ES2960222T3 - Microdispositivo para la captura in vivo de biomarcadores celulares circulantes - Google Patents
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Abstract
La invención se refiere a un dispositivo (100) para capturar biomarcadores celulares que circulan en un flujo biológico animal o humano, caracterizado porque puede usarse in vivo y porque comprende un medio de filtración (104, 120) previsto para retener dichos biomarcadores celulares. , comprendiendo dichos medios de filtración al menos una abertura pasante (121) con dimensiones adecuadas para retener dichos biomarcadores celulares y estando conectados rígidamente a un soporte (105, 110), teniendo el soporte la forma de una parte hueca. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Microdispositivo para la capturain vivode biomarcadores celulares circulantes
La invención se sitúa en el campo de los dispositivos de captura y toma de muestras de células de interés presentes en la circulación de un flujo biológico tal como la sangre y cuyo análisis tras la captura permite, entre otras cosas, realizar un diagnóstico.
Desde hace algunos años, la tendencia en la identificación y tratamiento de los cánceres ha sido hacia la personalización de la atención, lo que pasa por el estudio detallado de las células tumorales. Por lo general, estas células se extraen mediante biopsia. Sin embargo, una biopsia es invasiva y se han desarrollado métodos alternativos para evitarla.
Los tumores cancerosos liberan células llamadas “Células Tumorales Circulantes” o CTC en el torrente sanguíneo; comúnmente se acepta que este fenómeno aparece en una fase temprana de la enfermedad. El análisis inmunohistoquímico de estas células permite realizar un diagnóstico y proporcionar información, en particular, sobre la agresividad del cáncer. Por lo tanto, las CTC representan un biomarcador de interés en todo momento en el tratamiento de la enfermedad cancerosa, el diagnóstico, el pronóstico y el seguimiento.
Ahora bien, las CTC están presentes en concentraciones extremadamente bajas en la sangre de pacientes con cáncer (alrededor de 1/109 células sanguíneas normales) (Nagrath, S., et al.). Por tanto, el aislamiento de estas células es extremadamente difícil. Se conocen diferentes procedimientos para realizar este aislamiento.
El documento WO 99/16382 A2 describe un catéter de perfusión que tiene una pantalla para capturar materiales embólicos.
El sistema CellSearch® se basa en una inmunodetección. Se basa en la presencia en la superficie de las CTC de EpCAM, un antígeno de membrana específico de las células de origen epitelial. Se centrifuga una muestra de 7,5 ml de sangre y luego se coloca en presencia de nanopartículas ferromagnéticas provistas en su superficie de anticuerpos anti-EpCAM. Luego, las CTC se separan de otras células mediante la aplicación de un campo magnético. El inconveniente de este sistema es doble:
- utiliza una muestra de sangre muy limitada (7,5 ml, lo que corresponde al 0,15 % del volumen sanguíneo total), en la que el número de CTC, dada su baja concentración, es muy bajo.
- no permite detectar las CTC que hayan perdido la proteína EpCAM durante la transición epiteliomesénquima (EMT) (Small, A.C., et al.), lo que representa aproximadamente 2/3 de la población total de estas células; por otro lado, sólo permite detectar células diferenciadas cuya vida es limitada y que no son las más peligrosas.
Se conocen otros enfoques para aislar las CTCin vitrode una muestra de sangre, basados en el tamaño de las CTC. En particular, el sistema ISET (“Isolation by size of Epithelial Tumor Cells” (aislamiento por tamaño de células tumorales epiteliales)) utiliza la filtración de una muestra de sangre tratada (lisis previa de glóbulos rojos) sobre una membrana de policarbonato microperforada; en este sistema, las CTC se endurecen previamente mediante la aplicación de paraformaldehído para que resistan la alta presión que se aplica (Williams, A., et al.).
En general, la sensibilidad de la detecciónin vitrose reduce debido al pequeño volumen de las muestras. De hecho, dada la rareza de las CTC en la sangre, su presencia en una muestra de unos pocos mililitros puede ascender a unas pocas unidades en una fase ya avanzada del cáncer. Su detección en fases mucho más tempranas es de hecho casi imposible.
Por el documento WO 2010/145 824 se conoce el sistema GILUPI® que permite una detecciónin vivo.Este sistema se basa en la funcionalización de una varilla metálica mediante anticuerpos anti-EpCAM introducida en el torrente sanguíneo. Este sistema permite evitar la limitación inherente al pequeño volumen de las muestras, pero sigue estando limitado por el método de captura inmunológica.
La invención tiene como objetivo proponer un dispositivo que permita evitar los inconvenientes relacionados con la toma de muestras y con los métodos inmunológicos para aislar los biomarcadores celulares circulantes. Para ello, propone un dispositivo de captura de biomarcadores celulares circulantes en un flujo biológico animal o humano, tal como se define en la reivindicación 1.
El dispositivo según la invención se basa en las propiedades físicas de los biomarcadores celulares circulantes, su tamaño y su deformabilidad. Las plaquetas tienen unas dimensiones de 2 a 4 pm y los glóbulos rojos tienen unas dimensiones de aproximadamente 7 pm; los glóbulos blancos tienen dimensiones variables, de 7 a 25 pm, pero son muy deformables, lo que les permite circular en los vasos más pequeños. Entre los biomarcadores celulares circulantes, las células tumorales circulantes, en particular, tienen dimensiones variables, comprendidas entre 4 y 25 pm, pero son muy poco deformables. En consecuencia, es posible prever un medio de filtración que retenga los biomarcadores celulares circulantes tales como las CTC y al mismo tiempo deje pasar todos los demás componentes del flujo biológico en condicionesin vivo,en particular de presión y de velocidad. El dispositivo de captura según la invención sólo utiliza las propiedades físicas (tamaño, deformabilidad) de los biomarcadores celulares, por lo que se evita cualquier hipótesis sobre la presencia de proteínas de membrana en la superficie de las CTC. Preferiblemente, el dispositivo no incluye medios para capturar biomarcadores celulares basados en afinidades químicas de los biomarcadores. Los biomarcadores celulares penetran en el hueco del soporte y son retenidos debido a sus propiedades físicas mediante filtración. Esta forma del dispositivo de captura permite limitar el fenómeno de recirculación de los biomarcadores celulares. Por un lado, al presentar el dispositivo de captura un soporte hueco, permite evitar que los biomarcadores se escapen lateralmente. Por otro lado, el dispositivo de captura permite también evitar que los biomarcadores que hayan penetrado en el dispositivo de captura sean arrastrados al exterior de éste por movimientos de flujo internos al mismo. El dispositivo de captura está previsto en particular para limitar los vórtices contrarrotativos.
