JPH01187459A

JPH01187459A - 免疫分析方法

Info

Publication number: JPH01187459A
Application number: JP63011795A
Authority: JP
Inventors: Kyoko Imai; 恭子今井; Yasushi Nomura; 靖野村; Hiroko Makiguchi; 牧口　浩子
Original assignee: Hitachi Instruments Engineering Co Ltd; Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Instruments Engineering Co Ltd; Hitachi Ltd
Priority date: 1988-01-21
Filing date: 1988-01-21
Publication date: 1989-07-26

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、免疫分析方法に係わり、特に光音響分光法に
より試料中の成分を定量するに好適な免疫分析方法に関
する。

〔従来の技術〕

抗原、抗体、ハブテンなどの試料中の測定対象物質をこ
れらと特異的に反応する受容体（抗体あるいは抗原）と
反応させて、生成する免疫複合体による凝集パターンや
濁度あるいは光散乱の強度を測定して、測定対象物質の
濃度を求める方法は従来より知られている。しかしなが
ら、これらの方法は、試料中の東雑成分の影響をうけや
すい上に、測定感度の面からみても問題があり、測定対
象成分の濃度が低い場合（１０−’Ｍ以下）には測定で
きない状況にある。

このような低濃度の物質を測定するために従来から用い
られている方法は、ラジオアイソトープを標識として用
いるＲＩＡ法である。しかしラジオアイソトープの取扱
いが面倒であることから、アイソトープの代わりに螢光
物質や酵素を標識とする方法が開発された。これらの方
法には一長一短がある。定量性に優れた測定方法のうち
、操作性のよい均一反応系の方法では測定感度が不十分
であるし、不均一反応系を用いる測定方法は感度は比較
的高いが結果が得られるまでに長時間を要するため、通
常の臨床検査の場においては不便なものであった。不均
一反応系のうち、標識抗原と抗体の結合物（ＢＯＵＮＤ
またはＢ）と、遊離の状態（ＦＲＥＥまたはＦ）で残っ
た過剰の標識抗原とを分離するいわゆるＢ／Ｆ分離方法
のなかでは、液相中では沈降してしまう大粒径の固相担
体やあるいは反応管壁を同相として反応を進行させ、そ
の後洗浄して遊離標識抗原を除去してＢの活性を測定す
る方法が広く使われている（例えば酵素免疫測定方法具
かく書院１９７８．１２第１２項〜１８項）の固相担体
の扱いが容易であるために、この方法が近年普及してき
ている。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしこれらの固相法は反応の効率が極めて悪いために
、測定結果を得るまでに数時間を要する。

また、測定感度においても、従来の検知手段である吸光
度あるいは螢光強度の検出限界とのかねあいからＩＯＥ
１２Ｍ程度の測定感度を達成するのが限界であった。す
なわち、この測定検出感度よりもさらに低濃度に存在す
る試料成分は、その濃度はもとより存在の有無さえも確
認できなかったという問題があった。

本発明の目的は、測定時間を短縮できて、しかも測定感
度を高めることができる免疫分析方法を提供することに
ある。

〔課題を解決するための手段〕

上記目的は、試料中の目的物質と受容体との複合体の検
出手段として、吸光度、散乱強度及び螢光強度の測定の
代わりに、光音響分光法を用いることにより達成される
。

すなわち、本発明は、試料中の目的物質と、該目的物質
と特異的に結合する受容体とを反応させ、光音響分光法
により、前記目的物質と受容体との複合体の活性を測定
し、該測定値から前記試料中の目的物質量を求めること
を特徴とする免疫分析方法である。

〔作用〕

上記本発明によれば測定対象物質景に応じた光音響信号
を検出でき、この光音響信号を処理することにより、酵
素免疫分析に基づく測定目的物質の定量を行うことがで
きるため、測定感度が向上する。

〔実施例〕

次に、本発明の実施例について説明する。

受容体として、試料中の目的成分に特異的結合能を有す
る抗原又は抗体を用いる。

本実施例では、抗原−抗体反応の活性、すなわち、目的
成分の含有量を求めるファクタとして、微粒子を用いる
。すなわち、反応固相上に抗原−抗体反応を起こさせ、
抗原又は抗体に微小粒子をあらかじめ結合させおき、抗
原−抗体反応により結合した微小粒子を反応固相から遊
離させ、−の微小粒子を光音響分光法により測定し、目
的成分の定量を行なう。

