JPH02108968A - 免疫分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、免疫分析方法に係り、特に光音響分光法を利
用して試料中の免疫成分を分析測定するに好適な免疫分
析方法に関する。

〔従来の技術〕

生体液試料中に含まれる抗原又は抗体を高感度に測定す
る方法として光音響分光法を利用した免疫分析法が最近
注目されるようになった。この方法は１例えば特開昭６
３−４４１４９号に記載されている。この従来技術は、
液体中で粒子状の抗原抗体反応複合物を生成させ、その
液を光音響セルに導入して測定している。この場合、光
音響分光法の感度の粒径依存性を利用し、分析対象の粒
子状物質の大きさに一致するか、もしくは、その近傍の
波長の励起光を使用することにより、光音響分光装置の
感度を分析対象の粒子状物質に対して高感度にし、該粒
子状物質を選択的に検出・定量する。

〔発明が解決しようとする課題〕

上述の従来技術によれば、抗原抗体反応複合物粒子を他
の粒子の影響が小さい状態で検出することが可能である
。しかし、リューマチ因子やガン特異抗原等の濃度は極
めて低いので、−層の高感度測定が望まれる。

本発明は、従来の方法が抗原抗体反応複合物を含む液を
そのまま光音響セルへ導いている点に着目してなされた
もので、その目的は、−層の高感度測定ができる免疫分
析方法を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は１反応固相上に抗原抗体複合物を生成させ、こ
の反応同相を光音響セルに装填し、この光音響セル内で
圧力媒体として気体を用いて光音響分光側定を行うこと
を特徴とする。さらには、第１の抗体を担持した担体を
反応同相に吸着させること、反応固相上で試料中の抗原
と上記第１の抗体を反応させ反応固相上に抗原抗体複合
物を形成させること、有色の標識物質で標識された第２
の抗体を上記反応固相上に固定化すること、この反応固
相上の液を除去し反応固相を光音響セルへ導くこと、お
よびその後反応固相上の反応生成物の光音響分光側定を
行うことを特徴とする。

〔作用〕

光音響分光法では、まず光を吸収することが不可欠であ
る。物質が光を吸収するということは、物質が光エネル
ギーを取りこみ、物質を構成している原子あるいは分子
がエネルギーが富んだ状態に上がることを意味する。こ
の原子あるいは分子がとりこんだ光エネルギーが、熱を
放出して元の状態に戻る過程を測定する分光法が光音響
分光法である。放出された熱により音響波が発生するの
で、この光音響信号を検出する。

光音響分光計における主要な構成要素は、光源。

チョッパー、光音響セル、音響センサー、増幅器。

信号処理系である。光源から出た光は、分光器を通った
のちにチョッパーにより断続光にされ、光音響セルに入
射する。セル内では試料が断続光を吸収する結果、光音
響信号が発生する。これをマイクロフォンなどの音響セ
ンサーを用いて検出する。

本発明では、測定すべき反応固相を、気体を封入した気
密な光音響セル内に置いて、試料中に光吸収の結果発生
する熱の気体へのリークを気体の周期的な圧力変化とし
て内蔵の高感度マイクロフォンで検出する。

試料に入射光を照射したとき発生する圧力変化（光音響
信号）は、マイクロフォンまたは圧電素子により電気信
号（電圧の発生）に変換される。

あらかじめ濃度既知の抗原を用いて抗原濃度と該電気信
号を変えられた光音響信号との間で検量線を作成してお
くことにより、抗原抗体反応を光音響分光法を用いて定
量的に分析することができ、これにより目的の抗原また
は抗体を定量することができる。

本発明の望ましい実施例によれば、従来実用的にはＲＩ
Ａによって初めて測定可能であった微量成分を、高感度
、迅速、簡便に定量的に測定できる。

標準物質の種類を複数種使用することにより。

同時に複数の測定対象物質を測定することも可能である
。

〔実施例〕

測定対象物質を含む試料と、該測定物質に特異的に反応
する物質（第１抗体）を固定化した担体と、該第１抗体
と、該第１抗体に特異的に反応する物質（第２抗体）を
標識物質で標識したものを反応させたのち、光音響分光
法により測定することにより達成される。この場合には
、標識物質で標識する第２抗体は、測定対象物質に特異
的に反応する必要はなく、第１抗体に特異的に反応すれ
ばよい。すなわち、たとえば、測定対象物質がＡＦＰ、
第１抗体が兎抗ＡＦＰ抗体であるとき、第２抗体は羊抗
兎ＩｇＧ抗体であればよい。このため、高価な抗体を大
量に使用しなくてもよく、試薬コスト的にみて優れた方
法であるといえる。

