ES2708573T3 - Dispositivo y método de detección fotoacústica - Google Patents

Abstract

Un método de detección de un analito en una muestra de un fluido corporal que comprende las etapas de: - hacer circular dicha muestra a través de una cámara (52) de ensayo, incluyendo dicha cámara (52) de ensayo un sensor acústico (260) configurado para detectar una señal fotoacústica después de que se produzca una expansión termoelástica en dicha cámara (52) de ensayo; - exponer la muestra de fluido corporal a energía electromagnética, que comprende un haz láser (64) de impulsos, para provocar una expansión termoelástica en el analito, que comprende dirigir un haz de dicha energía electromagnética al interior de dicha cámara de ensayo y que comprende captar todo el flujo de dicha muestra de fluido corporal con dicho haz; - detectar una señal fotoacústica en la muestra resultante de dicha expansión termoelástica.

Description

DESCRIPCION

Dispositivo y metodo de deteccion fotoacustica

Campo tecnico

El campo de la invencion son las pruebas medicas. Un aspecto de la invencion se refiere a dispositivos y a un metodo de deteccion de analitos en una muestra de fluido corporal, siendo un ejemplo las celulas tumorales en circulacion en una muestra sangumea.

Tecnica antecedente

La deteccion de analitos en muestras de fluidos corporales es usada de forma generalizada para fines medicos y de otra naturaleza. Las aplicaciones incluyen la deteccion de patogenos, protemas u otros compuestos qmmicos en sangre, orina, bilis, saliva u otros fluidos corporales. Algunas aplicaciones ejemplares incluyen la deteccion de drogas, la deteccion de enfermedades, la deteccion de una protema particular y similares. A tftulo de ejemplo particular, la deteccion de celulas tumorales en circulacion (CTC) en la sangre humana y los sistemas linfaticos tiene el potencial de ayudar en la toma de decisiones clmicas en el tratamiento del cancer. La presencia de CTC puede significar la aparicion de metastasis, indicar una recafda o puede ser usada para monitorizar el avance de una enfermedad.

Las tecnicas y los dispositivos actuales para la deteccion de las CTC tienen lfmites. La reaccion en cadena de la polimerasa con transcripcion inversa (RT-PCR) es una tecnica que se usa en la practica. Esta tecnica implica el analisis del ARN. La tecnica lleva un tiempo significativo e implica varias etapas que requieren la pericia de tecnicos para realizar ensayos. Con el requerimiento de tal pericia aparece el potencial de error tecnico. La congelacion, el cultivo, el ensayo, etc., en la tecnica de RT-PCR llevan tanto tiempo como pericia. Ademas, los resultados no estan inmediatamente disponibles para un medico encargado.

La citometna de flujo con laser tambien tiene el potencial de analizar muestras en busca de CTC. Sin embargo, la deteccion de las CTC es un area de investigacion en evolucion y las tecnicas optimas de deteccion siguen siendo un trabajo en curso. Sin embargo, cuando sea perfeccionada, y si lo es, la tecnica seguira siendo una que comparta parte de los inconvenientes de la RT-PCR; por ejemplo, la implicacion de tecnicos expertos y demoras en la obtencion y la interpretacion de los resultados.

Unos instrumentos potentes de diagnostico permiten una evaluacion rapida y precisa. Cntica para el tratamiento es la etapa inicial de deteccion de la aparicion de metastasis o recafda, y la monitorizacion del avance de la enfermedad y la respuesta de la enfermedad a un curso o tratamiento que se este aplicando. Tener informacion precisa sobre una metastasis puede proporcionar a un medico encargado la oportunidad de ser mas efectivo y de abordar la fase particular de la enfermedad indicada por la metastasis. Detectar precisa y rapidamente la presencia de las CTC tiene el potencial de avanzar el estado del diagnostico y el tratamiento del cancer.

MacKenzie et al., “A laser photoacoustic sensor for analyte detection in aqueous systems”, Sensors and Actuators B, 11 (1993) 213-220 describen la absorcion de impulsos de laser por un lfquido, por lo que la energfa absorbida es convertida en calor y se produce una expansion termica localizada que provoca una onda de presion a frecuencias ultrasonicas que puede ser detectada con un transductor adecuado.

Gulshan Ara et al., “ Irradiation of pigmented melanoma cells with high intensity pulsed radiation generates acoustic waves and kills cells”, Lasers in surgery and medicine 10 (1990) n° 1, Nueva York, describen que una radiacion visible de impulsos cortos genera ondas acusticas por expansion termica.

Laufer et al., “Pulsed near-infrared photoacoustic spectroscopy of blood”, Proceedings of SPIE, vol. 5320, 2004, pp.

57-68 describen la determinacion de la saturacion de oxfgeno de una suspension salina de hematfes in vitro dirigiendo impulsos de laser a una cubeta que contiene la suspension de hematfes y detectando la senal acustica resultante.

El documento EP 0369 176 A2 describe el marcado de un complejo antfgeno-anticuerpo con un material colorante y la determinacion de las propiedades fotoacusticas de la marca por espectroscopia fotoacustica.

El documento EP 0256474 A2 describe el uso de la espectrometna fotoacustica para determinar la concentracion de una sustancia particulada en una muestra. En el metodo, se dirigen un haz de excitacion a una celda que contiene una muestra lfquida que comprende una sustancia particulada que absorbe la luz de excitacion y genera una senal fotoacustica cuya magnitud es medida y usada para determinar la concentracion de la sustancia particulada en la muestra.

Divulgacion de la invencion

Un metodo ejemplar para la deteccion de un analito en una muestra de fluido corporal comprende las etapas de exponer la muestra de fluido corporal a energfa electromagnetica para provocar una expansion termoelastica en el analito, y detectar una senal fotoacustica en la muestra que es resultado de la expansion termoelastica, segun se define en la reivindicacion 1. Un sistema ejemplar para la deteccion de uno o mas analitos en un fluido corporal comprende una camara de ensayo que tiene al menos una pared lateral configurada para contener una muestra de ensayo de un fluido corporal, una fuente de energfa electromagnetica configurada para dirigir una fuente de e n e ^a al interior de dicha camara de ensayo a traves de dicha al menos una pared lateral e inducir una expansion termoelectrica en los uno o mas analitos, y un sensor configurado para detectar la expansion termoelastica en la muestra de ensayo, segun se define en la reivindicacion 12.

Un aparato ejemplar adicional es un dispositivo fotoacustico de deteccion de metastasis que comprende un recipiente para contener una muestra de fluido que ha de ser sometida a ensayo para comprobar la presencia o ausencia de celulas tumorales en circulacion, un laser para someter la muestra de fluido a una luz que inducina una reaccion fotoacustica en celulas tumorales en circulacion o en un marcador unido a las mismas, y un sensor acustico para detectar una reaccion fotoacustica inducida en la muestra de fluido contenida en dicho recipiente.

Breve descripcion de los dibujos

La FIG. 1 es un diagrama de flujo que ilustra un metodo ejemplar de la invencion;

la FIG. 2 es un diagrama de flujo que ilustra un segundo metodo ejemplar de la invencion;

la FIG. 3 es una ilustracion esquematica de un sistema ejemplar de la invencion y tambien es util para ilustra un metodo ejemplar de la invencion;

la FIG. 4 ilustra la celda de ensayo del sistema de la FIG. 3, ilustrando la FIG. 4(B) la celda cuando es vista a lo largo de la lmea 4B-4B de la FIG. 4(A) en la direccion mostrada;

la FIG. 5 ilustra la celda de ensayo del sistema de la FIG. 3;

la FIG. 6 ilustra esquematicamente la deteccion de un evento termoelastico usando el sensor del sistema de la FIG.

3;

la FIG. 7 ilustra datos resultantes de la practica de un sistema y un metodo ejemplares de la invencion, presentando la FIG. 7(A) datos para una muestra de ensayo que incluye melanoma vivo y presentando la FIG. 7(B) datos para una muestra de ensayo que incluye caldo de cultivo RPMI y nada de melanoma;

la FIG. 8 es una ilustracion esquematica de una celda ejemplar alternativa de flujo; y

la FIG. 9 es una ilustracion esquematica de la celda de flujo de la FIG. 8 vista a lo largo de la lmea 9-9 de la FIG. 8 en la direccion mostrada.

Mejor modo para la realizacion de la invencion

Antes de exponer realizaciones ejemplares de la invencion, se apreciara que la presente invencion incluye metodos, asf como sistemas. Por ejemplo, un metodo de la invencion puede incluir etapas de uso de un sistema de la invencion, y un sistema de la invencion, cuando se utilice, puede ser util para realizar etapas de un metodo de la invencion. En consecuencia, se apreciara que, al describir un metodo de la invencion, tambien puede proporcionarse la descripcion de un sistema. Ademas, cuando se describe un sistema de la invencion, puede hacerse una descripcion de un metodo de la invencion. Por ejemplo, se apreciara que, cuando se describen detalles de un sistema de la invencion, se proporciona simultaneamente una descripcion de uno o mas metodos de la invencion, y viceversa.

La presente invencion va dirigida a metodos y sistemas de deteccion de un analito en una muestra de fluido corporal. Segun es usado en la presente memoria, se pretende que el termino “analito” sea interpretado de manera amplia en el sentido de ser una sustancia qmmica, biologica o de otra naturaleza, o un material de interes. A tttulo de ejemplo, un analito puede ser una protema, un patogeno, tal como una o mas celulas tumorales cancerosas, un compuesto qrnmico o similares. Ademas, segun se la usa en la presente memoria, se pretende que la expresion “fluido corporal” sea interpretada de manera amplia con el significado de una muestra lfquida que contiene algun fluido que se origino en un cuerpo. Ejemplos incluyen muestras de fluidos corporales que contienen sangre, plasma sangumeo, orina, bilis, saliva, semen, esperma, leche materna, lfquido cefalorraqrndeo, fluido intracelulary similares. Es importante destacar que, segun es usada en la presente memoria, la expresion “muestra de fluido corporal” no esta limitada al fluido obtenido del cuerpo unicamente, sino que tambien esta previsto que incluya muestras preparadas usando el fluido y un fluido diluyente o fluido vehicular. A tftulo de ejemplo, la expresion “muestra de fluido corporal” abarca una muestra preparada suspendiendo un fluido corporal tal como leucocitos en una solucion salina.

Para describir de manera optima diversas realizaciones ejemplares de la invencion, se proporciona inicialmente una descripcion de realizaciones generales (y, en consonancia con ello, un aparato general). La FIG. 1 es un diagrama de flujo que ilustra un metodo ejemplar de la invencion. Una muestra de fluido corporal es expuesta a una fuente de energfa electromagnetica para provocar una expansion termoelastica en el analito contenido en la muestra. Bloque 10. La muestra de fluido corporal puede ser cualquiera de las muestras particulares expresadas anteriormente, incluyendo, por ejemplo, orina, sangre o saliva. Ademas, puede ser, por ejemplo, una muestra de ensayo que incluya uno de estos materiales diluido, suspendido o en otra condicion presente junto con un fluido vehicular. Un fluido vehicular puede ser un disolvente o un fluido diluyente, incluyendo ejemplos soluciones acuosas, una solucion salina y similares.

La fuente de energfa electromagnetica es una luz laser. Se produce una expansion termoelastica cuando un material absorbe energfa, se calienta y se expande en consecuencia. El resultado es una senal fotoacustica.

El metodo de la FIG. 1 incluye, a continuacion, una etapa de uso de un sensor acusti

resultante de la expansion termoelastica. Bloque 12. La senal fotoacustica puede ser una onda u otra senal. La deteccion puede incluir, por ejemplo, el uso de un detector adecuado para detectar una onda acustica que se desplaza a traves de la muestra de ensayo. Un ejemplo incluye la deteccion de la desviacion de un diafragma en contacto de fluido con la solucion cuando la onda acustica hace contacto con el diafragma de un sensor. Otro es usar un detector optico para medir una senal tal como una perturbacion (que puede ser un cambio refractivo) en la muestra tras la expansion termoelastica.

A tftulo de ejemplo adicional, la FIG. 2 presenta un metodo ejemplar adicional de la invencion. Esta realizacion ejemplar esta dirigida a un metodo de deteccion de un patogeno, tal como una celula tumoral cancerosa, en una muestra sangumea. Sin embargo, la aplicacion particular del analito para esta realizacion ejemplar podna cambiarse facilmente.

En una etapa inicial, se obtiene de un paciente una muestra de sangre. Bloque 20. La muestra puede ser, por ejemplo, de un volumen de solo una fraccion de un mililitro hasta un litro o mas. Puede ser obtenida a traves de un pinchado de la piel con una aguja, de forma intravenosa o similar. Los leucocitos son separados a continuacion de la muestra sangumea. Bloque 22. Esto se puede efectuar, por ejemplo, usando una centrifugadora u otro metodo conocido de separacion. La cantidad de leucocitos separados dependera, al menos en cierto grado, del tamano de la muestra sangumea inicial.

Los leucocitos asf separados son puestos a continuacion en un fluido vehicular. Esta etapa puede incluir, por ejemplo, la suspension en una solucion salina. Bloque 24. Se pretende que “suspension”, como se usa en la presente memoria, sea interpretado de manera amplia, con el significado de diluido con, transportado con, puesto en o similares. La suspension de leucocitos en un lfquido vehicular puede incluir, por ejemplo, diluir las celulas en el lfquido, mezclar las celulas en el lfquido o similares. Los leucocitos pueden incluir una o mas celulas tumorales cancerosas, tales como melanina.

En una etapa opcional de este metodo ejemplar, se adhieren varias partmulas diana a las celulas cancerosas. Bloque 26. Las partmulas o esferas diana pueden tener un diametro inferior a 0,01 milfmetros. Las partmulas pueden ser, por ejemplo, esferas sinteticas de escala micrometrica seleccionadas por su capacidad de ser detectadas por la energfa electromagnetica a la que sera expuesta la muestra. A tftulo de ejemplo particular, pueden usarse nanopartmulas de oro, esferas de latex negro, tinciones, puntos cuanticos o cualquier otra molecula (tal como la biotina) que de a la celula algun color que sean buenos absorbentes de energfa electromagnetica, tal como una luz laser.

