KR101520531B1 - 편도줄기세포를 이용하여 부갑상선 호르몬을 생산하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 편도줄기세포로부터 부갑상선 조직세포의 분화를 유도하는 방법, 상기 방법에 의해 수득한 부갑상선 조직세포로부터 부갑상선 호르몬을 생산하는 방법, 상기 부갑상선 조직세포를 포함하는 부갑상선 기능저하증 또는 골다공증의 치료를 위한 세포치료제, 및 상기 세포치료제를 이용하여 부갑상선 기능저하증 또는 골다공증을 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

편도줄기세포를 이용하여 부갑상선 호르몬을 생산하는 방법{Method of producing parathyroid hormone from tonsil-derived mesenchymal stem cell}

본 발명은 편도줄기세포로부터 부갑상선 조직세포의 분화를 유도하는 방법 및 상기 방법에 의해 수득한 부갑상선 조직세포로부터 부갑상선 호르몬을 생산하는 방법에 관한 것이다.

최근에 들어, 기관 재생과 면역반응 조절 능력을 가지는 성체 줄기세포에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 현재 임상 및 연구에서 사용되고 있는 성체 줄기세포의 공급원은 골수, 지방세포, 제대혈등이 있다(Ding DC, et al., Cell Transplant., 20:5-14, 2011; Lee OK, et al., Blood, 103:1669-1675, 2004). 그러나, 종래의 성체 줄기세포는 사용에 몇 가지 제한점이 있는데, 조직을 채취하는 과정이 침습적이고, 충분한 양을 얻기 어려우며, 대부분이 중배엽 기원의 조직이여서 외배엽과 내배엽 기원의 조직으로 분화가 용이하지 않다. 이러한 제한점을 극복하기 위하여 줄기세포의 공급원을 다양화 하는 연구가 필요하다.

한편, 인간의 편도선은 일종의 림프상피 면역조직으로서 인체의 구인두 비인두에 존재하며, 사춘기까지 그 면역기능을 수행하여 이후에는 서서히 퇴화하므로, 편도선이 비정상적으로 비대해지거나(아데노이드편도 과형성: adenotonsillar hyperplasia), 감염(편도염: tonsillitis)되는 등의 문제가 발생하면 편도선 절제수술(tonsillectomy)을 통해 제거하게 된다.

최근, 편도선의 조직에서 중간엽 줄기세포(Mesenchymal stem cells)(MSC)를 추출한 연구결과가 보고되어, 상기 편도조직이 성체 줄기세포의 새로운 공급원으로 주목되고 있다(Janjanin SF, et al., Arthritis Res. Ther., 10:R83, 2008). 상기 편도조직으로부터 유래된 줄기세포는 다른 성체 줄기세포와 동일한 수준의 줄기세포능을 나타내어, 중배엽성 세포(지방세포형성(adipogenesis), 골세포형성(osteogenesis), 연골세포형성(chondrogenesis))로 분화될 수 있는 것으로 알려져 있으나 내배엽성 세포로의 분화에 대해서는 알려진 바가 없다. 이러한 편도조직의 장점은 편도선 절제수술을 통해 버려지는 조직이기 때문에 재료의 수급이 비교적 원활하다는 점이다.

한편, 부갑상선 호르몬(PTH)은 부갑상선에서 분비되는 84개의 아미노산으로 이루어진 호르몬으로서, 생체내에서 칼슘농도를 조절하는 주요 호르몬이며, 부갑상선기능저하증 및 골다공증 등의 치료제로서 사용될 수 있어 부갑상선 호르몬에 대한 수요는 증가하고 있으나, 아직까지 부갑상선 호르몬을 효과적으로 생산할 수 있는 방법은 개발되지 않은 상태이다.

이러한 배경 하에 본 발명자들은 편도줄기세포로부터 분화될 수 있는 조직을 찾기 위하여 예의 노력한 결과, 편도줄기세포로부터 부갑상선 조직세포가 분화될 수 있으며, 이로부터 부갑상선 호르몬이 정상적으로 생산되고 분비됨을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 편도줄기세포로부터 부갑상선 조직세포를 분화시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 편도줄기세포를 이용하여 부갑상선 호르몬을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 편도줄기세포로부터 분화된 부갑상선 조직세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 편도줄기세포로부터 분화된 부갑상선 조직세포를 포함하는 부갑상선 기능저하증 또는 골다공증의 치료를 위한 세포 치료제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 부갑상선 조직 세포를 포함하는 세포치료제를 부갑상선 기능 저하증 또는 골다공증이 의심되는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 부갑상선 기능 저하증 또는 골다공증의 치료 방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 액티빈(Activin) A 및 소닉 헤지호그(Sonic hedgehog)(Shh)를 포함하는 배지에서 편도줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 편도줄기세포로부터 부갑상선 조직세포를 분화시키는 방법을 제공한다.

본 발명 이전에 일부 미분화된 인간배아줄기세포 또는 소아의 흉선조직에서 유래한 성체줄기세포로부터 부갑상선 조직을 분화시키기 위한 연구가 이루어진 적은 있었으나, 편도줄기세포로부터 부갑상선 조직을 분화시키는 방법에 대한 연구는 이루어진 적이 없었다.

또한, 배아줄기세포 또는 흉선으로부터 유래한 성체줄기세포로부터 부갑상선 조직을 유도하는 경우, 부갑상선 조직을 유도하기 위하여 6개월 이상의 오랜 시간이 걸렸다.

하지만, 본 발명에서는 지금까지 부갑상선 조직으로 분화될 수 있는 후보로서 고려된 적이 없었던 편도줄기세포로부터 단기간 내에 부갑상선 조직의 분화를 유도할 수 있는 방법을 최초로 확인하였다.

본 발명에서 용어 "편도"란, 목의 안쪽과 코의 뒷부분에 위치하여, 외부에서 침입하는 세균 등의 물질로부터 일차적으로 우리 몸을 방어함과 동시에 림프상피 면역조직으로 작용을 수행하는 조직을 의미한다. 상기 편도는 인두편도, 귀인두관편도, 구개편도, 혀편도 등을 포함한다. 본 발명에 있어서 상기 편도는 편도유래 중간엽 줄기세포를 제공하는 원천조직으로 사용된다.

본 발명의 용어 "편도줄기세포"는 편도에서 유래한 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells; MSCs)를 의미하며, 중간엽 줄기세포란, 골, 연골, 지방, 골수간질, 근육, 신경 등으로 분화될 수 있는 미분화된 줄기세포를 의미하는데, 성인에서는 일반적으로 골수에 머물러 있지만 제대혈, 말초혈액, 기타 조직 등에도 존재한다.

