KR20210055027A - 고장성 세포 용액으로부터 유래된 세포외 물질과 관련된 방법 및 조성물 - Google Patents

고장성 세포 용액으로부터 유래된 세포외 물질과 관련된 방법 및 조성물 Download PDF

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조나단 에이. 로울리
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루스터바이오, 인크.
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Abstract

본 명세서에는 고장성 용액을 포함하는 조성물, 키트 및 방법이 개시된다. 구체적으로, 본 명세서에는 세포로부터 세포외 물질의 수율을 증가시키기 위해 사용되는 방법 및 조성물이 개시된다. 이것은 상기 세포가 고장성 용액에 노출될 때 일어난다.

Description

고장성 세포 용액으로부터 유래된 세포외 물질과 관련된 방법 및 조성물
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 5월 14일자로 출원된 미국 가출원 제62/671,074호의 우선권을 주장하며, 상기 가출원의 전체 내용은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
세포외 소포(extracellular vesicle: EV)와 같은 세포외 물질(extracellular material: EM)은 다른 치료제와는 상이한 신종 치료제로서 부상하고 있다. 하나의 응용예는 치료법, 영상화 등을 위해 외인성 카고(cargo)를 운반 및 전달하는데 EM을 사용하는 것이다. 이러한 응용예에서 EM은 임의의 세포 유형으로부터 수확할 수 있지만, 성장하거나 유전자 변형되기 쉬운 세포주로부터 수확하는 것이 가장 일반적이다. 다른 응용예는 치료 세포 유래의 EM을 사용하는 것이고, 이로부터 EM은 일반적으로 치료 특성을 이어받는다. 천연의 치료 특성을 가진 EM은 재생 의학에 특히 유망하다: 이러한 EM은 생물성 치료 생성물인 세포계 치료법에 대한 무생물성 대안이며, 임상 투여를 엄청나게 단순화할 수 있고 재생 의학 제품의 안전성 프로파일을 개선시킬 수 있다.
EM을 제조하는데 있어서 중요한 장애는 낮은 세포 수율이다. 동물 연구로부터 추론해 보면, 한 사람당 EM의 용량은 생성하는데 수십억 개의 세포를 필요로 할 것이다. 본 기술분야에서 필요한 것은 배양물 중의 생세포로부터 EM 수율을 증가시키는 방법 및 조성물이다. 이러한 방법 및 조성물이 본 명세서에 개시된다.
본 명세서에는 세포외 물질의 생산을 증가시키기 위해 고장성(hypertonic) 용액을 사용하는 세포에 관한 조성물 및 방법이 개시된다.
구체적으로, 본 명세서에는 320 내지 1000 mOsm/㎏ 사이의 오스몰농도(osmolality)를 포함하는 용액에 침지된 세포외 물질의 농축된 집단을 포함하는 약제학적 조성물이 개시된다.
또한, 본 명세서에는 키트(kit)가 개시된다. 키트는, 예를 들어, 세포; 세포 배양 배지; 및 320 mOsm/㎏ 내지 20 Osm/㎏ 사이의 오스몰농도를 갖는 용액을 포함할 수 있다.
또한, 본 명세서에는 세포외 물질의 축적 또는 생산을 증가시키기 위한 방법으로서, 320 내지 1000 mOsm/㎏ 사이의 오스몰농도를 갖는 용액에 세포를 침지시키는 단계; 320 내지 1000 mOsm/㎏ 사이의 오스몰농도를 갖는 상기 용액 중의 세포를 인큐베이션하는 단계; 및 상기 세포에 의해 방출되는 세포외 물질을 수집 및 정제하는 단계를 포함하는 방법이 개시된다.
본 명세서에는 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 세포에 의해 방출된 세포외 물질을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법이 개시된다.
본 발명의 하나 이상의 실시형태의 세부 사항은 이하 첨부된 도면 및 상세한 설명에 기술된다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 이하 상세한 설명과 도면 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.
도 1은 260 내지 310 mOsm/㎏의 등장성 농도 범위를 나타내는 기존의 기성 기본 배지를 평가한 것이다.
도 2는 배지의 오스몰농도를 조절하기 위한 용질로서 사용되는 NaCl의 예를 도시한다.
도 3은 고장성 배지가 장기간(2일) 세포 생존에 영향을 미칠 수 있으므로 오스몰농도의 조정이 세포 생육성의 균형을 맞추는 데 중요하다는 것을 도시한다.
도 4는 확대 배지로부터 전환한 후 2일째 수집 배지에서의 세포외 소포의 수율을 나타낸다. 3가지 다른 BM-MSC 기증자 및 2가지 배지 제형을 EV 수율에 대해 평가하였다. 수집 배지(즉, 고장성)의 오스몰농도 증가(+0, +200 및 +600)는 EV 수율을 증가시킨다.
도 5는 수집 배지 중의 세포외 인간 간세포 성장 인자를 도시한다. 3가지 다른 BM-MSC 기증자 및 2가지 배지 제형을 EV 수율에 대해 평가하였다. 수집 배지의 오스몰농도의 조정(+0, +200 및 +600)은 세포외 HGF의 분비 수준을 제어할 수 있다.
도 6은 배지 오스몰농도의 함수로서 세포외 소포 생산량을 도시한다. 등장성 배지(RoosterBasal)를 사용한 48시간 수집과 비교할 때, 고장성 배지는 30분 내에 동일한 수율을 달성하거나 또는 동일 기간 동안에는 수율을 5배 넘게 증가시킬 수 있다.
도 7A 내지 도 7D는 배지 중의 입자의 크기 분포를 도시한다. 모든 히스토그램은 다양한 오스몰농도를 가진 조절된 배지가 세포외 소포로 예상되는 크기 범위의 입자를 함유한다는 것을 시사한다. 도 7A는 모든 시점에서의 기증자 1을 나타낸다. 도 7B는 모든 시점에서의 기증자 2를 나타낸다. 도 7C는 48 시간째 기증자 1을 나타낸다. 도 7D는 48시간째 기증자 2를 나타낸다.
도 8은 +600 mOsm/㎏(수확 중)과 +0 mOsm/㎏ 용액 사이를 번갈아 가며 수확한 두 수확물로부터 수집된 입자를 나타낸다. 유사한 입자 수준은 배지간에 번갈아 가며 여러 수확물을 수확할 수 있고, 여러 수확물에 대해 동일한 세포 배양을 사용하여 세포 생산성을 증가시킬 수 있는 실현가능성을 시사한다.
도 9는 조절된 배지로부터 중요한 생성물인 단백질을 함유한, 오스몰농도가 다른 조절된 배지로부터 분리된 입자를 나타낸다.
도 10A 내지 도 10C는 세포외 소포 분리 후 수집된 입자의 RNA 분석을 도시한 것이다. 다른 배지 오스몰농도(0, +200, +600 mOsm/㎏, 각각 A 내지 C)는 Bioanalyzer에서 진행된, 조절된 배지로부터 분리된 입자의 상이한 RNA 프로파일을 초래하였다. 조절된 배지 유래의 하나의 생성물인 세포외 소포는 RNA를 함유하는 것으로 알려져 있다. 오스몰농도가 +200 mOsm/㎏로 증가된 경우, 추가 입자가 생성되고 RNA 프로파일이 유지되며, 이는 세포외 소포의 생산성 증가를 입증한다. +600 mOsm/㎏으로 증가시킨 경우, 훨씬 더 많은 입자 수가 생성되지만 RNA 프로파일은 상이하고 더 적은 RNA가 존재한다. 상이한 EV 집단들은 다른 치료 응용예를 위해 활용될 수 있다. 또한, 입자는 RNA 카고가 더 적어, 페이로드(payload)가 로딩되는 약물 전달 비히클로서 이용될 수 있다.
도 11A 및 도 11B는 오스몰농도가 정상, +200 mOsm/㎏ 및 +600 mOsm/㎏인 조절된 배지가 기증자 1(도 11A) 및 기증자 2(도 11B)에 대하여 시험관내 상처 치유 모델에서 대조군에 비해 더 높은 봉합률을 나타낸다는 것을 도시한다. 이것은 조절된 배지가 상처 치유 및 기타 응용예에서 생물활성(bioactivity) 및 유용성이 있음을 입증한 것이다.