Las partmulas diana pueden estar tratadas para hacer que sean atrafdas hacia la celula cancerosa y se adhieran a ella. El tratamiento puede incluir proporcionar anticuerpos superficiales que se sabe que son atrafdos al analito de interes, carga electrica o similares. En una etapa ejemplar, las dianas se unen creando un enlace mediante un par anticuerpo-receptor. Esto proporciona la especificidad y la resistencia necesaria para la union. La partmula diana es funcionalizada para unirse al anticuerpo espedfico. Estas partmulas funcionalizadas son introducidas en la muestra que contiene las celulas con los receptores emparejados. Tras lavar las esferas sobrantes que no se unieron a un receptor de celula cancerosa, las celulas cancerosas tienen esferas unidas a sus receptores (habitualmente, aunque no necesariamente, receptores superficiales).

Esta etapa opcional puede ser util para “amplificar” el umbral de deteccion de las una o mas celulas cancerosas. Una etapa alternativa incluye tincionar el analito con una coloracion absorbente adecuada. Las partmulas diana sobrantes (que no se adhieren a las celulas cancerosas) pueden ser eliminadas de la muestra de ensayo mediante lavado u otros metodos conocidos. Bloque 28.

A continuacion, la muestra de ensayo es comunicada por delante de una luz laser de impulsos. Bloque 30. Esta etapa puede incluir, por ejemplo, colocar la muestra en un sistema de la invencion que incluye un deposito, un generador de flujo, tal como una bomba, y un conducto que conecta el deposito a una camara de ensayo, a la que se dirige la luz laser. Cuando la celula cancerosa de interes es, por ejemplo, un melanoma, la luz laser usada para interrogar a la muestra de fluido puede encontrarse en cualquier lugar del intervalo visible, y en otras longitudes onda que absorbe la melanina. Cuando la celula cancerosa es distinta de un melanoma, la deteccion se lograra mediante la absorcion por las esferas diana.

Ademas, los metodos y los sistemas de la invencion pueden incluir etapas y elementos para usar diferentes longitudes de onda de luz para detectar analitos particulares. Por ejemplo, si se sabe que un analito absorbe luz de la longitud de onda X y no Y, una muestra de ensayo puede ser interrogada con luz de una longitud de onda tanto X como Y. Si se produce una senal positiva cuando es interrogada con X, pero no con Y, se proporciona una indicacion de que esta presente el analito particular.

La luz laser de impulsos es absorbida por la melanina e induce una expansion termoelastica en ella, que da lugar a una onda acustica en la solucion. La onda acustica es medida usando un detector tal como un diafragma. Bloque 32. La magnitud de la desviacion del diafragma puede indicar, por ejemplo, no solo la presencia de una celula cancerosa, sino ademas una indicacion de su tamano, densidad, coloracion, concentracion y otras propiedades. Los datos procedentes del diafragma son grabados y mostrados usando un controlador. Bloque 34. Esta etapa puede incluir, por ejemplo, amplificar una senal electrica procedente del diafragma, grabarla en memoria y mostrarla en una pantalla.

Habiendo descrito ahora algunos metodos ejemplares generales de la invencion, puede proporcionarse una descripcion mas detallada de otros metodos, sistemas y detalles de realizaciones de la invencion. Para hacerlo, resultara util una presentacion de los principios de la fotoacustica en relacion con algunas realizaciones de la invencion.

La fotoacustica, tambien denominada ultrasonido inducido por laser, usa una luz pulsante de duracion corta para crear ondas acusticas ultrasonicas en un medio opticamente absorbente. Estas ondas acusticas son generadas en funcion de las propiedades termoelasticas de los analitos seleccionados como diana, que en muchas realizaciones de la invencion (pero no en todas) comprenderan cromoforos. Los cromoforos, por definicion, son atomos o moleculas dentro de un compuesto que son responsables del color del compuesto dado. Inherentemente, presentan color absorbiendo parcialmente longitudes de onda que componen el espectro visible de la luz incidente. Las longitudes de onda que no se absorben estan sujetas a dispersion y reflectancia, segun determine la composicion del cromoforo particular, emitiendo asf el color representativo de las longitudes de onda reflejadas. La fotoacustica se basa en la porcion absorbida de la luz incidente. Cuando la luz es absorbida por los cromoforos irradiados, la energfa optica se convierte en energfa termica cinetica atrapada dentro del cromoforo, y entonces tiene lugar la posterior expansion termica de los atomos. Se produce una expansion termoelastica cuando se logra una condicion de confinamiento de tensiones depositando energfa directa en un cromoforo de manera continua, de manera que la energfa sea incapaz de propagarse, salvo por medio de la eventual conveccion con los medios circundantes. Esta condicion se expresa como:

t_p < δ/ C_s

siendo tp la duracion del impulso del laser, siendo 8 la profundidad de absorcion de la energfa del laser, y siendo Cs la velocidad del sonido en el medio. Se da por sentado que la profundidad de absorcion, 8, es menor que el diametro del haz laser.

Puede lograrse una expansion termoelastica transitoria irradiando con impulsos cortos de luz laser concentrada, permitiendo la expansion y la contraccion elasticas de una molecula absorbente. Esta expansion termoelastica y la subsiguiente contraccion dan lugar a la produccion de ondas ultrasonicas longitudinales que se propagan en todas las direcciones alejandose del medio de interes excitado termicamente. Una generacion de calor mas intensa producira una onda acustica mas intensa mediante una mayor expansion termoelastica. Por lo tanto, un absorbente optico intenso desprende una onda acustica intensa. Conceptualmente, la fotoacustica puede describirse como energfa laser pulsante que es absorbida rapidamente por un medio dispersante, de modo que la expansion termoelastica transitoria de lugar a la formacion y la propagacion de energfa acustica. La expansion termoelastica, usada en la fotoacustica, puede ser descrita (suponiendo un absorbente puro en el que 8 = 1 / ) por

representando p(z) la presion a la profundidad z, siendo |Ja el coeficiente de absorcion optica del tejido, siendo r el coeficiente de Gruneisen, que denota la fraccion de energfa optica que es convertida en energfa acustica. Depende de la temperatura y es igual a 0,12 a temperatura ambiente para la mayona de los tejidos.

La energfa fotoacustica total resultante de la absorcion de un haz esta directamente relacionada con el contenido de los cromoforos. La cantidad de expansion termoelastica dada en la anterior ecuacion esta directamente relacionada con el coeficiente de absorcion ja del cromoforo. El coeficiente de absorcion se deriva del coeficiente de absortividad molar y de la concentracion de cromoforos, segun se describe con: ja= 2,3 ec, siendo c la concentracion de los cromoforos espedficos y siendo £ el coeficiente de absortividad molar del compuesto. Estas relaciones son utiles para caracterizar al cromoforo mas alla de su deteccion. Por ejemplo, la magnitud de la energfa fotoacustica detectada puede ser util para estimar el tamano, la densidad y la identidad de un cromoforo desconocido.

La presion acustica es proporcional a la energfa por unidad de volumen, dada en julios por cm3. Si se mantiene constante el tamano de un punto, la integral de la presion sobre la profundidad presenta la energfa total absorbida, dada por:

Ea es la energfa total absorbida por el cromoforo y Po(z) es la presion inicial en funcion de la profundidad z. La integral da una cantidad expresa en terminos de J/cm2, por lo que la energfa total detectada esta relacionada con esta cantidad por el area activa del detector. La cantidad de energfa (Ea) absorbida esta directamente relacionada con la cantidad de energfa lummica incidente sobre el medio (tambien dada como J/cm2) hasta cierto Kmite determinado por la capacidad de absorcion del cromoforo espedfico.

La deteccion de estas ondas fotoacusticas diminutas es, igualmente, tan importante como su produccion en muchas realizaciones de la invencion. Los metodos de deteccion fotoacustica pueden variar drasticamente de un diseno experimental a otro. Un elemento que se ha descubierto que es util en los metodos y los aparatos de la invencion es un copolfmero piezoelectrico en conexion electrica con dos electrodos, siendo uno el hilo de tierra y midiendo el otro el cambio de tension positiva de la pelfcula. Estas pelfculas pueden estar construidas de difluoruro de polivinilideno, o PVDF, y pueden o no incorporar un recubrimiento de aluminio que actue como elemento conductor. Sin embargo, se contemplan muchas otras configuraciones del detector, incluyendo (a tttulo de ejemplo y no de limitacion) otros diafragmas cuya desviacion pueda ser medida cuando los golpee una onda acustica, detectores opticos que detecten un cambio en el mdice de reflexion y/o de refraccion en un fluido cuando una onda acustica se desplaza en el mismo, y similares.

Al propagarse las ondas longitudinales acusticas hacia la pelfcula piezoelectrica de un sistema y un metodo ejemplares, se acumula presion segun la magnitud de cada onda de presion. Cuando estas ondas de presion entran en contacto con la pelfcula piezoelectrica, la superficie lateral de la pelfcula objeto de impacto por la onda de presion se desplaza, alternado la bicapa estabilizada entropicamente. La alteracion de la capa polimerica provoca que se forme una carga electrica entre las dos capas del copolfmero que puede ser detectada por dos electrodos conductores como un pico de tension. Usando informacion sobre la magnitud de la senal (por ejemplo, la amplitud del pico de tension) y/o la diferencia horaria entre el envfo de un impulso de laser y la recepcion de la onda de presion, la densidad y la concentracion de los cromoforos pueden ser cuantificadas, asf como su ubicacion relativa a la de la pelfcula de PVDF, segun se describe en detalle posteriormente. Algunos sistemas y metodos de la invencion incluyen elementos y etapas de toma de estas mediciones y de uso de los datos resultantes para medir la densidad y similares.

Segun se ha expuesto anteriormente, algunos ejemplos de la presente invencion incluyen aparatos y metodos para detectar la presencia de celulas cancerosas melanoticas en el aparato hematogenico humano. Algunos sistemas y metodos emplean la tecnologfa fotoacustica como un metodo in vitro de deteccion y cuantificacion de celulas tumorales en diseminacion con el fin de detectar canceres o como un metodo de determinacion de la eficacia de la quimioterapia. Tales dispositivos y metodos ofrecen una manera de mejorar los protocolos estandar de deteccion, a la vez que alivian muchos de los srntomas problematicos de los metodos alternativos de deteccion de la tecnica anterior.

Algunos sistemas y metodos de deteccion fotoacustica de la invencion proporcionan beneficios y ventajas, incluyendo la capacidad de identificar con precision las celulas cancerosas diseminadas en el torrente sangumeo, tanto en una etapa temprana como en una tardfa. Esto proporciona una alternativa relativamente indolora y de menor coste a los protocolos clmicos de metodos de deteccion de tipo quirurgico, y ofrece un mecanismo muy necesario para la deteccion temprana de la enfermedad. Se propone que este sistema de deteccion puede proporcionar un metodo para umbrales de deteccion precisos y sin precedentes identificando celulas individuales de melanoma en presencia de millones de celulas secundarias constituyentes de la sangre.

Un dispositivo ejemplar de deteccion proporciona un sistema de flujo a traves del cual pueden introducirse soluciones de interes con el fin de excitar tan solo una unica celula cancerosa melanotica por excitacion laser pulsante. Para hacerlo, se incorpora en el sistema una celdatransparente de flujo, o camara de excitacion, propicia para la excitacion por laser. Tambien se incluye un sistema acustico fiable de deteccion o un elemento de deteccion similar para captar ondas fotoacusticas. Se usa un elemento de senal para convertir las ondas acusticas producidas por la excitacion melanotica en senales de tension que puedan ser mostradas para su analisis.

En la FIG. 3 se muestra esquematicamente un sistema ejemplar 50 de deteccion de la invencion. Incluye, entre otros elementos, una camara de excitacion o celda 52 de flujo. La celda 52 de flujo es la camara en la que se producen la excitacion laser y la propagacion y la deteccion de la onda acustica. Varias celdas de flujo diferentes son adecuadas para su uso en metodos y sistemas de la invencion. Algunas incluyen paredes laterales transparentes que permiten que una fuente de energfa electromagnetica, siendo el laser un ejemplo, este situada de forma externa a la celda. Una celda ejemplar 52 que resulta ser util es una celda adaptable de flujo disponible comercialmente en Spectrocell, Oreland, Pensilvania). La celda 52 es mostrada esquematicamente en la FlG. 3, y es ilustrada con mayor detalle en la FIG. 4.

Las FIGURAS 4(A) y 4(B) muestran la celda 52 de flujo. Tiene una forma tridimensional de caja generalmente rectangular, que incluye paredes laterales estrechas opuestas primera y segunda 54 unidas a paredes laterales opuestas mas anchas 56. Las dimensiones mostradas son unicamente ilustrativas; seran utiles otras dimensiones. Segun muestra la FIG. 4B, en la celda ejemplar 52 las paredes laterales estrechas tienen una anchura de aproximadamente 2 mm (a lo ancho de la FIG. 4B) y las paredes laterales mas anchas tienen una anchura de aproximadamente 10 mm. La celda 52 tambien incluye un diafragma 58 de deteccion dispuesto en una de las paredes laterales mas anchas 56 y que cubre un paso cilmdrico de aproximadamente el mismo diametro en la pared lateral 56, por el que esta en contacto de fluido con la muestra de ensayo en el interior de la celda 52. En la celda ejemplar 52, el diafragma 58 es una pelfcula de PVDF con un diametro de 5 mm. La celda 52 tambien incluye un electrodo positivo 60 que se extiende fuera del interior de la celda y a traves de un paso pequeno en una de las paredes laterales estrechas 54 y en contacto de fluido con la muestra de ensayo en la misma.

La FIG. 4(B) es un esquema que muestra las dimensiones de la celda ejemplar 52 de flujo y la direccion de un haz laser incidente 64 cuando atraviesa la celda 52 desde una fuente externa. La celda ejemplar 52 de flujo tiene unas dimensiones de aproximadamente 2 * 10 * 45 mm (anchura de las paredes 54 * anchura de la pared 56 * altura) para un volumen flmdico total de aproximadamente 0,9 ml. Se contemplan y seran utiles otras dimensiones. Las dimensiones particulares seran seleccionadas en funcion de consideraciones de diseno, incluyendo tamano del haz de energfa, el rendimiento volumetrico deseado de la muestra de ensayo, el caudal y similares.

