙げられているＮ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミンは、天然のＬ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−チロシン、Ｌ−グルコサミンのアミノ基をアセチル基で修飾したものであり、有機化学合成されたものとしてよい。
　Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミンから選ばれる少なくとも一種が投与される対象となる細胞間脂質及び肌としては、ヒト由来、非ヒト動物（例えば、ブタ、ウシ、トリ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ等）由来のものとしてよく、これらの試験管内で調製される細胞間脂質モデルとしてもよい。
　また、細胞間脂質及び肌の生体における部位は、特に限定されることなく、皮膚、毛髪等としてよい。
　以下、Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミンから選ばれる少なくとも一種の有効成分の作用効果について詳述する。以下、これらＮ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミンから選ばれる少なくとも一種の有効成分のことを、「当該有効成分」と表現する場合がある。
　本実施形態では、有効成分として、Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリンが特に好ましい。
　有効成分としては、上述のＮ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミンから選ばれる少なくとも一種に、他の成分を含むものであってもよい。この場合、処方におけるアミノ酸の配合量は、０．０１~２質量％であることが好ましく、０．１~１質量％であることが更に好ましい。
　また、有効成分としては、上述のアミノ酸の特定の組み合わせであってもよい。この場合、全アミノ酸における各アミノ酸の配合量は、０．０１~２質量％であることが好ましく、０．１~１質量％であることが更に好ましい。
　例えば、Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリンを用いる場合、かかる組み合わせとしては、Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリンとセリンとの組み合わせを好適に用いてもよい。この場合、Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリンに対するセリンの配合割合は、０．１~２が好ましく、０．１５~１．５が更に好ましく用いられる。
　当該有効成分が細胞間脂質（例えば、ヒトの皮膚の細胞間脂質）に対して投与された場合、細胞間脂質に含まれる、脂肪酸、コレステロール、セラミド等の分子どうしのパッキングが良好になる、例えば、コレステロールがセラミドのスフィンゴイド部分に沿い、脂肪酸がセラミドの脂肪酸部分に沿って配向するようになり、ひいては、細胞間脂質において優れた結晶構造が得られるものと推測される。
　より具体的には、後述の実施例にて示す通り、
　当該有効成分の細胞間脂質への投与により、細胞間脂質の微細構造におけるラメラ構造（短周期ラメラ構造、長周期ラメラ構造）が改善される、あるいは、ラメラ構造が増加する。
　具体的には、小角・広角Ｘ線散乱（ＳＷＡＸＳ）測定等により示されるように、細胞間脂質の微細構造のラメラ構造の絶対量（短周期ラメラ構造と長周期ラメラ構造との合計量）が増加する。
　また、皮膚等に当該有効成分を投与することによって、細胞間脂質の微細構造における充填構造が改質される、あるいは、充填構造がより密になる。
　詳細には、小角・広角Ｘ線散乱（ＳＷＡＸＳ）測定等により示されるように、細胞間脂質の微細構造における直方晶比率（直方晶の直方晶と六方晶との合計に対する割合）が維持・改善される、あるいは、直方晶比率が保持・増加される。
　更に、当該有効成分の肌への投与により、肌における水分保持性が改善される、あるいは、水分保持性が向上する。
　具体的には、後述の実施例のバリア能評価試験により示されるように、肌におけるバリア能が改善される、あるいは、バリア能が向上する。
　更に、皮膚等に当該有効成分を投与することによって、肌における抗老化（アンチエイジング）の効果が得られる。
　近年、皮膚の最外層である角層における角層細胞間脂質の充填構造は加齢により緩む傾向があることが報告されている（ＩＦＳＣＣ２０１４パリ大会・国内報告会講演要旨集参照）。具体的には、２０代から５０代までの健常な日本人女性を被験者として、頬の角層についてラマンスペクトル測定により分析したところ、５０代の被験者の角層の充填構造のパッキングの指標は、２０代の被験者の当該指標と比較して十数パーセントも低いものであることがわかった。
　ここで、前述の通り、当該有効成分の肌への投与により充填構造が改質される効果が得られることから、皮膚等に当該有効成分を投与することによって、肌における抗老化（アンチエイジング）の効果が得られることとなる。
　上記のラメラ構造改善剤や上記の水分保持改善剤の投与方法としては、経皮投与が挙げられる。経皮投与は、例えば、当該有効成分を含むラメラ構造改善剤や水分保持改善剤を、手指にて直接取り出す、あるいは、スプーン、スパチュラ等の小道具を用いて、塗布、付着、堆積等することによって、行ってよい。
　上記のラメラ構造改善剤や上記の水分保持改善剤の投与量としては、効果が得られる量であれば特に限定されず、被験者の状態、体重、性別、年齢等により適宜調整されてよいが、特に、皮膚への塗布により投与する場合には、好適には、０．１~１００ｍｇ／ｃｍ２であり、更に好適には、１~１００ｍｇ／ｃｍ２であり、より好適には、１０~１００ｍｇ／ｃｍ２である。
　上記のラメラ構造改善剤や上記の水分保持改善剤の投与間隔としては、効果が得られる間隔であれば特に限定されないが、好適には、１~４８時間であり、更に好適には、１~２４時間であり、より好適には、１~１２時間である。
　本発明の各剤は、当該有効成分以外に、必要に応じて添加剤が含まれていてよい。
　かかる添加剤としては、細胞賦活剤、抗酸化剤、保湿剤、紫外線防止剤、溶剤（水、アルコール類等）、油剤、界面活性剤、増粘剤、粉体、キレート剤、ｐＨ調整剤、乳化剤、安定化剤、着色剤、光沢剤、矯味剤、矯臭剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、浸透圧調整剤、香料等が挙げられる。
　本発明のラメラ構造改善剤や水分保持改善剤は、例えば、液状、乳液状、クリーム状、固形状、ゲル状、ペースト状等、種々の形態で調製してよい。
　また、各剤は、油性系、油中水型乳化系、水中油型乳化系等、種々の剤形で調製してよい。
　具体的には、各剤は、化粧水、乳液、クリーム、美容液、化粧油、リップクリーム、ハンドクリーム、洗顔料、クレンジング料等のスキンケア化粧料；ファンデーション、メイクアップ下地、ほほ紅、アイシャドウ、マスカラ、アイライナー、アイブロウ、オーバーコート剤、口紅、リップグロス等のメイクアップ化粧料；ヘアトニック、ヘアクリーム、シャンプー、リンス、コンディショナー、整髪料等の頭皮又は毛髪用の化粧料；マッサージ化粧料等、種々の化粧料とすることができる。
　なお、本発明の各剤は、化粧品に含めてもよく、医薬部外品に含めてもよく、更に、医薬品、例えば、皮膚外用剤にも含めることも可能である。
　本発明の各剤の製造方法としては、特に限定されることなく、当該技術分野において通常の方法としてよい。
　上述の通り、本発明は、当該有効成分を、ラメラ構造改善剤や水分保持改善剤を製造するために使用することも、その範囲に含む。
　上述の当該有効成分の作用効果は、本発明者らが開発した、特開２０１６−２２４０３０号公報又は特開２０１６−２２２６４５号公報記載の細胞間脂質の微細構造を評価する方法により、確認することもできる。この方法は、示差走査熱量測定（以下、「ＤＳＣ測定」ともいう）を用いることを特徴としている。
　細胞間脂質の微細構造を評価する方法としては、様々な手法があるが、その代表例として、Ｘ線回折（ＸＲＤ）測定、より詳細には、小角・広角Ｘ線散乱（ＳＷＡＸＳ）測定が挙げられる。小角Ｘ線散乱測定では、主として細胞間脂質のラメラ構造に関する情報が得られ、広角Ｘ線散乱測定では、主として細胞間脂質の充填構造に関する情報が得られるとされている。
　図１（ａ）に、ある対象の示差走査熱量測定の結果を模式的に示し、図１（ｂ）に、（ａ）に示す示差走査熱量測定のピークを非線形最小二乗法によるカーブフィッティングにより分割した３つの小ピーク（Ａ）~（Ｃ）を模式的に示す。図中、「×」は小ピーク（Ａ）~（Ｃ）のピークトップを示し、それぞれのピークトップの位置における温度をＳ１~Ｓ３で示す。