본 발명의 용어 "줄기세포"란, 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 새로운 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 의미하며, 만능 줄기세포 (totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포 (pluripotent stem cells), 다분화능 (다능성) 줄기세포(multpotent stem cells)로 분류할 수 있다. 만능 줄기세포 (totipotent stem cells)란, 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있는 만능의 성질을 가진 세포로 난자와 정자의 수정 이후 8세포기까지의 세포가 이러한 성질을 가지며 이 세포를 분리하여 자궁에 이식하면 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있는 세포를 의미한다. 전분화능 줄기세포 (pluripotent stem cells)란, 외배엽, 중배엽, 내배엽층 유래의 다양한 세포와 조직으로 발생할 수 있는 세포로서, 수정 4-5일 후 나타나는 배반포 (blastocyst)의 안쪽에 위치한 내세포괴(inner cell mass)에서 유래하며, 이를 배아 줄기 세포라 하며 다양한 다른 조직 세포로 분화되지만 새로운 생명체를 형성하지는 못하는 세포를 의미한다.

본 발명의 용어 "부갑상선 조직세포"란, 갑상선에 부착하여 있는 내분비기관인 부갑상선을 구성하는 세포를 의미하며, 부갑상선 호르몬(PTH)를 분비하며, 체액의 칼슘과 인의 대사를 조절한다. 본 발명에서는 부갑상선 호르몬을 분비하는 한, 부갑상선 조직세포에 포함될 수 있다.

본 발명의 부갑상선 조직세포 분화 방법은 액티빈 A와 소닉 헤지호그(Shh)를 각각 50 ng/ml ~ 300 ng/ml의 농도로 포함하는 배지에서 편도줄기세포를 배양하는 단계를 포함하며, 편도줄기세포의 배양 기간은 바람직하게는 4일 이상이며, 보다 바람직하게는 7일 이상이다.

본 발명의 방법에 있어서, 편도줄기세포는 편도선 절제수술을 받은 환자에서 분리한 편도선 조직으로부터 채취하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

환자에서 분리한 편도선 조직으로부터 채취할 경우, 채취한 편도조직을 완충액으로 세척한 후, 효소혼합액을 처리하여 결합조직을 분해하고, 이때 부유된 조직을 원심분리하고, 잘라진 조직 내의 세포 혼합액을 Ficol을 이용한 세포분획법과 원심분리법으로 하층의 침전된 부분만을 배양하고, 세포바닥에의 부착능을 보이는 세포부분만을 분리한 후, 배양접시 바닥에의 부착능을 보이는 세포 중 세포표면 표지자를 이용한 면역화학방법을 이용하여 편도줄기세포를 분리할 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 분화유도제로서 사용되는 액티빈 A는 TGF-베타 수퍼패밀리의 구성원으로서, FSH 방출을 촉진하는 단백질로서 처음 알려졌으나, 중배엽 유도, 신경세포 분화, 골 리모델링, 조혈작용 등의 광범위한 생물학적 활성을 갖는 것으로 알려져 있다.

한편, 소닉 헤지호그 단백질은 헤지호그로 불리는 포유류 시그널링 경로 패밀리 내의 3가지 단백질 중 하나로서, 사지에서 손가락의 성장 및 뇌의 조직화 등과 같은 척추동물 기관형성 조절에서 핵심 역할을 한다. 소닉 헤지호그는 그 농도에 따라 발생중인 배(embryo)의 세포에 상이한 영향을 미치는 몰포젠(morphogen)의 일종이며, 또한 성체 줄기세포의 세포 분열을 제어하며 일부 암의 발생에도 관여하는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 액티빈 A 및 소닉 헤지호그는 시판되는 임의의 액티빈 A 및 소닉 헤지호그를 구입하여 이용할 수 있다.

본 발명의 방법에서 액티빈 A와 소닉 헤지호그의 농도가 50 ng/ml 미만일 경우, 편도줄기세포로부터 부갑상선 조직세포가 분화되기 위하여 필요한 기간이 수 개월로 길어지거나 분화 효율이 떨어지는 단점이 있으며, 이들 분화유도제의 농도가 300 ng/ml을 초과할 경우, 분화유도 효율에 있어서 개선이 없어 이와 같이 고농도의 화학물질을 사용하는 것은 비효율적이다.

바람직하게는, 액티빈 A와 소닉 헤지호그의 농도는 각각 80 ng/ml 내지 200 ng/ml이며, 가장 바람직하게는 각각 100 ng/ml이다.

본 발명의 방법에 따라, 액티빈 A와 소닉 헤지호그를 각각 50 ~ 300 ng/ml의 농도로 포함하는 배지에서 편도줄기세포를 배양할 경우, 짧게는 4일의 배양만으로도 편도줄기세포로부터 부갑상선 조직세포를 분화시킬 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 방법에 따라 4일 내지 25일 동안 편도줄기세포를 액티빈 A와 소닉 헤지호그를 각각 100 ng/ml의 농도로 포함하는 배지에서 배양함으로써 부갑상선 조직세포의 분화를 유도할 수 있으며, 배양 기간이 4일을 초과할 경우, 4-5일 마다 액티빈 A와 소닉 헤지호그를 포함하는 신선한 배지로 배지를 교체하여 줄 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 분화 유도시 사용되는 배지는 줄기세포의 배양을 위해 이용될 수 있는 통상적인 배지를 사용할 수 있는데, 예를 들면, DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium), Keratinocyte-SFM (Keratinocyte serum free medium), RPMI-1640 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 DMEM 배지를 사용할 수 있다.

상기 줄기세포 배지는 첨가제로 보충될 수 있다. 일반적으로, 등장액 중의 중성 완충제(예컨대 인산염 및/또는 고농도 중탄산염) 및 단백질 영양분(예를 들면 혈청, 예컨대 FBS, 혈청 대체물, 알부민, 또는 필수 아미노산 및 비필수 아미노산, 예컨대 글루타민)을 함유할 수 있다. 나아가, 지질(지방산, 콜레스테롤, 혈청의 HDL 또는 LDL 추출물) 및 이 종류의 대부분의 보존액 배지에서 발견되는 기타 성분(예컨대 인슐린 또는 트랜스페린, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드, 피루빈산염, 임의의 이온화 형태 또는 염인 당원, 예컨대 글루코스, 셀레늄, 글루코코르티코이드, 예컨대 히드로코르티존 및/또는 환원제, 예컨대 β-메르캅토에탄올)을 함유할 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시양태에서는, 편도줄기세포를 액티빈 A와 소닉 헤지호그를 각각 100 ng/ml의 농도로 포함하는 배지에서 배양한 결과, 배양 4일 후, 부갑상선 조직세포에서 생성되는 부갑상선 호르몬의 생산이 유의적으로 증가함을 확인하였으며, 전자현미경을 이용하여 세포내 미세구조를 확인한 결과, 분화된 세포는 기본 세포 미세구조 외에 세포과립 구조 및 과립전구체 구조가 존재하여 호르몬 분비조직으로의 분화를 확인할 수 있었다.

