WO2018154169A1 - Dispositivo y método de separación de células móviles - Google Patents

Dispositivo y método de separación de células móviles Download PDF

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WO2018154169A1
WO2018154169A1 PCT/ES2018/070135 ES2018070135W WO2018154169A1 WO 2018154169 A1 WO2018154169 A1 WO 2018154169A1 ES 2018070135 W ES2018070135 W ES 2018070135W WO 2018154169 A1 WO2018154169 A1 WO 2018154169A1
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mobile
separation device
cell separation
cells
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Herberto Ernesto Héctor REPETTO
Original Assignee
REPETTO, Constanza Julia
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/34—Purifying; Cleaning

Definitions

  • the present invention describes a mobile cell separation device from a cell population and a method of separation. Especially it is part of the sperm recovery techniques for an ART (assisted reproduction technique) where it is necessary to recover quantity and quality of sperm related to its mobility, morphology and integrity of DNA (1) without the need for other devices.
  • ART assisted reproduction technique
  • Cell separation methods and devices are abundant in the state of the art, based on characteristic properties of sperm-like mobile cells, such as reothaxis (4), among others.
  • the devices and methods of separation of the state of the art use filter membranes, density gradients, perforated membranes that prevent the passage of cells, among others.
  • Patents US6129214 (A) and US6357596B1 describe a method and apparatus for separating the best sperm using a membrane; where sperm that penetrate the membrane can be maintained in a suitable medium.
  • This device separates the mobile sperm when they pass through a membrane with pores between 5 and 8 ⁇ . This device does not separate sperm by reotaxis but only filters immobile sperm.
  • US Patent Application US200831 1653 (A1) describes a method and apparatus for optimally regulating semen flow and mobile sperm separation.
  • the apparatus consists of a cylindrical container, a membrane composed of pores (holes with a diameter between 10 and 150 ⁇ ), and a second cylindrical container that is coupled to the first cylindrical container.
  • the method of separation is based on the ability of sperm to swim against the current (swim-up).
  • This method uses a current system that is inducing the reotaxis, but its implementation is more complex requiring a degree of specialization and apparatus that the device of the present invention does not need, the amount of medium that must have this method is greater and can not dispense with a stove.
  • WO2008104042 A 1 describes a sperm cell separation process using a membrane filtration system with pores between 2 and 3 microns
  • the membrane can be of various materials such as PES, PVDF, MCE, PTFE, Nylon, polycarbonate, etc. This type of device does not allow the passage of mobile cells, but they are retained in the pores of the membrane.
  • US5575914A discloses a filter for separating spermatozoa with low mobility from those with high mobility, wherein said filter is composed of compact glass wool. Nor is it based on reotaxis, it filters still sperm.
  • Patent application CA2834007A1 describes a sperm separation device, wherein said device uses a radial array of microchannels configured to direct sperm from one reservoir to another.
  • the width of said microchannels is between 50 and 300 microns, the height between 100 and 200 microns and the length between 6 and 9 mm.
  • the microchannels are cylindrical. This device is of complex design and manufacturing. The sperm do not swim against the current and therefore what it does is direct them under the definition of "wall swimming", that is, through the shape of the channels it redirects the sperm. This device also needs a stove.
  • the present invention achieves self-selection by taking advantage of the sperm's ability to penetrate and swim against the current, since an initial current is generated in the device to the site where the sperm are placed.
  • the shape of the channels of the present invention achieve extraordinary performances without additional device requirements.
  • Application US2016017273 discloses a method and device for sperm separation through the swim-up technique.
  • the devices and methods present in the state of the art have technical disadvantages in comparison with the present invention due to the fact that the means they use for separation can be covered, they need manipulation by a person with certain technical skills in handling laboratory instruments and therefore it is also necessary to manipulate them in controlled environments making it impossible to use them in the field or in offices.
  • most of them need extra filtration and / or centrifugation operations, leading to possible contamination of the sample, loss of material, alteration of DNA etc., either due to an increase in the maneuvering time of the sample or by the pressure produced by the revolutions during centrifugation.
  • the present invention provides a mobile cell separation device and method that does not require filtration and / or centrifugation operations, of simple manipulation achieving excellent separation results of those mobile cells from a cell population, including the separation of mobile cells with Damaged DNA.
  • a outstanding feature of the present invention is that it does not require a stove to perform the separation of mobile cells, this allows the necessary actions for artificial insemination of both animals and humans in elementary conditions, without the need for usual equipment in this type of techniques
  • the device of the present invention even allows artificial insemination in the field.
  • the mobile cell separation device of the present invention from a cell population, preferably sperm, comprises a first reservoir and a second reservoir linked by at least one screened plate, characterized in that said screened plate comprises at least one channel with at least one end that has a reduction in its diameter towards the inside of said channel. And where said screened plate is constituted, preferably of a material selected from the set comprised of: glass, PET, metal, polymer, carbon fiber and mixtures or combinations thereof. Where said channel preferably comprises, at least one of its ends, a shape selected from the assembly comprised of conical and hyperboloid, and said screened plate comprises, in a preferred mode of realization of a plurality of channels.
  • said channel comprises, in another preferred embodiment, its two ends with shapes selected from the set comprised of conical, paraboloid and hyperboloid.
  • said screened plate comprises a plurality of channels that allows the separation of mobile sperm from one side of said screened plate and from non-translational elements or cells remaining on the other side of said screened plate.
  • said mobile cell separation device of the invention has channels comprising a first external diameter of between 50 and 200 ⁇ , an internal diameter of between 6 and 15 ⁇ and a length of entity 50 and 600 ⁇ ; more preferably they comprise a first external diameter of between 50 and 200 ⁇ , a second external diameter between 10 and 50 ⁇ , an internal diameter of between 8 and 15 ⁇ and a length of 50 and 350 ⁇ .
  • the mobile cell separation device of the present invention preferably has said screened plate with between 1000 to 20,000 channels / cm 2; and preferably the volume of said first reservoir is between 1 and 5ml_, and the volume of said second reservoir between 0.5 and 1.5 ml; and wherein said second reservoir comprises a root greater than said first reservoir.
  • said second reservoir is loaded with a culture medium generating a current of said culture medium towards said first reservoir.
  • screened plate is constituted of a material selected from the set comprised of: glass, PET, metal, ceramic, polymer, carbon fiber and mixtures or combinations thereof.
  • the mobile cell separation device of the invention allows a reduction of the semen with damaged DNA in said second reservoir, with respect to a fresh semen sample.
  • the present invention manages to decrease the value of the TUNEL assay (DNA damage) up to nine times ) regarding the direct method. In particular, a decrease of at least 3 times is observed for the invention carried out in PET (from 35% to 10%, for sample D, table 1); and up to 9 times for the invention in glass (from 35% to 4% for the same sample D).
