WO2018062876A2 - 통증이 경감되는 골관절염 치료용 키트 - Google Patents

통증이 경감되는 골관절염 치료용 키트 Download PDF

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Definitions

  • the present invention is a osteoarthritis treatment kit comprising a composition for intravenous administration comprising the mesenchymal stem cells treated with the STAT3 inhibitor as an active ingredient and an intraarticular administration composition comprising the mesenchymal stem cells as an active ingredient, and It relates to a method for preventing and treating osteoarthritis using the same.
  • Osteoarthritis is a kind of arthritis, also called degenerative arthritis, which occurs mainly in old age without a particular organic cause, and when it progresses chronically, it is accompanied by movement disorders such as gait disturbance due to deformation of the joint structure. Osteoarthritis is mainly caused by gradual damage to the cartilage or degenerative changes of the bones and ligaments of the joints, resulting in inflammation and pain.
  • MMPs such as collagenase and stromelysin increases the destruction of articular cartilage.
  • MMPs induce IL-1, TNF- ⁇ and the like, which affects tissues such as muscles, tendons, and ligaments, causing severe pain.
  • osteoarthritis For the treatment of osteoarthritis, acetaminophen, tramadol, nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs), diaserine, glucosamine and other drugs are used, but only to temporarily reduce the pain of osteoarthritis. Accordingly, there is a need for a treatment that can effectively alleviate pain while treating osteoarthritis.
  • NSAIDs nonsteroidal anti-inflammatory drugs
  • diaserine diaserine
  • glucosamine glucosamine
  • An object of the present invention is a composition for intravenous administration comprising mesenchymal stem cells treated with a STAT3 (Signal transducer and activator of transcription 3) inhibitor as an active ingredient; And it provides a kit for the treatment of osteoarthritis pain relief comprising a composition for intraarticular administration comprising mesenchymal stem cells as an active ingredient.
  • STAT3 Synignal transducer and activator of transcription 3
  • Still another object of the present invention is to intravenously administer a composition comprising mesenchymal stem cells treated with a pharmaceutically effective amount of a STAT3 (Signal transducer and activator of transcription 3) inhibitor as an active ingredient, and at the same time, the mesenchymal stem cells as an active ingredient. It is to provide a method for preventing and treating osteoarthritis comprising administering a composition comprising intraarticular intraarticularly.
  • STAT3 Signal transducer and activator of transcription 3
  • the present invention comprises a composition for intravenous administration comprising mesenchymal stem cells treated with a STAT3 (Signal transducer and activator of transcription 3) inhibitor as an active ingredient; And a composition for intraarticular administration comprising mesenchymal stem cells as an active ingredient.
  • STAT3 Synignal transducer and activator of transcription 3
  • the composition for intraarticular administration may be treated with a STAT3 inhibitor.
  • the STAT3 inhibitor is STA-21 (8-hydroxy-3-methyl-3,4-dihydrotetraphene-1,7,12 (2H) -trione), SD282, metformin, AG-490 ((E) -2-Cyano-3- (3,4-dihydrophenyl) -N- (phenylmethyl) -2-propenamide), Atiprimod; 3- (8,8-dipropyl-3-azaspiro [4.5 ] decan-3-yl) -N, N-diethylpropan-1-amine), oranopine (Auranofin; 3,4,5-triacetyloxy-6- (acetyloxymethyl) oxane-2-thiolate; triethylphosphanium), orosiomalate (Aurothiomalate; Sodium 2- (auriosulfanyl) -3-carboxypropanoate), BMS-354825 (Dasatinib; N- (2H) -trione),
  • the composition for intravenous administration immediately after administration of the composition for intravenous administration, the composition for intraarticular administration, or the composition for intravenous administration immediately after administration of the composition for intraarticular administration, Alternatively, the composition for intravenous administration and the composition for intraarticular administration may be administered simultaneously.
  • the mesenchymal stem cells treated with the STAT3 inhibitor may alleviate pain.
  • the mesenchymal stem cells may be isolated from peripheral blood or adipose tissue of a osteoarthritis patient.
  • the present invention is intravenously administering a composition comprising mesenchymal stem cells treated with a pharmaceutically effective amount of a STAT3 (Signal transducer and activator of transcription 3) inhibitor as an active ingredient, and at the same time comprising mesenchymal stem cells as an active ingredient
  • a method for preventing and treating osteoarthritis comprising administering the composition intraarticularly.
  • intraarticular administration of the composition containing the mesenchymal stem cells as an active ingredient may be treated with a STAT3 inhibitor.
  • the STAT3 inhibitor is STA-21 (8-hydroxy-3-methyl-3,4-dihydrotetraphene-1,7,12 (2H) -trione), SD282, metformin, AG-490 ((E) -2-Cyano-3- (3,4-dihydrophenyl) -N- (phenylmethyl) -2-propenamide), Atiprimod; 3- (8,8-dipropyl-3-azaspiro [4.5 ] decan-3-yl) -N, N-diethylpropan-1-amine), oranopine (Auranofin; 3,4,5-triacetyloxy-6- (acetyloxymethyl) oxane-2-thiolate; triethylphosphanium), orosiomalate (Aurothiomalate; Sodium 2- (auriosulfanyl) -3-carboxypropanoate), BMS-354825 (Dasatinib; N- (2H) -trione),
  • intravenous administration of a composition comprising mesenchymal stem cells treated with a STAT3 inhibitor as an active ingredient may alleviate the pain of osteoarthritis.
  • the mesenchymal stem cells may be isolated from peripheral blood or adipose tissue of a osteoarthritis patient.
  • Mesenchymal stem cells treated with the STAT3 inhibitors according to the present invention can effectively inhibit the expression of inflammatory factors, effectively increase the expression of anti-inflammatory factors, and have an excellent effect of increasing the expression of chemokine receptors (chemokine receptors).
  • Patient-derived mesenchymal stem cells can further improve the cartilage protection and osteoarthritis inflammation control efficacy of stem cells than using conventional stem cells, and can minimize side effects such as immune rejection reactions.
  • the mesenchymal stem cells derived from the patient are stem cells are aging stem cells in many cases, and since their functions are reduced, the composition containing the same can be used more effectively as a therapeutic agent for immune diseases.
  • kits according to the present invention intravenous administration of STAT3 inhibitor-treated mesenchymal stem cells and intra-articular injection of mesenchymal stem cells can effectively reduce pain while treating arthritis.
  • 1 is a view showing the degree of pain when intravenous administration of mesenchymal stem cells or STA-21 treated mesenchymal stem cells in one embodiment of the present invention.
  • Figure 2 is a diagram showing the degree of pain when intravenous administration of mesenchymal stem cells or STA-21 treated mesenchymal stem cells in one embodiment according to the course after administration (0, 3, 11, 22 and 29 days).
  • Figure 3 is a diagram showing the degree of cartilage damage with micro-CT when intravenous administration of mesenchymal stem cells or STA-21 treated mesenchymal stem cells in one embodiment.
  • Figure 4 is a diagram showing the degree of cartilage damage by H & E staining when intravenous administration of mesenchymal stem cells or STA-21 treated mesenchymal stem cells in one embodiment.
  • FIG. 5 is a diagram showing inflammatory cytokine expression when intravenous administration of mesenchymal stem cells or STA-21 treated mesenchymal stem cells in one embodiment.
  • Figure 6 is a view showing the degree of pain when intra-articular administration of mesenchymal stem cells or STA-21 treated mesenchymal stem cells in one embodiment of the present invention.
  • Figure 7 is a diagram showing the degree of pain when intra-articularly administered mesenchymal stem cells in one embodiment of the present invention and intravenous administration of STA-21 treated mesenchymal stem cells.
  • FIG. 8 is a view showing the results of micro-CT analysis showing the degree of cartilage damage in one embodiment of the present invention.
  • Figure 9 shows the results of confirming the pain marker CGRP in Ganglion tissues when intra-articularly administering mesenchymal stem cells in one embodiment of the present invention and intravenous administration of STA-21-treated mesenchymal stem cells.
  • FIG. 10 is a diagram showing the pain level when intra-articular administration of STA-21-treated mesenchymal stem cells and intravenous administration of STA-21-treated mesenchymal stem cells in one embodiment of the present invention.
  • Figure 11 is a view showing the result of H & E staining to check the degree of cartilage damage in one embodiment of the present invention.
  • FIG. 12 is a view showing the results of confirming the bone volume (%) through the C. Micro CT analysis to determine the degree of cartilage damage in one embodiment of the present invention.
  • FIG. 13 shows the results of confirming the pain marker TRPV1 when intra-articular administration of STA-21-treated mesenchymal stem cells and intravenous administration of STA-21-treated mesenchymal stem cells in one embodiment.
  • Figure 14 is a diagram showing the results confirmed the target cell activity regulation of STA21 treated MSC in vitro.
  • FIG. 15 is a diagram illustrating pain control and expression of cartilage protection factor by SD-282 and metformin in one embodiment of the present invention.
  • 16 is a view showing the results for anti-inflammatory and cartilage protection by SD-282 and metformin in one embodiment of the present invention.
  • STATs Signal Transducer and Transcriptions
  • STATs include N-terminal domain (ND), coiled-coil domain (CCD), DNA-binding domain (DBD), linker domain (LD), Src homology 2 (SH2) and transcriptional activation domain (TAD) It shares six distinct structural domains, among which STAT3 has tyrosine and serine residues (Tyrosine 705, Serine 727 residues for STAT3) that are important at the C-terminus, which is phosphorylated by activation.