標識物質は、該測定物質あるいは該測定物質に特異的に
反応する物質である抗体に結合させることができる色素
、蛍光物質発光物質などを好適に用いることができる。

また、リポソームなどの小胞体に色素や蛍光物質を封入
あるいは結合、吸着させたものや、ラテックス粒子のよ
うな担体に色素や蛍光物質などを結合、吸着させたもの
あるいは、無色粒子や、担体自体が有色ラテックスのよ
うに１［されているもの等を用いることができる。

固相担体としては、ガラスピーズや試験管などの反応管
やマイクロプレート類、あるいはドライケミストリーの
分野で繁用されているペーパーでもよいし、ろ過材やナ
イロンフィルム、ポリエステルフィルムなどのフィルム
類でもよい。また、アガロース、セファロース、シリカ
ゲルなどの充てん剤であってもよい。

例えば、反応固相として、ＴＬＣ（薄層クロマトグラフ
ィー）のプレートを用いる例を次に述べる。光音響分光
法による固体試料すなわち反応固相の測定では、表面近
傍に存在する物質を比較的高感度に測定することができ
る。これは１例えば気体を圧力媒体としてマイクロフォ
ンで光音響信号を検出する場合は、信号に寄与するのは
固体試料の表面近傍の領域だけであるので、吸着物など
固体表面の近傍に存在する物質が高感度に検出できるた
めである。

基質物質である反応同相自体がほとんど吸収をもたず反
射率の大きい物質の場合はさらにこの傾向は著しいもの
となる。ＴＬＣでは一般に吸着材としてシリカゲル、ア
ルミナなどがよく用いられる。これらの物質は光学的に
は不透明であり、また、粉末状をしているため１通常の
透過法や反射法などの光学的手法により吸着物質である
反応標識物質を定量することは、散乱光の影響をうけて
測定精度が悪い上に、測定感度も不十分であった。

このため、通常は、展開後のＴＬＣプレートに紫外光を
照射したり、ヨウ素ガスをかけるなどして、スポットの
位置をまず確認し、次にそのスポットをかき取り、適当
な溶媒で、吸着物質を抽出したのちに吸収スペクトルな
どを測定して定量、あるいは同定している。このため非
常に時間を要した。

しかし、光音響分光法によれば、吸着状態のまま、スポ
ットの位置決めおよび吸着物質の定量。

同定ができるのである。このとき、吸着材に由来するバ
ックグラウンド信号が検出限界に影響するため、吸着物
質すなわち′８Ｍ識物質を有色とすることによりＳ／Ｎ
を大幅に向上させることができる。

従来法である吸光度測定法と比較すると１反応固相に標
識物質を吸着させた状態で２桁以上の高感度測定が可能
となる。

本発明の一実施例を説明する。

第１図に一実施例における抗原抗体反応複合物の分析装
置例の既略構成を示す。

励起光源１７は出力１０Ｗのアルゴンレーザであり、ア
ルゴンレーザ光源からのレーザ光２５は、４８８ｎｍ、
５１４．５ａｍ及び紫外から可視領域に渡る幾つかの波
長の発振線であり、分析対象の反応生成物の大きさに合
わせ、適切な色素レーザ１８内の色素を励音（ポンピン
グ）する。例えば、反応生成物の大きさが０．６〜・０
．７μｍである場合には、アルゴンレーザ光源１７から
の励起光２５の波長を５１４．５ａｍ、色素レーザ１８
の色素にローダミンを使用する。分析対象の大きさに応
じて波長変換されたレーザ光２７は、その一部がハーフ
ミラ−５ａにより分岐されて反射鏡５ｃを介して入射さ
れた波長モニタ２８により、その波長を確認する。残り
のレーザ光は回転ブレード式の光チョッパから成る光強
度変調器１９により、周期的な矩形波に強度変調され、
励起光２６となる。励起光２６はセル２３に入射され。

セル内の試料に光音響信号を発生させる。

セル２３で発生した光音響信号３４は、圧電素子で検出
され、ロックインアンプ３１により、光強度変調器１９
のドライバ２９から出力される光強度変調に同期した参
照信号３５を参照し、増幅される。励起光２６の一部は
ハーフミラ−５ｂにより、その一部を分岐され、光強度
モニタ３０により、その強度をモニタされる。ロックイ
ンアンプ３１から、光音響信号の強度と位相に関する情
報が、また、波長モニタ２８２強度変調器のドライバ２
９、及び、光強度モニタ３０からは、励起光の波長、変
調周波数及び強度に関する情報が、データ処理装置３２
に入力される。データ処理装置３２は、測定条件に関す
るパラメータ、例えば励起光波長や変調周波数などの情
報を表示装置３３に表示させたり、また、測定結果をデ
ータ処理し反応生成物の検量線や未知濃度試料の定量結
果などを表示装置３３に表示させる。