  • the device of the present invention increases the amount of sperm with normal morphology by at least 80% (morphology values for sample D).
  • Another object of the present invention is a method of separating mobile cells from a cell population comprising the following steps:
  • step "b” comprises a current of a culture medium in the opposite direction to the direction of passage of said mobile cells, wherein said current is generated by a difference of pressure, or by capillarity; and preferably said pressure difference is generated by level difference between the reservoirs that are located on both sides of said screened plate.
  • step “c” comprises incubating for a time between 1 and 90 minutes at a temperature between 35 and 37 ° C. Preferably, between 10 and 90 minutes.
  • the method of the present invention makes use of the device of the present invention.
  • FIGURE 1 represents a front view, with a section showing the screened plate (101), where the channels of the plate (102) are shown in the enlarged image.
  • FIGURE 2 represents the lateral section of the device where the first reservoir is observed
  • FIGURE 3 represents the complete possible scheme of the device of the present invention, where the first reservoir (201), the screened plate (203) and the second reservoir are observed
  • FIGURE 4 represents the device adapted to the technique of intracytoplasmic sperm injection (ICSI).
  • ICSI intracytoplasmic sperm injection
  • FIGURE 5 Schemes of some of the ways that the channels of the screened plate of the present invention can take.
  • FIGURE 6 represents an alternative embodiment of the device of the present invention.
  • a cell population comprises a fluid that can be a culture medium, or a biological fluid with a great variety of cells, where in said fluid there are cells with locomotive capacity, now called in more mobile cells.
  • the example of the present invention comprises the separation of mobile cells of the spermatic type, however, the device and method are also applicable to other types of mobile cells, such as microorganisms or parasites.
  • the present invention describes a device and a method of separating mobile cells, preferably sperm, which is not based on the budgets of a swim-up or those that use most other systems, but is based on two aspects 1 ) the search made by the gamete, or cell, of a space to enter, search that is random, aided by the shape of the channel and 2) the microcurrents that generate the same sperm and that end up guiding the following by reotaxis ( first induced by pressure difference and then self-induced by the passage through the narrow channel).
  • the device of the present invention does not require any other laboratory element to achieve its purpose, that is, no additional tubes, or centrifuge or stove. Nor does it require electricity, which makes it a basic and innovative tool when it comes to extending assisted fertility practices to everyone, enabling both Health professionals such as veterinarians to have a tool for themselves to be arranged even in the least provided places.
  • the incubation required by the method of the present invention can be performed by keeping the device locked in an adult's fist or in contact with the human body.
  • the device of the present invention comprises a first reservoir (201), where the semen sample is placed from which it is desired to separate the sperm, a second reservoir (202) to which the sperm or mobile cells linked to both reservoirs are migrated and collected. using a screened plate (203).
  • Said screened plate comprises one or more perforations that form channels through which the mobile cells migrate.
  • Said perforations, called channels may have the same or different diameters according to the section of said channel that is measured, that is, taking into account the section that links to the first reservoir, the section that links to the second reservoir and the section which is between the aforementioned (both called external sections), now called in more intermediate section.
  • the channels presented by the screened plate have equal diameters in all sections of said channels.
  • the diameter of the channels is different in the sections that are linked to the reservoirs with respect to the intermediate section.
  • said external sections of said channels have a diameter greater than the diameter of the intermediate section of said channel.
  • said external sections of said channels have conical, hyperbolic or parabolic geometric shapes.
  • the device of the present invention operates in the absence of filtering or the application of electromagnetism, or static currents or immunological labeling methods.
  • the device of the present invention makes the sperm swim in the same way as it would in vivo, migrating together from a reservoir through a screened plate to another reservoir leaving behind detritus, sperm with mostly damaged DNA and cells not mobile
  • the property of reotaxis, the design and natural behavior of the gamete is essentially used to penetrate interfaces (this behavior is observed to a greater extent in sperm with undamaged DNA).
  • the device uses the sperm reotaxis property generated by a pressure difference between the two reservoirs, this being achieved as a result of a higher initial level of the second reservoir (where mobile sperm are recovered) that will be maintained until such time as balance the two pressures, although they also get involved as forces drivers of such current the capillarity and possibly the difference in concentrations in both reservoirs. Beyond the phenomenon that causes the current is a fact that there is a fluid flow from the second reservoir to the first, which generates the impulse for healthy sperm to swim against the current.
  • This condition of the sperm most apt to pass or pass through the screened plate of the present invention is consistent, in the results, with the significant increase in the percentage of normal morphology and the highly significant decrease in the percentage of sperm with damaged DNA.
  • the characteristics of the present invention allow a self-selection in gametes with rapid linear translational characteristics, which, as expected, coincide with a percentage in an increased normal morphology and with a higher percentage of conserved DNA (without alterations).
  • the sperm are following a microcurrent produced by the flow between the recovery medium compartment and the semen compartment and then self-sustained by those who follow.
  • the others are favored by the microcurrents produced by the first scourge to which the microcurrents of the successive scourges are added, thereby enhancing the current and therefore the effect of reotaxis.
  • the sperm leave the seminal plasma on their own to access the insemination culture medium, leaving behind all seminal non-sperm elements in the seminal plasma (cells, detritus, immobile sperm and also sperm without reotaxis) since they do not have this ability of sperm to penetrate this type of holes.
  • the device of the present invention comprises at least one plate screened with one or more channels of selected shapes among conical, hyperbolic, paraboloid of revolution, among many others that allow a widening in at least one of the ends of the channel as can be seen in figure 5.
  • the quantity quality and type of channels varies according to the material used to make the plate.
  • the size of the reservoirs for the semen sample can also vary according to the quantity of sample to be processed, among others. Constructive methods are known in the state of the art and can be performed with lasers, among other drilling mechanisms.
  • the screened plate comprises a channel density of between 1,000 and 20,000 per cm 2 .
  • the perforations or channels of the screened plate of the present invention comprise a length of between 100 and 600 ⁇ .
  • the channels of the present invention comprise three sections with different diameters, a first external diameter linked to said first reservoir (where semen is placed), an internal diameter, and a second external diameter that links the screened plate with said second reservoir (where the mobile cells are collected in a culture medium provided for that purpose).
  • said first external diameter comprises between 50 and 200 ⁇
  • said internal diameter comprises between 8 and 15 ⁇
  • said second external diameter comprises between 10 and 50 ⁇ .
  • the perforations of the screened plate comprise different geometric shapes such as cylindrical, conical, parabolic, hyperbolic, hyperbolic of revolution.