Las partes superior e inferior de la camara 52 de flujo estan ahusadas hacia tomas cilmdricas 66 con un diametro interno de aproximadamente 2,7 mm y un diametro externo de aproximadamente 4,95 mm. Estas tomas 66 sirven para conectar la celda al conducto 68 (FIG. 3) que comunica el fluido de la muestra de ensayo con el interior y el exterior de la celda 52.

El haz laser 64 de alta intensidad es dirigido a una de las paredes laterales estrechas 54 de la celda 2 de flujo, opuesta a la del diafragma 58 de deteccion, a una altura aproximadamente igual a la de la abertura 54 de deteccion. El haz laser 64 atraviesa la muestra lfquida de ensayo en el interior de la celda 52 y sale a traves de la pared lateral estrecha 54 opuesta.

Segun se ha expuesto anteriormente, el haz laser se configura para inducir una reaccion termoelastica en la muestra de ensayo que da lugar a una onda acustica. En algunos metodos y aparatos de la invencion, la onda acustica es detectada a traves del uso de un diafragma 58 que se desvfa cuando la onda acustica hace contacto con el. El diafragma ejemplar 58 se encuentra en contacto de fluido con la muestra de ensayo. La desviacion del diafragma 58 puede ser detectada a traves de varios metodos. En la celda ejemplar 52 de flujo, se emplea el diafragma 58 de pelfcula piezoelectrica en la pared lateral mas ancha 56 de la celda como diafragma sensor de la onda acustica.

Segun se ilustra optimamente en esquema de la FIG. 5, el diafragma 58 esta dispuesto alrededor de un par de electrodos que incluyen el electrodo interno 60 y un electrodo externo mostrado en general en 80 que seran descritos posteriormente. Esta configuracion da lugar a un campo electrico entre los electrodos 60 y 80 que ha de ser alterado y fluctuar cuando el diafragma 58 sea desviado entre los mismos. Segun se expondra con detalle posteriormente en la presente memoria, la fluctuacion del campo electrico puede ser medida y usada para senalar la presencia de una onda acustica y, por lo tanto, de un analito. La cantidad de desviacion del diafragma puede ser usada para estimar cualidades del analito detectado, incluyendo, por ejemplo, su coloracion, su densidad, su masa y/o su tamano.

El diafragma o pelfcula piezoelectrica 58 en el sistema ejemplar 50 es cortado a un diametro ligeramente mayor que un paso de 5 mm de diametro en una de las paredes laterales mas anchas 56 (10 mm) y esta fijado al exterior de la celda 52 de flujo por un sellador 100% de silicona disponible en DAP Inc., Baltimore, Maryland. La pelfcula piezoelectrica 54 es una pelfcula copolimerica de difluoruro de polivinilideno (PVDF) de 100 micrometros disponible en Ktech Corp., Albuquerque, Nuevo Mexico.

Aunque se contemplan muchas configuraciones adicionales, se usan electrodos de cobre tanto para la deteccion de la senal positiva como para la conexion a tierra. Para cada una se usaron mecanismos diferentes. El electrodo positivo ejemplar 60 es un hilo de cobre pelado de 0,6 mm de diametro de aproximadamente 17 mm de longitud insertado en la pared lateral estrecha 54 (2 mm de anchura) de la celda 52 de flujo, segun muestran las FIGURAS 4A-B y la FIG.

5. El electrodo 60 esta sellado con sellador 100% de silicona. Se extiende sobre gran parte de la anchura horizontal de 10 mm de la pared lateral mas ancha 56 y deja un extremo externo que esta conectado por un conductor, tal como el hilo 82, para su transferencia a un controlador, que puede incluir uno o mas de un ordenador, un amplificador 84 (FIG. 3), un osciloscopio 86 (FIG. 3), o similares.

El electrodo negativo 80, o de tierra, consiste en una placa circular delgada 90 de cobre de 4 mm de diametro de Small Parts, Inc., Miami Lakes, Florida, soldada a un hilo de corta longitud de 3,5 mm de diametro que, a su vez, esta soldado a un conector 31-221-VP BNC 92 de Jameco Electronics, Belmont, California, que se conecta a un cable coaxial RG 58 94 puesto a tierra de Pomona Electronics, Everett, Washington. La placa plana 90 de cobre esta a ras del lado externo de la pelfcula 54 de PVDF. Esto proporciona una tierra a un lado de la pelfcula piezoelectrica.

Con referencia una vez mas al esquema de la FIG. 3, se bombean soluciones experimentales de una muestra de ensayo a traves del conducto 68 de circulacion usando una bomba 102. En el sistema ejemplar 50, la bomba 102 es una bomba peristaltica, concretamente una Masterflex L/S Economy Drive.

Se hace notar que, aunque muchos sistemas y metodos de la invencion incluyen la circulacion de muestras de ensayo, otros no. La circulacion es beneficiosa en muchas aplicaciones, sin embargo, dado que permite que una muestra relativamente grande sea sometida a un haz de energfa relativamente pequeno y compacto mientras se hace que circule por delante del haz.

El conducto 68 de circulacion en el sistema ejemplar comprende un tubo de silicona endurecida con platino L/S 14 disponible en Cole-Parmer Instruments, Vernon Hills, Illinois. Aunque pueden usarse otras bombas, una bomba peristaltica ofrece ventajas, porque no hay ningun elemento mecanico de la bomba que interactue directamente con la muestra de fluido en el conducto 100. En el sistema ejemplar 50, se introducen aproximadamente 15 ml de soluciones de muestras de ensayo en un deposito abierto 104 de 13,75 cm3. La bomba peristaltica 102 proporciona una presion negativa, que hacer circular al fluido de la muestra de ensayo fuera del deposito 102, llevandolo a traves de la celda 52 de ensayo, y devolviendolo finalmente al deposito 104 a traves de una parte superior abierta. El tubo 68 de silicona es ajustado por tamano a las tomas 66 de salida y entrada (FIG. 4) de la celda 52 de flujo. En el sistema ejemplar 50, las soluciones de muestras de ensayo circulan a una velocidad promedio de aproximadamente 9 ml/minuto, permitiendo que los analitos de interes sean excitados 235 veces cuando cruzan verticalmente la trayectoria 64 del haz (FIG. 4) de un laser de impulsos de 5 ns con un tamano de punto de 1 mm (condiciones medias para una configuracion dada).

Los expertos en la tecnica apreciaran que, como fuente de energfa electromagnetica, se usan laseres, y en particular luz laser de impulsos. Hay una amplia variedad de laseres adecuados para ser usados en diferentes metodos y sistemas de la invencion. Para una aplicacion particular se pueden especificar, segun se desee, factores tales como longitud de onda de la luz, anchura del haz, intensidad y similares.

En el sistema ejemplar 50, se hace posible la excitacion fotoacustica por un sistema laser pulsante mtidamente enfocado mostrado en general en 110 en la FIG. 3. Aunque pueden usarse diversos laseres diferentes y otras fuentes de energfa electromagnetica, el sistema laser 110 en el sistema ejemplar 50 incluye un laser de itrio-aluminio-granate dopado con neodimio, o Nd:YAG, de triple frecuencia de conmutacion Q de Quantel Les Ulis, Cedex, Francia, alojado en un sistema laser regulable integrado vibrante de Opotek, Carlsbad, California. El Nd:YAG es un laser bombeado que emite luz laser de 1024 nm por impulsos mediante un conmutador optico denominado “conmutador Q” que actua como una puerta para liberar luz en la inversion maxima de los iones de neodimio. Una vez liberada, la luz laser es reflejada por dos espejos dentro del sistema laser regulable integrado vibrante a un segundo generador armonico en el que la longitud de onda es convertida en 532 nm, luego a un tercer generador armonico, en el que es convertida en 355 nm. La luz laser de 355 nm es bombeada a un oscilador parametrico optico u OPO.

El OPO contiene un cristal de borato de bario beta que es regulado por la rotacion electronicamente controlada del cristal con respecto al haz. El OPO convierte la longitud de onda de entrada de 355 nm en dos haces —el de senal y el complementario—, cada uno de los cuales tiene longitudes de onda mas largas que el haz de entrada una cavidad denominada oscilador resonante doble hace oscilar las longitudes de onda tanto de senal como la complementaria, mientras que el angulo de regulacion del cristal determina una coincidencia de fase que produce la longitud de onda deseada, que luego es liberada de la cavidad. El angulo de regulacion es controlado por un motor por pasos operado por un programa externo generado por un ordenador.

El OPO permite la produccion de longitudes de onda variables que oscilan entre 410 nm y 710 nm. La longitud de onda particular de la luz utilizada en los metodos y los sistemas de la invencion usando un laser dependera de las aplicaciones, incluyendo la longitud de onda que sera absorbida por el analito que se este buscando, y similares. A tttulo de ejemplo, puede ser util una luz laser de aproximadamente 450 nm.

Tras el OPO, al haz atraviesa un polarizador. En algunos sistemas de la invencion, la luz laser es acoplada entonces por una lente en un soporte de fibras de fibra optica (siendo un ejemplo una fibra estandar de sflice de 1,5 mm) para la transferencia lummica. Aunque esto puede ser util, en algunas aplicaciones la fibra puede estar sujeta a roturas y a perdida de energfa que dan lugar a resultados deficientes. Otros dispositivos y metodos ejemplares, incluyendo el sistema ejemplar 50, utilizan un sistema de suministro “abierto”, en el que la luz laser atraviesa la atmosfera desde el sistema laser 110 hasta la celda 52 de ensayo. En el sistema ejemplar 50, el uso de la luz abierta aumento la entrada de energfa en la celda 52 de ensayo, pasando de un intervalo de 7,0-8,0 mJ de salida cuando se usaba fibra, a 11-12 mJ.

En algunos sistemas y metodos ejemplares de la invencion, puede existir una solucion de compromiso entre la intensidad de la energfa radiante y una exposicion radiante suficiente. Es decir, un haz radiante es, idealmente, lo bastante grande para abarcar la totalidad del analito o todos los cromoforos que puedan atravesar la celda 52 de deteccion, pero no demasiado grande para que no proporcione suficiente energfa para una intensidad de senal competente. Esta solucion de compromiso debe ser equilibrada, ademas, con los costes de un sistema laser 110: aunque es concebible que pudiera obtenerse un sistema suficientemente grande para proporcionar un haz de diametro sumamente grande de muchnsima energfa, los costes para hacerlo pueden ser prohibitivos.

El haz laser 64 que sale de la toma de salida del sistema laser regulable integrado vibrante 110 adopta la forma de una elipse. En tales metodos y sistemas ejemplares, el haz debena estar enfocado en la celda 52 de flujo para que el perfil del haz adopte una forma circular que oscile entre aproximadamente 1 mm y 2 mm de diametro para que entre limpiamente en la pared de 2 mm de la celda 52 de flujo. Diferentes tamanos de haz seran utiles para celdas de diferente tamano, pero es generalmente ventajoso configurar el haz para que tenga un diametro que se extienda por toda la anchura de la celda 52. Esto permite que toda la seccion transversal de la muestra de ensayo en circulacion sea irradiada por el haz. Ademas, configurar la celda de ensayo en una geometna tal como la mostrada en la FIG. 4, en la que la celda con forma de caja rectangular tiene un lado delgado (por ejemplo, el lado de 2 mm) y un lado mas ancho (por ejemplo, el lado de 10 mm) puede ser ventajoso. En tales geometnas, el haz 64 puede atravesar las paredes laterales estrechas opuestas 54 e irradiar toda la seccion transversal de la muestra en circulacion dentro de la celda 52 de ensayo.

Con referencia de nuevo al esquema de la FIG. 3, en el sistema ejemplar 50 el haz 64 de salida estaba orientado espacialmente por una serie de lentes mostradas en general en 112. Estas incluyen una lente cilmdrica 114 (lente n° LJ1014L2-B, de Thorlabs, Newton, Nueva Jersey), ademas de dos lentes colimadoras plano-convexas, de 100 mm (elemento 116) y 50 mm (elemento 118) de distancia focal (lentes nos LA 1509 y LA 1131, tambien de Thorlabs, Newton, Nueva Jersey) antes de entrar en la celda 52 de flujo. El resultado fue que el haz 64 tiene un tamano de punto cilmdrico de 1 a 2 mm diametro que media entre 11,0-12,0 mJ cuando entra en la celda 52. El tamano del punto se determino irradiando papel de alineamiento laser ZP-IT, de Kentek Corp., Pittsfield, New Hampshire, con un unico impulso de 5 ns y midiendo el diametro de la quemadura.

Se presenta el esquema de la FIG. 6 para ilustrar mas completamente los mecanismos de excitacion y deteccion de algunos sistemas y metodos. En lo pertinente a algunos metodos y sistemas ejemplares de la invencion, el mecanismo fotoacustico comienza con la excitacion de un analito o cromoforo 150; en este caso ejemplar, melanoma o su espectro tisular relacionado. En el sistema ejemplar 50 y en los metodos ejemplares relacionados, se destella luz laser 54 con una frecuencia de aproximadamente 5 ns y se encuentra a una longitud de onda de aproximadamente 450 nm. La frecuencia de los impulsos puede ser seleccionada segun se desee, dependiendo de factores tales como geometna y escala de la celda, caudal de la muestra, analito que se este buscando y similares. En muchos sistemas y metodos ejemplares, se creen que son utiles las frecuencias mas rapidas que un milisegundo, mas rapidas que un microsegundo y, en muchas aplicaciones (tales como el sistema ejemplar 50), del orden de un nanosegundo (ns).

Esto bombardea al cromoforo 150 de interes en la muestra de ensayo cuando atraviesa el haz 64. El cromoforo 150 absorbe del haz 64 al menos una porcion de la luz incidente y la energfa fotonica es transformada en energfa termica. El aumento de energfa termica causa una elevacion de la temperatura dentro del cromoforo 150 y se produce una expansion termoelastica cinetica. La expansion termoelastica es transitoria, debido a la naturaleza pulsante de la luz laser incidente 64. Dado que los impulsos de excitacion son lo suficientemente cortos en duracion para que no escape del cromoforo 150 ningun calor termico, se producen pequenos agrandamientos elasticos de las celulas 150 dentro de la solucion, de manera que se propaguen ondas 152 de presion alejandose de la fuente en el intervalo de 1-50 MHz.