  • STAT3 is continuously activated through various pathways to promote tumor formation, and STAT3 is also a diverse cytokine and growth factor-interferon, epidermal growth factor, platelet-derived growth factor, interleukin 5, interleukin 6, It is activated by phosphorylation of two residues of tyrosine 705 and serine 727 in response to hepatocyte growth factor, leukemia inhibitory factor (LIF), bone morphogenetic protein2, hormone leptin, and carcinogenic proteins such as Src and Ras.
  • LIF leukemia inhibitory factor
  • STAT3 is a transcriptional regulator involved in the transcription of several genes in human cells. Normally, STAT3 in the cytoplasm moves into the nucleus in response to signaling by cytokines or growth factors from the outside.
  • STAT3 regulates genes for differentiation, growth, survival, neovascularization and immune function.
  • STAT3 plays an important role in the development of cancer.
  • a large number of malignancies, animal model experiments, and activated STAT3 have been found in cancer patients, and STAT3 regulates the expression of many different genes that cause and develop cancer.
  • STAT3 is known to inhibit the expression of mediators required for immune activation against tumor cells, and the activity of STAT3 also promotes the production of factors that activate STAT3 in a variety of immune cells while altering the gene expression program. It also suppresses.
  • meenchymal stem cell is a stem cell that is separated from bone marrow, blood, dermis and periosteum, and is pluripotent capable of differentiating into various cells such as adipocytes, chondrocytes and bone cells. Or multipotent cells.
  • mesenchymal stem cells used in the present invention means mesenchymal stem cells isolated from osteoarthritis patients.
  • the mesenchymal stem cells may be mesenchymal stem cells of animals, preferably mammals, and more preferably humans.
  • the process of isolating and culturing mesenchymal stem cells is well known in the art and is disclosed, for example, in US Pat. No. 5,486,359, which is incorporated herein by reference.
  • the mesenchymal stem cells can be obtained by separating them from the hematopoietic stem cells of bone marrow according to a known method and then proliferating without losing differentiation ability.
  • mesenchymal stem cells are isolated from mammalian, preferably human, mesenchymal stem cell sources, such as blood or bone marrow, including humans or mice.
  • the bone marrow can be extracted from the tibia, femur, spinal cord or iliac bone. Cells are then obtained from the bone marrow and these cells are cultured in a suitable medium. Suspension cells are removed during the culturing process and passaged cells attached to the culture plate to obtain finally established mesenchymal stem cells.
  • the medium used in the above process any medium commonly used for culturing stem cells can be used.
  • the medium contains serum (eg fetal calf serum, horse serum and human serum).
  • Mediums that can be used in the present invention are, for example, RPMI series, Eagles' MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130: 432 (1959)), ⁇ -MEM (Stanner, CP et al., Nat New Biol. 230: 52 (1971)), Iscove's MEM (Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147: 923 (1978)), DMEM (Dulbecco's modifation of Eagle's medium, Dulbecco, R. et al., VirProcy 8: 396 (1959)), and the like.
  • the medium may include other components such as antibiotics or antifungal agents (eg, penicillin, streptomycin), glutamine, and the like.
  • antibiotics or antifungal agents eg, penicillin, streptomycin
  • glutamine e.g., glutamine
  • identification of mesenchymal stem cells can be performed, for example through flow cytometry.
  • flow cytometry is performed using specific surface markers of mesenchymal stem cells.
  • mesenchymal stem cells show a positive response to CD44, CD29 and / or MHC class I.
  • the mesenchymal stem cells used in the present invention show a positive response to the surface markers CD44, CD29 and CD105, and for CD34, CD45 and HLA-DR (Human Leukocyte Antigen-Antigen D Related) Indicates a negative response.
  • the term positive reaction used while referring to stem cells and surface markers means that the antibody specifically binds to the surface antigens of the stem cells when the stem cells are treated with an antibody against the surface markers.
  • the present invention is a osteoarthritis treatment kit comprising a composition for intravenous administration comprising the mesenchymal stem cells treated with the STAT3 inhibitor as an active ingredient and an intraarticular administration composition comprising the mesenchymal stem cells as an active ingredient, and Provided are osteoarthritis osteoarthritis prevention and treatment methods using the same.
  • composition for intravenous administration comprising mesenchymal stem cells treated with the STAT3 inhibitor and the composition for intraarticular administration including mesenchymal stem cells may be administered simultaneously.
  • the "simultaneous" administration means intravenous administration of a composition comprising the mesenchymal stem cells treated with the STAT3 inhibitor, followed by intraarticular administration of the composition comprising the mesenchymal stem cells or a composition comprising the mesenchymal stem cells. After intraarticular administration, it means administering a composition comprising mesenchymal stem cells treated with the STAT3 inhibitor, or simultaneously administering a composition for intravenous administration and a composition for intraarticular administration.
  • the STAT3 inhibitor is STA-21 (8-hydroxy-3-methyl-3,4-dihydrotetraphene-1,7,12 (2H) -trione), SD282, metformin, AG-490 ((E) -2-Cyano-3- (3,4-dihydrophenyl) -N- (phenylmethyl) -2-propenamide), Atiprimod; 3- (8,8-dipropyl-3-azaspiro [4.5 ] decan-3-yl) -N, N-diethylpropan-1-amine), auranofin (3,4,5-triacetyloxy-6- (acetyloxymethyl) oxane-2-thiolate; triethylphosphanium), orosiomaleate (Aurothiomalate; Sodium 2- (auriosulfanyl) -3-carboxypropanoate), BMS-354825 (Dasatinib; N- (2-chloro-6-methylphen
  • the STAT3 inhibitor may be treated with a concentration of 0.1 ⁇ M to 100 ⁇ M in mesenchymal stem cells of 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 7 cells to incubate for 24 to 72 hours at a temperature of 37 ° C. to obtain mesenchymal stem cells excellent in the treatment of immune diseases.
  • statin-based compounds include cilastatin, nystatin, nystatin, lovastatin, somatostatin, pravastatin, simvastatin, fluvastatin, fluvastatin, and the like. It may be an atorvastatin, cervastatin, cerinastatin, ulinastatin, or rosuvastatin.
  • the STAT3 inhibitor-treated mesenchymal stem cells are CD44, CD29 and CD105 is positive, CD34, CD45 and HLA-DR (Human Leukocyte Antigen-antigen D Related) is negative immunological features It may be to have.
  • the mesenchymal stem cells treated with the STAT3 inhibitor are interleukin-6 (IL-6), Vascular endothelial growth factor (VEGF) or interleukin-1 ⁇ (Interleukin-1 beta, IL). Expression of a factor of -1 ⁇ may be suppressed.
  • IL-6 interleukin-6
  • VEGF Vascular endothelial growth factor
  • IL-1 ⁇ Interleukin-1 beta, IL
  • the mesenchymal stem cells may be isolated from peripheral blood or adipose tissue.
  • the term “treatment” reverses, alleviates, inhibits the progression of, or a disease or condition to which the term applies, or one or more symptoms of the disease or condition, or by prophylaxis, the term, as used herein, refers to the act of treating.
  • the treatment or therapy of an immune disease such as osteoarthritis in a mammal may comprise one or more of the following:
  • composition of the kit according to the invention may comprise mesenchymal stem cells or mesenchymal stem cells treated with a pharmaceutically effective amount of a STAT3 inhibitor alone or may comprise one or more pharmaceutically acceptable carriers, excipients or diluents.
  • the pharmaceutically effective amount herein refers to an amount sufficient to prevent, ameliorate and treat the symptoms of an immune disease.
  • pharmaceutically acceptable refers to a composition that is physiologically acceptable and does not normally cause an allergic reaction, such as gastrointestinal disorders, dizziness, or the like when administered to a human.
  • carriers, excipients and diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, Polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers and preservatives may be further included.
  • compositions of the present invention may be formulated using methods known in the art to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to a mammal.
  • the formulations may be in the form of powders, granules, tablets, emulsions, syrups, aerosols, soft or hard gelatin capsules, sterile injectable solutions, sterile powders.
  • the dosage of the active ingredient of the composition of the present invention may be appropriately selected according to several factors such as the route of administration, the age, sex, weight of the patient and the severity of the patient, and the composition according to the present invention prevents the symptoms of osteoarthritis. It may be administered in combination with a known compound having an effect of improving, treating or treating.
  • Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention may vary depending on factors such as the formulation method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response to the recipient. Can be.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is preferably 1 x 10 3 to 1 x 10 12 cells / kg per day.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered in a therapeutically effective amount or in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and an effective dose level is determined by the type and severity of the subject, age, sex, activity of the drug, drug Sensitivity, time of administration, route of administration and rate of release, duration of treatment, factors including concurrent use of drugs, and other factors well known in the medical arts.
  • the present inventors obtained mesenchymal stem cells through the following process. First, in osteoarthritis patients, the adipose tissue obtained after surgery was washed 10 times or more with PBS containing 10% penicillin-streptomycin to remove blood and foreign matter, and the tissue was cut finely to 0.2-0.3 g. The solution was added to a 0.2% collagenase (Roche, Sandhofer Strasse, Mannheim, Germany) solution and reacted at 37 ° C. in a water bath at 100 rpm for 1 hour. After separating the solution layer and the undecomposed fragments by the collagenase using a 100 ⁇ m mesh, the same amount of PBS was added to the separated collagenase solution.
  • PBS penicillin-streptomycin
  • MSC basal medium (Cambrex, Walkersville, MD, USA)
  • mesenchymal cell growth aid (Cambrex, Walkersville, MD, USA) 4 mM L-glutamine and penicillin (0.025 unit / 500 mL) / streptomycin (0.025 mg / 500 mL)] was added and centrifuged again at 4 ° C. and 1200 rpm for 5 minutes.
