ES2710001T3 - Sistema de flujo de fase múltiple para detectar y aislar sustancias - Google Patents

Abstract

Un sistema de flujo múltiple para detectar sustancias en un fluido, comprendiendo el sistema: un primer tubo de fluido que contiene un primer fluido; un segundo tubo de fluido que contiene un segundo fluido, en donde el primer fluido es diferente del segundo fluido, en donde el primer y segundo fluidos son inmiscibles; un tubo de fluido común; un conector acoplado al primer tubo de fluido, el segundo tubo de fluido y el tubo de fluido común, en donde el fluido fluye desde el primer tubo de fluido y el segundo tubo de fluido hacia el tubo de fluido común a través del conector de manera tal que se alternen compartimentos discretos del primer fluido y el segundo flujo de fluido a través del tubo de fluido común; y un detector de sustancia acoplado al tubo de fluido común, en donde el detector de sustancia comprende una cámara de flujo que tiene una pared interna, en donde los compartimientos discretos alternos fluyen a través de la cámara de flujo y son analizados por el detector de sustancias, en donde el detector de sustancias comprende además: un láser; y un pulsador, en donde el láser es un láser fotoacústico, en donde el detector de sustancias está configurado para detectar sustancias en los compartimientos discretos del primer y segundo fluidos que fluyen a través de la cámara de flujo utilizando imágenes generadas con el láser fotoacústico, en donde el sistema de flujo múltiple está configurado para detectar células tumorales circulantes.

Description

DESCRIPCION

Sistema de flujo de fase multiple para detectar y aislar sustancias

Antecedentes de la invencion

El melanoma es la forma mas mortal de cancer de piel. Aunque el melanoma tiene una tasa de mortalidad relativamente baja en comparacion con otros tipos de cancer, ya que generalmente es facil de ver en la piel y se puede extirpar facilmente, rapidamente se vuelve mortal si el tumor superficial hace metastasis en otras partes del cuerpo. En metastasis, las celulas de melanoma circulantes (CMC, por sus siglas en ingles), las celulas que se han desprendido del sitio del tumor original y se mueven a traves de la sangre o el sistema linfatico, pueden plantarse en otros lugares y crear tumores secundarios que luego son la causa del melanoma terminal. En consecuencia, el diagnostico temprano probablemente sera la cura para el cancer, ya que los tratamientos tienen mayores posibilidades de exito porque el cancer aun no se ha manifestado completamente.

Ademas, se preve que en 2010 mas de 68000 estadounidenses seran diagnosticados con la enfermedad y mas de 8000 pacientes con melanoma moriran a causa de la enfermedad. Sin embargo, el melanoma se puede curar facilmente si se detecta temprano y se elimina rapidamente de la piel; sin embargo, si hace metastasis, el cancer puede llegar a ser letal. Teniendo en cuenta que un tumor de 1 mm de diametro generalmente consiste en un millon de celulas, los tumores mas grandes y visibles generalmente pueden consistir en miles de millones de celulas. Dicho esto, un paciente diagnosticado de un tumor grande tendra opciones reducidas y necesitara un tratamiento mas exigente fisicamente que un paciente diagnosticado antes de que puedan formarse tumores secundarios. Desafortunadamente, los pacientes actualmente deben esperar meses para saber si el tumor del melanoma superficial se ha diseminado, debido a que los metodos actuales para diagnosticar el cancer metastasico son a traves de tecnicas de generacion de imagenes, que requieren la presencia de un tumor metastasico visible. En consecuencia, los pacientes a menudo son diagnosticados demasiado tarde.

Los metodos actuales para diagnosticar el cancer metastasico incluyen biopsias de ganglios linfaticos y tecnicas de generacion de imagenes. Sin embargo, las biopsias de ganglios linfaticos pueden producir falsos negativos si el cancer no interactua con el sistema linfatico y no se puede realizar varias veces para la monitorizacion de la enfermedad. Dicho esto, las celulas tumorales circulantes pueden ser una excelente fuente de informacion para el diagnostico y la monitorizacion del melanoma metastasico y otras enfermedades patologicas si pueden detectarse en el sistema linfatico o el torrente sanguineo. Por esa razon, se estan investigando muchas tecnicas para detectar y aislar estas celulas con fines de diagnostico y monitorizacion de enfermedades. Ya se han realizado algunas investigaciones para encontrar CMC, incluyendo RT-PCR, inmunohistoquimica, clasificacion magnetica de celulas, tecnologias de escaneo con matrices de fibra optica y microfiltros; sin embargo, las altas tasas de falsos negativos, la marcacion y los procedimientos prolongados limitan las posibilidades de implementacion clinica.

Desafortunadamente, los metodos actuales utilizados para diagnosticar la enfermedad metastasica no son sensibles a las celulas metastasicas individuales. Los pacientes deben esperar hasta que se formen tumores secundarios antes de poder diagnosticarlos y comenzar un tratamiento que les salve la vida.

El documento W02008/008402 describe la deteccion de celulas tumorales circulantes (CTC) utilizando analisis fotoacustico junto con una celda de flujo.