또한, 배양배지를 4일 간격으로 신선한 배지로 교체하면서 3주간 배양한 결과, 7일 이후부터 부갑상선 호르몬의 생산이 현저히 증가함을 확인하였으며, 또한 부갑상선 조직에 특이적인 GCM2(glial cells missing homolog 2), CaSR(calcium sensing receptor), CCL21(chemokine(C-C motif) ligand 21) 및 PTH(parathyroid hormone) 유전자의 발현을 확인할 수 있었다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 편도줄기세포를 이용하여 부갑상선 호르몬을 생산하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 i) 액티빈(Activin) A 및 소닉 헤지호그(Sonic hedgehog)(Shh)를 포함하는 배지에서 편도줄기세포를 배양하여 부갑상선 조직세포로 분화시키는 단계, 및 ii) i) 단계에서 수득한 배양액 또는 세포용해액으로부터 부갑상선 호르몬을 분리하는 단계를 포함하는, 편도줄기세포를 이용하여 부갑상선 호르몬을 생산하는 방법을 제공한다.

편도줄기세포로부터 부갑상선 조직세포를 분화시키는 방법과 관련하여 상기한 바와 같이, 본 발명의 방법에 따라 편도줄기세포로부터 분화된 부갑상선 조직세포는 정상적인 부갑상선 조직세포와 같이 부갑상선 호르몬을 생산하고 분비한다. 따라서, 편도줄기세포로부터 분화된 부갑상선 조직세포의 배양액 또는 세포용해액으로부터 부갑상선 호르몬을 분리함으로써 부갑상선 호르몬을 수득할 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 편도줄기세포, 액티빈 A, 소닉 헤지호그에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명의 부갑상선 호르몬 생산 방법에 있어서, 편도줄기세포를 액티빈 A와 소닉 헤지호그를 포함하는 배지에서 배양하여 부갑상선 조직세포로 분화시키는 단계는 앞서 기술한 바와 동일하다.

배양액 또는 세포용해액으로부터 부갑상선 호르몬을 분리하는 단계는 단백질의 분리 및 정제에 이용될 수 있는 일반적인 방법을 이용하여 실시될 수 있으며, 예를 들어, 친화성 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 공침전 등의 방법을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않고 통상의 기술자가 적절히 선택하여 실시할 수 있다.

한편, 부갑상선 호르몬은 부갑상선 조직 세포내에서 생산된 후 분비과립 형태로 세포내에서 존재하게 되며, 세포 외부 칼슘 농도에 따라 세포 밖으로의 분비 여부가 결정된다.

따라서, 본 발명의 방법에 있어서, 편도줄기세포로부터 유도된 부갑상선 조직세포에서 생산된 부갑상선 호르몬의 세포 밖으로의 분비를 촉진하여 부갑상선 호르몬의 분리를 용이하게 하기 위하여, 본 발명의 방법은 상기 i) 단계 후에, 배양액의 칼슘 농도를 조절하여 부갑상선 호르몬을 세포 밖으로 분비시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

바람직하게는, 부갑상선 조직세포로부터 부갑상선 호르몬의 분비를 촉진하기 위하여, 배양액의 칼슘 농도를 1.5 mM 미만으로 조절하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

부갑상선 호르몬의 분비를 촉진하기 위한 배양액의 칼슘 농도는 바람직하게는 1.0 mM 미만이며, 보다 바람직하게는 0.5 mM 미만이며, 가장 바람직하게는 0.1 mM 미만이다.

다르게는, 부갑상선 호르몬을 세포 밖으로 분비시키지 않고, 세포를 용해하여 용해액으로부터 부갑상선 호르몬을 분리할 수도 있다.

본 발명의 부갑상선 호르몬 생산 방법은 편도절제술 후에 폐기되는 편도조직으로부터 얻어질 수 있는 편도줄기세포를 이용하여, 부갑상선 기능저하증 또는 골다공증 등의 치료에 유용하게 이용될 수 있는 부갑상선 호르몬을 용이하게 생산할 수 있도록 하며, 또한 세포 외부의 칼슘 농도 조절을 통해 부갑상선 호르몬의 분비를 촉진함으로써 다량의 호르몬을 용이하게 수득할 수 있도록 한다.

본 발명의 구체적인 일 실시양태에서는, 편도줄기세포를 액티빈 A와 소닉 헤지호그를 포함하는 배지에서 배양하여 부갑상선 조직의 분화를 유도하면서, 기간별로 부갑상선 호르몬의 발현 양상을 확인한 결과, 분화 유도 후 4일이 경과한 시점부터 부갑상선 호르몬의 발현이 유의적으로 증가하는 것을 확인하였으며, 분화 유도 후 7일 이후부터 발현량이 현저히 증가함을 확인함으로써, 본 발명의 방법에 의해 편도줄기세포로부터 분화된 부갑상선 조직세포로부터 부갑상선 호르몬을 생산할 수 있음을 확인하였다.

또한, 분화유도기간이 경과할수록 부갑상선 호르몬의 누적 분비량 또한 증가함을 확인하여, 편도줄기세포로부터 분화된 부갑상선 조직을 지속적으로 배양할 경우, 많은 양의 부갑상선 호르몬을 수득할 수 있음을 확인하였으며, 세포 외부의 칼슘 농도가 정상 농도(1.5 mM)보다 낮아질 경우, 부갑상선 호르몬이 세포 외부로 분비됨을 확인하여, 부갑상선 조직세포의 분화 유도시 배양액의 칼슘 농도를 조절함으로써 부갑상선 호르몬의 분비를 조절할 수 있음도 확인하였다.

본 발명의 또 다른 실시 양태로서, 본 발명은 편도줄기세포로부터 분화된 부갑상선 조직세포를 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 부갑상선 조직세포는 상기한 바와 같은, 편도줄기세포를 액티빈 A와 소닉 헤지호그를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 부갑상선 조직세포 분화 방법에 의해 얻어질 수 있으며, 바람직하게는 편도줄기세포를 액티빈 A와 소닉 헤지호그를 각각 50 ng/ml 내지 300 ng/ml의 농도로 포함하는 배지에서 적어도 4일 동안 배양함으로써 얻어질 수 있으며, 부갑상선 조직 세포를 얻기 위한 가장 바람직한 액티빈 A와 소닉 헤지호그의 농도는 각각 100 ng/ml이다.

상기와 같은 본 발명의 분화 방법에 의해 편도줄기세포로부터 분화되어 수득된 부갑상선 조직세포는 부갑상선 호르몬을 생산할 수 있으며, 세포 외부의 칼슘 농도의 변화에 따라 부갑상선 호르몬의 분비를 조절할 수 있어서, 세포 외부의 칼슘 농도가 정상 농도(1.5 mM) 보다 낮으면 부갑상선 호르몬을 세포 밖으로 분비하고, 세포 외부의 칼슘 농도가 정상 농도보다 높으면 부갑상선 호르몬의 분비를 억제할 수 있다.