  • the geometric shape of entry and exit of the perforations is a revolution curve that can be between a straight line (which generates a cone) or a parabola or hyperbola section type curve that results in a revolution figure with a diameter exterior greater than interior (204).
  • the reservoirs of the device of the present invention comprise a volumetric capacity that depends on several factors: the amount of sample to be processed, the dimensions of the screened plate, among others.
  • the reservoirs used for a 1x3 cm screened plate vary between 0.5 and 4.0 ml. It is essential to emphasize that the device of the present invention generates a current in the culture fluid or medium in such a way that the mobile cells, preferably the sperm cells, use their ability to swim against the current for their separation; said current is generated by a pressure difference in the reservoirs.
  • the second reservoir contains a higher level, that way a current is generated to the first reservoir through the screened plate.
  • the sample to be separated is loaded, and said second reservoir is loaded with a culture medium or fluid to recover the mobile cells separated from the rest of the population by their passage through said screened plate
  • the device of the present invention separates the mobile sperm in a time between 1 and 90 minutes. Preferably, between 10 and 90 minutes.
  • the device is adapted for the technique of intracytoplasmic sperm injection (ICSI).
  • ICSI intracytoplasmic sperm injection
  • the insemination with micro injection of semen to an oocyte can be useful to perform the separation of high performance sperm in the same injection plate.
  • a preferred alternative of carrying out the present invention with only one channel that is schematized in Figure 4 comprises said two reservoirs, also called microcubas (402 and 403) communicated by a funnel-shaped channel that communicates both reservoirs (404 ). Both reservoirs are covered by a coverslip (401) thus enabling a 10 ⁇ channel.
  • the screen contains only one channel.
  • FIG. 6 shows a cylindrical shape as shown in Figure 6, which comprises a cover (601), a hole near the opening of said tube (602), a first reservoir ( 604) and a second reservoir (603) where it can be observed that the enrase of the second reservoir, exit reservoir and collection of the selected sperm, is greater than the enrase of the first reservoir where the semen sample goes with the sperm to be separated.
  • Figure 6 shows an enlargement of the section where the screened plate (605) is shown with the channels (606) through which the sperm flow.
  • the mobile cell separation device of the present invention (MXM) consists of two reservoirs separated by a screened glass plate 130 ⁇ 40 ⁇ thick, with conical shaped channels of the length of the width of the glass, i.e. 130 ⁇ 40 ⁇ , a first diameter (inlet) of 15 ⁇ and a second diameter (outlet) of 8 ⁇ .
  • MXM mobile cell separation device of the present invention
  • the plate is 1 cm x 2cm, with a density of 6600 perforations / cm 2 .
  • the first reservoir where the sample to be processed is placed, has a maximum volumetric capacity of 3ml_, and the second reservoir comprises a maximum capacity of 1 ml_.
  • the PET-screened plate was made with 2500 channels, each 200 ⁇ long.
  • the conical shaped channels comprise a first diameter (inlet) of 15 ⁇ and a second diameter (outlet) of 10 ⁇ .
  • the size of the PET plate is 1 cm x 2 cm.
  • the reservoirs are the same ones used for the glass sieve plate of Example 1. First, Ham F10 1X recovery medium with HEPES, supplemented with SSS and Penicillin / streptomycin was placed in the recovery reservoir (second reservoir); Semen sample A, B, C and D previously processed according to WHO2010 protocol was placed in the remaining reservoir (first reservoir).
  • Step 1- The Ham F10 1X medium with HEPES (0.6-0.7 milliters) is placed until the second reservoir is rooted.
  • the HamF10 1X is loaded with HEPES with a Pasteur pipette with a capillary tip (to enter the cuvette); When it is filled, it allows filling the screens with the HTF medium that will bathe the entire interior and the immediate surface of the semen side.
  • Step 2 - Immediately afterwards, the semen sample is placed in the first reservoir. Be sure to completely cover the screened plate with the sample to be processed and make the most of the screened surface
  • Step 3 The incubation of one hour (which can be between 1 minutes and 90 minutes) is carried out in contact with the body, although it can be done in an oven.
  • Step 4 The device is removed from the incubation state (either from a stove or in contact with the body), a stove was used for example 2, at 36 ° C and the fist for example 1.
  • the processed sample is taken of the recovery medium (that is, of the second reservoir) with syringe and tuberculin needle. This processed sample is ready to be used in artificial insemination.
  • the% of sperm was tripled with normal forms compared to the direct one, going from 10.3% to 36.0% (for samples A, B, C, D), average values of the results obtained in each essay While in the case of swim-up only the value of sperm with normal forms almost doubles, going from 1 1.3% of normal forms to 18.0% with the method of the present invention.
  • the swim-up technique is the normal basic technique for sperm recovery with a view to artificial insemination, of high or low complexity, with the disadvantage that given the exposure and handling time together with centrifugation that can lead to DNA alterations
  • A, B, C, D passes from 13.3% pass from
  • A, B, C, D passes

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Abstract

Dispositivo para separar células móviles, formado por dos reservorios que comparten un lado constituido por una placa cribada en la que al menos un canal presenta una disminución de su diámetro adoptando una forma cónica. El primer reservorio es donde se deposita la muestra que contiene las células y el segundo reservorio se carga con un medio de cultivo con un nivel de enrase superior al del primer reservorio, lo que origina una corriente hacia el mismo. El dispositivo se emplea para seleccionar en una muestra de semen, los espermatozoides más aptos utilizados en técnicas de reproducción asistida.

Description

DISPOSITIVO Y MÉTODO DE SEPARACIÓN DE CÉLULAS MÓVILES
Campo de la técnica
La presente invención describe un dispositivo de separación de células móviles a partir de una población celular y un método de separación. Especialmente se enmarca dentro de las técnicas de recuperación de espermatozoides para una ART (técnica de reproducción asistida) donde se necesita recuperar cantidad y calidad de espermatozoides relacionada a su movilidad, morfología e integridad del ADN (1) sin necesidad de otros dispositivos. Estado de la técnica
Los métodos y dispositivos de separación de células son abundantes en el estado de la técnica, se basan en propiedades características de las células móviles tipo espermatozoides, tales como reothaxis (4), entre otras. Los dispositivos y métodos de separación del estado de la técnica utilizan membranas filtrantes, gradientes de densidad, membranas perforadas que impiden el paso de las células, entre otros.
Las patentes US6129214 (A) y US6357596B1 describen un método y un aparato para separar a los mejores espermatozoides utilizando una membrana; donde los espermatozoides que penetren la membrana podrán ser mantenidos en un medio adecuado. Este dispositivo, según se menciona en la descripción, separa los espermatozoides móviles cuando éstos atraviesan una membrana con poros de entre 5 y 8 μηι. Este aparato no separa a los espermatozoides por reotaxis sino que sólo filtra espermatozoides inmóviles.