  • MSCGM is a medium based on Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) containing fetal calf serum. Subsequently, the supernatant was removed, and the obtained mesenchymal stem cells were inoculated in a culture dish and cultured in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator with MSCGM. Incubate while replacing the culture medium every other day.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • Osteoarthritis animal models were prepared to test the osteoarthritis pain relief effect of the kits of the present invention.
  • a 5-week-old male Wistar rat 200-250 g
  • osteoarthritis was induced by administering monosodium iodoacetate (MIA, Sigma, ST. Louis, MO) at a dose of 3 mg / 50 ⁇ l to the right knee of the rat to induce osteoarthritis.
  • MIA monosodium iodoacetate
  • the mesenchymal stem cells treated with STA-21 of 3x10 5 cell number of Preparation Example 2 in the osteoarthritis animal model of Preparation Example 2 intraarticularly Either by intraarticular injection (STA21 OA-MSC IA) or intravenous injection (STA21 OA-MSC IV).
  • STA21 OA-MSC IA intraarticular injection
  • STA21 OA-MSC IV intravenous injection
  • MIA intravenous injection
  • Example 1-1 Pain Relief Effects of STA-21 Treated Mesenchymal Stem Cells Following Intravenous Injection (IV)
  • OA-MSC IV OA-derived MSC injected intravenously
  • the mesenchymal stem cells treated with STA-21 administered intravenously over days (0, 3, 11, 22 and 29 days) after administration were alleviated more pain than MSC derived from OA patients. Confirmed. In particular, it was confirmed that the pain relief effect persists even after the administration.
  • cartilage damage was suppressed in the OA-MSC IV-injected group (OA-MSC IV) administered intravenously than the MIA-only group, and STA-21 was treated more than the OA-MSC IV group.
  • Intravenous administration of isolated mesenchymal stem cells (STA21-MSC IV) further confirmed that the cartilage damage was alleviated.
  • H & E staining was performed to analyze the degree of cartilage damage in each group, and the total Mankin score, OARSI score and structure of each group were confirmed (FIG. 4).
  • il-6, TNF-a, HIF2-a, IL-6 (beta) IHC staining were performed to analyze cells expressing inflammatory cytokines expressed in cartilage of each group, and confirmed them (FIG. 5). The results are shown in FIGS. 4 and 5.
  • STA-21 treated mesenchymal stem cells were intravenously administered (STA21-MSC IV), the group administered with MIA only and the group injected with MSC derived from intravenous OA patients (OA- It was confirmed that cartilage damage is reduced than MSC IV).
  • STA-21 treated mesenchymal stem cells STA21-MSC IV
  • STA21-MSC IV STA-21 treated mesenchymal stem cells
  • Example 1-2 Pain Relief Effect of STA-21 Treated Mesenchymal Stem Cells Following Intra-articular Injection (IA)
  • the spinal cord was revealed by separating the spine and removing the dorsal part of the spine at the time of animal sacrifice. After that, the Dorsal Root Ganglion tissue was collected between lumbar spine 1-5 and the pain inhibition was directly observed through the immunostaining method to confirm the expression of CGRP, a pain transporter. The results are shown in FIG.
  • the osteoarthritis animal model of Preparation Example 3 was injected with intraarticular injection of mesenchymal stem cells treated with STA-21 of 3x10 5 cell number of Preparation Example 1, and STA-21 of 3x10 5 cell number of Preparation Example 2 was Treated mesenchymal stem cells were injected by intravenous injection (STA21 OA-MSC IA + IV).
  • STA21 OA-MSC IV intravenous injection
  • STA-21-treated mesenchymal stem cells alone by intra-articular injection STA21 OA-MSC IA
  • MIA was administered as a control (MIA).
  • Sta21-MSCs and chondrocytes (A), osteoclasts (B), osteoblasts (c) Were co-cultured, and the active factors of each cell were analyzed. Each cell was co-cultured with 1 ⁇ 10 4 , and 3 uM trans wells were used for co-culture. The target cells were seeded on the plate below and STA21-MSC was seeded on the trans well. The results are shown in FIG.
  • IL-6 cytokine an inflammation-related factor
  • metformin an inflammation-related factor
  • IL-10 cytokine expression an anti-inflammatory factor

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Abstract

본 발명은 STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 정맥내 투여용 조성물; 및 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 관절강내 투여용 조성물을 포함하는 통증이 경감되는 골관절염 치료용 키트 및 이를 이용한 골관절염 예방 및 치료 방법에 관한 것으로, STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포를 정맥내 투여하고 동시에 간엽줄기세포를 관절강내 투여함으로써 골관절염의 통증을 경감시키면서도 치료할 수 있다.

Description

통증이 경감되는 골관절염 치료용 키트
본 발명은 STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 정맥내 투여용 조성물 및 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 관절강내 투여용 조성물을 포함하는 통증이 경감되는 골관절염 치료용 키트, 및 이를 이용한 골관절염 예방 및 치료 방법에 관한 것이다.
골관절염은 퇴행성 관절염으로도 명명되는 관절염의 일종으로서, 특정한 기질적 원인이 없이 주로 노년에 많이 발생되며 만성적으로 진행되면 관절구조의 변형으로 보행 장애 등의 운동 장애를 수반한다. 골관절염은 주로 관절연골(cartilage)의 점진적인 손상이나 퇴행성 변화로 인해 관절을 이루는 뼈와 인대 등에 손상이 일어나서 염증과 통증이 발생된다.
골관절염이 진행될 때 TNF-α, IL-1 등의 염증성 사이토카인(cytokine)의 생성이 증가하고 콜라게네이즈(collagenase), 스트로멜라이신(stromelysin) 등과 같은 MMPs의 분비가 증가되어 관절연골의 파괴가 이루어지게 된다. 또한 MMPs는 IL-1, TNF-α 등을 유도시키게 되는데 이로 인하여 근육, 건, 인대 등과 같은 조직에도 영향을 끼쳐 심한 통증을 일으킨다.
현재 골관절염의 치료를 위해서는, 아세트아미노펜, 트라마돌, 비스테로이드성 항염제(NSAIDs), 디아세린, 글루코사민 등의 약물이 사용되고 있으나, 골관절염의 통증을 일시적으로 경감시키는데 그치고 있다. 이에 따라, 골관절염을 치료하면서도 통증을 효과적으로 경감시킬 수 있는 치료법에 대한 필요성이 대두되고 있다.
본 발명의 목적은 STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3) 억제제가 처리된 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 정맥내 투여용 조성물; 및 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 관절강내 투여용 조성물을 포함하는, 통증이 경감되는 골관절염 치료용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 약학적으로 유효한 양의 STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3) 억제제가 처리된 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 조성물을 정맥내 투여하고, 동시에 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 조성물을 관절강내 투여하는 단계를 포함하는 골관절염 예방 및 치료 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3) 억제제가 처리된 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 정맥내 투여용 조성물; 및 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 관절강내 투여용 조성물을 포함하는, 통증이 경감되는 골관절염 치료용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 관절강내 투여용 조성물은 STAT3 억제제가 처리될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 STAT3 억제제는 STA-21 (8-hydroxy-3-methyl-3,4-dihydrotetraphene-1,7,12(2H)-trione), SD282, 메트포민, AG-490 ((E)-2-Cyano-3-(3,4-dihydrophenyl)-N-(phenylmethyl)-2-propenamide), 아티프리모드 (Atiprimod; 3-(8,8-dipropyl-3-azaspiro[4.5]decan-3-yl)-N,N- diethylpropan-1-amine), 오라노핀 (Auranofin; 3,4,5-triacetyloxy-6- (acetyloxymethyl) oxane-2-thiolate; triethylphosphanium), 오로싸이오말레이트 (Aurothiomalate; Sodium 2-(auriosulfanyl)-3-carboxypropanoate), BMS-354825 (Dasatinib; N-(2-chloro-6-methylphenyl)-2-[[6-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-2-methyl-4-pyrimidinyl]amino]-5-thiazole carboxamide monohydrate), CADPE (3-(3,4-dihydroxy-phenyl)-acrylic acid 2-(3,4-dihydroxy-phenyl)-ethyl ester), 스타틱 (Stattic; 6-nitro-1,1-dioxide-benzo[b]thiophene), 도베실레이트 (Dobesilate; calcium 2,5-dihydroxybenzenesulfonate), 에탄올(Ethanol), NCX-4016(NO-Aspirin), 넬피나비어(Nelfinavir; (3S,4aS,8aS)-N-tert-butyl-2-[(2R,3R)-2-hydroxy-3-[(3-hydroxy-2-methylphenyl)formamido]-4-(phenylsulfanyl)butyl]-decahydroisoquinoline-3-carboxamide), PDP(phosphododecapeptide), PS-341(볼테조밉(Bortezomib); [(1R)-3-methyl-1-({(2S)-3-phenyl-2-[(pyrazin-2-ylcarbonyl)amino]propanoyl}amino)butyl]boronic acid), R115777(티피파르닙(tipifarnib); 6-[amino(4-chlorophenyl)(1-methyl-1H-imidazol-5-yl)methyl]-4-(3-chlorophenyl)-1-methylquinolin-2(1H)-one), S31-M2001(N-Hexyl-2-(1-naphthalenyl)-5-[[4-(phosphonooxy)phenyl]), 스타틴계 화합물, 소듐살리실레이트(Sodium Salicylate), 카페익산(Caffeic acid; 3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-2-propenoic acid 3,4-Dihydroxy-cinnamic acid trans-Caffeate 3,4-Dihydroxy-trans-cinnamate)), 에모딘(Emodin; 1,8-Dihydroxy-3-(hydroxymethyl)-9,10-anthracenedione), 우르솔릭산(Ursolic acid; 3-beta-3-hydroxy-urs-12-ene-28-oic-acid), 레스베라트롤(Resveratrol; 3,5,4'-trihydroxy-trans-stilbene), 레티노익산(Retinoic acid; (2E,4E,6E,8E)-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohexen-1-yl)nona-2,4,6,8-tetraenoic acid), EGCG(Epigallocatechin gallate; [(2R,3R)-5,7-dihydroxy-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)chroman-3-yl] 3,4,5-trihydroxybenzoate), Sr11302((E,E,Z,E)-3-Methyl-7-(4-methylphenyl)-9-(2,6,6-trimethyl-1-cyclohexen-1-yl)-2,4,6,8-nonatetraenoic acid), 탄시논 IIA(Tanshinone IIA; 1,6,6-Trimethyl-6,7,8,9-tetrahydrophenanthro[1,2-b]furan-10,11-dione) 및 커큐민(curcumin; (1E,6E)-1,7-Bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 예를 들어, 상기 STAT3 억제제는 STA-21, SD282 또는 메트포민일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 정맥내 투여용 조성물의 투여 후 바로 상기 관절강내 투여용 조성물을 투여하거나, 상기 관절강내 투여용 조성물을 투여한 후 바로 상기 정맥내 투여용 조성물을 투여하거나, 또는 상기 정맥내 투여용 조성물과 상기 관절강내 투여용 조성물을 동시에 투여할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포는 통증을 경감시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 간엽줄기세포는 골관절염 환자의 말초혈액 또는 지방조직으로부터 분리된 것일 수 있다.