Las ondas longitudinales de presion, como las emanadas de una fuente fotoacustica, se propagan paralelas a la direccion e la onda. El efecto resultante es el de una onda de compresion o banda en movimiento de alta presion. Esta banda de alta presion se mueve libremente en la solucion (tal como el entorno de la muestra de ensayo dentro de la celda 52 de flujo) alejandose de la fuente en todas direcciones. la velocidad de la onda vana con la aplicacion y puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 5 mm por segundo. Una porcion de estas ondas 152 entra en contacto con el diafragma 58 y lo golpea como un mazo golpeana la superficie de un tambor.

La pelfcula 58 de PVDF es un copolfmero de alta ordenacion que puede ser comparado con una bicapa lipfdica en un sistema biologico. En el estado estacionario, o tierra, las condiciones son entropicamente favorables para una estructura copolimerica ordenada. Cuando una onda acustica 152 golpea una superficie de la pelfcula 58, esa capa copolimerica es alterada, aumentando la entropfa del sistema y, en consecuencia, formando un cambio en la superficie alterada. El exterior de la pelfcula 58 esta conectado a tierra por el electrodo 90 de placa de cobre (FIG. 5), confiriendo por ello una carga positiva a la superficie interior de la pelfcula 58 de PVDF.

En otras realizaciones ejemplares, la pelfcula de PVDF u otro sensor puede ser de menor tamano, lo que puede aumentar la intensidad de la senal al disminuir el area del detector y eliminar parte de la atenuacion de la senal. Pueden aplicarse productos qmmicos como el oxido de indio y estano a la superficie positiva del PVDF para aumentar la conductancia en la superficie de la pelfcula.

La tension positiva producida por el fenomeno fotoacustico es conducida por todo del interior de la celda 52 de ensayo por una solucion vehicular conductora, tal como la solucion salina al 1,8% que es usada en algunos metodos y sistemas ejemplares de la invencion. El electrodo 60 descrito anteriormente saca la carga de la celda 52 de flujo para su analisis ulterior.

En el sistema ejemplar 50, la senal electrica resultante es amplificada para facilitar la deteccion. La tension transducida de un efecto fotoacustico es llevada al amplificador 84 (FIG. 3), que, en el sistema ejemplar, es un amplificador SR445A de 350 MHz de Stanford Research Systems, Sunnyvale, California, en el que es amplificada por cuatro etapas, cada una de las cuales proporciona una ganancia de 5 para un intervalo de amplificacion de 5 a 125. En el sistema ejemplar 50, las senales de tension son mostradas por el osciloscopio 86, que, en el sistema ejemplar 50, es un osciloscopio TDS 2024 de 200 MHz de Tektronix, Beaverton, Oregon, activado por un fotodiodo disponible en Thorlabs, Newton, Nueva Jersey, tras cada disparo del laser.

Se hace notar que el amplificador 84 y el osciloscopio 86 son un ejemplo de componentes electronicos utiles para recibir y analizar senales procedentes de la celda 52 de ensayo. En otros sistemas ejemplares, estos componentes son sustituidos por un unico controlador, que puede ser, por ejemplo, un dispositivo a base de procesadores con componentes internos utiles para amplificar y procesar la senal de tension procedente de la celda 52. Tal controlador puede producir datos, incluyendo datos visuales y/o de audio que indiquen la presencia de una onda acustica y, por lo tanto, de un cromoforo de interes. El controlador tambien puede grabar datos en memoria, y grabar otros datos, tales como la hora, la identificacion de la muestra de ensayo y similares. El controlador puede ser, por ejemplo, un ordenador.

Segun se ha hecho notar anteriormente, las FIGURAS 3-6 son unicamente esquematicas, y han sido proporcionadas para ilustrar diversos elementos de una realizacion ejemplar de un sistema y un metodo de la invencion. Otros sistemas y metodos variaran con respecto a los ilustrados anteriormente. De hecho, el sistema, segun esta ilustrado, representa un aparato experimental que puede ser configurado, por ejemplo, en un laboratorio. Las realizaciones comerciales de sistemas y metodos de la invencion pueden ser configuradas usando conductos, celdas, depositos y similares alternativos.

A tftulo de ejemplo, algunas realizaciones comerciales pueden ser configuradas en un alojamiento, usando un controlador informatico que este unido al laser, a la bomba y que proporcione obtencion, grabacion, procesamiento y presentacion de datos. Algunas realizaciones de la invencion pueden valorar la portabilidad y ser configuradas como tales. Otras variaciones resultaran evidentes para los expertos en la tecnica.

A tftulo de ejemplo, se configuro un sistema adicional de la invencion usando una configuracion alternativa de la celda. La celda fue configurada como un dispositivo de doble camara construido a partir de portaobjetos de microscopio disponibles en Fisher Scientific, Pittsburgh, Pensilvania, cianoacrilato de Loctite, Avon, Ohio, sellador 100% de silicona de Dow Coming, Baltimore, Maryland, y plastico laminar de nailon de Small Parts Inc., Miami Lakes, Florida. Estos materiales fueron cuidadosamente cortados y construidos a mano y, en ocasiones, dieron lugar a resultados menos fiables que los obtenidos con el sistema ejemplar 50. Una camara sirvio como camara de flujo y condujo una senal positiva, similar a la celda 52 de flujo de las FIGURAS 3-4. La segunda camara era un deposito estancado lleno de solucion salina que se conecto a tierra mediante un electrodo insertado en la camara.

Separando las dos camaras habfa una division de vidrio con un paso de 5 mm de diametro cortado en la misma. La peftcula de PVDF se sello en la cara de la division en el lado conectado a tierra. En consecuencia, este mecanismo funciono de la misma manera que el diafragma en el sistema ejemplar 50 y fue usado para plasmar la idea de un dispositivo fotoacustico propuesto. Era esencialmente coherente con la celda 52 expuesta anteriormente, salvo que la segunda camara llena de solucion salina sustituyo al electrodo 80 conectado a tierra.

Se han utilizado, asimismo, otras variaciones de la celda 52. A tftulo de ejemplo, en una configuracion alternativa, el electrodo interno 60 fue eliminado. Esta configuracion utilizo un electrodo adicional positivo de placa de cobre alojado en el lado opuesto del electrodo 80 de tierra que sujetaba entre sf ambos lados de una peftcula de PVDF chapada en aluminio. Esta peftcula sustituyo al diafragma 58 mostrado anteriormente. El chapado de aluminio puede servir como conductores para las senales tanto positiva como de tierra, evitando el uso del electrodo 60 invasivo en la celda de flujo.

Sin embargo, se descubrio que el chapado en aluminio comprometio a cierta medida la integridad estructural de la peftcula 58 de PVDF y dio como resultado una intensidad deficiente de la senal. Se cree que la falta de intensidad de la senal puede haber sido consecuencia del cortocircuitamiento de la senal por el contacto del electrodo. Para abordar este problema, el sistema ejemplar 50 mostrado anteriormente utiliza la peftcula no chapada 58, un electrodo positivo interno 60, y una puesta directa a tierra mediante un electrodo chapado externo 80 colocado directamente en el area de deteccion de la peftcula 58 de PVDF. Aunque la configuracion mostrada anteriormente resulto beneficiosa con respecto a la configuracion de peftcula chapada, en algunas aplicaciones esta configuracion alterna de los electrodos puede ser util en algunas aplicaciones.

Tambien se contemplan otras variaciones y modificaciones del sistema y del metodo mostrados anteriores. Algunas modificaciones, por ejemplo, seran utiles para regular el umbral de deteccion de los sistemas y los metodos de la invencion. Este puede regularse, al menos hasta cierto punto, a traves del ajuste de la intensidad de la senal. Una mayor intensidad de la senal generalmente dara lugar a mayor sensibilidad. Sin embargo, los incrementos en la intensidad de la senal deben equilibrarse con el ruido resultante en la senal. Es deseable una relacion senal-ruido elevada. Los expertos en la tecnica apreciaran que la puesta a punto de un sistema para lograr esto sera posible y puede variar en detalles de aplicacion particulares. A continuacion, se exponen algunos elementos del sistema y de los metodos ejemplares que pueden variarse para afectar a la intensidad de la senal y a la proporcion de ruido.

Por ejemplo, se logro una mejora en la intensidad de la senal en el sistema ejemplar 50 debido a un aumento en el tamano de la abertura de deteccion en la pared lateral 56 que subyace al diafragma 58 de aproximadamente 2 mm a aproximadamente 5 mm de diametro. Generalmente, las aberturas de deteccion mayores aumentan la probabilidad de que se produzca la captacion de la onda acustica de entre el medio circundante. Se logro una mejora adicional en la intensidad de la senal usando un volumen total de la celda relativamente pequeno, y en particular en lo referente a la anchura de la pared lateral estrecha 54 de 2 mm. Esta anchura de la pared lateral estrecha 54 de 2 mm restringe a los cromoforos que atraviesan la celda de flujo y fuerza a todo el medio a atravesar el haz de excitacion, garantizando que no se pase por alto ningun cromoforo que atraviese la celda.

Aunque el valor de 2 mm es solo un ejemplo de un tamano util, muchos metodos y sistemas se beneficiaran usando una primera pared lateral 54 que sea mas estrecha que la segunda pared lateral 56, estando dirigida la fuente de energfa electromagnetica a traves de la primera pared lateral estrecha 54. Cuando el haz tiene una anchura que se extiende sustancialmente por toda la pared lateral estrecha 54, es irradiada toda la seccion transversal de la muestra de ensayo en circulacion. Dirigir al haz a traves de la pared lateral mas ancha 56, por otro lado, requerina un haz significativamente mas ancho (con una energfa resultante significativamente menor por unidad de area).

Son posibles otras configuraciones para lograr este resultado, incluyendo, por ejemplo, configuraciones de la celda de ensayo con una porcion estrecha de “garganta” a traves de la cual la muestra de ensayo fluye a alta velocidad. Sin embargo, la velocidad no debena ser tan grande que acorte el tiempo de estancia de los analitos en el haz de energfa. A continuacion, se expone en la presente memoria una configuracion ejemplar.

Tambien se hace notar que hay beneficios en ubicar el diafragma 58 de deteccion en la pared lateral mas ancha 56, a traves de la cual no pasa el haz 64. Esta pared lateral mas ancha 56 proporciona un area mayor para que puedan usarse diafragmas mayores 58. Ademas, en algunos experimentos se descubrio que el haz 64 podna causar un mayor ruido en la senal de deteccion por un efecto piroelectrico de fotones lummicos que interactuaban con los polfmeros de la pelfcula. Se logro un mejor rendimiento cuando el haz fue dirigido atravesando la pared lateral estrecha 54 y se evito la interaccion directa con el diafragma 58. Sin embargo, en algunos sistemas y metodos ejemplares, la excitacion frontal puede resultar util.

En otras realizaciones de metodos y sistemas de la invencion, se proporciono otra modificacion para mejorar adicionalmente el rendimiento. Pueden proporcionarse, por ejemplo, elementos para regular la ubicacion mutua del haz laser 64 y de la celda 52. Aunque son posibles muchos mecanismos posibles para lograr esto, resulta util una etapa x-z de traslacion conectada a uno o a ambos del laser 110 o la celda 52. Esto puede resultar util para garantizar que el haz encuentre con precision la celda 52 de ensayo. Tal mecanismo ha sido ilustrado esquematicamente como el dispositivo 170 de ajuste X-Y-Z. En la practica, este puede comprender una mesa controlable subyacente al laser 110 o a la celda 52 o similar.

Otras modificaciones potenciales del sistema 50 incluyen el uso de una fibra para comunicar luz laser segun se ha descrito anteriormente para maniobrar la fuente de luz a la ubicacion mas eficiente para la excitacion de la celda 52. Se efectuaron pruebas de ensayo usando luz emitida directamente desde una fibra y se descubrio que daban lugar a un tamano de punto de casi 4 mm. Se descubrio que el enfoque de la luz laser era importante y que estaba directamente relacionado con la intensidad de la senal. Tambien se descubrio que una pequena disminucion en el diametro del tamano del punto daba lugar a un aumento en la exposicion radiante segun la ley cuadratica inversa. Segun se expone posteriormente, se descubrio que, al menos en el sistema ejemplar 50, el uso de fibra disminma la intensidad de la senal.

La exposicion radiante se define como julios por cm2. En lo que respecta al diseno de algunos sistemas de la invencion, una disminucion de un milfmetro en el tamano del punto de 3 mm a 2 mm para una fuente lummica de 12 rnJ da lugar a un aumento del 125% en exposicion radiante. Por lo tanto, se inserto una lente planoconvexa de 35 mm (lente n° LAI027 de Thorlabs, Newton, Nueva Jersey) entre la fibra y la camara de deteccion para disminuir el tamano del punto incidente hasta aproximadamente 2 mm de diametro. Al final, todo el sistema fue recolocado para la excitacion sin una fibra intermedia, segun se ha descrito anteriormente con referencia al sistema laser 110 y a su lente 112. Esto aumento la energfa incidente de 7,0 u 8,0 mJ a 11,0 o 12,0 mJ. El tamano del punto fue llevado a menor de 0,026 cm3 (entre 1 y 2 mm de diametro), dando una exposicion radiante en el intervalo de 460-900 mJ/cm2 y aumentando las tensiones de la senal a su nivel mas alto.

La amplificacion de la senal al pasar del aparato de deteccion al osciloscopio tambien puede desempenar un papel importante en la identificacion de una senal, asf como en la respuesta de ruido. En el sistema ejemplar 50, se descubrio que una ganancia de 25 pareda producir la mejor diferenciacion de las senales. A menudo, una ganancia de 125 reduda la proporcion senal-ruido significativamente y produda resultados deficientes, aunque debena hacerse notar que, en algunos casos, fue preferible una ganancia de 125 para la deteccion de senales sumamente debiles. Por lo tanto, en el sistema ejemplar 50, se usa por defecto una ganancia de 25; sin embargo, la ganancia debena fijarse en funcion del experimento o aplicacion individual.