本発明の望ましい実施例では、第１の抗体を結合させた
第１の反応固相と試料とを反応させ、第１の抗体に試料
中の測定対象物質（抗原）を結合させる。こののちに、
第２の固相である不溶性微小粒子が結合した抗体を反応
液に加えて抗原抗体反応を行なわせ、そののちに洗浄に
より、抗原と反応しなかった過剰の不溶性微粒子を反応
系がら除く。次に、第１の固相から、抗原と結合した不
溶性微粒子を遊離させる。この遊離液を光音響セルに導
き、入射光を照射する。試料内に発生する圧力変化（光
音響信号）は、圧電セラミックスにより電気信号（電圧
の発生）に変換される。あらかじめ濃度既知の抗原をも
ちいて、抗原濃度と光音響信号との間で検量線を作成し
ておくことにより、抗原抗体反応を光音響分光法を用い
て定量的に測定し、これにより目的の抗原又は抗体を定
量することができる。試料成分の濃度に応じて第１の反
応同相上から遊離する不溶性担体微小粒子数が変化する
ため、光音響信号強度は、試料成分濃度に対応すること
になる。

本実施例によれば、従来実用的には、ＲＩＡによって始
めて測定可能であったような微量成分を、それよりもは
るかに高感度で迅速に定量的に測定できる。

本発明に使用する微小粒子は、平均粒径が０゜０１μｍ
から１００μｍのものが目的にかない、特に好ましくは
、平均粒径が０．１μｍから１０μｍの不活性微小粒子
を同相として用いるのがよい。このような微小粒子を測
定試料と反応させると反応効率が非常によくなるため測
定が迅速に進行する。試料中の測定目的物質を、本発明
の方法により高感度、迅速に定量するためには、例えば
ラテックス粒子のような不活性担体微小粒子に担持させ
た抗体と高濃度で反応する測定試料とを接触させること
が望ましい。種々の粒子径を有する微小粒子を用いて、
ヒトＩｇＧ定量のために抗原抗体反応をさせたところ、
担体の平均粒径１００μｍ以下のものを用いると反応時
間が１時間以内に、抗原であるヒトＩｇＧを定量的に検
出できることがわかった。また、特に１０μｍ以下の不
溶性微小粒子を用いると反応時間１５分以内に定量が可
能であることがわかった。測定試料の分析にあたり、処
理スピードの点から許容される反応時間は、１時間、好
ましくは１５分以内であることから平均粒径１０μｍ以
下の不活性担体粒子を使用することが好ましいといえる
。また、測定感度とＳ／Ｎに着目して比較すると、平均
粒径０．０１μｍ以上、好ましくは０．１μｍ以上の粒
子径が必要であることが判明した。

以上の結果によれば、不活性微小粒子は、平均粒子径が
１００μｍ以下が好ましく、特に平均粒径が０．１μｍ
から１０μｍの担体が好適であることが判明した。

不活性の微小粒子としては、生体液の測定を行なうとき
に用いられる液体媒体に実質的に不溶で前記平均粒径を
有する有機高分子物質の微粒子、例えば、ポリスチレン
のような有機高分子のラテックス、細胞、あるいは例え
ばシリカ、シリカアルミナ、アルミナのような無機酸化
物、その他鉱物粉末、金属等が用いられる。

抗原−抗体反応方法としては、固相を用いたヘテロジニ
アス法であれば競合法であっても非競合法のいずれでも
よい９上記本実施例の他の反応方法としては、次のものがある
。

反応方法の例としては■測定対象物質を含む試料と、該
物質をあらかじめ担持させた微小粒子と、該物質に体す
る抗体を担持させた反応同相とを反応させる方法、■測
定対象物質を含む試料と、該物質に対する抗体を担持さ
せた微小粒子と、該物質をあらかじめ担持させた反応固
相とを反応させ一７＝る方法、■測定対象物質を含む試料と、該物質をあらか
じめ担持させた微小粒子と、該物質に対する抗体と、該
抗体に対する第２の抗体を担持させた反応同相とを反応
させる方法、■測定対象物質を含む試料と、該物質に対
する抗体を担持させた微小粒子を反応させたのち該物質
に対する抗体を担持させた反応同相と反応させる方法、
などがある。

反応固相から、抗原抗体反応によって結合した微小粒子
を遊離させる方法としては、水酸化ナトリウムを使用す
ればよい。その他チオシアン酸ナトリウムのようなカオ
トロピックイオンを用いる等種々の方法を使用すること
ができる。

第１図は、本発明に係る免疫分析方法を実施するための
装置の一実施例を示した系統構成図である。まず、本実
施例の構成について説明する。

複数のサンプルが貯留された自動サンプリング装置１に
は、サンプリングノズル２が接続されており、このサン
プリングノズル２は、反応容器４に接続されている。反
応容器４の内壁には、抗体３が固定されている。反応容
器４内には、反応液１１が貯留されている。この反応容
器４は、緩衝液ボトル５．微小粒子が結合した抗体液ボ
トル８゜微小粒子と抗体とを遊離する遊離液ボトル９．
とそれぞれチューブによって接続されている。反応容器
４は、インキベータ６内に保持されている。