또한 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3) 억제제가 처리된 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 조성물을 정맥내 투여하고, 동시에 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 조성물을 관절강내 투여하는 단계를 포함하는 골관절염 예방 및 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 조성물을 관절강내 투여는 STAT3 억제제가 처리될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 STAT3 억제제는 STA-21 (8-hydroxy-3-methyl-3,4-dihydrotetraphene-1,7,12(2H)-trione), SD282, 메트포민, AG-490 ((E)-2-Cyano-3-(3,4-dihydrophenyl)-N-(phenylmethyl)-2-propenamide), 아티프리모드 (Atiprimod; 3-(8,8-dipropyl-3-azaspiro[4.5]decan-3-yl)-N,N- diethylpropan-1-amine), 오라노핀 (Auranofin; 3,4,5-triacetyloxy-6- (acetyloxymethyl) oxane-2-thiolate; triethylphosphanium), 오로싸이오말레이트 (Aurothiomalate; Sodium 2-(auriosulfanyl)-3-carboxypropanoate), BMS-354825 (Dasatinib; N-(2-chloro-6-methylphenyl)-2-[[6-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-2-methyl-4-pyrimidinyl]amino]-5-thiazole carboxamide monohydrate), CADPE (3-(3,4-dihydroxy-phenyl)-acrylic acid 2-(3,4-dihydroxy-phenyl)-ethyl ester), 스타틱 (Stattic; 6-nitro-1,1-dioxide-benzo[b]thiophene), 도베실레이트 (Dobesilate; calcium 2,5-dihydroxybenzenesulfonate), 에탄올(Ethanol), NCX-4016(NO-Aspirin), 넬피나비어(Nelfinavir; (3S,4aS,8aS)-N-tert-butyl-2-[(2R,3R)-2-hydroxy-3-[(3-hydroxy-2-methylphenyl)formamido]-4-(phenylsulfanyl)butyl]-decahydroisoquinoline-3-carboxamide), PDP(phosphododecapeptide), PS-341(볼테조밉(Bortezomib); [(1R)-3-methyl-1-({(2S)-3-phenyl-2-[(pyrazin-2-ylcarbonyl)amino]propanoyl}amino)butyl]boronic acid), R115777(티피파르닙(tipifarnib); 6-[amino(4-chlorophenyl)(1-methyl-1H-imidazol-5-yl)methyl]-4-(3-chlorophenyl)-1-methylquinolin-2(1H)-one), S31-M2001(N-Hexyl-2-(1-naphthalenyl)-5-[[4-(phosphonooxy)phenyl]), 스타틴계 화합물, 소듐살리실레이트(Sodium Salicylate), 카페익산(Caffeic acid; 3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-2-propenoic acid 3,4-Dihydroxy-cinnamic acid trans-Caffeate 3,4-Dihydroxy-trans-cinnamate)), 에모딘(Emodin; 1,8-Dihydroxy-3-(hydroxymethyl)-9,10-anthracenedione), 우르솔릭산(Ursolic acid; 3-beta-3-hydroxy-urs-12-ene-28-oic-acid), 레스베라트롤(Resveratrol; 3,5,4'-trihydroxy-trans-stilbene), 레티노익산(Retinoic acid; (2E,4E,6E,8E)-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohexen-1-yl)nona-2,4,6,8-tetraenoic acid), EGCG(Epigallocatechin gallate; [(2R,3R)-5,7-dihydroxy-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)chroman-3-yl] 3,4,5-trihydroxybenzoate), Sr11302((E,E,Z,E)-3-Methyl-7-(4-methylphenyl)-9-(2,6,6-trimethyl-1-cyclohexen-1-yl)-2,4,6,8-nonatetraenoic acid), 탄시논 IIA(Tanshinone IIA; 1,6,6-Trimethyl-6,7,8,9-tetrahydrophenanthro[1,2-b]furan-10,11-dione) 및 커큐민(curcumin; (1E,6E)-1,7-Bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 예를 들어, 상기 STAT3 억제제는 STA-21, SD282 또는 메트포민일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 조성물을 정맥내 투여하는 것은 골관절염의 통증을 경감시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 간엽줄기세포는 골관절염 환자의 말초혈액 또는 지방조직으로부터 분리된 것일 수 있다.
본 발명에 따른 STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포는 염증유발인자의 발현을 효과적으로 억제할 수 있고, 항염증인자의 발현을 효과적으로 증가시키며, 케모카인 수용체(chemokine receptor)의 발현을 증가시키는 효과가 우수하다.
환자 유래의 간엽줄기세포는 일반적인 줄기세포를 사용하는 경우보다 줄기세포의 연골보호나 골관절염 염증 제어 효능을 더욱 개선할 수 있으며, 면역거부반응 등의 부작용을 최소화 할 수 있다. 다만 환자 유래의 간엽줄기세포는 줄기세포는 고령화 줄기세포일 경우가 많고, 자체의 기능이 저하되어 있기 때문에, 이를 포함하는 조성물은 면역질환의 치료제로서 더욱 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명에 따른 키트를 사용하여 STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포를 정맥내 투여하고, 동시에 간엽줄기세포를 관절강내 투여함으로써, 관절염의 치료하면서 통증을 효과적으로 경감시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에서 간엽줄기세포 또는 STA-21이 처리된 간엽줄기세포를 정맥내 투여했을 때 통증 정도를 나타낸 도이다.
도 2는 투여 후 경과(0, 3, 11, 22 및 29일)에 따라 일 실시예에서 간엽줄기세포 또는 STA-21이 처리된 간엽줄기세포를 정맥내 투여했을 때 통증 정도를 나타낸 도이다.
도 3은 일 실시예에서 간엽줄기세포 또는 STA-21이 처리된 간엽줄기세포를 정맥내 투여했을 때 micro-CT로 연골 손상 정도를 나타낸 도이다.
도 4는 일 실시예에서 간엽줄기세포 또는 STA-21이 처리된 간엽줄기세포를 정맥내 투여했을 때 H&E 염색으로 연골 손상 정도를 나타낸 도이다.
도 5는 일 실시예에서 간엽줄기세포 또는 STA-21이 처리된 간엽줄기세포를 정맥내 투여했을 때 염증성 사이토카인 발현을 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에서 간엽줄기세포 또는 STA-21이 처리된 간엽줄기세포를 관절강내 투여했을 때 통증 정도를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에서 간엽줄기세포를 관절강내 투여하고 동시에 STA-21이 처리된 간엽줄기세포를 정맥내 투여했을 때의 통증 정도를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에서 연골 손상 정도를 나타내는 micro-CT 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에서 간엽줄기세포를 관절강내 투여하고 동시에 STA-21이 처리된 간엽줄기세포를 정맥내 투여했을 때의 Ganglion 조직 내에 통증 마커 CGRP를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에서 STA-21이 처리된 간엽줄기세포를 관절강내 투여하고 동시에 STA-21이 처리된 간엽줄기세포를 정맥내 투여했을 때의 통증 정도를 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에서 연골 손상 정도를 확인하기 위하여 H&E 염색한 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에서 연골 손상 정도를 확인하기 위하여 C. Micro CT 분석을 통하여 골 볼륨(%)을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 명의 일 실시예에서 STA-21이 처리된 간엽줄기세포를 관절강내 투여하고 동시에 STA-21이 처리된 간엽줄기세포를 정맥내 투여했을 때의 통증 마커 TRPV1를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 in vitro 내 STA21 처리된 MSC의 타깃 세포 활성 조절 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에서 SD-282 및 메트포민에 의한 통증 조절 및 연골보호 인자 발현 정도를 나타낸 도이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에서 SD-282 및 메트포민에 의한 항염증 및 연골보호에 대한 결과를 나타낸 도이다.
이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 상세히 설명한다. 이하의 설명에 있어, 당업자에게 주지 저명한 기술에 대해서는 그 상세한 설명을 생략할 수 있다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다.