정의
본 명세서 및 청구범위 전체에 걸쳐, 이하의 용어들은 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 본 명세서에서 명시적으로 연관된 의미를 갖는다.
본 명세서에서 사용되는 "일 실시형태에서"라는 문구는 동일한 실시형태를 의미할 수 있지만, 반드시 동일한 실시형태를 의미하는 것은 아니다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 "다른 실시형태에서"라는 문구는 다른 실시형태를 의미할 수 있지만, 반드시 다른 실시형태를 의미하는 것은 아니다. 따라서, 이하에 기술되는 바와 같은 본 발명의 다양한 실시형태는 본 발명의 범위 또는 사상에서 벗어남이 없이 쉽게 조합될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "또는"은 포괄적인 "또는" 연산자이며, 문맥이 달리 명확하게 지시하지 않는 한, "및/또는"이라는 용어와 동등한 것이다.
단수형 용어는 복수의 참조물을 포함한다. 따라서, 단수형 용어는 하나 또는 하나보다 많은 것을 의미할 수 있다. 예를 들어, 세포 및/또는 세포외 소포는 하나의 세포 및/또는 세포외 소포 또는 복수의 세포 및/또는 세포외 소포를 의미할 수있다.
본 명세서에 사용된 "줄기세포"는 다양한 다른 세포 유형(하나 이상의 특정 기능을 수행하는)으로 분화하는 잠재력을 갖고, 자가 재생 능력을 갖는 다능성 세포(multipotent cell)를 의미한다.
본 명세서에 사용된 "성체 줄기세포"는 배아 줄기세포가 아닌 줄기세포를 의미하며 신생아 줄기세포를 포함한다. 예를 들어, 성체 줄기세포는 중간엽 간질 세포 또는 MSC(mesenchymal stromal cell)라고도 지칭되는 중간엽 줄기세포를 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "투여하는", "도입하는", "전달하는", "배치" 및 "이식"은 호환해서 사용되며, 원하는 부위에 세포 및/또는 세포외 소포를 적어도 부분적으로 국재화시키는 방법 또는 경로에 의해 대상체에게 본 기술의 세포외 소포를 배치하는 것을 의미한다. 세포 및/또는 세포외 소포는 세포 및/또는 세포외 소포의 적어도 일부가 이의 치료적 능력을 유지하는 대상체의 바람직한 위치로 전달을 초래하는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 투여 방법은 정맥내 투여(i.v.)를 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "치료하는"은 본 기술의 치료 조성물을 대상체의 신체 내로 또는 신체 상에 임의의 방식으로 도입시킴을 통해 질병 또는 장애의 적어도 하나의 부작용 또는 증상을 감소 또는 완화시키는 것을 포함한다.
본 명세서에 사용된 "치료적 유효 용량"은 치료제의 양(예를 들어, 유익하거나 원하는 임상 효과를 야기하기에 충분한 양)을 의미한다. 용량은 일회 또는 다회 투여(예컨대, 2회, 3회, 4회 등)로 투여될 수 있다. 하지만, 유효 용량으로 간주될 수 있는 것의 정확한 결정은 환자의 연령, 사이즈, 질병의 유형 또는 정도, 질병의 단계, 투여 경로, 사용된 보조 요법의 유형 또는 정도, 진행 중인 질병 과정, 및 공격적 치료 대 통상적인 치료를 위해 원하는 치료 유형(예컨대, 약제학적 허용성 제제로서 세포 및/또는 세포외 소포)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 각 환자에게 개별적인 요인들을 기반으로 할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "유효량"은 유익하거나 원하는 결과를 달성하기에 충분한 조성물의 양을 의미한다. 유효량은 일회 이상의 투여, 적용 또는 투여량으로 투여될 수 있으며 특별한 제형 또는 투여 경로에 제한하려는 의도는 없다.
본 명세서에 사용된 용어 "약제학적 조성물"은 활성제인 세포외 소포와, 원하는 경우 조성물을 특히 시험관내, 생체내 또는 생체외에서 진단 또는 치료 용도로 적합하게 만드는 담체, 불활성제 또는 활성제와의 조합물을 의미한다. 본 명세서에 사용된 용어 "약제학적 허용성" 또는 "약리학적 허용성"은 대상체에게 투여했을 때 이상 반응, 예를 들어 독성, 알레르기성 또는 면역학적 반응을 실질적으로 생성하지 않는 조성물을 의미한다. 예를 들어, 생리식염수는 약제학적 허용성 담체 용액이다.
본 명세서에 사용된 용어 "숙주", "환자" 또는 "대상체"는 본 기술의 제제 및/또는 방법에 의해 치료되거나 본 기술에 의해 제공되는 다양한 검사를 받을 유기체를 의미한다.
용어 "대상체"는 동물, 바람직하게는 인간을 포함한 포유동물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 영장류이다. 다른 바람직한 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 이하의 실시예는 본 기술의 특정 바람직한 실시형태 및 양상을 입증하고 더욱 예시하기 위해 제공된 것으로, 이는 본 기술의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 명세서에 사용된 용어 "세포"는 또한 구체적으로 나타내지 않는 한, 개별 세포, 세포주, 1차 배양물 또는 이러한 세포로부터 유래된 배양물을 의미한다. "배양물"은 동일하거나 다른 유형의 분리된 세포를 포함하는 조성물을 의미한다. 생세포(living cell)는 세포 배양물에서 찾을 수 있다.
용어 "세포외 물질"("EM"이라고도 지칭함)은 혈액, 림프, 소변, 타액 및 세포 배양물의 조절된 배지를 포함하는 진핵생물 유체에 존재하는 세포외 소포(EV)를 포함하는 세포 유래 물질을 의미한다. 이 세포외 물질은 세포의 엔도솜 및 원형질 막에서 유래할 수 있으며 분비성 성분을 포함할 수 있다. 이러한 성분의 예는 DNA, RNA(miRNA 포함)와 같은 핵산, 단백질, 폴리펩타이드, 탄수화물, 지질 및 소분자를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 세포외 물질은 세포 유래의 작은 소포일 수 있으며, 엑소좀, 미세소포, 엑토좀, 쉐딩(shedding) 소포, 막 소포, 원형질막 소포 또는 기타 막-결합된 어셈블리, 및 아폽토시스체, 바이러스 및 세포를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 세포외 물질은 세포외 소포를 포함하거나, 세포외 소포로 구성되거나, 또는 세포외 소포로 본질적으로 구성될 수 있다.
일반적 설명
본 발명 이전에 배양된 세포로부터 세포외 물질을 생산하기 위한 최신 관행은 세포를 융합성일 때까지 배양하고, 세정하여 존재하는 배양 배지를 제거하고, EM 수집 전에 등장성 배지에서 24 내지 72시간 동안 추가 인큐베이션하는 것이었다.
본 명세서에서는 EM의 생산을 증가시키기 위해 생세포와 함께 고장성 용액(320 mOsm/㎏ 초과)을 이용하는 방법 및 조성물이 개시된다. 고장성 용액의 예는 추가 염화나트륨이 첨가된 용액을 포함한다. 고장성 용액은 EM 생산률을 용량 의존적 방식으로 급증시킬 수 있다. 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법에 의하면, EM 생산은 임의의 시점에 증가될 수 있고, 목표 수율은 등장성 배지를 사용하는 경우에 비해 더 짧은 시간 내에 수확될 수 있다(도 6). 이러한 현상은 다수의 근원/기증자 유래의 세포를 따라, 그리고 다른 배지 제형을 따라 관찰되었다. 또한, 용액이 다른 오스몰농도 간에 번갈아 교대되는 다수의 수확이 수행될 수도 있다(도 8). 본 명세서에는 고장성 용액 중의 세포가 더 높은 양의 세포외 물질을 분비/배출한다는 놀라운 발견을 이용한 방법, 키트, 장치 및 약제학적 조성물이 개시된다.