Las pruebas de deteccion se realizaron usando el sistema ejemplar 50 y los metodos expuestos anteriormente. Se usaron microesferas de latex como precursor de celulas de melanoma vivo. Tambien se usaron soluciones de ensayo para determinar un umbral de deteccion para el sistema y el metodo ejemplares para caracterizar la sensibilidad del sistema ejemplar. Se realizaron algunos ensayos experimentales usando un diseno de doble camara, mientras que el establecimiento inicial de umbrales se llevo a cabo un diseno de camara unica para la celda de flujo.

Se usaron microesferas negras de latex CML (n° 2-BK-7000, disponibles en Interfacial Dynamics Corp., Portland, Oregon) que median 6,6 pm de diametro como espectros tisulares para imitar la respuesta fotoacustica de las celulas de melanoma (las propiedades opticas de las celulas de melanoma y de los espectros tisulares son descritas posteriormente). Se opto por las microesferas de latex por su espectro de absorcion de banda ancha y su tamano relativo. Una celula estandar de melanoma puede oscilar entre 10 pm y mas de 50 pm, dependiendo de la heterogeneidad de la lmea celular y de la morfologfa de la celula. Aunque la celula de melanoma tiene a ser mucho mayor que las microesferas usadas en estas pruebas, las microesferas contienen un pigmento mas oscuro y, por lo tanto, imitan suficientemente el efecto fotoacustico de una celula de melanoma, segun se expone posteriormente. Sin embargo, se especula que el mayor tamano de las celulas de melanoma y el gran numero de granulos de melanina contenidos dentro de ellas les permitiran producir una senal fotoacustica mas intensa que las microesferas por celula individual. Por lo tanto, se cree que el autentico melanoma proporcionara una senal similar a la de las microesferas, si no mayor.

El analisis espectroscopico de las microesferas de latex se realizo usando un espectrometro de alta resolucion HR-2000 y una fuente de luz halogena HL-2000 (de Ocean Optics Inc., Dunedin, Florida). Se tomo un espectro de absorcion de 4,3 g/100ml (4,3%) de microesferas negras usando una cubeta de 150 pm construida de portaobjetos de vidrio de 1 mm de grosor (de Fisher Scientific, Pittsburgh, Pensilvania) y material delgado de 150 pm (de Artus Corp., Englewood, Nueva Jersey). La solucion de microesferas fue colocada en la cubeta construida e insertada entre la fuente de luz halogena y el detector del espectrometro. Los datos se analizaron usando OOIBase32 (de Ocean Optics Inc., Dunedin, Florida). La captura de datos se realizo en un tiempo de integracion de 14 ms sin promediar. Se uso un tramo de trayectoria corta para reducir los efectos de la dispersion en los datos de absorbancia. El espectro de absorcion resultante confirma que las microesferas poseen una absorcion estable en todo el espectro visible, lo que demuestra que las esferas son, ciertamente, un absorbente negro de banda ancha. Este espectro indica un ligero aumento en la absorbancia con una longitud de onda dentro del intervalo visible.

Las microesferas de latex fueron introducidas en un fluido vehicular conductor de la senal. En los ensayos experimentales realizados, se uso solucion salina. Tambien resultaran utiles otros fluidos vehiculares. Inicialmente, la solucion salina fue una solucion de cloruro sodico (NaCl) al 0,9% creada anadiendo 0,9 g de soluto solido de NaCl en 100 ml de disolvente de agua desionizada. En los ensayos experimentales realizados, se uso una solucion al 1,8%, aunque muchas otras concentraciones resultaran utiles. Se anadieron microesferas a 20 ml de solucion salina en concentraciones variables que oscilaban entre un maximo de 7,124 * 106 microesferas/ml a un mmimo de 7,0 * 102 microesferas/ml. La concentracion de microesferas de cada solucion se dedujo por:

representando Vs el volumen solido de las microesferas de fabrica, Vm el volumen de una sola microesfera de 6,6 pm, Vsu el volumen restante de la suspension de microesferas de fabrica, and V el volumen incorporado en la solucion salina. Se pusieron 15 ml de cada concentracion selecciona en el deposito para su circulacion a traves del sistema de deteccion.

Se crearon diversas concentraciones de esferas usando sistemas y metodos de la invencion. Las pruebas emplearon una solucion salina al 0,9%, una excitacion de 510 nm, una energfa de entrada de 7,5 mJ, y un tamano de punto de 2,36 mm * 2,45 mm, dando lugar a una exposicion radiante de 0,129 J/cm2. La senal fue promediada en 64 tomas de datos. Los resultados de estas pruebas confirman que los sistemas y los metodos de la invencion son no solo utiles para detectar las microesferas, sino que, ademas, son utiles para estimar la concentracion de las microesferas.

Se efectuaron dos conjuntos adicionales de experimentos para determinar la sensibilidad de un sistema y un metodo ejemplares. En el primero, se usaron concentraciones de muestras que oscilaban entre 7,12 * 106 y 7,0 * 102 microesferas/ml para obtener una comprension de la variacion de la senal con la concentracion. Determinar esto hace posible cuantificar concentraciones desconocidas de espectros tisulares mediante intensidades de senal conocidas. Esto representa un beneficio importante de algunos sistemas y metodos de la invencion: la intensidad de la senal puede ser usada para estimar cualidades tales como la densidad del analito, la concentracion del analito, el tamano del analito y otras propiedades.

Todas las pruebas del primer conjunto de experimentos se efectuaron con los siguientes parametros experimentales: excitacion de 450 nm, entrada de energfa de 8,75 mJ, tamano de punto de 1 * 1 mm, longitud del haz de 13,1 mm, exposicion radiante de 0,875 J/cm2, y caudal de 9 ml/min. Las concentraciones de 7,12 * 106 a 8,9 * 104 de las muestras emplearon una ganancia de senal de 25 promediada en 64 tomas de datos. Concentraciones menores que oscilaban de 5,5 * 103 a 7,0 * 102 usaron una ganancia de senal de 125 promediada en 128 tomas de datos. Los parametros distintos fueron utiles para diferenciar senales de concentraciones menores para esta configuracion. Los resultados experimentales de estos experimentos confirmaron de nuevo que puede lograrse la deteccion fotoacustica de celulas en circulacion usando sistemas y metodos de la invencion descritos en la presente memoria. Se detectaron con exito microesferas de latex de 6,6 pm de diametro en 3 concentraciones del orden de 106 por mililitro.

En el segundo conjunto de experimentos, se hizo que siete soluciones de microesferas de diferentes concentraciones que oscilaban entre 8,9 * 104 microesferas/ml y 7,0 * 102 microesferas/ml atravesaran un sistema de la invencion. Las pruebas se realizaron con los siguientes parametros: excitacion de 450 nm, amplificacion de *25, promediada en 128 tomas de datos, caudal de 9 ml/min, entrada de energfa laser 11,5-12,0 mJ, tamano de punto de 0,13 * 0,2 cm (0,026 cm2), y una exposicion radiante de 0,461 mJ/cm2.

Estos experimentos sugieren que las variaciones en la ganancia de amplificacion de la senal pueden ser una modificacion parametrica ejemplar util para aumentar la sensibilidad. En el sistema ejemplar 50, resultaron utiles las ganancias de 25, 50 y 125, resultando las configuraciones mayores de ganancia en mayor sensibilidad de deteccion. Sin embargo, una configuracion de ganancia demasiado alta corre el riesgo de una mayor proporcion senal-ruido.

En consideracion adicional de la sensibilidad, suponiendo una distribucion homogenea de las microesferas en toda la solucion, la cantidad exacta de microesferas individuales que cruzan la trayectoria del haz en cualquier momento dado puede deducirse por:

M ^, =(Cm )(K ⁾

siendo M# el numero de microesferas excitadas, siendo Cm la concentracion de microesferas por mililitro de solucion, y siendo Vb el volumen de la trayectoria del haz de excitacion a traves de la celda de flujo en cm3. Esta deduccion hace posible darse cuenta del numero de celulas individuales que producen cada senal fotoacustica, interpolando, por lo tanto, el numero de cromoforos individuales necesarios para inducir una senal diferenciada.

Ademas, durante las pruebas experimentales se uso una solucion salina mas concentrada para potenciar la intensidad de la senal incrementando la conductividad por la solucion de ensayo mientras se disminma la resistencia del agua. Inicialmente, se habfa usado una solucion salina fisiologica al 0,9% como disolvente para las pruebas. Se realizo un estudio que doblo la concentracion salina al 1,8%, con un aumento resultante en la intensidad de la senal. Aumentar la concentracion salina del 0,9% al 1,8% aumento la senal pico de la solucion en un factor de 1,2. Aunque pueden lograrse aumentos adicionales de la intensidad con concentraciones salinas mayores, a cierto nivel la concentracion se vuelve demasiado alta para soportar la supervivencia de una celula de melanoma vivo, dado que empiezan a lisarse a concentraciones salinas por encima de aproximadamente el 0,9%. Se cree que las concentraciones de aproximadamente un 1,8% proporcionan un maximo util, aunque en algunas circunstancias puedan usarse concentraciones mas elevadas. Ademas, pueden ser utiles otras soluciones, ademas del suero fisiologico, en la practica de los metodos y los sistemas de la invencion. Generalmente, los fluidos conductores que soportan un melanoma resultaran utiles cuando se use un sensor acustico que dependa de un electrodo interno. Otras configuraciones del sensor pueden permitir usar fluidos no conductores.

Usar el sistema ejemplar expuesto en lo que antecede con un vetuculo de solucion salina al 1,8% resulto tener mucho exito para la deteccion fotoacustica de espectros tisulares en forma de microesferas de latex negro de 6,6 pm. Los resultados indican que los sistemas y los metodos de la invencion son capaces de detectar la presencia de celulas individuales en una solucion en circulacion.

Para caracterizar adicionalmente algunos sistemas y metodos de la invencion, se llevaron a cabo ensayos adicionales usando analitos distintos de las microesferas descritas anteriormente, o ademas de las mismas. Una aplicacion en la que muchos sistemas y metodos de la invencion encontraran utilidad particular incluyen (sin limitacion) la deteccion de celulas cancerosas de melanoma que circulan por el sistema hematogenico de un potencial paciente de cancer. Los sistemas y metodos ejemplares de deteccion de la invencion pueden procesar materiales a traves de un analisis in vitro que requiere un metodo para extraer las celulas de interes de un paciente humano. Una simple extraccion sangumea es el metodo mas comun de obtencion de celulas presentes en el aparato circulatorio y puede ser usada como metodo rutinario, relativamente indoloro, para obtener muestras particulares de interes. Una vez que se recoge una muestra de sangre, se propone que las celulas metastasicas de melanoma puedan ser aisladas con precision de sangre entera in vitro implementando, a tftulo de ejemplo, una tecnica de centrifugacion de Ficoll-Hypaque. Esta tecnica requiere que la sangre entera extrafda sea sometida a separacion de gradiente por centrifugacion para aislar la capa celular particular de interes antes de introducirla en el sistema de deteccion fotoacustica.

Para evaluar adicionalmente los sistemas y los metodos de la invencion, se introdujeron espectros tisulares que representan melanoma biologico en muestras sanas de sangre in vitro y fueron detectados usando el metodo fotoacustico. Esta seccion describe detalles experimentales de tales ensayos de prueba. Sin embargo, antes de proporcionar tal detalle, seran utiles ciertos antecedentes de la aplicacion.

Los leucocitos, o globulos blancos, defienden al cuerpo contra organismos infecciosos y agentes extranos, tanto en tejidos como en el propio torrente sangumeo. La sangre humana contiene entre aproximadamente 5.000 y 10.000 leucocitos por miftmetro cubico; el numero aumenta en presencia de una infeccion. Los leucocitos, al igual que los eritrocitos, se forman en celulas madre de la medula osea. Tienen nucleos y se clasifican en dos grupos: granulocitos and agranulocitos.

Los granulocitos se forman en la medula osea y representan aproximadamente el 70% de todos los leucocitos. Los granulocitos incluyen tres tipos de celulas: neutrofilos, eosinofilos y basofilos. Los neutrofilos constituyen la gran mayona de los granulocitos. El fin principal de estas celulas es rodear y destruir a las bacterias y a otras partfculas extranas, asf como actuar en mecanismos de respuesta inflamatoria durante la infeccion o una reaccion alergica. Los granulocitos sirven como primera lmea de defensa contra la infeccion de celulas extranas.

Los agranulocitos incluyen monocitos y linfocitos. Los monocitos se derivan de las celulas fagocfticas que recubren muchos canales vasculares y linfaticos, denominados sistemas reticuloendoteliales. Los monocitos normalmente suman del 4% al 8% de los leucocitos. Se desplazan a areas de infeccion, donde se transforman en macrofagos, grandes celulas fagocfticas que atrapan y destruyen organismos dejados por los granulocitos y los linfocitos. Los linfocitos, en condiciones normales, constituyen entre aproximadamente el 20% y el 35% de todos los leucocitos, pero proliferan rapidamente ante una infeccion. Hay dos tipos basicos de linfocitos: los linfocitos B y los linfocitos T. Los linfocitos B tienden a migrar al tejido conectivo, en el que se desarrollan en celulas plasmaticas que producen anticuerpos muy espedficos contra antfgenos extranos. Otros linfocitos B actuan como celulas con memoria, listas para una infeccion posterior del mismo organismo. Algunos linfocitos T matan a las celulas invasoras directamente; otros interactuan con otras celulas del sistema inmunitario, regulando la respuesta inmunologica.

Celulas mononucleares de la sangre periferica (PBMC) es una expresion usada para describir monocitos y linfocitos que pueden ser separados de una solucion de sangre entera usando una tecnica de centrifugacion de Ficoll-Hypaque descrita en la presente memoria. En los metodos y los sistemas de la invencion tambien seran utiles otras tecnicas de separacion, incluyendo el centrifugado y tecnicas similares.