따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명의 용어, "STATs(Signal Transducer and Transcriptions)"는 STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5A, STAT5B, STAT6의 7개의 subunit 형태를 가지는 전사인자이다. STATs은 N-터미널 도메인(ND), 코일드-코일 도메인(CCD), DNA-바인딩 도메인(DBD), 링커 도메인(LD), Src 호몰로지2(SH2) 및 전사활성 도메인(TAD)이 포함된 6가지 별개의 구조적 도메인을 공유하며, 그 중에 STAT3는 활성화에 의해 인산화되는 C-말단에 중요한 티로신(tyrosine)과 세린(serine) 잔기(Tyrosine 705, Serine 727 residues for STAT3)를 가지고 있다. 특히, STAT3는 다양한 경로를 통해 지속적으로 활성화 되어 종양형성을 촉진하는 역할을 하며, 또한 STAT3는 다양한 사이토카인과 성장인자-인터페론, 표피의 성장인자, 혈소판 유래된 성장인자, 인터루킨5, 인터루킨6, 간세포 성장인자, LIF(leukemia inhibitory factor), 뼈 형성유전 단백질2, 호르몬 렙틴, Src와 Ras같은 발암 단백질에 대한 반응으로써 티로신 705, 세린 727의 두 잔기에 인산화를 통하여 활성화된다. STAT3는 인간 세포에서 여러 유전자의 전사에 관여하는 전사조절인자이며, 정상적인 경우에는 외부로부터 사이토카인이나 성장 요소들에 의한 신호전달에 반응하여, 세포질에 존재하던 STAT3는 핵 안으로 이동하여 세포의 발달, 분화, 생장, 생존, 신생혈관합성 그리고 면역기능 등을 위한 유전자들을 조절한다, 그러나, STAT3가 비정상적일 경우에는 STAT3는 암의 발생에 중요한 기능을 한다. 많은 수의 악성종양, 동물모델 실험, 암 환자에서 활성화된 STAT3가 발견되었으며 STAT3에 의해서 암을 유발하고 발전시키는 여러 다양한 유전자의 발현을 조절한다. STAT3는 종양 세포에 대항하는 면역 활성화에 필요한 중재자의 발현을 억제하는 것으로 알려져 있고, 또한, STAT3의 활성은 유전자발현 프로그램을 변경하면서 다양한 면역 세포에서 STAT3을 활성화시키는 인자들의 생산을 촉진함으로써 항암면역 반응을 억제하기도 한다.
본 발명에서 용어, "간엽줄기세포"는 골수(bone marrow), 혈액, 진피 및 골막에서 분리되는 줄기세포로서, 다양한 세포 예컨대 지방세포, 연골세포 및 뼈세포 등으로 분화할 수 있는 전능성(pluripotent) 또는 다능성(multipotent) 세포를 의미한다.
또한, 본 발명에서 사용된 "간엽줄기세포"는 골관절염 환자로부터 분리한 간엽줄기세포를 의미한다. 상기 간엽줄기세포는 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간의 간엽줄기세포일 수 있다. 간엽줄기세포를 분리 및 배양하는 과정은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예컨대, 미국특허 제5,486,359호에 개시되어 있으며, 상기 특허 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 또한, 상기 간엽줄기세포는 공지된 방법에 따라 골수의 조혈모세포로부터 부착특성에 의해 분리한 후 분화능력을 잃지 않은 상태에서 증식시켜 얻을 수 있다.
보다 구체적으로는, 인간 또는 마우스를 포함하는 포유동물, 바람직하게는, 인간의 간엽줄기세포 소스, 예컨대, 혈액 또는 골수로부터 간엽줄기세포를 분리한다. 상기 골수는 경골, 대퇴골, 척수 또는 장골로부터 추출할 수 있다. 이어, 골수로부터 세포를 얻고, 이들 세포를 적합한 배지에서 배양한다. 배양과정에서 부유 세포를 제거하고 배양 플레이트에 부착된 세포들을 계대 배양하여, 최종적으로 구축된(established) 간엽줄기세포를 수득한다. 상기 과정에서 이용되는 배지로는, 줄기세포의 배양에 이용되는 일반적인 어떠한 배지도 이용할 수 있다. 바람직하게는, 혈청(예컨대, 우태아 혈청, 말 혈청 및 인간 혈청)이 함유된 배지이다. 본 발명에서 이용될 수 있는 배지는, 예를 들어, RPMI 시리즈, Eagles's MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959)), α-MEM (Stanner, C.P. et al., Nat. New Biol. 230:52(1971)), Iscove's MEM (Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147:923(1978)), DMEM (Dulbecco's modifA ation of Eagle's medium, Dulbecco, R.et al., VirProcy 8:396(1959)) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 배지에는, 다른 성분, 예를 들어, 항생제 또는 항진균제(예컨대, 페니실린, 스트렙토마이신) 및 글루타민 등이 포함될 수 있다. 배지 및 배양에 대한 일반적인 설명은 R. Ian Freshney, Culture of Animal Cells, Alan R. Liss, Inc., New York (1984)에 기재되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
또한, 간엽줄기세포의 확인은, 예컨대, 유세포 분석을 통하여 할 수 있다. 이러한 유세포 분석은, 간엽줄기세포의 특이한 표면 마커를 이용하여 실시된다. 예컨대, 간엽줄기세포는 CD44, CD29 및/또는 MHC 클래스 I에 대하여 양성 반응을 나타낸다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 간엽줄기세포는 표면 마커 CD44, CD29 및 CD105에 대하여 양성 반응을 나타내며, CD34, CD45 및 HLA-DR(Human Leukocyte Antigen - antigen D Related)에 대해서는 음성 반응을 나타낸다. 줄기세포와 표면 마커를 언급하면서 사용되는 용어양성 반응은 표면 마커에 대한 항체를 줄기세포에 처리하는 경우, 줄기세포의 표면 항원과 특이적으로 결합하는 양상을 의미한다.
본 발명은 STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 정맥내 투여용 조성물 및 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 관절강내 투여용 조성물을 포함하는 통증이 경감되는 골관절염 치료용 키트, 및 이를 이용한 골관절염 골관절염 예방 및 치료 방법을 제공한다.
상기 STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포를 포함하는 정맥내 투여용 조성물과 간엽줄기세포를 포함하는 관절강내 투여용 조성물은 동시에 투여될 수 있다. 이때, “동시에” 투여된다는 것은, 상기 STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포를 포함하는 조성물을 정맥내 투여한 후 상기 간엽줄기세포를 포함하는 조성물을 관절강내 투여하거나, 상기 간엽줄기세포를 포함하는 조성물을 관절강내 투여한 후 상기 STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포를 포함하는 조성물을 투여하거나, 또는 정맥내 투여용 조성물과 상기 관절강내 투여용 조성물을 동시에 투여하는 것을 의미한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 STAT3 억제제는 STA-21(8-hydroxy-3-methyl-3,4-dihydrotetraphene-1,7,12(2H)-trione), SD282, 메트포민, AG-490((E)-2-Cyano-3-(3,4-dihydrophenyl)-N-(phenylmethyl)-2-propenamide), 아티프리모드(Atiprimod; 3-(8,8-dipropyl-3-azaspiro[4.5]decan-3-yl)-N,N- diethylpropan-1-amine), 오라노핀(Auranofin; 3,4,5-triacetyloxy-6- (acetyloxymethyl) oxane-2-thiolate; triethylphosphanium), 오로싸이오말레이트(Aurothiomalate; Sodium 2-(auriosulfanyl)-3-carboxypropanoate), BMS-354825(Dasatinib; N-(2-chloro-6-methylphenyl)-2-[[6-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-2-methyl-4-pyrimidinyl]amino]-5-thiazole carboxamide monohydrate), CADPE(3-(3,4-dihydroxy-phenyl)-acrylic acid 2-(3,4-dihydroxy-phenyl)-ethyl ester), 스타틱(Stattic; 6-nitro-1,1-dioxide-benzo[b]thiophene), 도베실레이트(Dobesilate; calcium 2,5-dihydroxybenzenesulfonate), 에탄올(Ethanol), NCX-4016(NO-Aspirin), 넬피나비어(Nelfinavir; (3S,4aS,8aS)-N-tert-butyl-2-[(2R,3R)-2-hydroxy-3-[(3-hydroxy-2-methylphenyl)formamido]-4-(phenylsulfanyl)butyl]-decahydroisoquinoline-3-carboxamide), PDP(phosphododecapeptide), PS-341(볼테조밉(Bortezomib); [(1R)-3-methyl-1-({(2S)-3-phenyl-2-[(pyrazin-2-ylcarbonyl)amino]propanoyl}amino)butyl]boronic acid), R115777(티피파르닙(tipifarnib); 6-[amino(4-chlorophenyl)(1-methyl-1H-imidazol-5-yl)methyl]-4-(3-chlorophenyl)-1-methylquinolin-2(1H)-one), S31-M2001(N-Hexyl-2-(1-naphthalenyl)-5-[[4-(phosphonooxy)phenyl]), 스타틴계 화합물, 소듐살리실레이트(Sodium Salicylate), 카페익산(Caffeic acid; 3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-2-propenoic acid 3,4-Dihydroxy-cinnamic acid trans-Caffeate 3,4-Dihydroxy-trans-cinnamate)), 에모딘(Emodin; 1,8-Dihydroxy-3-(hydroxymethyl)-9,10-anthracenedione), 우르솔릭산(Ursolic acid; 3-beta-3-hydroxy-urs-12-ene-28-oic-acid), 레스베라트롤(Resveratrol; 3,5,4'-trihydroxy-trans-stilbene), 레티노익산(Retinoic acid; (2E,4E,6E,8E)-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohexen-1-yl)nona-2,4,6,8-tetraenoic acid), EGCG(Epigallocatechin gallate; [(2R,3R)-5,7-dihydroxy-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)chroman-3-yl] 3,4,5-trihydroxybenzoate), Sr11302((E,E,Z,E)-3-Methyl-7-(4-methylphenyl)-9-(2,6,6-trimethyl-1-cyclohexen-1-yl)-2,4,6,8-nonatetraenoic acid), 탄시논 IIA(Tanshinone IIA; 1,6,6-Trimethyl-6,7,8,9-tetrahydrophenanthro[1,2-b]furan-10,11-dione) 및 커큐민(curcumin; (1E,6E)-1,7-Bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있으며, 예를 들어, STA-21, SD282 또는 메트포민일 수 있다.