구체적으로, 본 명세서에는 320 내지 1000 mOsm/㎏ 사이의 오스몰농도를 포함하는 용액에 침지된 세포외 물질의 농축된 집단을 포함하는 약제학적 조성물이 개시된다. 이것은 본 명세서에서 "고장성" 용액으로 지칭된다. 오스몰농도는, 예를 들어, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 또는 1000 mOsm/㎏ 이상일 수 있다. 본 명세서에 사용된 "등장성(isotonic)" 용액은 오스몰농도가 250 내지 320 mOsm/㎏ 사이인 용액을 의미한다. "저장성(hypotonic)"은 250 mOsm/㎏ 미만의 용액을 의미한다.
용액은 농축물로부터 조제될 수 있다. 이 경우, 농축물의 오스몰농도는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 Osm/㎏ 이상일 수 있다.
또한, 본 명세서에는 액체 또는 콜로이드계 내에 현탁되거나, 동결된, 건조된, 동결건조된, 다른 물질의 표면 위에 고정된, 또는 다른 물질 내에 캡슐화된 세포외 물질의 농축된 집단 또는 이의 분획이 개시된다. 또한, 약제학적 조성물의 분리되거나 정제된 분획이 개시된다.
세포외 물질은 생세포(living cell) 또는 생육성 세포(viable cell)에서 유래될 수 있다. 이러한 세포는 예를 들어 배양물에서 발견될 수 있다. 세포의 예로는 줄기세포, 1차 세포, 면역 세포, 이들의 딸세포 또는 이들의 분화된 유도체를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 세포는 예를 들어 무한증식성 1차 세포일 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 세포는 이하에 더 상세하게 설명된다.
또한, 본 명세서에는 키트가 개시된다. 키트는 예를 들어 세포; 세포 배양 배지; 및 320 mOsm/㎏ 내지 20 Osm/㎏ 사이의 오스몰농도를 갖는 용액을 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 세포 배양 배지의 예로는 둘베코 변형 이글 배지[Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)], DMEM/F12, 최소 필수 배지 이글 알파(Minimum Essential Medium Eagle Alpha(MEMα), RPMI(Roswell Park Memorial Institute) 및 IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)이 있다. 세포 배양 배지는 배양된 세포의 생육성을 유지하기 위한 필수 영양소와 미네랄을 함유한다. 세포 배양 배지 및 용액은 동일한 포뮬러(formular) 내에 있을 수 있거나, 함께 조제될 수 있다.
세포는 현탁액 내에; 플라스크, 플레이트, 마이크로캐리어(microcarrier), 필름, 직물 또는 섬유와 같은 고체 기질 상에; 하이드로겔과 같은 연성 기질 상에 또는 그 내부에; 응집체로서; 단세포 용액으로서 또는 이들의 조합으로서 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 키트의 세포는 고장성 용액없이, 예컨대, 등장성 용액에서 3일 이상 동안 배양되었다. 예를 들어, 이러한 배양은 고장성 용액에 노출되기 전에 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일 이상일 수 있다. 고장성 용액은 단백질을 첨가함이 없이 DMEM, DMEM/F12, MEMα, RPMI 또는 IMDM과 같은 세포 배양 배지를 함유할 수 있다.
조절된 배지(conditioned media)는 본 명세서에 개시된 세포와 함께 사용될 수 있으며, 세포외 물질의 생산을 향상시키거나 수집을 촉진시키는, 바람직한 다양한 특정 속성 또는 특성을 제공할 수 있다. 조절된 배지 조성물은 일반적으로 필수 아미노산, 염, 비타민, 미네랄, 미량 금속, 당, 지질 및 뉴클레오사이드를 포함한다. 세포 배양 배지는 제어된 환경에서 세포를 성장시키는데 필요한 영양소 요구를 충족시키는데 필수적인 구성성분을 공급할 수 있다. 영양소 제형, pH 및 기타 요인은 세포 유형, 세포 밀도 및 사용되는 배양 시스템과 같은 매개변수에 따라 달라질 수 있다. "조절된 배지"는 1차 세포 집단을 배지에서 배양한 다음, 배지를 수확하여 제조한다. 그 다음, 조절된 배지(세포에 의해 배지로 분비된 모든 것과 함께)를 사용하여 2차 세포 집단의 성장을 지원하거나 반응을 유도해낼 수 있다.
조절된 배지는 배지의 근본적인 많은 구성성분뿐만 아니라, 다양한 세포 대사산물 및 분비 단백질, 예컨대 생물학적 활성 성장 인자, 염증 매개인자 및 다른 세포외 단백질을 함유한다. 예를 들어, 도 9는 조절된 배지 유래의 중요한 생성물인 단백질을 함유한, 상이한 오스몰농도의 조절된 배지로부터 분리된 입자를 도시한다.
또한, 본 명세서에는 세포외 물질의 축적 또는 생산을 증가시키는 방법으로서, 320 내지 1000 mOsm/㎏ 사이의 오스몰농도를 갖는 용액에 세포를 침지시키는 단계; 320 내지 1000 mOsm/㎏ 사이의 오스몰농도를 갖는 상기 용액에서 세포를 인큐베이션하는 단계; 및 상기 세포에 의해 방출된 세포외 물질을 수집 및 정제하는 단계를 포함하는 방법이 개시된다.
세포외 물질의 증가된 축적 또는 생산은, 배양 시간이 동일한 경우, 오스몰농도가 250 내지 320 mOsm/㎏ 사이인 용액에서보다 오스몰농도가 320 내지 1000 mOsm/㎏ 사이인 상기 용액에서 더 높다. "더 높은"는 등장성 용액과 비교하여 고장성 용액으로부터의 생산 증가가 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 이상인 것을 의미한다. 생산 증가는 또한 시간의 함수로서 측정될 수 있으며, 고장성 용액 중의 세포로부터 유래된 세포외 물질의 증가가 등장성 용액 중의 세포로부터의 EM의 생산에 비해, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 28 또는 72시간 기간 내에 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100% 이상인 것이다. 일례에서, 세포외 물질은 원하는 특정 결과를 생성하도록 맞춤제작될 수 있다.
고장성 용액에 노출되기 전이나 후에 세포는 오스몰농도가 320 mOsm/㎏ 사이인 용액(등장성 용액)에 침지될 수 있다. 일례에서, 세포는 고장성 용액과 및 등장성 용액에 교대로 노출될 수 있다. 이러한 고장성 용액과 등장성 용액 간의 교대는 2, 3, 4, 5회 이상 일어날 수 있다. 용액은 펌프, 중력, 모세관 작용 또는 대류에 의해 구동되는 유체 흐름에 의해 도입될 수 있다. 예를 들어, 용액 교대의 결과는 예컨대 도 8에서 확인할 수 있다.
본 명세서에 개시된 방법은 저산소 환경에서 이루어질 수 있다. "저산소 환경"은 대기 산소가 0%와 20% 사이로 측정되거나, 용존 산소가 0%와 80% 사이로 측정되는 곳을 의미한다. 세포 및 용액은 4℃ 내지 45℃ 사이의 온도에서 인큐베이션될 수 있다. 상기 세포의 유무하에, 상기 용액의 pH는 6.5 내지 8.0 사이로 측정될 수 있다. 세포 생육성은 50, 60, 70, 80, 90 또는 100% 또는 그 사이의 임의의 양일 수 있다.
또한, 본 명세서에는 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 세포에 의해 방출된 세포외 물질을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법이 개시된다. 본 명세서에 기술된 방법은 이식편대 숙주 질환, 폐 고혈압, 관절염, 안구 외상 및 신부전을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 질환 및 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 본 명세서에 개시된 조성물은 혈관형성, 상처 치유 및 피부 재생을 촉진하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 조성물은 하이드로겔 패치와 같은 패치 상에 배치될 수 있다. 패치는 세포외 소포를 생성하는 생세포를 포함할 수 있고, 생세포는 고장성 용액 내에 배치될 수 있다. 패치는 이를 필요로 하는 대상체 상에 사용될 수 있다. 상처 치유를 돕기 위해 조성물을 사용하는 예는 도 11에서 확인할 수 있다.