Breve descripcion de los dibujos

La presente invencion se describe en detalle a continuacion con referencia a las Figuras de dibujos adjuntas, en donde:

La FIGURA 1 es una vista en perspectiva de un sistema de flujo de multiples fases para aislar sustancias de acuerdo con una realizacion de la invencion;

La FIGURA 2A es una vista ampliada de una conexion de un sistema de flujo de fase multiple con la parte superior del cuerpo retirada para exponer el canal y los fluidos de acuerdo con una realizacion de la invencion;

La FIGURA 2B es una vista ampliada de una conexion de un sistema de flujo de fase multiple que incluye la parte superior del cuerpo retirada para exponer el canal, los fluidos y la guia de onda optica de acuerdo con una realizacion de la invencion;

Las FIGURAS 3A y 3B son vistas ampliadas de un tubo que contiene dos fluidos, donde la cantidad de cada fluido alterno varia de acuerdo con las realizaciones de la invencion;

La FIGURA 4 es una vista en perspectiva ampliada de una camara de deteccion de un sistema de flujo de fase multiple de acuerdo con una realizacion de la invencion;

Las FIGURAS 5A-5F son vistas graficas de amplitudes fotoacusticas de varias muestras en concordancia con realizaciones de la invencion.

La FIGURA 6 es una vista grafica de una amplitud fotoacustica de una muestra de globulos blancos irradiados, con una gota aislada de la suspension celular que muestra un globulo blanco, de acuerdo con realizaciones de la invencion; y

La FIGURA 7 es una vista grafica de una amplitud fotoacustica de una muestra de celulas de melanoma irradiadas entre globulos blancos, con una gota aislada de la suspension de celulas que muestra la presencia de celulas de melanoma pigmentadas, de acuerdo con realizaciones de la invencion.

Descripcion detallada de la invencion

Las realizaciones de la presente invencion se dirigen a un metodo sin etiqueta para detectar el melanoma in vitro en combinacion con un metodo de aislamiento que es simple, tiene un margen de error bajo y es efectivo. Las celulas de melanoma metastasico se detectan y luego se aislan de una muestra de paciente, tal como una muestra de sangre centrifugada. El aislamiento de las celulas del melanoma ayudara no solo en el diagnostico temprano del paciente, sino que existe una correlacion positiva entre la cantidad de celulas tumorales circulantes presentes en la sangre y el pronostico del paciente. La deteccion de celulas de melanoma circulantes, celulas que se han desprendido del sitio del tumor original y se mueven a traves de la sangre o el sistema linfatico, pueden ser herramientas de diagnostico y monitoreo del cancer. La capacidad de aislar y contar celulas de melanoma podria usarse para monitorear las terapias de pacientes con cancer; los recuentos celulares altos indican un pronostico grave, mientras que los recuentos celulares bajos indican que el tratamiento esta funcionando bien.

La deteccion del melanoma metastasico en la sangre es imperativa porque elimina la perdida de tiempo para los pacientes con cancer. Usando realizaciones de la presente invencion, los pacientes pueden tener una muestra de sangre simple escaneada en busca de cancer con la frecuencia que se desee, en lugar de esperar meses para ver si un tumor es visible en una exploracion. Estos meses se podrian haber pasado brindando a los pacientes terapias para salvar vidas, en lugar de esperar a ver si el cancer se ha diseminado, o monitorizar si las terapias actuales estan funcionando.

Las realizaciones de la presente invencion hacen disminuir el error potencial involucrado con un sistema de flujo normal y permiten el aislamiento preliminar del melanoma metastasico de la muestra del paciente. En una realizacion, el detector incluye un laser, un transductor y un osciloscopio.

Habiendo descrito brevemente una vision general de las realizaciones de la presente invencion, se describen Figuras de ejemplo que representan realizaciones de la presente invencion con el fin de proporcionar un contexto general para diversos aspectos de la presente invencion. Con referencia a las Figuras 1-4 en particular, donde los numeros de referencia iguales identifican elementos similares en las distintas vistas, se ilustra un sistema 10 de flujo de fase multiple de ejemplo. El sistema 10 de flujo de fase multiple generalmente incluye una primera bomba 12, una segunda bomba 14, un primer tubo 24 de fluido, un segundo tubo 26 de fluido, un conector 28, un tubo 30 de fluido multiple y un detector 32 de sustancias. Aunque se describe con dos bombas, se apreciara que el sistema 10 de flujo de fase multiple puede incluir cualquier numero de bombas. La primera bomba 12 y la segunda bomba 14 se representan en la FIGURA 1 como bombas de jeringa. Sin embargo, se apreciara que cualquier tipo de dispositivo que se use para el movimiento de fluidos puede ser utilizado como una bomba. El caudal del sistema de flujo de fase multiple utilizado varia de 0 a 1000 pL/s. En realizaciones adicionales, el movimiento de fluidos a traves del sistema de flujo de multiples fases se basa en la presion que conduce el flujo del fluido respectivo a traves del sistema. Por ejemplo, el uno o mas fluidos pueden estar fluyendo a traves del sistema de flujo de multiples fases con base en la gravedad, dando como resultado una cabeza de elevacion para el fluido.

Con referencia a la Figura 2, los tubos 24, 26 y 30 son un objeto largo, hueco y tipicamente cilindrico, utilizado para el paso de fluidos. En una realizacion, los tubos 24, 26 y 30 son tubos de silicona.

Haciendo referencia brevemente a la Figura 4, la camara 33 de flujo dentro de la camara 38 de deteccion esta hecha de gel de acrilamida en forma redondeada un cable u otro tubo. Se permite que el gel de acrilamida se endurezca o se solidifique y el alambre se retira para crear un canal, como la camara 33 de flujo definida por una pared interna, para que el fluido fluya cuando esta dentro de la camara 38 de deteccion. Se apreciara que se puede usar una variedad de otros metodos y materiales para crear la camara 33 de flujo, para que fluya el fluido. En realizaciones, la camara 33 de flujo esta hecha de un material que tiene una impedancia acustica cercana a la impedancia acustica del agua. El sistema 10 de flujo de fase multiple tiene un diametro de flujo interno de la camara 33 de flujo de aproximadamente 0-10 mm de diametro. La acrilamida se utiliza como un camino acustico desde la celula excitada hasta el sensor acustico.