상기 STAT3 억제제는 1x105~1x107 세포수의 간엽줄기세포에 0.1μM~100μM의 농도로 처리하여 37℃의 온도에서 24~72시간 배양하여 면역질환 치료능이 우수한 간엽줄기세포를 수득할 수 있다.
상기 STAT3 억제제 중, "스타틴계 화합물"은 실라스타틴(Cilastatin), 나이스타틴(Nystatin), 로바스타틴(Lovastatin), 소마토스타틴(Somatostatin), 프라바스타틴(Pravastatin), 심바스타틴(Simvastatin), 플루바스타틴(Fluvastatin), 아토바스타틴(Atorvastatin), 세르바스타틴(Cervastatin), 울리나스타틴(Ulinastatin) 또는 로슈바스타틴(Rosuvastatin)인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포는 CD44, CD29 및 CD105는 양성이며, CD34, CD45 및 HLA-DR(Human Leukocyte Antigen - antigen D Related)는 음성의 면역학적 특징을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포는 인터루킨-6(Interleukin-6, IL-6), VEGF(Vascular endothelial growth factor) 또는 인터루킨-1β(Interleukin-1 beta, IL-1β)의 인자의 발현이 억제되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 간엽줄기세포는 말초혈액 또는 지방조직으로부터 분리된 것일 수 있다.
본 발명의 용어, "치료"란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 치료란 용어는 치료하는 행위를 말한다. 따라서 포유동물에 있어서 골관절염과 같은 면역질환의 치료 또는 치료요법은 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:
(1) 면역질환의 성장을 저해함, 즉, 그 발달을 저지시킴;
(2) 면역질환의 확산을 예방함, 즉, 전이를 예방함;
(3) 면역질환을 경감시킴;
(4) 면역질환의 재발을 예방함; 및
(5) 면역질환의 증상을 완화함(palliating)
본 발명에 따른 키트의 조성물은 약학적으로 유효한 양의 STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포 또는 간엽줄기세포를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 면역질환의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.
또한, 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
또한, 본 발명에 조성물의 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있고, 본 발명에 따른 조성물은 골관절염의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 수용자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 1 x 103 ~1 x 1012 세포/kg 이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 치료적 유효량 또는 약학으로 유효한 양으로 투여한다. 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
제조예 1 : 간엽줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)의 획득 및 배양
본 발명자들은 하기의 과정을 통하여, 간엽줄기세포를 획득하였다. 우선, 골관절염 환자에서 외과적 수술 후에 얻어진 지방 조직을 10％ 페니실린-스트렙토마이신을 포함한 PBS로 10회 이상 세척하여 혈액과 이물질을 제거한 후, 조직을 0.2~0.3g이 되도록 잘게 절단하였다. 0.2％ 콜라게나아제(Roche, Sandhofer Strasse, Mannheim, Germany) 용액에 넣어서 37℃의 수욕, 100rpm에서 1시간 동안 반응시켰다. 100㎛ 메쉬를 이용하여 콜라게나아제에 의해서 분해된 용액층과 분해 되지 않은 조각을 분리한 후, 분리된 콜라게나아제 용액에 동량의 PBS를 첨가하였다. 이어, 4℃, 1200rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액인 지질과 지방층을 제거하고, 콜라게나아제 상층액을 제거하였다. 가라앉은 간엽줄기세포로부터 남은 콜라게나아제 용액을 제거하기 위해서 MSCGM[mesenchymal stem cell growth media: MSC 기본 배지 (Cambrex, Walkersville, MD, 미국), 간엽세포 성장보조물(Cambrex, Walkersville, MD, 미국), 4mM L-글루타민 및 페니실린(0.025 unit/500 ㎖)/스트렙토마이신(0.025 mg/500 ㎖)]를 넣어 다시 4℃, 1200 rpm에서 5분간 원심분리 하였다. MSCGM은 우태아혈청을 포함하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)에 기초한 배지이다. 이어, 상층액을 제거하고, 얻어진 간엽줄기세포는 배양접시에 접종하여 MSCGM으로 37℃, 5％ CO2 항온기에서 배양하였다. 이틀에 한번 씩 배양액을 교체하면서 배양하였다.
제조예 2 : STA-21이 처리된 간엽줄기세포의 제조
3x105 세포수의 상기 제조예 1의 간엽줄기세포에 5μM 농도의 STA-21를 처리한 후 37℃의 온도에서 24~72시간 배양하여 STA-21이 처리된 간엽줄기세포를 제조하였다.
제조예 3: 골관절염 동물 모델
본 발명의 키트의 골관절염 통증완화 효과를 실험하기 위해 골관절염 동물모델을 제작하였다.
구체적으로, 골관절염 동물모델을 제작하기 위해 200~250g인 5주령 수컷 Wistar 랫(rat)를 21~22℃의 온도에서 명암주기(light-dark cycle)를 12시간 간격으로 사육하였고 살균한 물과 사료를 공급하여 키웠다. 이후 골관절염 유도를 위해 랫(rat)의 오른쪽 무릎에 3mg/50μl의 용량으로 모노소듐 아이도아세테이트(Monosodium iodoacetate, MIA, Sigma, ST. Louis, MO)를 투여하여 골관절염을 유도하였다. MIA는 생리식염수에 용해시켜 투여하였다.
실시예 1 : 투여 경로에 따른 STA-21이 처리된 간엽줄기세포의 통증 경감 효과
투여 경로에 따른 STA-21이 처리된 간엽줄기세포의 통증 경감 효과를 확인하기 위해 제조예 3의 골관절염 동물모델에 제조예 2의 3x105 세포수의 STA-21이 처리된 간엽줄기세포를 관절강내 주사(intraarticular injection)(STA21 OA-MSC IA) 또는 정맥내 주사(intravenous injection)(STA21 OA-MSC IV)로 주입하였다. 또한, 비교예로서 제조예 1의 간엽줄기세포 단독으로 정맥내 주사(OA-MSC IV) 또는 관절강내 주사(OA-MSC IA)로 주입하고 대조군(MIA)으로는 MIA만을 투여하였다.
실시예 1-1. 정맥내 주사(IV)에 따른 STA-21이 처리된 간엽줄기세포의 통증 경감 효과
투여 2일 후 Dynamic plantat aesthsiometer(Ugo Basile, Comerio, Italy)를 이용하여 통증을 측정하였다. 기계의 통증 측정 방법은 측정 기계 위에 그물로 된 판을 얹고 그 위에 아크릴로 된 동물고정틀 안에 랫(rat)을 넣은 후, 측정기계로 약물이 주입된 오른발에 찔러 주었다. 찌른 후에 기계가 자동적으로 발을 떼는데 걸리는 시간(s, 초)과 얼마만큼의 무게를 주었을 때 발을 떼는지(g)를 측정하여 그때 나오는 시간과 무게를 기재하여 통증 측정 그래프를 그렸다. 그 결과를 도 1 및 2에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, MIA만을 투여한 군에 비해 정맥내 투여된 OA 환자 유래 MSC를 주입한 군(OA-MSC IV)이 통증을 완화시킴을 확인할 수 있었으며, 특히, 정맥내 투여된 STA-21이 처리된 간엽줄기세포가 OA 환자 유래 MSC에 비해 통증을 더 경감시킴을 확인할 수 있었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 투여 후 경과(0, 3, 11, 22 및 29일)에 따라 정맥내 투여된 STA-21이 처리된 간엽줄기세포가 OA 환자 유래 MSC에 비해 통증을 더 경감시킴을 확인하였다. 특히, 투여 후 경과가 지나도 통증 경감 효과가 지속됨을 확인하였다.
또한, 각 투여군의 연골 손상 정도를 확인하기 위하여, 랫의 대퇴골(Femur) 및 경골(Tibia)을 채취하여 micro-CT로 관찰하여 연골 파괴 정도를 확인하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, MIA만을 투여한 군보다 정맥내 투여된 OA 환자 유래 MSC를 주입한 군(OA-MSC IV)이 연골 손상이 억제되었으며, 상기 OA-MSC IV군 보다 STA-21이 처리된 간엽줄기세포를 정맥내 투여했을 경우(STA21-MSC IV) 더욱 연골 손상이 완화됨을 확인하였다.
또한, 상기 각 군의 연골 손상 정도를 분석하기 위하여 H&E 염색을 수행하였으며, 각 군의 총 Mankin score, OARSI score 및 structure를 확인하였다(도 4). 또한, 각 군의 연골에서 발현되는 염증성 사이토 카인을 발현하는 세포를 분석하기 위하여, il-6, TNF-a, HIF2-a, IL-6(beta) IHC 염색을 수행하였으며, 이를 확인하였다(도 5). 그 결과를 도 4 및 5에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, STA-21이 처리된 간엽줄기세포를 정맥내 투여했을 경우(STA21-MSC IV), MIA만을 투여한 군과 정맥내 투여된 OA 환자 유래 MSC를 주입한 군(OA-MSC IV)보다 연골 손상이 감소됨을 확인하였다.
또한, 도 5에 나타낸 바와 같이, STA-21이 처리된 간엽줄기세포를 정맥내 투여했을 경우(STA21-MSC IV) MIA만을 투여한 군과 비교하여 염증성 사이토카인 발현을 억제하여, 통증을 경감시킴을 확인하였다.