La solicitud de patente estadounidense US200831 1653 (A1), describe un método y aparato para regular de manera óptima el flujo de semen y la separación de los espermatozoides móviles. El aparato consiste de un contenedor cilindrico, una membrana compuesta por poros (agujeros con diámetro de entre 10 y 150 μηι), y un segundo contenedor cilindrico que se acopla al primer contenedor cilindrico. El método de separación se basa en la capacidad de los espermatozoides de nadar contracorriente (swim-up). Este método utiliza un sistema de corriente que va induciendo la reotaxis, pero resulta más compleja su realización requiriendo un grado de especialización y aparataje que el dispositivo de la presente invención no precisa, la cantidad de medio que debe disponer este método es mayor y no puede prescindir de una estufa.
La solicitud internacional WO2008104042 A 1 describe un proceso de separación de células espermáticas utilizando un sistema de filtración por membrana con poros de entre 2 y 3 micrones. La membrana puede ser de varios materiales como PES, PVDF, MCE, PTFE, Nylon, policarbonato, etc. Este tipo de dispositivo no permite el paso de las células móviles, sino que quedan retenidas en los poros de la membrana.
La patente US5575914A describe un filtro para separar espermatozoides con baja movilidad de aquellos con alta movilidad, donde dicho filtro está compuesto de lana de vidrio compacta. Tampoco se basa en reotaxis, filtra espermatozoides inmóviles.
La solicitud de patente CA2834007A1 describe un dispositivo de separación de espermatozoides, donde dicho dispositivo utiliza un arreglo radial de microcanales configurados para dirigir a los espermatozoides desde un depósito a otro. El ancho de dichos microcanales es de entre 50 y 300 micrones, la altura de entre 100 y 200 micrones y la longitud de entre 6 y 9 mm. Los microcanales son de forma cilindrica. Este dispositivo es de diseño y fabricación compleja. Los espermatozoides no nadan contra corriente y por lo tanto lo que hace es dirigirlos bajo la definición de "wall swimming", es decir, a través de la forma de los canales redirige a los espermatozoides. Este dispositivo, además, necesita necesariamente de una estufa. En cambio, la presente invención logra una autoselección aprovechando la capacidad de los espermatozoides de penetrar y nadar contra la corriente, ya que se genera en el dispositivo una corriente inicial hacia el sitio donde se colocan los espermatozoides. Además, la forma de los canales de la presente invención logran rendimientos extraordinarios sin requerimientos de dispositivos adicionales.
La solicitud US2016017273 divulga un método y dispositivo para la separación de espermatozoides a través de la técnica de swim-up.
Los dispositivos y métodos presentes en el estado de la técnica poseen desventajas técnicas en comparación con la presente invención por el hecho de que el medio que utilizan para la separación puede taparse, necesitan de la manipulación por una persona con ciertas habilidades técnicas en el manejo de instrumental de laboratorio y por ende también es necesaria su manipulación en ambientes controlados imposibilitando su uso en campo o en consultorios. Por otra parte, la mayoría de ellos necesitan de operaciones extras de filtración y/o centrifugación, propiciando posibles contaminaciones de la muestra, perdida de material, alteración del ADN etc., ya sea por aumento en el tiempo de maniobra de la muestra o por la presión producida por las revoluciones durante la centrifugación.
La presente invención proporciona un dispositivo y un método de separación de células móviles que no necesita de operaciones de filtración y/o centrifugación, de sencilla manipulación logrando excelentes resultados de separación de aquellas células móviles de una población celular, inclusive la separación de células móviles con ADN dañado. Una característica destacada de la presente invención es que no requiere de estufa para realizar la separación de las células móviles, esto permite realizar las acciones necesarias para la inseminación artificial tanto de animales como de humanos en condiciones elementales, sin necesidad de equipamientos usuales en este tipo de técnicas. El dispositivo de la presente invención, incluso permite la inseminación artificial en campo.
Breve descripción de la invención
El dispositivo de separación de células móviles, de la presente invención, a partir de una población celular, preferentemente espermatozoides, comprende un primer reservorio y un segundo reservorio vinculados por al menos una placa cribada, caracterizado porque dicha placa cribada comprende al menos un canal con al menos un extremo que presenta una reducción de su diámetro hacia el interior de dicho canal. Y donde dicha placa cribada está constituida, preferentemente de un material seleccionado del conjunto comprendido por: vidrio, PET, metal, polímero, fibra de carbono y sus mezclas o combinaciones. Donde dicho canal comprende, preferentemente, en al menos uno de sus extremos una forma seleccionada del conjunto comprendido por cónica e hiperboloide, y dicha placa cribada comprende, en un modo preferido de realización de una pluralidad de canales.
Además, dicho canal comprende, en otra forma de realización preferida sus dos extremos con formas seleccionadas del conjunto comprendido por cónica, paraboloide e hiperboloide. Donde dicha placa cribada comprende una pluralidad de canales que permite la separación de espermatozoides móviles de un lado de dicha placa cribada y de elementos o células no traslativas que quedan del otro lado de dicha placa cribada.
Preferentemente, dicho dispositivo de separación de células móviles de la invención presenta canales que comprenden un primer diámetro externo de entre 50 y 200 μηι, un diámetro interno de entre 6 y 15 μηι y una longitud de ente 50 y 600 μηι; más preferentemente comprenden un primer diámetro externo de entre 50 y 200 μηι, un segundo diámetro externo de entre 10 y 50 μηι, un diámetro interno de entre 8 y 15 μηι y una longitud de ente 50 y 350 μηι.
Además, el dispositivo de separación de células móviles de la presente invención presenta, preferentemente, dicha placa cribada con entre 1000 a 20.000 canales /cm2; y preferentemente el volumen de dicho primer reservorio es de entre 1 y 5ml_, y el volumen de dicho segundo reservorio de entre 0,5 y 1 ,5 mi; y donde dicho segundo reservorio comprende un enrace superior a dicho primer reservorio. Además, dicho segundo reservorio se carga con un medio de cultivo generándose una corriente de dicho medio de cultivo hacia dicho primer reservorio.
Donde dicha placa cribada está constituida de un material seleccionado del conjunto comprendido por: vidrio, PET, metal, cerámica, polímero, fibra de carbono y sus mezclas o combinaciones.