血しよう等の生体試料は、試料ピペッタ３６によって反
応装置２１内の反応同相ディスク上に添加される。また
、抗原抗体反応複合物を生成させるだめの試薬液は、試
薬注入器２２により添加される０反応装置２１において
免疫反応生成物の形成された反応固相は、反応固相移送
装置２０によって光音響セル２３内へ挿入される。セル
２３内は空気が入った状態で密封される。セル２３は光
入射窓を備えたガラス容器からなり、内部にマイクロフ
ォンが設置されている。セル２３に設けられた開閉可能
なふたは、反応固相が内部に収納されると閉じられて密
閉される。

次に第１図の分析装置を用いて血清試料を測定した例を
説明する。

測定例１ ホルダーに液体をろ過し得る多孔性物質で形成された反
応固相ディスクをセットしておく。抗ヒトＨＣＧ抗体を
結合させたセルロース膜を多孔性の反応固相ディスクに
吸着させた後、このディスクを乗せたホルダーを反応装
置２１に載置する。

試料ピペッタ３６により血清試料１００μＱを反応固相
ディスク上に添加する。５分後ＦＩＴＣで標識した抗ヒ
トＨＣＧ抗体溶液１００μＱを反応固相ディスク上に添
加し、余分の水分を多孔性物質に吸水させる。室温で５
分間放置した後、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，８）を反
応同相ディスク上に添加する。これにより未反応の過剰
のＦＩＴＣ標識抗ヒトＨＣＧ抗体および水分を多孔性物
質内に吸収させてセルロース膜面から除く。反応固相デ
ィスクのセルロース膜上には抗原抗体反応複合物が生成
されている。

次に反応装置２１内の反応固相を反応固相移送装置２ｏ
によって光音響セル２３内へ移送し、この光音響セルに
ふたをして密閉する。続いて光源１７からのレーザ光を
セル２３内に入射させ、セルロース膜面上に形成されて
いる抗原抗体反応複合物に基づく光音響信号を測定する
。このようにして試料中のＨＣＧを測定する場合の検量
線の例を第２図に示す。

測定例２ ろ紙（ＴｏｙｏＮａ５１）を１×２１に切り抜きペーパ
ーディスクとした。約１ｇのペーパーディスクを２０ｍ
０の５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ１２，１）に懸濁
して１０ｍｕの水を加えた。

スターターで撹拌しながら１０ｍＱのＢ　ｒＣＮ溶液（
０，１ｇ／Ｑ）を２分間はどで除々に加えて、さらに６
分間反応させた。反応は４℃で行なった。

反応後、直ちに水冷した大量の０．００５ＭＮａＨＣＣ
）ａ溶液で洗浄し、５ｍｇの精製抗ヒトＡＦＰ抗体およ
び精製抗ヒトＣＥＡ抗体と室温で８時間反応させた。さ
らに、１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８，０）と４℃で一
晩反応させたのち、０　、５　Ｍ　Ｎ　ａ　ＨＣＯａ　
、　０　、１　Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，０）、０．０１
５Ｍ　ＰＢＳ（ｐ！（７，２）で順次洗浄して１．５ｍ
ＱＰＢＳ　（ｐＨ７，２）中で凍結乾燥した。

抗ヒトＡＦＰ抗体および抗ヒトＣＥＡ抗体が固定化され
た反応固相ディスクを、反応装置２１内に配設した後、
この反応固相ディスクに被検血清試料１００μＱを加え
る。室温で１０分間免疫反応をさせた後、０．９％Ｎａ
ＣＱ　　の１ｍＱによって反応同相ディスクを２回洗浄
し洗浄液を除去する。

試薬として、抗ヒトＡＦＰ抗体を結合させた黄色ラテッ
クス粒子を懸濁させた第１の試薬液および抗ヒトＣＥＡ
抗体を結合させた青色ラテックス粒子を懸濁させた第２
の試薬液を準備する。反応同相ディスクに第１試薬液と
第２試薬液をそれぞれ２５０μＱ加え、室温で１０分間
反応させる。

その後１ｍＱの０．９％ＮａＣＱ　　で２回洗浄する。

洗浄液を除去した後の反応同相を反応装置２１から取り
出して光音響セル２３内に位置づける。

セル２３を密閉した後、反応同相にレーザ光を照射して
光音響信号を測定する。このような測定方法によれば、
１枚の反応同相ディスクで試料中のＡＦＰとＣＥＡを同
時定量することができる。この測定例で使用されたＡＦ
ＰとＣＥＡの同時定量用検量線の例を第３図に示す。