실시예 1-2. 관절강내 주사(IA)에 따른 STA-21이 처리된 간엽줄기세포의 통증 경감 효과
관절강내 주사에 따른 각 군의 통증 경감 효과 확인은 상기 실시예 1-1에 기재된 기계의 통증 측정 방법에 따라 측정하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, OA 환자 유래 MSC를 관절강내로 투여했을 때 정맥내 투여에 비해 통증억제 효과는 떨어지지만 연골 보호 효과는 더 좋은 것을 확인할 수 있었다. 또한, 관절강내 투여된 STA-21이 처리된 간엽줄기세포는 OA 환자 유래 MSC에 비해 연골 보호 및 통증 억제 둘 다에서 더 적은 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
실시예 2 : 본 발명의 키트에 의한 골관절염 치료 효과 분석
실시예 2-1. 본 발명의 키트에 의한 통증 억제 효과 확인
제조예 3의 골관절염 동물모델에게 제조예 1의 3x105 세포수의 간엽줄기세포를 관절강내 주사(intraarticular injection)로 주입하고 제조예 2의 3x105 세포수의 STA-21이 처리된 간엽줄기세포를 정맥내 주사(intravenous injection)로 주입하였다(STA21 IV + OA IA). 비교예로서 STA-21이 처리된 간엽줄기세포 단독으로 정맥내 주사(STA21 OA-MSC IA)로 주입하거나 간엽줄기세포 단독으로 관절강내 주사(OA-MSC IA)로 주입하였다. 대조군(MIA)으로는 MIA만을 투여하였다.
투여 후 2일이 경과한 다음부터 투여 후 28일 까지 실시예 1과 같은 방법으로 통증정도를 확인하고 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 볼 수 있는 바와 같이, 간엽줄기세포를 관절강내 주사로 주입하고 동시에 STA-21이 처리된 간엽줄기세포를 정맥내 주사로 주입했을 때(STA21 IV + OA IA), 비교예(STA21 OA-MSC IA 또는 OA-MSC IA)에 비해 개선된 통증 억제 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다. 또한, 투여 후 시간이 경과하여도 통증 억제 효과는 지속됨을 확인하였다.
실시예 2-2. 본 발명의 키트에 의한 연골 손상 억제 효과 확인
각 투여군의 연골 손상 정도를 확인하기 위하여, 랫의 대퇴골(Femur) 및 경골(Tibia)을 채취하여 micro-CT로 관찰하여 연골 파괴 정도를 확인하였다(도 8).
도 8에 나타낸 바와 같이, 간엽줄기세포를 관절강내 투여하고 동시에 STA-21이 처리된 간엽줄기세포를 정맥내 투여했을 경우(STA21 IV + OA IA), 비교예(STA21 OA-MSC IA 또는 OA-MSC IA)에 비해 연골 파괴가 억제된 것이 관찰되었다.
실시예 2-3: 본 발명의 키트에 의한 조직 내에 통증 마커 확인 및 신경 통증 억제 효과 확인
통증 측정(in vivo)에서의 효과를 정량적으로 확인하기 위하여 동물 희생 시 척추를 따로 분리하고 척추의 등쪽 부분을 제거해 나가면서 척수를 드러나게 하였다. 그 후 요추 1~5번 사이에 있는 Dorsal Root Ganglion 조직을 채취하여 면역염색법을 통하여 통증 전달물질인 CGRP 발현량의 확인을 통해 직접적으로 통증의 억제를 관찰하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9의 조직결과에서 볼 수 있는 것과 같이, 엽줄기세포를 관절강내 투여하고 동시에 STA-21이 처리된 간엽줄기세포를 정맥내 투여했을 경우(STA21 IV + OA IA), 비교예(STA21 OA-MSC IA 또는 OA-MSC IA)에 비해 통증 전달물질인 CGRP 발현량이 낮아짐을 확인하여, 연골파괴 뿐만 아니라 직접적인 신경 통증 억제도 이루어지는 것을 확인할 수 있다.
실시예 3 : STA-21이 모두 처리된 본 발명의 키트에 의한 골관절염 치료 효과 분석
실시예 3-1. 본 발명의 키트에 의한 통증 억제 효과 확인
제조예 3의 골관절염 동물모델에게 제조예 1의 3x105 세포수의 STA-21이 처리된 간엽줄기세포를 관절강내 주사(intraarticular injection)로 주입하고 제조예 2의 3x105 세포수의 STA-21이 처리된 간엽줄기세포를 정맥내 주사(intravenous injection)로 주입하였다(STA21 OA-MSC IA+IV). 비교예로서 STA-21이 처리된 간엽줄기세포 단독으로 정맥내 주사(STA21 OA-MSC IV)로 주입하거나, STA-21이 처리된 간엽줄기세포 단독으로 관절강내 주사(STA21 OA-MSC IA)로 주입하였다. 대조군(MIA)으로는 MIA만을 투여하였다.
투여 후 0, 5, 12, 20, 29일이 경과한 다음부터 실시예 1과 같은 방법으로 통증정도를 확인하고 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 볼 수 있는 바와 같이, STA-21이 처리된 간엽줄기세포를 관절강내 주사로 주입하고 동시에 STA-21이 처리된 간엽줄기세포를 정맥내 주사로 주입했을 때(STA21 OA-MSC IA+IV), 비교예(STA21 OA-MSC IA 또는 STA21 OA-MSC IA)에 비해 개선된 통증 억제 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다. 또한, 투여 후 시간이 경과하여도 통증 억제 효과는 지속됨을 확인하였다.
실시예 3-2. 본 발명의 키트에 의한 연골 손상 억제 효과 확인
각 투여군의 연골 손상 정도를 확인하기 위하여, H&E 염색을 수행하였으며, 각 군의 총 Mankin score, OARSI score 및 structure를 확인하였다(도 11). 또한, C. Micro CT 분석을 통하여 골 볼륨(%)을 분석하였다(도 12). 그 결과를 도 11 및 도 12에 나타내었다.
도 11 및 도 12에 나타낸 바와 같이, STA-21이 처리된 간엽줄기세포를 관절강내 주사로 주입하고 동시에 STA-21이 처리된 간엽줄기세포를 정맥내 주사로 주입했을 때(STA21 OA-MSC IA+IV), 비교예(STA21 OA-MSC IA 또는 STA21 OA-MSC IA)에 비해 ankin score, OARSI score 및 structurerk 낮고, 골 볼륨(%)가 높음을 확인하여, 연골 파괴가 억제된 것이 관찰되었다.
실시예 3-3: 본 발명의 키트에 의한 조직 내에 통증 마커 확인 및 신경 통증 억제 효과 확인
통증 측정(in vivo)에서의 효과를 정량적으로 확인하기 위하여, 각 군이 투여된 신경절 내의 통증 마커인 TRPV1을 확인하기 위하여 IHC 염색하여 이를 확인하였다. 그 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13의 조직결과에서 볼 수 있는 것과 같이, STA-21이 처리된 간엽줄기세포를 관절강내 주사로 주입하고 동시에 STA-21이 처리된 간엽줄기세포를 정맥내 주사로 주입했을 때(STA21 OA-MSC IA+IV), 비교예(STA21 OA-MSC IA 또는 STA21 OA-MSC IA)에 비해 신경절 내의 통증 마커인 TRPV1 활성이 현저히 감소됨을 확인하였다.
실시예 3-4: in vitro 내 STA21 처리된 MSC의 타깃 세포 활성 조절 확인
STA21-MSC의 in vitro 내 효력을 평가하고 타겟 세포의 활성을 조절하기 위하여, Sta21-MSC와 연골세포(chondrocyte)(A), 파골세포(osteoclast)(B), 조골세포(osteoblast)(c)를 각각 공조 배양하여, 각 세포의 활성인자를 분석하였다. 각 세포는 1X104으로 공조 배양하였으며, 공조 배양시 3uM의 trans well을 사용하였다. 아래의 플래이트에 타깃 세포를 seeding 하였으며, trans well 에는 STA21-MSC 를 seeding하였다. 그 결과를 도 14에 나타내었다.
도 14에 나타낸 바와 같이, 연골세포(Chondrocyte)와 공조 배양시 카다볼릭 팩터인 ADAMTS5의 활성은 억제 되었으며, 아나볼릭 인자인 TIMP1, 3의 활성은 증가됨을 확인하였다. 또한, 파골 세포와의 공조 배양시, 파골세포 활성 인자인 cathepsin-K의 활성이 억제됨을 확인하였다. 또한, 조골 세포와의 공조 배양시 조골세포에서 활성되는 염증성 인자인 IL-6, IL-1b의 활성이 현저히 억제됨을 확인하였다. 따라서, 상기와 결과로 STA21 처리된 MSC는 연골 손상 및 염증 반응을 일으킬 수 있는 타깃 세포의 활성을 조절 할 수 있는 효과가 존재함을 in vitro 상으로 확인하였다.
실시예 4: SD-282에 의한 통증 조절 및 연골보호 인자 발현
중간엽 줄기세포를 다른 자극 없이 메트포민과 SD282를 처리 하고 3일 동안 배양하여 ELISA (효소결합 면역흡착 분석법)를 통해 염증성 cytokine을 측정하였다. 도 15으로부터 통증과 더불어 염증관련 Factor 인 IL-6 cytokine은 SD282 및 메트포민에 의해 억제되었고, 항염증 인자인 IL-10 cytokine 발현량은 SD282에 의해 증가된 것을 확인할 수 있었다. 따라서 염증과 더불어 통증 메커니즘과도 연관이 있는 항염요소는 증가시키고 염증요소는 감소시켜 통증과 염증의 매개인자를 효과적으로 조절할 수 있음을 확인했다.