Con referencia a las Figuras 1 y 2, un primer fluido 20 y un segundo fluido 22 se alimentan desde sus respectivos tubos 24 y 26 al tubo 30 de fluido comun utilizando un conector 28. Un fluido es cualquier estado de materia la cual puede fluir con relativa facilidad y tiende a asumir la forma de su envase y puede incluir un liquido, gas o plasma. En esta realizacion, el primer fluido 20 es diferente del segundo fluido 22 y es inmiscible y/o crea burbujas con el segundo fluido 22. Por ejemplo, el primer fluido 20 puede ser aire, mientras que el segundo fluido 22 es agua u otro fluido que crea burbujas de gas del primer fluido 20 dentro del segundo fluido 22. En otro ejemplo, el primer fluido 20 es aceite, mientras que el segundo fluido 22 es agua o liquido hidrofilo. Mientras que las Figuras 1 y 2 se representan con un primer y segundo fluido, se apreciara que puede utilizarse cualquier numero de multiples fluidos diferentes en realizaciones de la presente invencion. Por ejemplo, un tercer fluido puede fluir hacia el tubo 30 de fluido comun a traves del conector 28.

El primer fluido 20 y el segundo fluido 22 se alimentan a un tubo 30 de fluido comun utilizando un conector 28. El tubo 30 de fluido comun es un canal comun para que los fluidos fluyan. El conector 28 representado en las Figuras 1 y 2 es un conector en Y. Se apreciara que el conector puede tener cualquier forma, incluido un conector en Y o un conector en T que permita que el primer fluido 20 y el segundo fluido 22 sean forzados juntos en una unica trayectoria de flujo sin mezclarse entre si. En una realizacion, el sistema de flujo de fase multiple puede usar tres fluidos, dos de los cuales se mezclan en el tubo 30 de fluido comun mientras se mantienen separados del tercer fluido. Por ejemplo, si los tres fluidos son agua, alginato y aire, el agua y el alginato se pueden mezclar para formar un compartimiento discreto de gel y este permanece separado del compartimiento discreto de aire. En otras formas de realizacion, en lugar de dos tubos que se juntan en un tubo comun, se puede crear un flujo de multiples fases en base a multiples tubos que se juntan en el tubo 30 de fluido comun.

El primer fluido 20 y el segundo fluido 22 esencialmente se turnan para ingresar al tubo 30 de fluido comun debido a la inmiscibilidad (por ejemplo, aceite y agua) y/o la creacion de burbujas de gas (por ejemplo, aire y agua) de los dos fluidos. En una realizacion, la inmiscibilidad se debe a la hidrofobicidad del primer fluido (tal como aceite) y la hidrofilicidad del segundo fluido (tal como fluido soluble en agua). Cuando el primer fluido 20 entra en el tubo 30 de fluido comun, el segundo fluido 22 acumula presion hasta que el primer fluido 20 deja de fluir y el segundo fluido 22 tiene su turno para fluir. Esto crea compartimentos discretos alternos del primer fluido 20 y segundo fluido 22 respectivamente. Al introducir dos fluidos a traves de un conector, como una union en T en una sola via de flujo, una sustancia se compartimenta. Esto es ideal porque el compartimento discreto exacto de un primer fluido o segundo fluido en donde se encuentra la sustancia que se va que se va que se va a detectar se puede identificar y extraer facilmente. Se apreciara que los compartimentos discretos del primer fluido 20 y el segundo fluido 22 como se muestra en las Figuras 3A y 3B pueden variar en tamano dependiendo del diametro del tubo 30 de fluido comun y la velocidad de flujo de los fluidos puede ser de 0-1 ml/s de tamano. Ademas, se pueden utilizar mas de dos fluidos y los fluidos biologicos de multiples pacientes tambien se pueden usar y separar en compartimientos discretos alternos.

En realizaciones, el primer fluido 20 es un fluido separador tal como aire, gas y/o aceite para crear compartimientos discretos del segundo fluido 22. El segundo fluido 22 puede incluir cualquier tipo de fluido que incluya una sustancia que se va a detectar. En una realizacion, el segundo fluido 22 puede ser cualquier tipo de fluido que contenga un material o sustancia biologica, como celulas cancerosas (cancer de mama, melanoma, cancer de prostata y similares), tejidos, celulas, patogenos, microorganismos (como la malaria), enfermedades infecciosas, pigmentos, sustancias no absorbentes opticamente con induccion de color (por ejemplo, tintes agregados a celulas cancerosas no coloreadas o nanoparticulas de oro agregadas a las celulas), compuestos, sustancias no biologicas y/o cuerpos extranos de una muestra biologica de un individuo, incluidos pero no limitandose a, sangre, saliva, orina, materia fecal, suero, plasma, tejido y fluido espinal. En otra realizacion, el segundo fluido 22 es un fluido no biologico que contiene sustancias biologicas o no biologicas tales como la deteccion de plomo (sustancia) en agua (segundo fluido). Como se describira con mas detalle a continuacion, en una realizacion, el segundo fluido 22 es una solucion de globulos blancos centrifugada de un individuo la cual puede o no contener celulas de melanoma. En una realizacion, se toman muestras de sangre completa de pacientes con melanoma y se centrifugan, dejando cualquier melanoma en una suspension de globulos blancos.