測定例３ 反応同相ディスクとしてガラス片を用いる。反応同相デ
ィスクには、あらかじめ抗ＴＳＨ抗体をガラス壁に結合
させておく。この反応固相を収容した容器を反応装置２
１に設置する。試料ピペッタ３６によりＴＳＨを含む血
清試料２０μＱを容器に加え、３７℃にて５分間反応固
相ディスク上の抗ＴＳＨ抗体と反応させる。

次に試薬注入器２２により、羊抗兎ＩｇＧ抗体結合赤色
ラテックス粒子分散液１００μＱを加え、３７℃にて５
分間反応させる。その後未反応液を除去し、０．０５Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７，５）を用いて洗浄し洗浄液を排
出する。洗浄済の反応同相ディスクを光音響セル２３内
に導入し、セル２３を密閉する。レーザ光を反応固相デ
ィスクに照射し光音響信号を測定する。Ｔ　Ｓ　Ｈ定量
用検量線例を第４図に示す。

次に本発明の他の実施例を第５図を参照して説明する。

第５図において、各測定項目毎に濃度の異なる複数個の
標準物質を設置したサンプルテーブル１０が設けられて
いる。複数個の標準物質は測定項目毎に連続してサンプ
ルテーブル１０上に並べることができる。また、反応テ
ーブル１２１は、その円周上に複数種類の項目の分析を
するための複数種類の抗体を各々結合させた反応固相を
収容した反応容器１２２を有し、回転自在に構成されて
いる。また、標準物質および被検試料の移送は、サンプ
リングプローブ４１によって行われ、試料の分注は、移
動分注器３７によって行われる。

複数種類、複数個の反応固相を収容した反応容器１２２
は、測定項目毎に連続して反応テーブル１２１上に並べ
ることができるよう構成され、対応する反応容器へは反
応同相供給装置４２により必要な反応固相が供給される
。反応容器列上には排液袋＠１２９および洗浄装置１２
４が配置されている。光音響信号測定装置４９は第１図
に示したものと同様である。気密型光音響セルは、内部
に置かれる反応固相に光源１７の光を照射した結果生じ
る圧力変化をマイクロフォンで検出できるように構成さ
れている。

制御装置は、マルチプレクサ５３．Ａ／Ｄ変換器５４．
リード・オンリ・メモリ　（以下ＲＯＭと称する）、ラ
ンダム・アクセス・メモリ（以下ＲＡＭと称する）、プ
リンタ５５．操作パネル５２、機構部能動回路１３５を
備えているが、Ａ／Ｄ変換器５４はさらに、インターフ
ェイス５０を経て中央処理装置５１に接続されている。

この中央処理装置５１は、機構系を含めた装置全体の制
御と、検量線作成や濃度演算などのデータ処理全般を行
なうものでマイクロコンピュータが使用される。

次に、第５図図示実施例の動作について説明する。

まず、複数項目の反応固相が反応同相供給装置４２にセ
ットされると項目毎に連続して必要数の反応同相が反応
テーブル１２１上の反応容器１２２へ供給される。次に
、ホルモン、がんマーカ、感染症関連物質等を含む被測
定血清（試料）を収容した試料容器４４がサンプルテー
ブル１０上のサンプリング位置に供給されると、ピペッ
タ４０の可動アーム１２に保持されているプローブ４１
の先端が上記試料容器中に浸入され、血清の一定量を吸
入し、プローブ４１内に保持する。その後、プローブ４
１は、反応テーブル１２１の吐出位置４５まで移動し、
吐出位置４５に移送されている測定する項目に対応した
種類の反応同相を含む反応容器１２２内にプローブ４１
で保持していた血清を吐出する。

このサンプリング動作が終ると反応テーブル１２１は反
時計方向に反応容器１ピッチ分だけ進んだ位置に来て停
止する。例えば１反応テーブル１２１の回転および停止
している間の時間を２０秒とすると、２０秒を１サイク
ルとして上記の動作をくり返す。上記サイクルが進むに
つれてサンプリングされた特定の被測定試料は反応テー
ブル１２１が停止している状態での位置が反応容器１ピ
ッチ分ずつ順次反時計方向に進む。移動分注器３７から
の試薬の吐出は、試料の入った反応容器１２２が反応テ
ーブル１２１上の吐出位置４７に停止した状態でなされ
る。分注器３７は、試薬容器列３９の中から必要な試薬
液を選択して反応容器へ吐出する。特定の被測定試料に
ついて見ると、吐出位置４５で添加された試料と反応容
器内の反応同相が第１の反応を開始し、吐出位置４７で
添加された試薬により第２の反応が開始される。