Aunque existe informacion contradictoria sobre la enfermedad metastasica y sus interacciones con el sistema inmunitario humano, se plantea la hipotesis de que los antigenos presentes en la superficie de las celulas de melanoma en el torrente sangumeo de un individuo con enfermedad metastasica seran reconocidos por estas celulas mononucleares, que se uniran a ellos. Esta suposicion se basa en la idea de que la enfermedad metastasica es una enfermedad cronica que persiste en el torrente sangumeo y sena principalmente atacada por monocitos y linfocitos, que se cree que defienden contra la enfermedad cronica mas que los granulocitos. Por lo tanto, el aislamiento de la capa de celulas mononucleares de sangre periferica debena dar lugar al aislamiento de cualquier celula de melanoma presente en el torrente sangumeo.

Se extrajeron muestras de sangre sana y libre de cancer de individuos que dieron su consentimiento dentro del grupo del laboratorio. Se tomaron muestras mediante puncion venosa del area antecubital del brazo en una cantidad de 10 a 50 centimetros cubicos usando un procedimiento estandar de extraccion de sangre. Se usaron tubos recubiertos de lfquido de acido etilendiaminotetraacetico (EDTA) para la recogida de sangre para inhibir la coagulacion. Las muestras de sangre fueron almacenadas en un ambiente refrigerado durante no mas de cinco horas antes de ser procesadas.

Se uso una tecnica de separacion de Ficoll-Hypaque para aislar la capa de celulas mononucleares de sangre periferica de las muestras de sangre entera. El proceso de Ficoll-Hypaque emplea un compuesto de azucar de una densidad espedfica que separa componentes sangumeos espedficos por un gradiente de densidad cuando se aplica la fuerza centnfuga. Se puso aproximadamente 1 ml de gradiente de separacion Histopaque 1077 (de Sigma-Aldrich Inc., San Luis, Misuri) en tubos de vidrio Pyrex n° 9800 (de Corning Inc., Acton, Massachusetts). Se vertieron suavemente aproximadamente 7 ml de sangre de las muestras refrigeradas sobre el Histopaque 1077 y se detuvieron con un tapon de caucho. El tubo de muestra fue colocado a continuacion en una centnfuga Vanguard 6500 de 60 Hz a 3400 rpm (de Hamilton Bell Co., Montvale, Nueva Jersey) y fue centrifugado durante 10 minutos. El gradiente y la ubicacion relativa resultantes incluyen la capa de celulas mononucleares de sangre periferica, que consiste en monocitos y linfocitos separados directamente por encima de la capa de Histopaque y por debajo del plasma. Los granulocitos son mas grandes y estan separados por debajo de la capa de Histopaque, directamente por encima de la capa de sangre (no mostrado).

Despues de la separacion, la capa diferenciada de PBMC fue retirada cuidadosamente con pipetas estandar de transferencia (de Samco Scientific Corp., San Fernando, California) y fue colocada en tubos de microcentrifugacion de parte superior plana de 1,5 ml (de Fisher Scientific, Pittsburgh, Pensilvania). Las PBMC de los tubos de microcentrifugacion fueron lavadas en una solucion salina y se volvieron a centrifugar durante 5 minutos. Se pipetearon la solucion salina y el plasma sobrantes de la parte superior de la capa de PBMC. Esto se repitio hasta que las celulas mononucleares de sangre periferica quedaron claramente aisladas.

Se anadieron dos suspensiones de celulas mononucleares aisladas (0,111 g) a 20 ml de una solucion salina al 0,9%. Una suspension sirvio de control. La segunda suspension contema 0,5 ml (1,49*108) de microesferas de latex negro. Ambas fueron introducidas en un sistema ejemplar de deteccion fotoacustica de la invencion.

Se creo una segunda muestra de ensayo en la que se anadio 1 ml (2,98 * 108) de microesferas de latex negro de 6,6 pm a 7 ml de una muestra de sangre humana antes de la centrifugacion de Ficoll-Hypaque. La capa de celulas mononucleares de sangre periferica fue aislada segun se ha descrito previamente, se le anadieron 20 ml de suero fisiologico al 0,9% y fue introducida en el sistema de deteccion.

Todas las pruebas fueron realizadas con los siguientes parametros: excitacion de 450 nm, amplificacion de *25, promediada en 128 tomas de datos, caudal de 9 ml/min, energfa de entrada 9,5-10,5 mJ, y un tamano de punto de 0,16 * 0,16 cm (0,0256 cm2), resultando en una exposicion radiante de 0,39 J/cm2. Se postula que las celulas de melanoma en el torrente sangumeo de un paciente metastasico pueden permanecer en el plasma cuando sean sometidas al gradiente de Ficoll-Hypaque. Por esta razon, se realizo un ensayo separado utilizando plasma sangumeo aislado para determinar la capacidad dinamica del sistema ejemplar de deteccion de funcionar usando diferentes medios. Se prepararon dos muestras: una muestra de control que consistfa en 3 ml de plasma humano y 10 ml de solucion salina al 0,9% y una muestra de ensayo de la misma solucion con 0,5 ml (1,49 * 108) de microesferas negras agregadas, para imitar la presencia de melanoma en el plasma. Se usaron parametros experimentales similares a los de antes, salvo que se uso una longitud de onda de excitacion de 595 nm para eliminar la absorcion por el plasma pigmentado de forma natural de color amarillo. Despues del aislamiento de la capa de celulas mononucleares de sangre periferica, se creo una suspension de suero fisiologico/celulas mononucleares a la que se agregaron 1,49 * 108 microesferas (7,12 * 106 por ml). La amplificacion se establecio en 25, excitacion de 450 nm y resultados fotoacusticos para una suspension celular de agranulocitos de control.

La forma de onda de control de salida resultante para la suspension de celulas mononucleares confirma que no hay excitacion fotoacustica que ocurra al excitar las PBMC. Cabe esperar esto, ya que las celulas mononucleares son de color blanco y no debenan contener cromoforos activos que puedan producir una senal fotoacustica. La forma de onda fotoacustica resultante de la adicion de microesferas en una suspension de celulas mononucleares aisladas confirma claramente una vez mas la capacidad de los sistemas y los metodos de investigacion investigados para identificar cromoforos entre una solucion de PBMC en circulacion.

Ademas, la forma de onda resultante de la adicion de microesferas en la sangre entera previa a la centrifugacion es representativa de las celulas de melanoma presentes en el propio torrente sangumeo. Las microesferas se agregaron en una gran concentracion, para que, si todas las esferas se aislaban debidamente, se diera lugar a 7,12 * 106 microesferas/ml en la solucion. Probablemente no fue asf, ya que se puede suponer que se perdieron muchas microesferas durante el proceso de separacion. La forma de onda resultante muestra que la centrifugacion de Ficoll-Hypaque tiene muchusimo exito en el aislamiento de espectros tisulares que representan celulas de melanoma, lo que demuestra que esta hipotesis es correcta.

La extraccion de plasma sangumeo ilustra un segundo metodo para detectar cromoforos en una solucion no salina. Las microesferas se detectaron con precision a altas concentraciones a 595 nm. Esto muestra la versatilidad de la modificacion de la longitud de onda para la deteccion. La longitud de onda de 595 nm no excita al plasma pigmentado amarillo (como se ve en el control), fundamentalmente porque el plasma absorbe en el espectro azul y rojo. No obstante, la longitud de onda de 595 nm proporciona excitacion fotoacustica para espectros tisulares presentes en una solucion debido a la absorcion de banda ancha de las microesferas. Esto proporciona un modo para la deteccion de celulas aisladas en el plasma sangumeo, lo que resultara beneficioso.

Estos experimentos confirmaron que la respuesta fotoacustica de los espectros tisulares inoculados en sangre sana puede ser aislada y detectada con precision mediante los sistemas y los metodos de deteccion fotoacustica de la invencion ilustrados anteriormente. Los resultados experimentales confirman que los metodos y los sistemas de la invencion son utiles para extraer e identificar celulas distribuidas uniformemente entre cientos de millones de celulas constituyentes de la sangre que no son de interes. Tambien muestra la capacidad de los sistemas y los metodos para expresar la presencia de cromoforos entre una suspension de celulas mononucleares que elimina la necesidad de un metodo de aislamiento celular adicional. Se cree que las celulas de melanoma maligno vivo residiran en el mismo gradiente Ficoll-Hypaque que las celulas espectrales tisulares. Sin embargo, tambien es posible que las celulas de melanoma, al ser mas grandes que las microesferas y de diferente composicion, puedan separarse de manera diferente, posiblemente en la capa de granulocitos.

Los ensayos de deteccion descritos anteriormente han demostrado que los metodos y los sistemas de la invencion pueden detectar con exito cromoforos en solucion del orden de veinte celulas individuales o menos. La sensibilidad de un sistema ejemplar descrito anteriormente es de solo dos microesferas. Otros sistemas y metodos de la invencion pueden ser modificados mediante la seleccion de la energfa del laser, el area del haz, la geometna de la celda de ensayo y parametros similares para lograr un umbral de deteccion de solo una celula cancerosa.

Una evaluacion experimental adicional de metodos y sistemas de la invencion en aplicaciones dirigidas a la deteccion de celulas cancerosas diseminadas es someter a ensayo la capacidad de detectar celulas de melanoma in vitro. Para ello, se cultivo una lmea celular de melanoma vivo para que se pudiera introducir una gran cantidad de melanina aislada en el sistema para la deteccion. La siguiente exposicion describe la lmea celular usada y los metodos de cultivo celular empleados, y describe en detalle los metodos y los sistemas de la invencion utilizados para detectar el melanoma vivo.

Resultara util cierta exposicion de antecedentes sobre el melanoma. El melanoma es un tumor maligno compuesto de melanocitos no regulados. Una celula de melanoma es esencialmente un melanocito que contiene una o mas mutaciones que inhiben el crecimiento celular normal y la regulacion. Un melanocito produce coloracion en mairnferos al segregar tres pigmentos unicos: las eumelaninas nitrogenadas insolubles oscuras, formadas por la polimerizacion oxidativa de las dihidroxiindolquinonas; las fenomelaninas solubles en alcali, derivadas de cisteinil-DOPA, que proporcionan los colores mas claros (principalmente marron y rojo-marron); y los feocromos anfoteros (colores rojo y rojo-anaranjado). Estos colores se sintetizan enzimaticamente en sitios granulares de 10 nm que recubren las paredes internas de los melanocitos.

Estos pigmentos son denominados melanina y son producidos en diversas formas, tamanos y cantidades, dependiendo de la celula. La cantidad y el tipo de melanina producida determinan el color de la piel, del cabello y de los ojos en los marnfferos. La melanina producida esta encapsulada por la celula de melanoma que proporciona un pigmento para cualquier celula productora de melanina. Precisamente los granulos de melanina encapsulados dentro del melanocito o celula de melanoma, sirven como absorbentes de banda ancha para producir senales fotoacusticas cuando son expuestos a una luz laser incidente.

Las melaninas son una clase extensa de macromoleculas funcionales que muestran conjuntamente un modelo de estructura de banda caractenstico de un solido amorfo con amplio espectro de absorcion de banda en el espectro visible y UV. Se ha demostrado que la eumelanina, el pigmento mas extendido, absorbe eficientemente la energfa de los fotones UV y visibles y se desactiva con una eficiencia cuantica de menos del 0,05%, lo que se ajusta a su papel como fotoprotector en la piel. El mecanismo por el cual esto ocurre es complicado y no se entiende completamente. Los estudios muestran que las melaninas consisten en pequenas unidades oligomericas heterogeneas que poseen diferentes estados redox que dan como resultado un amplio abanico de saltos HOMO-LUMO (diferencia de energfa entre el orbital molecular ocupado mas alto y el orbital molecular no ocupado mas bajo). Este modelo de desorden qmmico permite la absorcion monotona de banda ancha como consecuencia de la superposicion de un gran numero de transiciones gaussianas ampliadas no homogeneamente asociadas con los componentes del conjunto de melanina. A pesar de todo el trabajo realizado para caracterizar la absorcion de melanina, se ha planteado la hipotesis de que el espectro de absorcion de la melanina humana esta dominado por la dispersion, ya que no muestra resonancias de absorcion caractensticas en el espectro visible o el ultravioleta.

Los melanocitos estan presentes en todos los organos de base epitelial que dan lugar a tumores cancerosos. Por lo tanto, se cree que las celulas de melanoma estan presentes en cualquier cancer de base epitelial, o carcinomas, y sus celulas metastasicas resultantes. Desgraciadamente, aproximadamente el 10% de estos carcinomas consisten en celulas de melanoma amelanoticas que no producen pigmento, lo que hace que el metodo de deteccion fotoacustica sea ineficaz. Sin embargo, se cree que podnan usarse los mecanismos de marcado molecular, que incluyen tecnologfa de tincion y nanopartfculas, a tttulo de ejemplo y no de limitacion, para identificar celulas amelanoticas in vitro y unirse a ellas, lo que permitina la excitacion fotoacustica de los marcadores unidos. Esto podna acabar permitiendo la deteccion fotoacustica de cualquier cancer a base de melanoma.

La lmea celular de melanoma utilizada en los experimentos expuestos a continuacion fue SK-MEL-1. Estas celulas se obtuvieron originalmente en 1968 a partir de la linfa del conducto toracico de un caucasico de 29 anos con melanoma maligno que avanzaba rapidamente. Se sabe que las celulas son tumorigenicas en ratones desnudos o hamsters tratados con cortisona, que producen melanomas malignos pigmentados. Caractensticas celulares adicionales inclrnan una propiedad de crecimiento esferico, con celulas agrupadas de forma poco ngida que presentaban un citoplasma granular.

Las celulas fueron cultivadas en suspension en matraces de cuello inclinado de 25 cm2 con un tapon de estilo fenolico (de Corning Glass Works, Corning, Nueva York) a 37°C en un entorno humidificado con CO2 al 5%. En cada matraz se mantuvieron aproximadamente 10 ml de la suspension celular. Se uso un caldo compuesto por 444,4 ml de RPMI (de Invitrogen Corp., Grand Island, Nueva York), 5 ml de glutamina (tambien de Invitrogen Corp.), 50 ml de suero fetal bovino (de US Bio-Technologies Inc., Pottstown, Pensilvania) y 0,6 ml de gentamicina (de American Pharmaceutical Partners, Schaumburg, Illinois) y fue renovado tres veces por semana. Cuando se cambiaba el caldo, se retiraban y desechaban 7 ml de la suspension celular, dejando 3 ml en el matraz original. Luego, se volvfa a anadir al matraz 7 ml de caldo fresco.