　図２（ａ）に、ある対象の小角Ｘ線散乱測定の結果を示し、図２（ｂ）に、ある対象の広角Ｘ線散乱測定の結果を示す。
　図２（ａ）中、「×」は、ピーク（Ｘ）~（Ｚ）のピーク位置（それぞれ、０．２７ｎｍ−１、０．２３ｎｍ−１、０．２２ｎｍ−１）を示し、それぞれの位置における温度Ｔ１~Ｔ３は相転移温度を示す。
　図２（ｂ）中、「×」は、２５℃における、ピーク（Ｖ）、（Ｗ）のピーク位置（それぞれ、２．４ｎｍ−１、２、７ｎｍ−１）を示す。なお、２．４ｎｍ−１のピーク（Ｖ）は、六方晶及び直方晶に由来するもの、２．７ｎｍ−１のピーク（Ｗ）は、直方晶に由来するものである。また、ピーク（Ｖ）の散乱強度を（Ｓｖ）、ピーク（Ｗ）の散乱強度を（Ｓｗ）としたときに、直方晶の直方晶と六方晶との合計に対する割合（％）は、［Ｓｗ／｛（Ｓｖ−２×Ｓｗ）／３＋Ｓｗ｝］×１００で算出される。
　これまでに、示差走査熱量測定のピークの面積と、小角Ｘ線散乱測定の回折ピークの強度の積分値とは、相関を有する、具体的には、前者が増加・減少するに従って後者も増加・減少する、ことが知られており、これに基づいて、示差走査熱量測定のピークの面積からラメラ構造の絶対量（直方晶と六方晶との合計の絶対量）を評価することができることが知られている（図１（ａ）、図２（ａ）参照）。
　今回、発明者らは、対象の示差走査熱量測定のピークを非線形最小二乗法によるカーブフィッティングにより複数の小ピークに分割するという新規な手法を試みたところ、この分割された小ピーク（Ａ）~（Ｃ）のピーク位置におけるそれぞれの温度（図１（ｂ）中、Ｓ１~Ｓ３にて示す）と、対象の温度走査小角Ｘ線散乱測定による回折ピーク（Ｘ）~（Ｚ）のピーク位置における温度（図２（ａ）中、Ｔ１~Ｔ３にて示す）とが、相関を有する、具体的には、上記温度Ｓ１~Ｓ３が、それぞれＴ１~Ｔ３と極めて近い値である、ことを見出した（図１（ｂ）、図２（ａ）参照）。
　この発見により、示差走査熱量測定のピークから、ラメラ構造の全体量等といった微細構造の概要に留まらず、直方晶と六方晶との比率等といった微細構造の詳細にまで至る情報が得られる可能性が示された。
　その後、発明者らの研究により、特に、対象の温度走査小角Ｘ線散乱測定による回折ピーク（Ｙ）は、脂肪酸、コレステロール、セラミド類から構成されるラメラ構造に由来するものであると推測されるようになった。
　そこで、発明者らは、示差走査熱量測定のピークから、例えば、広角Ｘ線散乱測定から得られる情報である、細胞間脂質の微細構造（例えば、直方晶と六方晶との比率等）に関する情報が得られる可能性があることに想到した（図１（ｂ）、図２（ｂ）参照）。
　以下、図面を参照して、細胞間脂質の微細構造を評価する方法の実施形態について詳細に例示説明する。
　実施形態の細胞間脂質の微細構造を評価する方法（以下、「実施形態の方法」ともいう。）は、示差走査熱量測定（以下、「ＤＳＣ測定」ともいう）によるものである。
　実施形態の方法では、ＤＳＣ測定の結果とＸＲＤ測定の結果との間の関係性についての前述の知見に基づいて、興味の対象について小角・広角Ｘ線散乱（ＳＷＡＸＳ）測定を行うことを必須とすることなく、興味の対象について示差走査熱量測定を行うことによって、細胞間脂質の微細構造を評価することができ、ひいては、多数の興味の対象について簡便に細胞間脂質の微細構造を評価することを可能にする。
　また、実施形態の方法によれば、細胞間脂質の微細構造の詳細を評価することが可能となる。
　更に、実施形態の方法によれば、細胞間脂質の微細構造を薬剤の添加前後における変化を評価することが可能となる。これにより、細胞間脂質の充填構造に影響を与える化粧料・薬剤をスクリーニングすることができ、細胞間脂質の充填構造を緩める成分であるか、充填構造を密にする成分であるかを評価することができる。ひいては、角層のバリアをコントロールすること、化粧料に配合される有効成分の経皮吸収を高めることも可能となる。また、有効成分を投与した後のステップにおいて充填構造を密にする成分を使用することによって、角層における経皮水分蒸散量を低く保ち、皮膚の恒常性を維持することも可能となる。
　上記した実施形態の方法については、特開２０１６−２２４０３０号公報又は特開２０１６−２２２６４５号公報に記載されたものを参考にすることも可能である。
　実施形態の方法を適用することが可能な細胞間脂質としては、皮膚の角質、毛髪内部の細胞膜複合体（ＣＭＣ（Ｃｅｌｌ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｃｏｍｐｌｅｘ））部分、更に詳細には、キューティクルＣＭＣ（ＣＵ−ＣＵ）、キューティクル−コルテックス間ＣＭＣ（ＣＵ−ＣＯ）、コルテックス−コルテックス間ＣＭＣ（ＣＯ−ＣＯ）、これらのモデル系（後述）等が挙げられ、特に、脂質濃度が高い状態で示差走査熱量測定を行うことができ、ピーク検出が容易であるため、モデル系が好ましい。
　そして、実施形態の方法では、複数の対象について示差走査熱量測定を行うことが好ましい。対象を複数とすることによって、示差走査熱量測定の結果を対象間で比較することができ、細胞間脂質の微細構造について詳細な知見を得ることが可能となる。
　ここで、複数の対象とは２つ以上の対象をいい、対象は３つ以上であることが好ましい。
　図３に、実施形態の細胞間脂質の微細構造を評価する方法の概略図を示す。
　実施形態の方法は、まず、複数の対象（図３では、対象Ａ及び対象Ｂ）について示差走査熱量測定を行う（ＤＳＣ測定工程）。
　実施形態の方法は、次いで、複数の対象の示差走査熱量測定のピークを、非線形最小二乗法により、それぞれ複数の小ピークに分割する（ピーク分割工程）。
　ここで、複数の小ピークとは２つ以上の小ピークをいい、小ピークは３つ以上であることが好ましい。
　この工程は、例えば、コンピュータ等の計算機器を用いて行ってよい。
　非線形最小二乗法において、ピーク形状に対するカーブフィッティングに用いられる関数としては、例えば、ガウス関数、ローレンツ関数、これら２つを畳み込んだフォークト関数等が挙げられ、特に、ガウス関数、ローレンツ関数とすることが好ましい。
　ピーク解析用ソフトとしては、例えば、Ｏｒｉｇｉｎ等が挙げられる。
　該解析ソフトに搭載されるアルゴリズムとしては、例えば、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭＡ）等が挙げられる。
　実施形態の方法は、続いて、複数の対象のうちの一方の示差走査熱量測定のピーク及び／又は複数の小ピークと、これらのピークに対応する、複数の対象のうちの他方の示差走査熱量測定のピーク及び／又は複数の小ピークとを比較する（比較工程）。
　この工程は、ピーク及び／又は複数の小ピークどうしで、その面積やピーク位置等を比較してよい。
　ここで、前述の複数の対象としては、特に限定されないが、比較検討され得るものが好ましく、例えば、細胞間脂質サンプル及び細胞間脂質コントロール、薬剤添加後の細胞間脂質被験体及び薬剤未添加の細胞間脂質被験体、美肌から採取した角層及び荒れ肌から採取した角層、健常毛髪及びダメージ毛髪等が挙げられる。
　これらの複数の対象では、他方を一方に薬剤を与えたものとしてもよい。
　なお、薬剤とは、細胞間脂質の微細構造（ラメラ構造、充填構造）に変化を与え得るものをいい、通常、化粧料等に配合する成分等であれば特に限定されるものではなく、例えば、美白成分や抗肌荒れ成分、保湿成分等の有効成分等が挙げられる。
（第一実施形態）
　図４に、第一実施形態の細胞間脂質の微細構造を評価する方法の概略図を示す。
　第一実施形態の細胞間脂質の微細構造を評価する方法（以下、「第一実施形態の方法」ともいう。）は、前述の複数の対象を、細胞間脂質サンプル及び細胞間脂質コントロールとし、細胞間脂質サンプルにおける細胞間脂質の微細構造の詳細を評価するものである。
　なお、細胞間脂質サンプルとは、微細構造の詳細を評価する対象となる細胞間脂質を指し、細胞間脂質コントロールとは、該細胞間脂質サンプルに対する比較対象となる細胞間脂質を指す。
　ここで、第一実施形態の方法の一例である実施例の方法（後述）では、細胞間脂質の微細構造の詳細を、細胞間脂質の充填構造における直方晶と六方晶との比率としている。
　また、この実施例の方法では、細胞間脂質サンプルを細胞間脂質モデルとして、細胞間脂質コントロールを該細胞間脂質モデルに薬剤（エタノール、グリセリン、１，３−ブチレングリコール（１，３−ＢＧ）、これらの混合物）を添加したものとしている。
　第一実施形態の方法では、まず、細胞間脂質サンプル及び細胞間脂質コントロールについて示差走査熱量測定を行う（ＤＳＣ測定工程）。
　次いで、細胞間脂質サンプル及び細胞間脂質コントロールの示差走査熱量測定のピークを、非線形最小二乗法により、それぞれ複数の小ピークに分割する（ピーク分割工程）。
　ここに示す例では、細胞間脂質モデル及び細胞間脂質モデルに薬剤を添加したもののＤＳＣピークを、第１ピーク、中間ピーク、第２ピークの３つの小ピークに分割している（図４参照）。