Los compartimientos discretos alternos del primer fluido 20 y el segundo fluido 22 fluyen a traves del tubo 30 comun hacia la camara 33 de flujo dentro de la camara 38 de deteccion del detector 32. Con referencia a las Figuras 1 y 4, el generador 34 es una fuente de laser fotoacustico. La camara 38 de deteccion incluye una pared 36 interna que define un interior abierto de la camara 38 de deteccion. La fuente 34 de laser incluye un laser 40 y un pulsador 42. Aunque la fuente 34 de laser esta representada como un detector fotoacustico, se apreciara que el generador 34 puede incluir cualquier variedad de dispositivos de excitacion y/o mecanismos para convertir energia en algo que pueda procesarse aun mas para obtener informacion que incluya radiacion, laser, agentes quimicos, semiconductores electricos, fluorescencia, ondas de radio, magneticas, tomografia, termografia y deteccion por ultrasonido.

En una realizacion, un detector fotoacustico puede detectar o determinar si un fluido contiene o no sustancias que tienen pigmento como el melanoma metastasico que contiene inherentemente melanina, un granulo pigmentado pequeno. Cuando un componente individual discreto de fluido pasa a traves de la camara 33 de flujo, es irradiado por la fuente 34 de laser fotoacustico con un rapido pulso de luz. Se apreciara que la luz laser puede dirigirse transversalmente al flujo o a lo largo del eje del flujo usando una guia de onda optica como se describe con respecto a la FIGURA 2B. Cuando el melanoma se irradia con un pulso rapido de luz laser intensa, la melanina experimenta una expansion termoelastica. Por lo tanto, si el componente discreto que pasa a traves de la camara 33 contiene melanoma, la melanina en el melanoma sufre una expansion termoelastica y, en ultima instancia, crea una onda fotoacustica. Las celulas de melanoma irradiadas producen ondas fotoacusticas que se detectan con un transductor piezoelectrico, mientras que los globulos blancos no generan senales porque son opticamente transparentes. Se apreciara que se puede usar un detector para determinar si un fluido que pasa a traves del detector en un sistema de flujo de fase multiple contiene o no una sustancia particular.

En esta realizacion, como se muestra y se explica con mas detalle a continuacion con respecto a las Figuras 5A a 5F, el volumen de irradiacion para cada compartimento discreto que se ha irradiado con luz laser intensa puede comunicarse desde un sensor acustico (u otro tipo de sensor) dentro de la camara 33 de flujo a traves de la conexion 50 al dispositivo 52 de visualizacion de ordenador u otro dispositivo de salida. El volumen de irradiacion para el compartimiento discreto se muestra en el dispositivo 52 de visualizacion y se muestra y describe con mas detalle a continuacion con respecto a las FIGURAS 5A-5F. Las visualizaciones graficas del volumen de irradiacion incluyen un espectrometro antes del punto de irradiacion para garantizar que el medio esperado este produciendo senales. El uso de los volumenes de irradiacion puede permitir el aislamiento de una sola celula de melanoma, ya que cuando se detecta una celula de melanoma, se puede ver visualmente en que compartimiento discreto de fluido residen las celulas de melanoma.

Se pueden extraer compartimentos discretos especificos detectados para contener la sustancia que se esta analizando, como las celulas de melanoma. Con referencia a la Figura 1, se puede usar un contenedor 48 de recoleccion para recolectar el compartimiento discreto de la salida 46 del tubo. Se apreciara que a la vez que la recoleccion del compartimiento discreto de fluido identificado porque contiene la sustancia que se esta probando, se representa de la manera en que se realiza manualmente en contenedor 48 de recoleccion en la Figura 1, se puede usar cualquier variedad de mecanismos de recoleccion, automatica o manual, para recolectar el compartimiento discreto. Ademas, se pueden usar recipientes separados alternativos (que no se muestran) para recolectar otros compartimentos discretos que no han resultado positivos para la sustancia que se esta analizando. Los volumenes de fluido que contienen sustancias, como las celulas de melanoma, pueden ser secuestrados por burbujas, lo que permite el aislamiento de pequenos volumenes de liquido. Considerando que, utilizando un flujo continuo sin burbujas es dificil determinar que volumen de liquido se debe recolectar, los compartimientos discretos recolectados de fluidos se pueden enviar para una variedad de pruebas o se pueden diluir mas.

El compartimento discreto extraido se puede diluir y volver a pasar a traves del sistema 10 y repetir hasta que cada volumen de extraccion separado del segundo fluido 22 contenga una unica celula de melanoma y no globulos blancos. Como tal, el analisis de las muestras puede realizarse de forma iterativa hasta que se detecte y/o aisle una concentracion deseada de una sustancia deseada. En una realizacion, cada iteracion de la separacion repetida reduce la concentracion de particulas no deseadas (como los globulos blancos) por un factor particular de dilucion. Por ejemplo, un compartimento discreto que demuestra un efecto fotoacustico (lo que indica que el compartimento discreto contiene una celula de melanoma) se puede diluir y volver a pasar a traves del sistema 10 de forma iterativa hasta que la celula de melanoma deseada se aisle de otras particulas no deseadas. La celula de melanoma aislada (u otra particula deseada) puede analizarse para realizar pruebas particulares, como pruebas de expresion genica, PCR y similares.