反応が進行した反応容器１２２が洗浄位置４８に停止し
たとき洗浄装置１２４によって洗浄用試薬の吐出と吸引
が繰り返され１反応固相が反応容器内にとどめられたま
ま洗浄される。反応テーブル１２１の回転が進行して停
止位置４６まで進むと、反応容器内の反応同相だけが光
音響セル内に取り込まれ、光音響装置４９により光音響
信号の測定がなされ、光音響装置４９の出力は、マルチ
プレクサ５３により現在必要な測定波長の信号が選択さ
れ、Ａ／Ｄ変換器５４により中央処理装置５１に取り込
まれて、ＲＡＭに記憶される。中央処理装置はＲＯＭの
プログラムに従って作動し。

ＲＡ、　Ｍ内の測定データを抽出して演算処理を行なう
。反応テーブル１２１は恒温槽１２３内に設置すること
により反応容器内の反応は恒温下で進行させ得る。

検量線作成に必要である１項目あたり例えば５あるいは
６種類の標準物質は、サンプルテーブル１０上に連続し
て並べられているため、ある特定項目の濃度の異なる複
数個の標準物質は、自動的に連続して複数回ずつ（例え
ば２回ずつ）サンプリングプローブ４１によって反応容
器１２２に移送される。濃度に対して直線関係のない物
質について検量線を作成する場合には、濃度の異なる標
準物質を複数回ずつサンプリングして測定することは必
須であり、本装置ではこれが可能である。

これらの測定データは項目毎に１まとめにして、検量線
の作成に供せられる。測定結果は、プリンタ５５および
ＣＲＴ５６に表示される。

〔発明の効果〕

本発明によれば、これまで測定できなかった低濃度の微
量物質を高感度に測定することができるという効果がも
たらされる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一実施例で使用した光音響分析装置の
概略構成図、第２図はＨＣＧ測定用検量線例を示す図、
第３図はＡＦＰとＣＥＡの同時測定のための検量線例を
示す図、第４図はＴＳＨ測定用検量線例を示す図、第５
図は本発明の他の実施例を行うための分析装置の概略構
成を示す図である。 １０・・・サンプルテーブル、１７・・・レーザ光源、
２１・・・反応装置、２３・・・光音響セル、３２・・
・データ処理装置、４２・・・反応固相供給装置、４９
・・・光音響測定装置、５１・・・中央処理装置、５２
・・・操作パネル、１２１・・・反応テーブル、１２４
・・・洗ｉ＋装置。 ＨＣｑ　　α［廖） ＨＣｑＰｔ量腺 ＦＦ ＣＥＡのヂ計量様 第４ｍ Ｔｓｓ　＃ｆ威 慕 図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、第１の抗体を担持した担体を反応固相に吸着させる
   こと、上記反応固相上で試料中の抗原と上記第１の抗体
   を反応させ上記反応固相上に抗原抗体複合物を形成させ
   ること、有色の標識物質で標識された第２の抗体を上記
   反応固相上に固定化すること、上記反応固相上の液を除
   去しこの反応固相を光音響セルへ導くこと、および上記
   反応固相上の反応生成物の光音響分光側定を行うことを
   特徴とする免疫分析方法。 ２、請求項第１項記載の免疫分析方法において、上記標
   識物質は色素、蛍光性物質又は着色粒子からなることを
   特徴とする免疫分析方法。 ３、請求項第１項記載の免疫分析方法において、上記標
   識物質は色素又は蛍光性物質を内胞した小胞体からなる
   ことを特徴とする免疫分析方法。 ４、請求項第１項記載の免疫分析方法において、上記標
   識物質の種類が複数あることを特徴とする免疫分析方法
   。 ５、担体上に固定化されている第１の抗体と試料中の被
   検抗原を反応させ、上記担体上に抗原抗体複合物を形成
   させること、上記第１の抗体に特異的に反応する第２の
   抗体を有色物質で標識しておき、この標識第２抗体と上
   記担体上の第１の抗体を反応させること、その後上記担
   体を光音響セルへ導入して光音響分光測定を行うことを
   特徴とする免疫分析方法。 ６、反応固相上に抗原抗体複合物を生成させ、この反応
   固相を光音響セルに装填し、上記光音響セル内で圧力媒
   体として気体を用いて光音響分光測定を行うことを特徴
   とする免疫分析方法。