El dispositivo de separación de células móviles de la invención permite lograr una disminución del semen con ADN dañado en dicho segundo reservorio, con respecto a una muestra de semen fresco La presente invención logra disminuir hasta nueve veces el valor del ensayo de TUNEL (daño del DNA) respecto del método directo. En particular se observa una disminución de al menos 3 veces para la invención realizada en PET (de 35% a 10%, para la muestra D, tabla 1); y hasta 9 veces para la invención en vidrio (de 35% a 4% para la misma muestra D). Además, el dispositivo de la presente invención incrementa la cantidad de espermatozoides con morfología normal en al menos un 80% (valores de morfología para la muestra D).
Otro objeto de la presente invención es un método de separación de células móviles a partir de una población celular que comprende los siguientes pasos:
a. Colocar el medio de cultivo para que inunde la cámara 2 y los canales,
b. poner en contacto la población celular con una cara de una placa cribada que comprende al menos un canal con al menos un extremo que presenta una reducción de su diámetro hacia el interior de dicho canal, enrasando por debajo del nivel del medio de la cámara 2, lo que permite que siga pasando medio hacia la cámara 1 y así producirse el efecto de contracorriente inicial
c. incubar;
d. recuperar las células móviles con mayor porcentaje de morfología normal de la otra cara de dicha placa cribada.
Donde dicho método de separación de células móviles a partir de una población celular, en el paso "b" comprende una corriente de un medio de cultivo en sentido contrario al sentido de paso de dichas células móviles, donde dicha corriente es generada por una diferencia de presión, o por capilaridad; y preferentemente dicha diferencia de presión se genera por diferencia de nivel entre los reservónos que se encuentran a ambos lados de dicha placa cribada. Además, dicho paso "c" comprende incubar por un tiempo de entre 1 y 90 minutos a una temperatura entre 35 y 37°C. Preferentemente, entre 10 y 90 minutos. Y, preferentemente, el método de la presente invención hace uso del dispositivo de la presente invención.
Breve descripción de las figuras FIGURA 1 : representa vista frontal, con corte donde se muestra la placa cribada (101), donde en la imagen aumentada se muestran los canales de la placa (102).
FIGURA 2: representa el corte lateral del dispositivo donde se observan el primer reservorio
(201) , la placa cribada (203) y el segundo reservorio (202). Además, se muestra en aumento la forma preferida del tipo de canal de la placa cribada.
FIGURA 3: representa, el esquema completo posible del dispositivo de la presente invención, donde se observan el primer reservorio (201), la placa cribada (203) y el segundo reservorio
(202) .
FIGURA 4: representa el dispositivo adaptado a la técnica de inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI).
FIGURA 5: esquemas de algunas de las formas que pueden adoptar los canales de la placa cribada de la presente invención.
FIGURA 6: representa una forma alternativa de realización del dispositivo de la presente invención.
Descripción detallada de la invención
De acuerdo a la presente invención, una población celular comprende un fluido que puede ser un medio de cultivo, o un fluido biológico con una gran variedad de células, donde en dicho fluido hay células con capacidad locomotora, llamadas de ahora en más células móviles. El ejemplo de la presente invención comprende la separación de células móviles del tipo espermáticas, sin embargo, el dispositivo y método también son aplicables a otro tipo de células móviles, tales como microorganismos o parásitos.
La presente invención describe un dispositivo y un método de separación de células móviles, preferentemente espermáticas, que no se basa en los presupuestos de un swim-up o en los que utilizan la mayoría de los otros sistemas, sino que se basa en dos aspectos 1) la búsqueda que realiza la gameta, o célula, de un espacio por donde entrar, búsqueda que es aleatoria, auxiliada por la forma del canal y 2) las micro corrientes que generan los mismos espermatozoides y que terminan guiando a los siguientes por reotaxis (primero inducida por diferencia de presión y luego auto-inducida por el paso a través del estrecho canal).
El dispositivo de la presente invención no requiere ningún otro elemento de laboratorio para poder lograr su cometido, esto es ni tubos adicionales, ni centrífuga ni estufa. Tampoco requiere electricidad, lo que lo convierte en una herramienta básica e innovadora a la hora de extender las prácticas de fertilidad asistida a todo el mundo, habilitando tanto a los profesionales de la salud como a los veterinarios a disponer por ellos mismos de una herramienta para ser dispuesta hasta en los lugares menos provistos. La incubación que requiere el método de la presenta invención puede realizarse manteniendo el dispositivo encerrado en el puño de un adulto o en contacto con el cuerpo humano.
El dispositivo de la presente invención comprende un primer reservorio (201), donde se coloca la muestra de semen de la cual se desean separar los espermatozoides, un segundo reservorio (202) a donde migran y se recogen los espermatozoides o células móviles vinculados ambos reservónos mediante una placa cribada (203). Dicha placa cribada comprende una o más perforaciones que conforman canales por donde migran las células móviles. Dichas perforaciones, llamadas canales, pueden tener iguales o diferentes diámetros de acuerdo a la sección de dicho canal que se mida, esto es, teniendo en cuenta la sección que se vincula al primer reservorio, la sección que se vincula al segundo reservorio y la sección que queda entre medio de las anteriormente mencionadas (ambas llamadas secciones externas), llamada de ahora en más sección intermedia.
En un aspecto preferente de la presente invención, los canales que presenta la placa cribada poseen diámetros iguales en todas las secciones de dichos canales.
En otro aspecto de la presente invención, el diámetro de los canales es diferente en las secciones que se vinculan a los reservónos respecto de la sección intermedia. En una forma preferida de la presente invención, dichas secciones externas de dichos canales poseen un diámetro superior al diámetro de la sección intermedia de dicho canal.
En otro aspecto de la presente invención dichas secciones externas de dichos canales poseen formas geométricas del tipo cónica, hiperbólicas o parabólicas.
El dispositivo de la presente invención opera en ausencia de un filtrado o la aplicación de electromagnetismo, o corrientes estáticas o métodos de marcación inmunológica. El dispositivo de la presente invención logra que el espermatozoide nade del mismo modo que lo haría in vivo, migrando en conjunto desde un reservorio pasando a través de una placa cribada hacia otro reservorio dejando atrás los detritus, espermatozoides con ADN dañado en su mayoría y células no móviles. Se aprovecha esencialmente la propiedad de reotaxis, el diseño y comportamiento natural de la gameta para penetrar interfases (este comportamiento se observa en mayor medida en espermatozoides con ADN no dañado). El dispositivo utiliza la propiedad de reotaxis de los espermatozoides generada por una diferencia de presión entre los dos reservónos, lográndose esto como consecuencia de un mayor nivel inicial del segundo reservorio (donde se recuperan los espermatozoides móviles) que se mantendrá hasta el momento en que se equilibren las dos presiones, aunque también se involucran como fuerzas impulsoras de tal corriente la capilaridad y posiblemente la diferencia de concentraciones en ambos reservónos. Más allá del fenómeno que provoque la corriente es un hecho que existe una corriente de fluido desde el segundo reservorio hacia el primero, lo que genera el impulso para que los espermatozoides saludables naden en contracorriente. Hasta ese instante, las corrientes inducidas a través de cada una de los canales desde el medio de cultivo hacia dicho primer reservorio de colección del semen entero, favorece la reotaxis de los espermatozoides que conservan esa propiedad intacta, quedando a partir de ese momento (el de equilibrio de presión o flujo cero) el sistema autosustentado por las microcorrientes inducidas ahora por el grupo de espermatozoides que continúa pasando a través de la placa cribada.