　図５に、第一実施形態の方法の一例である実施例の方法における、細胞間脂質サンプル（細胞間脂質モデル）、及び細胞間脂質コントロール（細胞間脂質モデルに各薬剤を添加したもの）の示差走査熱量測定の結果を、ＤＳＣピーク、及びそれを分割して得られる３つの小ピーク（第１ピーク、中間ピーク、第２ピーク）の面積に関して示す。
　第一実施形態の方法では、続いて、細胞間脂質サンプルの示差走査熱量測定のピーク及び／又は複数の小ピークと、細胞間脂質コントロールの示差走査熱量測定のピーク及び／又は複数の小ピークとを比較する（サンプル−コントロール比較工程）。
　ここに示す例では、細胞間脂質モデルのＤＳＣピーク、及びそれを分割して得られる第１ピーク、中間ピーク、第２ピークと、該細胞間脂質モデルに各薬剤を添加したもののＤＳＣピーク、及びそれを分割して得られる第１ピーク、中間ピーク、第２ピークのそれぞれとを比較している（図６、図８参照）。
　特に、第一実施形態の方法の好適な形態では、前述のサンプル−コントロール比較工程において下記の通りとしてよい。
　図６に、第一実施形態の方法の好適な形態において、細胞間脂質サンプル（細胞間脂質モデル）のピーク及び／又は複数の小ピークと、細胞間脂質コントロール（細胞間脂質モデルに各薬剤を添加したもの）のピーク及び／又は複数の小ピークとを、ＤＳＣピーク、及びそれを分割して得られる３つ小ピーク（第１ピーク、中間ピーク、第２ピーク）の面積に関して比較した結果を示す。
　この好適な形態では、まず、細胞間脂質コントロールとして、細胞間脂質サンプルの示差走査熱量測定のピーク及び／又は複数の小ピークの面積と比較して小さい示差走査熱量測定のピーク及び／又は複数の小ピークの面積を有するものを選択する。
　ここに示す例では、細胞間脂質モデルに薬剤（エタノール、グリセリン、１，３−ブチレングリコール（１，３−ＢＧ）、これらの混合物）を添加した細胞間脂質モデルの全てのＤＳＣピークの面積が、細胞間脂質モデルのＤＳＣピークの面積と比較して小さくなっている（図６参照）。これに基づいて、細胞間脂質コントロールとして、上記薬剤を添加した細胞間脂質モデルの全てを選択している。
　そして、この好適な形態では、細胞間脂質サンプルの示差走査熱量測定のピーク及び／又は複数の小ピークの面積から、細胞間脂質コントロールの示差走査熱量測定のピーク及び／又は複数の小ピークの面積を、減じて得られるピーク及び／又は複数の小ピークの面積を、細胞間脂質サンプルにおける六方晶に由来するピーク及び／又は複数の小ピークの面積とみなす。
　ここに示す例では、細胞間脂質モデルの第１ピーク、中間ピーク、第２ピークのそれぞれの面積から、細胞間脂質モデルに各薬剤を添加した細胞間脂質モデルの第１ピーク、中間ピーク、第２ピークのそれぞれの面積を減じて得られる小ピークの面積、すなわち、図６中に破線にて示した部分に係るピークの面積を、細胞間脂質モデルにおける六方晶に由来するピークの面積とみなしている。
　上記の第一実施形態の方法の好適な形態は、細胞間脂質においてラメラ構造が失われるとき、直方晶に優先して六方晶が失われていく、すなわち、直方晶の絶対量は大きく変動せず、場合によっては維持されながら、六方晶の絶対量が減少する、という発明者らの知見に基づくものである。上記知見は、言い換えれば、ある対象が別の対象と比較してそのラメラ構造が少ないとき、当該ある対象では、直方晶よりもむしろ六方晶が少ない、すなわち、直方晶の絶対量は上記の別の対象と比較してほぼ同じでありながら、直方晶の絶対量は上記の別の対象と比較して少ない、ということも意味する。
　ここで、第一実施形態の方法では、評価の精度を高める観点から、細胞間脂質コントロールについて、微細構造の詳細が既知である、この場合、充填構造における直方晶と六方晶との比率が既知であることが好ましい場合がある。
　充填構造における直方晶と六方晶との比率は、前述の小角・広角Ｘ線散乱（ＳＷＡＸＳ）測定等の公知の手法により、既知とすることができる。
　図７に、第一実施形態の方法の一例である実施例の方法における、細胞間脂質コントロール（細胞間脂質モデルに各薬剤を添加したもの）について、微細構造の詳細を既知とするための広角Ｘ線散乱測定の結果を示す。なお、細胞間脂質サンプルについては広角Ｘ線散乱測定を行っていない。
　また、第一実施形態の方法のより好適な形態では、前述の第一実施形態の方法の好適な形態において下記の通りとしてよい。
　図８に、第一実施形態の方法のより好適な形態において、細胞間脂質サンプル（細胞間脂質モデル）のピーク及び／又は複数の小ピークと、細胞間脂質コントロール（細胞間脂質モデルに各薬剤を添加したもの）のピーク及び／又は複数の小ピークとを、ＤＳＣピーク、及びそれを分割して得られる３つ小ピーク（第１ピーク、中間ピーク、第２ピーク）の面積に関して比較した結果を示す。
　このより好適な形態では、まず、細胞間脂質コントロールとして、直方晶と六方晶との比率が８０：２０~１００：０であるものを選択する。
　ここに示す例では、細胞間脂質コントロールとして、直方晶と六方晶との比率が９０：１０である、細胞間脂質モデルにグリセリンを添加した細胞間脂質モデルを選択している。
　そして、このより好適な形態では、細胞間脂質コントロールの示差走査熱量測定のピーク及び／又は複数の小ピークの面積は、（実質的に）細胞間脂質サンプルにおける直方晶に由来するピーク及び／又は複数の小ピークの面積とみなすことができることに基づいて、細胞間脂質サンプルにおける直方晶と六方晶との比率は、細胞間脂質コントロールの示差走査熱量測定のピーク及び／又は複数の小ピークの面積と、細胞間脂質サンプルにおける六方晶に由来するピーク及び／又は複数の小ピークの面積との比率であるとみなす。
　ここに示す例では、グリセリンを添加した細胞間脂質モデルのＤＳＣピークの面積が、細胞間脂質モデルに直方晶に由来するピークの面積とみなすことができることに基づいて、細胞間脂質モデルにおける直方晶と六方晶との比率は、グリセリンを添加した細胞間脂質モデルのＤＳＣピークの面積、すなわち、図８中に黒色にて示した部分に係るピークの面積と、細胞間脂質モデルのＤＳＣピークの面積から、グリセリンを添加した細胞間脂質モデルのＤＳＣピークの面積を減じて得られる小ピークの面積、すなわち、図８中に破線にて示した部分に係るピークの面積との比率であるとみなしている。
　なお、ここに示す例では、細胞間脂質モデルのみならず、細胞間脂質モデルにグリセリン以外の薬剤を添加したものも、細胞間脂質サンプルとして、同様に、直方晶と六方晶との比率を求めている（図８参照）。
　上記の第一実施形態の方法のより好適な形態は、細胞間脂質コントロールとして、充填構造が実質的に全て直方晶であるものを選択する点に特徴を有している。
　図９に、第一実施形態の方法のより好適な形態により得られる結果の概略を示す。
　ここに示す例では、図９中に囲み線にて示す通り、細胞間脂質モデルにおける直方晶と六方晶との比率を求めることができる。
（第二実施形態）
　図１１に、第二実施形態の細胞間脂質の微細構造を評価する方法の概略図を示す。
　第二実施形態の細胞間脂質の微細構造を評価する方法（以下、「第二実施形態の方法」ともいう。）は、複数の対象を、薬剤添加後の細胞間脂質被験体及び薬剤未添加の細胞間脂質被験体とし、薬剤添加後の細胞間脂質被験体と薬剤未添加の細胞間脂質被験体との間での細胞間脂質の微細構造の薬剤添加前後における変化を評価するものである。
　なお、細胞間脂質被験体とは、微細構造の薬剤添加前後における変化を評価する対象となる細胞間脂質を指す。
　ここで、第二実施形態の方法の一例である実施例の方法（後述）では、薬剤として、前述の第一実施形態の方法でも用いたエタノール、グリセリン、１，３−ブチレングリコール（１，３−ＢＧ）、これらの混合物、及びＮ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミンとしている。
　第二実施形態の方法では、まず、薬剤添加後の細胞間脂質被験体及び薬剤未添加の細胞間脂質被験体について示差走査熱量測定を行う（ＤＳＣ測定工程）。
　第二実施形態の方法では、次いで、薬剤添加後の細胞間脂質被験体及び薬剤未添加の細胞間脂質被験体の示差走査熱量測定のピークを、非線形最小二乗法により、それぞれ複数の小ピークに分割する（ピーク分割工程）。
　ここに示す例では、薬剤添加後の細胞間脂質被験体及び薬剤未添加の細胞間脂質被験体のＤＳＣピークを、第１ピーク、中間ピーク、第２ピークに分割している（図１１参照）。
　図１２に、第二実施形態の方法の一例である実施例の方法における、薬剤添加後の細胞間脂質被験体（細胞間脂質モデルに各薬剤を添加したもの）、及び薬剤未添加の細胞間脂質被験体（細胞間脂質モデル）の示差走査熱量測定の結果を、ＤＳＣピーク、及びそれを分割して得られる３つ小ピーク（第１ピーク、中間ピーク、第２ピーク）の面積に関して示す。
　第二実施形態の方法では、続いて、薬剤添加後の細胞間脂質被験体の示差走査熱量測定のピーク及び／又は複数の小ピークと、薬剤未添加の細胞間脂質被験体の示差走査熱量測定のピーク及び／又は複数の小ピークとを比較する（薬剤添加前後比較工程）。