En realizaciones, la pigmentacion se detecta debido a la expansion termoelastica fotoacustica cuando un absorbente es impactado con un rapido pulso de luz; las particulas incoloras permanecen acusticamente transparentes, lo que permite que numerosas celulas crucen el haz de deteccion a la vez. Por consiguiente, se proporciona una tecnica de flujometria multifasica con deteccion fotoacustica para detectar y capturar CMCs in vitro. La captura de las celulas de melanoma detectadas no solo verifica que el melanoma realmente se esta detectando; tambien proporcionara a los biologos del cancer los CMCs en etapa temprana para su estudio.

Con referencia a la Figura 2B, una guia 54 de onda optica es producida por el fluido que tiene un indice optico de refraccion mas alto que el material circundante. El liquido que contiene las celulas podria tener un indice de refraccion de 1.39 mediante la adicion de azucar o polietilenglicol y la camara de flujo de acrilamida circundante puede tener un indice de refraccion de 1.35. Este desajuste permite una reflexion interna total, lo que hace que una guia de onda optica sea muy parecida a una fibra optica. Esto permite que los componentes alternos sean una guia de onda optica, de modo que la luz laser este llenando todo el tubo y cada compartimiento discreto se llene con luz laser. La luz laser puede irradiar toda la muestra debido a la reflexion interna total. La reflexion interna total ocurre cuando la luz incide en un material que tiene un indice de refraccion mas bajo que el material por el que se esta moviendo la corriente. Esto permite que la luz laser permanezca dentro del medio de eleccion siempre que se cumpla con el indice de parametros de refraccion. Por lo tanto, el canal de flujo es una guia de onda optica para garantizar que todos los compartimentos discretos se irradian sin desperdiciar energia laser. Esto se hace en una realizacion mediante la adicion de azucar, polietileno u otra sustancia para incrementar el indice de refraccion al segundo fluido para incrementarlo mas alto que el indice de refraccion de la acrilamida.

El sistema 10 de flujo de fase multiple permite que una muestra de interes se procese a traves de un detector para identificar si ciertos analitos y/o sustancias estan presentes en la muestra. Millones de celulas pueden fluir mas alla del detector a la vez debido a la transparencia fotoacustica de los globulos blancos. Esto permite escanear grandes volumenes muy rapidamente para detectar celulas de melanoma circulantes.

Ejemplo 1: Diseno de flujo de fase multiple

El sistema de flujo de fase multiple utilizado en el Ejemplo 1 comprende tubos cilindricos de silicona. Sin embargo, se apreciara que podrian usarse otras formas tales como cuadrada o rectangular. El sistema de flujo de fase multiple tiene un diametro de flujo interno del canal de aproximadamente 1.6 mm de diametro. El sistema de flujo de fase multiple utilizado oscilo entre 200 y 300 pL/min. Sin embargo, los globulos que se formaron eran solo de 2 a 3 microlitros y el numero de Capillary y Reynolds se mantuvo en condiciones de microfluidos. Ademas, se utilizaron altas ratas de flujo para poder examinar rapidamente un gran volumen de sangre.

El sistema utilizo un transductor de "clip" de fluoruro de polivinilideno (PVDF). El sensor puede ser cualquier material piezoelectrico u otro sensor de sonido no piezoelectrico. Se apreciara que se puede usar cualquier material siempre que conduzca corriente electrica. Se cortaron dos laminas de bronce con un orificio en el medio y se soldaron a un conector de cable coaxial BNC. Se separaron con cinta las hojas de bronce y se coloco PVDF entre el bronce que cubria los orificios. El transductor se coloco en una carcasa de polidimetilsiloxano (PDMS) que mantuvo el transductor y la camara de flujo estacionarios. El transductor se ajusto en la ranura y se coloco un anillo de PDMS sobre el transductor, exponiendo el PVDF pero cubriendo el bronce. El PDMS se uso para prevenir las reflexiones acusticas del bronce que podrian interferir con la deteccion del melanoma.

A continuacion, la camara de flujo se coloco en la parte superior del anillo de PDMS, de manera que la camara se alineo directamente con el elemento de PVDF. Un laser Nd:YAG (Continuo) con conmutacion Q de frecuencia fue disparado al lado de la camara de flujo en angulo recto desde el transductor. El laser se pulso a 532 nm, 20 Hz y entre 5 y 8 mJ para una duracion de pulso de 5 ns.

La camara de flujo estaba conectada a dos bombas de jeringa; una jeringa contenia las muestras de celulas y la otra contenia aire. El aire se bombea a 0.2 mL/min y las muestras celulares se bombean a 0.1 mL/min. La bomba de jeringa que albergaba las celdas se ajusto verticalmente para garantizar que las celdas no se asentaran en el fondo, por lo que el aire necesitaba un caudal mas alto para compensar el aumento de presion.

Ejemplo 2: Preparacion de la muestra

El flujo de dos fases se creo utilizando una union en T, que combina las dos fases separadas en una sola ruta de flujo, manteniendo las fases distinguibles. Las fases elegidas para usar en el Ejemplo 2 fueron tanto agua como aceite, y aire y agua. El aire y el agua producian un globulo de agua que podia extraerse facilmente sin contaminar la muestra con la fase vecina. Sin embargo, cuando se usa aire y agua, los liquidos acumulan presion y purgan el sistema. Se utilizo Tween 20 en el sistema de flujo de dos fases aire/agua para reducir la tension interfase entre las fases. Se uso un Tween 20 al 2% en regulador PBS como fase acuosa. Se apreciara que otros tensioactivos, tales como el Tween 80 al 2%, tambien se pueden usar para reducir la tension entre las fases.