Ejemplos de flujos biológicos son la sangre, la linfa, la orina...
Ejemplos de biomarcadores celulares circulantes para los que es adecuado el dispositivo de captura son las células estromales, células epiteliales, células fetales circulantes (CFC), células madre, agrupamientos o agregados de células tumorales, células tumorales asociadas con todo tipo de cáncer: células tumorales prostáticas, de cáncer de mama, de colon... y los otros tipos de células: monocitos (macrófagos). Por lo tanto, el dispositivo según la invención es especialmente adecuado para el diagnóstico de diferentes tipos de cáncer, en particular mediante la captura de células tumorales circulantes.
Por biomarcadores celulares se entiende también elementos infestantes de gran tamaño como los parásitos intra o extracelulares o sus huevos. Por ejemplo, la leishmaniasis puede diagnosticarse por la presencia de su forma infectante, el promastigote, con un tamaño de 10 a 15 pm. Del mismo modo, la esquistosomiasis se puede diagnosticar por la presencia de sus huevos con un tamaño de 70 pm a 200 pm.
Preferiblemente, los biomarcadores celulares son células eucariotas. Estas células pueden ser individuales o estar en forma de agregados.
El diagnóstico de otras enfermedades podría considerarse tras la captura de otros biomarcadores celulares circulantes que, en particular, pueden presentar anomalías. El diagnóstico de estados fisiológicos distintos de las enfermedades o la prevención de enfermedades también puede considerarse mediante la captura de biomarcadores celulares circulantes.
El dispositivo de captura según la invención es adecuado para su usoin vivo.En particular, puede estar previsto para colocarlo en el flujo del torrente sanguíneo. Por tanto, el medio de filtración está asociado a un soporte para darle rigidez y/o retenerlo dentro del flujo biológico y permitir su recuperación. El dispositivo de captura puede ser un dispositivo de capturain vivo, in vitrooex vivo.Preferiblemente, el dispositivo de captura es un dispositivoin vivo.Sin embargo, no se descarta que pueda utilizarseex vivooin vitro.
El dispositivo de captura puede incluir cualquiera de las siguientes características, solas o en combinación.
Ventajosamente, el dispositivo de captura es capaz de filtrar biomarcadores celulares cuando la presión del flujo biológico al que está sometido está comprendida entre 9 y 16 mmHg. Estas presiones son típicamente las presiones que se encuentran en los flujos biológicosin vivo,al nivel de las venas periféricas (Munis, J. R. et al.).
Ventajosamente, el medio de filtración comprende al menos una abertura pasante cuyas dimensiones están adaptadas para retener los biomarcadores celulares en función de su tamaño y de su deformabilidad en el flujo sanguíneo.
Las dimensiones son, por ejemplo, la profundidad y al menos una dimensión transversal.
Ventajosamente, al menos una abertura puede ser sustancialmente circular o sustancialmente ovalada o sustancialmente poligonal o adoptar la forma de una ranura.
La invención no está limitada por la forma de las aberturas, siempre que, por supuesto, sean pasantes. La forma y las dimensiones de las aberturas pueden variar dentro del espesor del medio de filtración para permitir la captura de diferentes tipos de biomarcadores celulares con diferentes espesores. La pared de estas aberturas puede formar un cono truncado, pero preferiblemente forma un cilindro, es decir, comprende generatrices paralelas.
El medio de filtración puede comprender solamente una abertura, por ejemplo, en forma de ranura, rectilínea o curvada, cuya dimensión mínima se elige para poder retener los biomarcadores celulares considerados, o varias aberturas, uniformemente o desigualmente repartidas en el medio de filtración, con las mismas forma y dimensiones o con forma y/o dimensiones diferentes.
Según un modo de realización preferido, cada abertura presenta una dimensión transversal, preferiblemente su dimensión transversal mínima, comprendida entre 1 pm y 200 pm, más preferiblemente entre 1 pm y 100 pm, incluso más preferiblemente entre 5 pm y 100 pm. En particular, cada abertura presenta una dimensión transversal comprendida preferiblemente entre 1 pm y 25 pm para biomarcadores celulares del tipo CTC, más preferiblemente entre 5 pm y 25 pm, incluso más preferiblemente entre 12 pm y 25 pm, siendo el diámetro óptimo en este caso cercano a 12 pm.
Preferiblemente, cada abertura pasante del medio de filtración es circular. La dimensión transversal corresponde entonces al diámetro de la abertura.
El soporte es una pieza hueca abierta por un extremo y cerrada por el otro extremo por el medio de filtración. Preferiblemente, el soporte se extiende en dirección longitudinal. La abertura del soporte puede estar entonces en un extremo longitudinal y el medio de filtración en el extremo longitudinal opuesto.
Ventajosamente, el medio de filtración puede ser plano.
La invención tampoco está limitada por la forma del medio de filtración, pero éste es preferiblemente plano.
Según un modo de realización, el soporte tiene una simetría de revolución alrededor de un eje. El soporte tiene una simetría de revolución total alrededor de un eje o una simetría de revolución parcial y está truncado a lo largo de un plano paralelo al eje. Al utilizar un dispositivo con simetría de revolución, se reduce la perturbación de la corriente del flujo biológico, cuando el dispositivo se coloca con su eje de revolución en la dirección principal del flujo biológico. Este tipo de forma permite, en particular, reducir el riesgo de trombosis cuando el dispositivo se utilizain vivo.La parte truncada permite fijar mejor el dispositivo de captura en un medio de introducción. Preferiblemente está destinada a estar en contacto con el medio de introducción. El eje de revolución es preferiblemente la dirección longitudinal en la que se extiende el soporte.