　ここに示す例では、薬剤未添加の細胞間脂質被験体のＤＳＣピーク、及びそれを分割して得られる第１ピーク、中間ピーク、第２ピークと、薬剤添加後の細胞間脂質被験体のＤＳＣピーク、及びそれを分割して得られる第１ピーク、中間ピーク、第２ピークのそれぞれとを比較している（図１３参照）。
　特に、第二実施形態の方法の好適な形態では、薬剤により細胞間脂質被験体のバリア能が向上したかどうかを評価することを目的として、前述の薬剤添加前後比較工程において、下記の通りとしてよい。
　より詳細には、薬剤添加前後比較工程において、下記（Ａ）及び（Ｂ）の条件を満たす場合に、薬剤により細胞間脂質被験体のバリア能が向上したと評価する。
（Ａ）薬剤添加後の細胞間脂質被験体の示差走査熱量測定のピークの面積が、薬剤未添加の細胞間脂質被験体の示差走査熱量測定のピークの面積と比較して、大きい。
（Ｂ）細胞間脂質被験体の示差走査熱量測定の複数の小ピークのうち、直方晶による部分と六方晶による部分との合計における直方晶による部分の割合が第１番目に大きいものを第１直方晶主体小ピークとしたときに、薬剤添加後の細胞間脂質被験体の示差走査熱量測定の第１直方晶主体小ピークの面積が、薬剤未添加の細胞間脂質被験体の示差走査熱量測定の第１直方晶主体小ピークの面積と比較して、大きい。
　ここで、上記（Ａ）の点は、ＤＳＣピークの面積とラメラ構造の絶対量との間に相関があるという公知の事実（例えば、Ｎｅｔｓｕ　Ｓｏｋｕｔｅｉ　３４　（４）　１５９−１６６参照）に基づくものである。
　上記（Ａ）の条件を満たす場合には、薬剤添加後に細胞間脂質被験体におけるラメラ構造の絶対量が増大したことを意味する。
　また、上記（Ｂ）の点は、示差走査熱量測定のピーク全体における直方晶と六方晶との比率と、示差走査熱量測定のピークを分割して得られる各小ピークにおける直方晶と六方晶との比率は、必ずしも一致するものではなく、ピーク全体における直方晶と六方晶との比率と比較して大きい比率を有する小ピーク、及びピーク全体における直方晶と六方晶との比率と比較して小さい比率を有する小ピークが存在するという、発明者らの新たな知見に基づくものである。
　そして、上記（Ｂ）の点における第１直方晶主体小ピークは、薬剤未添加の細胞間脂質被験体について公知の手法を用いることによって、定めてよく、例えば、薬剤未添加の細胞間脂質被験体を細胞間脂質サンプルとし、グリセリンを添加した細胞間脂質被験体を細胞間脂質コントロールとして、前述の第一実施形態の方法のより好適な形態を用いることによって、定めることができる。
　すなわち、まず、図１３に示す通り、薬剤未添加の細胞間脂質被験体の複数の小ピークにおける直方晶による部分と六方晶による部分との比率を、それぞれ、薬剤添加後の細胞間脂質被験体の複数の小ピークにおける直方晶による部分の面積と、薬剤未添加の細胞間脂質被験体の複数の小ピークの面積から、薬剤添加後の細胞間脂質被験体の複数の小ピークにおける直方晶による部分の面積を減じて得られる小ピークの面積との比率とみなす。
　ここに示す例では、薬剤未添加の細胞間脂質モデルの第１ピーク、中間ピーク、第２ピークにおける直方晶による部分と六方晶による部分との比率を、それぞれ、グリセリンを添加した細胞間脂質モデルの第１ピーク、中間ピーク、第２ピークにおける直方晶による部分の面積（図１３中、黒色にて示す）と、薬剤未添加の細胞間脂質モデルの第１ピーク、中間ピーク、第２ピークの面積から、グリセリンを添加した細胞間脂質モデルの第１ピーク、中間ピーク、第２ピークにおける直方晶による部分の面積を減じて得られる第１ピーク、中間ピーク、第２ピークの面積（図１３中、破線にて示す）との比率とみなす。
　次いで、細胞間脂質被験体における上記の複数の小ピークのうち直方晶による部分と六方晶による部分との合計における直方晶による部分の割合が第１番目に大きいものを第１直方晶主体小ピークと定める。
　ここに示す例では、細胞間脂質モデルの第１ピーク、中間ピーク、第２ピークのうち直方晶による部分と六方晶による部分との合計における直方晶による部分の割合が第１番目に大きい中間ピークを第１直方晶主体小ピークと定めている。
　ここに示す例での第二実施形態の方法の好適な形態では、図１３に示す通り、
（Ａ）について、Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミンを添加した細胞間脂質モデルの示差走査熱量測定のピークの面積が、薬剤未添加の細胞間脂質被験体の示差走査熱量測定のピークの面積と比較して、大きくなっている。
　また、図１３に示す通り、
（Ｂ）について、Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミンを添加した細胞間脂質モデルの示差走査熱量測定の第１ピーク、中間ピーク、第２ピークのうち直方晶と六方晶との合計における直方晶による部分の割合が第１番目に大きい中間ピークが、直方晶主体小ピークとなり、Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミン添加後の細胞間脂質被験体の示差走査熱量測定の中間ピークの面積が、薬剤未添加の細胞間脂質被験体の示差走査熱量測定の中間ピークの面積と比較して、大きくなっている。
　上記の通り、Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミンを添加した細胞間脂質モデルは、（Ａ）及び（Ｂ）の条件を満たすため、Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミンにより細胞間脂質被験体のバリア能が向上したと評価している。そして、Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミンを細胞間脂質被験体のバリア能を向上させるのに適した薬剤と評価することができる。
　なお、第二実施形態の方法の好適な形態では、前述の薬剤添加前後比較工程において、前述の（Ａ）又は（Ｂ）（（Ａ）及び（Ｂ）のいずれか一方）を満たさない場合に、薬剤により細胞間脂質被験体のバリア能が向上しないと評価してもよい。
　ここに示す例では、図８に示す通り、
　グリセリンを添加した細胞間脂質モデルの示差走査熱量測定のピークの面積が、薬剤未添加の細胞間脂質被験体の示差走査熱量測定のピークの面積と比較して、小さくなっており、前述の（Ａ）を満たしていない。よって、グリセリンにより細胞間脂質被験体のバリア能が向上しないと評価している。そして、グリセリンを細胞間脂質被験体のバリア能を向上させるのに適しない薬剤と評価することができる。
　また、グリセリンの場合と同様に、エタノール、１，３−ブチレングリコール（１，３−ＢＧ）、これらとグリセリンとの混合物についても、前述の（Ａ）を満たしておらず、これらの薬剤を細胞間脂質被験体のバリア能を向上させるのに適しない薬剤と評価することができる。
　また、第二実施形態の方法の好適な形態では、前述の（Ｂ）の条件を下記の（Ｂ’）の条件としてもよい。
（Ｂ’）細胞間脂質被験体の示差走査熱量測定の複数の小ピークのうち、直方晶による部分と六方晶による部分との合計における直方晶による部分の割合が、細胞間脂質被験体の示差走査熱量測定のピーク全体における直方晶と六方晶との合計における直方晶による部分の割合と比較して大きいものを直方晶主体小ピークとしたときに、薬剤添加後の細胞間脂質被験体の示差走査熱量測定の直方晶主体小ピークの面積が、薬剤未添加の細胞間脂質被験体の示差走査熱量測定の直方晶主体小ピークの面積と比較して、大きい。
　ここで、直方晶主体小ピークは、１つでも複数でもよい。
　また、直方晶主体小ピークにおける直方晶による部分と六方晶による部分との合計における直方晶による部分の割合は、用いる細胞間脂質被験体に依存して定められる。
　例えば、ピーク全体における上記割合が２８％であり、３つの小ピークにおける上記割合が４５％、３０％、２５％である場合には、４５％の割合を有する小ピーク及び３０％の割合を有する小ピークを、直方晶主体小ピークとしてよい。
　上記比率としては、例えば、０：１００~５０：５０としてもよく、また、５０：５０~１００：０としてもよく、７０：３０~１００：０としてもよい。
　上記第二実施形態の方法は、細胞間脂質被験体のバリア能を向上させるのに適切した又は適しない薬剤をスクリーニングするために用いることができる。すなわち、第二実施形態の方法を用いる、薬剤のスクリーニング方法を提供することもできる。
　実施形態の細胞間脂質の微細構造を評価する方法において好適に用いられる細胞間脂質モデルとしては、直方晶と六方晶とを形成させる観点から、脂肪酸、コレステロール、セラミド類の混合物を含むものが好ましく、該混合物からなるものが更に好ましい。