Ejemplo 3: Preparacion de la muestra

Se utilizaron muestras biologicas para mostrar que el sistema de multiples fases es aplicable a un entorno clinico. Las celulas de melanoma se cultivaron en la Universidad de Missouri y todas las muestras de globulos blancos se obtuvieron de sangre completa donada por miembros del laboratorio. Las tecnicas de cultivo celular y enriquecimiento se describen a continuacion. Celulas de melanoma fueron suspendidas en PBS.

Se cultivo una linea celular de melanoma HS 936 para uso en experimentos fotoacusticos. Las celulas se fijaron en etanol y se resuspendieron en PBS. Aproximadamente 15 minutos antes de los experimentos, las celulas se diluyeron con una solucion salina regulada con fosfato (PBS) Tween 20 (Fisher Scientific) al 2% hasta la concentracion celular deseada. Las celulas fueron contadas manualmente utilizando un hemocitometro.

Globulos blancos suspendidos en PBS y melanoma.

Los globulos blancos suspendidos en PBS se prepararon al obtener sangre completa libre de cancer donada por los miembros del laboratorio. La sangre se vertio en un tubo de centrifuga que contenia Histopaque 1077, un material cuyo valor de densidad se encuentra entre el de los globulos blancos y los globulos rojos, y luego se centrifugo. La capa de globulos blancos y los contenidos adyacentes a ella se eliminaron y luego se agregaron a un tubo de centrifugadora de diametro mas pequeno. Este tubo se centrifugo de nuevo y la capa de globulos blancos se elimino y se diluyo con PBS.

Las muestras de globulos blancos enriquecidas con melanoma suspendido en PBS se prepararon al obtener sangre completa donada por los miembros del laboratorio. La sangre se vertio de nuevo en un tubo de centrifuga que contenia Histopaque 1077. Se agregaron celulas de melanoma cultivadas de la linea HS 936 en el mismo tubo de centrifuga. El proceso de centrifugacion y el procedimiento de separacion siguieron siendo los mismos que la preparacion de globulos blancos de arriba. Las celulas de melanoma y los globulos blancos se asientan en la misma capa despues de la centrifugacion debido a sus densidades similares. Esta capa se aislo y se diluyo con PBS.

Ejemplo 4: Diseno de la camara de flujo

El sistema de flujo de fases multiples fotoacustico utilizo un transductor piezoelectrico PVDF mientras que el laser impacto a 90° desde el elemento del transductor. La alternativa es introducir la luz laser a lo largo del eje de flujo utilizando la naturaleza de guia de onda optica del sistema. Una sola celda se considera una fuente de punto optico y, por lo tanto, emitira ondas fotoacusticas de forma radial en todas las direcciones por igual. La camara de flujo se mantuvo unida con un anillo acrilico que tenia tres orificios perforados a 90° entre si. S introdujo tuberia Masterflex a traves de los orificios y un cable con el mismo diametro exterior que el diametro interior del tubo se suspendio a traves de los dos orificios opuestos, mientras que un segundo cable se introdujo a traves del tercer orificio para evitar que la acrilamida ingresara en el orificio del tubo.

Una vez que se preparo el anillo acrilico, se estiro Parafilm a traves de la parte inferior del anillo y se vertio acrilamida transparente en el anillo, formando gel alrededor del tubo y el alambre. La acrilamida se elaboro a partir de 10 mL de solucion de acrilamida al 20% (Sigma Aldrich), 0.04 g de persulfato de amonio (Sigma Aldrich) y 20 pL de TEMED (Fisher Scientific). Despues de agregar el TEMED, la mezcla se vertio inmediatamente para evitar la gelificacion prematura.

Despues de la gelificacion, se retiraron los cables, y el tubo utilizado para sujetar la fibra optica se extrajo aproximadamente 4 mm. La camara de flujo estaba entonces lista para ser utilizada en el sistema.

Ejemplo 5: Estudio ciego

Con el fin de demostrar que cualquier medico puede operar con exito este sistema, se realizo un estudio ciego para determinar si las muestras que no contienen melanoma pueden distinguirse facilmente de las muestras que si lo contienen.

Se obtuvieron veinte valores Booleanos aleatorios utilizando un programa corto hecho en MATLAB: "0" representaba PBS 2% p/v solucion de Tween 20, y "1" representaba 10 celulas de melanoma/pL suspendidas en PBS 2% p/v Tween 20.

Dos cientificos inicialmente prepararon las muestras sin revelar cuales muestras contenian melanoma y cuales no. Luego, dos cientificos diferentes analizaron las muestras a traves del sistema de flujo y se les pidio que determinaran cuales muestras tenian celulas de melanoma y cuales no se, basandose en las ondas fotoacusticas que se observaron en el osciloscopio.

Los cientificos identificaron correctamente las 20 muestras, como se ve en la Tabla 1. Las senales fotoacusticas de una linea de base y una muestra de celulas detectadas se muestran en las Figuras 6 y 7. Ademas de las amplitudes mas grandes, las celulas de melanoma producen senales transitorias, mientras que los picos de linea de base permanecen constantes en todo el flujo.

Tabla 1. Los 20 valores Booleanos aleatorios utilizados para el estudio ciego.