상기 "정의" 부문에 설명된 바와 같이, 세포외 물질은 분비 또는 배출에 의해 세포로부터 압출된 임의의 물질일 수 있다. 이러한 세포외 물질은 치료 및 진단 목적을 포함한 다양한 목적에 사용될 수 있다. 본 발명에서 고려되는 바람직한 세포외 물질의 예는 CD9, CD63, CD81, 주요 조직적합성 복합체 또는 인간 백혈구 항원, 인테그린, 테트라스파닌(tetraspanin), 셀렉틴, 기질 금속단백분해효소, 열 충격 단백질, 히스톤, 아밀로이드 단백질, 바이러스 성분, 콜레스테롤, 포스파티딜세린, 핵산(RNA, DNA 및 마이크로RNA 포함) 또는 이의 조합을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 세포외 물질은 바이오마커 또는 표적으로서 사용될 수 있고, 이에 따라 검출에 적합한 임의의 물질이 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포외 물질은 검정법 또는 진단 검사를 사용하여 검출할 수 있다. 검정법 및 진단 검사는 본 명세서에 고려된다.
약제학적 조성물은 또한 상기 세포외 물질 또는 이의 분획에 융합되는 다른 세포외 물질, 세포, 막 결합 어셈블리, 또는 지질 함유 어셈블리를 포함할 수 있다. 세포외 물질은 50 내지 1000㎚ 사이, 또는 그 이상, 그 이하, 또는 그 사이의 임의의 양인 평균 입자 직경 또는 평균 유체역학적 직경을 가질 수 있다. 그 예로는 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000㎚를 포함한다. 일례에서, 세포외 물질은 음(negative)의 표면 전하 또는 음의 제타 전위를 가질 수 있다.
약제학적 조성물은 시험관내에서 세포 생육성을 유지하는데 필요한 다른 성분을 포함할 수 있다. 이러한 성분의 예는 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 염화물, 인산염, 아세트산염, 중탄산염 및/또는 시트르산염을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 약제학적 조성물은 또한 혈관형성 또는 혈관신생을 촉진하는 화학물질, 예컨대 안지오포이에틴(Ang-1), 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor: VEGF), 혈소판 유래 성장 인자(platelet-derived growth factor: PDGF) 및 금속단백분해효소의 조직 억제인자(tissue inhibitors of metalloproteinase: TIMP)를 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 또한 세포외 물질의 상기 농축된 집단 또는 이의 분획의 이화학적 특징, 생체분포, 약동학, 약력학, 또는 생물학적 기능의 영구적 또는 일시적 변화에 영향을 미치기 위한 소분자, 조영제, 보존제, 안정제, 단백질, 지질, 핵산, 탄수화물, 이들의 유도체 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 EM은 이를 필요로 하는 대상체에게 전달하기 위한 카고를 포함할 수 있다. 카고는 EM에 접합되거나, EM 내에 포매(embedded)되거나, EM 내에 캡슐화되거나, 또는 세포외 소포와 같은 EM에 의해 다르게 운반될 수 있다. 대안적으로, EM 자체가 카고일 수도 있다. 따라서, 본 명세서에 사용된 바와 같이, EM에 "존재하는" 카고에 대한 언급은 카고를 운반하는 전술한 임의의 수단을 포함하는 것으로 이해한다.
일부 실시형태에서, 세포외 소포와 같은 EM에는 2 내지 5개의 분자 또는 단일 카고 또는 2개(또는 그 이상)의 다른 카고의 카피가 로딩된다. 일부 실시형태에서, 엑소좀 또는 이의 약제학적 조성물에는 1 내지 4,000개, 10 내지 4,000개, 50 내지 3,500개, 100 내지 3,000개, 200 내지 2,500개, 300 내지 1,500개, 500 내지 1,200개, 750 내지 1,000개, 1 내지 2,000개, 1 내지 1,000개, 1 내지 500개, 10 내지 400개, 50 내지 300개, 1 내지 250개, 1 내지 100개, 2 내지 50개, 2 내지 25개, 2 내지 15개, 2 내지 10개, 3 내지 50개, 3 내지 25개, 3 내지 25개, 3 내지 10개, 4 내지 50개, 4 내지 25개, 4 내지 15개, 4 내지 10개, 5 내지 50개, 5 내지 25개, 5 내지 15개 또는 5 내지 10개의 분자 또는 단일 카고 또는 2개(또는 그 이상)의 다른 카고의 카피가 로딩된다. 카고는 내인성이거나 외인성이며, 2개 이상의 카고가 존재하는 경우, 각 카고는 독립적으로 내인성이거나 외인성이다.
카고는 내인성 카고, 외인성 카고, 또는 이의 조합일 수 있다. 본 명세서에 기술된 세포외 소포에 접합되거나, 포매되거나, 캡슐화되거나, 또는 달리 운반될 수 있는 카고의 예는 핵산 분자{예를 들어, DNA, cDNA, 안티센스 올리고 뉴클레오타이드, mRNA, 억제성 RNA[예를 들어, 안티센스 RNA, miRNA, 짧은 간섭성 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 및 agomiR], antagomiR, 원발성 miRNA(pri-miRNA), 긴 비-암호성 RNA(IncRNA), 작은 핵 RNA(snRNA), 작은 핵소체 RNA(snoRNA) 및 미생물성 RNA}, 폴리펩타이드(예컨대, 효소, 항체), 지질, 호르몬, 비타민, 미네랄, 소분자 및 의약품 또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에 기재된 세포외 소포와 같은 EM은 하나 이상의 카고를 포함할 수 있으며, 여기서 카고(들)는 치료 분자이다. 예시적인 소분자는 항생제, 스테로이드, 스테롤, 펩타이드, 천연산물, 알칼로이드, 테르펜 및 합성 분자를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
카고는 본질적으로 진단용 또는 치료용일 수 있다. 진단 목적으로 사용되는 경우, 카고는 예를 들어 영상화제를 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 영상화제는 직접 또는 간접적으로 신호를 방출하여 검출을 가능하게 하는 제제이다. 핵 의학 스캔 및 자기 공명 영상촬영(MRI)과 같은 의료 영상 기술을 사용하여 검출할 수 있는 조영제 및 방사성 제제와 같은 영상화제가 본 명세서에 개시된다. 또한, 형광 염료 또는 염료-접합된 나노입자와 같은 형광 영상화를 위한 영상화제가 개시된다. 다른 실시형태에서, 전달될 제제는 영상화제에 접합되거나 또는 융합되거나, 또는 혼합되거나 또는 조합된다.
치료적 분자는 세포외 소포에 접합되거나, 세포외 소포 내에 포매되거나, 세포외 소포 내에 캡슐화되거나, 그렇지 않으면 세포외 소포에 의해 운반되거나 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 치료제의 예에는 mRNA 및/또는 mRNA에 의해 암호화된 폴리펩타이드(예컨대, Cre 재조합효소, 인슐린, 펩타이드 호르몬 및 효소), miRNA, siRNA 또는 치료적 가치가 있는 miRNA 길항제, 불안정할 수 있거나 생체이용률이 낮은 영양소(예컨대, 비타민 B1 및 B12, 다중불포화 지방산), 의약품[예컨대, 항생제(예컨대, 퓨로마이신, 젠타마이신 및 네오마이신), 항암제(예컨대, 화학요법제, 면역요법제, 호르몬 치료제 및 표적 치료제), 톨-유사 수용체(Toll-like receptor)의 활성인자], 및 대식세포로 전달될 분자(예컨대, 죽상경화성 플라크를 제거 또는 예방하거나, 또는 대식세포 관련 암을 치료하기 위한 것), 뿐만 아니라 본 명세서에 제공된 임의의 다른 치료적 카고 분자를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
일부 실시형태에서, 치료 제제는 생물학적 제제이다. 일부 실시형태에서, 생물학적 제제는 호르몬, 알레르기항원, 보조제, 항원, 면역원, 백신, 인터페론, 인터루킨, 성장 인자, 단클론성 항체(mAb)로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 생물학적 제제는 폴리펩타이드 또는 펩타이드이다.