Esta condición de los espermatozoides más aptos a pasar o atravesar la placa cribada de la presente invención se condice, en los resultados, con el incremento significativo en el porcentaje de morfología normal y de la disminución altamente significativa en el porcentaje de espermatozoides con ADN dañado. Las características de la presente invención permiten una autoselección en las gametas con características traslativas lineales rápidas, que coinciden, como es de esperar, con un porcentaje en una morfología normal aumentada y con un mayor porcentaje de ADN conservado (sin alteraciones).
En el dispositivo de la presente invención los espermatozoides están siguiendo una microcorriente producida por la el flujo entre el compartimiento de medio de recuperación y el compartimiento del semen y luego autosustentada por los que siguen. En otras palabras, después de que uno ha encontrado la entrada los demás ven favorecido su camino por las microcorrientes que produce el primer flagelo a la que se van sumando las microcorrientes de los sucesivos flagelos, potenciando, de esa manera, la corriente y por ende el efecto de reotaxis. De este modo los espermatozoides abandonan por sí mismos el plasma seminal para acceder al medio de cultivo de inseminación, dejando atrás en el plasma seminal todo tipo de elementos no espermatozoides no traslativos (células, detritus, espermatozoides inmóviles y también espermatozoides sin capacidad de reotaxis) ya que no presentan esta capacidad de los espermatozoides de penetrar este tipo de orificios.
El dispositivo de la presente invención comprende al menos una placa cribada con uno o más canales de formas seleccionadas entre cónica, hiperbólica, paraboloide de revolución, entre muchas otras que permitan un ensanchamiento en al menos uno de los extremos del canal tal como se puede apreciar en la figura 5. La cantidad calidad y tipo de canales varía de acuerdo al material usado para fabricar la placa. También puede variar el tamaño de los reservónos para la muestra de semen según la cantidad de muestra a procesar, entre otros. Los métodos constructivos son conocidos en el estado del arte y pueden realizarse con láser, entre otros mecanismos de perforación. En un aspecto preferido de la presente invención, la placa cribada comprende una densidad de canales de entre 1.000 y 20.000 por cm2.
En otro aspecto de la presente invención, las perforaciones o canales de la placa cribada de la presente invención comprenden una longitud de entre 100 y 600 μηι.
Tal como se mencionó anteriormente, los canales de la presente invención comprenden tres secciones con diámetros distintos, un primer diámetro externo vinculado dicho primer reservorio (donde se coloca el semen), un diámetro interno, y un segundo diámetro externo que vincula la placa cribada con dicho segundo reservorio (donde se recogen las células móviles en un medio de cultivo provisto para tal fin). Así, dicho primer diámetro externo comprende entre 50 y 200 μηι, dicho diámetro interno comprende entre 8 y 15 μηι, y dicho segundo diámetro externo comprende entre 10 y 50 μηι.
En otro aspecto de la presente invención, las perforaciones de la placa cribada comprenden diferentes formas geométricas tales como cilindricas, cónicas, parabólica, hiperbólica, hiperbólica de revolución. De forma preferente, la forma geométrica de entrada y salida de las perforaciones es una curva de revolución que puede ser entre una recta (que genera un cono) o una curva tipo sección de parábola o hipérbola que resulta en una figura de revolución con un diámetro exterior mayor al interior (204).
Se ha encontrado, sorprendentemente que las formas descritas de dichas perforaciones que dan origen a los canales de dicha placa cribada, al ser ensanchados en el ingreso propician una conformación que aumenta notablemente la eficiencia del dispositivo de la invención para obtener una mayor concentración de células móviles viables.
Los reservónos del dispositivo de la presente invención comprenden una capacidad volumétrica que depende de varios factores: la cantidad de muestra a procesar, las dimensiones de la placa cribada, entre otros. De manera preferente, los reservónos utilizados para una placa cribada de 1x3 cm varían entre 0.5 y 4,0 mi. Es fundamental resaltar que el dispositivo de la presente invención genera una corriente en el fluido o medio de cultivo de tal manera que las células móviles, preferentemente los espermatozoides, utilicen su capacidad de nadar contracorriente para su separación; dicha corriente se genera mediante una diferencia de presión en los reservónos. Para generar la diferencia de presión, el segundo reservorio contiene mayor nivel, de esa manera se genera una corriente hacia el primer reservorio a través de la placa cribada. De manera preferida, en el dispositivo de la presente invención, en dicho primer reservorio se carga la muestra a separar, y dicho segundo reservorio se carga con un medio de cultivo o fluido para recuperar las células móviles separadas del resto de la población por su paso a través de dicha placa cribada Para generar la diferencia de presión y consecuentemente generar una corriente con sentido hacia el primer reservorio, primero debe cargar el segundo reservorio hasta un nivel o enrace superior al de dicho primer reservorio; luego se carga el primer reservorio con la muestra poblacional de células a separar.
El dispositivo de la presente invención separa los espermatozoides móviles en un tiempo de entre 1 y 90 minutos. Preferentemente, entre 10 y 90 minutos.
En otro aspecto de la presente invención, la misma puede realizarse en ausencia de estufa, ya que funciona aún cuando es calefaccionada por el calor emitido por el propio operador.
En otro aspecto de realización de la presente invención, el dispositivo es adaptado para la técnica de inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI). La inseminación con micro inyección de semen a un ovocito puede ser de utilidad realizar la separación de espermatozoides de alta performance en la misma placa de inyección. Se basa en una realización alternativa del dispositivo de la presente invención, pero con las dimensiones acordes al proceso de ICSI. Una alternativa preferida de realización de la presente invención con sólo un canal que está esquematizada en la figura 4, comprende dichos dos reservónos, también llamados microcubas (402 y 403) comunicados por un canal con entrada en forma de embudo que comunica ambos reservónos (404). Ambos reservónos se hallan cubiertos por un cubreobjeto (401) habilitando de este modo un canal de 10 μ. Este sistema permite la recuperación in situ de espermatozoides de alta calidad. En esta forma de realización alternativa la criba contiene sólo un canal.