Ejemplo 6: Deteccion fotoacustica y captura de melanoma entre los globulos blancos:

El sistema de flujo se preparo utilizando tres entradas separadas: una bomba de jeringa contenia aire, una bomba de jeringa contenia WBC en PBS Tween 20 y una jeringa contenia celulas de melanoma cultivadas en PBS. El WBC PBS y se utilizaron los globulos formados por aire en todo el sistema para mostrar que no se produjeron senales fotoacusticas a partir de burbujas de aire o de WBC. La bomba de jeringa que contenia globulos blancos se detuvo y la jeringa que contenia melanoma se uso para introducir manualmente una burbuja de melanoma en el sistema de flujo con la esperanza de crear ondas fotoacusticas y luego aislarlas del sistema.

Resultados

Flujo en dos fases: Agua y aceite.

Se observo que el flujo de dos fases con aceite y aire producia burbujas uniformes y consistentes sin ningun retraso del sistema de flujo.

Agua y aire.

Se observo que el flujo de dos fases con agua y aire producia un flujo inconsistente y la acumulacion de presion ocasionalmente purga el sistema de flujo.

Despues de agregar 2% de Tween 20 al agua, se produjeron burbujas consistentes y uniformes sin sufrir ningun retraso.

Ejemplo 7: Senales de melanoma fotoacustico por concentracion:

El sistema produjo una senal fotoacustica de las burbujas de melanoma y se mantuvo en la linea de base para el WBC y las burbujas de aire como se ve en las Figuras 5A-5F. La burbuja de melanoma detectada se aislo luego, ya que goteaba fuera del sistema y se generaron imagenes de la burbuja junto con una burbuja de control de WBC.

Las Figuras 5A-5E son representaciones graficas de senales fotoacusticas de diferentes concentraciones de celulas de melanoma de compartimiento discreto detectadas utilizando el sistema de flujo de multiples fases descrito anteriormente. Las Figuras 5A-5E se representan graficamente como amplitud fotoacustica (mV) vs. tiempo (ps). La Figura 5A es una representacion grafica de senales fotoacusticas de una muestra libre de celulas de melanoma. La Figura 5B es una representacion grafica de una senal fotoacustica de una muestra que contiene 10 celulas/pL de melanoma. La Figura 5C es una representacion grafica de una senal fotoacustica de una muestra que contiene 25 celulas/pL de melanoma. La Figura 5D es una representacion grafica de una senal fotoacustica de una muestra que contiene 100 celulas/pL de melanoma. La Figura 5E es una representacion grafica de una senal fotoacustica de una muestra que contiene 800 celulas/pL de melanoma.

La FIGURA 5F es una representacion grafica de una imagen de la respuesta de voltaje frente a la concentracion celular. La amplitud de las senales fotoacusticas siguio la linealidad con la concentracion hasta concentraciones de 10 celulas/pL como se muestra en la FIGURA 5F.

Si bien la formacion exitosa de burbujas se logro con el uso de aceite/agua y aire/ agua tensioactivo, debido a la facilidad con la cual se pueden extraer las celulas de melanoma del sistema de flujo, el agua y el aire con la adicion de un tensioactivo seran los fluidos de eleccion para estudios posteriores. La adicion de Tween 20 fue efectiva debido a su capacidad para hacer disminuir la tension interfases entre las dos fases permitiendo que el agua se deslice mas alla del aire cuando se acumula presion.

El estudio de concentracion mostro una correlacion lineal entre la amplitud de voltaje y la concentracion hasta que se investigaron concentraciones muy bajas. Esto se esperaba porque las celulas no se diseminan de manera homogenea, lo que se hace evidente a bajas concentraciones. Ademas, como era de esperar, el control PBS Tween 20 no produjo ninguna senal fotoacustica.

El estudio ciego confirmo que este metodo se puede utilizar en un entorno clinico para detectar el melanoma. La captura de celulas de melanoma demostro ademas que el sistema puede aislar eficazmente las celulas de melanoma detectadas del sistema. Ademas, este es un paso significativo hacia una tecnica de monitorizacion de enfermedades eficiente y permitira a los cientificos estudiar estas celulas metastasicas con la esperanza de descubrir los mecanismos por los cuales hacen metastasis, sobreviven en la sangre y los sistemas linfaticos y se asientan en otros tejidos, de manera que se puedan desarrollar mejores terapias para pacientes con cancer y otros tipos de enfermedades.

Ejemplo 8: Captura y aislamiento de melanoma

El sistema no produjo senales para la linea de base de PBS y produjo senales fotoacusticas de cada concentracion diferente de globulos de melanoma. Las Figuras 6 y 7 muestran la respuesta fotoacustica de 1 celula de melanoma/ pL en comparacion con la linea de base de PBS. Los globulos que produjeron senales fotoacusticas se aislaron y luego se tineron con la tincion de Fontana Masson, pero los mejores resultados fueron de las muestras de 100 celulas/pL, probablemente debido al fuerte procedimiento de tincion que requiere que los portaobjetos se laven varias veces, el nucleo se tino de rojo y la melanina tenida de negro. Como se muestra en la FIGURA 6, una vista grafica 600 de una amplitud fotoacustica de una muestra de globulos blancos irradiados no produce ningun efecto fotoacustico, con una gota aislada de la suspension celular que muestra un globulo blanco 610. En la FIGURA 7, una vista grafica 700 de una amplitud fotoacustica de una muestra de celulas de melanoma irradiadas entre los globulos blancos produce ondas fotoacusticas. Una gota aislada de la suspension celular que muestra ondas fotoacusticas indica la presencia de celulas de melanoma pigmentadas 710.