따라서, 본 발명의 부갑상선 조직 세포는 체내에 존재하는 부갑상선 조직 세포와 마찬가지로 부갑상선 조직 세포로서의 기능을 수행할 수 있으며, 부갑상선 조직의 기능 손상 또는 부갑상선 호르몬의 부족으로 인한 질병 또는 부갑상선 호르몬에 의해 치료가능한 것으로 알려진 골다공증 등의 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 또 다른 실시 양태로서, 본 발명은 본 발명의 부갑상선 조직 세포를 포함하는 부갑상선 기능 저하증 또는 골다공증의 세포치료제를 제공한다.

본 발명에 있어서, 용어 "세포치료제"는 개체로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.

본 발명의 부갑상선 조직 세포를 포함하는 세포치료제가 이용될 수 있는 질병으로서는, 예를 들어, 부갑상선기능저하증, 또는 골다공증이 있다.

부갑상선 기능저하증은 부갑상선 호르몬 기능 장애로 인해 혈중 칼슘이 낮아져 생기는 저칼슘혈증에 따른 여러 증상이 발생하는 질환으로서, 그 치료법으로는 과량의 칼슘 복용이 유일한 방법이나, 부갑상선호르몬 대신 칼슘을 과량으로 복용하는 간접적 방법으로는 적정한 혈중 칼슘 농도를 지속적으로 유지하기 어렵고, 저칼슘혈증에 따른 응급상황이 흔히 발생하는 등 치료 효과의 적정성을 확보하기 어려우며, 칼슘제제 장기복용으로 인한 위염과 같은 소화기관계 합병증의 발생이 증가하는 등 여러 문제점이 있다. 따라서, 이와 같은 칼슘 복용을 대신하여, 부갑상선 호르몬을 생산할 수 있는 부갑상선 조직 세포를 포함하는 세포치료제를 이용할 경우, 부작용없이 부갑상선 기능저하증을 치료할 수 있을 것이다.

한편, 골다공증은 뼈의 양이 감소하고 질적인 변화로 인해 뼈의 강도가 약해져서 골절이 일어날 가능성이 높은 상태를 말하며, 골다공증 치료제로는 주로 골흡수를 억제하는 제제가 주종이었으나, 최근 골성분 형성을 직접 촉진하는 골형성유도제로 부갑상선 호르몬의 사용이 제시되어 오고 있다. 그러나, 부갑상선 호르몬을 사용할 경우, 현재 단기간 (최대 2년 허용, 미국 FDA) 밖에 사용할 수 없고, 고가이며, 매일 인슐린주사와 같이 피하주사해야 하며, 치료 종료 후 빠른 골소실을 보이는 등의 여러 문제점들이 보고된 바 있다. 따라서, 이처럼 부갑상선 호르몬을 투여하기 보다는 부갑상선 호르몬을 생산할 수 있으며 세포 외부 칼슘의 농도 변화에 따라 호르몬의 분비를 조절할 수 있는 부갑상선 조직 세포를 포함하는 세포치료제를 이용할 경우, 부작용없이 골다공증을 치료할 수 있을 것이다.

본 발명에서 용어 "치료"는 상기 세포치료제의 투여로 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.

또한, 본 발명의 세포치료제는 1㎖ 당 1.0×10⁵개 내지 1.0×10⁹개, 바람직하게는 1.0×10⁶개 내지 1.0×10⁸개, 보다 바람직하게는 1.0×10⁷개의 세포를 포함할 수 있다.

본 발명의 세포치료제는 동결되지 않은 채 사용되거나 차후 사용을 위해 동결될 수 있다. 동결되어야 할 경우, 표준 냉동보존제 (예를 들어 DMSO, 글리세롤, 에피라이프 (Epilife®) 세포 동결 배지 (Cascade Biologics))가 동결 전 세포 집단에 첨가될 수 있다.

또한, 상기 세포치료제는 약학적 분야의 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 약학적 제제로 제형화시켜 투여할 수 있으며, 상기 제제는 1회 또는 수회 투여에 의해 효과적인 투여량을 포함한다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서 주사용 앰플과 같은 주사제, 주입 백과 같은 주입제, 및 에어로졸 제제와 같은 분무제 등이 바람직하다. 상기 주사용 앰플은 사용 직전에 주사액과 혼합 조제할 수 있으며, 주사액으로는 생리 식염수, 포도당, 만니톨, 링거액 등을 사용할 수 있다. 또한, 주입 백은 염화폴리비닐 또는 폴리에틸렌 재질의 것을 사용할 수 있으며, 박스터 (Baxter), 벡톤 디킨슨 (Becton Dickinson), 메드셉 (Medcep), 내셔날 호스피탈 프로덕츠 (National Hospital Products) 또는 테루모 (Terumo) 사의 주입 백을 예시할 수 있다.

상기 약학적 제제에는 상기 유효성분 외에 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용가능한 통상의 불활성 담체, 예를 들어, 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등을, 국소 투여용 제제의 경우에는 기제 (base), 부형제, 윤활제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

이렇게 제조된 본 발명의 세포치료제 또는 약학적 제제는 당업계에서 통상적으로 사용하는 투여방법을 이용하여 이식 및 기타 용도에 사용되는 다른 줄기세포와 함께 또는 그러한 줄기세포와의 혼합물의 형태로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 치료가 필요한 환자의 질환 부위에 직접 생착 또는 이식하거나 복강에 직접 이식 또는 주입하는 것이 가능하나 이에 한정되지는 않는다. 또한, 상기 투여는 카테터를 이용한 비외과적 투여 및 질환부위 절개 후 주입 또는 이식 등 외과적 투여방법 모두 가능하나 카테터를 이용한 비외과적 투여방법이 보다 바람직하다. 또한 통상의 방법에 따라 비경구적으로, 예를 들면 직접 병변에 투여하는 것 외에 조혈계 줄기세포 이식의 일반적 방법인 혈관 내 주입에 의한 이식도 가능하다.

상기 줄기세포의 1일 투여량은 1.0×10⁴ 내지 1.0×10¹⁰ 세포/kg 체중, 바람직하게는 1.0×10⁵ 내지 1.0×10⁹ 세포/kg 체중을 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 유효성분의 실제 투여량은 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 실시 양태로서, 본 발명은 본 발명의 부갑상선 조직 세포를 포함하는 세포치료제를 부갑상선 기능 저하증 또는 골다공증이 의심되는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 부갑상선 기능 손상 관련 질병 또는 골다공증의 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 세포치료제의 투여는 임의의 동물에 적용가능하며, 동물은 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개, 쥐, 랫트 및 고양이 등의 가축을 포함한다.

본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 세포치료제를 도입하는 것을 의미하며, 분화된 세포의 이식을 포함한다. 본 발명의 세포치료제의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.