　細胞間脂質モデルに用いられる脂肪酸としては、炭素数１４~２２の飽和又は不飽和脂肪酸が好ましく、炭素数１６~１８のものが更に好ましい。より具体的には、脂肪酸としては、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸が好ましい。脂肪酸として、これらの塩を用いてもよい。
　細胞間脂質モデルに用いられるセラミド類とは、スフィンゴイド類と脂肪酸とがアミド結合した構造を基本構造として有する化合物（以下、「基本セラミド」とも称する）、上記基本セラミドの誘導体（以下、「セラミド誘導体」とも称する）、上記基本セラミド及びその誘導体を模倣して合成された類縁体（以下、「セラミド類似体」とも称する）、スフィンゴイド類を指す。
　本発明におけるセラミド類は、合成物、天然物（例えば、植物抽出物）等の由来を問わない。
−−基本セラミド−−
　基本セラミドが有する基本構造としては、下記式（Ｓ１）に示す構造が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 　なお、上記式（Ｓ１）に示す基本セラミドのうち、セラミド１~セラミド１０は、特に、ヒトの角質層に含まれるセラミド（肌セラミド）である。
　また、実際には、ヒトやそれ以外の動物等に由来するセラミドの中には、上記式（Ｓ１）中に示されるスフィンゴイド類及び脂肪酸のアルキル鎖長に関して様々な変形例が存在する。上記基本セラミドには、アルキル鎖長以外について上記式（Ｓ１）中に示す化合物と同じ骨格を有する化合物も含まれるものとする。
　更に、上記基本セラミドとしては、天然型（Ｄ（−）体）の光学活性体を用いても、非天然型（Ｌ（＋）体）の光学活性体を用いても、更に、天然型と非天然型との混合物を用いてもよい。上記基本セラミドの構造中の複数の不斉炭素についての相対立体配置は、天然型の立体配置のものでも、それ以外の非天然型の立体配置のものでもよく、また、これらの混合物によるものでもよい。
　セラミド類に含まれるスフィンゴイド類部分としては、天然型スフィンゴシン及びその類縁体が挙げられる。天然型スフィンゴシンとしては、具体的には、スフィンゴシン、スフジヒドロスフィンゴシン、フィトスフィンゴシン、６−ヒドロキシスフィンゴシン（以上、上記式（Ｓ１）に示す）、スフィンガジエニン、デヒドロスフィンゴシン、デヒドロフィトスフィンゴシン、並びにこれらのＮ−アルキル化体（例えばＮ−メチル化体）及びアセチル化体等の誘導体等が挙げられ、スフィンゴシンが好ましい。
　セラミド類に含まれる脂肪酸部分としては、炭素数１４~３４の、ヒドロキシル基を有しない飽和又は不飽和脂肪酸、α−ヒドロキシ脂肪酸、ω−ヒドロキシ脂肪酸、及びこれらの誘導体等が挙げられ、炭素数１４~３４のα−ヒドロキシ脂肪酸が好ましい。
　セラミド類に含まれるスフィンゴイド類部分及び脂肪酸部分は、合成物、天然物（例えば、植物抽出物）等の由来を問わない。
−−セラミド誘導体−−
　セラミド誘導体としては、糖類により分子内で修飾されたセラミド化合物（以下、「糖セラミド」とも称する）等が挙げられる。糖セラミドに用いられる糖類としては、例えば、グルコース、ガラクトース等の単糖類；ラクトース、マルトース等の二糖類；これらの単糖類や二糖類がグルコシド結合により高分子化されているオリゴ糖類や多糖類等が挙げられる。また、別のセラミド誘導体として、上記糖セラミドにおいて、糖類の糖単位に含まれるヒドロキシル基が他の官能基で置換されている糖類類縁体により分子内で修飾されたセラミド化合物（以下、「糖セラミド類縁体」とも称する）も挙げられる。糖セラミド類縁体に用いられる糖類類縁体としては、例えば、グルコサミン、グルクロン酸、Ｎ−アセチルグルコサミン等が挙げられる。
　糖セラミド及び糖セラミド類縁体における糖単位の数は、組成物中における分散安定性の観点から、１~５であることが好ましく、１又は２（糖セラミドの場合、糖類がそれぞれ、グルコース又はラクトース）であることがより好ましく、１であることが特に好ましい。
　糖セラミド及び糖セラミド類縁体は、化学的合成により入手してもよく、市販品の購入により入手してもよい。
　糖セラミドの市販品としては、例えば、岡安商店社製の（商品名）「植物スフィンゴ液ＦＲ１」が挙げられる。
−−セラミド類似体−−
　セラミド類似体としては、例えば、下記式（Ｓ２）に示すセラミド化合物が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
−−スフィンゴイド類−−
　更に、本発明におけるセラミド類には、スフィンゴイド類も含まれる。スフィンゴイド類として、前述のセラミド類に含まれるスフィンゴイド類部分に用いられるものが挙げられる。
　本発明に好適に用いられるフィトスフィンゴシンの具体例としては、例えば、Ｅｖｏｎｉｋ　Ｇｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔ　ＧｍｂＨ社製の（商品名）「Ｐｈｙｔｏｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ」が挙げられる。
　上記セラミド類として例示されたものは、１種単独で用いてもよく、２種以上組み合わせて用いてもよい。
　細胞間脂質モデルに用いられるセラミド類としては、天然の細胞間脂質における存在比率が比較的大きい、セラミドＡＳ（セラミド５）、セラミドＮＳ（セラミド２）、セラミドＥＯＳ（セラミド１）が好ましい。これらの中でも、更にバリア能の高い長周期ラメラ構造を形成する傾向がある、セラミドＥＯＳ（セラミド１）が好ましく、天然の細胞間脂質における存在比率が特に大きい、セラミドＡＳ（セラミド５）、セラミドＮＳ（セラミド２）が好ましい。
　細胞間脂質モデルとして、脂肪酸、コレステロール、セラミド類の混合物を用いた場合、各成分の混合比は、この順に、４５~７５：０~２５：１０~５０であることが好ましく、５５~６５：１０~１５：２０~４０であることが更に好ましい。
　特に、細胞間脂質モデルとして、パルミチン酸、コレステロール、セラミドＡＳ（セラミド５）の混合物を用いた場合、各成分の混合比は、５９．６：１３．９：２６．５であることが特に好ましい。
　以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は下記の実施例に何ら限定されるものではない。
　本実施例では、パルミチン酸：コレステロール：セラミドＡＳ（セラミド５）＝５９．６：１３．９：２６．５の混合物からなり、直方晶と六方晶との比率が３１：６９であることを確認している、細胞間脂質モデルを用いた。
　また、本実施例では、細胞間脂質サンプルに対する細胞間脂質コントロール、及び薬剤未添加の細胞間脂質被験体に対する薬剤添加後の細胞間脂質被験体を調製するために、下記の薬剤を用いた。
・エタノール（日本アルコール社製）
・グリセリン（阪本薬品工業社製）
・１，３−ブチレングリコール（ダイセル社製）
・Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン（協和発酵バイオ社製）
・Ｌ−プロリン（味の素株式会社製）
・Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシン（東京化成工業株式会社製）
・Ｌ−トレオニン（純正化学株式会社製）
・Ｌ−メチオニン（東京化成工業株式会社製）
・Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミン（片倉コープアグリ株式会社製）
・Ｌ−セリン（協和発酵バイオ社製）
　そして、本実施例における対象を、下記の通り調製した。
　細胞間脂質モデル溶液２００ｍＬ（脂質濃度１０ｍｍｏｌ／Ｌ）を準備した（以下、この場合の対象を「Ｂｌａｎｋ」ともいう。）。
　また、上記細胞間脂質モデル溶液が２００ｍＬとなるように薬剤溶液を加え、相転移温度以上とし、これに超音波処理を行い、続いて、３５℃の恒温槽で２４時間保管した。そして、この溶液の水分を除去することによって、薬剤を添加した細胞間脂質モデルの薄膜を得た。