El dispositivo de captura puede, por ejemplo, adoptar la forma de un cilindro, de un cono o de un paraboloide truncado o no. El medio de filtración forma el fondo del soporte.
El dispositivo tiene una simetría de revolución alrededor de un eje. El dispositivo de captura puede, por ejemplo, adoptar la forma de un cilindro o de un cono, o de un cilindro coronado por un cono o por un casquete esférico.
En un modo de realización preferido, el dispositivo puede adoptar la forma de un cilindro hueco, truncado a lo largo de un plano paralelo al eje del cilindro, y el medio de filtración puede formar el fondo del cilindro truncado.
El soporte puede comprender al menos una abertura pasante sustancialmente circular o sustancialmente ovalada o sustancialmente poligonal o adopta la forma de una ranura. Preferiblemente, el soporte no incluye una abertura pasante cuyas dimensiones estén previstas para retener los biomarcadores celulares.
La invención tampoco está limitada por la presencia o ausencia de aberturas pasantes en el soporte, su forma o su número, que pueden ser diferentes de las de las aberturas presentes en el medio de filtración.
Según un modo de realización, el soporte y el medio de filtración forman una sola pieza.
Ventajosamente, el dispositivo, el medio de filtración y el soporte pueden estar realizados en una resina fotosensible.
El dispositivo, el medio de filtración y el soporte pueden realizarse mediante litografía láser tridimensional o fotolitografía convencional: la resina se polimeriza en el lugar donde se irradia y luego se disuelve la resina no polimerizada.
Ventajosamente, el dispositivo puede realizarse en un material biocompatible o puede revestirse con un material biocompatible, por ejemplo, un polímero tal como parileno, o puede revestirse con una capa metálica biocompatible (Au, Ti...). Este material biocompatible también puede adoptar la forma de un gel compatible con el cultivo celular.
Ventajosamente, el dispositivo de captura puede funcionalizarse mediante un compuesto antitrombótico tal como la heparina para evitar el riesgo de trombosis o de coagulación. En particular, el dispositivo puede exponerse a diversos tratamientos superficiales destinados a modificar sus propiedades de adsorción con respecto a las entidades biológicas circulantes. Estos tratamientos pueden ser tratamientos con plasma que permitan el control de la tensión superficial, de la reactividad química de la superficie o de la rugosidad de la superficie, pero también tratamientos químicos de injerto o de funcionalización. Ventajosamente, el dispositivo de captura puede funcionalizarse mediante un compuesto antitrombótico.
La invención también se refiere a un dispositivo de toma de muestras de biomarcadores celulares, que comprende al menos un dispositivo de captura de biomarcadores según la invención fijado en un medio de introducción del dispositivo de captura en un vaso de flujo biológico.
El dispositivo de captura está asociado a un medio de introducción para introducirlo fácilmente en un vaso de flujo biológico, en particular un vaso sanguíneo, una arteria o preferiblemente una vena, o un vaso linfático. El dispositivo de captura puede fijarse directamente mediante introducción o por medio de una pieza tal como un taco. Por supuesto, el dispositivo de toma de muestras puede incluir varios dispositivos de captura, que pueden ser diferentes entre sí, particularmente con respecto a la forma y el diámetro de las aberturas.
En una variante, el medio de introducción del dispositivo de captura en el torrente sanguíneo puede formar el soporte. En esta variante, existe identidad entre el soporte del medio de filtración y el medio de introducción.
Ventajosamente, el medio de introducción del dispositivo de captura en el torrente sanguíneo puede incluir una lengüeta.
Una lengüeta delgada, por ejemplo, metálica, puede servir de medio de introducción del dispositivo de captura en el vaso sanguíneo.
Ventajosamente, la lengüeta puede comprender una aleación metálica o un material compuesto a base de resina y de fibras.
Puede ser un acero inoxidable o una aleación de níquel y titanio tal como el nitinol, conocido por sus propiedades de biocompatibilidad y su flexibilidad. De hecho, la lengüeta debe estar realizada en un material suficientemente flexible para poder insertarse a lo largo del eje longitudinal del vaso sanguíneo.
En el caso de una lengüeta fabricada en acero inoxidable o material compuesto, se puede revestir con un material biocompatible como parileno o con una capa metálica biocompatible (Au, Ti...). El depósito de material biocompatible permite también proporcionar rigidez a la lengüeta o mejorar su resistencia mecánica.
Ventajosamente, el medio de introducción puede comprender un primer medio de protección del medio de filtración previsto para evitar el desprendimiento del medio de filtración.
Es ventajoso proteger el medio de filtración del dispositivo de captura, o incluso el dispositivo de captura en su conjunto, para evitar su desprendimiento del medio de introducción durante la maniobra de introducción o de retirada. Para ello, el dispositivo de toma de muestras puede incluir un primer medio de protección. Una función de este primer medio de protección también puede ser centrar el dispositivo de toma de muestras con respecto al flujo en el vaso sanguíneo, y también con respecto al catéter cuando se introduce en un catéter.
Ventajosamente, el primer medio de protección puede comprender al menos un taco fijado al medio de introducción. El medio de introducción puede comprender, por ejemplo, dos tacos que enmarquen el o los dispositivos de captura y estén suficientemente alejados para no perturbar el flujo sanguíneo.
Ventajosamente, el medio de introducción puede comprender un segundo medio de protección previsto para proteger un vaso sanguíneo en el que haya de introducir.
Es ventajoso proteger las paredes del vaso sanguíneo del cuerpo extraño representado por el dispositivo de toma de muestras.
Ventajosamente, el dispositivo de toma de muestras puede comprender una pieza terminal fijada al extremo del medio de introducción y que forme un primer y/o un segundo medios de protección.