본 발명의 편도줄기세포로부터 부갑상선 조직세포를 분화시키는 방법은 편도적출술 후에 폐기되는 편도조직을 이용하여 부갑상선 조직세포를 단기간에 효과적으로 분화시킬 수 있으며, 이로부터 수득되는 부갑상선 조직세포는 체내에 존재하는 부갑상선 조직세포와 동일하게 부갑상선 호르몬을 생산하고 세포 외부의 칼슘 농도에 따라 부갑상선 호르몬의 분비를 조절할 수 있어, 부갑상선기능저하증과 골다공증을 비롯한 부갑상선 호르몬의 작용을 필요로 하는 질병의 치료에 효과적으로 이용될 수 있으며, 이와 같은 본 발명의 부갑상선 조직세포의 세포 외부 칼슘 농도를 조절함으로써 다량의 부갑상선 호르몬을 세포 밖으로 분비시켜 부갑상선 호르몬을 용이하게 수득할 수 있도록 한다.

도 1은 편도선절제술로 획득한 편도조직으로부터의 편도줄기세포 분리과정을 도식화한 그림이다.
도 2는 편도유래세포로부터 분화기간에 따른 세포모양의 변화를 보여주는 도면이다.
도 3은 분화 기간 동안 세포배양액으로 분비되는 PTH 농도 조사 결과를 보여주는 도면이다.
도 4는 편도세포의 부갑상선분화기간에 따른 PTH 단백질 발현양상을 보여주는 도면이다.
도 5는 부갑상선조직으로의 분화과정 동안의 PTH의 세포 내 기질에서의 분포양상을 보여주는 도면이다.
도 6은 PTH 분비관련 단백질인 CHGA의 세포 내 발현 및 분포를 보여주는 도면이다.
도 7은 PTH와 CHGA의 세포 내 발현 분포를 보여주는 도면이다.
도 8은 세포외부 칼슘 농도 변화에 따른 PTH 분비량의 조절을 보여주는 도면이다.
도 9는 세포외부 칼슘 농도 변화에 따른 편도줄기세포의 세포모양의 변화를 보여주는 도면이다.
도 10은 세포외부 칼슘 농도 변화에 따른 편도줄기세포에서의 칼슘감응수용체의 발현 변화를 보여주는 도면이다.
도 11은 부갑상선조직으로 분화된 편도줄기세포의 세포미세구조를 보여주는 도면이다.
도 12는 편도줄기세포에서 생성, 분비된 PTH의 골 형성 능력을 보여주는 도면이다.

이하 본 발명을 하기 예에 의해 상세히 설명한다. 다만, 하기 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 편도줄기세포의 분리

이화여자대학교 목동병원 이비인후두경부외과의 환자중에서 10세 미만의 6명의 환자 (남아 5인, 여아 1인, 평균 연령 7.2세)를 대상으로 편도선 절제술을 시행하였다. 본 연구수행은 임상윤리위원회의 심의를 통과하였다 (ECT 11-53-02). 적출된 편도조직의 3분의 2는 임상조직검사에 사용하였으며, 나머지 3분의 1을 본 실험에 사용하였다.

획득한 편도선 조직으로부터 줄기세포를 분리 및 배양하는 방법은 도 1과 같다.

구체적으로, 채취한 편도조직을 생리식염수로 세척한 후, 효소혼합액 210 U/㎖의 콜라겐분해효소 I(collagenase type I)(Invitrogen)과 10㎍/㎖ DNAse (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)가 혼합된 세포배양액 RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute medium 1640, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)에서 37℃의 조건하에서 30분 동안 편도조직내의 결합조직을 분쇄하였다. 부유된 조직을 원심분리, 여과하여 세포를 획득하였다. 획득한 세포를 RPMI 1640/20% NHS (normal human serum) (PAA Laboratories, GmbH, Paching, Austria)로 2회 세척하고, RPMI 1640/10% NHS로 1회 세척하였다. 세척된 세포를 Ficoll-Paque (GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK) 구배 원심분리에 적용하여 단핵 세포들을 수득하였다. 상기 단핵세포 10⁸개를 10% 우태혈청(Fetal bovine serum, FBS, Invitrogen), 100㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 100U/㎖ 암피실린을 함유하는 DMEM-HG (Dulbecco’s modified Eagle's medium-High Glucose) (Invitrogen)배지에 접종하고 48시간 동안 배양하였다. 배양이 종료된 후, 부착되지 않은 세포는 제거하고, 편도조직 유래 중간엽 줄기세포 (tonsillar mesenchymal stem cells, T-MSC)로 간주되는 부착된 세포는 4주에 걸쳐 3-5세대까지 계대 배양하여 본 실험에 사용하였다.

실시예 2: 부갑상선조직으로의 분화유도

T-MSC가 내배엽성 세포로 분화가능한지를 확인하기 위하여, T-MSC를 내배엽성 세포인 부갑상선 조직세포(parathyroid cell-like cells)로의 분화를 유도하였으며, 구체적으로, T-MSC를 5% FBS, 액티빈 A (activin A, 100 ng/㎖, R&D System, Inc. Minneapolis)와 sonic hedgehog (Shh, 100 ng/㎖, R&D Systems)를 포함하는 DMEM 배지에 접종하고, 상기 배양액을 4일마다 교체하면서 21-25일간 배양하였다.

배양 결과, 분화기간이 경과함에 따라 편도줄기세포는 도 2와 같이 여러 층으로 누적되는 multi-layer를 형성함과 동시에 입방형의 세포 모양을 형성하는 것이 관찰되었다.

실시예 3: 분화기간에 따른 PTH 의 분비정도 조사

분화기간별로 분화유도제가 함유된 세포배양액으로 교환해줄 때마다 (0, 4, 7, 10, 15, 20일), 기존의 세포배양액을 모아서 부갑상선조직으로의 분화과정에 따라 세포외부로 분비되는 PTH의 농도를 분석하기 위한 시료로 사용하였다. 각 시기별로 모은 세포배양액을 0.45 ㎛크기의 시린지 필터로 여과하여 세포부유물이나 세포파편 등을 제거한 뒤, 여과된 세포배양액을 동결건조기 (Freeze Dryer, Operon)를 사용하여 동결건조, 농축하였다.

동결건조한 파우더형태의 시료는 Phosphate buffered saline (pH 7.4)으로 재현탁하여 면역화학법으로 PTH 농도를 분석하였다. 즉, PTH 단백질에 대한 항체와의 결합력을 이용한 ELCIA 방법으로 배출되는 PTH 농도를 조사하였다.

그 결과, 도 3a와 같이, 분화 유도액을 처리한 세포에서는 분화하지 않은 세포에 비해 통계적으로 유의적으로 많은 양의 PTH가 세포배양액으로 분비되었다. 이를 분화기간별로 조사한 결과, 분화유도액 처리 7일 이후부터 10일까지 현저히 증가함을 알 수 있었고, 그 양은 최대 40 pg/ml 농도로 이는 생체내 정상 PTH 농도범위인 15-60 pg/ml의 범위에 포함됨을 알 수 있었다 (도 3b). 이를 누적 PTH 농도 값으로 조사한 결과, 분화유도액을 처리한 후 10일 이후의 누적 PTH 분비량은 100 pg/ml의 농도로 조사되어, 분화한 편도줄기세포를 지속적으로 배양할 경우, 100 pg/ml의 PTH도 획득 가능함을 알 수 있었다 (도 3c).