실시예 5: SD-282에 의한 항염증 및 연골보호
연골세포에 IL-1beta를 처리하여 골관절염 연골과 유사한 상태로 만들어 주고 메트포민과 SD282를 처리하여 하룻동안 배양 후 RNA추출과, cDNA합성을 거쳐 중합효소연쇄반응 (PCR)을 통하여 연골 합성요소와 파괴 요소를 정량 분석하였다. 도 16에서 볼 수 있는 바와 같이, 연골 파괴 인자인 MMP-13은 SD282가 메트포민과 유사하게 억제하는 것을 확인하였고, 연골 보호 인자인 TIMP1의 발현량은 메트포민보다 SD282에 의해 더 크게 증가된 것을 관찰할 수 있었다. 따라서 SD282에 의해 Chondrogenesis mechanism을 활성화시키고 그로인해 Anabolic factor는 증가키시고 catabolic factor는 감소시켜 연골보호와 재생에 뛰어난 효과를 기대할 수 있다.

Claims (11)

  1. STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3) 억제제가 처리된 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 정맥내 투여용 조성물; 및
    간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 관절강내 투여용 조성물을 포함하는, 통증이 경감되는 골관절염 치료용 키트.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 관절강내 투여용 조성물은 STAT3 억제제가 처리된 것을 특징으로 하는 키트.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 STAT3 억제제는 STA-21 (8-hydroxy-3-methyl-3,4-dihydrotetraphene-1,7,12(2H)-trione), SD282 (N,N-Ethyl-4-fluorophenyl biguanide), 메트포민, AG-490 ((E)-2-Cyano-3-(3,4-dihydrophenyl)-N-(phenylmethyl)-2-propenamide), 아티프리모드 (Atiprimod; 3-(8,8-dipropyl-3-azaspiro[4.5]decan-3-yl)-N,N- diethylpropan-1-amine), 오라노핀 (Auranofin; 3,4,5-triacetyloxy-6- (acetyloxymethyl) oxane-2-thiolate; triethylphosphanium), 오로싸이오말레이트 (Aurothiomalate; Sodium 2-(auriosulfanyl)-3-carboxypropanoate), BMS-354825 (Dasatinib; N-(2-chloro-6-methylphenyl)-2-[[6-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-2-methyl-4-pyrimidinyl]amino]-5-thiazole carboxamide monohydrate), CADPE (3-(3,4-dihydroxy-phenyl)-acrylic acid 2-(3,4-dihydroxy-phenyl)-ethyl ester), 스타틱 (Stattic; 6-nitro-1,1-dioxide-benzo[b]thiophene), 도베실레이트 (Dobesilate; calcium 2,5-dihydroxybenzenesulfonate), 에탄올(Ethanol), NCX-4016(NO-Aspirin), 넬피나비어(Nelfinavir; (3S,4aS,8aS)-N-tert-butyl-2-[(2R,3R)-2-hydroxy-3-[(3-hydroxy-2-methylphenyl)formamido]-4-(phenylsulfanyl)butyl]-decahydroisoquinoline-3-carboxamide), PDP(phosphododecapeptide), PS-341(볼테조밉(Bortezomib); [(1R)-3-methyl-1-({(2S)-3-phenyl-2-[(pyrazin-2-ylcarbonyl)amino]propanoyl}amino)butyl]boronic acid), R115777(티피파르닙(tipifarnib); 6-[amino(4-chlorophenyl)(1-methyl-1H-imidazol-5-yl)methyl]-4-(3-chlorophenyl)-1-methylquinolin-2(1H)-one), S31-M2001(N-Hexyl-2-(1-naphthalenyl)-5-[[4-(phosphonooxy)phenyl]), 스타틴계 화합물, 소듐살리실레이트(Sodium Salicylate), 카페익산(Caffeic acid; 3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-2-propenoic acid 3,4-Dihydroxy-cinnamic acid trans-Caffeate 3,4-Dihydroxy-trans-cinnamate)), 에모딘(Emodin; 1,8-Dihydroxy-3-(hydroxymethyl)-9,10-anthracenedione), 우르솔릭산(Ursolic acid; 3-beta-3-hydroxy-urs-12-ene-28-oic-acid), 레스베라트롤(Resveratrol; 3,5,4'-trihydroxy-trans-stilbene), 레티노익산(Retinoic acid; (2E,4E,6E,8E)-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohexen-1-yl)nona-2,4,6,8-tetraenoic acid), EGCG(Epigallocatechin gallate; [(2R,3R)-5,7-dihydroxy-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)chroman-3-yl] 3,4,5-trihydroxybenzoate), Sr11302((E,E,Z,E)-3-Methyl-7-(4-methylphenyl)-9-(2,6,6-trimethyl-1-cyclohexen-1-yl)-2,4,6,8-nonatetraenoic acid), 탄시논 IIA(Tanshinone IIA; 1,6,6-Trimethyl-6,7,8,9-tetrahydrophenanthro[1,2-b]furan-10,11-dione) 및 커큐민(curcumin; (1E,6E)-1,7-Bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인 키트.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 정맥내 투여용 조성물과 상기 관절강내 투여용 조성물은 동시에 투여되는 것인 키트.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 STAT3 억제제가 처리된 간엽줄기세포는 통증을 경감시키는 것인 키트.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 간엽줄기세포는 골관절염 환자의 말초혈액 또는 지방조직으로부터 분리된 것인 키트.
  7. 약학적으로 유효한 양의 STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3) 억제제가 처리된 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 조성물을 정맥내 투여하고, 동시에 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 조성물을 관절강내 투여하는 단계를 포함하는 골관절염 예방 및 치료 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 조성물을 관절강내 투여는 STAT3 억제제가 처리된 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    상기 STAT3 억제제는 STA-21(8-hydroxy-3-methyl-3,4-dihydrotetraphene-1,7,12(2H)-trione), SD282, 메트포민, AG-490 ((E)-2-Cyano-3-(3,4-dihydrophenyl)-N-(phenylmethyl)-2-propenamide), 아티프리모드(Atiprimod; 3-(8,8-dipropyl-3-azaspiro[4.5]decan-3-yl)-N,N- diethylpropan-1-amine), 오라노핀(Auranofin; 3,4,5-triacetyloxy-6- (acetyloxymethyl) oxane-2-thiolate; triethylphosphanium), 오로싸이오말레이트(Aurothiomalate; Sodium 2-(auriosulfanyl)-3-carboxypropanoate), BMS-354825(Dasatinib; N-(2-chloro-6-methylphenyl)-2-[[6-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-2-methyl-4-pyrimidinyl]amino]-5-thiazole carboxamide monohydrate), CADPE(3-(3,4-dihydroxy-phenyl)-acrylic acid 2-(3,4-dihydroxy-phenyl)-ethyl ester), 스타틱(Stattic; 6-nitro-1,1-dioxide-benzo[b]thiophene), 도베실레이트(Dobesilate; calcium 2,5-dihydroxybenzenesulfonate), 에탄올(Ethanol), NCX-4016(NO-Aspirin), 넬피나비어(Nelfinavir; (3S,4aS,8aS)-N-tert-butyl-2-[(2R,3R)-2-hydroxy-3-[(3-hydroxy-2-methylphenyl)formamido]-4-(phenylsulfanyl)butyl]-decahydroisoquinoline-3-carboxamide), PDP(phosphododecapeptide), PS-341(볼테조밉(Bortezomib); [(1R)-3-methyl-1-({(2S)-3-phenyl-2-[(pyrazin-2-ylcarbonyl)amino]propanoyl}amino)butyl]boronic acid), R115777(티피파르닙(tipifarnib); 6-[amino(4-chlorophenyl)(1-methyl-1H-imidazol-5-yl)methyl]-4-(3-chlorophenyl)-1-methylquinolin-2(1H)-one), S31-M2001(N-Hexyl-2-(1-naphthalenyl)-5-[[4-(phosphonooxy)phenyl]), 스타틴계 화합물, 소듐살리실레이트(Sodium Salicylate), 카페익산(Caffeic acid; 3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-2-propenoic acid 3,4-Dihydroxy-cinnamic acid trans-Caffeate 3,4-Dihydroxy-trans-cinnamate)), 에모딘(Emodin; 1,8-Dihydroxy-3-(hydroxymethyl)-9,10-anthracenedione), 우르솔릭산(Ursolic acid; 3-beta-3-hydroxy-urs-12-ene-28-oic-acid), 레스베라트롤(Resveratrol; 3,5,4'-trihydroxy-trans-stilbene), 레티노익산(Retinoic acid; (2E,4E,6E,8E)-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohexen-1-yl)nona-2,4,6,8-tetraenoic acid), EGCG(Epigallocatechin gallate; [(2R,3R)-5,7-dihydroxy-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)chroman-3-yl] 3,4,5-trihydroxybenzoate), Sr11302((E,E,Z,E)-3-Methyl-7-(4-methylphenyl)-9-(2,6,6-trimethyl-1-cyclohexen-1-yl)-2,4,6,8-nonatetraenoic acid), 탄시논 IIA(Tanshinone IIA; 1,6,6-Trimethyl-6,7,8,9-tetrahydrophenanthro[1,2-b]furan-10,11-dione) 및 커큐민(curcumin; (1E,6E)-1,7-Bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인 방법.
  10. 제7항에 있어서,
    STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3) 억제제가 처리된 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 조성물을 정맥내 투여하는 것은 골관절염의 통증을 경감시키는 것인 방법.
  11. 제7항에 있어서,
    상기 간엽줄기세포는 골관절염 환자의 말초혈액 또는 지방조직으로부터 분리된 것인 방법.
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