上記反応容器４は、配管３ｏにより光音響セル１２と接
続されている。さらに、反応容器４は、配管によりドレ
ンボトル７と接続されており、このドレンボトル７は、
上記光音響セル１２と接続されている。

光音響セル１２には、圧力センサ１６が設けられている
。この圧力センサ１６は、アンプ１７に接続されている
。アンプ１７は、データ処理部１８と発信器１９とそれ
ぞれ接続されている。

一方、レーザ光源１３が設けられており、さらにチョッ
パ１４およびレンズ１５が設けられている。チョッパ１
４は、前記発信器１９に接続されている。

次に、本実施例の動作について説明する。自動サンプリ
ング装置１に設けられた各サンプルは、サンプリングノ
ズル２により吸引され、予め抗体３が内壁に固定化され
た反応容器４内に吐出される。緩衝液５も反応容器４内
に吐出されたのち、反応容器４はシェーカインキベータ
６により保温されつつインキベーションされる。その後
、反応容器４に緩衝液５を加え、反応容器同相を洗浄し
、ドレン７に吸引したのち、系外に排出される。

次に抗体液８を反応容器４に加え、再びインキベーショ
ンを行なう。その後再び緩衝液５を加え、反応容器固相
を洗浄し、ドレン７に排出させる。

次いで、微小粒子遊離液９を加え、インキベーションす
る。

次に反応液１１を光音響セル１２に吸引する。

レーザ光源１３から出た光は、発信器１９の信号を受け
たチョッパ１４により断続光に変化され、レンズ１５を
通って光音響セル１２に照射される。

セル内では、試料が断続光を吸収した結果、光音響信号
を発生し、その光音響信号を圧力センサ１６により検出
する。検出された信号は、アンプ１７によりＳ／Ｈの向
上がなされ、データ処理部１８へ取り込まれ出力される
。

次に、本実施例における光音響分光法の詳細について説
明する。反応液中の物質が光を吸収すると、物質が光エ
ネルギを取り込み、物質を構成している原子あるいは分
子が励起される。この原子あるいは分子が取り込んだ光
エネルギにより、基定状態に戻る際に、エネルギ（螢光
、可視光、熱）を放出する。この過程で音響波が発生す
る。この音響信号をアンプ１７で増幅し、データ処理部
１８に送り検出される。光音響信号は、圧力センサ１６
、例えばマイクロホンなどの音響センサにより検出され
る。臨床検査における検体、すなわち生体試料は、血液
、血清など通常液体である。これら液体試料の光音響分
光の場合は、液体試料用の光音響セルを用いる。すなわ
ち、光音響セル１２は、試料を気体が封入された小さい
気密容器に入れ、試料中に発生した熱を気体の圧力変化
に変え、高感度マイクロホンで検出する。また、試料自
体を圧力媒体とし、試料中に発生した熱を圧力変化に変
えて、ジルコン、チタン酸鉛系セラミックス（ＰＴＺ）
などの圧電素子を検出器として用いても、高感度測定が
可能となる。

光源１３から照射された光は、窓材やセルの内壁面で入
射光やその散乱光が吸収されると、ここからも光音響信
号が発生する。したがって、特に吸収係数の小さな光学
的に希薄な試料の測定のときには、バックグラウンド雑
音除去に注意する必要がある。また、試料以外の物質に
起因するバックグラウンド信号も、光音響信号から差し
引く必要がある。このような場合には、測定を２回に分
け、試料があるときとないときについて測定し、その差
をデータ処理部１８で求めれば、試料のみに起因する光
音響スペクトルを得ることができる。

光源の強度が時間的に安定していないときばかりでなく
、異なる２つの試料（片方は対照）について、わずかな
スペクトル差を短時間で測定したいときには、従来のダ
ブルビーム分光光度計と同じ目的で、光音響分光計を２
光束型にし、２光束かた光音響分光計を用いる。

光音響分光法の光源としてレーザを用いると、極めて高
感度な検出法となり、その結果、吸光度で１０−５〜１
０−′オーダに相当する高感度測定が可能となる。

このような光音響分光法では、従来法に比較して次のよ
うな利点がある。

従来、微粒子状物質の分析として知られる方法としては
、懸濁粒子による光散乱を利用する比濁法あるいは凝集
反応法がある。しかし、これらは測定精度や正確さの点
で問題がある。すなわち、懸濁粒子による光散乱の量は
測定波長や粒径分布に大きく依存するためである。試料
中の灸雑物に由来する光散乱の影響も避けられず、高感
度測定を達成するためには試料のブランク測定は必須で
あった。反応液は、種々の粒子径物質の混合液となるた
めに、測定対照物質の測定濃度範囲を広くカバーするほ
ど、低濃度域における測定精度は不十分なものであった
。