일부 실시형태에서, EM은 카고의 구성요소를 모두 부분적으로 또는 완전히 고갈시키거나, 선택하도록, 또는 원하는 페이로드를 특이적으로 변화시키도록, 또는 카고 로딩의 추가 수단의 제조에서 조작될 수 있다. 세포외 소포와 같은 EM을 조작하는 방법은 종래 기술에 공지되어 있고, 문헌[Dhruvitkumar et al.(2017) Low active loading of cargo into engineered extracellular vesicles results in inefficient miRNA mimic deliver, Journal of Extracellular Vesicles, 6:1, EM 및 카고에 관한 교시에 대해서는 전체적으로 본 명세서에 참고 인용됨]에 기술되어 있다.
본 명세서에 기술된 본 명세서에 개시된 조성물에 사용하기 위한 세포는 배양할 수 있는 임의의 세포일 수 있으며, 살아있는 생육성 세포를 포함할 수 있다. 세포는 변형될 수 있다. 예를 들어, 세포는 상기 세포외 물질의 이화학적 특징, 생체분포, 약동학, 약력학, 또는 생물학적 기능의 영구적인 또는 일시적인 변화에 영향을 미치도록 유전자 변형될 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 개시된 조성물은 줄기세포 또는 전구 세포(progenitor cell)를 함유한다. 만능 줄기세포, 성체 줄기세포, 배반포 유래 줄기세포, 생식선능선 유래 줄기세포, 기형종 유래 줄기세포, 전능성 줄기세포, 다능성 줄기세포, 온코스타틴-독립적 줄기세포(oncostatin-independent stem cell: OISC), 배아 줄기세포(embryonic stem cell: ES), 배아 생식 세포(embryonic germ cell: EG) 및 배아 암종 세포(embryonic carcinoma cell: EC)는 모두 줄기세포의 예이다. 줄기세포는 다양한 다른 속성과 이러한 속성의 범주를 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 형태에서 줄기세포는 미분화 상태에서 적어도 10회, 15회, 20회, 30회 또는 그 이상의 계대 동안 증식할 수 있다. 일부 형태에서, 줄기세포는 분화없이 1년 넘게 증식할 수 있다. 줄기세포는 또한 증식 및/또는 분화하면서 정상적인 핵형을 유지할 수 있다. 줄기세포는 또한 생식 세포, 난자 및 정자를 포함하는 중배엽, 내배엽 및 외배엽 조직으로 분화하는 능력을 보유할 수 있다. 일부 줄기세포는 또한 미분화 상태에서 시험관내에서 무한증식할 수 있는 세포일 수 있다. 일부 줄기세포는 또한 장기간 배양을 통해 정상적인 핵형을 유지할 수 있다. 일부 줄기세포는 특히 장기간 배양 후에도 모두 3가지 배아 배엽층(내배엽, 중배엽 및 외배엽)의 유도체로 분화하는 잠재력을 유지할 수 있다. 일부 줄기세포는 유기체에서 임의의 세포 유형을 형성할 수 있다. 일부 줄기세포는 미분화 성장을 유지하지 않는 배지에서의 성장과 같은 특정 조건 하에서 배아체를 형성할 수 있다. 일부 줄기세포는, 예를 들어, 배반포와의 융합을 통해 키메라를 형성할 수 있다. 일부 줄기세포는 유전자 또는 화학적 수단에 의해 비-줄기세포로부터 유도되거나 변형될 수 있다.
일부 줄기세포는 다양한 마커에 의해 정의될 수 있다. 예를 들어, 일부 줄기세포는 알칼리성 포스파타제를 발현한다. 일부 줄기세포는 SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 및/또는 TRA-1-81을 발현한다. 일부 줄기세포는 SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 및/또는 TRA-1-81을 발현하지 않는다. 일부 줄기세포는 Oct4, Sox2 및 Nanog를 발현한다. 일부 줄기세포는 마커들을 mRNA 수준에서 발현하고 또 다른 줄기세포는, 예를 들어, 세포 표면 또는 세포 내에서, 단백질 수준에서 마커들을 발현하는 것으로 이해된다.
일부 실시형태에서, 상기 개시된 조성물은 줄기세포 이외에 다른 세포를 포함한다. 성인 인체는 많은 다른 세포 유형을 생성한다. 이러한 다른 세포 유형에는 각질화 상피 세포, 습식 층화 장벽 상피 세포, 외분비 분비성 상피 세포, 호르몬 분비 세포, 상피 흡수 세포(내장, 외분비선 및 비뇨생식관), 대사 및 저장 세포, 장벽 기능 세포(폐, 내장, 외분비선 및 비뇨생식관), 폐쇄된 내부 체강을 감싸는 상피 세포, 추진 기능을 가진 섬모 세포, 세포외 기질 분비 세포, 수축 세포, 혈액 및 면역계 세포, 감각 변환기 세포, 자율 뉴런 세포, 감각 기관 및 말초 뉴런 지원 세포, 중추 신경계 뉴런 및 아교 세포, 수정체 세포, 색소 세포, 생식 세포 및 보모 세포가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
인체의 세포는 각질화 상피 세포, 표피 각질세포(분화 표피 세포), 표피 기저세포(줄기세포), 손톱 및 발톱의 각질 세포, 손발톱 기저세포(줄기세포), 수질 모간 세포, 피질 모간 세포, 소피 모간 세포, 소피 모근초 세포, 헉슬리(Huxley) 층의 모근초 세포, 헨레(Henle) 층의 모근초 세포, 외부 모근초 세포, 모발 기질 세포(줄기세포), 습식 층화 장벽 상피 세포, 각막, 혀, 구강, 식도, 항문관, 원위 요도 및 질의 층화된 편평 상피의 표면 상피 세포, 각막, 혀, 구강, 식도, 항문관, 원위 요도 및 질의 상피의 기저세포(줄기세포), 비뇨기 상피 세포(방광 및 비뇨관 내벽), 외분비계 분비성 상피 세포, 타액선 점액 세포(다당류가 풍부한 분비), 타액선 장액 세포(당단백 효소가 풍부한 분비), 혀의 폰 에브너(Von Ebner) 선 세포(미뢰 세척), 유선 세포(젖 분비), 눈물샘 세포(눈물 분비), 귀에 있는 귀지선 세포(왁스 분비), 에크린(Eccrine) 땀샘 어두운 세포(당단백질 분비), 에크린 땀샘 투명 세포(소분자 분비), 아포크린 땀샘 세포(냄새 분비, 성 호르몬 감수성), 눈꺼풀의 몰(Moll)세포 샘(특수 땀샘), 피지선 세포(지질이 풍부한 피지 분비), 코의 보우만(Bowman)샘 세포(후각 상피 세척), 십이지장의 브루너(Brunner)샘 세포(효소 및 알칼리성 점액), 정낭 세포(유영 정자를 위한 과당을 포함한 정액 성분 분비), 전립선 세포(정액 성분 분비), 구요도선 세포(점액 분비), 바르톨린선(Bartholin's gland) 세포(질 윤활제 분비), 리트레(Littre) 세포 샘(점액 분비), 자궁 자궁내막 세포(탄수화물 분비), 기도 및 소화관의 분리된 배상 세포(점액 분비), 위 내막 점액 세포(점액 분비), 위샘 자이모겐 세포(펩시노겐 분비), 위샘 산분비 세포(HCl 분비), 췌장 선포 세포(중탄산염 및 소화 효소 분비), 소장의 파네스(Paneth) 세포(라이소자임 분비), 폐의 제II형 폐포 세포(계면활성제 분비), 폐의 클라라(Clara) 세포, 호르몬 분비 세포, 성장 호르몬을 분비하는 뇌하수체 전엽 세포, 난포 자극 호르몬을 분비하는 뇌하수체 