En otra forma alternativa de realización de la presente invención, la misma comprende una forma cilindrica tal como lo muestra la figura 6, que comprende una tapa (601), un agujero cercano a la apertura de dicho tubo (602), un primer reservorio (604) y un segundo reservorio (603) donde se puede observar que el enrase del segundo reservorio, reservorio de salida y recolección de los espermatozoides seleccionados, es mayor que el enrase del primer reservorio donde va la muestra de semen con los espermatozoides a separar. En la figura 6 se muestra una ampliación de la sección donde se muestra la placa cribada (605) con los canales (606) por donde fluyen los espermatozoides. Ejemplos de aplicación
Ejemplo 1
Dispositivo con placa cribada de vidrio. Ensayos D, E y F En placa de vidrio. El dispositivo de separación de células móviles, de la presente invención (MXM) consta de dos reservónos separados por una placa cribada de vidrio de 130 ±40 μηι de espesor, con canales de forma cónica de la longitud del ancho del vidrio, es decir de 130 ±40 μηι, un primer diámetro (entrada) de 15 μηι y un segundo diámetro (salida) de 8 μηι. En primer lugar, se colocó el medio de recuperación Ham F10 1X con HEPES, suplementado con SSS y Penicilina/streptomicina en el reservorio de recuperación (segundo reservorio); luego se colocó muestra de semen D, E y F previamente procesadas según protocolo de la OMS2010 en el reservorio restante (primer reservorio).
En este ejemplo la placa es de 1 cm x 2cm, con una densidad de 6600 perforaciones/cm2. El primer reservorio, donde se coloca la muestra a procesar posee una capacidad volumétrica máxima de 3ml_, y el segundo reservorio comprende una capacidad máxima de 1 ml_.
Ejemplo 2
Dispositivo con placa cribada de PET. Ensayos A, B, C y D
La placa cribada hecha en PET se realizó con 2500 canales, cada una de 200μηι de largo. Los canales de forma cónica comprenden un primer diámetro (entrada) de 15 μηι y un segundo diámetro (salida) de 10 μηι. La dimensión de la placa de PET es de 1 cm x 2cm. Los reservónos son los mismos utilizados para la placa cribada de vidrio del ejemplo 1. En primer lugar, se colocó el medio de recuperación Ham F10 1X con HEPES, suplementado con SSS y Penicilina/streptomicina en el reservorio de recuperación (segundo reservorio); luego se colocó muestra de semen A, B, C y D previamente procesadas según protocolo de la OMS2010 en el reservorio restante (primer reservorio).
El procedimiento para ambos ejemplos, para la utilización del dispositivo de la presente invención es el siguiente:
Paso 1- Se coloca el medio Ham F10 1X con HEPES (0.6-0.7militros) hasta el enrace del segundo reservorio. Se carga el HamF10 1X con HEPES con una pipeta Pasteur de punta capilar (para poder entrar en la cubeta); al llenarse ésta, permite rellenar las cribas con el medio HTF que bañará todo su interior y la superficie inmediata del lado del semen.
Paso 2 - Inmediatamente después se procede a colocar la muestra de semen en el primer reservorio. Debe de asegurarse de tapar completamente la placa cribada con la muestra a procesar y aprovechar al máximo la superficie cribada
Paso 3 - Se procede a la incubación de una hora (que puede ser entre 1 minutos y 90 minutos) en contacto con el cuerpo, aunque puede ser realizado en estufa. Paso 4 - Se retira el dispositivo del estado de incubación (ya sea de estufa o en contacto con el cuerpo), se utilizó una estufa para el ejemplo 2, a 36 °C y el puño para el ejemplo 1. Se toma la muestra procesada del medio de recuperación (es decir, del segundo reservorio) con jeringa y aguja de tuberculina. Esta muestra procesada está lista para ser utilizada en inseminación artificial.
Para la evaluación del semen antes y después de su recuperación se siguieron los lineamientos de OMS 2010. Para evaluar el DNA se utilizó el test de TUNEL con el uso de un citómetro de flujo o microscopio de fluorescencia.
Resultados
Los resultados de las pruebas del instrumento muestran que con el método de la presente invención (MXM) para el material de vidrio duplican el % formas normales (morfología estricta) con respecto al semen sin tratamiento pasando de 13.3% en el método directo (promedio de muestras D, E, F) de formas normales a 27,0% (n:3) con el dispositivo de la presente invención. Comparando MXM de la presente invención (Vidrio), con el swim-up, la presente invención logra una mejora del 50 % (muestras D, E, F) en la morfología de los espermatozoides seleccionados. (Tabla 1)
Para el caso de a presente invención empleando material PET, se triplico el % de espermatozoides con formas normales respecto del directo, pasando de 10.3% a 36.0% (para las muestras A, B, C, D), valores promedios de los resultados obtenidos en cada ensayo. Mientras que en el caso de swim-up solo llega casi a duplicarse el valor de espermatozoides con formas normales, pasando de 1 1.3% de formas normales a 18.0% con el método de la presente invención. Cabe acotar que la técnica swim-up es la técnica básica normal para la recuperación de espermatozoides con vistas a una inseminación artificial, de alta o baja complejidad, con la desventaja de que dado el tiempo de exposición y manipulación junto con centrifugación que puede conducir a alteraciones del ADN.
Por otra parte, la morfología se evalúa según la OMS según el criterio de Kruger. Tomada una muestra cuyo estudio de Túnel (2) para evaluar la integridad de ADN arrojó un valor de 35 % (patológica dado que los valores de referencia deben ser menor a 20%) se procedió a realizar ese mismo estudio sobre un swim-up y sobre el MXM de PET y de vidrio, de la misma muestra (muestra D). Los valores obtenidos, como se observa en la tabla que sigue, indican una mejora significativa al utilizar MXM en PET se reduce en más de un tercio del valor original (se pasa de un valor de 35 a uno de 10), altamente significativa. Por otro lado, los valores del ensayo de Túnel para los métodos tanto de swim-up como en MXM en vidrio de la presente invención para la muestra D, muestran una mejora en dicho valor con una reducción casi nueve veces. Si bien se observa que el swim-up logra para la muestra D una disminución en el daño del DNA de los espermatozoides que es casi igual a la encontrada para MXM, este último método de la presente invención en vidrio logra una muestra de espermatozoides con una mejor morfología de tres veces para dicha muestra.