　上記操作中の薬剤溶液としては、エタノール１０％水溶液２０ｇ（以下、この場合の対象を「エタノール」ともいう。）、グリセリン１０％水溶液２０ｇ（以下、この場合の対象を「グリセリン」ともいう。）、１，３−ブチレングリコール１０％水溶液２０ｇ（以下、この場合の対象を「１，３−ＢＧ」ともいう。）、更にエタノール５％水溶液１２．５６ｍＬ、グリセリン１０％水溶液２５．１２ｍＬ、１，３−ブチレングリコール１０％水溶液２０ｍＬの混合溶液（以下、この場合の対象を「混合」ともいう。）、Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン２％水溶液２０ｇ（以下、この場合の対象を「Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン」ともいう。）、Ｌ−プロリン２％水溶液２０ｇ（以下、この場合の対象を「Ｌ−プロリン」ともいう。）、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシン２％水溶液２０ｇ（以下、この場合の対象を「Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシン」ともいう。）、Ｌ−トレオニン２％水溶液２０ｇ（以下、この場合の対象を「Ｌ−トレオニン」ともいう。）、Ｌ−メチオニン２％水溶液２０ｇ（以下、この場合の対象を「Ｌ−メチオニン」ともいう。）、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミン２％水溶液２０ｇ（以下、この場合の対象を「Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミン」ともいう。）を用いた。また、特に、Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン（以下において、「ＡＨＹＰ」と称する場合がある）とセリンとを併用した場合については、Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン２％且つＬ−セリン３％水溶液２０ｇを用いた（以下、この場合の対象を「ＡＨＹＰ＋Ｌ−セリン」ともいう。）。
　実施例で用いた分析方法について以下に説明する。
（１）示差走査熱量測定
　示差走査熱量計（セイコーインスツルメンツ（株）社製、ＤＳＣ６２００）を用いて、温度範囲：５~９５℃、昇温速度：３℃／分の条件にて行った。
　示差走査熱量測定のピークの解析用ソフトとして、ＬｉｇｈｔＳｔｏｎｅ社製、Ｏｒｉｇｉｎを用いた。
（２）小角・広角Ｘ線散乱（ＳＷＡＸＳ）測定
　ＳＰｒｉｎｇ−８／ＢＬ４０Ｂ２を用いて、温度：３２℃の条件にて行い、データを取得した。
　下記の手順に従って、本発明の細胞間脂質の微細構造を評価する方法を実施した。
・上記調製した、「Ｂｌａｎｋ」、「エタノール」、「グリセリン」、「１，３−ＢＧ」、「混合」の５つの対象について、（１）に従って示差走査熱量測定を行った（図５参照）。
・第一に、「Ｂｌａｎｋ」を細胞間脂質サンプルとして、細胞間脂質サンプルにおける細胞間脂質の微細構造の詳細（充填構造における直方晶と六方晶との比率）を評価することを試みた。
・次に、５つの対象のＤＳＣピークを、それぞれ、（１）に従って小ピークに分割したところ、第１ピーク、中間ピーク、第２ピークの３つの小ピークに分割された（図５参照）。
・ここで、５つの対象のうち「Ｂｌａｎｋ」を除く４つの対象については、（２）に従って広角Ｘ線散乱測定を行った（図７参照）。その結果、図７に示す通り、「エタノール」、「グリセリン」、「１，３−ＢＧ」、「混合」における直方晶と六方晶との比率は、それぞれ、６５：３５、９０：１０、７０：３０、９０：１０であることがわかった。
・続いて、「Ｂｌａｎｋ」のＤＳＣピークの面積と比較して小さいＤＳＣピークの面積を有し、また、直方晶と六方晶との比率が８０：２０~１００：０である「グリセリン」を細胞間脂質コントロールとして選択した。
　そして、「Ｂｌａｎｋ」のＤＳＣピークの面積から、「グリセリン」のＤＳＣピークの面積を減じて得られるピークの面積（図８中に破線にて示す）を、「Ｂｌａｎｋ」における六方晶に由来するピークの面積とみなしたうえで、「Ｂｌａｎｋ」における直方晶と六方晶との比率は、「グリセリン」のＤＳＣピークの面積（図８中に黒色にて示す）と、「Ｂｌａｎｋ」のＤＳＣピークの面積から、「グリセリン」のＤＳＣピークの面積を減じて得られるピークの面積との比率であるとみなした。
　その結果、図９に示す通り、「Ｂｌａｎｋ」における直方晶と六方晶との比率は、３５：６５であると評価した（図９中に囲み線にて示す）。なお、「エタノール」、「１，３−ＢＧ」、「混合」における直方晶と六方晶との比率についても、同様に、６５：３５、７０：３０、１００：０であると評価した。
・ここで、「Ｂｌａｎｋ」についても、確認のため、（２）に従って広角Ｘ線散乱測定を行った（図１０参照）。
　図１０に、第一実施形態の方法の一例である実施例の方法における、細胞間脂質サンプル（細胞間脂質モデル）について、微細構造の詳細を確認するための広角Ｘ線散乱測定の結果を示す。
　その結果、図１０に示す通り、「Ｂｌａｎｋ」における直方晶と六方晶との比率は、３１：６９であることがわかった。
　以上より、本実施例の方法により得られた、細胞間脂質サンプルにおける細胞間脂質の微細構造の詳細（充填構造における直方晶と六方晶との比率）の評価が、微細構造の詳細の分析において確立された方法である広角Ｘ線散乱測定による評価と高い相関を有することが実証された。
・第二に、「Ｂｌａｎｋ」を薬剤未添加の細胞間脂質被験体として、「Ｂｌａｎｋ」を除く５つの対象を薬剤添加後の細胞間脂質被験体として、細胞間脂質の微細構造の薬剤添加前後における変化を評価することを試みた。
・ここで、上記調製した、「Ｂｌａｎｋ」、「Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン」、「Ｌ−プロリン」、「Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシン」、「Ｌ−トレオニン」、「Ｌ−メチオニン」、「Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミン」、「ＡＨＹＰ＋Ｌ−セリン」について、（１）に従って示差走査熱量測定を行った（図１２参照）。
　また、「Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン」、「Ｌ−プロリン」、「Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシン」、「Ｌ−トレオニン」、「Ｌ−メチオニン」、「Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミン」、「ＡＨＹＰ＋Ｌ−セリン」のＤＳＣピークを、それぞれ、（１）に従って小ピークに分割したところ、第１ピーク、中間ピーク、第２ピークの３つの小ピークに分割された（図１２参照）。
・ここで、「Ｂｌａｎｋ」の第１ピーク、中間ピーク、第２ピークにおける直方晶による部分と六方晶による部分との比率は、前述の通り、図８に示す通り、それぞれ、２６：７４、５０：５０、２２：７８であると評価している。この結果より、この系においては、中間ピークを、第１直方晶主体小ピークとした。
・このとき、「Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン」、「Ｌ−プロリン」、「Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシン」、「Ｌ−トレオニン」、「Ｌ−メチオニン」、「Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミン」、「ＡＨＹＰ＋Ｌ−セリン」のＤＳＣピークの面積が、「Ｂｌａｎｋ」のＤＳＣピークの面積と比較して、大きく、且つ、「Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン」、「Ｌ−プロリン」、「Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシン」、「Ｌ−トレオニン」、「Ｌ−メチオニン」、「Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミン」、「ＡＨＹＰ＋Ｌ−セリン」の中間ピークの面積が、「Ｂｌａｎｋ」の中間ピークの面積と比較して、大きい、ことを見出した。
　これにより「Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン」、「Ｌ−プロリン」、「Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシン」、「Ｌ−トレオニン」、「Ｌ−メチオニン」、「Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミン」、「ＡＨＹＰ＋Ｌ−セリン」の添加により細胞間脂質モデルのバリア能が向上したと評価した（図１３参照）。
・ここで、「Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン」について、確認のため、（２）に従って広角Ｘ線散乱測定を行った（図１４参照）。
　図１４に、第二実施形態の方法の一例である実施例の方法における、バリア能を向上させるのに適した薬剤（Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン）添加後の細胞間脂質被験体（細胞間脂質モデル）について、微細構造の詳細を確認するための広角Ｘ線散乱測定の結果を示す。
　その結果、図１４に示す通り、「Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン」における直方晶と六方晶との比率は、３４：６６であり、「Ｂｌａｎｋ」におけるそれ（３１：６９）と比較して大きくなっていることがわかった。