실시예 4: 웨스턴 블롯 방법에 의한 PTH 단백질 및 관련 단백질 발현조사

각 분화단계별로 분화과정 중의 T-MSC를 모은 뒤, 세포표면을 PBS (Phosphate buffered saline, pH 7.4)로 2회 세척한 뒤, RIPA 버퍼 (25mM Tris?Cl pH 7.6, 150mM NaCl, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS)를 이용하여 세포내 단백질 부분을 추출하였다. 추출된 단백질은 알부민을 표준용액으로 한 BCA (bicinchoninic acid)방법으로 정량하여, 세포내 PTH 단백질 발현조사에 사용하였다.

10-12 %의 SDS (sodium deoxycholate)-폴리아크릴아미드 젤 (SDS-PAGE)을 제조하고, 분화기간 각 단계별로 정량한 단백질 시료 30㎍씩을 미리 준비한 SDS-PAGE에 로딩하여 전기영동함으로써, 추출한 세포내 단백질들이 각각의 크기별로 분리되도록 하였다. 전기영동 후, 젤상에서 분리한 각 크기별 단백질들을 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 전기적인 방법을 이용하여 옮겨주었다.

멤브레인상으로 전달된 각 크기별 단백질 중, PTH 단백질 크기에 해당하는 멤브레인 부분만을 취하고, 취한 멤브레인에 PTH 특이 항체 (Ab frontier, LF-MA0140), 칼슘 감응 수용체(calcium sensing receptor) (CaSR, Abcam ab18200), 크로마그라닌(chromagranin) A (CHGA, AVIVA ARP-41930-T100), 시스테인 농후 단백질(Cystein rich protein) 61 (Cyr61,Santa Cruz SC-13100) 및 오스테오칼신(osteocalcin) (OC, Santa Cruz SC-74495) 를 첨가하여 14-16시간 동안 4℃ 저온상태에서 항체와 반응시켰다. 1차 항체와의 반응 후 (1:1000 비율로 희석), 1차 항체 특이적인 2차 항체인 마우스-IgG-HRP (horse radish peroxidase) conjugate을 추가 반응시켜주었다 (1:3000 비율로 희석). 세포내 PTH 단백질 항원과 결합한 PTH 항체의 반응은 ECL (enhanced chemiluminescence)방법을 통해 결합한 정도를 조사하였다. 즉, 1차 항체인 PTH 항체와 결합한 2차 항체내의 HRP효소에 의한 ECL 반응 정도를 감지함으로써 각 단계별로 추출된 단백질내에 존재하는 PTH 및 CaSR, CHGA, Cyr61의 발현정도를 조사하였다.

동시에, 각 시료별로 동일한 양의 단백질을 사용하였으며, 전체 웨스턴 블롯 방법이 일관적으로 수행되었음을 증명하기 위해 각 단계별로 추출된 단백질내에서의 GAPDH (glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase) 항체를 사용한 발현정도를 조사하였다.

각각의 특정 단백질의 발현정도는 Image J 프로그램을 이용하여 정량분석하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 대로, 분화기간이 경과함에 따라, 편도세포내 PTH 단백질의 발현이 증가하는 것으로 조사되었다. 특히 분화유도 4일이 경과한 후, 유의적으로 증가하여 7일까지 유지되는 것을 알 수 있었다.

실시예 5: 공초점 현미경을 이용한 PTH 및 PTH 분비 과립 단백질 분포 조사

부갑상선조직으로 분화되는 과정동안 T-MSC 세포 내부에서 PTH 및 PTH 분비 조절과 관련된 단백질의 세포내 분포양상을 공초점현미경 (Confocal Lazer Scanning Microscope, LSM-5 Pascal EXCITER, Carl Zeiss)을 이용하여 조사하였다.

공초점현미경 관찰에 사용할 세포를 처리하기 위해, 분화하지 않은 세포와 분화한 세포를 여러 분화기간별 (7, 14, 21일)로 다양하게 준비하여 미리 cover-glass를 각각의 웰 바닥에 준비해둔 6-웰 플레이트에 각 웰 당 10⁴ 개씩 분주하였다.

각 분화기간별 세포는 PBS로 세포표면을 세척한 후, 10% 포르말린용액으로 세포를 고정하였다. 고정된 세포는 2% BSA (bovine serum albumin)용액으로 비특이적인 단백질들을 불활성화 시킨 후, 1차 항체 (PTH, CHGA, Cyr61)를 넣은 2% BSA용액을 각 세포에 처리하여 37℃에서 4시간동안 반응시켰다. 1차 항체와의 반응 후, 반응하지 않은 항체를 PBS로 2회 세척한 후, 1차 항체에 상응하는 형광이 달린 2차 항체 (mouse IgG-FITC, rabbit-IgG-Rhodamine, Invitrogen)가 포함된 2% BSA용액을 37℃에서 1시간동안 반응시켰다. 이때 핵에 특이적으로 염색되는 DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) (Molecular Probes®)를 첨가하여 각 세포내의 핵을 동시에 염색하였다. 2차 항체와의 반응 종료 후, 세포표면을 다시 PBS로 2회 세척한 후, 세포가 부착되어 있는 커버글래스를 떼어내고, 형광현미경 용 글래스에 얹은 뒤, mounting 용액으로 글래스에 부착시킨 뒤, 형광현미경상에서의 각각 항체의 발현 및 세포내 분포양상을 조사하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 총 분화기간동안 조사한 결과, 세포내 PTH의 발현은 분화유도액을 처리하지 않은 세포군 (Control cell, C로 표기)에서는 아래의 그림처럼 PTH 분포에 큰 변화가 나타나지 않는 것으로 조사되었다. 반면, 분화유도액을 처리한 경우(Differentiated cell, D로 표기)에서는 분화기간이 경과함에 따라, PTH의 발현이 현저히 증가함을 알 수 있었다. 그 양상은 14일에서 현저히 높은 발현 분포를 보여주어, 세포내 PTH 단백질의 발현양상 및 분비되는 PTH 농도 변화 양상과 동일한 경향을 보여주었다.

또한, 세포질내에 분산되어 분포하는 PTH의 발현양상은 과립의 형태로 나타나, 생성된 PTH의 세포 내 존재형태가 다른 분비되는 호르몬과 같이 분비과립의 형성 및 이와 유사한 기작을 통해 호르몬 저장 및 분비과정이 이뤄질 것임을 예측할 수 있었다.