Ventajosamente, la pieza terminal puede comprender al menos un arco.
Por arco se entiende una pieza curva alargada que comprende un primer y un segundo extremos, que puede estar unida a la lengüeta por al menos uno de sus extremos.
Cuando la pieza terminal se fija al extremo del dispositivo de toma de muestras, el al menos un arco se apoya de manera no agresiva en la pared del vaso y centra el dispositivo en el interior del vaso y del catéter, cuando se use un catéter. El al menos un arco también puede estar previsto para proteger el dispositivo de captura.
En otra variante, el medio de introducción puede comprender en las proximidades de su extremo al menos un arco longitudinal que forme un primer y/o un segundo medios de protección.
Ventajosamente, el dispositivo de toma de muestras puede revestirse con material biocompatible, tal como parileno. Ventajosamente, el dispositivo de toma de muestras se puede funcionalizar mediante un compuesto antitrombótico, por ejemplo, heparina.
Ventajosamente, el dispositivo de toma de muestras puede incluir un medio de agarre para hacerlo adecuado para su uso en un catéter.
El dispositivo de toma de muestras puede incluir un "tapón", es decir, un medio de agarre tal como un tapón de plástico, colocado en el extremo distal del medio de introducción, que facilite el agarre del dispositivo y sirva de tope al introducir el dispositivo en el catéter. Se denomina extremo distal del dispositivo de toma de muestras el extremo opuesto al que incluye el dispositivo de captura.
Ventajosamente, el dispositivo de toma de muestras se puede insertar en un catéter.
La invención también se refiere a un conjunto de toma de muestras de biomarcadores celulares que comprende un catéter y un dispositivo de toma de muestras según la invención, insertándose dicho dispositivo en el catéter.
Un catéter de perfusión, eventualmente funcionalizado mediante un compuesto antitrombótico, tal como heparina, guía y protege ventajosamente el dispositivo de toma de muestras. El catéter se introduce en el vaso sanguíneo, el dispositivo de toma de muestras se coloca en el interior del catéter y luego el dispositivo de toma de muestras se empuja afuera del catéter para colocarlo en el flujo sanguíneo. Después de la toma de muestras se realiza la maniobra inversa: colocación del dispositivo de toma de muestras dentro del catéter, retirada del catéter. Las células capturadas pueden luego contarse, marcarse inmunológicamente y cultivarse directamente en el dispositivo de captura, o recuperarse fácilmente para su recuento, inmunomarcaje y recultivoin vitro.
Las ventajas del dispositivo según la invención son las siguientes:
- Es adecuado para su usoin vivo.Normalmente, sus dimensiones permiten su introducción en un canal biológico, tal como un vaso sanguíneo.
- Sólo utiliza las propiedades físicas (tamaño, deformabilidad) de los biomarcadores celulares, por lo que puede evitarse la presencia real o supuesta de proteínas de membrana específicas en la superficie de los biomarcadores celulares.
- El torrente sanguíneo se puede utilizar directamente como sistema fluídico.
- El volumen de sangre analizado es mucho mayor; el dispositivo puede analizar 100 ml de sangre en 5 minutos, un volumen de 10 a 100 veces mayor que el analizado por los sistemas que utilizan una muestra.
- El número de capturas se puede aumentar aumentando el tiempo de toma de muestras y previendo un dispositivo que comprenda varios dispositivos de captura.
- Es aplicable a cualquier tipo de biomarcador celular circulante mencionado anteriormente adaptando su geometría, en particular el tamaño de las aberturas.
También se divulga un método para detectar una enfermedad o un estado fisiológico en un paciente que comprende una etapa de captura de un biomarcador celular mediante el dispositivo de captura según la invención y una etapa de análisis de los biomarcadores celulares capturados.
La etapa de captura del biomarcador celular se puede realizarin vivo, in vitrooex vivo.
La etapa de análisis puede ser una etapa de análisis cuantitativo o cualitativo. Por ejemplo, una etapa de determinación puede ser una etapa para determinar si los biomarcadores celulares son células cancerosas.
La etapa de análisis puede incluir una etapa de recultivo de los biomarcadores celulares.
La invención se refiere a un dispositivo de captura de biomarcadores celulares según la invención para su uso con fines de diagnóstico, en particular con fines de diagnóstico del cáncer.
También se divulga un método para detectar una enfermedad o un estado fisiológico en un paciente que comprende una etapa de captura de un biomarcador celular mediante el dispositivo de toma de muestras según la invención y una etapa de análisis de los biomarcadores celulares capturados.
La invención también se refiere a un dispositivo de toma de muestras de biomarcadores celulares según la invención para su uso con fines de diagnóstico, en particular con fines de diagnóstico del cáncer.
También se divulga un método para detectar una enfermedad o un estado fisiológico en un paciente que comprende una etapa de captura de un biomarcador celular mediante el conjunto de toma de muestras según la invención y una etapa de análisis de los biomarcadores celulares capturados.
La invención también se refiere a un conjunto de toma de muestras de biomarcadores celulares según la invención para su uso con fines de diagnóstico, en particular con fines de diagnóstico del cáncer.
También se divulga un método para tratar una enfermedad en un paciente que comprende una etapa de captura de un biomarcador celular mediante el dispositivo de captura según la invención.
La invención se refiere a un dispositivo de captura de biomarcadores celulares según la invención para su uso con fines terapéuticos, en particular con fines de terapia contra el cáncer.
También se divulga un método para tratar una enfermedad en un paciente que comprende una etapa de captura de un biomarcador celular mediante el dispositivo de toma de muestras según la invención.
La invención también se refiere a un dispositivo de toma de muestras de biomarcadores celulares según la invención para su uso con fines terapéuticos, en particular con fines de terapia contra el cáncer.
También se divulga un método para tratar una enfermedad en un paciente que comprende una etapa de captura de un biomarcador celular mediante el conjunto de toma de muestras según la invención.
La invención también se refiere a un conjunto de toma de muestras de biomarcadores celulares según la invención para su uso con fines terapéuticos, en particular con fines de terapia contra el cáncer.