전엽 세포, 황체 형성 호르몬을 분비하는 뇌하수체 전엽 세포, 프로락틴을 분비하는 뇌하수체 전엽 세포, 부신피질자극 호르몬을 분비하는 뇌하수체 전엽 세포, 갑상선 자극 호르몬을 분비하는 뇌하수체 전엽 세포, 멜라닌세포 자극 호르몬을 분비하는 뇌하수체 중간 세포, 옥시토신을 분비하는 뇌하수체 후엽 세포, 바소프레신을 분비하는 뇌하수체 후엽 세포, 세로토닌을 분비하는 내장 및 기도 세포, 엔돌핀을 분비하는 내장 및 기도 세포, 소마토스타틴을 분비하는 내장 및 기도 세포, 가스트린을 분비하는 내장 및 기도 세포, 세크레틴을 분비하는 내장 및 기도 세포, 콜레시스토키닌을 분비하는 내장 및 기도 세포, 인슐린을 분비하는 내장 및 기도 세포, 글루카곤을 분비하는 내장 및 기도 세포, 봄베신을 분비하는 내장 및 기도 세포, 갑상선 호르몬을 분비하는 갑상선 세포, 칼시토닌을 분비하는 갑상선 세포, 부갑상선 호르몬을 분비하는 부갑상선 세포, 부갑상선 옥시필 세포, 에피네프린을 분비하는 부신 세포, 노르에피네프린을 분비하는 부신 세포, 스테로이드 호르몬(미네랄코르티코이드 및 글루코코르티코이드)을 분비하는 부신 세포, 테스토스테론을 분비하는 고환의 라이디히(Leydig) 세포, 에스트로겐을 분비하는 난소 난포의 난포막 내부 세포, 프로게스테론을 분비하는 파열된 난소 난포의 황체 세포, 신장 방사구체 장치 세포(레닌 분비), 신장의 치밀 반점 세포, 신장의 혈관극주위 세포, 신장의 혈관사이 세포, 상피 흡수 세포(내장, 외분비선 및 비뇨생식관), 장 브러시 경계 세포(미세융모 포함), 외분비선 줄무늬관 세포, 담낭 상피 세포, 신장 근위 세뇨관 브러시 경계 세포, 신장 원위 세뇨관 세포, 수출세관 비섬모 세포, 부고환 주세포, 부고환 기저세포, 대사 및 저장 세포, 간세포(간 세포), 백색 지방 세포, 갈색 지방 세포, 간 지방세포, 장벽 기능 세포(폐, 내장, 외분비선 및 비뇨생식관), 제I형 폐포세포(폐의 공기 공간 내벽), 췌장관 세포(선포중심 세포), 비줄무늬관 세포(땀샘, 침샘, 유선 등의 세포), 신장 사구체 벽 세포, 신장 사구체 족세포, 헨레(Henle) 박부세포의 루프(신장 내), 신장 집합관 세포, 관세포(정낭, 전립선 등), 폐쇄된 내부 체강을 감싸는 상피 세포, 혈관 및 림프 혈관 내피 유창 세포, 혈관 및 림프 혈관 내피 연속 세포, 혈관 및 림프 혈관 내피 비장 세포, 활액 세포(관절강 내벽, 히알루론산 분비), 장막 세포(복막, 흉막 및 심막 공동 내벽), 편평 세포(귀의 외림프 공간 내벽), 편평 세포(귀의 내림프 공간 내벽), 미세 융모가 있는 내림프 낭의 주상 세포(귀의 내림프 공간 내벽), 미세 융모가 없는 내림프 낭의 주상 세포(귀의 내림프 공간 내벽), 어두운 세포(귀의 내림프 공간 내벽), 전정 막 세포(귀의 내림프 공간 내벽), 혈관선조 기저세포(귀의 내림프 공간 내벽), 혈관선조 경계 세포(귀의 내림프 공간 내벽), 클라우디우스(Claudius) 세포(귀의 내림프 공간 내벽), 보에처(Boettcher) 세포(귀의 내림프 공간 내벽), 맥락막 신경총 세포(뇌척수액 분비), 피아-지주막 편평 세포, 눈의 유색 섬모 상피 세포, 눈의 무색 섬모 상피 세포, 각막 내피 세포, 추진 기능을 가진 섬모 세포, 기도 섬모 세포, 난관 섬모 세포(여성), 자궁 자궁 내막 섬모 세포(여성), 고환그물 섬모 세포(남성), 수출 세관 섬모 세포(남성), 중추신경계의 섬모 뇌실막 세포(뇌강 내벽), 세포외 기질 분비 세포, 에나멜아세포 상피 세포(치아 에나멜 분비), 귀의 전정 장치의 반달면 상피 세포(프로테오글리칸 분비), 코르티 치간 상피 세포의 기관(모발세포를 덮는 분비성 덮개막), 느슨한 결합조직 섬유아세포, 각막 섬유아세포, 힘줄 섬유아세포, 골수 망상 조직 섬유아세포, 기타(비상피) 섬유아세포, 혈액 모세관 주위세포, 추간판의 수핵 세포, 시멘트질모세포/시멘트질세포(치근 뼈유사 시멘트질 분비), 상아질모세포/상아질세포(치아 상아질 분비), 유리질 연골 연골세포, 섬유연골 연골세포, 탄성 연골 연골세포, 조골세포/골세포, 골전구세포(골모세포의 줄기세포), 눈의 유리체의 유리체세포, 귀의 외림프 공간의 별모양 세포, 수축 세포, 적색 골격근 세포(느림), 백색 골격근 세포(빠름), 중간 골격근 세포, 근육 방추-핵낭 세포, 근육 방추-핵 사슬 세포, 위성 세포(줄기세포), 일반 심장 근육 세포, 결절 심장 근육 세포, 푸르킨예(Purkinje) 섬유 세포, 평활근 세포(다양한 유형), 홍채의 근상피 세포, 외분비 선의 근상피 세포, 혈액 및 면역계 세포, 적혈구(적혈구 세포), 거핵구, 단핵구, 결합 조직 대식세포(다양한 유형), 표피 랑게르한스 세포, 파골 세포(골 내), 수지상 세포(림프 조직 내), 소교 세포(중추 신경계 내), 호중구, 호산구, 호염기구, 비만 세포, 헬퍼 T 림프구 세포, 억제인자 T 림프구 세포, 킬러 T 림프구 세포, IgM B 림프구 세포, IgG B 림프구 세포, IgA B 림프구 세포, IgE B 림프구 세포, 킬러 세포, 줄기세포 및 혈액 및 면역계를 위한 수임된 전구 세포(다양한 유형), 감각 변환기 세포, 눈의 광수용체 막대 세포, 눈의 광수용체 청색 감광성 원추 세포, 눈의 광수용체 녹색 감광성 원추 세포, 눈의 감수용체 적색 감광성 원추 세포, 코르티 기관의 청각 내부 유모 세포, 코르티의 청각 외부 유모 세포, 귀의 전정기구의 제I형 유모 세포(가속 및 중력), 귀의 전정기구의 제II형 유모 세포(가속 및 중력), 제I형 미뢰 세포, 후각 뉴런, 후각 상피의 기저세포(후각 뉴런용 줄기세포), 제I형 경동맥체 세포(혈액 pH 센서), 제II형 경동맥체 세포(혈액 pH 센서), 표피의 메르켈(Merkel) 세포(촉각 센서), 촉각-감응성 일차 감각 뉴런(다양한 유형), 저온-감수성 일차 감각 뉴런, 열-감수성 일차 감각 뉴런, 통증-감수성 일차 감각 뉴런(다양한 유형), 고유감각 일차 감각 뉴런(다양한 유형), 자율 뉴런 세포, 콜린성 신경 세포(다양한 유형), 아드레날린성 신경 세포(다양한 유형), 펩타이드성 신경 세포(다양한 유형), 감각 기관 및 말초 뉴런 지원 세포, 코르티 기관의 내부 기둥 세포, 코르티 기관의 외부 기둥 세포, 코르티 기관의 내부 지절골 세포, 코르티 기관의 외부 지절골 세포, 코르티 기관의 경계 세포, 코르티 기관의 헨슨(Hensen) 세포, 전정기구 지원 세포, 제I형 미뢰 지원 세포, 후각 상피 지원 세포, 슈반(Schwann) 세포, 위성 세포(말초 신경 세포체를 캡슐화함), 장 신경교 세포, 중추 신경계 뉴런 및 아교 세포, 뉴런 세포(매우 다양한 유형, 여전히 잘 분류되지 않음), 성상세포 아교 세포(다양한 유형), 희소돌기아교세포, 수정체 세포, 전방 수정체 상피 세포, 결정질 함유 수정체 섬유 세포, 색소 세포, 멜라닌세포, 망막 색소 상피 세포, 생식 세포, 난조세포/난모세포, 정모세포, 정조세포(정모세포용 줄기세포), 보모 세포, 난소 난포 세포, 세톨리(Sertoli) 세포(고환내) 및 흉선 상피 세포를 포함한다.