세포 내에서의 PTH 분포와 관련하여, CHGA의 세포내 분포양상을 조사한 결과, 도 6에서와 같이 분화하지 않은 편도세포에서는 발현되지 않는 것으로 조사되었으나, 분화한 편도세포에서는 분화기간이 경과함에 따라, CHGA의 발현이 증가하고, 그 정도도 세포질내에 고르게 분포하는 양상을 보여주었다.

PTH 단백질과 CHGA를 동시에 이중염색하여 분포양상을 조사한 결과, PTH와 CHGA의 발현부위가 일치하는 것으로 조사되어, 생성된 PTH를 저장하고 분비하는 과정에 CHGA와 직접적인 연관성이 있음을 알 수 있었다(도 7).

실시예 6: 세포 외부 칼슘 농도에 따른 PTH 분비조절능 조사

PTH는 세포외부 칼슘 농도의 변화를 인지하여, 생체내 칼슘의 항상성을 유지하는데 작용하는 주요 호르몬이다. 편도세포에서 분화된 부갑상선 조직세포에서 생성된 PTH를 생체내 적용, 사용하기 위해서는 PTH가 PTH 고유의 기능을 정상적으로 수행하는지 여부를 조사하는 것이 중요하다.

따라서, 편도세포를 부갑상선조직으로 분화시킨 후, 세포외부 칼슘 농도를 다양하게 조절하여 외부의 칼슘 농도 변화에 따른 PTH 분비 조절능의 변화를 조사하였다.

먼저, T-MSC에 분화유도제를 7일간 처리하여 부갑상선조직으로의 분화를 유도하였다. 7일간 분화를 유도한 후, 부갑상선으로 분화된 세포를 세포 배양액 내의 칼슘 농도를 정상농도 (1.5 mM), 저농도 (0.09 mM), 고농도 (3.0 mM)로 달리한 배양액으로 배양하였다. 다양한 칼슘 농도를 함유한 배양액에 배양한 T-MSC를 3, 8, 24, 48시간동안 노출시킨 뒤, 시간대 별로 세포배양액을 수집하여 외부 칼슘 농도에 따른 세포배양액으로의 PTH 분비량을 실시예 3의 ELCIA 방법으로 조사하였다.

그 결과, 도 8과 같이, 저칼슘 상태에서는 정상 칼슘 농도에 비해 고농도의 PTH 분비량을 보여주었으며, 특히 24시간 노출 이후에 그 분비량이 더욱 증가하는 것으로 조사되었다. 반면, 고칼슘 상태에서는 PTH의 분비량이 정상 칼슘농도 상태에서 보다 현저히 낮은 것으로 조사되었다. 이는 분화된 부갑상선조직 역시 세포외부 칼슘농도에 따라 PTH 분비 정도를 조절가능하고, PTH 분비 조절을 통해 칼슘의 흡수/재흡수를 조절하여 혈중 칼슘농도 항상성 유지에 기여하는 PTH 고유의 기능을 수행할 수 있음을 보여주는 결과이다.

특히, 저칼슘 상태에서는 편도세포의 세포모양 역시 분비과립 형태의 입자가 다수 형성되는 것을 보여주어, 분비과립형성에 따른 세포형태의 변화 역시 유발될 수 있음을 보여주고 있다(도 9).

또한, 세포외부 칼슘농도를 인지하고, 저장된 PTH의 분비를 조절하는 것으로 알려진 인자로는 칼슘 감응 수용체 (CaSR)가 있다. CaSR는 부갑상선세포의 표면에 다수 존재하는 수용체로, 세포외부의 칼슘농도를 인지하면서 혈중 칼슘농도의 항상성을 유지, 조절하는 역할을 한다. 칼슘농도가 낮은 상태인 경우, 이를 인지하고 저장된 PTH의 세포외부로의 분비를 촉진하고, 이때 분비된 PTH는 혈액순환을 통해 골조직으로 이동하여 조골세포 표면에 존재하는 PTH 수용체 (PTH receptor, PTHR)와 결합, 반응하면서 저장된 칼슘이 혈액으로 방출되도록 함으로써 혈중 칼슘의 항상성이 유지되는 작용이 생체내에서 일어나게 된다. 이러한 작용을 하는 CaSR는 수용체 자체의 양에 의해 그 활성이 조절되는 것으로 알려져 있다. 이에, 다양한 세포외부 칼슘농도에 노출된 편도세포를 이용하여 CaSR의 발현정도 및 PTH 발현정도를 조사하여, 생성된 PTH의 CaSR와의 작용과의 연관성을 조사하였다.

그 결과, 도 10과 같이, 저칼슘 상태일때는 CaSR의 발현정도가 증가하고, 고칼슘 상태에서는 발현량이 현저히 감소하여, 편도세포에서 생성된 PTH의 정상적인 칼슘농도 항상성 조절과정에도 CaSR가 주요 인자로 작용할 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 7: 부갑상선조직으로 분화된 편도줄기세포의 세포내 미세구조 확인

줄기세포를 이용하여 특정 장기로의 분화를 유도한 경우, 특정 장기 고유의 기능을 수행하기 위해서는 분화된 조직이 실제 장기 조직이나 세포와 구조적인 면에서 유사성을 갖게 된다.

이에, 부갑상선조직으로 분화된 편도줄기세포의 세포내 미세구조를 전자현미경을 이용하여 조사함으로써 정상 부갑상선조직과의 유사성을 조사하였다.

부갑상선으로 분화한 T-MSC의 세포내 미세구조의 변화를 조사하기 위해 전자현미경을 이용하여 관찰하였다. 가장 최대의 PTH 분비능을 보이는 시점인 분화 7일째의 세포를 이용하여 세포내 미세구조의 변화를 조사하였다. 이때, 대조군으로는 분화유도제인 액티빈 A와 Shh를 처리하지 않은 7일째의 세포를 사용하였다. 대조군 (Control, C)과 분화 7일째 (Differentiation, D)의 세포를 PBS 를 이용하여 세포 표면을 세척한 후, trypsin을 처리하여 부착된 세포를 떼어낸 뒤, 원심분리기를 이용하여 1200 rpm에서 5분간 원심분리하여 떨어진 세포를 수집하였다. 펠렛 형태로 모은 세포는 2.5 % glutaraldehyde 용액에 보관하여 4℃에서 고정하여 보관하였다.

세포내 미세구조를 관찰하기 위해 투과전자현미경 (MODEL H-7650 (2006), H-600 (1982) / HITACHI)을 이용하여 관찰 조사하였다. 관찰한 배율은 4,000배율, 12,000배율을 이용하였다.

분화하지 않은 편도줄기세포와 부갑상선으로 분화한 편도줄기세포를 비교, 관찰하였을 때, 분화하지 않은 편도줄기세포는 다른 일반세포와 마찬가지로 핵, 미토콘드리아, 골지체의 기본 구조를 보이고 있는 것으로 조사되었다 (도 11a).