　以上より、本実施例の方法により得られた、細胞間脂質の微細構造の薬剤添加前後における変化（薬剤による細胞間脂質モデルのバリア能の向上）の評価が、微細構造の詳細の分析において確立された方法である広角Ｘ線散乱測定による評価と高い相関を有することが実証された。
　本発明者らは、図１４に示される「Ｂｌａｎｋ」及び「Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン」のＤＳＣピークの面積及び直方晶と六方晶との比率に着目して、細胞間脂質においてラメラ構造（直方晶及び六方晶）が増加するとき、直方晶と六方晶との比率を少なくとも維持する（ときに直方晶割合を増大させる）傾向がある、という新たな知見を得た。
　続いて、木発明者らは、上記知見を深めるため、また、Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリンによる細胞間脂質のバリア能の向上の効果を確認するため、細胞間脂質モデルの代わりに角層シートを用いて、薬剤添加前後の角層シートについて広角Ｘ線散乱測定を行った。
　角層シートとして、ヒト胸部の皮膚より剥離した皮膚をトリプシン処理した角層シート（ＢＩＯＰＲＥＤＩＣ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社（フランス）製）を用いた。
　また、薬剤としては、前述のＮ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリンとその対照としての水とを用いた。
　ここでは、図１５に示すように、Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン添加前の角層シート、Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン添加後の角層シートについて広角Ｘ線散乱測定を行った）。水についても同様に広角Ｘ線散乱測定を行った。
　具体的な実験項を以下の通りとした。
　ヒト胸部の皮膚より剥離した皮膚をトリプシン処理した角層シート（ＢＩＯＰＲＥＤＩＣ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社（フランス）製）（以下、単に「角層シート」ともいう。）を用意した。
　角層シートから３×３ｍｍ２のサイズのシートを５枚切り出し、これらを積層させて、広角Ｘ線散乱測定の試料とした。
　薬剤溶液としてＮ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン（以下、「ＮＨＹＰ」と記載することもある）２０％水溶液を用い、対照液として精製水を用いた。
　準備した角層シートの試料をＳＷＡＸＳ測定用のワッシャーに挟み込んだ。
　ここで、下記条件において、小角・広角Ｘ線散乱（ＳＷＡＸＳ）測定を行った（以下、同じ）；測定装置：ＳＰｒｉｎｇ−８ビームラインＢＬ１９Ｂ２、露光時間：１２０秒／回、測定温度２３℃、単回照射、Ｘ線波長：０．０８３ｎｍ（２５ｋｅＶ）、カメラ長：５３９．２８１（ｍｍ）、検出器：ＰＩＬＡＴＵＳ。散乱像を取得した後、円環平均を計算し、１次元散乱プロファイルデータを得た。得られた回折ピークをガウス関数にフィッティングすることにより解析を行った。
　試料のワッシャー中央部からＡＨＹＰ２０％水溶液を２０μＬ添加し、３５℃の恒温槽で保管した。保管中、試料に薬剤溶液中の薬剤を吸収させつつ、水分を薬剤溶液から揮発させた。
　添加した後、約２時間経過後、角層シートの試料は乾燥状態であった。このとき、再び広角Ｘ線散乱測定を行った。
　図１５に、バリア能を向上させるのに適し得る薬剤（Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン）添加前後の角層シートについての広角Ｘ線散乱測定の結果を直方晶と六方晶との比率について示す。
　図１５に示す通り、Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリンの添加により角層シートにおいてラメラ構造中の直方晶比率が増加することが確認された。
　図１５に示す通り、Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン添加前の角層シートにおける直方晶と六方晶との比率は、４５：５５であり、Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン添加２時間後の角層シートにおける直方晶と六方晶との比率は、５５：４５であった（図１５下図参照）。
　なお、対照である水の場合、直方晶と六方晶との比率は、添加前において４４：５６であり、添加２時間後において４５：５５であった（図１５上図参照）。
　この結果から、Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリンの添加により角層シートにおいて直方晶と六方晶との比率は増大することが確認された。
　また、薬剤として、Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミン以外のアミノ酸を用いて、細胞間脂質の微細構造の薬剤添加前後における変化を評価することも試みた。
　薬剤添加後の細胞間脂質被験体を調製するために用いた、細胞間脂質モデル溶液（脂質濃度１０ｍｍｏｌ／Ｌ）、Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン２％水溶液としては、前述の通りとした。
　Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミン以外のアミノ酸として、Ｌ−フェニルアラニン（純正化学株式会社製）、Ｌ−チロシン（純正化学株式会社製）、Ｌ−トリプトファン（純正化学株式会社製）、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン酸（日本プロティン株式会社製）、グリシン（純正化学株式会社製）、Ｌ−グルタミン（純正化学株式会社製）、Ｌ−アスパラギン酸（純正化学株式会社製）、Ｌ−セリン（協和発酵バイオ社製）を用いた。そして、薬剤溶液として、それぞれのアミノ酸の溶解度を考慮して、できるだけ高い濃度を設定し、Ｌ−フェニルアラニン１％水溶液、Ｌ−チロシン０．０１％水溶液、Ｌ−トリプトファン１％水溶液、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン酸２％水溶液、グリシン１５％水溶液、Ｌ−グルタミン４％水溶液、Ｌ−アスパラギン酸０．１％水溶液、Ｌ−セリン２０％水溶液を、それぞれ２０ｍＬずつ準備した（以下、それぞれの場合の対象を、「Ｌ−フェニルアラニン」、「Ｌ−チロシン」、「Ｌ−トリプトファン」、「Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン酸」、「グリシン」、「Ｌ−グルタミン」、「Ｌ−アスパラギン酸」、「Ｌ−セリン」ともいう。）。
　ここで、上記調製した、「Ｂｌａｎｋ」、「Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン」、「Ｌ−フェニルアラニン」、「Ｌ−チロシン」、「Ｌ−トリプトファン」、「Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン酸」、「グリシン」、「Ｌ−グルタミン」、「Ｌ−アスパラギン酸」、「Ｌ−セリン」についても、（１）に従って示差走査熱量測定を行った（図１６参照）。
　また、各アミノ酸溶液を添加した対象のＤＳＣピークを、それぞれ、（１）に従って小ピークに分割したところ、第１ピーク、中間ピーク、第２ピークの３つの小ピークに分割された（図１６参照）。
　前述の通り、「Ｂｌａｎｋ」の第１ピーク、中間ピーク、第２ピークにおける直方晶による部分と六方晶による部分との比率は、前述の通り、図８に示す通り、それぞれ、２６：７４、５０：５０、２２：７８であると評価している。この結果より、この系においては、中間ピークを、第１直方晶主体小ピークとした。
　このとき、「Ｌ−フェニルアラニン」、「Ｌ−チロシン」、「Ｌ−トリプトファン」、「Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン酸」、「グリシン」、「Ｌ−グルタミン」、「Ｌ−アスパラギン酸」、「Ｌ−セリン」のＤＳＣピークの面積が、「Ｂｌａｎｋ」のＤＳＣピークの面積と比較して小さいことを見出した（図１６参照）。
　これにより、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−セリンの添加によっては、細胞間脂質モデルのバリア能を向上させる効果は見受けられないと評価した。（図１６参照）。