몇몇 경우에, 세포는 중간엽 줄기세포(MSC) 또는 골수 간질 세포(BMSC)이다. 이러한 용어는 본 명세서 전체에서 동의어로 사용된다. MSC는 골수의 소량 흡인물 또는 기타 중간엽 줄기세포 근원으로부터 쉽게 분리되고 단세포 유래 콜로니를 쉽게 생성하기 때문에 관심 대상이다. 골수 세포는 장골 능선, 대퇴골, 경골, 척추, 갈비뼈, 무릎 또는 기타 중간엽 조직에서 얻을 수 있다. MSC의 다른 근원으로는 배아 난황낭, 태반, 탯줄, 피부, 지방, 관절의 활액 조직 및 혈액이 있다. 배양 콜로니에서 MSC의 존재는 단클론성 항체에 의해 동정되는 특정 세포 표면 마커에 의해 확인될 수 있다. 미국 특허 제5,486,359호 및 제7,153,500호 참조. 단세포 유래 콜로니는 약 10주 후에 50배만큼 많은 집단 배가를 통해 확대될 수 있으며, 골아세포, 지방세포, 연골세포로 분화할 수 있다(Friedenstein et al., 1970 Cell Tissue Kinet. 3: 393-403; Castro-Malaspina, et al., 1980 Blood 56: 289-301; Beresford et al., 1992 J. Cell Sci. 102: 341-351; Prockop, 1997 Science 276: 71-74), 근육세포(Wakitani et al., 1995 Muscle Nerve 18: 1417-1426), 성상 세포, 희소돌기세포 및 뉴런(Azizi et al., 1998 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 3908-3913); Kopen et al 1999 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 10711-10716; Chopp et al., 2000 Neuroreport II 300 1-3005; Woodbury et al., 2000 Neuroscience Res. 61: 364-370). 드물게, 세포는 세 가지 생식선 모두의 세포로 분화할 수 있다. 따라서, MSC는 뼈, 연골, 인대, 힘줄, 지방, 근육, 심장 조직, 간질, 진피 및 기타 결합 조직을 포함한 여러 중간엽 세포 계통의 전구 세포로서 작용한다. 미국 특허 제6,387,369호 및 제7,101,704호 참조. 이러한 이유로, MSC는 현재 많은 인간 질병의 세포 및 유전자 치료에 있어서 잠재적 사용에 대해 검사되고 있다(Horwitz et al., 1999 Nat. Med. 5: 309-313; Caplan, et al. 2000 Clin. Orthoped. 379: 567-570).
몇몇 경우에, MSC는 다양한 마커에 의해 정의될 수 있다. 예를 들어, MSC는 CD73, CD90, CD166에 대해 양성일 수 있고, CD14, CD34 및 CD45에 대해 음성일 수 있다.
세포는 인간 또는 다른 동물에서 유래될 수 있다. 예를 들어, 세포는 마우스, 기니피그, 래트, 소, 말, 돼지, 양 또는 염소에서 유래할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 세포는 인간이 아닌 영장류로부터 유래한다. 몇몇 경우에는, 세포는 자가 또는 동종이형 치료로서 사용된다.
본 발명의 다수의 실시형태가 설명되었다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어남이 없이 다양한 변형이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 다른 실시형태는 이하 청구항의 범위 내에 있다.
실시예
실시예 1: 고장성 용액에서 중간엽 줄기세포로부터 유래된 세포외 물질
본 명세서에서 언급되는 바와 같이, "고장성 용액"은 350 mOsm/㎏ 초과의 총 오스몰농도로 조제된 것이며, 이는 세포로부터 세포외 소포(EV) 또는 다른 세포 유래 물질을 수집하거나 추출하는데 사용된다. 여기에 언급된 EV는 엑소좀, 미세소포, 및 아폽토시스체와 구별되는 임의의 다른 EV를 포함한다. 본 명세서에 언급되는 세포는 인간 중간엽 줄기세포(hMSC)일 수 있다.
본 발명의 적용은 개별 세포 유형의 특정 요구에 의해 제한되지 않는다: 고장성 용액의 조제는 총 오스몰농도가 350 mOsm/㎏을 초과하는 한, 다양한 상황에 맞게 변경될 수 있다. 하나의 상황은 세포 부착 또는 생육성이 필요한 경우이다. 용액의 오스몰농도가 443 mOsm/㎏까지 증가했을 때; 용액의 오스몰농도가 658 Osm/㎏까지 증가했을 때; 그리고 IMDM의 오스몰농도(301 mOsm/㎏)가 498 mOsm/㎏까지 증가했을 때 세포는 부착된 채/생육성을 유지하였다. 이러한 시나리오에서, EV 수율은 등장성 배지에 비해 30분 이내에 10배가 넘게 증가하였다. 또한, 개시된 고장성 용액은 등장성 배지가 48시간 넘게 생산할 수 있는 것보다 12시간 이내에 더 많은 EV를 생산하였다(도 6).
상이한 기증자 및 제형에 대한 세포 생육성은 특정 응용예를 위해 모니터링 및 확립될 수 있으며, 본 기술분야의 기술자는 결정된 용도에 대한 특정 용액의 적절한 오스몰농도를 결정할 수 있을 것이다. 더욱이, 본 명세서에 공개된 고장성 용액의 일례는 등장성 배지가 48시간 넘게 생산할 수 있는 것보다 30분 이내에 더 많은 EV를 생산하였다(도 6).
어떤 상황에서든지, 더 많은 EV가 더 빠르게 생산된다. 이는 이러한 실험에서 예상치 못한 고유한 특징이다(도 6). 특히, EV는 세포 배양 상층액을 2,000 rcf에서 20분 동안 원심분리하여 아폽토시스체를 제거한 후 정량하였다. 따라서, 배지의 고장성(hypertonicity)은 세포 부착 또는 생육성을 감소시킬 수 있지만, EV의 증가는 아폽토시스체의 증가로 인한 것이 아니다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 개시된 발명이 속하는 본 기술 분야의 숙련된 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 인용된 간행물 및 이들이 인용된 자료는 구체적으로 참고로 포함된다.
본 기술분야의 기술자는 단지 일상적인 실험을 사용하여 본 명세서에 기술 된 본 발명의 특정 실시형태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 이하의 청구범위에 포함되는 것으로 간주한다.