De lo anterior, se vera que esta invencion esta bien adaptada para alcanzar todos los fines y objetos expuestos anteriormente junto con otras ventajas que son obvias y que son inherentes a la estructura.

Se entendera que ciertas caracteristicas y subcombinaciones son de utilidad y pueden emplearse sin hacer referencia a otras caracteristicas y subcombinaciones. Esto esta contemplado por y esta dentro del alcance de las reivindicaciones.

Dado que se pueden hacer muchas realizaciones posibles de la invencion sin apartarse del alcance de la misma, debe entenderse que toda la materia expuesta en este documento o mostrada en los dibujos adjuntos debe interpretarse como ilustrativa y no en un sentido limitativo.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Un sistema de flujo multiple para detectar sustancias en un fluido, comprendiendo el sistema: un primer tubo de fluido que contiene un primer fluido; un segundo tubo de fluido que contiene un segundo fluido, en donde el primer fluido es diferente del segundo fluido, en donde el primer y segundo fluidos son inmiscibles; un tubo de fluido comun; un conector acoplado al primer tubo de fluido, el segundo tubo de fluido y el tubo de fluido comun, en donde el fluido fluye desde el primer tubo de fluido y el segundo tubo de fluido hacia el tubo de fluido comun a traves del conector de manera tal que se alternen compartimentos discretos del primer fluido y el segundo flujo de fluido a traves del tubo de fluido comun; y un detector de sustancia acoplado al tubo de fluido comun, en donde el detector de sustancia comprende una camara de flujo que tiene una pared interna, en donde los compartimientos discretos alternos fluyen a traves de la camara de flujo y son analizados por el detector de sustancias,

en donde el detector de sustancias comprende ademas: un laser; y un pulsador,

en donde el laser es un laser fotoacustico, en donde el detector de sustancias esta configurado para detectar sustancias en los compartimientos discretos del primer y segundo fluidos que fluyen a traves de la camara de flujo utilizando imagenes generadas con el laser fotoacustico, en donde el sistema de flujo multiple esta configurado para detectar celulas tumorales circulantes.

2. El sistema de la reivindicacion 1, en donde la camara de flujo esta hecha de un material que tiene una impedancia acustica cercana a una impedancia acustica del agua.

3. El sistema de la reivindicacion 1, que comprende ademas un tercer tubo de fluido que contiene un tercer fluido, en donde el tercer tubo de fluido esta acoplado al conector, en donde el fluido que fluye desde el segundo y tercer tubo de fluido se combina para formar una mezcla de fluidos, en donde compartimientos discretos alternos de la mezcla de fluidos fluyen a traves del tubo comun separados de compartimientos discretos alternos del primer fluido que fluye a traves del tubo de fluido comun.

4. El sistema de la reivindicacion 1, que comprende adicionalmente al menos un dispositivo para el movimiento de fluido.

5. El sistema de la reivindicacion 4, en donde la camara de flujo esta hecha de un material que tiene una impedancia acustica cercana a una impedancia acustica del agua, en donde el material tiene un indice de refraccion, en donde el segundo fluido tiene un indice de refraccion, en donde el indice de refraccion del segundo fluido se incrementa hasta un indice de refraccion que es mas alto que el indice de refraccion del material.

6. El sistema de la reivindicacion 4, que comprende ademas: un tercer tubo de fluido que contiene un tercer fluido, en donde el tercer tubo de fluido esta acoplado al conector, en donde el tercer fluido se mezcla con el segundo fluido para formar una mezcla de fluidos, en donde la mezcla de fluidos no se mezcla con el primer fluido, en donde compartimentos discretos alternos de la mezcla de fluidos y compartimentos discretos alternos del primer fluido fluye a lo largo de una unica trayectoria de flujo en el tubo de fluido comun, en donde se alternan los compartimentos discretos de la mezcla de fluidos y los primeros fluidos son analizados por el detector de sustancias.

7. Un metodo para detectar sustancias en un fluido, comprendiendo el metodo:

recibir un primer fluido de un primer tubo de fluido a traves de un conector; recibir un segundo fluido desde un segundo tubo de fluido a traves del conector, en donde el primer y segundo fluidos son inmiscibles, en donde recibir el primer y segundo fluidos a traves del conector comprende recibir compartimientos discretos alternos del primer fluido y el segundo fluido; y detectar al menos una sustancia en uno o mas de los compartimientos discretos alternos recibidos utilizando un detector de sustancias, en el donde el detector de sustancias comprende una camara de flujo que tiene una pared interna, en donde los compartimientos discretos alternos del primer fluido y el segundo fluido fluyen a traves de la camara de flujo,

en el cual el detector de sustancias comprende ademas: un dispositivo de excitacion para analizar los compartimentos discretos alternos recibidos, en el cual el dispositivo de excitacion es una fuente de laser fotoacustico; y un pulsador,

en el cual el metodo es para detectar celulas tumorales circulantes.

8. El metodo de la reivindicacion 7, en donde recibir compartimentos discretos alternos del primer fluido y el segundo fluido comprende recibir los compartimentos discretos alternos del primer fluido y el segundo fluido a traves de un tubo de fluido comun acoplado al conector.

9. El metodo de la reivindicacion 7, en donde la camara de flujo esta hecha de un material que tiene una impedancia acustica cercana a una impedancia acustica del agua.

10. El metodo de la reivindicacion 9, que comprende ademas aumentar un indice de refraccion del segundo fluido a un indice de refraccion que es mas alto que un indice de refraccion del material.