Las celulas eran contadas antes de cada renovacion del caldo. Se obtema una pequena muestra de celulas para el recuento. Las celulas eran mezcladas suavemente con una tinta azul con una disolucion de 1:2. Usando un hemocitometro, se contaron las celulas en tres cuadrados. Se realizo una citocentrifugacion en una tanda seleccionada de celulas y se formo un bloque celular y se lo tinciono con hematoxilina y eosina. Las celulas individuales variaban en tamano, y muchas conteman inclusiones intracelulares oscuras. Los nucleos estaban ubicados centralmente, eran redondos, y conteman uno o mas nucleolos prominentes.

Se descubrio que la cantidad de melanina producida variaba segun la celula, conteniendo aproximadamente el 5% de las celulas densos granulos citoplasmaticos marrones dispersos uniformemente por todo el citoplasma. Por lo tanto, solo 1 de cada 20 celulas vivas de melanoma produdan melanina de forma activa. El estado aneuploide mutado del melanoma transformado es evidente a traves de celulas que contienen multiples nucleos.

Se llevaron a cabo varios ensayos de control usando metodos y sistemas ejemplares de la invencion para demostrar de manera definitiva la deteccion de celulas de melanoma en lugar de otros absorbentes o efectos piroelectricos. Estos experimentos de control se realizaron ademas de detectar suspensiones de melanoma.

Ademas de una solucion de control salina normal al 1,8% (preparada y sometida a ensayo segun la anterior exposicion), se preparo una solucion de 7,124 * 106 microesferas/ml utilizando microesferas de latex CML blanco de 6,6 pm (de Interfacial Dynamics Corp., Eugene, Oregon). Aunque las microesferas negras representan los efectos absorbentes del melanoma, las microesferas blancas pueden ser usadas para representar los efectos dispersantes de las celulas de melanoma. Por lo tanto, la suspension de microesferas blancas fue introducida para determinar los efectos de un medio puramente dispersante en el sistema. Las celulas de melanoma vivo actuan como absorbentes y dispersantes debido a su contenido variable de melanina y a la gran cantidad de area de superficie blanca. Es posible que un medio de dispersion (como el melanoma) pueda producir senales fantasma u oscilaciones debido a un efecto pirotecnico, o senales producidas por fotones dispersos que interactuen con la pelfcula piezoelectrica o los electrodos. Estos ensayos de control dan ejemplos de las formas de onda piroelectricas tfpicas para eliminar la posibilidad de confundir una senal piroelectrica con la de una senal de melanoma.

Se realizo un segundo experimento de control utilizando una suspension 1:1 de caldo de cultivo RPMI (descrito anteriormente) y solucion salina al 1,8%. El caldo, usado para cultivar las celulas de melanoma, contiene rojo de fenol que sirve como un indicador de acido/base para identificar cuando las celulas han agotado los nutrientes del caldo de cultivo. El rojo de fenol (fenolsulfonftalema) tiene un valor de pK de 7,9. Existen diferentes espectros de absorcion de diferentes fuentes y tecnicas de deteccion, como se puede ver al comparar los dos espectros. Es evidente que el rojo de fenol tiene una absorbancia variable a 450 nm que podna producir una senal fotoacustica, pero ninguna absorbancia a 620 nm. Por lo tanto, los ensayos de deteccion se realizaron a 450 nm y 620 nm tanto para la suspension del caldo de cultivo como para la suspension del melanoma para la comparacion. Esto garantizana que cualquier senal producida a 620 nm sena la de las celulas de melanoma, no la del caldo de cultivo, ya estuviera presente en las celulas o absorbido por las celulas, eliminando asf la nocion de que el medio de cultivo pueda estar produciendo una senal fotoacustica confundida con melanoma.

Antes de suspender el melanoma para su introduccion en el sistema de deteccion, las celulas fueron contadas y luego centrifugadas 1200 RPM a 4°C durante diez minutos usando una centrifugadora Fisher Scientific accuSpin 3R. El sobrenadante del caldo se elimino entonces del sedimento celular formado. A continuacion, las celulas se lavaron usando solucion salina tamponada con fosfato de Dulbeccos (Invitrogen Corp., Grand Island, Nueva York). Se anadio solucion salina al sedimento, las celulas se mezclaron suavemente, volvieron a suspenderse y se repitio el procedimiento utilizando los mismos metodos descritos anteriormente. Finalmente, se elimino el sobrenadante de la solucion salina y se anadio una pequena cantidad de solucion salina nueva al sedimento celular.

Se creo una solucion de 15ml que consistfa en of 2,3 * 106 celulas de melanoma vivo y solucion salina al 1,8%, resultando en una suspension de 1,53 * 105 celulas/ml. Esta suspension fue introducida en el sistema ejemplar de la invencion y detectada usando luz laser de impulsos con los siguientes parametros: excitacion de 450 nm y 620 nm, energfa de entrada de 9,5-11,6 mJ, ganancia de 25, y promedio en 128 tomas de datos.

La lmea celular elegida para estos ensayos fue una lmea celular de melanoma metastasico no agrupada. La muestra original fue tomada del tumor metastasico de un paciente con cancer de clase IV, lo que insinua que las celulas poseen una capacidad inherente de diseminarse e introducirse en el torrente sangumeo. Por lo tanto, las celulas cultivadas y sometidas a ensayo debenan ser comparables a las celulas que estanan presentes en el torrente sangumeo de un paciente con cancer metastasico. Aproximadamente el 5%, o 1 de cada 20, de las celulas cultivadas produjeron melanina visible. El tamano de punto irradiado para estos ensayos fue de 0,13 cm * 0,2 cm (0,026 cm2) con una longitud de haz de 1 cm. Si se supone que 1 de cada 20 celulas produjo melanina viable, entonces se puede deducir que cualquier senal resultante fue producida por 200 celulas melanoticas de melanoma por trayectoria de haz irradiado. Se usaron 450 nm para excitar las muestras de melanoma debido a las propiedades de absorcion optica presentadas anteriormente.

Las FIGURAS 7A y 7B muestran los datos resultantes, incluyendo la FIG. 7a los resultados para el melanoma vivo y mostrando la FIG. 7B resultados para el cultivo de RPMI. Los datos de ruido en el extremo izquierdo de cada grafico (cerca del origen) corresponden al ruido de disparo del laser. Segun indica la FIG. 7A, es evidente una senal distinta de melanoma a aproximadamente 2,5 ms. No se produce tal pico en los datos de RPMI de la FIG. 7B. Los resultados de estos experimentos confirman que las senales de melanoma vivo se diferenciaron clara y sistematicamente. Las senales fueron claramente diferentes de las del caldo de cultivo de RPMI y de las de los ensayos espectrales tisulares de microesferas. Estas formas de onda caractensticas muestran claramente la capacidad del sistema de deteccion para detectar celulas de melanoma maligno in vitro.

Por lo tanto, el melanoma maligno vivo cultivado fue detectado con exito usando los sistemas y los metodos de la invencion. Las senales estuvieron claramente diferenciadas y conservaron un patron distinto en lo relativo a la deteccion de melanoma. Ademas, cuando se comparan con las pruebas de umbral para los metodos y los sistemas ejemplares expuestos anteriormente en relacion con las pruebas con esferas unicamente, la senal del melanoma tuvo una tension mas de 2 veces mayor.

La determinacion de las propiedades opticas para las microesferas de latex negro y las celulas del melanoma vivo que se expuso anteriormente es util para comprender como se comparan los espectros tisulares de microesferas con las celulas vivas que intentan representar. Entender como interactua la luz con los dos medios absorbentes objeto de ensayo permite extraer conclusiones sobre su capacidad para producir senales fotoacusticas. Una vez que se tiene conciencia del potencial de produccion de senales a traves de la determinacion de las propiedades opticas, se puede explicar con mayor detalle la respuesta fotoacustica de las suspensiones de celulas de melanoma y de las suspensiones de microesferas de latex negro. A partir de estos datos, se pueden establecer correlaciones entre los ensayos de sensibilidad realizados con espectros tisulares de latex y los resultados de la deteccion del melanoma vivo real.

Las esferas de integracion ofrecen un metodo para determinar simultaneamente las propiedades opticas de los materiales empleando el algoritmo de adicion-duplicacion inversa para medir el flujo de luz conjunto de las esferas de integracion. Esta exposicion detalla las propiedades opticas de interes, proporciona una breve explicacion de la teona de la integracion de las mediciones de las esferas, describe la metodologfa usada y expone las propiedades opticas de las microesferas de latex y del melanoma maligno.

Hay varias propiedades que se usan para describir las interacciones de la luz con medios turbios. Las tres propiedades consideradas en detalle en esta memoria son la absorcion, la dispersion y la anisotropfa. Una propiedad optica importante para el proposito de los sistemas y los metodos de la invencion es la absorcion. La cantidad de absorcion de un material en una longitud de onda particular esta directamente relacionada con la intensidad de la senal fotoacustica que produce.

La absorcion se produce cuando un foton de luz incidente interactua con una molecula que puede absorber ese foton en forma de transicion de e n e ^a molecular. En el espectro visible, estas transiciones consisten en desplazamientos orbitales de electrones en compuestos formados por dienos conjugados. Los compuestos que contienen dienos conjugados constituyen la mayona de los materiales absorbentes o cromoforos. La absorcion de un compuesto se describe por su coeficiente de absorcion, |Ja, definido como la probabilidad de absorcion de luz a una distancia infinitesimal ds, dada como cm-1. El coeficiente de absorcion depende de la longitud de onda y esta determinado por el tipo de cromoforo y su concentracion. Suponiendo un medio puramente absorbente, el coeficiente de absorcion se puede calcular utilizando la ley de Beer, dada como:

El coeficiente de absorcion esta exponencialmente relacionado con el porcentaje de luz transmitida y depende del grosor de la muestra. Esto describe el metodo mas simple para determinar la absorcion. De forma realista, no existe un medio puramente absorbente, lo que explica la necesidad de metodos mas complicados de determinacion de propiedades opticas, como el algoritmo de adicion-duplicacion inversa.

La dispersion describe la interaccion de fotones que no son absorbidos por un medio particular y es causada por cambios en el mdice de refraccion en un material. La dispersion optica se describe mediante el coeficiente de dispersion, Js, y se define como la probabilidad de dispersion de fotones a una distancia infinitesimal ds, dada por cm-1. El coeficiente de dispersion de un material se basa en la densidad volumetrica de los dispersores y depende del tamano de la partfcula. Se puede usar la ley de Beer de la misma manera que en la absorcion para calcular el coeficiente de dispersion para un medio puramente dispersante.

La anisotropfa describe la cantidad de luz que es dispersada hacia delante por un material. La funcion de fase, o angulo de refraccion de la luz, se caracteriza por la anisotropfa, g, que es el coseno promedio de la funcion de fase. La anisotropfa vana entre la dispersion isotropica (g=0) y la dispersion frontal completa (g=1).

Hay otras propiedades opticas que pueden ser relevantes para algunos metodos y sistemas de la invencion, incluyendo, por ejemplo, el albedo de dispersion, dado por:

El albedo representa la porcion relativa de dispersion durante un evento de interaccion de la luz. El coeficiente de atenuacion lummica total esta dado por:

La tasa de atenuacion efectiva para medios muy dispersos es dada por:

El camino libre medio (clm) para un foton que atraviesa un medio absorbente y dispersante esta dado por:

La profundidad optica para un medio absorbente y dispersante esta dada por:

Por ultimo, el coeficiente reducido de dispersion describe un medio muy dispersante relacionando la anisotropfa con el coeficiente de dispersion como:

Todas estas propiedades opticas pueden ser usadas para descifrar la composicion de un material a traves de la puesta en practica de los sistemas y los metodos de la invencion.

Estas relaciones pueden ser usadas no solo para comprender mejor el funcionamiento y los resultados de los sistemas y los metodos de la invencion, sino que tambien pueden ser usadas para determinar y estimar las cualidades de los analitos detectados. Las etapas de un metodo de la invencion incluyen, por ejemplo, el uso de estas relaciones para determinar la densidad, la masa, el tamano de un analito, su concentracion y similares.

Ademas, algunos otros metodos y sistemas de la invencion pueden incluir etapas y elementos para construir con el tiempo una base de conocimientos que sea util para determinar tales caractensticas para los analitos. A tttulo de ejemplo, algunos metodos de la invencion pueden incluir etapas de calibracion, mediante las cuales se someta a ensayo a diferentes dianas espectrales (por ejemplo, microesferas) usando diferentes concentraciones, diferentes absorbancias, diferente aporte de e n e ^a y otras variaciones de los parametros de ensayo. Un sistema de la invencion puede incluir una memoria para almacenar datos resultantes e instrucciones de programa para analizar los datos. Los datos resultantes pueden ser usados para desarrollar un modelo predictivo para usarlo cuando se presenten datos de pruebas reales de un analito desconocido para determinar las caractensticas de ese analito.

Ademas, pueden desarrollarse las denominadas formas de onda distintivas para diferentes analitos mediante ensayos. Estas pueden ser utiles para identificar un analito desconocido. Ademas, algunos sistemas y metodos de la invencion pueden ser utiles para detectar e identificar multiples analitos diferentes en una sola muestra. Los diferentes analitos presentes en la muestra unica pueden ser identificados a traves de sus diferentes formas de onda.

Los sistemas y los metodos de deteccion fotoacustica de la invencion tienen la capacidad de detectar la presencia de melanina en solucion. Los sistemas y los metodos son faciles de usar y permiten una preparacion de muestras relativamente simple, ya que, una vez que se afsla un bloque de celulas, solo se requiere agregar un fluido vehicular como solucion salina para conducir la senal de tension. Las muestras pueden introducirse rapidamente en un sistema ejemplar a traves de un deposito externo y hacerlas circular utilizando una bomba para inducir una presion negativa. Las soluciones de ensayo tambien se pueden eliminar facilmente y todo el sistema se puede limpiar en minutos, proporcionando resultados eficientes y una capacidad de procesamiento de alto volumen.