A continuación se describirán modos de realización y variantes, a título de ejemplos no limitativos, con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:
- la Figura 1 representa en perspectiva un dispositivo de captura, siendo la Figura 1A una vista ampliada de una parte de este dispositivo,
- las Figuras 2A y 2B representan en perspectiva variantes de medios de filtración, la figura 2C representa en perspectiva una variante de dispositivo de captura,
- las Figuras 3A y 3B representan los extremos de dos modos de realización de un dispositivo de toma de muestras,
- la Figura 4 representa el extremo de un dispositivo de toma de muestras que comprende dos medios de protección,
- las Figuras 5A y 5B representan el extremo de un dispositivo de toma de muestras y una pieza terminal de protección, la Figura 5C es una vista ampliada de la figura 5B,
- las Figuras 6A y 6B representan el extremo de un dispositivo de toma de muestras que comprende un medio de protección y de centrado en dos variantes,
- las Figuras 7A a 7E representan variantes de dispositivos de captura.
El dispositivo 100 de captura ilustrado en la Figura 1 comprende un soporte cilíndrico 110 truncado a lo largo de un plano paralelo al eje X-X' del cilindro, es decir, este soporte comprende una parte plana 111 y una parte redondeada 112. Como se verá posteriormente, la parte plana 111 es útil para fijar el dispositivo en un medio de introducción; sin embargo, el dispositivo podría fijarse mediante una generatriz de un cilindro no truncado o en las aristas de la generatriz del cilindro truncado.
En un primer extremo, el cilindro está cerrado por un fondo plano 120, y está abierto en su otro extremo. El fondo 120 constituye el medio de filtración del dispositivo 100 en forma de una membrana filtrante. Como puede verse en la Figura 1 A, la membrana filtrante 120 comprende una serie de aberturas pasantes 121 de forma cilíndrica de sección circular con el mismo diámetro.
El dispositivo 100 de captura está previsto para colocarlo en el torrente sanguíneo, estando orientada la abertura hacia el lado aguas arriba de la circulación de manera que los biomarcadores buscados entren en el dispositivo de captura y sean retenidos por el filtro 120. Es importante que estos biomarcadores no escapen del dispositivo de captura una vez que hayan entrado en el mismo. Sin embargo, en determinadas configuraciones, las simulaciones digitales han mostrado que podría haber bucles de recirculación en el interior del dispositivo y que los biomarcadores podrían escapar. En el caso del dispositivo cilíndrico ilustrado en la Figura 1, este fenómeno ocurre cuando el soporte 110 incluye las mismas aberturas 121 que el filtro 120. En el modo de realización preferido ilustrado en la Figura 1, la parte redondeada 112 del soporte no incluye ninguna abertura y permite mantener un flujo sustancialmente laminar cuando el flujo sanguíneo pasa a través del dispositivo.
Las Figuras 2A, 2B y 2C ilustran otros modos de realización del dispositivo de captura. En las Figuras 2A y 2B, los dispositivos 101,102 comprenden un medio de filtración que adopta la forma de un paraboloide de revolución, estando constituido en este caso el soporte del medio de filtración por un medio de introducción tal como una lengüeta. El dispositivo 101 incluye aberturas circulares, el dispositivo 102 incluye aberturas poligonales. Estos dispositivos pueden estar truncados o provistos de una base o zócalo para facilitar su fijación en un medio de introducción como se mencionó anteriormente con referencia a la Figura 1.
La Figura 2C ilustra un dispositivo 103 de captura que comprende un filtro plano 104 sostenido por un soporte 105 que comprende dos montantes 105a, 105b unidos por un travesaño 105c paralelo al plano del filtro 104.
Las dimensiones del dispositivo están adaptadas a su aplicación en un vaso sanguíneo; no debe perturbar el torrente sanguíneo para no crear especialmente un riesgo de trombosis.
En el caso del dispositivo 100 ilustrado en la Figura 1, las dimensiones son las siguientes:
- diámetro comprendido entre 50 gm y 3 mm, preferiblemente entre 50 gm y 1,7 mm, más preferiblemente cercano a 200 gm, según un modo realización, el diámetro del dispositivo está comprendido entre un 0,5 % y un 15 % del diámetro del canal en el que se introduce el dispositivo, preferiblemente entre un 0,5 % y un 5 %, particularmente en el caso en el que el dispositivo de captura esté destinado a ser colocado en la vena basílica,
- longitud comprendida entre 50 gm y 3 mm, preferiblemente cercana a 150 gm, preferiblemente mayor que la suma del espesor de la pared del dispositivo y el diámetro del biomarcador celular que se pretende capturar,
- diámetro de las aberturas comprendido entre 1 pm y 200 pm, preferiblemente entre 1 pm y 100 pm, incluso más preferiblemente entre 5 pm y 100 pm de manera general para los biomarcadores celulares mencionados anteriormente y entre 1 pm y 25 pm, más preferiblemente entre 5 pm y 25 pm, incluso más preferiblemente entre 12 pm y 25 pm para las CTC; sorprendentemente, y a modo de ejemplo no limitativo, se encontró que, para las células tumorales de líneas prostáticas PC3 de tamaño comprendido entre 12 pm y 25 pm, el dispositivo de captura era muy sensible al diámetro de las aberturas, siendo en este caso el diámetro óptimo cercano a 12 pm;
- cuando la abertura adopta la forma de una ranura, su dimensión transversal está comprendida entre 1 pm y 200 pm, preferiblemente entre 1 pm y 100 pm, incluso más preferiblemente entre 5 pm y 100 pm, preferiblemente comprendida entre 1 pm y 25 pm, más preferiblemente entre 5 pm y 25 pm, incluso más preferiblemente entre 12 pm y 25 pm, preferiblemente cerca de 12 pm,
- las aberturas pueden tener forma troncocónica, variando el diámetro de 1 pm y 200 pm, preferiblemente de 1 pm y 100 pm, incluso más preferiblemente de aproximadamente 5 pm y 100 pm para los biomarcadores celulares, preferiblemente entre 1 pm y 25 pm, más preferiblemente entre 5 pm y 25 pm, incluso más preferiblemente entre 12 pm y 25 pm, de aproximadamente 15 pm a aproximadamente 8 pm para las CTC, con el fin de retener los biomarcadores celulares y más particularmente las CTC en el interior de las aberturas,
- espesor de la pared del soporte y de la membrana filtrante comprendido entre 5 pm y 20 pm, preferiblemente cercano a 9 pm; preferiblemente el espesor de la membrana filtrante es cercano a 6 pm y el de la pared cercano a 10 pm para aumentar la resistencia mecánica del dispositivo de captura,
- en el caso de una membrana filtrante plana y rectangular como se ilustra en la Figura 2C, las dimensiones características de los montantes estarán comprendidas entre 50 pm y 1,5 mm.