Claims (56)

  1. 약제학적 조성물로서, 세포외 물질(extracellular material)의 농축 집단(enriched population)을 포함하되, 상기 세포외 물질은 320 내지 1000 mOsm/㎏ 사이의 오스몰농도를 포함하는 용액에 침지되어 있는, 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 용액은 1 내지 20 Osm/㎏ 사이의 오스몰농도를 포함하는 농축물로부터 조제되는, 약제학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 용액은 시험관내에서 세포 생육성을 유지할 수 있는 성분을 포함하는, 약제학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 용액은 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 염화물, 인산염, 아세트산염, 중탄산염 및/또는 시트르산염을 포함하는, 약제학적 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 물질은 생세포로부터 유래되는, 약제학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 생세포는 줄기세포, 1차 세포, 면역 세포, 이들의 딸세포 또는 이들의 분화된 유도체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 세포는 무한증식성 1차 세포인, 약제학적 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 물질의 농축 집단은 카고(cargo)를 포함하는, 약제학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 카고는 내인성 또는 외인성인, 약제학적 조성물.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 카고는 CD9, CD63, CD81, 콜레스테롤, 포스파티딜세린 또는 이들의 조합인, 약제학적 조성물.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 EM 또는 이의 카고가 혈관형성, 상처 치유, 분화, 면역조절, 증식, 괴사/아폽토시스, 인자(factor)의 분비 또는 혈관신생을 촉진하는, 약제학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 카고는 안지오포이에틴(Ang-1)인, 약제학적 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물의 분리 또는 정제된 분획.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 물질의 농축 집단 또는 이의 분획은 액체 또는 콜로이드계에 현탁되거나, 동결되거나, 건조되거나, 동결건조되거나, 다른 물질의 표면에 고정되거나, 또는 다른 물질에 캡슐화된 것인, 약제학적 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 상기 세포외 물질의 농축 집단 또는 이의 분획의 이화학적 특징, 생체분포, 약동학, 약력학, 또는 생물학적 기능의 영구적 또는 일시적 변화에 영향을 미치는, 소분자, 조영제, 보존제, 안정제, 단백질, 지질, 핵산, 탄수화물, 이들의 유도체 또는 이의 조합을 포함하는, 약제학적 조성물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 물질 또는 이의 분획에 융합되는, 다른 세포외 물질, 세포, 막-결합 어셈블리 또는 지질-함유 어셈블리를 더 포함하는, 약제학적 조성물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 물질은 평균 입자 직경 또는 평균 유체역학적 직경이 50 내지 1000㎚ 사이인, 약제학적 조성물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 물질은 음의 표면 전하 또는 음의 제타 전위를 갖는, 약제학적 조성물.
  19. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 카고는 핵산 분자, 폴리펩타이드, 지질, 호르몬, 비타민, 미네랄, 소분자 및 의약품, 또는 이의 임의의 조합을 포함하는, 약제학적 조성물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 패치 형태인, 약제학적 조성물.
  21. 키트로서,
    a. 생세포;
    b. 세포 배양 배지;
    c. 320 mOsm/㎏ 내지 20 Osm/㎏ 사이인 오스몰농도를 갖는 용액
    을 포함하는, 키트.
  22. 제21항에 있어서, 상기 세포는 줄기세포, 1차 세포, 무한증식성 세포 또는 유전자 변형된 세포를 포함하는, 키트.
  23. 제22항에 있어서, 상기 세포는 고장성 용액없이 3일 이상 배양된 것인, 키트.
  24. 제23항에 있어서, 상기 용액은 단백질이 없는 기본 배지에 있는 것인, 키트.
  25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 상기 세포외 물질의 이화학적 특징, 생체분포, 약동학, 약력학 또는 생물학적 기능의 영구적 또는 일시적 변화에 영향을 미치도록 유전자 변형된 것인, 키트.
  26. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 세포외 물질을 포함하는, 키트.
  27. 제26항에 있어서, 상기 세포외 물질은 상기 세포외 물질로부터 카고를 변경, 추가 또는 제거하도록 변형된 것인, 키트.
  28. 세포외 물질을 위한 세포를 농축시키는 방법으로서,
    a. 320 내지 1000 mOsm/㎏ 사이의 오스몰농도를 갖는 용액에 세포를 침지시키는 단계;
    b. 320 내지 1000 mOsm/㎏ 사이의 오스몰농도를 갖는 상기 용액에서 세포를 인큐베이션하는 단계;
    c. 상기 세포에 의해 방출된 세포외 물질을 수집 및 정제하는 단계
    를 포함하는, 세포외 물질을 위한 세포를 농축시키는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 세포는 320 내지 1000 mOsm/㎏ 사이의 오스몰농도를 갖는 용액에 침지되거나 인큐베이션되지 않은 세포에 비해 세포외 물질의 증가된 축적 또는 생성을 야기하는, 방법.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 세포외 물질의 증가된 축적 또는 생성 은 인큐베이션 시간이 동일한 경우, 250 내지 320 mOsm/㎏ 사이의 오스몰농도를 갖는 용액에서보다 320 내지 1000 mOsm/㎏ 사이의 오스몰농도를 갖는 상기 용액에서 더 높은, 방법.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인큐베이션 시간은 0.5 내지 72 시간 사이의 인큐베이션 시간인, 방법.
  32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 상기 세포외 물질의 이화학적 특징, 생체분포, 약동학, 약력학 또는 생물학적 기능의 영구적 또는 일시적 변화에 영향을 미치도록 유전자 변형된 것인, 방법.
  33. 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 현탁액 내에 있거나; 마이크로캐리어(microcarrier), 필름 또는 섬유와 같은 고체 기질 상에 있거나; 하이드로겔과 같은 연성 기질 상 또는 내부에 있거나; 응집체로서 있거나; 단세포 용액으로서 있거나 또는 이들의 조합으로 있는 것인, 방법.
  34. 제29항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a) 전에, 상기 세포는 250 내지 320 mOsm/㎏의 오스몰농도를 갖는 용액에 침지되어 있는 것인, 방법.
  35. 제28항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b) 후에, 단계 c)로 진행하기 전에 세포를 250 내지 320 mOsm/㎏ 사이의 오스몰농도를 갖는 용액에 침지시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 단계 c)로 진행하기 전에 세포를 250 내지 320 mOsm/㎏ 사이의 오스몰농도를 갖는 용액과 320 내지 1000 mOsm/㎏ 사이의 오스몰농도를 갖는 용액에 교대로 침지시키는, 방법.
  37. 제28항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액(들)은 펌프, 중력, 모세관 작용 또는 대류에 의해 구동되는 유체 흐름에 의해 도입되는, 방법.
  38. 제28항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 대기 산소가 0% 내지 20% 사이로 측정되거나, 또는 용존 산소가 0% 내지 80% 사이로 측정되는 저산소 환경을 더 포함하는, 방법.
  39. 제28항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 및 상기 용액은 4℃ 내지 45℃ 사이의 온도에서 인큐베이션되는, 방법.
  40. 제28항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포의 유무 하에 상기 용액의 pH가 6.5 내지 8.0 사이로 측정되는, 방법.
  41. 제28항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 수집된 세포의 적어도 50%는 원하는 기능을 갖는 세포외 물질을 포함하는, 방법.
  42. 제28항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 물질은 측정가능한 바이오마커 또는 측정가능한 표적을 보유하는, 방법.
  43. 제42항의 방법을 포함하는 분석 검정법으로서, 상기 세포외 물질이 상기 검정법의 측정가능한 표적 또는 바이오마커를 보유하는, 분석 검정법.
  44. 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서, 제28항의 단계 c)의 세포에 의해 방출된 세포외 물질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체를 치료하는 방법.
  45. 제28항 내지 제42항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된, 세포외 물질.
  46. 320 내지 1000 mOsm/㎏ 사이의 오스몰농도를 포함하는 용액에 세포를 침지시켜, 현탁액 또는 유체 흐름 하의 생세포로부터 생성되는, 세포외 물질.
  47. 제46항에 있어서, 상기 용액은 1 내지 20 Osm/㎏의 오스몰농도를 포함하는 농축물로부터 조제되는, 세포외 물질.
  48. 제46항 또는 제47항에 있어서, 상기 용액은 시험관내에서 세포 생육성을 유지할 수 있는 성분을 포함하는, 세포외 물질.
  49. 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생세포는 줄기세포, 1차 세포, 면역 세포, 이들의 딸 세포, 또는 이들의 분화된 유도체를 포함하는, 세포외 물질.
  50. 제46항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 무한증식성 1차 세포인, 세포외 물질.
  51. 제46항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 물질의 농축 집단이 카고를 포함하는, 세포외 물질.
  52. 세포외 물질을 생성할 수 있는 생세포를 포함하는 키트로서, 320 내지 1000 mOsm/㎏ 사이의 오스몰농도를 포함하는 용액에 상기 세포를 침지시키는 것인, 키트.
  53. 제52항에 있어서, 상기 세포외 물질은 상기 세포에 대해 자연 발생성이 아닌 것인, 키트.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서, 상기 생세포는 유체 흐름 또는 현탁액 내에 있는 것인, 키트.
  55. 제52항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 마이크로캐리어에 접합된 것인, 키트.
  56. 제52항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 현탁액 또는 유체 흐름 내에서 배양을 촉진하도록 변형된 것인, 키트.
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