これに対して、光音響分光法では、物質による光の吸収
量のみが測定できるので粒径分布の影響を受けにくく、
懸濁溶液の分析に適している。特に、レーザ光音響分光
法は感度の点でも、従来の比濁法より約２桁程度高感度
であるなど優れている。また、抗体に結合させた同相微
小粒子を計測する場合には、測定する粒子径は一定であ
るので、粒径分布の影響がなくなり精度の高い分析がで
きる。

次に具体的な実施例について説明する。

（１）　　抗α−フェトブチイン抗体感作ラテックス試
薬の調製（抗ヒトＡＦＰラテックス試薬）抗ヒトＡＦＰ
抗体のグリシン緩衝液（０，１Ｍ。

ＰＨ６，５）１０ｍｌに、平均粒径が０．２２　μｍの
ポリスチレンラテックス（固形分濃度　１０重量％）１
ｍｌを加えて室温において３時間撹拌したのち、２〜４
℃の冷却下で４０分間１２．ＯＯＯｒｐｍにて遠心した
。得られた沈澱を０．５％牛血清アルブミン、０．１Ｍ
　　ＮａＣ１，２ｍＭ　　ＭｇＣｌ２を含む１０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ＰＨ６，５）に懸濁されて、該感作ラテツ
クス粒子濃度が１重量％の抗ＡＦＰラテックス試薬を調
製した。

（２）　　抗体の同相化ポリスチレンチューブの底に抗ＡＦＰ抗体２００１１１
を入れ、３７℃で１時間保温して、抗体を固相化した。

次に、０．５％ウシ血清アルブミン０゜５ｍｌを加えて
３７℃、３０分放置後、内容物をデカンテーションで除
き、０．５％牛血清アルブミンを含む１０ｍＭリン酸緩
衝液（ＰＨ６，５）１ｎ＋１で洗浄した。

（３）抗原抗体反応試料溶液１００μｌを（２）で作成したチューブに加え
３７℃で１０分間反応させた。次に、（１）で作成した
抗ヒトＡＦＰラテックス試薬１００μｍを加え、３７℃
でさらに１０分間反応させた。こののち、前述のリン酸
緩衝液１ｍｌで２回洗浄して、未反応の抗ヒトＡＦＰラ
テックス担体を除いた。洗浄後のチューブに４Ｎ　　Ｎ
ａＯＨ３００μｍを加えて３７℃５分間反応させること
によりチューブ固相から、ラテックス担体を遊離させた
。

（４）測光方法測定装置の概略構成概略を第２図に示す。なお、第１図
に示したと同一の構成には同一の符号を付す。遊離液を
フロー型の光音響セルに導き、光音響信号を測定した。

光源にはアルゴンイオンレーザを用いた。ヒトＡＦＰ測
定のために作成した検量線を第３図に示す。従来法では
測定することができなかった１　０　ｎ　ｇ　／　ｍ　
ｌ以下の低濃度領域を定量的に測定できていることがわ
かる。

本測定例では、フロー型の光音響セルを用いているため
に、連続的な測光を可能として処理能力を高めることが
できる。

〔発明の効果〕以上説明したように本発明によれば、測定感度が向上す
るとともに、測定時間が短縮される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明に係る免疫分析方法を実施するための
装置の一実施例を示した系統構成図、第２図は、光音響
信号を測定する装置の概略構成図、第３図はＡＦＰ測定
のための検量線である。１・・・自動サンプリング装置、２・・・サンプリング
ツズル、３・・・固定化抗体、４・・・反応容器、５・
・・緩衝液ボトル、６・・・インキュアベータ、７・・
・ドレンボトル、８・・・抗体液ボトル、９・・・遊離
液ボトル、１１・・・反応液、１２・・・光音響セル、
１３・・・レーザ光源、１４・・・チョッパ、１５・・
・レンズ、１６・・・圧力センサ、１７・・・アンプ、
１８・・・データ処理部、１９・・・発振器。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）試料中の目的物質と、該目的物質と特異的に結合
する受容体とを反応させ、光音響分光法により、前記目
的物質と受容体との複合体の活性を測定し、該測定値か
ら前記試料中の目的物質量を求めることを特徴とする免
疫分析方法。