El dispositivo de captura puede estar realizado a partir de una resina fotosensible trabajada mediante litografía láser tridimensional o cualquier otra técnica de litografía adaptada a las dimensiones del dispositivo.
En cuanto a la biocompatibilidad, la invención propone dos opciones:
- o la resina utilizada es biocompatible,
- o el dispositivo, una vez fabricado, se reviste con una película de biocompatibilidad tal como parileno o con un metal biocompatible tal como Au, Ti...
El dispositivo de captura de la invención no está limitado por la descripción anterior. En particular:
- el plano de truncamiento podría estar desplazado angularmente con respecto al eje X-X',
- el soporte podría presentar una forma distinta de la cilíndrica, por ejemplo, cónica, esférica, truncada o no truncada por un plano,
- cuando el soporte no tenga eje de revolución, la forma del soporte no estará limitada a la utilización de dos montantes y un travesaño,
- la membrana filtrante podría estar colocada a lo largo de una sección del cilindro y no constituir el fondo, es decir, el soporte 110 podría incluir una parte aguas abajo del flujo sanguíneo,
- el fondo 120 del cilindro, que forma la membrana filtrante del dispositivo 100, podría no ser plano, sino que podría adoptar, por ejemplo, la forma de un casquete semiesférico o de un cono.
La Figura 3A ilustra un dispositivo 300 de toma de muestras que comprende un dispositivo 100 de captura fijado en un medio de introducción, aquí una lengüeta 200, por la parte plana 111 del soporte 110, en las proximidades del extremo 201 de la lengüeta. Se puede fijar mediante soldadura o depósito de metal o mediante el uso de un pegamento o resina biocompatibles.
La lengüeta 200 está hecha de nitinol, que es una aleación de níquel y titanio y que tiene la propiedad de ser biocompatible y flexible, lo que permite facilitar su introducción en el vaso sanguíneo. En caso de que estuviese compuesta de otro material no biocompatible, se revestiría, en una etapa de su fabricación, con una película de material biocompatible tal como el parileno.
La anchura de la lengüeta está comprendida entre 300 pm y 3 mm, preferiblemente entre 300 pm y 1,5 mm, preferiblemente cerca de 900 pm, para que sea compatible con el diámetro interno de los catéteres en los que se puede insertar la lengüeta. En el caso de una lengüeta de nitinol, su espesor está comprendido entre 50 pm y 76 pm. Una vez cortada, mide unos centímetros de largo, por ejemplo, 5 cm, pero la longitud realmente introducida en el torrente sanguíneo se limita a 1 cm o 2 cm.
La Figura 3B ilustra un modo de realización alternativo que no forma parte del objeto reivindicado en el que el soporte de la membrana 130 está constituido por la lengüeta 200. La membrana filtrante está fijada en la lengüeta 200 mediante un borde 131 para presentar una abertura destinada a estar orientada hacia el lado aguas arriba del flujo sanguíneo. La membrana filtrante está configurada para no perturbar el flujo sanguíneo.
Un riesgo asociado con el dispositivo 300 de toma de muestras es que el o los dispositivos 100 de captura se desprendan de la lengüeta 200 y entren en el torrente sanguíneo, por ejemplo, en el momento de la introducción o retirada del dispositivo de toma de muestras. Para este propósito, como se ilustra en la Figura 4, la lengüeta 200 comprende unos primeros medios de protección en forma de tacos 210, fijados en la lengüeta 200 a ambos lados de uno o varios dispositivos 100 de captura en la dirección longitudinal. Los tacos ilustrados en la Figura 4 presentan una forma de "barril" con la parte superior redondeada, pero podrían presentar una forma cilíndrica, semiesférica, troncocónica... siempre y cuando se presenten en forma de un cuerpo relativamente masivo a la escala del dispositivo y con formas redondeadas para no perturbar el torrente sanguíneo ni dañar la pared del vaso.
Los tacos 210 están suficientemente cerca del dispositivo 100 de captura para proporcionarle protección, pero lo suficientemente alejados, por ejemplo, separados aproximadamente 1 mm, para no perturbar el flujo sanguíneo alrededor del dispositivo 100 de captura.
Ventajosamente, los tacos 210 pegados a la lengüeta pueden estar hechos de resina y fabricados con el mismo procedimiento de fabricación que el dispositivo 100 de captura, sin que esto sea limitativo.
Otra ventaja de los tacos 210 es que pueden participar en la función de centrar el dispositivo de toma de muestras en el vaso y/o en un catéter.