Tabla 1 : resultados de ensayos realizados en ejemplos 1 y 2
Presente invención
Presente invención en Swim Up DIRECTO
MUESTRA en VIDRIO
PET
MORFOLOGI MORFOLOGI
MORFOLOGIA TUNEL TUNEL TUNEL MORFOLOGÍA TUNEL A A
A 22 13 12
B 43 26 6
C 43 18 10
D 35 10 24 4 8 3 13 35
E 31 26 15
F 26 20 12 comparando Comparando
comparando D,E,F pasa A,B,C,D,E,F
A,B,C,D pasa de 13,3%de pasa de
de un formas 11 ,3% de
% de
promedio de normales formas
incremento
10,3% de promedio en normales
del % de
formas semen sin promedio de
morfología
normales en tratamiento a semen sin 0 normal con
semen sin 27,0%d e tratamiento a
respecto al
tratamiento a formas 18,5% .
semen sin
35.7%. implica normales. Incrementa
tratamiento
que se triplica Implica que menos del
el ¾ de se duplican doble las
normales las formas formas
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Comparando
de un
D,E,F pasa
promedio de
de 18,0% a
% de 16 ,3% de
27,0% esto
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del % de normales en el
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en la
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swim up
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120% Disminuyó
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semen fresco la muestra muestra la muestra
sin
(solo muestra sin sin
tratamiento tratamient tratamiental
D) al tercio o al décimo
décimo
Referencias
(1)Aitken RJ, Sawyer D. The human spermatozoon-not waving but drowning. Adv Exp Med Biol 2003;518:85- 98
(2)A Agarwai, SS Allamaneni - Minerva Ginecol, 2004 - clevelandclinic.org
(3) D Mortimer - Human Reproduction, 1991 - ESHRE
(4) K Miki, DE Clapham - Current Biology, 2013 - Elsevier

Claims

REIVINDICACIONES Habiendo así descrito y determinado la naturaleza de la presente invención y la forma como la misma ha de ser llevada a la práctica, lo que se declara reivindicar como invención y de propiedad exclusiva, es:
1. Un dispositivo de separación de células móviles a partir de una población celular que comprende un primer reservorio y un segundo reservorio vinculados por al menos una placa cribada, caracterizado porque dicha placa cribada comprende al menos un canal con al menos un extremo que presenta una reducción de su diámetro hacia el interior de dicho canal
2. El dispositivo de separación de células móviles de la reivindicación 1 caracterizado porque dicho canal comprende en al menos uno de sus extremos una forma seleccionada del conjunto comprendido por cónica, paraboloide e hiperboloide.
3. El dispositivo de separación de células móviles de la reivindicación 1 caracterizado porque dicha placa cribada comprende una pluralidad de canales.
4. El dispositivo de separación de células móviles de la reivindicación 1 caracterizado porque dicho canal comprende sus dos extremos con formas seleccionadas del conjunto comprendido por cónica, paraboloide e hiperboloide.
5. El dispositivo de separación de células móviles de la reivindicación 1 caracterizado porque dichas células comprenden espermatozoides.
6. El dispositivo de separación de células móviles de la reivindicación 1 caracterizado porque dicha placa cribada comprende una pluralidad de canales que permite la separación de espermatozoides móviles de un lado de dicha placa cribada y de elementos o células no traslativas que quedan del otro lado de dicha placa cribada.
7. El dispositivo de separación de células móviles de la reivindicación 1 caracterizado porque dichos canales comprenden un primer diámetro externo de entre 50 y 200 μηι, un diámetro interno de entre 6 y 15 μηι.
8. El dispositivo de separación de células móviles de la reivindicación 4 caracterizado porque dicho canal comprende un primer diámetro externo de entre 50 y 200 μηι y un segundo diámetro externo de entre 10 y 50 μηι, un diámetro interno de entre 8 y 15 μηι.
9. El dispositivo de separación de células móviles de la reivindicación 1 caracterizado porque dicha placa cribada comprende entre 1000 a 20.000 canales /cm2.
10. El dispositivo de separación de células móviles de la reivindicación 1 caracterizado porque el volumen de dicho primer reservorio es de entre 1 y 5 mL, y el volumen de dicho segundo reservorio de entre 0,5 y 1 ,5 mL.
1 1. El dispositivo de separación de células móviles de la reivindicación 1 , caracterizado porque el volumen de dicho primer reservorio es de entre 1 y 5mL, el volumen de dicho segundo reservorio de entre 0,5 y 1 ,5 mL y donde dicho segundo reservorio comprende un enrace superior a dicho primer reservorio.
12. El dispositivo de separación de células móviles de la reivindicación 10, caracterizado porque dicho segundo reservorio se carga con un medio de cultivo generándose una corriente de dicho medio de cultivo hacia dicho primer reservorio.
13. El dispositivo de separación de células móviles de la reivindicación 1 caracterizado porque dicha placa cribada está constituida de un material seleccionado del conjunto comprendido por: vidrio, PET, metal, cerámica, polímero, fibra de carbono y sus mezclas o combinaciones.
14. El dispositivo de separación de células móviles de cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque la disminución de semen con ADN dañado obtenido en dicho segundo reservorio, con respecto al semen fresco es de al menos tres veces.
15. El dispositivo de separación de células móviles de cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque incrementa la morfología normal de los espermatozoides en al menos 80% respecto al método directo.
16. Un método de separación de células móviles a partir de una población celular caracterizado porque comprende los siguientes pasos:
a. Colocar el medio de cultivo para que inunde la cámara 2 y los canales,
b. poner en contacto la población celular con una cara de una placa cribada que comprende al menos un canal con al menos un extremo que presenta una reducción de su diámetro hacia el interior de dicho canal, enrasando por debajo del nivel del medio de la cámara 2, lo que permite que siga pasando medio hacia la cámara 1 y así producirse el efecto de contracorriente inicial,
c. incubar;
d. recuperar las células móviles con mayor porcentaje de morfología normal de la otra cara de dicha placa cribada.
17. El método de separación de células móviles a partir de una población celular de la reivindicación 16 caracterizado porque el paso "b" comprende una corriente de un medio de cultivo en sentido contrario al sentido de paso de dichas células móviles, donde dicha corriente es generada por una diferencia de presión.
18. El método de separación de células móviles a partir de una población celular de la reivindicación 16 caracterizado porque dicha diferencia de presión se genera por diferencia de nivel entre los reservónos que se encuentran a ambos lados de dicha placa cribada.
19. El método de separación de células móviles a partir de una población celular de la reivindicación 16 caracterizado porque dicho paso "c" comprende incubar por un tiempo de entre 1 y 90 minutos a entre 35 y 37°C.
20. El método de separación de células móviles a partir de una población celular de la reivindicación 16 caracterizado porque dicho paso "c" comprende incubar por un tiempo de entre 10 y 90 minutos a entre 35 y 37°C
21. El método de separación de células móviles a partir de una población celular de la reivindicación 16 caracterizado porque comprende la utilización del dispositivo de separación de la reivindicación 1.
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