반면, 부갑상선으로 분화유도된 세포에서는 기본 세포 미세구조 외에, 세포과립으로 간주되는 구조가 다수 형성되어 있음이 조사되었다 (도 11b). 또한, 과립전구체 (pro-secretory granule) 와 유사한 형태를 보이는 구조 역시 관찰되어(도 11b), PTH를 분비하는 호르몬 분비조직으로의 분화가 잘 진행되었음을 구조적으로도 확인할 수 있었다.

실시예 8: 전조골세포를 이용한 조골기능 조사

PTH는 조골세포 표면의 PTH 수용체 (parathyroid hormone receptor, PTHR)를 통해 골형성능을 갖는다는 연구결과가 보고된 이래로, PTH 자체가 갖는 직접적인 골형성능 유도를 통한 새로운 골다공증치료제로서의 역할이 제시되어 오고 있다.

이를 토대로, 부갑상선조직으로 분화된 편도줄기세포로부터 생성, 분비된 PTH가 실제로 PTH 고유의 골형성 능력을 갖는지 여부를 조사하였다.

전조골세포인 (Preosteoblast) MC3T3-E1 세포를 이용하여 PTH를 배출하는 부갑상선조직으로 분화된 T-MSC에서 얻어진 세포배양액에 의한 조골기능을 조사하였다. 즉, MC3T3-E1 세포는 24-웰 플레이트에 각 웰 당 10⁴ 개씩 분주하고, 각 웰당 아스코빅산 2-포스페이트, 덱사메타손 및 β-글리세로포스페이트를 함유한 골세포배양액 (Invtorgen)을 2주간 처리하여 조골기능을 조사하였다. 상기 배양액을 3-4일마다 교체하였으며, 세포외부로 분비된 PTH를 함유하고 있는 세포배양액 (conditioned medium, CM)을 다양한 농도로 처리하여 (세포배양액 내의 PTH함유량으로 10, 50, 100, 1000 pg/ml), 분비된 PTH의 골형성 능력을 조사하였다. 유전자재조합 방법으로 합성, 시판하는 PTH와 골다공증의 호르몬 요법으로 임상에서 사용중인 17-beta estradiol (10 μM)을 양성대조약물로 비교 조사하였다.

골형성능을 조사하기 위해, 웨스턴 블롯 방법으로 골형성의 대표적인 표지자인 오스테오칼신 (OC) 단백질의 세포질내 발현 및 세포질내 칼슘의 축적정도를 염색하는 Alizarin red S 방법을 이용하여 조사하였다.

즉, 배양이 종료된 후, 배양액을 제거하고, 각 웰의 바닥에 부착된 세포를 PBS로 세척한 다음, 60% 이소프로필알콜을 사용하여 5분동안 고정하며, 증류수로 2회 세척하고, 2% Alizarin red S 수용액(pH 4.2)로 3분간 염색하였다. 염색이 종료된 후, Alizarin red S 수용액을 제거하고 즉시 증류수로 3회 세척한 다음, 위상차 현미경으로 관찰하여 대조군 (분화를 유도하지 않고 배양한 MC3T3-E1)과 비교하였다

대표적인 골형성 표지자인 osteocalcin 단백질의 발현 정도를 조사한 결과, CM의 농도가 증가함에 따라, 오스테오칼신의 발현 역시 증가하는 양상을 보였으며, 그 정도는 호르몬인 에스트로겐 보다는 낮은 발현정도를 보였으나, 분화유도액을 처리한 경우와 유사한 정도의 골형성능을 보여주었다 (도 12). 또한, 시판 PTH (104 ng/ml)를 처리한 경우와 비교할 때, 시판 PTH 농도의 1/100에 해당하는 농도의 CM (1000 pg/ml = 1 ng/ml)을 처리한 경우에서도 시판 PTH와 유사한 골형성능을 보여주어, 편도줄기세포에서 생성, 분비된 PTH가 높은 생리활성을 보유하고 있음을 확인하였다.

Alizarin red-S 염색법을 이용하여 세포내 석회화된 부분을 염색한 결과에서도, CM에 의해 골형성이 유도되었으며, 석회화되어 염색된 부분이 현저히 증가하였음을 확인할 수 있었다.

상기 결과는 본 발명의 방법에 의해 생산된 PTH는 생체내에 적용시 PTH 고유의 생리학적 기능 수행이 가능하여, 치료제로 활용될 수 있음을 보여준다.

모든 데이터는 평균 ± 표준편차(S.D.)로 표시하고, 통계적으로 유의성 검증은 GRAPHPAD PRISM 소프트웨어(GraphPad Software Inc., San Diego, CA)를 이용하여 Student’s t-test로 분석하였다. 모든 분석에서, P<0.05인 경우를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. 모든 실험은 최소 3회 반복 수행하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (19)

1. 액티빈(Activin) A 및 소닉 헤지호그(Sonic hedgehog)(Shh)를 포함하는 배지에서 편도줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 편도줄기세포로부터 부갑상선 조직세포를 분화시키는 방법.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 액티빈 A 및 소닉 헤지호그는 각각 50 ng/ml 내지 300 ng/ml의 농도로 배지에 존재하는 것인 방법.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 액티빈 A 및 소닉 헤지호그는 각각 100 ng/ml의 농도로 배지에 존재하는 것인 방법.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 배지는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium) 배지인 방법.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 배양은 4일 이상 실시되는 것인 방법.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 편도줄기세포는 중간엽줄기세포인 방법.
   
7. 제1항에 있어서, 배양이 4일 이상 이루어질 경우, 4 내지 5일 마다 신선한 배지로 교체하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
   
8. i) 액티빈(Activin) A 및 소닉 헤지호그(Sonic hedgehog)(Shh)를 포함하는 배지에서 편도줄기세포를 배양하여 부갑상선 조직세포로 분화시키는 단계 및 ii) i) 단계에서 수득한 배양액 또는 세포 용해액으로부터 부갑상선 호르몬을 분리하는 단계를 포함하는, 편도줄기세포를 이용하여 부갑상선 호르몬을 생산하는 방법.
   
9. 제8항에 있어서, i) 단계 후에, 배양액의 칼슘 농도를 조절하여 부갑상선 호르몬을 세포 밖으로 분비시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
   
10. 제9항에 있어서, i) 단계 후에, 배양액의 칼슘 농도를 0.5 mM 이하로 조절하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
    
11. 제8항에 있어서, 상기 액티빈 A 및 소닉 헤지호그는 각각 50 ng/ml 내지 300 ng/ml의 농도로 배지에 존재하는 것인 방법.
    
12. 제8항에 있어서, 상기 액티빈 A 및 소닉 헤지호그는 각각 100 ng/ml 의 농도로 배지에 존재하는 것인 방법.
    
13. 제8항에 있어서, 상기 배양은 4일 이상 실시되는 것인 방법.
    
14. 제8항에 있어서, 상기 배양은 7일 이상 실시되는 것인 방법.
    
15. 삭제
16. 삭제
17. 삭제
18. 삭제
19. 삭제

Images