Otro riesgo asociado al dispositivo 300 de toma de muestras, particularmente teniendo en cuenta el tiempo de captura de varios minutos, es el de dañar la pared del vaso en el que se inserta. Para ello, la invención propone dos segundos medios de protección:
- las Figuras 5B y 5C ilustran una lengüeta 200 provista de una pieza terminal 220 prevista para fijarse a la lengüeta, cerca de su extremo; esta parte terminal 220 forma dos arcos 221,222 unidos en un primer extremo común 223 y cuyos segundos extremos 224a, 224b están libres; esta pieza terminal 220 se fija a la lengüeta 200 por un lado uniendo el extremo común 223 y el extremo 201 de la lengüeta, por otro lado fijando los segundos extremos 224a, 224b en caras opuestas de la lengüeta; estos arcos 221, 222 se apoyan de forma no agresiva en la pared del vaso y lo protegen; protegen también contra el arranque el dispositivo 100 de captura fijado en la lengüeta 200 entre los primeros y segundos extremos de estos arcos;
- la Figura 6A ilustra una lengüeta 200 de la cual una lámina 231, 232 está separada de cada uno de los bordes 202, 203 de la lengüeta 200 y forma un arco, permaneciendo los extremos 231a, 231b, 232a, 232b de estas láminas unidos a la lengüeta; las láminas 231, 232 se extienden a ambos lados del plano de la lengüeta 200 de modo que, como en el caso de la Figura 5, estos arcos protegen el vaso y centran el dispositivo 300 de toma de muestras en el vaso. En la variante de la Figura 6B, sólo los extremos 231a, 232a situados aguas abajo permanecen unidos a los bordes 202, 203 de la lengüeta 200; las láminas 231, 232 están ligeramente torcidas de modo que los extremos 231b, 232b situados aguas arriba se han separado de los bordes de la lengüeta 200 y están fijados en el plano de la lengüeta y a ambos lados. Por supuesto, la invención también se refiere a la configuración simétrica, donde sólo los extremos 231b, 232b situados aguas arriba de las láminas permanecen unidos a los bordes de la lengüeta y donde son los extremos situados aguas abajo los que están fijados en el plano de la lengüeta y a ambos lados.
La invención no está limitada por la descripción anterior:
- el medio de introducción podría no ser plano y adoptar otra forma, por ejemplo, la de un cilindro o la de un alambre,
- el dispositivo 300 de toma de muestras podría incluir varios dispositivos de captura, por ejemplo, alineados longitudinalmente o al tresbolillo, para no perturbar demasiado el flujo sanguíneo, o transversalmente en la lengüeta 200, pudiendo los dispositivos de captura ser diferentes de dos en dos, particularmente en términos de forma, tamaño, dimensión y tamaño de las aberturas.
Ejemplos
Simulación digital
Material y métodos:
Para evaluar la repercusión del dispositivo de captura en la velocidad del flujo, el número de Reynolds, los esfuerzos cortantes y la activación plaquetaria, se simuló la influencia en el flujo sanguíneo de diferentes prototipos de dispositivos de captura mediante "computational fluid dynamics" (CFD (dinámica de fluidos computacional)). Esta etapa de simulación digital de la interacción fluido-estructura (FSI) se realizó mediante elsoftwareAnsys Fluent® 15.0.
Un estudio bibliográfico permitió definir las constantes que rigen la corriente del flujo sanguíneo, así como los algoritmos de cálculo más adecuados.
La sangre se considera un fluido no newtoniano, lo que significa que su viscosidad depende de la velocidad de corte, a diferencia de los fluidos newtonianos, cuya viscosidad es constante. Tener en cuenta esta propiedad es decisivo. Entre los diferentes modelos para simular la viscosidad de fluidos no newtonianos se eligió el modelo de la ley de potencia (Power Law Model) (Petkova, S., et al.). Este modelo se escribe según la siguiente fórmula: r|mín. > q = kYn-1eT0 T < r|máx donde k es una medida de la viscosidad promedio del fluido (Índice de consistencia), n es una medida de la desviación del fluido newtoniano (Índice de ley de potencia), T0 es la temperatura de referencia y qmín y qmáx son respectivamente los límites inferior y superior de viscosidad. Los parámetros de la ley de potencia utilizados durante las simulaciones se muestran en la Tabla 1 a continuación.
Tabla 1
Como el dispositivo de captura está destinado preferiblemente a ser colocado en una vena del antebrazo, el modelo de vena utilizado fue el de la vena basílica.
Se desarrolló un modelo de vena basílica basado en diferentes estudios anatómicos, entre ellos Baptista-Silva et al.
La vena basílica se modelizó utilizando las variables presentadas en la Tabla 2 a continuación (Munis, J.R., L.J. Bhatia S Fau - Lozada y L.J. Lozada):
Tabla 2
La trombogenicidad se determinó estudiando los esfuerzos cortantes y el tiempo de exposición, apareciendo la activación plaquetaria a partir de un valor de 35 dinas/cm2 denominado umbral de Hellums (Bludszuweit, C.).
Resultados:
Determinación de la forma óptima del dispositivo de captura:
Se ensayaron diferentes formas de dispositivo de captura. Para cada una de estas formas, se determinó la influencia del dispositivo de captura sobre la velocidad del flujo, el número de Reynolds, los esfuerzos cortantes y la activación plaquetaria del flujo sanguíneo. Se estableció un mapa 3D de los vectores de velocidad dentro y en las proximidades del dispositivo para diferentes valores de la velocidad de la corriente sanguínea dentro del canal.
Las diferentes formas ensayadas se ilustran en las Figuras 7A a 7E. Los resultados se resumen en la Tabla 3.
Tabla 3
Conclusiones:
Las formas paraboloides y cilindricas permiten conservar el carácter laminar del flujo sanguíneo.
La presencia de vórtices contrarrotativos y por tanto la recirculación de los biomarcadores se reduce en gran medida cuando las paredes del dispositivo son paralelas al flujo y cuando el dispositivo de captura no tiene aberturas en sus paredes laterales.
Eficiencia de captura
Materiales y métodos
Las condiciones de circulación en una vena se reprodujeronin vitro.
La muestra de sangre ensayada es una muestra de sangre de un voluntario sano extraída en tubos Vacutainer® EDTA (Becton, Dickinson & Company), a la que se añadieron células tumorales PC3-GFP en una concentración de 500 a 25 000 células tumorales/ml.
Se ensayaron dispositivos de captura cilíndricos tales como el ilustrado en la Figura 7B con diferentes aberturas. Estos dispositivos tienen aberturas con un diámetro de 10 gm para las aberturas cilindricas y de 15 gm en la entrada y 8 gm en la salida para las aberturas cónicas.