Los expertos en la tecnica apreciaran que se pueden realizar muchas modificaciones a los sistemas y los metodos descritos anteriormente. Por ejemplo, las camaras de deteccion pueden ser configuradas para mejorar la sensibilidad del dispositivo. Los sistemas y los metodos de la invencion han sido utilizados con espectros en forma de microesferas negras de latex CML de 6,6 pm, que actuan como un absorbente de banda ancha similar al de la melanina. Las senales fotoacusticas derivadas de microesferas de latex negro han sido discriminadas y han presentado un umbral de deteccion bajo, asf como una senal muy intensa y claramente diferenciada.

Los metodos de la invencion tambien incluyen etapas para el aislamiento de celulas de melanoma de sangre entera. Se ha descubierto que la capa de celulas mononucleares de sangre periferica puede ser aislada y puesta en el sistema de deteccion sin crear falsos positivos. Ademas, la simple adicion de espectros tisulares en forma de microesferas de latex en sangre entera ha producido resultados firmes que indican que el protocolo para la preparacion de muestras puede aislar con precision cuerpos extranos, como el melanoma, en el torrente sangumeo. Los resultados han demostrado tener exito en la deteccion de absorbentes de banda ancha en medio de millones de celulas mononucleares.

Un dispositivo fotoacustico ejemplar de la invencion ha detectado con exito celulas de melanoma en una suspension salina estandar. La forma de onda fotoacustica para el melanoma maligno es marcadamente diferente de la de otros absorbentes, incluidas las microesferas de espectros tisulares. La difraccion acustica de las celulas de melanoma da lugar a una forma de onda fotoacustica identificable de forma unica que puede ser usada para diferenciar una senal de melanoma de posibles falsos positivos como la sangre. El umbral de deteccion es de un nivel util para proporcionar una deteccion muy temprana de CTC, patogenos y otros analitos de interes. Ademas, se contemplan modificaciones a algunos de los elementos de los sistemas y los metodos descritos en la presente memoria para aumentar la sensibilidad. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, aumentar la intensidad o el tamano del haz incidente, disminuir el area de irradiacion, mejorando aun mas la intensidad de la senal y similares.

Las FIGURAS 8 y 9, por ejemplo, ilustran esquematicamente una configuracion alternativa ejemplar de una celda 250 de flujo. La celda 250 incluye secciones 252 superior e inferior que generalmente tienen forma de embudo. Una seccion 254 de angostura estrecha de forma cilmdrica esta situada entre las dos secciones de embudo 252 y las conecta. La seccion de angostura esta hecha de una pared lateral transparente que puede ser de vidrio, a tttulo de ejemplo. Un laser 256 dirige un haz 258 de impulsos a traves de la seccion 256 de angostura. Segun se muestra mejor en la vista desde arriba de la FIG. 9, el haz pulsante 258 se extiende sustancialmente por todo el diametro de la seccion 254 de angostura cilmdrica, por lo que se ilumina la seccion transversal completa de la muestra de ensayo que se comunica a traves de la seccion 254 de angostura. Dicho de otra manera, esta configuracion, como la de las FIGURAS 3-5, capta todo el flujo de la muestra de ensayo dentro de la trayectoria del haz.

Hay un sensor acustico 260 dispuesto en un lado de la seccion 254 de angostura. El sensor 260 puede ser una pelmula que se desvfe cuando una onda acustica la golpee, o puede ser otro dispositivo. Como se muestra en las FlGURAS 8 y 9, el sensor 260 esta dispuesto en la seccion 254 de angostura en una ubicacion adyacente a la trayectoria del haz 258, pero esta situado en un lado en el que el haz no pasa directamente para evitar (o al menos minimizar) la posible interferencia con o desde el haz laser 258.

La celda 250 de flujo puede dimensionarse como se desee y como sea adecuado para una aplicacion particular. En una configuracion ejemplar, la celda es de escala micrometrica, para que la seccion 254 de angostura transporte solo algunas celulas de melanoma y garantice la excitacion de todo el material que atraviese la seccion 254. La seccion 254 de angostura puede ser, por ejemplo, un tubo capilar que tenga un diametro de aproximadamente 1 mm o aproximadamente 2 mm. Si se proporcionara en un diametro adecuadamente pequeno, cabna esperar que solo una o algunas CTC estuvieran en el pequeno volumen que reside en la seccion 254 de angostura. Dirigir el haz de energfa 258 a la angostura estrecha 254 excitana entonces solo una o algunas CTC cada vez.

Usar una configuracion como la celda 250 de flujo puede ser util en algunos metodos de la invencion para estimar la concentracion del analito. Los picos de onda en los datos resultantes se pueden contar para estimar el numero de celulas de analito detectadas en la muestra. Este conocimiento, junto con el volumen de la muestra, llevara a una determinacion de la concentracion de analito en la muestra.

La celda 250 de flujo puede ser colocada en lmea con un deposito, una bomba y otros elementos, segun se desee. Puede ser usada en una configuracion en circulacion en la que se hace que una muestra atraviese la seccion 254 de angostura varias veces, o puede ser usada en una configuracion de una sola pasada, en la que una muestra atraviesa la celda 250 de flujo solo una vez. En una configuracion ejemplar, la celda 250 de flujo es usada en una disposicion de flujo por gravedad que no depende de una bomba. O bien, se puede usar una jeringa para suministrar una muestra de ensayo en lmea con la celda 250 de flujo, impulsando la presion de expulsion de la jeringa la muestra de ensayo a traves de la celda 250. Se proporciona un controlador 262 (FIG. 8), que esta vinculado tanto al laser 256 como al sensor acustico 260. El controlador puede ser un dispositivo a base de procesadores, tal como un ordenador, e incluye el procesamiento de obtencion de datos, el almacenamiento de datos, el control del laser y funcionalidades de control del sensor acustico. Tambien puede incluir una pantalla para mostrar datos.

Los sistemas y los metodos de deteccion de la invencion para la deteccion de analitos como el melanoma metastasico han demostrado tener exito. Con la capacidad de analizar muestras de sangre en menos de 30 minutos sin la ayuda de un histologo capacitado, un sistema ejemplar de deteccion fotoacustica puede ser el metodo mas fiable para detectar el cancer. Este metodo y este sistema sin precedentes podnan revolucionar el campo de la oncologfa, entre otros, al proporcionar un vehmulo para la deteccion temprana de una enfermedad metastasica, ademas de funcionar como un metodo para determinar la eficacia de la quimioterapia. Ademas, si la teona paralela de la metastasis es cierta, los dispositivos y los sistemas ejemplares seran de gran utilidad como detectores tempranos no solo de la enfermedad metastasica sino tambien de cualquier forma melanotica de cancer cerca de su inicio.

Sin embargo, los metodos y los sistemas de la invencion no estan limitados al cancer o a la deteccion de patogenos. Los expertos en la tecnica apreciaran que los sistemas y los metodos encontraran utilidad en una amplia variedad de aplicaciones adicionales. Algunas aplicaciones ejemplares adicionales incluyen pruebas para determinar si un fluido corporal incluye una protema particular o un rastro de una droga ilegal. Otras incluyen la deteccion de analitos que estan presentes en el esperma.

Los beneficios y las ventajas de los dispositivos y los sistemas de la invencion son evidentes. La exposicion en la presente memoria de metodos y sistemas particulares se ha hecho con el proposito de ilustrar algunos de los mejores modos para poner en practica la invencion.

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Un metodo de deteccion de un analito en una muestra de un fluido corporal que comprende las etapas de: - hacer circular dicha muestra a traves de una camara (52) de ensayo, incluyendo dicha camara (52) de ensayo un sensor acustico (260) configurado para detectar una senal fotoacustica despues de que se produzca una expansion termoelastica en dicha camara (52) de ensayo;

- exponer la muestra de fluido corporal a energfa electromagnetica, que comprende un haz laser (64) de impulsos, para provocar una expansion termoelastica en el analito, que comprende dirigir un haz de dicha energfa electromagnetica al interior de dicha camara de ensayo y que comprende captar todo el flujo de dicha muestra de fluido corporal con dicho haz;

- detectar una senal fotoacustica en la muestra resultante de dicha expansion termoelastica.

2. El metodo de deteccion de un analito definido por la reivindicacion 1 en el que dicha expansion termoelastica es resultado de que dicho analito absorba al menos una porcion de dicha luz, y en el que dicha senal fotoacustica comprende una onda acustica resultante de dicha expansion termoelastica.

3. El metodo de deteccion de un analito definido por la reivindicacion 1 en el que dicha fuente de energfa electromagnetica comprende un laser (110) pulsante a una frecuencia mas rapida que un microsegundo, comprendiendo dicho fluido corporal uno o mas de sangre, bilis, esperma, orina o saliva, y en el que dicho analito comprende uno de una protema o un patogeno.

4. El metodo de deteccion de un analito definido por la reivindicacion 1 y que, ademas, comprende la etapa de anadir partfculas diana a dicha muestra de fluido corporal que tienen un diametro inferior a 0,01 milfmetros, estando configuradas dichas partfculas para responder a dicha energfa electromagnetica, y estando configuradas dichas partfculas para adherirse a dicho analito.

5. El metodo de deteccion de un analito definido por la reivindicacion 4 en el que dichas partfculas diana comprenden microesferas que tienen anticuerpos seleccionados para adherirse a dicho analito, estando configuradas dichas microesferas para absorber dicha energfa electromagnetica.

6. El metodo de deteccion de un analito definido por la reivindicacion 1 en el que la etapa de deteccion de dicha senal fotoacustica comprende la deteccion de una desviacion en un diafragma (58) que se encuentra en contacto de fluido con dicha muestra de fluido corporal, produciendose dicha desviacion cuando una onda acustica hace contacto con dicho diafragma (58).

7. El metodo de deteccion de un analito definido por la reivindicacion 1 en el que la etapa de deteccion de dicha senal fotoacustica comprende la medicion de una perturbacion electrica que se produce cuando una capa piezoelectrica es desviada.

8. El metodo de deteccion de un analito definido por la reivindicacion 1 en el que dicha senal fotoacustica comprende una onda de presion que se desplaza por dicha muestra de fluido corporal.

9. El metodo de deteccion de un analito definido por la reivindicacion 1 en el que la etapa de deteccion de dicha senal fotoacustica incluye, ademas, el uso de la magnitud de dicha senal para estimar uno o mas del tamano, la densidad y la concentracion del analito.

10. El metodo de deteccion de un analito definido por la reivindicacion 1, realizandose el metodo in vitro y en el que el analito comprende una o mas celulas cancerosas en circulacion, que comprende las etapas de: separar leucocitos de una cantidad de sangre;

suspender dichos leucocitos en un lfquido vehicular para crear una muestra de ensayo; y

comunicar dicha muestra de ensayo a traves de la camara (52) de ensayo;

usar un laser (110) para inducir la expansion termoelastica de dichas una o mas celulas cancerosas en dicha muestra de ensayo comunicada a traves de dicha camara (52) de ensayo; y

usar el sensor acustico (260) para detectar la senal fotoacustica resultante de dicha expansion termoelastica en dicha camara (52) de ensayo.

11. El metodo de deteccion de una o mas celulas cancerosas en circulacion definido por la reivindicacion 10 y que, ademas, incluye las etapas de:

adherir varias dianas microesfericas a cada una de dichas una o mas celulas cancerosas;

comprendiendo la etapa de uso de dicho laser (110) dirigir un rayo laser pulsante a una frecuencia mas rapida que aproximadamente 1 microsegundo al interior de dicha muestra de ensayo a traves de una pared lateral transparente (54, 56) de la camara de ensayo; y,

comprendiendo dicha senal fotoacustica una onda acustica que se desplaza por dicha muestra; e

incluyendo dicho sensor acustico (260) un diafragma (58) en contacto de fluido con dicha muestra de ensayo en dicha camara (52) de ensayo, desviandose dicho diafragma (58) cuando dicha onda acustica lo golpea.

12. Un sistema (50) de deteccion de uno o mas analitos en un fluido corporal que comprende:

una camara (52) de ensayo que tiene al menos una pared lateral (54, 56) y que esta configurada para contener al menos una porcion de una muestra de fluido corporal;

una fuente de energfa electromagnetica configurada para dirigir una fuente de energfa al interior de dicha camara (52) de ensayo a traves de dicha al menos una pared lateral (54, 56) y para inducir una expansion termoelastica en dichos uno o mas analitos, siendo dicha camara (52) de ensayo transparente y

comprendiendo dicha fuente de energfa electromagnetica un laser (110) de impulsos que tiene un haz que ilumina toda la seccion transversal de dicha muestra de ensayo segun atraviesa dicha camara (52) de ensayo; y un sensor configurado para detectar dicha expansion termoelastica en dicha muestra de fluido corporal en dicha camara (52) de ensayo.

13. El sistema (50) definido por la reivindicacion 12 en el que dicho sensor comprende un sensor acustico (260) que tiene un diafragma (58) que es desviado cuando una onda acustica generada por dicha expansion termoelastica lo golpea, estando dispuesto dicho sensor acustico (260) sobre dicha camara (52) de ensayo.

14. El sistema (50) definido por la reivindicacion 13 en el que dicho diafragma (58) del sensor acustico comprende un diafragma piezoelectrico en contacto de fluido con dicha muestra de ensayo, comprendiendo ademas dicho sensor acustico (260) electrodos primero y segundo (60, 64) dispuestos alrededor de lados opuestos de dicho diafragma piezoelectrico.

15. El sistema (50) definido por la reivindicacion 12 en el que dicha fuente de energfa electromagnetica comprende un laser (110) pulsante a una frecuencia mas rapida que un milisegundo.

16. El sistema (50) definido por la reivindicacion 11 y que, ademas, comprende:

un deposito (104), un conducto (68) y una bomba (102), comunicandose dicho deposito (104) con dicha camara (52) de ensayo a traves de dicho conducto (68), estando dispuesta dicha bomba (102) a lo largo de dicho conducto (68) para llevar dicha muestra de dicho deposito (104) a dicha camara (52) de ensayo; y

comprendiendo dicha camara (52) de ensayo al menos unas paredes laterales primera y segunda (54, 56), siendo dicha primera pared lateral (54) mas estrecha que dicha segunda pared lateral (56), estando dirigido dicho laser (110) de impulsos a traves de dicha primera pared lateral (54) y estando dispuesto dicho sensor en dicha segunda pared lateral (56).