　以下では、上記のように有用な薬剤候補として見出されたＮ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリンを用いて、その水分保持や抗老化の効果を評価した。
　水分保持効果試験を下記のとおり実施した。
　使用テスト期間：１２週間
　被験者：２４名の健常人女性（３６~５１歳）
　実験手順：試料（試験サンプル）及び偽薬（プラセボ）を適量で１日に２回、目尻の小じわ部位に適用した。測定時点として２時点、適用開始前及び適用１２週間後において、室温に馴化の上、コルネオメーター（ＣＭ８２５　Ｃｏｕｒａｇｅ＆Ｋｈａｚａｋａ社　；ドイツ）を用いて適用部位の測定を行った。結果に関しては統計解析（対応のあるｔ検定）を行った。
　試料の性状：透明ゲル状
　試料中の有効成分：Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン１．０質量％、Ｌ−セリン０．３質量％
　図１７に、水分保持を向上させるのに適し得る薬剤（Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリンとセリンとの混合物）と偽薬とについての被験者に対する水分保持効果試験の結果を示す。縦軸に保持率（％）を示し、横軸に時間（週）を示す。
　図１７において、各測定時点での試料（試験サンプル）及び偽薬（プラセボ）の有意差はＰ値：０．２１６９（４週間時点）、Ｐ値：０．０００５（８週間時点）、Ｐ値：０．０００７（１２週間時点）となり、８週間時点と１２週間時点においてＰ値が０．０５未満であり、プラセボに対して試験サンプルは有意に水分保持効果が高いことが確認された。
　シワ改善効果試験を下記のとおり実施した。
　使用テスト期間：１２週間
　被験者：２４名の健常人女性（３６~５１歳）
　実験手順：試料（試験サンプル）及び偽薬（プラセボ）を適量で１日に２回、目尻の小じわ部位に適用した。測定時点として２時点、適用開始前及び適用１２週間後において、室温に馴化の上、適用部位である目尻の小じわ部位において、以下の目視評価及びレプリカのＶｉｓｉｏｍｅｔｅｒ測定によるシワ改善効果の評価を行った。結果に関しては統計解析（対応のあるｔ検定）を行った。
　試料の性状：透明ゲル状
　試料中の有効成分：Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン１．０質量％、Ｌ−セリン０．３質量％
＜目視評価＞
　試験方法：ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ（２００４−８０）のプロトコール及びレギュレーションに従い行った。試験は、ランダム化された二重盲検法により行った。また、２名の専門パネルにより、試料及び偽薬の適用前後において、被験者に対して、以下のグローバルフォトダメージスコアを付与し、その平均点を算出した。
　グローバルフォトダメージスコアは損傷度合いに応じて下記のとおりに定められた。
　０：ｎｏｎｅ　なし
　１：ｎｏｎｅ／ｍｉｌｄ　なし／緩やか
　２：ｍｉｌｄ　緩やか
　３：ｍｉｌｄ／ｍｏｄｅｒａｔｅ　緩やか／中程度
　４：ｍｏｄｅｒａｔｅ　中程度
　５：ｍｏｄｅｒａｔｅ／ｓｅｖｅｒｅ　中程度／激しい
　６：ｓｅｖｅｒｅ　激しい
　７：ｖｅｒｙ　ｓｅｖｅｒｅ　非常に激しい
　被験者は、上記のグローバルフォトダメージスコア（Ａｒｃｈ　Ｄｅｒｍａｔｏｌ　１３７（８）：１０４３−１０５１（２００１）参照）が２~６を有する者とした。
　図１８に、シワ改善効果試験の目視評価における被験者のグローバルフォトダメージスコアの内訳をその人数割合（％）にて示す。
　図１９に、抗老化に適し得る薬剤（Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリンとセリンとの混合物）と偽薬とについての被験者に対するシワ改善効果試験の目視評価の結果を示す。縦軸にグローバルフォトダメージスコア（—）を示し、横軸に時間（週）を示す。
＜レプリカ評価＞
　被験者は目視評価の場合と同じとした。シリコン製のレプリカの作製を通して、Ｖｉｓｉｏｍｅｔｅｒ（Ｓｋｉｎ−Ｖｉｓｉｏｍｅｔｅｒ　ＳＶ　６００（Ｃｏｕｒａｇｅ＆Ｋｈａｚａｋａ社　；ドイツ））による機器測定を行った。機器測定は、ランベルトベールの法則に従い、レプリカの透過光の強度変化を測定することにより、皮膚の変化を観察した。
　Ｒ１：しわ等高線の最高値と最低値との差の値
　Ｒ２：しわ等高線を任意に５個ずつ分けた後、Ｒ１値のうち最高値
　Ｒ３：しわ等高線を任意に５個ずつ分けた後、Ｒ１値の平均値
　Ｒ４：しわ等高線のベースライン（ｂａｓｅｌｉｎｅ）としわ等高線の最高値のラインとで囲まれた面積
　Ｒ５：しわ等高線のベースライン（ｂａｓｅｌｉｎｅ）と中央線とで囲まれた面積に相当する、Ｒ４の平均偏差
　図１９において、各測定時点での試料（試験サンプル）及び偽薬（プラセボ）の有意差はＰ値：０．３２８（４週間時点）、Ｐ値：０．０２２（８週間時点）、Ｐ値：０．００１（１２週間時点）となり、８週間時点と１２週間時点において、Ｐ値が０．０５未満であり、プラセボに対して試験サンプルはシワ改善効果が有意に高いことが示された。
　図２０に、抗老化に適し得る薬剤（Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリンとセリンとの混合物）と偽薬とについての被験者に対するシワ改善効果試験のレプリカ評価の結果を示す。縦軸に横軸に示す各評価指数（Ｒｉ（ｉ＝１~５））の変化量ΔＲｉの大きさを示す。
　図２０において、１２週間時点での試料（試験サンプル）及び偽薬（プラセボ）の有意差はＰ値：０．１２５（Ｒ１）、Ｐ値：０．０４１（Ｒ２）、Ｐ値：０．０３６（Ｒ３）、Ｐ値：０．５１７（Ｒ４）、Ｐ値：０．３７３（Ｒ５）となり、Ｒ２とＲ３においてＰ値が０．０５未満であり、プラセボに対して試験サンプルはシワ改善効果が有意に高いことが示された。
　本発明によれば、Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミンを有効成分として用いることによって、細胞間脂質の微細構造におけるラメラ構造を改善する及び／又は充填構造を改質することができる。
　本発明によれば、Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミンを有効成分とする、細胞間脂質の微細構造における、ラメラ構造改善剤、充填構造改質剤、直方晶比率維持・改善剤；Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミンを有効成分とする、肌における、水分保持改善剤、バリア能改善剤、抗老化剤、抗シワ剤；を提供することができる。

Claims (9)

  1. 　Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミンから選ばれる少なくとも一種を有効成分とする、細胞間脂質の微細構造におけるラメラ構造改善剤。
  2. 　Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミンから選ばれる少なくとも一種を有効成分とする、細胞間脂質の微細構造における充填構造改質剤。
  3. 　Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミンから選ばれる少なくとも一種を有効成分とする、細胞間脂質の微細構造における直方晶比率維持・改善剤。
  4. Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミンから選ばれる少なくとも一種を有効成分とする、肌における水分保持改善剤。
  5. 　Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミンから選ばれる少なくとも一種を有効成分とする、肌におけるバリア能改善剤。
  6. 　Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミンから選ばれる少なくとも一種を有効成分とする、肌における抗老化剤。
  7. 　Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミンから選ばれる少なくとも一種を有効成分とする、肌における抗シワ剤。
  8. 　細胞間脂質の微細構造におけるラメラ構造改善剤の製造のためのＮ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミンから選ばれる少なくとも一種の使用。
  9. 　肌における水分保持改善剤の製造のためのＮ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミンから選ばれる少なくとも一種の使用。
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