Luego se evaluó la viabilidad de las células capturadas retirando células mediante tripsinización y volviendo a cultivar estas últimas en pocillos de cultivo.
Resultados:
Tabla 4
Longitud 6 gm 150 gm 150 gm 150 gm 150 gm
Espesor d 6 gm 6 gm 6 gm 10 gm 10 gm
Forma de cilíndrica cilíndrica cónica cilíndrica cónica
Duración del experimento 20 minutos 10 minutos 20 minutos 20 minutos 20 minutos
Eficacia de captura
Conclusiones:
Los resultados resumidos en la Tabla 4 muestran que el espesor y la longitud del dispositivo de captura influyen en la eficacia de captura. El dispositivo de captura debe tener una longitud mínima determinada para permitir la captura de los biomarcadores celulares. Sin esta longitud mínima, los biomarcadores celulares retenidos por el medio de filtración se ponen en recirculación casi inmediatamente en el flujo biológico. El espesor del dispositivo de captura también influye en la eficacia de captura. De hecho, demasiado espesor puede reducir la eficacia de captura. El dispositivo de captura permite la captura específica de biomarcadores celulares tales como las CTC. Las demás células sanguíneas, tales como los leucocitos, no se capturan. De hecho, a diferencia de las CTC, estos últimos tienen propiedades viscoelásticas que les permiten pasar a través de aberturas inferiores a su diámetro.
La forma circular de las aberturas es la más adecuada para capturar biomarcadores celulares tales como las CTC. El diámetro de las aberturas debe adaptarse al diámetro de los biomarcadores, pero especialmente al régimen de presión encontrado en el sistema venoso periférico.
Las células cancerosas capturadas son viables después de la captura.
Referencias
A lo largo de esta solicitud, diversas referencias describen el estado de la técnica al que pertenece esta invención. Las descripciones de estas referencias se incorporan como referencia en la presente solicitud.
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Claims (14)
1. Dispositivo (300) de toma de muestras de biomarcadores celulares, que comprende:
- al menos un dispositivo (100) de captura de biomarcadores celulares, adecuado para su usoin vivoy que comprende:
- un medio (120) de filtración previsto para retener dichos biomarcadores celulares, comprendiendo dicho medio de filtración al menos una abertura pasante (121), cuyas dimensiones están adaptadas para retener dichos biomarcadores celulares seleccionados del grupo que consiste en células estromales, células epiteliales, células fetales circulantes, células madre, agrupamientos o agregados de células tumorales, células tumorales asociadas con todo tipo de cáncer y los otros tipos de células: monocitos, macrófagos, y
- dicho medio (120) de filtración es solidario con un soporte (110) que adopta la forma de una pieza hueca abierta por un extremo y cerrada por otro extremo por el medio de filtración, y que tiene una simetría de revolución alrededor de un eje (X-X') total o truncada a lo largo de un plano paralelo al eje (X-X'), formando el medio de filtración el fondo del soporte (110),
estando fijado dicho dispositivo de captura a un medio (200) de introducción de dicho dispositivo de captura en un vaso de flujo biológico.
2. Dispositivo de toma de muestras de biomarcadores celulares según la reivindicación 1,caracterizado por quela al menos una abertura pasante (121) presenta al menos una dimensión transversal comprendida entre 1 pm y 200 pm, preferiblemente entre 5 pm y 25 pm.
3. Dispositivo de toma de muestras de biomarcadores celulares según una de las reivindicaciones precedentes,caracterizado por queel medio (120) de filtración es plano.
4. Dispositivo de toma de muestras de biomarcadores celulares según una de las reivindicaciones precedentes,caracterizado por queel soporte (110) adopta la forma de un cilindro hueco, truncado a lo largo de un plano paralelo al eje (X-X') del cilindro, formando el medio (120) de filtración el fondo del cilindro truncado.
5. Dispositivo de toma de muestras de biomarcadores celulares según una de las reivindicaciones precedentes,caracterizado por queestá hecho de una resina fotosensible.
6. Dispositivo de toma de muestras de biomarcadores celulares según una de las reivindicaciones precedentes,caracterizado por queel medio de introducción de dicho dispositivo de captura en el torrente sanguíneo comprende una lengüeta (200).
7. Dispositivo de toma de muestras de biomarcadores celulares según la reivindicación 6,caracterizado por queel medio (200) de introducción comprende un primer medio de protección del medio de filtración, previsto para evitar que el medio de filtración se desprenda.
8. Dispositivo de toma de muestras de biomarcadores celulares según la reivindicación 7,caracterizado por queel primer medio de protección comprende al menos un taco (210) fijado al medio (200) de introducción.
9. Dispositivo de toma de muestras de biomarcadores celulares según una de las reivindicaciones precedentes,caracterizado por queel medio (200) de introducción comprende un segundo medio de protección previsto para proteger un vaso sanguíneo en el que se ha de introducir.
10. Dispositivo de toma de muestras de biomarcadores celulares según una de las reivindicaciones 7 o 9,caracterizado por quecomprende una pieza terminal (220) fijada al extremo (201) del medio (200) de introducción y que forma un primer y/o un segundo medios de protección.
11. Conjunto de toma de muestras de biomarcadores celulares que comprende un catéter y un dispositivo de toma de muestras según una de las reivindicaciones precedentes, estando insertado dicho dispositivo en el catéter.
12. Dispositivo de toma de muestras de biomarcadores celulares según una de las reivindicaciones 1 a 10 para su uso con fines diagnósticos o terapéuticos.
13. Conjunto de toma de muestras de biomarcadores celulares según la reivindicación 11 para uso con fines diagnósticos o terapéuticos.
14. Dispositivo de toma de muestras de biomarcadores celulares según la reivindicación 12 o conjunto de toma de muestras de biomarcadores celulares según la reivindicación 13,caracterizado(s) por queestá(n) destinado(s) a ser utilizado(s) para el diagnóstico o la terapia del cáncer.
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